JPH0797991B2 - Ｄｎａプラスミド - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 これは,1983年８月10に受理された共同所有，同時係属
の合衆国特許出願番号521,964の一部継続出願である。
の合衆国特許出願番号521,964の一部継続出願である。
背景 本発明は，一般に有益なポリペプチドの微生物による生
成を行うための組換え方法とその材料に関するもので，
より具体的には，大腸菌宿主細胞内で外来性遺伝子を例
外的に高いレベルで発現させるのに有用な新規のDNAプ
ラスミドに関する。
成を行うための組換え方法とその材料に関するもので，
より具体的には，大腸菌宿主細胞内で外来性遺伝子を例
外的に高いレベルで発現させるのに有用な新規のDNAプ
ラスミドに関する。
外来性遺伝子を，微生物宿主細胞集団，例えば，大腸
菌,B.subtilis,酵母およびその他の種類の微生物細胞等
において最大限に発現させるためにこれまで数多くの試
みが成されている。大腸菌による『外来性』遺伝子の発
現の最適化に関する初期の比較的に有望視された成果の
一つは，いわゆる『温度依存性』，『温度感受性』ある
いは『暴走突然変異体性』の形態の環状DNAプラスミド
の分離であった。一般に,Uhlin等のGene,６,pp.91−106
（1979）,Uhlin等のJ.Bacteriol,148,pp・386−390（19
81）,Uhlin等の英国特許明細書1,557,774を参照された
い。これらの自己複製プラスミドは，一般に,34℃未満
の『許容』温度，例えば約30℃で細胞を培養した場合に
は，適度なコピー数を有する大腸菌宿主細胞内に保持す
ることが出来る。培養液の温度が，『非許容』レベルの
37℃あるいはそれ以上に上昇すると，宿主内のプラスミ
ドの自己複製を行う生来の制御が失われ，プラスミドの
複製は暴走状態となり，非常に多数のプラスミドのコピ
ーが細胞内に存在するようになるまで止まらなくなる。
菌,B.subtilis,酵母およびその他の種類の微生物細胞等
において最大限に発現させるためにこれまで数多くの試
みが成されている。大腸菌による『外来性』遺伝子の発
現の最適化に関する初期の比較的に有望視された成果の
一つは，いわゆる『温度依存性』，『温度感受性』ある
いは『暴走突然変異体性』の形態の環状DNAプラスミド
の分離であった。一般に,Uhlin等のGene,６,pp.91−106
（1979）,Uhlin等のJ.Bacteriol,148,pp・386−390（19
81）,Uhlin等の英国特許明細書1,557,774を参照された
い。これらの自己複製プラスミドは，一般に,34℃未満
の『許容』温度，例えば約30℃で細胞を培養した場合に
は，適度なコピー数を有する大腸菌宿主細胞内に保持す
ることが出来る。培養液の温度が，『非許容』レベルの
37℃あるいはそれ以上に上昇すると，宿主内のプラスミ
ドの自己複製を行う生来の制御が失われ，プラスミドの
複製は暴走状態となり，非常に多数のプラスミドのコピ
ーが細胞内に存在するようになるまで止まらなくなる。
外来性遺伝子生成物の大腸菌により発現を行う方法にお
いて，このような温度感受性を有する暴走突然変異プラ
スミドの潜在的な有用性は明白である。外来性遺伝子の
発現は，しばしば細胞に有毒なあるいは細胞の代謝に有
害な生成物を形成することがあり，且つ外来性遺伝子生
成物の生成量は，時間がたつにつれ宿主細胞が外来ポリ
ペプチドを劣化させるためにしばしば減少するので，宿
主細胞が醗酵体内でその最大の細胞培養密度に達するま
では組換えプラスミドの複製を遅らせることによって，
望みの生成物の総生成量を最大限にすることが出来ると
考えられていた。このようにして，望みの外来性を遺伝
時の宿主発現に必要な大規模なDNAの転写およびmRNAの
翻訳を一時的に調節して，宿主細胞の損傷および生成物
の劣化が総生成物に最小限の影響しか及ぼさない最終的
な生成物の収穫間近に置きるようにすることが可能であ
る。
いて，このような温度感受性を有する暴走突然変異プラ
スミドの潜在的な有用性は明白である。外来性遺伝子の
発現は，しばしば細胞に有毒なあるいは細胞の代謝に有
害な生成物を形成することがあり，且つ外来性遺伝子生
成物の生成量は，時間がたつにつれ宿主細胞が外来ポリ
ペプチドを劣化させるためにしばしば減少するので，宿
主細胞が醗酵体内でその最大の細胞培養密度に達するま
では組換えプラスミドの複製を遅らせることによって，
望みの生成物の総生成量を最大限にすることが出来ると
考えられていた。このようにして，望みの外来性を遺伝
時の宿主発現に必要な大規模なDNAの転写およびmRNAの
翻訳を一時的に調節して，宿主細胞の損傷および生成物
の劣化が総生成物に最小限の影響しか及ぼさない最終的
な生成物の収穫間近に置きるようにすることが可能であ
る。
しかし最初に分離された温度感受性の高い暴走プラスミ
ドには種々の欠点があり，それらの欠点のゆえに，商業
的に有用な蛋白質の大規模な微生物合成に用いる潜在的
な発現ベクターとしてはこれらのプラスミドは魅力的で
ない。まず第一に，これらのプラスミドは非常に大きく
（平均的大きさ約10あるいは12Kb），従って宿主細胞内
でのプラスミドの暴走複製は，相当なエネルギーの損失
になる。この欠点は，もっと小さなサイズの，即ち，
『ミニプラスミド』，たとえば,4.6Kb pKN402（Deutshe
Sammlung von Microorganismen,“DSM"登録番号1228）
の開発によって緩和されたが，ミニプラスミドの場合で
あっても，宿主内にプラスミドを保持していることを示
す蛋白質生成物のコードを有する１個あるいはそれ以上
の『マーカー』遺伝子の挿入によって，問題はもっと深
刻になった（例えば，β−ラクタマーゼの生成の遺伝情
報を有する遺伝子により，アンピシリンに対する宿主細
胞の表現型耐性が変化した）。プラスミドpKN402から誘
導された，マーカー遺伝子を含むプラスミドには，例え
ば，アンピシリン耐性を与えるプラスミドpKN403（DSM
登録番号1229），ストレプトマイシン耐性を与えるプラ
スミドpKN404,およびクロラムフェニコールないしはテ
トラサイクリンに対する耐性を与えるプラスミドpMOB45
とpMOB48〔それぞれ10.5Kbと9.5Kb。Bitter等のGene,1
5,pp.319−329（1981）を参照のこと〕がある。機能的
に関連するプロモーター／レギュレーター配列を有す
る，控え目の大きさの外来性遺伝子を挿入しても，プラ
スミドの大きさは容易に11kbあるいは12Kbに達する。pK
N402とその多くの誘導体にとって，比較的多数の『基本
的』コピー数と非常に多量の『暴走』コピー数の点から
見て，暴走複写におけるプラスミドのサイズの大きなこ
とおよびそれに伴う宿主細胞のエネルギーの消耗は深刻
な問題となる。例えば英国特許番号1,557,774は,pKN402
による形質転換がなされた大腸菌の30℃における１細胞
当たり50プラスミドコピー（『コピー数』25）が得られ
たこと，さらに細胞培養液温度を40℃に上げると１細胞
当たりのプラスミドコピーは約5000個まで増幅したこと
を報告している。このような大きなコピー数は，外来性
遺伝子の広範囲にわたるmRNA転写に好都合であるという
意味では利点があるが，全細胞エネルギーの多くは，目
的の外来性遺伝子の発現にはほとんど影響しないDNAの
複製とDNA配列mRNAへの転写において浪費される。細胞
のエネルギー源の消耗は，望ましい蛋白質生成物へのmR
NAの翻訳率に直接に望ましくない影響を及ぼす。
ドには種々の欠点があり，それらの欠点のゆえに，商業
的に有用な蛋白質の大規模な微生物合成に用いる潜在的
な発現ベクターとしてはこれらのプラスミドは魅力的で
ない。まず第一に，これらのプラスミドは非常に大きく
（平均的大きさ約10あるいは12Kb），従って宿主細胞内
でのプラスミドの暴走複製は，相当なエネルギーの損失
になる。この欠点は，もっと小さなサイズの，即ち，
『ミニプラスミド』，たとえば,4.6Kb pKN402（Deutshe
Sammlung von Microorganismen,“DSM"登録番号1228）
の開発によって緩和されたが，ミニプラスミドの場合で
あっても，宿主内にプラスミドを保持していることを示
す蛋白質生成物のコードを有する１個あるいはそれ以上
の『マーカー』遺伝子の挿入によって，問題はもっと深
刻になった（例えば，β−ラクタマーゼの生成の遺伝情
報を有する遺伝子により，アンピシリンに対する宿主細
胞の表現型耐性が変化した）。プラスミドpKN402から誘
導された，マーカー遺伝子を含むプラスミドには，例え
ば，アンピシリン耐性を与えるプラスミドpKN403（DSM
登録番号1229），ストレプトマイシン耐性を与えるプラ
スミドpKN404,およびクロラムフェニコールないしはテ
トラサイクリンに対する耐性を与えるプラスミドpMOB45
とpMOB48〔それぞれ10.5Kbと9.5Kb。Bitter等のGene,1
5,pp.319−329（1981）を参照のこと〕がある。機能的
に関連するプロモーター／レギュレーター配列を有す
る，控え目の大きさの外来性遺伝子を挿入しても，プラ
スミドの大きさは容易に11kbあるいは12Kbに達する。pK
N402とその多くの誘導体にとって，比較的多数の『基本
的』コピー数と非常に多量の『暴走』コピー数の点から
見て，暴走複写におけるプラスミドのサイズの大きなこ
とおよびそれに伴う宿主細胞のエネルギーの消耗は深刻
な問題となる。例えば英国特許番号1,557,774は,pKN402
による形質転換がなされた大腸菌の30℃における１細胞
当たり50プラスミドコピー（『コピー数』25）が得られ
たこと，さらに細胞培養液温度を40℃に上げると１細胞
当たりのプラスミドコピーは約5000個まで増幅したこと
を報告している。このような大きなコピー数は，外来性
遺伝子の広範囲にわたるmRNA転写に好都合であるという
意味では利点があるが，全細胞エネルギーの多くは，目
的の外来性遺伝子の発現にはほとんど影響しないDNAの
複製とDNA配列mRNAへの転写において浪費される。細胞
のエネルギー源の消耗は，望ましい蛋白質生成物へのmR
NAの翻訳率に直接に望ましくない影響を及ぼす。
普通の温度感受性突然変異プラスミドの比較的大きな基
本コピー数に伴う問題は，潜在的な外来性遺伝子生成物
の毒性を考慮するとさらに深刻になる。なぜなら，たと
え低い（『許容』）温度であっても，高率の転写および
翻訳によって，培養宿主細胞の最適な生育を妨げる多く
の遺伝子生成物を生成するからである。暴走突然変異プ
ラスミドの基本的コピー数と増幅された（高温によって
誘起されたもの）コピー数を減少させるための調整操作
は，一般に温度感受性特性の喪失あるいは宿主細胞内に
