JPH0644880B2 - 目標核酸配列の試験方法およびキット - Google Patents
目標核酸配列の試験方法およびキットInfo
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- JPH0644880B2 JPH0644880B2 JP60279367A JP27936785A JPH0644880B2 JP H0644880 B2 JPH0644880 B2 JP H0644880B2 JP 60279367 A JP60279367 A JP 60279367A JP 27936785 A JP27936785 A JP 27936785A JP H0644880 B2 JPH0644880 B2 JP H0644880B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6862—Ligase chain reaction [LCR]
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
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- Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は各種核酸試料における特別のヌクレオチドの配
列、より詳細には標準的配列から単一の塩基対における
相違により特徴付けられる配列を含むものの検出に関す
る。
列、より詳細には標準的配列から単一の塩基対における
相違により特徴付けられる配列を含むものの検出に関す
る。
近年、多くの人の病気が遺伝的突然変異に直接に原因を
辿ることが出来ることが判明した。幾つかの通常知られ
ている例としては、嚢胞性線繊症、筋ジストロフィー、
テイーサックス病、血友病、フェニルケトン尿症、及び
鎌状赤血球性貧血などが挙げられる。５００を越える認
識された遺伝病のうち、多くのものは単一の塩基対の突
然変異に原因を辿ることが出来る。
辿ることが出来ることが判明した。幾つかの通常知られ
ている例としては、嚢胞性線繊症、筋ジストロフィー、
テイーサックス病、血友病、フェニルケトン尿症、及び
鎌状赤血球性貧血などが挙げられる。５００を越える認
識された遺伝病のうち、多くのものは単一の塩基対の突
然変異に原因を辿ることが出来る。
これらの単一塩基対突然変異を直接に検出するための二
つの重要な技術が従来開発されている。しかしながら、
これらの手法のいずれも容易に自動化することが出来な
い。自動化技術は労働時間を減少し、必要とされる技能
の程度を減少する潜在能力を有するので望ましく、信頼
性を増大する。これらの従来技術の第一番目のものにお
いて患者における突然変異の存在又は不存在はサザン
（Ｓouthern）ブロッティングを用いた患者のＤＮＡの
制限消化物の分析により検出される〔Ｅ．サザン「ゲル
電気泳動により分離されたＤＮＡ断片中の特別の配列の
検出（Ｄetectio of Ｓpecific Ｓequences Ａmong
ＤＮＡ Ｆragments Ｓeparated by ＧelＥlectrophor
esis）」、Ｊournal of Ｍolecular Ｂiology，98,(19
75) 、503 〕。例えば、鎌状赤血球性貧血病はヘモグロ
ビンのβ−グロビン鎖中の位置６においてトリプレット
ＧＡＧによりコード化されているグルタミン酸残基をＧ
ＡＧによりコード化されるバリン残基に変更する突然変
異に生ずるものである。β−グロビン遺伝子の塩基配列
におけるＡからＴへの突然変異において、酵素ＭstII
（並びにその他の制限酵素）のための制限部位が除去さ
れる。従って、鎌状赤血球性ヘモグロビン突然変異は鎌
状赤血球及び正常のＤＮＡをＭstIIで消化し、サザンブ
ロッティングを用いて制限断片を識別することにより検
出することができる。正常のＤＮＡは1,1 キロベース長
のＭstII断片を発生するのに対して、鎌状赤血球のＤＮ
Ａは1,3 キロベース長の断片を発生する。
つの重要な技術が従来開発されている。しかしながら、
これらの手法のいずれも容易に自動化することが出来な
い。自動化技術は労働時間を減少し、必要とされる技能
の程度を減少する潜在能力を有するので望ましく、信頼
性を増大する。これらの従来技術の第一番目のものにお
いて患者における突然変異の存在又は不存在はサザン
（Ｓouthern）ブロッティングを用いた患者のＤＮＡの
制限消化物の分析により検出される〔Ｅ．サザン「ゲル
電気泳動により分離されたＤＮＡ断片中の特別の配列の
検出（Ｄetectio of Ｓpecific Ｓequences Ａmong
ＤＮＡ Ｆragments Ｓeparated by ＧelＥlectrophor
esis）」、Ｊournal of Ｍolecular Ｂiology，98,(19
75) 、503 〕。例えば、鎌状赤血球性貧血病はヘモグロ
ビンのβ−グロビン鎖中の位置６においてトリプレット
ＧＡＧによりコード化されているグルタミン酸残基をＧ
ＡＧによりコード化されるバリン残基に変更する突然変
異に生ずるものである。β−グロビン遺伝子の塩基配列
におけるＡからＴへの突然変異において、酵素ＭstII
（並びにその他の制限酵素）のための制限部位が除去さ
れる。従って、鎌状赤血球性ヘモグロビン突然変異は鎌
状赤血球及び正常のＤＮＡをＭstIIで消化し、サザンブ
ロッティングを用いて制限断片を識別することにより検
出することができる。正常のＤＮＡは1,1 キロベース長
のＭstII断片を発生するのに対して、鎌状赤血球のＤＮ
Ａは1,3 キロベース長の断片を発生する。
サザンブロット技術の詳細は下記の通りである。先ず、
試料ＤＮＡを制限酵素（この場合にはＭstII）を用いて
切断し、得られた断片をそれらの大きさに基づいて典型
的にはアガロースゲル電気泳動により分離する。このゲ
ルを次いでニトロセルロース片上に置き、適当な緩衝液
の流れをゲル中に電気泳動の方向とは直角にニトロセル
ロースフィルターに向って作り出す。この流れがＤＮＡ
断片をゲルからフィルター上に運び出し、フィルター上
にそれらが結合し、その結果ゲル中のＤＮＡ断片の分布
がニトロセルロース上に複製される。このＤＮＡを次い
で変性し、フィルター上に固定する。検討中の配列に相
補的な放射線でラベルされたプローブを次いでフィルタ
ーにハイブリッド化し、プローブは検討中の配列を含有
する特別の断片にハイブリッド化する。ニトロセルロー
スフィルターのオートラジオグラフィーが次いでどの断
片が検討中の配列を含むかを明らかにし、各断片はその
分子量に応じて固定される。この技術の一つの変法はニ
トロセルロースフィルター上で行う代りに、ハイブリッ
ド化及びオートラジオグラフィーをゲル中で直接に行う
方法がある。又、得られる断片の一つが対象となる突然
変異部位を含有するならば、その他の制限酵素も使用す
ることができる。
試料ＤＮＡを制限酵素（この場合にはＭstII）を用いて
切断し、得られた断片をそれらの大きさに基づいて典型
的にはアガロースゲル電気泳動により分離する。このゲ
ルを次いでニトロセルロース片上に置き、適当な緩衝液
の流れをゲル中に電気泳動の方向とは直角にニトロセル
ロースフィルターに向って作り出す。この流れがＤＮＡ
断片をゲルからフィルター上に運び出し、フィルター上
にそれらが結合し、その結果ゲル中のＤＮＡ断片の分布
がニトロセルロース上に複製される。このＤＮＡを次い
で変性し、フィルター上に固定する。検討中の配列に相
補的な放射線でラベルされたプローブを次いでフィルタ
ーにハイブリッド化し、プローブは検討中の配列を含有
する特別の断片にハイブリッド化する。ニトロセルロー
スフィルターのオートラジオグラフィーが次いでどの断
片が検討中の配列を含むかを明らかにし、各断片はその
分子量に応じて固定される。この技術の一つの変法はニ
トロセルロースフィルター上で行う代りに、ハイブリッ
ド化及びオートラジオグラフィーをゲル中で直接に行う
方法がある。又、得られる断片の一つが対象となる突然
変異部位を含有するならば、その他の制限酵素も使用す
ることができる。
しかしながら、鎌状赤血球病に使用されるこの直接サザ
ンブロッド手法は突然変異が制限部位を変更させない遺
伝病例えばα１−抗トリブシン欠陥における如く肺気腫
或いは乳児肝硬変を発達させる大きな増加したリスクに
曝す遺伝病に対しては使用することができない。その場
合には、突然変異遺伝子は残基３４２におけるアミノ酸
置換（ＧＬＵ→ＬＹＳ）に導く単一の塩基変化（Ｇ→
Ａ）を有し、それにより非機能的蛋白質を生成する。し
かしながら、この置換は鎌状赤血球性貧血におけるよう
な現在知られている制限酵素のいづれに対する制限部位
を創出或いは破壊するものではない。従って、変化した
制限部位を探索するための制限断片の直截的分析は可能
ではない。しかしながら、この状況において用いること
のできる技術が開発された。〔「合成オリゴヌクレオチ
ドとのハイブリッド化による鎌状赤血球βｓ−グロビン
対立遺伝子の検出（Ｄetection of Ｓicklecell βｓ−
globin Ａllele by Ｈybridization with Ｓyntheti
c Ｏligonucleotides）」ブレンダ Ｊ、コナー等（Ｂ
reda Ｊ、Ｃonner et al.）、Ｐroc.Ｎatl. Ａcad.
Ｓci. Ｖol.80 、pp．278 −282（1983年１月)、及び
「遺伝子内の突然変異部位の直接分析によるα１−抗ト
リプシン欠陥の出生前の診断（Ｐrenatal Ｄiagnosis o
f α１−Ａntitrypsin Ｄeficiency by Ｄirect Ａ
nalysis of the Ｍutation Ｓite in the Ｇene）」
ヴィンセントＪ．キッド等（Ｖincent Ｊ．Ｋidd et a
l）、Ｎew Ｅngland Ｊournal of Ｍedicine.Ｖol.