プラスミドを保持する能力の喪失を招くことになった。
例えば,Hashimoto−Gotoh等のGene,16,pp.227−235（19
81）を参照されたい。本発明の背景に関係するものとし
て,pSC101から得られたプラスミド内に『分割』DNA配列
が存在するとの独自の指摘があり，これらの配列は安定
したプラスミドの遺伝を促進することが報告されてい
る。Meakock等のCell,20,pp.529−542（1980）を参照さ
れたい。
本コピー数に伴う問題は，潜在的な外来性遺伝子生成物
の毒性を考慮するとさらに深刻になる。なぜなら，たと
え低い（『許容』）温度であっても，高率の転写および
翻訳によって，培養宿主細胞の最適な生育を妨げる多く
の遺伝子生成物を生成するからである。暴走突然変異プ
ラスミドの基本的コピー数と増幅された（高温によって
誘起されたもの）コピー数を減少させるための調整操作
は，一般に温度感受性特性の喪失あるいは宿主細胞内に
プラスミドを保持する能力の喪失を招くことになった。
例えば,Hashimoto−Gotoh等のGene,16,pp.227−235（19
81）を参照されたい。本発明の背景に関係するものとし
て,pSC101から得られたプラスミド内に『分割』DNA配列
が存在するとの独自の指摘があり，これらの配列は安定
したプラスミドの遺伝を促進することが報告されてい
る。Meakock等のCell,20,pp.529−542（1980）を参照さ
れたい。
基本コピー数が多いことに伴う毒性遺伝子生成物の『漏
出』問題を取り扱う試みの一つは，外来性遺伝子の発現
の化学薬品あるいは望ましくは熱による非常に選択的な
制御を可能とする『強力』なリプレッサー（オペレータ
ー）配列に機能的に関連する構造遺伝子転写プロモータ
ーDNA配列の取り込みという形態をとる。例えば,Sninsk
y等の米国特許証番号4,374,927,Sninsky等のGene,16,p
p.275−285（1981）,Remaut等のGene,22,pp.103−113
（1983）を参照されたい。
出』問題を取り扱う試みの一つは，外来性遺伝子の発現
の化学薬品あるいは望ましくは熱による非常に選択的な
制御を可能とする『強力』なリプレッサー（オペレータ
ー）配列に機能的に関連する構造遺伝子転写プロモータ
ーDNA配列の取り込みという形態をとる。例えば,Sninsk
y等の米国特許証番号4,374,927,Sninsky等のGene,16,p
p.275−285（1981）,Remaut等のGene,22,pp.103−113
（1983）を参照されたい。
pKN402から得られたプラスミドに『強力な』プロモータ
ー配列を利用すると，当然のことではあるが，それに相
応するだけの強力なmRNA転写終止配列が欠乏しているた
めに，遺伝子発現の全体的な効率は相応するだけの潜在
的な低減を被る。このような配列が無い場合には，外来
性遺伝子のmRNA転写には普通，隣接するDNA配列に達す
る『読み過ぎ（read through）』とそれに伴う細胞エネ
ルギー消耗，外来性遺伝子mRNAがリボゾームに付着する
のを著しく妨げる可能性（『オーバーサイズ』のた
め），さらに温度感受性暴走突然変異体の場合には，プ
ラスミドの自己複製および暴走特性に欠くことが出来な
いDNA配列の適切な転写を妨げる可能性が伴う。
ー配列を利用すると，当然のことではあるが，それに相
応するだけの強力なmRNA転写終止配列が欠乏しているた
めに，遺伝子発現の全体的な効率は相応するだけの潜在
的な低減を被る。このような配列が無い場合には，外来
性遺伝子のmRNA転写には普通，隣接するDNA配列に達す
る『読み過ぎ（read through）』とそれに伴う細胞エネ
ルギー消耗，外来性遺伝子mRNAがリボゾームに付着する
のを著しく妨げる可能性（『オーバーサイズ』のた
め），さらに温度感受性暴走突然変異体の場合には，プ
ラスミドの自己複製および暴走特性に欠くことが出来な
いDNA配列の適切な転写を妨げる可能性が伴う。
pKN402から得られたプラスミドのその他の欠点は，外来
性遺伝子の配列を容易に取り込むことができる特異的な
制限エンドヌクレアーゼ酵素認識部位が全般に欠如して
いることであった。このような特異的な部位が存在する
場合には，多くの場合マーカー遺伝子の中間に位置し，
外来性遺伝子の挿入と宿主の形質転換の検証の双方を可
能とするために実質上２つの選択可能な表現型マーカー
遺伝子を含むプラスミドの製造を必要とする。Hashimot
o−Gotoh等，上掲を参照されたい。比較のために,pKN40
2から得られた7kbのプラスミドpCP3への『マルチリンカ
ー（multilinker）配列』の挿入を考察しているRemaut
等，上掲を参照されたい。
性遺伝子の配列を容易に取り込むことができる特異的な
制限エンドヌクレアーゼ酵素認識部位が全般に欠如して
いることであった。このような特異的な部位が存在する
場合には，多くの場合マーカー遺伝子の中間に位置し，
外来性遺伝子の挿入と宿主の形質転換の検証の双方を可
能とするために実質上２つの選択可能な表現型マーカー
遺伝子を含むプラスミドの製造を必要とする。Hashimot
o−Gotoh等，上掲を参照されたい。比較のために,pKN40
2から得られた7kbのプラスミドpCP3への『マルチリンカ
ー（multilinker）配列』の挿入を考察しているRemaut
等，上掲を参照されたい。
最初に分離された暴走突然変異株を修飾（modificatio
n）するための相当な努力にもかかわらず，温度感受性
コピー数突然変異体複製特性を持つ，小型で，自己複製
能力をもち，安定性があり，且つ選択可能な環状DNAプ
ラスミドが本技術に欠如している。このような最適なプ
ラスミドは，比較的に少ない基本コピー数（１〜20の範
囲，望ましくは１〜10の範囲）および，比較的に増幅度
が小さな，温度上昇に誘起されたコピー数（100から無
制限の範囲，望ましくは100〜300の範囲）をもち，それ
によって，保持中と暴走状態の誘導中に細胞のエネルギ
ーが過大に消耗されるのを防ぎ，さらに，形質転換した
宿主細胞質への外来性遺伝子生成物のはやすぎる『漏
出』が起きるのを防ぐものであると言える。最適なプラ
スミドは，選択可能なマーカー遺伝子の機能を妨げるこ
となく外来遺伝子を素早く組み込む働きをするDNA配列
を含み，さらにmRNAの転写ターミネータとして働くDNA
配列をもたらすものであろう。後者のDNA配列は，一つ
の遺伝子座にもたらされるが，そこにおいてこれら配列
は，挿入された外来性遺伝子，とりわけ，前述の最適な
プラスミドにおいて選択的にもたらされる強力なプロモ
ーターDNA配列の支配のもとにある外来性遺伝子の転写
を終了させる。
n）するための相当な努力にもかかわらず，温度感受性
コピー数突然変異体複製特性を持つ，小型で，自己複製
能力をもち，安定性があり，且つ選択可能な環状DNAプ
ラスミドが本技術に欠如している。このような最適なプ
ラスミドは，比較的に少ない基本コピー数（１〜20の範
囲，望ましくは１〜10の範囲）および，比較的に増幅度
が小さな，温度上昇に誘起されたコピー数（100から無
制限の範囲，望ましくは100〜300の範囲）をもち，それ
によって，保持中と暴走状態の誘導中に細胞のエネルギ
ーが過大に消耗されるのを防ぎ，さらに，形質転換した
宿主細胞質への外来性遺伝子生成物のはやすぎる『漏
出』が起きるのを防ぐものであると言える。最適なプラ
スミドは，選択可能なマーカー遺伝子の機能を妨げるこ
となく外来遺伝子を素早く組み込む働きをするDNA配列
を含み，さらにmRNAの転写ターミネータとして働くDNA
配列をもたらすものであろう。後者のDNA配列は，一つ
の遺伝子座にもたらされるが，そこにおいてこれら配列
は，挿入された外来性遺伝子，とりわけ，前述の最適な
プラスミドにおいて選択的にもたらされる強力なプロモ
ーターDNA配列の支配のもとにある外来性遺伝子の転写
を終了させる。
要約 本発明は，外来性遺伝子の高レベルの発現を実現するた
めの組み換え手法における抜群に有用なベクターである
新規の環状DNAプラスミドを提供する。
めの組み換え手法における抜群に有用なベクターである
新規の環状DNAプラスミドを提供する。
本発明のプラスミドは，一般に分離したDNA配列からな
り，それら配列は，（１）プラスミドに宿主細胞内で自
己複製する能力を与え，（２）宿主細胞が保持される温
度に関連してプラスミドの自己複製を支配し，（３）宿
主細胞集団の中でのプラスミドの保持を安定させ，
（４）宿主細胞集団内でのプラスミドの保持を表示する
蛋白質生成物の合成を発揮し，（５）プラスミドに固有
の且つ外来性遺伝子DNA配列挿入を促進する複数個の制
限エンドヌクレアーゼの認識部位を順番にもたらし，さ
らに（６）プラスミド内の上記の固有の制限エンドヌク
レアーゼ制限部位に挿入された外来性遺伝子配列のmRNA
転写を終了させる働きをする。
り，それら配列は，（１）プラスミドに宿主細胞内で自
己複製する能力を与え，（２）宿主細胞が保持される温
度に関連してプラスミドの自己複製を支配し，（３）宿
主細胞集団の中でのプラスミドの保持を安定させ，
（４）宿主細胞集団内でのプラスミドの保持を表示する
蛋白質生成物の合成を発揮し，（５）プラスミドに固有
の且つ外来性遺伝子DNA配列挿入を促進する複数個の制
限エンドヌクレアーゼの認識部位を順番にもたらし，さ
らに（６）プラスミド内の上記の固有の制限エンドヌク
レアーゼ制限部位に挿入された外来性遺伝子配列のmRNA
転写を終了させる働きをする。
本発明のプラスミドは，望ましくは5.0キロベースを下
回る大きさ（挿入された外来性遺伝子は全て除く）で，
比較的少ない基本コピー数を有し，さらにこのプラスミ
ドは,mRNA転写の強力なプロモーターをもたらす働きを
するDNA配列を有し，これは機能的に温度感受性リプレ
ッサー配列に関連する。本発明の新規プラスミドの現在
望ましい実施態様の一つはプラスミドpCFM414であり，
このプラスミドはAmerican Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive,Rockville,Marylandに,1983年７
月21に，微生物の寄託に関する合衆国特許と商標事務局
の規定に従って委託され,A.T.C.C.番号40076;プラスミ
ドpCFM424,pCFM510,pCFM511,pCFM512,pCFM516,pCFM517,
pCFM526,pCFM536,pCFM636,pCFM736およびpCFM836と呼ば
れるもので，それらの構造は当業者による重複のために
本明細書において詳細に開示する。形質転換された大腸
菌細胞内において，これらのプラスミド用に基本コピー
数約20あるいはそれ以下を温度34℃未満で保持する。
回る大きさ（挿入された外来性遺伝子は全て除く）で，
比較的少ない基本コピー数を有し，さらにこのプラスミ