310、No.10（1984年３月）を参照〕。この第二の技術は
突然変異部位の周りの正常なα１−抗トリプシン配列に
相補的な１９−塩基長のオリゴヌクレオチド（以下１９
−量体と称する）を合成するものである。この１９−量
体はラベルされ、それが完全に相補的である正常な遺伝
子には１９−量体が安定にハイブリッド化するが、しか
し、単一の塩基対不適合を有する突然変異遺伝子とはハ
イブリッド化しないレベルにハイブリッド化のストリン
ジェンシーを上昇させることにより正常な遺伝子を突然
変異遺伝子から識別するプローブとして使用される。
（ストリンジェンシーとは核酸が付される二本鎖を分解
させる条件例えば温度、イオン強度及び添加物例えばホ
ルムアミドの濃度などの条件の組合わせを意味する。二
本鎖をより分解させやすい条件は「より高い」ストリン
ジェンシー例えばより高い温度より高いイオン強度及び
より高いホルムアミドの濃度と称される。）同様に、正
常な遺伝子の代りに突然変異遺伝子を検出したい場合に
は突然変異部位の周りの突然変異α１−抗トリプシン配
列に相補的な１９−量体が用いられる。従って、サザン
ブロット分析において興味の対象となる配列に相補的な
合成プローブを使用し、ストリンジェンシーを変えるこ
とにより正常及び突然変異遺伝子を区別することができ
る。
ンブロッド手法は突然変異が制限部位を変更させない遺
伝病例えばα１−抗トリブシン欠陥における如く肺気腫
或いは乳児肝硬変を発達させる大きな増加したリスクに
曝す遺伝病に対しては使用することができない。その場
合には、突然変異遺伝子は残基３４２におけるアミノ酸
置換（ＧＬＵ→ＬＹＳ）に導く単一の塩基変化（Ｇ→
Ａ）を有し、それにより非機能的蛋白質を生成する。し
かしながら、この置換は鎌状赤血球性貧血におけるよう
な現在知られている制限酵素のいづれに対する制限部位
を創出或いは破壊するものではない。従って、変化した
制限部位を探索するための制限断片の直截的分析は可能
ではない。しかしながら、この状況において用いること
のできる技術が開発された。〔「合成オリゴヌクレオチ
ドとのハイブリッド化による鎌状赤血球βｓ−グロビン
対立遺伝子の検出（Ｄetection of Ｓicklecell βｓ−
globin Ａllele by Ｈybridization with Ｓyntheti
c Ｏligonucleotides）」ブレンダ Ｊ、コナー等（Ｂ
reda Ｊ、Ｃonner et al.）、Ｐroc.Ｎatl. Ａcad.
Ｓci. Ｖol.80 、pp．278 −282（1983年１月)、及び
「遺伝子内の突然変異部位の直接分析によるα１−抗ト
リプシン欠陥の出生前の診断（Ｐrenatal Ｄiagnosis o
f α１−Ａntitrypsin Ｄeficiency by Ｄirect Ａ
nalysis of the Ｍutation Ｓite in the Ｇene）」
ヴィンセントＪ．キッド等（Ｖincent Ｊ．Ｋidd et a
l）、Ｎew Ｅngland Ｊournal of Ｍedicine.Ｖol.
310、No.10（1984年３月）を参照〕。この第二の技術は
突然変異部位の周りの正常なα１−抗トリプシン配列に
相補的な１９−塩基長のオリゴヌクレオチド（以下１９
−量体と称する）を合成するものである。この１９−量
体はラベルされ、それが完全に相補的である正常な遺伝
子には１９−量体が安定にハイブリッド化するが、しか
し、単一の塩基対不適合を有する突然変異遺伝子とはハ
イブリッド化しないレベルにハイブリッド化のストリン
ジェンシーを上昇させることにより正常な遺伝子を突然
変異遺伝子から識別するプローブとして使用される。
（ストリンジェンシーとは核酸が付される二本鎖を分解
させる条件例えば温度、イオン強度及び添加物例えばホ
ルムアミドの濃度などの条件の組合わせを意味する。二
本鎖をより分解させやすい条件は「より高い」ストリン
ジェンシー例えばより高い温度より高いイオン強度及び
より高いホルムアミドの濃度と称される。）同様に、正
常な遺伝子の代りに突然変異遺伝子を検出したい場合に
は突然変異部位の周りの突然変異α１−抗トリプシン配
列に相補的な１９−量体が用いられる。従って、サザン
ブロット分析において興味の対象となる配列に相補的な
合成プローブを使用し、ストリンジェンシーを変えるこ
とにより正常及び突然変異遺伝子を区別することができ
る。
この後者の技術は直截的であるが、特に自動化操作が望
まれる場合には困難を伴わない訳ではない。一般的に、
適合及び不適合プローブの両者は制限酵素により切出さ
れた断片にハイブリッド形成を行い、適合プローブは１
９塩基の全てにおいて結合し、不適合プローブはせいぜ
い１８塩基において結合する。従って、二つのプローブ
間の結合エネルギーにおける相対的な相違は極めて小さ
い。この様に、ストリンジェンシーにおける変化は適合
プローブも又解離することなく不適合プローブを解離す
るように十分に微妙でなければならない。これはおそら
く用いられた合成ＤＮＡプローブと幾分類似のヒトのゲ
ノムにおけるＤＮＡ配列による高分子量ＤＮＡによる１
９−量体プローブの相当な保持がなかったならば技術の
自動化に関しては問題とならないであろうが、しかし、
これは確実性をもって述べることはできない。α１−抗
トリプシン遺伝子と対比した幾分類似の配列のこの大過
剰は実験結果を曖昧にするものであり、如何なる自動化
技術においてもバックグラウンドノイズとして取扱わな
ければならず、現在、試料のゲル電気泳動及びサザンブ
ロッティングにかけることにより解決されている。（上
記キッド等により報告されたα１−抗トリプシン検出体
系に対するサザンブロットを示す第１Ａ図及び１Ｂ図参
照。）この特別の場合において、このバックグラウンド
は予め開発された制限地図が2.4 キロベースにおけるバ
ンドのみが関連性があることを示したので診断を妨害し
なかった。しかしながら、実際に結合されるプローブの
殆んどは2.4 キロベースバンド中にないことが判る。こ
の場合には時間及び労力のかかる制限消化及び電気泳動
を行って興味の対象となるＤＮＡ配列2.4 キローベース
断片をＤＮＡの全体から分離してそれによりバックグラ
ウンドの問題を本質的に除去する。
まれる場合には困難を伴わない訳ではない。一般的に、
適合及び不適合プローブの両者は制限酵素により切出さ
れた断片にハイブリッド形成を行い、適合プローブは１
９塩基の全てにおいて結合し、不適合プローブはせいぜ
い１８塩基において結合する。従って、二つのプローブ
間の結合エネルギーにおける相対的な相違は極めて小さ
い。この様に、ストリンジェンシーにおける変化は適合
プローブも又解離することなく不適合プローブを解離す
るように十分に微妙でなければならない。これはおそら
く用いられた合成ＤＮＡプローブと幾分類似のヒトのゲ
ノムにおけるＤＮＡ配列による高分子量ＤＮＡによる１
９−量体プローブの相当な保持がなかったならば技術の
自動化に関しては問題とならないであろうが、しかし、
これは確実性をもって述べることはできない。α１−抗
トリプシン遺伝子と対比した幾分類似の配列のこの大過
剰は実験結果を曖昧にするものであり、如何なる自動化
技術においてもバックグラウンドノイズとして取扱わな
ければならず、現在、試料のゲル電気泳動及びサザンブ
ロッティングにかけることにより解決されている。（上
記キッド等により報告されたα１−抗トリプシン検出体
系に対するサザンブロットを示す第１Ａ図及び１Ｂ図参
照。）この特別の場合において、このバックグラウンド
は予め開発された制限地図が2.4 キロベースにおけるバ
ンドのみが関連性があることを示したので診断を妨害し
なかった。しかしながら、実際に結合されるプローブの
殆んどは2.4 キロベースバンド中にないことが判る。こ
の場合には時間及び労力のかかる制限消化及び電気泳動
を行って興味の対象となるＤＮＡ配列2.4 キローベース
断片をＤＮＡの全体から分離してそれによりバックグラ
ウンドの問題を本質的に除去する。
遺伝病を含む殆んどの状況においてその様な制限地図は
既に利用可能であるので、上記技術は極めて一般的に適
用可能である。しかしながら、その様な技術は先の鎌状
赤血球病に用いられた技術が容易に自動化されないと同
様に容易には自動化されない。必要とされるのは制限酵
素、ゲル電気泳動或いは時間のかかるオートラジオグラ
フィーの使用を必要としないヌクレオチド配列間の単一
の塩基対相違を検出するための容易に自動化可能な技術
である。
既に利用可能であるので、上記技術は極めて一般的に適
用可能である。しかしながら、その様な技術は先の鎌状
赤血球病に用いられた技術が容易に自動化されないと同
様に容易には自動化されない。必要とされるのは制限酵
素、ゲル電気泳動或いは時間のかかるオートラジオグラ
フィーの使用を必要としないヌクレオチド配列間の単一
の塩基対相違を検出するための容易に自動化可能な技術
である。
発明の概要 本発明は容易に自動化することのできる遺伝異常或いは
その他の遺伝状態の診断方法を提供する。この方法はゲ
ノム内の多くの関連のない位置に見出される或る特別の
診断配列がこれらの関連性のない位置における同一の配
列或いは同様な隣接配列から存在することの低い確率を
利用するものである。診断及び隣接配列の両者が存在す
ることを要求することにより、診断配列の偽りの結合に
より引起こされるバックグラウンドノイズが除去され、
電気泳動或いはクロマトグラフィーなどの技術を用いる
がバックグラウンドからの関連配列を分離する必要が除
去される。
その他の遺伝状態の診断方法を提供する。この方法はゲ
ノム内の多くの関連のない位置に見出される或る特別の
診断配列がこれらの関連性のない位置における同一の配
列或いは同様な隣接配列から存在することの低い確率を
利用するものである。診断及び隣接配列の両者が存在す
ることを要求することにより、診断配列の偽りの結合に
より引起こされるバックグラウンドノイズが除去され、
電気泳動或いはクロマトグラフィーなどの技術を用いる
がバックグラウンドからの関連配列を分離する必要が除
去される。
一つの面において、本発明は変性核酸の試料における目
標配列を試験する方法を提供し、それは診断プローブが
目標配列を含む試料核酸にのみ実質的に結合して残る条
件下において、変性核酸を目標配列の診断部分に相補的
なプローブ（診断プローブ）及び診断部分に隣接したヌ
クレオチド配列に相補的なプローブ（隣接プローブ）と
共に処理し、診断プローブと隣接プローブを共有結合的
に結合して目標配列に相補的な目標プローブ与え、結合
されなかったプローブを除去する工程を含む。好ましく
は、少なくとも一つのプローブはラベルされる。このよ
うにして、目標配列の存在或いは不存在は、例えば試料
核酸−目標プローブ二本鎖を溶融し、分解した目標プロ
ーブを溶出させ、ラベルを試験することによって、試験
することができる。
標配列を試験する方法を提供し、それは診断プローブが
目標配列を含む試料核酸にのみ実質的に結合して残る条
件下において、変性核酸を目標配列の診断部分に相補的
なプローブ（診断プローブ）及び診断部分に隣接したヌ
クレオチド配列に相補的なプローブ（隣接プローブ）と
共に処理し、診断プローブと隣接プローブを共有結合的
に結合して目標配列に相補的な目標プローブ与え、結合
されなかったプローブを除去する工程を含む。好ましく
は、少なくとも一つのプローブはラベルされる。このよ
うにして、目標配列の存在或いは不存在は、例えば試料
核酸−目標プローブ二本鎖を溶融し、分解した目標プロ
ーブを溶出させ、ラベルを試験することによって、試験
することができる。
もう一つの手法においては、試験は先ず共有結合的に結
合しなかったプローブを除去することなくラベルされな
いプローブにラベルされた目標プローブがフックを捕捉
することにより回収されるようにフックを取付けること
により達成される。
合しなかったプローブを除去することなくラベルされな
いプローブにラベルされた目標プローブがフックを捕捉
することにより回収されるようにフックを取付けること
により達成される。
いずれの場合においても、ラベルがアッセイにおいて現
われるためには診断プローブ及び隣接プローブの両者の
存在が必要とされる。これはサザンブロット技術により
達成された予め大きさ分離により分離されていたバック
グラウンドを除去する。従って、従来技術の主な欠点が
除去された。即ち、制限酵素による処理が必要とされず
ゲル電気泳動が必要とされず又オートラジオグラフィー
も必要とされない。
われるためには診断プローブ及び隣接プローブの両者の
存在が必要とされる。これはサザンブロット技術により
達成された予め大きさ分離により分離されていたバック
グラウンドを除去する。従って、従来技術の主な欠点が
除去された。即ち、制限酵素による処理が必要とされず
ゲル電気泳動が必要とされず又オートラジオグラフィー
も必要とされない。
上記方法は遺伝病特に単一塩基対突然変異により生ずる
遺伝病の検出に直接に適用可能であり、正常及び異常配
列の各々が目標配列とされる試験からの比較結果により
より精密にされる。例えば、この実施態様において一つ
が正常遺伝子のための及び一つが突然変異遺伝子のため
の二つの診断プローブを合成し、上記方法を各プローブ
に独立に行われる。正常遺伝子に対してホモ接合体の個
人からのＤＮＡは正常遺伝子に特異的なプローブに対し
て高いカウントのラベルを示し、突然変異遺伝子に対し
て特異的な遺伝子には低いカウントを示す。同様に、突
然変異遺伝子に対してホモ接合体の個人からのＤＮＡは
突然変異遺伝子に特異的なプローブに対しては高いカウ
ントを示し、正常プローブには低いカウントを示す。ヘ
テロ接合体の個人は正常プローブ及び突然変異プローブ
の両者に対して同等であり、ホモ接合体及びヘテロ接合
体個人に対する高カウント及び低カウントの中間である
カウントを示す。一つのみの診断プローブ好ましくは興
味の対象となる突然変異配列に特異的なプローブの使用
も又可能である。前記一般的方法を用いてホモ接合体正
常、ホモ接合体突然変異及びヘテロ接合体の個人に対応
して予想されるラベルの量を知るようにこの検出方法の
検量を先ず行う。次いでこの方法を試料ＤＮＡについて
行い、検出ラベルの量を検量と対比する。
遺伝病の検出に直接に適用可能であり、正常及び異常配
列の各々が目標配列とされる試験からの比較結果により
より精密にされる。例えば、この実施態様において一つ
が正常遺伝子のための及び一つが突然変異遺伝子のため
の二つの診断プローブを合成し、上記方法を各プローブ
に独立に行われる。正常遺伝子に対してホモ接合体の個
人からのＤＮＡは正常遺伝子に特異的なプローブに対し
て高いカウントのラベルを示し、突然変異遺伝子に対し
て特異的な遺伝子には低いカウントを示す。同様に、突
然変異遺伝子に対してホモ接合体の個人からのＤＮＡは
突然変異遺伝子に特異的なプローブに対しては高いカウ
ントを示し、正常プローブには低いカウントを示す。ヘ
テロ接合体の個人は正常プローブ及び突然変異プローブ
の両者に対して同等であり、ホモ接合体及びヘテロ接合
体個人に対する高カウント及び低カウントの中間である
カウントを示す。一つのみの診断プローブ好ましくは興
味の対象となる突然変異配列に特異的なプローブの使用
も又可能である。前記一般的方法を用いてホモ接合体正
常、ホモ接合体突然変異及びヘテロ接合体の個人に対応
して予想されるラベルの量を知るようにこの検出方法の
検量を先ず行う。次いでこの方法を試料ＤＮＡについて
行い、検出ラベルの量を検量と対比する。
発明の具体的説明 以下の説明の目的のために次の定義を使用する。
「目標配列」はその存在或いは不存在を検出させること
が望まれる核酸配列である。本発明の方法の好ましい応
用においては、それは遺伝病例えば鎌状赤血球性貧血な
どに伴う遺伝子内のコード化領域の部分を形成する配列
である。多くのその様な病気において、遺伝的異常型の
存在はコード化配列における小さな変化により特徴付け
られ、最も頻繁には正常な個人は遺伝的「欠陥」を有す
る個人に存在する対応する配列からの１個のみのヌクレ
オチドが異る配列を有する。本発明の方法において、正
常或いは変更配列のいづれを目標配列として使用するこ
とができる。
が望まれる核酸配列である。本発明の方法の好ましい応
用においては、それは遺伝病例えば鎌状赤血球性貧血な
どに伴う遺伝子内のコード化領域の部分を形成する配列
である。多くのその様な病気において、遺伝的異常型の
存在はコード化配列における小さな変化により特徴付け
られ、最も頻繁には正常な個人は遺伝的「欠陥」を有す
る個人に存在する対応する配列からの１個のみのヌクレ
オチドが異る配列を有する。本発明の方法において、正
常或いは変更配列のいづれを目標配列として使用するこ
とができる。
「診断部分」はその存在或いは不存在を検出すべきヌク
レオチド修正を含む目標配列の部分を指す。
レオチド修正を含む目標配列の部分を指す。
「隣接部分」は診断部分として選ばれた配列部分のヌク
レオチド配列の続きであるＤＮＡの配列を指す。この連
続はいづれの方向でもあり得る。
レオチド配列の続きであるＤＮＡの配列を指す。この連
続はいづれの方向でもあり得る。
以下の開示内容に基づき目標配列の存在或いは不存在を
区別するヌクレオチドを含まなければならない他は選ば
れる診断部分の正確な位置は任意であることが認識され
る。即ち、この隣接部分はこの任意に選ばれた診断部分
の配列に連続するものである。
区別するヌクレオチドを含まなければならない他は選ば
れる診断部分の正確な位置は任意であることが認識され
る。即ち、この隣接部分はこの任意に選ばれた診断部分
の配列に連続するものである。
プローブ及び変性ＤＮＡにおける「ハイブリッド化」及
び「結合」は互換可能に用いられる。変性ＤＮＡにハイ
ブリッド化或いは結合されたプローブはポリヌクレオチ
ドの相補的配列に集められる。或る特別のプローブがポ
リヌクレオチドに集められて残るかどうかは相補性の程
度、プローブの長さ及び結合条件のストリンジェンシー
によって異る。ストリンジェンシーが高ければ高い程相
補性の程度及び／又はプローブの長さがより高くなけれ
ばならない。
び「結合」は互換可能に用いられる。変性ＤＮＡにハイ
ブリッド化或いは結合されたプローブはポリヌクレオチ
ドの相補的配列に集められる。或る特別のプローブがポ
リヌクレオチドに集められて残るかどうかは相補性の程
度、プローブの長さ及び結合条件のストリンジェンシー
によって異る。ストリンジェンシーが高ければ高い程相
補性の程度及び／又はプローブの長さがより高くなけれ
ばならない。
「共有的に結合させる」とは二つの物質間に共有的科学
結合を形成させることを指す。
結合を形成させることを指す。
「連結させる」とは二つのポリヌクレオチド配列を共有
結合的に結合させて単一の配列を形成することを指す。
これは典型的には一つの配列の５′末端と他方の３′末
端の間のホスホジエステル結合の形成を解媒するリガー
ゼにより処理することにより行われる。しかしながら、
本発明においては「連結させる」という用語はその様な
配列を共有結合的に結合させるその他の方法例えば化学
的手段をも包含するものであり、「共有結合的に結合さ
せる」及び「連結させる」という用語は互換可能に使用
される。
結合的に結合させて単一の配列を形成することを指す。
これは典型的には一つの配列の５′末端と他方の３′末
端の間のホスホジエステル結合の形成を解媒するリガー
ゼにより処理することにより行われる。しかしながら、
本発明においては「連結させる」という用語はその様な
配列を共有結合的に結合させるその他の方法例えば化学
的手段をも包含するものであり、「共有結合的に結合さ
せる」及び「連結させる」という用語は互換可能に使用
される。
「プローブ」は探索される変性核酸中においてその長さ
に関連して配列に十分に相補的であり選ばれたストリン
ジェンシー条件下において結合されるように設計された
オリゴヌクレオチドを指す。
に関連して配列に十分に相補的であり選ばれたストリン
ジェンシー条件下において結合されるように設計された
オリゴヌクレオチドを指す。
「診断プローブ」とは診断部分に相補的であるプローブ
を指す。
を指す。
「隣接プローブ」とは隣接部分に相補的であるプローブ
を指す。
を指す。
「目標プローブ」とは目標配列に相補的であり診断プロ
ーブと隣接プローブを共有結合的に結合させて（連結さ
せて）作られるプローブを指す。
ーブと隣接プローブを共有結合的に結合させて（連結さ
せて）作られるプローブを指す。
「フック」とは実験者がフックを「捕捉する」ことによ