ドは,mRNA転写の強力なプロモーターをもたらす働きを
するDNA配列を有し，これは機能的に温度感受性リプレ
ッサー配列に関連する。本発明の新規プラスミドの現在
望ましい実施態様の一つはプラスミドpCFM414であり，
このプラスミドはAmerican Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive,Rockville,Marylandに,1983年７
月21に，微生物の寄託に関する合衆国特許と商標事務局
の規定に従って委託され,A.T.C.C.番号40076;プラスミ
ドpCFM424,pCFM510,pCFM511,pCFM512,pCFM516,pCFM517,
pCFM526,pCFM536,pCFM636,pCFM736およびpCFM836と呼ば
れるもので，それらの構造は当業者による重複のために
本明細書において詳細に開示する。形質転換された大腸
菌細胞内において，これらのプラスミド用に基本コピー
数約20あるいはそれ以下を温度34℃未満で保持する。
本発明のプラスミドは，ヒトのインシュリンに似た発育
因子，ヒトのウロガストロンおよびウシの糖蛋白ホルモ
ンのアルファサブユニットのような様々なポリペプチド
のコードを持つ遺伝子によって例示されるような外来性
構造遺伝子の高レベルの大腸菌発現をもたらす。本発明
の種々の態様および利点は，本発明に関する下記の詳細
な説明により当業者には明白であろう。
因子，ヒトのウロガストロンおよびウシの糖蛋白ホルモ
ンのアルファサブユニットのような様々なポリペプチド
のコードを持つ遺伝子によって例示されるような外来性
構造遺伝子の高レベルの大腸菌発現をもたらす。本発明
の種々の態様および利点は，本発明に関する下記の詳細
な説明により当業者には明白であろう。
詳細な説明 本発明は，一クラスの環状DNAプラスミドベクターを提
供するものであり，これらプラスミドベクターは，本技
術において現在利用可能な温度感受性のコピー数を持つ
突然変異プラスミドの実質的な利点を有するが，前述の
突然変異プラスミドの機能上の欠陥の多くを実質的に持
たないものである。本発明のプラスミドはさらに，温度
感受性暴走プラスミドに現在得られない特性を有し，そ
れら特性は大腸菌による外来性遺伝子生成物の発現を行
う場合に本発明のプラスミドを非常に有用なものとす
る。本発明に従って作成されたプラスミドは，一般に物
理的に分離し（非重複），機能的に共同作用を行うDNA
配列の新規の組合せから成る。
供するものであり，これらプラスミドベクターは，本技
術において現在利用可能な温度感受性のコピー数を持つ
突然変異プラスミドの実質的な利点を有するが，前述の
突然変異プラスミドの機能上の欠陥の多くを実質的に持
たないものである。本発明のプラスミドはさらに，温度
感受性暴走プラスミドに現在得られない特性を有し，そ
れら特性は大腸菌による外来性遺伝子生成物の発現を行
う場合に本発明のプラスミドを非常に有用なものとす
る。本発明に従って作成されたプラスミドは，一般に物
理的に分離し（非重複），機能的に共同作用を行うDNA
配列の新規の組合せから成る。
1.本発明の各プラスミドには，大腸菌の宿主細胞内で自
己複製する能力をプラスミドに与える働きをするDNA配
列を有する。この機能を達成する上で特に適切なDNA配
列は，（１）通常に『RepA』と称される遺伝子，および
（２）『複製の発端』（『ori』）配列から成る。Rep A
遺伝子は，約33,000ダルトンの蛋白質の大腸菌による合
成のコードを有し，前述の蛋白質の大腸菌内の濃度がプ
ラスミドの複製開始事象の数を直接に決定すると考えら
れる。例えば,kollek等のMol.Gen.Genet.,162,pp.51−5
7（1981）およびLight等のE.M.B.O.Journal,２,pp.93−
98（1983）を参照されたい。『ori』配列は,14,000ダル
トンの蛋白質である『Rep A4』のコード配列を含む。
己複製する能力をプラスミドに与える働きをするDNA配
列を有する。この機能を達成する上で特に適切なDNA配
列は，（１）通常に『RepA』と称される遺伝子，および
（２）『複製の発端』（『ori』）配列から成る。Rep A
遺伝子は，約33,000ダルトンの蛋白質の大腸菌による合
成のコードを有し，前述の蛋白質の大腸菌内の濃度がプ
ラスミドの複製開始事象の数を直接に決定すると考えら
れる。例えば,kollek等のMol.Gen.Genet.,162,pp.51−5
7（1981）およびLight等のE.M.B.O.Journal,２,pp.93−
98（1983）を参照されたい。『ori』配列は,14,000ダル
トンの蛋白質である『Rep A4』のコード配列を含む。
2.本発明の各プラスミドは，プラスミドのコピー数の熱
感受性制御を行うDNA配列を含む。例を示すと，ある一
つの適切なコピー数制御配列は，（１）『cop B』のコ
ードを有する遺伝子，および（２）『cop A』配列を含
む。cop B遺伝子は，トランスアクティングリプレッサ
ーとして働く約11,000ダルトンの蛋白質の大腸菌による
生成のコードを定める。cop Bは，細胞の生育状態およ
び機能に基づき，細胞内で生成され，リプレッサーとし
てRep Aの転写のプロモーターの部位あるいはその近く
の部位に結合する。Cop Aは90ヌクレオチドのRNA合成を
発揮する配列である。転写されたRNAは,Rep A蛋白質の
転写の向きに逆に作成され,cop Aは,Rep A配列の前に来
るリーダーmRNA指揮配列に重複する。cop A RNAは，明
らかにRNA−RNAの相互作用によって働き，この相互作用
はRep A蛋白質の翻訳を低減する。他えば,Stougaard等
のProc.nat'1.Acad.Sci.U.S.A.,78,pp.6008−6012（198
1）;Molin等のMol.Gen.Genet.,181pp.123−130（198
1）;Light等のJ.Bacteriol.,151,pp.1129−1135（198
2）;Light等のE.M.B.O.Jounal,２,pp.93−98（1983）を
参照されたい。
感受性制御を行うDNA配列を含む。例を示すと，ある一
つの適切なコピー数制御配列は，（１）『cop B』のコ
ードを有する遺伝子，および（２）『cop A』配列を含
む。cop B遺伝子は，トランスアクティングリプレッサ
ーとして働く約11,000ダルトンの蛋白質の大腸菌による
生成のコードを定める。cop Bは，細胞の生育状態およ
び機能に基づき，細胞内で生成され，リプレッサーとし
てRep Aの転写のプロモーターの部位あるいはその近く
の部位に結合する。Cop Aは90ヌクレオチドのRNA合成を
発揮する配列である。転写されたRNAは,Rep A蛋白質の
転写の向きに逆に作成され,cop Aは,Rep A配列の前に来
るリーダーmRNA指揮配列に重複する。cop A RNAは，明
らかにRNA−RNAの相互作用によって働き，この相互作用
はRep A蛋白質の翻訳を低減する。他えば,Stougaard等
のProc.nat'1.Acad.Sci.U.S.A.,78,pp.6008−6012（198
1）;Molin等のMol.Gen.Genet.,181pp.123−130（198
1）;Light等のJ.Bacteriol.,151,pp.1129−1135（198
2）;Light等のE.M.B.O.Jounal,２,pp.93−98（1983）を
参照されたい。
3.本発明の各プラスミドは，宿主細胞内でのプラスミド
の保持に関与するDNA配列を含む。前述の配列は，普通
は安定した低コピー数大腸菌プラスミドから得られ且つ
プラスミド内のpar遺伝子座と呼ばれ，宿主細胞の分裂
時に少なくとも母細胞内にある各プラスミドのコピーが
娘細胞に配布されるように働く。例えば,Meacock等のCe
ll,20,pp.529−542（1980）を参照されたい。
の保持に関与するDNA配列を含む。前述の配列は，普通
は安定した低コピー数大腸菌プラスミドから得られ且つ
プラスミド内のpar遺伝子座と呼ばれ，宿主細胞の分裂
時に少なくとも母細胞内にある各プラスミドのコピーが
娘細胞に配布されるように働く。例えば,Meacock等のCe
ll,20,pp.529−542（1980）を参照されたい。
4.本発明の各プラスミドは，蛋白質の『マーカー』物質
を生み出す働きをするDNA配列を持ち，このマーカー物
質は宿主細胞内でのプラスミドの保持を示す働きをす
る。一般に，このような配列は，対抗生物質性を与える
蛋白質のコードを持つ。
を生み出す働きをするDNA配列を持ち，このマーカー物
質は宿主細胞内でのプラスミドの保持を示す働きをす
る。一般に，このような配列は，対抗生物質性を与える
蛋白質のコードを持つ。
5.本発明の各プラスミドは，制限エンドヌクレアーゼに
よる分割のための少なくとも２つ，望ましくは３つある
いはそれ以上の認識部位をもたらすDNA配列を含み，こ
れらの認識部位はプラスミドに単独のものであり（すな
わち，プラスミドのその他の領域には存在しない），従
って外来性遺伝子を容易に挿入することが出来る。
よる分割のための少なくとも２つ，望ましくは３つある
いはそれ以上の認識部位をもたらすDNA配列を含み，こ
れらの認識部位はプラスミドに単独のものであり（すな
わち，プラスミドのその他の領域には存在しない），従
って外来性遺伝子を容易に挿入することが出来る。
6.本発明の各プラスミドは，隣接するDNA配列のmRNA転
写のターミネータとして働くDNA配列であり且つこのプ
ラスミド内にあるものを含み，プラスミドに挿入される
外来性遺伝子の転写を終結させる。ウィルスゲノムDNA
の転写されなかった３′領域から一般に得られるこのよ
うなプラスミドの配列は，単に一連の複数個の翻訳終止
コドンから成ることもあり，これらコドンは場合によっ
てはmRNA転写のターミネータとして機能するように思わ
れる。例えば,Gentz等のProc.Nat'1.Acad.Sci.U.S.A.,7
8,pp.4936−4940（1981）およびYanofskyのNature,289,
pp.751−758（1981）を参照されたい。
写のターミネータとして働くDNA配列であり且つこのプ
ラスミド内にあるものを含み，プラスミドに挿入される
外来性遺伝子の転写を終結させる。ウィルスゲノムDNA
の転写されなかった３′領域から一般に得られるこのよ
うなプラスミドの配列は，単に一連の複数個の翻訳終止
コドンから成ることもあり，これらコドンは場合によっ
てはmRNA転写のターミネータとして機能するように思わ
れる。例えば,Gentz等のProc.Nat'1.Acad.Sci.U.S.A.,7
8,pp.4936−4940（1981）およびYanofskyのNature,289,