りこの修飾を含むプローブを迅速且つ便利に単離するこ
とを可能にするプローブの修飾を指す。フックと捕捉機
構の間の相互作用は例えば共有結合或いは十分な緊密さ
のリガンドレセプター結合であり得る。その様なフック
としては抗体により回収することのできる抗原、相補的
核酸により回収することのできる特異的ＤＮＡ配列及び
適当な反応基により回収できる特別の反応性化学基など
が挙げられる。
りこの修飾を含むプローブを迅速且つ便利に単離するこ
とを可能にするプローブの修飾を指す。フックと捕捉機
構の間の相互作用は例えば共有結合或いは十分な緊密さ
のリガンドレセプター結合であり得る。その様なフック
としては抗体により回収することのできる抗原、相補的
核酸により回収することのできる特異的ＤＮＡ配列及び
適当な反応基により回収できる特別の反応性化学基など
が挙げられる。
「ラベル」とは実験者が未ラベル核酸の存在下において
ラベルされた核酸を同定することを可能にするプローブ
核酸への修飾を指す。最も一般的には、これは１個以上
の原子の放射性アイソトープによる置換である。しかし
ながら、その他のラベルとして共有結合的に結合された
発色団、蛍光部分、酵素、抗原、特別の反応性を有する
基、化学発光部分及び電気化学的検出部分などが挙げら
れる。
ラベルされた核酸を同定することを可能にするプローブ
核酸への修飾を指す。最も一般的には、これは１個以上
の原子の放射性アイソトープによる置換である。しかし
ながら、その他のラベルとして共有結合的に結合された
発色団、蛍光部分、酵素、抗原、特別の反応性を有する
基、化学発光部分及び電気化学的検出部分などが挙げら
れる。
本発明の方法の好ましい実施態様においてはアッセイが
行われる前に試料核酸及びプローブを作成するために或
る種の予備操作が必要である。
行われる前に試料核酸及びプローブを作成するために或
る種の予備操作が必要である。
試料調製 試料核酸は変性され通常ニトロセルロース濾紙などの固
体支持体に結合されることにより固定化されている。変
性及び結合の技術は公知である〔例えばここにＡppendi
x Ａとして再生したマニアティス、フリッチ及びイサン
ブルックによるモレキュラークローニング（Ｍolecular
Ｃloning，byＭaniatis, Ｅritsch，and Ｓambroo
k）p.331 、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory 1982
を参照〕。
体支持体に結合されることにより固定化されている。変
性及び結合の技術は公知である〔例えばここにＡppendi
x Ａとして再生したマニアティス、フリッチ及びイサン
ブルックによるモレキュラークローニング（Ｍolecular
Ｃloning，byＭaniatis, Ｅritsch，and Ｓambroo
k）p.331 、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory 1982
を参照〕。
系において利用可能な非−特異的結合部位は次いで保護
される。ニトロセルロース濾紙を固体支持体として用い
る典型的な場合において、核酸−紙は追加の核酸が紙に
不可逆的に結合しないように処理される。これは、例え
ば、核酸と濾紙を40×デンハルトの溶液（４０×デンハ
ルトの溶液は８g/ウシ血清アルブミン、８g/ポリビ
ニルピロリドン及び８g/Ｆiollである）中で８０℃に
おいて２時間インキュベートすることにより達成され
る。次いで４０×デンハルトの溶液を除去する。
される。ニトロセルロース濾紙を固体支持体として用い
る典型的な場合において、核酸−紙は追加の核酸が紙に
不可逆的に結合しないように処理される。これは、例え
ば、核酸と濾紙を40×デンハルトの溶液（４０×デンハ
ルトの溶液は８g/ウシ血清アルブミン、８g/ポリビ
ニルピロリドン及び８g/Ｆiollである）中で８０℃に
おいて２時間インキュベートすることにより達成され
る。次いで４０×デンハルトの溶液を除去する。
プローブ調製 診断プローブ及び隣接プローブが既に利用可能でない場
合においてそれらは合成されなければならない。その様
な合成は現在バイオシステムズ ３８０Ａ ＤＮＡ シ
ンセサイザー（Ｂio−systems３８０Ａ ＤＮＡ synth
esizer ）として市販されており、各種核酸の合成技術
は文献に利用可能である。
合においてそれらは合成されなければならない。その様
な合成は現在バイオシステムズ ３８０Ａ ＤＮＡ シ
ンセサイザー（Ｂio−systems３８０Ａ ＤＮＡ synth
esizer ）として市販されており、各種核酸の合成技術
は文献に利用可能である。
一つの態様において、プローブは連結用に作成される。
例えば、リガーゼが使用される場合には、試料核酸にハ
イブリッド化された際にその５′末端を他のプローブの
３′末端に隣接して有するプローブが後に二つのプロー
ブ間にホスホジエステル結合を形成することができるよ
うにホスホリル化される。プローブの一方を次いでラベ
ルする。このラベル化は放射性活性リンを用いて上記ホ
スホリル化操作の一部として行うことができ或いは別の
操作として共有的に発色団、蛍光部分、酵素、抗原、化
学発光部分、特別の結合活性を有する基或いは電気化学
的に検出可能な部分を共有結合的に結合させることによ
り達成することができる。
例えば、リガーゼが使用される場合には、試料核酸にハ
イブリッド化された際にその５′末端を他のプローブの
３′末端に隣接して有するプローブが後に二つのプロー
ブ間にホスホジエステル結合を形成することができるよ
うにホスホリル化される。プローブの一方を次いでラベ
ルする。このラベル化は放射性活性リンを用いて上記ホ
スホリル化操作の一部として行うことができ或いは別の
操作として共有的に発色団、蛍光部分、酵素、抗原、化
学発光部分、特別の結合活性を有する基或いは電気化学
的に検出可能な部分を共有結合的に結合させることによ
り達成することができる。
（Ａppendix ＢはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い
て32Ｐで５′末端をラベル化するための詳細な説明を与
える。） 本発明のもう一つの面として本発明に有用な診断及び隣
接プローブが試験キットとして包装される。遺伝病に伴
う特別の目標配列を検出するたの診断プローブ及び隣接
プローブが合成され、一方がラベルされる。これらのプ
ローブの一方は又他のプローブに連結を可能にするよう
に末端を処理されている。これらの二つのプローブを次
いで本発明の方法が実施されるように適当な指示事項と
共に包装することができる。
て32Ｐで５′末端をラベル化するための詳細な説明を与
える。） 本発明のもう一つの面として本発明に有用な診断及び隣
接プローブが試験キットとして包装される。遺伝病に伴
う特別の目標配列を検出するたの診断プローブ及び隣接
プローブが合成され、一方がラベルされる。これらのプ
ローブの一方は又他のプローブに連結を可能にするよう
に末端を処理されている。これらの二つのプローブを次
いで本発明の方法が実施されるように適当な指示事項と
共に包装することができる。
発明の方法 工程１ よりストリンジェンシーの大きい条件下に結合して残る
プローブをハイブリッド化する。（一般的に、いづれか
のプローブがより長く、従ってよりストリンジェンシー
の大きい条件下に結合して残る。しかしながら、ヌクレ
オチドのある配列についてはより短いプローブがより強
く結合しているものであることがある。）試料核酸中の
相補的な配列にのみプローブの特異的結合を促進する条
件下においてこのプローブとインキュベートする。
プローブをハイブリッド化する。（一般的に、いづれか
のプローブがより長く、従ってよりストリンジェンシー
の大きい条件下に結合して残る。しかしながら、ヌクレ
オチドのある配列についてはより短いプローブがより強
く結合しているものであることがある。）試料核酸中の
相補的な配列にのみプローブの特異的結合を促進する条
件下においてこのプローブとインキュベートする。
工程２ よりストリンジェンシーの小さい条件下において結合し
て残るプローブをハイブリッド化する。再び試料核酸を
今度は試料核酸中の相補的配列にのみ特異的結合を促進
する条件下において他のプローブとインキュベートす
る。工程１からのプローブはこのプローブに要求される
よりストリンジェンシーの小さい条件下において結合し
て残るのでこのプローブの試料核酸へのハイブリッド化
は実質的に先のハイブリッド化に影響を及ぼさない。
て残るプローブをハイブリッド化する。再び試料核酸を
今度は試料核酸中の相補的配列にのみ特異的結合を促進
する条件下において他のプローブとインキュベートす
る。工程１からのプローブはこのプローブに要求される
よりストリンジェンシーの小さい条件下において結合し
て残るのでこのプローブの試料核酸へのハイブリッド化
は実質的に先のハイブリッド化に影響を及ぼさない。
副工程１ａ又は２ａ 完全に結合していない診断プローブの実質的部分を除去
する。（工程１において結合しているプローブが診断プ
ローブである場合にはこれは工程１ａであり、工程２の
前に行われるべきであるのに対し、工程２において結合
しているプローブが診断プローブである場合にはこれは
工程２ａであり、工程２に従うべきである。）これは試
料核酸を適当なストリンジェンシーにおいて洗浄し、完
全に結合しているものを無傷で残しながら完全に結合し
ていない（即ち、診断部分の全ての部位において結合し
ていない）任意の診断プローブを核酸から解離させるこ
とにより達成される。この操作は完全に結合されている
プローブと完全に結合されていないプローブの間にはエ
ネルギー差があるという事実に基づくものである。検討
されている状況下においては、全診断部位における単一
塩基対の不適当な組合わせの結果であり得るのでこの差
は極めて小さい場合がある。従って、この除去操作に際
してはストリンジェンシーを注意深くコントロールしな
ければならない。
する。（工程１において結合しているプローブが診断プ
ローブである場合にはこれは工程１ａであり、工程２の
前に行われるべきであるのに対し、工程２において結合
しているプローブが診断プローブである場合にはこれは