pp.751−758（1981）を参照されたい。
本発明のプラスミドの上記の別々の機能DNA配列は総
て，望ましくは介在する非機能DNA配列の最小限とし
て，プラスミドの大きさが5Kb以下となるようにし，宿
主細胞のエネルギー源の運用に最大限の効率をもたらす
ようにする。本発明の望ましいプラスミドは，プロモー
ターの制御の働きをし且つプラスミドが担うあるいは宿
主染色体のDNA配列に機能的に関連するmRNA転写のプロ
モーターとして働くDNA配列を含んでもよい。プロモー
ターの機能は，プラスミドのコピー制御と同じように熱
依存性があり，例えば，プラスミドの複製のリプレッシ
ョンを低下させる働きをする熱的刺激は，プロモーター
のリプレッションを解除する働きをする。最適な状態で
は，プラスミドの複製の増進は第１の高温で起こり，さ
らにプロモーターのリプレッション解除は，第２のさら
に高い温度で起こるであろう。このようなプロモーター
／レギューレーターのDNA配列は，本発明のプラスミド
の転写終結配列に隣接し且つ上記の遺伝子挿入を容易に
する一連の特異な制限部位と間隔を保った遺伝子座に設
けることになろう。あるいは，このレギュレーター配列
は，別のプラスミド上に置くかあるいは宿主細胞の染色
体に担わせるもできる。下記の実施例は，本発明のプラ
スミドの組み立てと使用を例示するものである。より具
体的には，実施例１は本発明によるプラスミドpCFM414
の組み立てと特性に関するものであり，実施例２から実
施例４まではそれぞれヒトのインシュリンに似た発育因
子，ヒトのウロガストロンおよびウシの糖蛋白ホルモン
サブユニットのための遺伝子の高レベルの大腸菌発現の
ためのpCFM414の使用に関するものであり，実施例５か
ら実施例７は本発明による温度感受性を有する別のプラ
スミドの組み立ておよび特性に関する。
て，望ましくは介在する非機能DNA配列の最小限とし
て，プラスミドの大きさが5Kb以下となるようにし，宿
主細胞のエネルギー源の運用に最大限の効率をもたらす
ようにする。本発明の望ましいプラスミドは，プロモー
ターの制御の働きをし且つプラスミドが担うあるいは宿
主染色体のDNA配列に機能的に関連するmRNA転写のプロ
モーターとして働くDNA配列を含んでもよい。プロモー
ターの機能は，プラスミドのコピー制御と同じように熱
依存性があり，例えば，プラスミドの複製のリプレッシ
ョンを低下させる働きをする熱的刺激は，プロモーター
のリプレッションを解除する働きをする。最適な状態で
は，プラスミドの複製の増進は第１の高温で起こり，さ
らにプロモーターのリプレッション解除は，第２のさら
に高い温度で起こるであろう。このようなプロモーター
／レギューレーターのDNA配列は，本発明のプラスミド
の転写終結配列に隣接し且つ上記の遺伝子挿入を容易に
する一連の特異な制限部位と間隔を保った遺伝子座に設
けることになろう。あるいは，このレギュレーター配列
は，別のプラスミド上に置くかあるいは宿主細胞の染色
体に担わせるもできる。下記の実施例は，本発明のプラ
スミドの組み立てと使用を例示するものである。より具
体的には，実施例１は本発明によるプラスミドpCFM414
の組み立てと特性に関するものであり，実施例２から実
施例４まではそれぞれヒトのインシュリンに似た発育因
子，ヒトのウロガストロンおよびウシの糖蛋白ホルモン
サブユニットのための遺伝子の高レベルの大腸菌発現の
ためのpCFM414の使用に関するものであり，実施例５か
ら実施例７は本発明による温度感受性を有する別のプラ
スミドの組み立ておよび特性に関する。
実施例１ プラスミドpCFM414は，約4465個の塩基対から成り，単
一のEcoRI制限部位を含み，その３′末端塩基対（C/G）
は，プラスミドの塩基対番号１と呼ばれる。（別に定め
ない限り，制限部位と共にに用いる塩基対番号は，指定
酵素による切断の後に残る分の３′の最初の対である。
下記の表ＩにpCFM414の１から36までの塩基対の配列を
示す。
一のEcoRI制限部位を含み，その３′末端塩基対（C/G）
は，プラスミドの塩基対番号１と呼ばれる。（別に定め
ない限り，制限部位と共にに用いる塩基対番号は，指定
酵素による切断の後に残る分の３′の最初の対である。
下記の表ＩにpCFM414の１から36までの塩基対の配列を
示す。
である。
表Ｉの配列は，総てpCFM414に特有の制限エンドヌクレ
ーゼ酵素HpaI,XbaI,NCoI,HindIII,XhoIおよびBamHIによ
る切断のための一連の認識部位をもたらす塩基対配列を
成す。（製造された表Ｉの配列はxbaI認識部位を含むよ
うに設計されたが,pCFM414をこの酵素で切断する試みで
は均一的な成功は得られなかった。） 転写ターミネイター配列一つがbp37に始まりbp235まで
続く。より具体的には，この配列では，プラスミドpK0I
−Ｔから得られたラムダバクテリオファージの『Toop』
ターイネイターがMboI断片上にあり〔McKenney等,Gene
Amplif.Anal.,２,pp.383−415（1981）を参照のこと，
この断片に『リンカー』対を加えるが，この『リンカ
ー』はBamHI付着端を持つ119bp断片をもたらす。pCFMへ
の組み込み操作において,Toop含有断片の『右側』bamHI
部位は再結合されず，そのために最終的なプラスミド組
み立ての『左側』BamHI部位の特異性が守られる。
ーゼ酵素HpaI,XbaI,NCoI,HindIII,XhoIおよびBamHIによ
る切断のための一連の認識部位をもたらす塩基対配列を
成す。（製造された表Ｉの配列はxbaI認識部位を含むよ
うに設計されたが,pCFM414をこの酵素で切断する試みで
は均一的な成功は得られなかった。） 転写ターミネイター配列一つがbp37に始まりbp235まで
続く。より具体的には，この配列では，プラスミドpK0I
−Ｔから得られたラムダバクテリオファージの『Toop』
ターイネイターがMboI断片上にあり〔McKenney等,Gene
Amplif.Anal.,２,pp.383−415（1981）を参照のこと，
この断片に『リンカー』対を加えるが，この『リンカ
ー』はBamHI付着端を持つ119bp断片をもたらす。pCFMへ
の組み込み操作において,Toop含有断片の『右側』bamHI
部位は再結合されず，そのために最終的なプラスミド組
み立ての『左側』BamHI部位の特異性が守られる。
bp236からbp415にいたるpCFM414のDNA配列は，最終的な
プラスミドを生み出すために使用された中間的な組み立
て手順の残余である。このDNAは，プラスミドpSM2〔Mic
kel等のJ.Bacteriol.,127,pp.644−655（1976）を参照
のこと〕内に,BcllからBglIIまでの断片としてその発端
をもつ。pCFM414組み立ての過程において,bcll部位は，
前記のパラグラフに述べたようにBamHIを末端とする断
片（bp37−235にわたるもの）に結紮した際に喪失し
た。転写ターミネータ配列（bp37−235およびbp236−41
5）は総て,BamHIおよびBglIIの消化によってpCFM414か
ら切出すことが出来る。
プラスミドを生み出すために使用された中間的な組み立
て手順の残余である。このDNAは，プラスミドpSM2〔Mic
kel等のJ.Bacteriol.,127,pp.644−655（1976）を参照
のこと〕内に,BcllからBglIIまでの断片としてその発端
をもつ。pCFM414組み立ての過程において,bcll部位は，
前記のパラグラフに述べたようにBamHIを末端とする断
片（bp37−235にわたるもの）に結紮した際に喪失し
た。転写ターミネータ配列（bp37−235およびbp236−41
5）は総て,BamHIおよびBglIIの消化によってpCFM414か
ら切出すことが出来る。
pCFM414のbp416からbp1259までのDNA配列は,pKN402から
BglIIおよびSalIによる部分的な消化の生成物として得
られたものである。この配列は，大腸菌cop B遺伝子と
そのプロモーター,cop A配列およびRep A遺伝子の一部
の最初の配列を含む。この配列は,BglIIおよびSaIIによ
る部分的な消化によって,pCF414から取り除いてもよ
い。bp1260から2879までのpCFM414配列は，プラスミドN
R1（R100）のPstIおよびSalIによる部分的な消化による
断片として得られたものである〔Rownd等のAnn.N.Y.Aca
d.Sci.,182,pp.188−206（1971）を参照のこと〕。PstI
部位は，先を丸くし，合成SstIリンカーを加えた。この
配列には,Rep Aの合成の行うコドンを含み，且つ『Rep
A4』遺伝子を組み込んだ『ori』配列を含む。bp1260−2
879の配列を含むこの配列は,SalIおよびSstIの消化によ
ってpCFM414から切り出すことが出来る。
BglIIおよびSalIによる部分的な消化の生成物として得
られたものである。この配列は，大腸菌cop B遺伝子と
そのプロモーター,cop A配列およびRep A遺伝子の一部
の最初の配列を含む。この配列は,BglIIおよびSaIIによ
る部分的な消化によって,pCF414から取り除いてもよ
い。bp1260から2879までのpCFM414配列は，プラスミドN
R1（R100）のPstIおよびSalIによる部分的な消化による
断片として得られたものである〔Rownd等のAnn.N.Y.Aca
d.Sci.,182,pp.188−206（1971）を参照のこと〕。PstI
部位は，先を丸くし，合成SstIリンカーを加えた。この
配列には,Rep Aの合成の行うコドンを含み，且つ『Rep
A4』遺伝子を組み込んだ『ori』配列を含む。bp1260−2
879の配列を含むこの配列は,SalIおよびSstIの消化によ
ってpCFM414から切り出すことが出来る。
pCFM414のbp2880から4088までの配列は，βラクタマー
ゼ酵素の大腸菌による生成のコードを持つ遺伝子で，β
ラクタマーゼ酵素は耐アムピシリン表現型を付与するも
のである。この配列は,pBR322のEcoRIによる消化および
部分的なHgaIによる消化の断片としてまず得られた。そ
の後，この遺伝子の内部配列（XmnIおよびBglIの制限部
位にわたる部分）は，プラスミドpUC9のβラクタマーゼ
遺伝子のXmnIからBglIまでの消化断片によって置き換え
られた〔Vieira等のGene,19,pp.259−268（1982）を参
照のこと〕が，この断片はHincIIあるいはPstIの制限部
位をもたらさない。
ゼ酵素の大腸菌による生成のコードを持つ遺伝子で，β
ラクタマーゼ酵素は耐アムピシリン表現型を付与するも
のである。この配列は,pBR322のEcoRIによる消化および
部分的なHgaIによる消化の断片としてまず得られた。そ
の後，この遺伝子の内部配列（XmnIおよびBglIの制限部
位にわたる部分）は，プラスミドpUC9のβラクタマーゼ
遺伝子のXmnIからBglIまでの消化断片によって置き換え
られた〔Vieira等のGene,19,pp.259−268（1982）を参
照のこと〕が，この断片はHincIIあるいはPstIの制限部
位をもたらさない。
pCFM414の塩基対4089から4465までは,HincIIおよびAvaI
による消化断片としてpSC101（A.T.C.C.37032）から得
られた分割調節配列を成す。EcoRIおよびSst Iを用いた
pCFM414の消化によって，塩基対4089から4465までの単
一の断片が得られる。
による消化断片としてpSC101（A.T.C.C.37032）から得
られた分割調節配列を成す。EcoRIおよびSst Iを用いた
pCFM414の消化によって，塩基対4089から4465までの単
一の断片が得られる。
下記の表IIは,pCFM414の組成の要約を表にしたものであ
る。角括弧内に示す制限エンドヌクレアーゼの認識部位
の表示は，特定の断片を得る際に関連した部位を示すも
ので，これらの部位は，プラスミドの組み立ての前に平
滑端化によって破壊されるか，あるいは粘着性の末端と
結合する過程で『喪失』されて完全な制限部位を回復す
ることのないものである。
る。角括弧内に示す制限エンドヌクレアーゼの認識部位
の表示は，特定の断片を得る際に関連した部位を示すも
ので，これらの部位は，プラスミドの組み立ての前に平
滑端化によって破壊されるか，あるいは粘着性の末端と
結合する過程で『喪失』されて完全な制限部位を回復す
ることのないものである。
上記の特定の配列の組み込みは，大きさが4.5キロベー
ス未満のpCFM414の組み立てを可能としたが，同一の機
能特性を備えた代替DNA配列を本発明のプラスミドに組
み込むことが可能なことは明らかである。但し，利用可
能な別の配列の使用は,DNAを『保存』するとは考えにく
い。
ス未満のpCFM414の組み立てを可能としたが，同一の機
能特性を備えた代替DNA配列を本発明のプラスミドに組
み込むことが可能なことは明らかである。但し，利用可
能な別の配列の使用は,DNAを『保存』するとは考えにく
い。
ラムダバクテリオファージから得られた『Toop』以外の
転写終止配列は，例えば,Adhya等のAnn.Rev.Biochem.,4
7,pp.967−996（1978）に記載された配列の中から適当
に選択してもよい。pSC101の遺伝子座『par』以外の安
定化あるいは分割保存機能をもたらすDNA配列の供給源
の説明については,Som等のPlasmid,５,pp.150およびそ
れ次の頁（1981）,Nordstrom等のPlasmid,４,pp.215お
よびその次の頁（1980），並びにMcKell等の（Abstrac
t）347頁,J.Supramolecular Structure Supp.No.4,9th
Annual ICN−UCLA Symposium（1980）を参照されたい。
本発明のプラスミドの自己複製を行う働きをする『or
i』およびRepA4遺伝子配列の代替供給源には,Rosen等の
Mol.Gen.Genet.,179,pp.527−537（1981）に記載されて
いるものを含む。プラスミドNRIは,CopA DNA配列および
CopB遺伝子の代替供給源となる。
転写終止配列は，例えば,Adhya等のAnn.Rev.Biochem.,4
7,pp.967−996（1978）に記載された配列の中から適当
に選択してもよい。pSC101の遺伝子座『par』以外の安
定化あるいは分割保存機能をもたらすDNA配列の供給源
の説明については,Som等のPlasmid,５,pp.150およびそ
れ次の頁（1981）,Nordstrom等のPlasmid,４,pp.215お
よびその次の頁（1980），並びにMcKell等の（Abstrac
t）347頁,J.Supramolecular Structure Supp.No.4,9th
Annual ICN−UCLA Symposium（1980）を参照されたい。
本発明のプラスミドの自己複製を行う働きをする『or
i』およびRepA4遺伝子配列の代替供給源には,Rosen等の
Mol.Gen.Genet.,179,pp.527−537（1981）に記載されて
いるものを含む。プラスミドNRIは,CopA DNA配列および
CopB遺伝子の代替供給源となる。
Stougaard等のMol.Gen.Genet.,181,pp.116−122（198
1）を参照されたい。
1）を参照されたい。
大腸菌細胞（例えば,K−12株 AM7,JM103等）の形質転換
後,34℃未満（すなわち30℃）に保たれた細胞内のpCFM4
14のコピー数は20である。培養液温度を34℃を上廻る温
度に（すなわち37℃）まで高めると，細胞が死ぬまで複
製が抑制されずに継続する。概して,30℃から37℃まで
培養液の温度を上昇させると,15分毎にコピー数は倍加
する。30℃から42℃まで温度を上昇させると，約12分毎
にコピー数は倍加する。
後,34℃未満（すなわち30℃）に保たれた細胞内のpCFM4
14のコピー数は20である。培養液温度を34℃を上廻る温
度に（すなわち37℃）まで高めると，細胞が死ぬまで複
製が抑制されずに継続する。概して,30℃から37℃まで
培養液の温度を上昇させると,15分毎にコピー数は倍加
する。30℃から42℃まで温度を上昇させると，約12分毎
にコピー数は倍加する。
下記の実施例は,pCFM414を用いて，ウシの糖蛋白ホルモ
ンのアルファサブユニットのコードを持つ遺伝子の大腸
菌による発現を得ることに関する。
ンのアルファサブユニットのコードを持つ遺伝子の大腸
菌による発現を得ることに関する。
実施例２ ウシの糖蛋白ホルモンに共通のアルファサブユニットの
直接的な大腸菌による発現に用いるために,2つのプラス
ミドを作り，さらにこれらのプラスミドを用いて，代表
的な遺伝子の発現におけるpCF414効果を試験した。第一
のプラスミドpBα−E2は， アルファサブユニットポリペプチド用のcDNAから得た構
造遺伝子を,trpプロモーターと共に含むものであった。
第二のプラスミドpBα−E3は,pBα−E2のプロモーター
および構造遺伝子配列の総てを,EcoRIおよびBamHIによ
って消化されたプラスミドpCFM414に組み込んで作成し
た。
直接的な大腸菌による発現に用いるために,2つのプラス
ミドを作り，さらにこれらのプラスミドを用いて，代表
的な遺伝子の発現におけるpCF414効果を試験した。第一
のプラスミドpBα−E2は， アルファサブユニットポリペプチド用のcDNAから得た構
造遺伝子を,trpプロモーターと共に含むものであった。
第二のプラスミドpBα−E3は,pBα−E2のプロモーター
および構造遺伝子配列の総てを,EcoRIおよびBamHIによ
って消化されたプラスミドpCFM414に組み込んで作成し
た。
pBα−E2で形質転換した大腸菌AM7細胞の増殖により，
約2.5mg/0Dリットルの望みのポリペプチドが得られた。
pBα−E3で形質転換した大腸菌AM7細胞は，最初に培養
液温度を28℃にし，その後37℃に高めて増殖させた。pB
α−E3で形質転換したAM7細胞が生成した望みのポリペ
プチドの量は，ゲルクロマトグラフィーによると，約25
mg/0Dリットルであると推定された。これはpBα−E2で
形質転換したAM7細胞の生成物の約10倍に当たる。
約2.5mg/0Dリットルの望みのポリペプチドが得られた。
pBα−E3で形質転換した大腸菌AM7細胞は，最初に培養
液温度を28℃にし，その後37℃に高めて増殖させた。pB
α−E3で形質転換したAM7細胞が生成した望みのポリペ
プチドの量は，ゲルクロマトグラフィーによると，約25
mg/0Dリットルであると推定された。これはpBα−E2で
形質転換したAM7細胞の生成物の約10倍に当たる。
下記の実施例は,pCFM414を用いて，ヒトのウロガストロ
ンのアルファサブユニットのコードを持つ遺伝子の大腸
菌による発現を行うことに関する。
ンのアルファサブユニットのコードを持つ遺伝子の大腸
菌による発現を行うことに関する。
実施例３ この実施例は,Banks等によって1983年４月25日に受理さ
れた共同所有，同時継続の米国出願番号486,091〔1983
年11月24日に公開された特許協力条約国際公開番号W083
/04030〕『ウロガストロンとポリペプチドの類似体のた
めの遺伝子の製造および発現』において示した実験デー
タを要約したものである。簡潔に述べると，ヒトのウロ
ガストロンの直接的な大腸菌による発現を行うのに用い
る２つの重要なプラスミドを作成した。第一のプラスミ
ドpADH−25は，ウロガストロン用の製造された構造遺伝
子を,trpプラスミドと共に含むものであった。第二のプ
ラスミドpADH−59は,pADH−25のプロモーターおよび構
造遺伝子の総てを,EcoRIおよびXhoIによって消化された
pCFM414に組み込んで作成した。
れた共同所有，同時継続の米国出願番号486,091〔1983
年11月24日に公開された特許協力条約国際公開番号W083
/04030〕『ウロガストロンとポリペプチドの類似体のた
めの遺伝子の製造および発現』において示した実験デー
タを要約したものである。簡潔に述べると，ヒトのウロ
ガストロンの直接的な大腸菌による発現を行うのに用い
る２つの重要なプラスミドを作成した。第一のプラスミ
ドpADH−25は，ウロガストロン用の製造された構造遺伝
子を,trpプラスミドと共に含むものであった。第二のプ
ラスミドpADH−59は,pADH−25のプロモーターおよび構
造遺伝子の総てを,EcoRIおよびXhoIによって消化された
pCFM414に組み込んで作成した。
pADH−25で形質転換した大腸菌JM103細胞の増殖によ
り，ラジオレセプターアッセイによると，約15ミクログ
ラム/0Dリットルの望みのポリペプチドが生成された。p
ADH−59で形質転換した大腸菌JM103細胞は，最初の温度
が約30℃，その後37℃まで温度を上げた培養液中で増殖
させた。pADH−59で形質転換したJM103細胞が生成した
望みのポリペプチドの量は，ゲルクロマトグラフィーに
よると，約50mg/0Dリットルであると推定され，これはp
ADH−25で形質転換したJM103細胞が生成した量の100倍
を軽く上回る。下記の実施例は,pCHM414を用いて，ヒト
のインシュリンに似た発育因子のアルファサブユニット
のコードを持つ遺伝子の大腸菌による発現を行うことに
関する。
り，ラジオレセプターアッセイによると，約15ミクログ
ラム/0Dリットルの望みのポリペプチドが生成された。p
ADH−59で形質転換した大腸菌JM103細胞は，最初の温度