工程２ａであり、工程２に従うべきである。）これは試
料核酸を適当なストリンジェンシーにおいて洗浄し、完
全に結合しているものを無傷で残しながら完全に結合し
ていない（即ち、診断部分の全ての部位において結合し
ていない）任意の診断プローブを核酸から解離させるこ
とにより達成される。この操作は完全に結合されている
プローブと完全に結合されていないプローブの間にはエ
ネルギー差があるという事実に基づくものである。検討
されている状況下においては、全診断部位における単一
塩基対の不適当な組合わせの結果であり得るのでこの差
は極めて小さい場合がある。従って、この除去操作に際
してはストリンジェンシーを注意深くコントロールしな
ければならない。
工程３ 二つのプローブを連結する。二つのプローブを結合して
有する試料核酸をリガーゼで処理するか或いは化学的に
処理して二つのプローブを一つのプローブの５′ホスフ
ェートを他のプローブの３′ヒドロキシルにそれらが互
いに隣接する核酸にハイブリッド化されている部位にお
いて共有的に結合する。
有する試料核酸をリガーゼで処理するか或いは化学的に
処理して二つのプローブを一つのプローブの５′ホスフ
ェートを他のプローブの３′ヒドロキシルにそれらが互
いに隣接する核酸にハイブリッド化されている部位にお
いて共有的に結合する。
工程４ ストリンジェンシーを増加して工程３において他のプロ
ーブに連結されていないラベルされたプローブの殆んど
全部を除去する（９９％より大）。
ーブに連結されていないラベルされたプローブの殆んど
全部を除去する（９９％より大）。
工程４に続き、系内に残る全てのラベルされた目標プロ
ーブであり幾つかの技術の任意のものを使用してそれを
検出することができる。例えば、ラベルされたプローブ
の非−特異的結合からバックグラウンドが除去されてい
るのでラベルを直接オートラジオグラフィー或いは計数
により検出することができる。しかしながら、多くの状
況においては、更にストリンジェンシーを増大して目標
プローブを除去し、ラベルされた目標プローブが目標配
列から解離するにつれて出てくるラベルの量を測定する
のが好ましく、より容易に定量化されこの操作は自動化
が容易である。
ーブであり幾つかの技術の任意のものを使用してそれを
検出することができる。例えば、ラベルされたプローブ
の非−特異的結合からバックグラウンドが除去されてい
るのでラベルを直接オートラジオグラフィー或いは計数
により検出することができる。しかしながら、多くの状
況においては、更にストリンジェンシーを増大して目標
プローブを除去し、ラベルされた目標プローブが目標配
列から解離するにつれて出てくるラベルの量を測定する
のが好ましく、より容易に定量化されこの操作は自動化
が容易である。
加えて、この溶離方法は試料調製が非−特異的結合部位
を防護する際に所望通りに有効でなかったような場合に
おいて、濾紙へのラベルされたプローブの直接の不可逆
的結合によるより与えられ得るバックグラウンドを更に
除去するので結合された目標プローブをその場で検出す
るよりもより正確な結果を与える。
を防護する際に所望通りに有効でなかったような場合に
おいて、濾紙へのラベルされたプローブの直接の不可逆
的結合によるより与えられ得るバックグラウンドを更に
除去するので結合された目標プローブをその場で検出す
るよりもより正確な結果を与える。
第２Ａ図〜２Ｃ図は、上記方法の原理を幾つかの段階に
おいて特に診断プローブの検出に関して例示するもので
ある。説明の目的のために、隣接プローブはより緊密に
結合されたものであり、診断プローブがラベルされてい
るものと想定されている。
おいて特に診断プローブの検出に関して例示するもので
ある。説明の目的のために、隣接プローブはより緊密に
結合されたものであり、診断プローブがラベルされてい
るものと想定されている。
第２Ａ図は工程１及び２の直後であるが、しかし、工程
２ａの前即ち診断プローブ１３と隣接プローブ１５のハ
イブリッド化の直後の段階に対応する。この図におい
て、幾つかの変性鎖１１により表わされる試料核酸は診
断部分Ｄ及び隣接部分Ｃを有する。隣接部分Ｃ及び診断
部分Ｄが隣合っている場所が目標配列を示す。又、診断
プローブがその区画にハイブリッド化するに十分に診断
部分に配列が類似している試料の任意の部分に対応する
部分Ｘも含まれている。領域Ｎはプローブを非特異的に
結合する系の任意の部位を示す。説明の目的のために第
２Ａ図において、存在する診断配列の８０％が診断プロ
ーブを結合し、Ｘ部位の２０％がプローブを結合し、全
てのＮ部位がプローブを結合するものと想定する。若
し、この段階において診断プローブの量を測定して存在
する目標配列の数を求めるならば、全てのＮ部位、目標
配列の外部のＤ部位及びＸ部位の％からの結合による従
来技術において生じたような過剰なバックグラウンドノ
イズがあるであろう。
２ａの前即ち診断プローブ１３と隣接プローブ１５のハ
イブリッド化の直後の段階に対応する。この図におい
て、幾つかの変性鎖１１により表わされる試料核酸は診
断部分Ｄ及び隣接部分Ｃを有する。隣接部分Ｃ及び診断
部分Ｄが隣合っている場所が目標配列を示す。又、診断
プローブがその区画にハイブリッド化するに十分に診断
部分に配列が類似している試料の任意の部分に対応する
部分Ｘも含まれている。領域Ｎはプローブを非特異的に
結合する系の任意の部位を示す。説明の目的のために第
２Ａ図において、存在する診断配列の８０％が診断プロ
ーブを結合し、Ｘ部位の２０％がプローブを結合し、全
てのＮ部位がプローブを結合するものと想定する。若
し、この段階において診断プローブの量を測定して存在
する目標配列の数を求めるならば、全てのＮ部位、目標
配列の外部のＤ部位及びＸ部位の％からの結合による従
来技術において生じたような過剰なバックグラウンドノ
イズがあるであろう。
第２Ｂ図は診断及び隣接プローブが連結されて目標プロ
ーブを形成し、ストリンジェンシーを増大して全ての未
連結診断プローブが最早試料核酸にハイブリッド化して
いない工程４の直後の方法の結果を図示する。この段階
において僅かのＮ部位が存在するならば、診断プローブ
の量をその場で測定して存在する目標配列の数を求める
ことができる。
ーブを形成し、ストリンジェンシーを増大して全ての未
連結診断プローブが最早試料核酸にハイブリッド化して
いない工程４の直後の方法の結果を図示する。この段階
において僅かのＮ部位が存在するならば、診断プローブ
の量をその場で測定して存在する目標配列の数を求める
ことができる。
第２Ｃ図は、溶離後の段階即ち目標プローブ17を含んで
全てのプローブが除去された段階を示す。ここにおい
て、目標配列に始めにハイブリッド化した診断プローブ
の量を目標配列にはないＮ部位、Ｘ部位及びＤ部位に対
する結合によるバックグラウンドノイズなしに求めるこ
とがてきる。
全てのプローブが除去された段階を示す。ここにおい
て、目標配列に始めにハイブリッド化した診断プローブ
の量を目標配列にはないＮ部位、Ｘ部位及びＤ部位に対
する結合によるバックグラウンドノイズなしに求めるこ
とがてきる。
次の実施例は上記技術の特別の応用として提供され、本
発明の範囲を限定するものと考えられるべきではない。
この実施例においてはバクテリオファージλ−ＤＮＡを
二つの理由により試料核酸として選んだ。先ず、λゲノ
ームの発現はより高級な生物体の細胞において生じる遺
伝的に決定された分化過程に対するモデルと一般的にみ
なされている。そのモデルの性質によりλファージは本
発明の方法を示すための適当な具体例を与えるものと感
ぜられた。第二に、λファージはよく研究されており容
易に利用可能である。
発明の範囲を限定するものと考えられるべきではない。
この実施例においてはバクテリオファージλ−ＤＮＡを
二つの理由により試料核酸として選んだ。先ず、λゲノ
ームの発現はより高級な生物体の細胞において生じる遺
伝的に決定された分化過程に対するモデルと一般的にみ
なされている。そのモデルの性質によりλファージは本
発明の方法を示すための適当な具体例を与えるものと感
ぜられた。第二に、λファージはよく研究されており容
易に利用可能である。
実施例１ 試料バクテリオファージλ−ＤＮＡはベテスダリサーチ
ラボラトリーズ（Ｂethesda ＲesearcＬaboratories
、メアリーランド州、ゲイタースバーグ、カタログ番
号5250）から得た。選ばれた目標配列は塩基１４５に始
まり、塩基２２４に終るヌクレオチドの配列に対応する
（「ファージλ−ＤＮＡにおけるcro. ｃ II、及びＯ
遺伝子の部分のヌクレオチド配列（Ｎucleotide Ｓeque
nce of cro，ｃII，and part of the Ｏ gene in Ｐh
age λ−ＤＮＡ）」、Ｅ、シュワルツ等（Ｅ．Ｓchwar
z，et al.）Ｎature，272, 30 1978年３月）。
ラボラトリーズ（Ｂethesda ＲesearcＬaboratories
、メアリーランド州、ゲイタースバーグ、カタログ番
号5250）から得た。選ばれた目標配列は塩基１４５に始
まり、塩基２２４に終るヌクレオチドの配列に対応する
（「ファージλ−ＤＮＡにおけるcro. ｃ II、及びＯ
遺伝子の部分のヌクレオチド配列（Ｎucleotide Ｓeque
nce of cro，ｃII，and part of the Ｏ gene in Ｐh
age λ−ＤＮＡ）」、Ｅ、シュワルツ等（Ｅ．Ｓchwar
z，et al.）Ｎature，272, 30 1978年３月）。
選ばれた診断部分はλ−ＤＮＡにおける塩基１４５に始
まり１５９に終るヌクレオチドの配列に対応する１５量
体であった。この診断配列に相補的な１５量体である診
断プローブはＡpplied Ｂiosystems ３８０Ａ ＤＮＡ
シンセサイザー上で合成され、５′−ATCAGCGTTTATAGT
−３′の配列を有した。選ばれた隣接部分は診断配列に
隣接した６５塩基の配列即ち塩基１６０から始まり塩基
２２４に終る配列であった。この隣接部分に相補的であ
る６５量体である隣接プローブも又Ａpplied Ｂiosyst
ems ３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザー上で合成され、