が約30℃，その後37℃まで温度を上げた培養液中で増殖
させた。pADH−59で形質転換したJM103細胞が生成した
望みのポリペプチドの量は，ゲルクロマトグラフィーに
よると，約50mg/0Dリットルであると推定され，これはp
ADH−25で形質転換したJM103細胞が生成した量の100倍
を軽く上回る。下記の実施例は,pCHM414を用いて，ヒト
のインシュリンに似た発育因子のアルファサブユニット
のコードを持つ遺伝子の大腸菌による発現を行うことに
関する。
実施例４ この実施例は,1983年８月10日に受理された共同所有，
同時継続の米国出願番号521,966『インシュリン様の発
育因子の微生物発言』，且つ1984年７月26日に受理され
たBanks等によるその一部継続米国出願番号633,451に記
載された実験データを要約するものである。簡潔に述べ
ると，インシュリン様の発育因子の大腸菌発現を行うの
に用いる２つの重要なプラスミドを作成した。第一のプ
ラスミドpT5−４−IGF−Ｉは，ポリペプチド用の製造さ
れた構造遺伝子を，合成プロモーターと共に含むもので
あった。第二のプラスミドpADP−233は,pT5−４−IGF−
Ｉのプロモーターおよび構造遺伝子配列の総てを,HindI
IIおよびXhoIによって消化されたpCFM414に組み込んで
作成した。
同時継続の米国出願番号521,966『インシュリン様の発
育因子の微生物発言』，且つ1984年７月26日に受理され
たBanks等によるその一部継続米国出願番号633,451に記
載された実験データを要約するものである。簡潔に述べ
ると，インシュリン様の発育因子の大腸菌発現を行うの
に用いる２つの重要なプラスミドを作成した。第一のプ
ラスミドpT5−４−IGF−Ｉは，ポリペプチド用の製造さ
れた構造遺伝子を，合成プロモーターと共に含むもので
あった。第二のプラスミドpADP−233は,pT5−４−IGF−
Ｉのプロモーターおよび構造遺伝子配列の総てを,HindI
IIおよびXhoIによって消化されたpCFM414に組み込んで
作成した。
pT5−４−IGF−Ｉで形質転換した大腸菌JM103細胞の増
殖により,10Dリットル当たり約２ミクログラムの望みの
ポリペプチドが生成された。pADP−223で形質転換した
大腸菌JM103細胞は，温度を最初28℃に，その後37℃に
まで高めた培養液中で増殖させた。
殖により,10Dリットル当たり約２ミクログラムの望みの
ポリペプチドが生成された。pADP−223で形質転換した
大腸菌JM103細胞は，温度を最初28℃に，その後37℃に
まで高めた培養液中で増殖させた。
pADP−233で形質転換した大腸菌JM103細胞による望みの
ポリペプチドの生成物の量は，ゲルクロマトグラフィー
によると,10Dリットル当たり約５ミクログラムであると
推定された。これは,pT5−４−IGF−Ｉで形質転換した
大腸菌JM103細胞の生成量の約２倍にあたる。
ポリペプチドの生成物の量は，ゲルクロマトグラフィー
によると,10Dリットル当たり約５ミクログラムであると
推定された。これは,pT5−４−IGF−Ｉで形質転換した
大腸菌JM103細胞の生成量の約２倍にあたる。
下記の実施例は，本発明に従うプラスミドの代替構造に
関する。
関する。
実施例５ 最初の一連のプラスミドは,pCFM414を基に組み立てたも
のであり，主にコピー制御領域における変更に拘わる。
これらのプラスミドは,pCFM510,pCFM512,pCFM516および
pCFM517と呼ばれるものであり，それらの調製法を以下
に示す。
のであり，主にコピー制御領域における変更に拘わる。
これらのプラスミドは,pCFM510,pCFM512,pCFM516および
pCFM517と呼ばれるものであり，それらの調製法を以下
に示す。
A.pCFM510 プラスミドpCFM414をBglIIおよびPstIで消化して，（pK
N402から得られた）Cop AおよびCop B領域を欠失させ，
大きな断片を残した。プラスミドNRlを,BglIIおよびPst
Iで消化し,NRlCop AおよびCop B配列を含む小さな断片
を分離してpCFM414の大きな断片と結紮してpCFM510を得
た。従ってこのプラスミドは，主にNRIのCop A,Cop B,
『Rep A』および『ori』配列の全体から成り，さらにpC
FM414の塩基対（4465）よりも６個多い塩基対（4471）
をもつ。
N402から得られた）Cop AおよびCop B領域を欠失させ，
大きな断片を残した。プラスミドNRlを,BglIIおよびPst
Iで消化し,NRlCop AおよびCop B配列を含む小さな断片
を分離してpCFM414の大きな断片と結紮してpCFM510を得
た。従ってこのプラスミドは，主にNRIのCop A,Cop B,
『Rep A』および『ori』配列の全体から成り，さらにpC
FM414の塩基対（4465）よりも６個多い塩基対（4471）
をもつ。
B.pCFM511 プラスミドpCFM414をBglIIおよびPstIで消化して，（pK
N402から得られた）Cop AおよびCop B領域を欠失させ，
大きな断片を残した。pR12から誘導したプラスミドpSMI
（Stougaard等のMolec.Gen.Genet.,181,pp.116−122（1
981）およびRosenC等MoIec.Gen.Genet.,179,pp.527−53
7（1980）を参照のこと〕を,BglIIおよびPstIで消化し,
pSM1 Cop AおよびCop B配列を含む小さな断片を分離し
てpCFM414の大きな断片を結紮してpCFM511を得た。従っ
てこのプラスミドは，主にpSMlのCop AおよびCop B配
列，並びにNRlの『Rep A』および『ori』配列から成
り，さらにpCFM414の塩基対（4465）よりも６個多い塩
基対（4471）をもつ。
N402から得られた）Cop AおよびCop B領域を欠失させ，
大きな断片を残した。pR12から誘導したプラスミドpSMI
（Stougaard等のMolec.Gen.Genet.,181,pp.116−122（1
981）およびRosenC等MoIec.Gen.Genet.,179,pp.527−53
7（1980）を参照のこと〕を,BglIIおよびPstIで消化し,
pSM1 Cop AおよびCop B配列を含む小さな断片を分離し
てpCFM414の大きな断片を結紮してpCFM511を得た。従っ
てこのプラスミドは，主にpSMlのCop AおよびCop B配
列，並びにNRlの『Rep A』および『ori』配列から成
り，さらにpCFM414の塩基対（4465）よりも６個多い塩
基対（4471）をもつ。
C.pCFM512 プラスミドpCFM414をXmnIおよびPstIで部分的に消化し
て,pCFM414の（pKN402から得た）Cop A配列を欠失さ
せ，大きな断片を残した。プラスミドNRlを,XmnIおよび
PstIで消化して,Cop A配列を含む小さな断片を分離して
pCFM414の大きな断片と結紮しpCFM5122を得た。従って
このプラスミドは，主にNRIのCop A領域,Beu 1のCop B
領域およびNR1の『Rep A』および『ori』配列から成る
ものであった。このプラスミドは,pCFM414と同じ数（44
65）の塩基対を持つ。Cop B mRNAを転写するプロモータ
ーは，単一の塩基対突然変異（部位435）を有し，それ
はC/GよりむしろT/Aのものである。この突然変異は，温
度感受性コピー数表現型のもとになる。
て,pCFM414の（pKN402から得た）Cop A配列を欠失さ
せ，大きな断片を残した。プラスミドNRlを,XmnIおよび
PstIで消化して,Cop A配列を含む小さな断片を分離して
pCFM414の大きな断片と結紮しpCFM5122を得た。従って
このプラスミドは，主にNRIのCop A領域,Beu 1のCop B
領域およびNR1の『Rep A』および『ori』配列から成る
ものであった。このプラスミドは,pCFM414と同じ数（44
65）の塩基対を持つ。Cop B mRNAを転写するプロモータ
ーは，単一の塩基対突然変異（部位435）を有し，それ
はC/GよりむしろT/Aのものである。この突然変異は，温
度感受性コピー数表現型のもとになる。
D.pCFM516およびpCFM517 上記パート（Ｃ）で作成されたプラスミドpCFM512をヒ
ドロキシルアミンによって突然変異生成を行い,Cop B蛋
白質情報伝達領域の単一塩基対（598）をC/GからT/Aに
変更した。プラスミドpCFM516は，この単一塩基対の突
然変異（アミノ酸の遺伝情報をアラニンからバリンに効
率的に変更する）を含んだ。プラスミドpCFM517は，領
域848および1282の間にある少なくとも一つのまだ解明
されていない塩基対突然変異を含んだ。
ドロキシルアミンによって突然変異生成を行い,Cop B蛋
白質情報伝達領域の単一塩基対（598）をC/GからT/Aに
変更した。プラスミドpCFM516は，この単一塩基対の突
然変異（アミノ酸の遺伝情報をアラニンからバリンに効
率的に変更する）を含んだ。プラスミドpCFM517は，領
域848および1282の間にある少なくとも一つのまだ解明
されていない塩基対突然変異を含んだ。
実施例６ 実施例１のプラスミドのpCFM414,および実施例５のプラ
スミドpCFM510,pCFM511,pCFM512,pCM516およびpCFM517
をスクリーニングして，宿主細胞増殖の指数増殖期と定
常期のプラスミドのコピー数の特性および蛋白質生成物
の発現を確認した。
スミドpCFM510,pCFM511,pCFM512,pCM516およびpCFM517
をスクリーニングして，宿主細胞増殖の指数増殖期と定
常期のプラスミドのコピー数の特性および蛋白質生成物
の発現を確認した。
コンサンセス白血球インターフェロンポリペプチドのコ
ードの生成のコードを持つ蛋白質ΑαCon−１−IFNを，
プラスミドに挿入するための『モデル』配列として用い
た。翻訳の開始のために最適化したShine−Delgarno配
列を先に持ち且つラムダバクテリオファージフロモータ
ーを持つαCon−１−IFN配列を,EcoRI/BamHIで消化した
各プラスミドに挿入した。
ードの生成のコードを持つ蛋白質ΑαCon−１−IFNを，
プラスミドに挿入するための『モデル』配列として用い
た。翻訳の開始のために最適化したShine−Delgarno配
列を先に持ち且つラムダバクテリオファージフロモータ
ーを持つαCon−１−IFN配列を,EcoRI/BamHIで消化した
各プラスミドに挿入した。
各プラスミドを,pSC101から得られた別のプラスミドと
共に用いて，大腸菌FM3の宿主の同時形質転換を行っ
た。前述の別のプラスミドは,PLリプレッサー蛋白質CI8
57のコードを持つ遺伝子を含む1.1kb（BglIIからPstI）