５′−GTTATTTATGCTGTTGTTTTTTTGTTACTCGGGAAGGGCTTTAC
CTCTTCCGCATAAACGCTTCC −３′の配列を有した。１５量
体はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて32Ｐでリン
酸化し、それにより又１５量体を放射活性ラベルを付し
た。（このキナーゼ化方法の詳細はＡppendix Ｂを参
照。） 試料ＤＮＡを変性し固定した（Ｓchleicher ＆Ｓchuell
ＢＡ８５ニトロセルロースフィルターを９mm直径の円
形に切った以外はＡppendix Ａで説明したのと同様にし
て行った）。及び非−特異的結合部位を試料調製の下に
上記した如く防護した。約0.3pmolのファージλ−ＤＮ
Ａをこの試料調製過程に際してニトロセルロースフィル
ター紙上に固定した。
まり１５９に終るヌクレオチドの配列に対応する１５量
体であった。この診断配列に相補的な１５量体である診
断プローブはＡpplied Ｂiosystems ３８０Ａ ＤＮＡ
シンセサイザー上で合成され、５′−ATCAGCGTTTATAGT
−３′の配列を有した。選ばれた隣接部分は診断配列に
隣接した６５塩基の配列即ち塩基１６０から始まり塩基
２２４に終る配列であった。この隣接部分に相補的であ
る６５量体である隣接プローブも又Ａpplied Ｂiosyst
ems ３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザー上で合成され、
５′−GTTATTTATGCTGTTGTTTTTTTGTTACTCGGGAAGGGCTTTAC
CTCTTCCGCATAAACGCTTCC −３′の配列を有した。１５量
体はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて32Ｐでリン
酸化し、それにより又１５量体を放射活性ラベルを付し
た。（このキナーゼ化方法の詳細はＡppendix Ｂを参
照。） 試料ＤＮＡを変性し固定した（Ｓchleicher ＆Ｓchuell
ＢＡ８５ニトロセルロースフィルターを９mm直径の円
形に切った以外はＡppendix Ａで説明したのと同様にし
て行った）。及び非−特異的結合部位を試料調製の下に
上記した如く防護した。約0.3pmolのファージλ−ＤＮ
Ａをこの試料調製過程に際してニトロセルロースフィル
ター紙上に固定した。
工程１ ４ pmolの６５量体を含有する１５０μの２×ＳＳＣ
でＤＮＡ−紙を５７℃で３時間インキュベートすること
によりλ−ＤＮＡにハイブリッド化させ、６５量体溶液
を除去した。（２×ＳＳＣは0.3 Ｍ NaCl、0.03Ｍクエ
ン酸ナトリウム、pH7.0 である） 工程２ １５量体をＤＮＡ−紙を４ pmolのラベルされた１５量
体を含有する１５０μの２×ＳＳＣでインキュベート
することによりλ−ＤＮＡにハイブリッド化した。
でＤＮＡ−紙を５７℃で３時間インキュベートすること
によりλ−ＤＮＡにハイブリッド化させ、６５量体溶液
を除去した。（２×ＳＳＣは0.3 Ｍ NaCl、0.03Ｍクエ
ン酸ナトリウム、pH7.0 である） 工程２ １５量体をＤＮＡ−紙を４ pmolのラベルされた１５量
体を含有する１５０μの２×ＳＳＣでインキュベート
することによりλ−ＤＮＡにハイブリッド化した。
工程２ａ 工程２において完全には結合しなかった（即ち、全ての
部位においては結合しなかった）１５量体の実質的部分
をＤＮＡ−紙を３２０ｍｌの２×ＳＳＣ中で２３℃にお
いて１０分間洗浄し、次いでフィルターを再び２μの
緩衝液６６ｍＭ Ｔris HCl pH 7.5、6.6mＭ MgCl2 及
び１０Ｍジチオスレイトールの２ｍｌ中で洗浄すること
により除去した。
部位においては結合しなかった）１５量体の実質的部分
をＤＮＡ−紙を３２０ｍｌの２×ＳＳＣ中で２３℃にお
いて１０分間洗浄し、次いでフィルターを再び２μの
緩衝液６６ｍＭ Ｔris HCl pH 7.5、6.6mＭ MgCl2 及
び１０Ｍジチオスレイトールの２ｍｌ中で洗浄すること
により除去した。
工程３ これらのプローブを１５０μの工程２ａで用いた緩衝
液、プラス0.4mＭ ＡＴＰ及び２μ Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ中においてＤＮＡ−紙を２３℃で２時間インキュベ
ートするとにより連結した。
液、プラス0.4mＭ ＡＴＰ及び２μ Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ中においてＤＮＡ−紙を２３℃で２時間インキュベ
ートするとにより連結した。
工程４ ストリンジェンシーを増大して工程４において連結され
なかったラベルされたプローブの殆んど全てを除去し
た。これは、２００μ／分の２×ＳＳＣを２８℃で１
時間フィルターを通過させることによりＤＮＡ−紙を洗
浄することにより達成された。他の目的のために設計さ
れたものであるが、この操作のためにＡpplied Ｂiosy
stems ４７０Ａ蛋白質シークエンサーを用いた。これは
それがフィルターを保持することのできるカートリッジ
組立物を有し、フィルターを通してプログラム可能な温
度において液体を運ぶようにプログラム化することがで
きるからである。
なかったラベルされたプローブの殆んど全てを除去し
た。これは、２００μ／分の２×ＳＳＣを２８℃で１
時間フィルターを通過させることによりＤＮＡ−紙を洗
浄することにより達成された。他の目的のために設計さ
れたものであるが、この操作のためにＡpplied Ｂiosy
stems ４７０Ａ蛋白質シークエンサーを用いた。これは
それがフィルターを保持することのできるカートリッジ
組立物を有し、フィルターを通してプログラム可能な温
度において液体を運ぶようにプログラム化することがで
きるからである。
連結されたプローブ（目標プローブ）を検出するために
温度５℃／時間で上昇させ、0.5 ％のドデシル硫酸ナト
リウムを有する 0.1×ＳＳＣをフィルターを通して通過
させることによりストリンジェンシーを更に増大させ
た。各々２００μの画分を４５分毎に集めた。各画分
の放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて
求め、各間隔の終りにおける累積カウント数を温度に対
してプロットした。
温度５℃／時間で上昇させ、0.5 ％のドデシル硫酸ナト
リウムを有する 0.1×ＳＳＣをフィルターを通して通過
させることによりストリンジェンシーを更に増大させ
た。各々２００μの画分を４５分毎に集めた。各画分
の放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて
求め、各間隔の終りにおける累積カウント数を温度に対
してプロットした。
第３図はこの操作の結果を示す。比較目的のために、こ
れをリガーゼを使用しなかった場合についても行った。
見られる如く、リガーゼの使用は未連結の場合に比べて
溶融カーブを飛躍的に変化させた。未連結ラベルプロー
ブの実質的には全ては温度が３５℃に到達するまでに解
離した。これに対し、連結された場合にはラベルされた
８０−量対の実質的部分は３５℃において残存した。従
って、放射活性の測定を３５℃より高温においてフィル
ターから除去された物質に限定することにより実質的に
連結されたプローブのみがカウントされる。８０−量対
数が３５℃より高温においてカウントされた全てである
という事実は更にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動によっても実証された。
れをリガーゼを使用しなかった場合についても行った。
見られる如く、リガーゼの使用は未連結の場合に比べて
溶融カーブを飛躍的に変化させた。未連結ラベルプロー
ブの実質的には全ては温度が３５℃に到達するまでに解
離した。これに対し、連結された場合にはラベルされた
８０−量対の実質的部分は３５℃において残存した。従
って、放射活性の測定を３５℃より高温においてフィル
ターから除去された物質に限定することにより実質的に
連結されたプローブのみがカウントされる。８０−量対
数が３５℃より高温においてカウントされた全てである
という事実は更にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動によっても実証された。
一般的方法及び上記特別の実施例に関して実験処法のあ
る種の側面を注意するべきである。一般的に診断プロー
ブは単一の塩基対と不適当な組合わせを検出することが
できるために絶対的な意味において比較的短いことが望
ましい。この選択性はハイブリッド化操作に引続く工程
１ａ或いは工程２ａにおける如く診断プローブがハイブ
リッド化される工程に応じて異るストリンジェンシーに
おいて完全に結合していない診断プローブを洗浄により
除去することにより達成される。
る種の側面を注意するべきである。一般的に診断プロー
ブは単一の塩基対と不適当な組合わせを検出することが
できるために絶対的な意味において比較的短いことが望
ましい。この選択性はハイブリッド化操作に引続く工程
１ａ或いは工程２ａにおける如く診断プローブがハイブ
リッド化される工程に応じて異るストリンジェンシーに
おいて完全に結合していない診断プローブを洗浄により
除去することにより達成される。
実際には、完全に結合されていないラベルされたプロー
ブを１００％除去することは勿論実際的ではなく、何故
ならばそうすることは実質的な割合の完全に結合された
プローブも又除去するからである。しかしながら、１５
量体について完全に結合されていないラベルされたプロ
ーブの７０％を越える割合、より好ましくは９０％を越
える割合を除去するのが実用的である。この方法の通常
の用途においては、ホモ接合体及びヘテロ接合体の細胞
間の相違を明白に決定させるためには、十分な完全に結
合されてないラベルされたプローブを除去することのみ
が必要である。目標配列にハイブリッド化されて残る任
意の不完全に結合したラベルされたプローブは連結され
る可能性があり、後に行われる測定においてバックグラ
ンウンドノイズを与える。従って、除去する必要のある
不完全に結合したラベルされたプローブの量は統計的に
妥当な決定に到達する際にどれだけのバックグラウンド
を許容することができるかに応じて異る。
ブを１００％除去することは勿論実際的ではなく、何故
ならばそうすることは実質的な割合の完全に結合された
プローブも又除去するからである。しかしながら、１５
量体について完全に結合されていないラベルされたプロ
ーブの７０％を越える割合、より好ましくは９０％を越
える割合を除去するのが実用的である。この方法の通常
の用途においては、ホモ接合体及びヘテロ接合体の細胞
間の相違を明白に決定させるためには、十分な完全に結
合されてないラベルされたプローブを除去することのみ
が必要である。目標配列にハイブリッド化されて残る任
意の不完全に結合したラベルされたプローブは連結され
る可能性があり、後に行われる測定においてバックグラ
ンウンドノイズを与える。従って、除去する必要のある
不完全に結合したラベルされたプローブの量は統計的に
妥当な決定に到達する際にどれだけのバックグラウンド
を許容することができるかに応じて異る。
好ましい態様である示された実施例においてはラベルさ
れたプローブと診断プローブは同一である。１５量体が
診断プローブとして選ばれたのはそれが如何なる不完全
に結合されたプローブをもストリンジェンシーにおける
変化により容易に分離させるのに十分に長さが短いから
である。ラベルを付されないプローブ即ち隣接プローブ
は高い特異性及び連結された際に融点において有意義な
変化を与えるの十分長いように選ばれ、又迅速にハイブ
リッド化するのに十分に短く、容易に合成することがで
きた。
れたプローブと診断プローブは同一である。１５量体が
診断プローブとして選ばれたのはそれが如何なる不完全
に結合されたプローブをもストリンジェンシーにおける
変化により容易に分離させるのに十分に長さが短いから
である。ラベルを付されないプローブ即ち隣接プローブ
は高い特異性及び連結された際に融点において有意義な
変化を与えるの十分長いように選ばれ、又迅速にハイブ
リッド化するのに十分に短く、容易に合成することがで
きた。
診断プローブの代りに隣接プローブがラベルされる異常
な状況においては診断プローブはストリンジェンシーに
おける変化により区別することのできる異った対立遺伝
子に対して特異的結合性を有することが出来るのになお
一層十分に小さくなければならない。又、ラベルされた
隣接プローブも又未連結のラベルされた隣接プローブが
連結プローブが溶出させる前に除去することが出来るよ
うに診断プローブに連結された際に融点に有意義な変化
を与えるに十分小さくなければならない一方、同時に又
それは隣接プローブ診断プローブが共に独特の配列に結
合するように十分長くなければならない。
な状況においては診断プローブはストリンジェンシーに
おける変化により区別することのできる異った対立遺伝
子に対して特異的結合性を有することが出来るのになお
一層十分に小さくなければならない。又、ラベルされた
隣接プローブも又未連結のラベルされた隣接プローブが
連結プローブが溶出させる前に除去することが出来るよ
うに診断プローブに連結された際に融点に有意義な変化
を与えるに十分小さくなければならない一方、同時に又
それは隣接プローブ診断プローブが共に独特の配列に結
合するように十分長くなければならない。
上記説明から、この実施例における１５量体及び６５量
体の使用は例示にすぎず、又多くのその他のプローブ長
の組合せが利用可能なことが明らかであろう。例えば、
ある状況においてはストリンジェンシーにおける変化に
より適合及び不適合診断プローブの区別を更に容易にす
るために極めて短い診断プローブおそらくは４〜５の塩
基対の長さの範囲のプローブを用いることが望ましい場
合がある。しかしながら、実際問題として従来技術に対
して利点を提供する方法に対しては、一緒に連結された
プローブの長さは検出されるべき独特の配列を規定する
のに十分長くなければならないのみならず、興味の対象
となる配列にはない部分に対する非特異的結合が従来に
おいて生じたような過度のバックグラウンドを引起こさ
にように十分長くなければならない。前者に関して明ら
かに配列が長ければ長い程より独特となるようである。
現在の技術は哺乳動物のゲノームＤＮＡに対しては独得
の配列の決定が約１９個のヌクレオチドの長さであるこ
とに落付いたようであり、それはおよそストリンジェン
シーにおける相違を用いた現在利用可能な技術により合
理的に区別することのできる最大長さに対応する。これ
らの考慮を与えると現時点において診断プローブに対す
る好ましい長さの範囲は約四つの塩基対乃至約１９の塩
基対である。非特異的結合に関しては最小の組合わせ連
結（目標）プローブ長さは未解決であり遺伝子毎に変り
得るものである。しかしながら、現在の実験からは８０
量対は適切であるよりも多く適当な長さの範囲は約２０
塩基対乃至約８０塩基対である。しかしながら、診断プ
ローブがラベルされたプローブである状況においてはは
るかに長し隣接プローブ例えば隣接プローブがクローン
化配列であるような場合におけるような何千もの塩基対
までの使用に対してもハイブリッド化の時間と製造上の
考慮以外には何等と不都合もありそうにない。従って、
好ましい態様においては組合わされた（目標）プローブ
の範囲は約１９ヌクレオチド以上の範囲である。
体の使用は例示にすぎず、又多くのその他のプローブ長
の組合せが利用可能なことが明らかであろう。例えば、
ある状況においてはストリンジェンシーにおける変化に
より適合及び不適合診断プローブの区別を更に容易にす
るために極めて短い診断プローブおそらくは４〜５の塩
基対の長さの範囲のプローブを用いることが望ましい場
合がある。しかしながら、実際問題として従来技術に対
して利点を提供する方法に対しては、一緒に連結された
プローブの長さは検出されるべき独特の配列を規定する
のに十分長くなければならないのみならず、興味の対象
となる配列にはない部分に対する非特異的結合が従来に
おいて生じたような過度のバックグラウンドを引起こさ
にように十分長くなければならない。前者に関して明ら
かに配列が長ければ長い程より独特となるようである。
現在の技術は哺乳動物のゲノームＤＮＡに対しては独得
の配列の決定が約１９個のヌクレオチドの長さであるこ
とに落付いたようであり、それはおよそストリンジェン
シーにおける相違を用いた現在利用可能な技術により合
理的に区別することのできる最大長さに対応する。これ
らの考慮を与えると現時点において診断プローブに対す
る好ましい長さの範囲は約四つの塩基対乃至約１９の塩
基対である。非特異的結合に関しては最小の組合わせ連
結（目標）プローブ長さは未解決であり遺伝子毎に変り
得るものである。しかしながら、現在の実験からは８０
量対は適切であるよりも多く適当な長さの範囲は約２０
塩基対乃至約８０塩基対である。しかしながら、診断プ
ローブがラベルされたプローブである状況においてはは
るかに長し隣接プローブ例えば隣接プローブがクローン
化配列であるような場合におけるような何千もの塩基対
までの使用に対してもハイブリッド化の時間と製造上の
考慮以外には何等と不都合もありそうにない。従って、
好ましい態様においては組合わされた（目標）プローブ
の範囲は約１９ヌクレオチド以上の範囲である。
未連結プローブを除去するためにストリンジェンシーに
おける相違を用いることにより創り出されたこの大きさ
依存性の幾つかは連結プローブを回収するための別の技
術を用いることにより除去することができる。例えば、
プローブの一方（未ラベルプローブ）に連結（目標）プ
ローブが工程４の後にストリンジェンシーを増大させる
のではなく、フックを捕捉することにより回収できるよ
うにフックを設けることも有用である。特に有望であり
ような一つのその様な手法は隣接プローブにそれを核酸
にハイブリッド化する前にビオチンを結合することであ
る。上記方法における工程１〜４を前と同様にして連結
プローブに含有されるビオチン分子を結合するためのス
トレプトアビジンを用いて回収する。この手法を用いる
と診断プローブが常に単一の塩基対の不適当な組合わせ
を区別するのに常に十分短かくなければならないこと、
及び隣接プローブ及び診断プローブが共に独特の部位に
結合するのに十分長くなければならないことを除いては
相対的な大きさは最早問題とならない。この一般的手法
を例示するビオチン−アビジン回収法の詳細は下記実施
例２に素描される。
おける相違を用いることにより創り出されたこの大きさ
依存性の幾つかは連結プローブを回収するための別の技
術を用いることにより除去することができる。例えば、
プローブの一方（未ラベルプローブ）に連結（目標）プ
ローブが工程４の後にストリンジェンシーを増大させる
のではなく、フックを捕捉することにより回収できるよ
うにフックを設けることも有用である。特に有望であり
ような一つのその様な手法は隣接プローブにそれを核酸
にハイブリッド化する前にビオチンを結合することであ
る。上記方法における工程１〜４を前と同様にして連結
プローブに含有されるビオチン分子を結合するためのス
トレプトアビジンを用いて回収する。この手法を用いる
と診断プローブが常に単一の塩基対の不適当な組合わせ
を区別するのに常に十分短かくなければならないこと、
及び隣接プローブ及び診断プローブが共に独特の部位に
結合するのに十分長くなければならないことを除いては
相対的な大きさは最早問題とならない。この一般的手法
を例示するビオチン−アビジン回収法の詳細は下記実施
例２に素描される。
実施例２ 前記の如く試料ＤＮＡを調製し、診断及び隣接プローブ
を得た。ビオチン部分を次いで隣接プローブの３′OHに
Ｅnzo Ｂio−Ｐrobe（登録商標）末端ラベルキットを用
いて結合した。Ｅnzo Ｂio-Ｐrobe（登録商標）の変法
であるビオチン結合のもう一つの手法は約１μｇのＤＮ
Ａプローブと0.2 Ｍカゴジル酸カリウム緩衝液、pH 7.0
１ｍＭ CoCl2 、0.1mＭビオチニル化ｄＵＴＰと混合
し、３７℃で１時間或いはＤＮＡプローブ当り平均で１
個のビオチンが導入されるまでインキュベートすること
を含むものである。隣接プローブを次いでリン酸化し
（ライベルを付さず）、及び診断プローブを５′OH或い
は内部のいずれかにラベルする。次いで工程１〜４を前