ラムダバクテリオファージのDNA断片でクロンを発生さ
せたものであった。42℃においてCI857蛋白質は不活性
となり,PLプロモーターに転写の開始を促す。
共に用いて，大腸菌FM3の宿主の同時形質転換を行っ
た。前述の別のプラスミドは,PLリプレッサー蛋白質CI8
57のコードを持つ遺伝子を含む1.1kb（BglIIからPstI）
ラムダバクテリオファージのDNA断片でクロンを発生さ
せたものであった。42℃においてCI857蛋白質は不活性
となり,PLプロモーターに転写の開始を促す。
Ｌブロス＋50ug/mlアムピシリンの一晩おいた新鮮な培
養液から得た各プラスミトの宿主システムをＬブロスに
接種し,28℃で指数光学密度の中間密度まで生育させ
た。（≦1.0 0D 600nm Beckmanスペクトロホトメー
タ）。細胞のアリコート（2.0 0Dml）を採取し，コピー
数を調べ且つ蛋白質ゲル分析を行った。この培養液は,L
ブロモで低細胞濃度まで希釈し,42℃で４時間増殖させ
た。細胞のアリコート（2 0Dml）を再び採取し，コピー
数を調べ且つ蛋白質のゲル分析を行った。
養液から得た各プラスミトの宿主システムをＬブロスに
接種し,28℃で指数光学密度の中間密度まで生育させ
た。（≦1.0 0D 600nm Beckmanスペクトロホトメー
タ）。細胞のアリコート（2.0 0Dml）を採取し，コピー
数を調べ且つ蛋白質ゲル分析を行った。この培養液は,L
ブロモで低細胞濃度まで希釈し,42℃で４時間増殖させ
た。細胞のアリコート（2 0Dml）を再び採取し，コピー
数を調べ且つ蛋白質のゲル分析を行った。
下記の表IIIは，異なる増殖温度における相対的なプラ
スミドのコピー数／宿主ゲノム当量を要約したものであ
る。プラスミドのコピー数は，プラスミドDNAを2 0Dml
の細胞ペレットから分離し（アルカリ溶解産物手法），
さらにDNA量/0Dmlを既にコピー数が分かっている標準プ
ラスミド（pCFM511,コピー数は20）と比較して概略的に
計算する。
スミドのコピー数／宿主ゲノム当量を要約したものであ
る。プラスミドのコピー数は，プラスミドDNAを2 0Dml
の細胞ペレットから分離し（アルカリ溶解産物手法），
さらにDNA量/0Dmlを既にコピー数が分かっている標準プ
ラスミド（pCFM511,コピー数は20）と比較して概略的に
計算する。
表IIIの右側の欄は，αCon−１−IFN配列を含むプラス
ミドに用いて宿主細胞を形質転換した場合に得られたプ
ラスミドのコピー数の変化を表示したものである。宿主
細胞の蛋白質生成物を分析した結果，望みのポリペプチ
ドは,pCFM510で形質転換した細胞の全細胞蛋白質の14〜
17％を占め,pCFM511で形質転換した細胞の全細胞蛋白質
の25〜30％，さらにpCFM414,pCFM516およびpCFM517で形
質転換した細胞の全細胞蛋白質の60〜70％を占めること
が判明した。
ミドに用いて宿主細胞を形質転換した場合に得られたプ
ラスミドのコピー数の変化を表示したものである。宿主
細胞の蛋白質生成物を分析した結果，望みのポリペプチ
ドは,pCFM510で形質転換した細胞の全細胞蛋白質の14〜
17％を占め,pCFM511で形質転換した細胞の全細胞蛋白質
の25〜30％，さらにpCFM414,pCFM516およびpCFM517で形
質転換した細胞の全細胞蛋白質の60〜70％を占めること
が判明した。
実施例７ 本発明によるさらに幾つかのプラスミドは，（ａ）pCFM
414に存在する特異な制限部位の数を増やし，ないしは
（ｂ）プロモーター配列を，リボソーム付着配列を持つ
ベクターと持たないベクターに組み込み，ないしは
（ｃ）pCFM414の耐アムピシリン性のβラクタマーゼマ
ーカー遺伝子を別の耐抗生物質性のマーカー遺伝子に変
える目的で設計した。新規に設計したプラスミドは,pCF
M424,pCFM526,pCFM536,pCFM636,pCFM736およびpCFM836
と呼び，その調整法は下記の通りである。
414に存在する特異な制限部位の数を増やし，ないしは
（ｂ）プロモーター配列を，リボソーム付着配列を持つ
ベクターと持たないベクターに組み込み，ないしは
（ｃ）pCFM414の耐アムピシリン性のβラクタマーゼマ
ーカー遺伝子を別の耐抗生物質性のマーカー遺伝子に変
える目的で設計した。新規に設計したプラスミドは,pCF
M424,pCFM526,pCFM536,pCFM636,pCFM736およびpCFM836
と呼び，その調整法は下記の通りである。
A.pCFM42 プラスミドpCFM414の誘導物であるpCFM424は，約4628個
の塩基対から成り，下記のものを含む。
の塩基対から成り，下記のものを含む。
（１） 塩基対37から4465までのpCFM414配列の全体。
（２） ラムダバクテリオファージPLプロモーター，お
よび （３） 制限エンドヌクレアーゼ酵素の認識部位の拡張
『バンク』および多数の『終止』コドンをもたらす塩基
対の隣接配列。
よび （３） 制限エンドヌクレアーゼ酵素の認識部位の拡張
『バンク』および多数の『終止』コドンをもたらす塩基
対の隣接配列。
より具体的に述べると，下記の表IVに示す199塩基対の
配列を用いて,pCFM414の１−36を占める塩基対の配列に
置き換える。
配列を用いて,pCFM414の１−36を占める塩基対の配列に
置き換える。
表IVの配列には，総てがpCFM424に特異な制限エンドヌ
クレアーゼ酵素HgiA,ClaI,HpaI,XbaI,NcoI,HindIII,XHo
I,BamHIおよびSstIIによる切断のための一連の認識部位
を示した塩基対配列が見られる。
クレアーゼ酵素HgiA,ClaI,HpaI,XbaI,NcoI,HindIII,XHo
I,BamHIおよびSstIIによる切断のための一連の認識部位
を示した塩基対配列が見られる。
さらに,BglIIおよびHgiA二よる消化によって130塩基対
断片としてプラスミドpKC30から誘導したラムダPLプロ
モーター配列〔例えば,Shimatake等のNature,292,pp.12
8−132（1981）を参照のこと〕は,pCFM424の，安定化遺
伝子配列の後で且つ制限部位『バンク』の前にある遺伝
子座に位置する。組み込み手順においては,EcoRIリンカ
ーをpCFM414のBglII粘着性末端に付加する。
断片としてプラスミドpKC30から誘導したラムダPLプロ
モーター配列〔例えば,Shimatake等のNature,292,pp.12
8−132（1981）を参照のこと〕は,pCFM424の，安定化遺
伝子配列の後で且つ制限部位『バンク』の前にある遺伝
子座に位置する。組み込み手順においては,EcoRIリンカ
ーをpCFM414のBglII粘着性末端に付加する。
pCFM424で形質転換した宿主内のPLプロモーターの制御
は,C1857リプレッサー遺伝子を用いた幾つかの手法で行
うことができる。その一例として，大腸菌の菌種K12ΔH
trpは，この遺伝子を細菌の染色体に組み込まれてお
り，宿主となることができる。
は,C1857リプレッサー遺伝子を用いた幾つかの手法で行
うことができる。その一例として，大腸菌の菌種K12ΔH
trpは，この遺伝子を細菌の染色体に組み込まれてお
り，宿主となることができる。
Bernard等のGene,５,pp.59−76（1979）を参照された
い。代替法としては,,この遺伝子は,1.1KbのPstIからBg
lIIまでの断片として，ラムダバクテリオファージDNAか
ら分離することができる。この遺伝子は,pCFM424を用い
て適切な宿主『同時形質転換』できる適切な低コピー数
プラスミドに挿入することができる。この断片はさら
に，転座配列のなかに入れて，選択されたいかなる宿主
大腸菌菌種の染色体にも組み込むことができる。
い。代替法としては,,この遺伝子は,1.1KbのPstIからBg
lIIまでの断片として，ラムダバクテリオファージDNAか
ら分離することができる。この遺伝子は,pCFM424を用い
て適切な宿主『同時形質転換』できる適切な低コピー数
プラスミドに挿入することができる。この断片はさら
に，転座配列のなかに入れて，選択されたいかなる宿主
大腸菌菌種の染色体にも組み込むことができる。
プラスミドpCFM424は，選択された外来性遺伝子の熱に
誘起された発現を可能とし，且つその利用によって,pCF
M414がもたらす以上の望みのポリペプチド生成物を大量
にもたらすものと期待される。
誘起された発現を可能とし，且つその利用によって,pCF
M414がもたらす以上の望みのポリペプチド生成物を大量
にもたらすものと期待される。
B.pCFM526 プラスミドpCFM526は,pCFM516の誘起物として調整さ
れ，塩基対１から36までの制限部位バンク配列の欠失，
および表Ｖに示す223個の塩基対配列の挿入の点でpCFM5
16と異なる。
れ，塩基対１から36までの制限部位バンク配列の欠失，
および表Ｖに示す223個の塩基対配列の挿入の点でpCFM5
16と異なる。
このように,pCFM526の設計は,PLプロモーター，特異な
制限部位の拡張したバンク（pCFM414と比較して），お
よびプロモーターと制限バンクの主要な構成部位の中間
にあるリボソーム付着配列を含むことがわかる。
制限部位の拡張したバンク（pCFM414と比較して），お
よびプロモーターと制限バンクの主要な構成部位の中間
にあるリボソーム付着配列を含むことがわかる。
C.pCFM536 プラスミドpCFM536も,pCFM516の誘起物として調整さ
れ，塩基対１から36までの制限部位バンク配列の欠失，
および表VIに示す191個の塩基対配配列の挿入の点でpCF
M516と異なる。
れ，塩基対１から36までの制限部位バンク配列の欠失，
および表VIに示す191個の塩基対配配列の挿入の点でpCF
M516と異なる。
このように,pCFM536の設計は，リボソーム付着配列が存
在しないこと以外は,pCFM526の設計と類似していること
がわかる。
在しないこと以外は,pCFM526の設計と類似していること
がわかる。
D.pCFM636 プラスミドpCFM636は,pCFM536の誘導物として調整さ
れ，耐アトピシリン性のマーカーの代わりに耐カナマイ
シン性のマーカー遺伝子を組み込むように構成された。
βラクタマーゼ遺伝子は，最初にSstIおよびEcoRI（PL
プロモーターの前のEcoRI部位，部分的）を用いて消化
し，このEcoRI部位は，もとのG/C塩基対を省いてEcoRI
部位を『殺す』リンカーによってAatII部位に変換させ
る。これはマーカー遺伝子だけでなく，『par』すなわ
ち安定化配列全体を欠失させる働きをする。カナマイシ
ン遺伝子配列は,Beck等のGene,19,pp.337−336（198
2），あるいはAuerswald等のCold Spring Harbor Symp.
Quant.Biol.,45,pp.107−113（1981）に示されるプラス
ミドTn5からSmaIからHindIIIまでの断片として得ること
ができ，且つSstIリンカーをSmaIの粘着末端に，且つNd
eIリンカーをHindIIIの粘着末端に加えることによっ
て，上記のpCFM536のSstI/EcoRI消化の大きな断片に挿
入できるようにする。『par』遺伝子座配列は，実施例
１同様に,pSC101のHincIIからAvaIまでの消化断片とし
て得てもよい。カナマイシン遺伝子と組み合わせ且つpC
FM536の大きな断片に挿入するためには，末端HincIIを
最初にSaIIリンカーで，その後AatIIリンカーで処理す
る。部位AvaIは，最初にBamHIリンカーで，その後NdeI
リンカーで処理する。pCFM536の大きな断片（AatII/Sst
I），カナマイシン遺伝子の断片（SstI/NdeI）およびpa
r遺伝子座断片（AatII/NdeI）を混ぜ合わせて結紮し,pC
FM636を形成する。
れ，耐アトピシリン性のマーカーの代わりに耐カナマイ
シン性のマーカー遺伝子を組み込むように構成された。
βラクタマーゼ遺伝子は，最初にSstIおよびEcoRI（PL
プロモーターの前のEcoRI部位，部分的）を用いて消化
し，このEcoRI部位は，もとのG/C塩基対を省いてEcoRI
部位を『殺す』リンカーによってAatII部位に変換させ
る。これはマーカー遺伝子だけでなく，『par』すなわ
ち安定化配列全体を欠失させる働きをする。カナマイシ
ン遺伝子配列は,Beck等のGene,19,pp.337−336（198
2），あるいはAuerswald等のCold Spring Harbor Symp.
Quant.Biol.,45,pp.107−113（1981）に示されるプラス
ミドTn5からSmaIからHindIIIまでの断片として得ること
ができ，且つSstIリンカーをSmaIの粘着末端に，且つNd
eIリンカーをHindIIIの粘着末端に加えることによっ
て，上記のpCFM536のSstI/EcoRI消化の大きな断片に挿
入できるようにする。『par』遺伝子座配列は，実施例
１同様に,pSC101のHincIIからAvaIまでの消化断片とし
て得てもよい。カナマイシン遺伝子と組み合わせ且つpC
FM536の大きな断片に挿入するためには，末端HincIIを
最初にSaIIリンカーで，その後AatIIリンカーで処理す
る。部位AvaIは，最初にBamHIリンカーで，その後NdeI
リンカーで処理する。pCFM536の大きな断片（AatII/Sst
I），カナマイシン遺伝子の断片（SstI/NdeI）およびpa
r遺伝子座断片（AatII/NdeI）を混ぜ合わせて結紮し,pC
FM636を形成する。
E.pCFM736 プラスミドpCFM736は,pCFM636の誘導物として調整し，
短縮されたPLプロモーター配列を含む。このプラスミド
は,AatIIおよびXbaIを用いたpCFM636の消化と下記のAat
IIからXbaIまでの断片に挿入によって調整する。
短縮されたPLプロモーター配列を含む。このプラスミド
は,AatIIおよびXbaIを用いたpCFM636の消化と下記のAat
IIからXbaIまでの断片に挿入によって調整する。
この手順は,pCFM636に存在する２番目の部位HpaIを欠失
させることに注意されたい。
させることに注意されたい。
F.pCFM836 プラスミドpCFM836は,pCFM736の誘導物として組み立て
られ，その目的は，制限部位SstIIを制限部位bankに加
え,3種のナンセンスコドンすなわち『終止』コドンを加
え，且つ耐カナマイシン性遺伝子に存在する部位NcoIを
『殺す』ことにある。このプラスミドは,BamHIを用いた
pCFM736の消化と下記の断片の挿入によって製造するこ
とができる。
られ，その目的は，制限部位SstIIを制限部位bankに加
え,3種のナンセンスコドンすなわち『終止』コドンを加
え，且つ耐カナマイシン性遺伝子に存在する部位NcoIを
『殺す』ことにある。このプラスミドは,BamHIを用いた
pCFM736の消化と下記の断片の挿入によって製造するこ
とができる。
カナマイシン耐性遺伝子内の部位NcoIの破壊は，カナマ
イシン耐性遺伝子によって指定されるカルボキシ末端ロ
イシンから76アミノ酸ほど上流のトレオニン残基用のコ
ドン部位限定突然変異生成によって行い，具体的には,A
CCコドンからACTコドンへの変換によって行う。
イシン耐性遺伝子によって指定されるカルボキシ末端ロ
イシンから76アミノ酸ほど上流のトレオニン残基用のコ
ドン部位限定突然変異生成によって行い，具体的には,A
CCコドンからACTコドンへの変換によって行う。
実施例６に示す発現システムの場合（プラスミドに挿入
された例示用外来性遺伝子にPLプロモーターが伴った）
と同様に,PLプロモーターあるいは短縮されたPLプロモ
ーターを含むように設計された上記プラスミドが関連す
る発現システムの最適化には，システムにC1857遺伝子
を伴うことが必要である。
された例示用外来性遺伝子にPLプロモーターが伴った）
と同様に,PLプロモーターあるいは短縮されたPLプロモ
ーターを含むように設計された上記プラスミドが関連す
る発現システムの最適化には，システムにC1857遺伝子
を伴うことが必要である。
上記の本発明の種々の変更態様および変化は，当業者に
対して起こることが予測される。その結果として，添付
する請求の範囲に示される限定のみを本発明に設ける。
対して起こることが予測される。その結果として，添付
する請求の範囲に示される限定のみを本発明に設ける。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｆ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (6)
- 【請求項１】外来性遺伝子の大腸菌発現を行うための組
換え方法において形質転換ベクターとして用いるDNAプ
ラスミドであって、前記プラスミドが； （ａ）該プラスミドに自己複製する能力を付与する、re
pA遺伝子と複製開始点を含んだDNA配列； （ｂ）宿主細胞をある温度で保持させた際に、宿主細胞
を異なる温度で保持させた際の基底コピー数と比較し
て、コピー数を向上させるが暴走させないようプラスミ
ド複製を制限するCop配列； （ｃ）宿主細胞集団におけるプラスミドの保持を安定さ
せるpar遺伝子座をコードするDNA配列； （ｄ）宿主細胞集団における抗生物質耐性を付与する、
タンパク質生成物を合成するヌクレオチド配列； （ｅ）該プラスミドに特異な、個別の一連の制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位；および （ｆ）外来性遺伝子配列の転写のターミネータ； を含む、ことを特徴とするDNAプラスミド。 - 【請求項２】複数の特異な制限エンドヌクレアーゼ認識
部位を提供する前記DNA配列に近接する遺伝子座に、mRN
A転写のプロモーターをさらに含む特許請求の範囲第１
項に記載のプラスミド。 - 【請求項３】前記RNA転写のプロモーターが、ラムダPL
プロモーターである特許請求の範囲第２項に記載のプラ
スミド。 - 【請求項４】前記mRNA転写のプロモーターと機能的に関
連する熱応答性のリプレッサーDNAをさらに含む特許請
求の範囲第２項に記載のプラスミド。 - 【請求項５】前記プラスミドが、5,000塩基対より少な
い塩基対を含む特許請求の範囲第１項に記載のプラスミ
ド。 - 【請求項６】前記プラスミドが、プラスミドpCFM414、
プラスミドpCFM424、プラスミドpCFM510、プラスミドpC
FM511、プラスミドpCFM512、プラスミドpCFM516、プラ
スミドpCFM526、プラスミドpCFM536、プラスミドpCFM63
6、プラスミドpCFM736、およびプラスミドpCFM836から
なるグループから選択されたプラスミドである特許請求
の範囲第１項に記載のプラスミド。
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| US636727 | 1984-08-06 | ||
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Publications (2)
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Family Applications (1)
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