と同様に行う。連結プローブの回収方法は例えば温度を
上昇することによりストリンジェンシーを増大し、次い
で、例えば溶離物質をストレプトアジビンで共有的に被
覆された多孔基材を通して通過させるか或いは溶離物質
をストレプトアビジンで被覆された容器中においてイン
キュベートすることにより溶離物質を結合アビジンと密
着させることにより行われる。〔ストレプトアビジンは
ストレプトミセス・アビジニイ（Ｓteptomyces Ａuidin
ii の細胞内生成物である。Ｌ、シャエット及びＦ．
Ｊ．ｄ．ウオルフ（L.Ｃhaiet and Ｆ．Ｊ．Ｗolf）、
Ａrch.Ｂiochem．and Ｂiophys．106 ：１〜５参照。〕
典型的な基材としてはニトロセルロースフィルター紙或
いは小ビーズ（通常３〜３０ミクロン直径）が挙げられ
る。ラベルされた連結プローブはそれがビオチンフック
を含む場合及びその場合にのみ（即ち、フックを有する
プローブ及びラベルされたプローブが連結された場合）
多孔性基材上で濃縮される。この方法は例えば蛍光ラベ
ル法についてしばしば望ましいようにラベルの濃縮にお
いて特に有用である。又、選択的に未連結プローブを解
離するためには温度の注意深いコントロールが必要とさ
れないことを注意すべきである。
を得た。ビオチン部分を次いで隣接プローブの３′OHに
Ｅnzo Ｂio−Ｐrobe（登録商標）末端ラベルキットを用
いて結合した。Ｅnzo Ｂio-Ｐrobe（登録商標）の変法
であるビオチン結合のもう一つの手法は約１μｇのＤＮ
Ａプローブと0.2 Ｍカゴジル酸カリウム緩衝液、pH 7.0
１ｍＭ CoCl2 、0.1mＭビオチニル化ｄＵＴＰと混合
し、３７℃で１時間或いはＤＮＡプローブ当り平均で１
個のビオチンが導入されるまでインキュベートすること
を含むものである。隣接プローブを次いでリン酸化し
（ライベルを付さず）、及び診断プローブを５′OH或い
は内部のいずれかにラベルする。次いで工程１〜４を前
と同様に行う。連結プローブの回収方法は例えば温度を
上昇することによりストリンジェンシーを増大し、次い
で、例えば溶離物質をストレプトアジビンで共有的に被
覆された多孔基材を通して通過させるか或いは溶離物質
をストレプトアビジンで被覆された容器中においてイン
キュベートすることにより溶離物質を結合アビジンと密
着させることにより行われる。〔ストレプトアビジンは
ストレプトミセス・アビジニイ（Ｓteptomyces Ａuidin
ii の細胞内生成物である。Ｌ、シャエット及びＦ．
Ｊ．ｄ．ウオルフ（L.Ｃhaiet and Ｆ．Ｊ．Ｗolf）、
Ａrch.Ｂiochem．and Ｂiophys．106 ：１〜５参照。〕
典型的な基材としてはニトロセルロースフィルター紙或
いは小ビーズ（通常３〜３０ミクロン直径）が挙げられ
る。ラベルされた連結プローブはそれがビオチンフック
を含む場合及びその場合にのみ（即ち、フックを有する
プローブ及びラベルされたプローブが連結された場合）
多孔性基材上で濃縮される。この方法は例えば蛍光ラベ
ル法についてしばしば望ましいようにラベルの濃縮にお
いて特に有用である。又、選択的に未連結プローブを解
離するためには温度の注意深いコントロールが必要とさ
れないことを注意すべきである。
本発明の上記方法の遺伝病の検出への応用は比較的直截
的である。例えば、鎌状赤血球症の検出においては正常
なβ−グロビン遺伝子（βＡβＢ）を有するホモ接合体
の個人のＤＮＡをβＳ対立遺伝子（βＡβＢ）を有する
鎌状赤血球性形質を有するヘテロ接合体個人のそれ、及
び鎌状赤血球症を有する個人のそれ（βＳβＳ）と区別
することが必要である。一つの手法において、一つが正
常なβ−グロビン（βＡ）に特異的であり、一つが鎌状
赤血球性対立遺伝子（βＳ）に特異的である二つの診断
プローブが合成される。又試験ＤＮＡにハイブリッド化
された際に、これらの二つの最初のプローブに隣接する
隣接プローブが合成され、上記工程１〜４が各診断プロ
ーブに別々に行われる。正常β−グロビン遺伝子にホモ
接合体の個人からのＤＮＡは次いで正常遺伝子βＡに特
異的なプローブに対して高いカウント数を示し、βＳ対
立遺伝子に特異的なプローブに対しては低いカウント数
を示す。同様に、鎌状−赤血球β−グロビン遺伝子にホ
モ接合体の個人からのＤＮＡはβＳ対立遺伝子に特異的
なプローブに対して高いカウント数を示し、正常遺伝子
βＡに特異的なプローブに対しては低いカウント数を示
す。ヘテロ接合体の個人からのＤＮＡ（βＡβＳ）は特
異的診断プローブの両者からの実質的に同等のカウント
数を示し、そのカウント数の大きさはホモ接合体の個人
に対して述べた高い及び低いカウント数の中間である。
的である。例えば、鎌状赤血球症の検出においては正常
なβ−グロビン遺伝子（βＡβＢ）を有するホモ接合体
の個人のＤＮＡをβＳ対立遺伝子（βＡβＢ）を有する
鎌状赤血球性形質を有するヘテロ接合体個人のそれ、及
び鎌状赤血球症を有する個人のそれ（βＳβＳ）と区別
することが必要である。一つの手法において、一つが正
常なβ−グロビン（βＡ）に特異的であり、一つが鎌状
赤血球性対立遺伝子（βＳ）に特異的である二つの診断
プローブが合成される。又試験ＤＮＡにハイブリッド化
された際に、これらの二つの最初のプローブに隣接する
隣接プローブが合成され、上記工程１〜４が各診断プロ
ーブに別々に行われる。正常β−グロビン遺伝子にホモ
接合体の個人からのＤＮＡは次いで正常遺伝子βＡに特
異的なプローブに対して高いカウント数を示し、βＳ対
立遺伝子に特異的なプローブに対しては低いカウント数
を示す。同様に、鎌状−赤血球β−グロビン遺伝子にホ
モ接合体の個人からのＤＮＡはβＳ対立遺伝子に特異的
なプローブに対して高いカウント数を示し、正常遺伝子
βＡに特異的なプローブに対しては低いカウント数を示
す。ヘテロ接合体の個人からのＤＮＡ（βＡβＳ）は特
異的診断プローブの両者からの実質的に同等のカウント
数を示し、そのカウント数の大きさはホモ接合体の個人
に対して述べた高い及び低いカウント数の中間である。
もう一つの手法において再生可能な接合を確実にするた
めに適当なコントロールが用いられるならばβＳ対立遺
伝子に特異的な単一の診断プローブを上記工程１〜４に
使用することができる。ここにおいて全カウント数を検
量して鎌状赤血球性形質或いは病気を有しない正常なゲ
ノタイプ（即ち、βＡβＡ）をβＡβＳ、及びβＳβＳ
ゲノタイプから直接に区別する。この手法においては、
鎌状赤血球性形質及び病気の要請の指示を有するために
βＳ対立遺伝子に特異的なプローブを使用するのが好ま
しいが、鎌状赤血球塩基対突然変異が起こる場所を有す
る試験ＤＮＡ中の配列に特異的な正常なプローブとハイ
ブリッド化した際に低い或いは中間のカウント数をもた
らすその他の遺伝病がないことを条件にして鎌状赤血球
対立遺伝子を指示する正常なゲノタイプに特異的なプロ
ーブを使用することも可能であることが理解されるべき
である。
めに適当なコントロールが用いられるならばβＳ対立遺
伝子に特異的な単一の診断プローブを上記工程１〜４に
使用することができる。ここにおいて全カウント数を検
量して鎌状赤血球性形質或いは病気を有しない正常なゲ
ノタイプ（即ち、βＡβＡ）をβＡβＳ、及びβＳβＳ
ゲノタイプから直接に区別する。この手法においては、
鎌状赤血球性形質及び病気の要請の指示を有するために
βＳ対立遺伝子に特異的なプローブを使用するのが好ま
しいが、鎌状赤血球塩基対突然変異が起こる場所を有す
る試験ＤＮＡ中の配列に特異的な正常なプローブとハイ
ブリッド化した際に低い或いは中間のカウント数をもた
らすその他の遺伝病がないことを条件にして鎌状赤血球
対立遺伝子を指示する正常なゲノタイプに特異的なプロ
ーブを使用することも可能であることが理解されるべき
である。
以上本発明の好ましい態様を説明したが当業者には本発
明から離れることなくその広い面において多くの変更及
び修正がなされることが理解されるであろう。例えば、
隣接プローブは核酸に沿っていづれの方向であってもよ
く、或いは隣接プローブは検出したい特別の目標配列に
応じて診断プローブよりも長くても短かくても良いこと
は明らかである。又上記技術はある特別の配列がＤＮＡ
鎖のもう一つの特別の配列の次に位置しているかどうか
を決定する際に有用であり、或いは同様に次のものにそ
れぞれ隣接する一連のプローブを用いて特別の配列の近
接性を示すか或いは連結プローブの大きさを増大するこ
とが可能である。従って、冒頭に挙げた特許請求の範囲
は本発明の真の趣旨及び範囲内に入る全てのその様な修
正、変更及び応用を全て包含するものである。
明から離れることなくその広い面において多くの変更及
び修正がなされることが理解されるであろう。例えば、
隣接プローブは核酸に沿っていづれの方向であってもよ
く、或いは隣接プローブは検出したい特別の目標配列に
応じて診断プローブよりも長くても短かくても良いこと
は明らかである。又上記技術はある特別の配列がＤＮＡ
鎖のもう一つの特別の配列の次に位置しているかどうか
を決定する際に有用であり、或いは同様に次のものにそ
れぞれ隣接する一連のプローブを用いて特別の配列の近
接性を示すか或いは連結プローブの大きさを増大するこ
とが可能である。従って、冒頭に挙げた特許請求の範囲
は本発明の真の趣旨及び範囲内に入る全てのその様な修
正、変更及び応用を全て包含するものである。
Ａppendix Ａ ハイブリッド化選択３３１によるｃＤＮＡクローンと同
定ニトロセルトース３へのＤＮＡの結合 1. ＤＮＡを水中に５００μｇ/ｍｌの濃度で溶解す
る。
定ニトロセルトース３へのＤＮＡの結合 1. ＤＮＡを水中に５００μｇ/ｍｌの濃度で溶解す
る。
2. １００℃に１０分間加熱する。
3. 試料を氷上で迅速に急冷する。当容量の１ＭNaOHを
添加し、室温において２０分間インキュベートする。
添加し、室温において２０分間インキュベートする。
4. 無菌のメス及び手袋を用いてニトロセルロースフィ
ルター（ミリポワＨＡＷＰ）のシートを３mm平方に切断
する。切断したフィルターを１枚のパラフィルムにきれ
いな側に置く。
ルター（ミリポワＨＡＷＰ）のシートを３mm平方に切断
する。切断したフィルターを１枚のパラフィルムにきれ
いな側に置く。
5. ＤＮＡ試料を0.5 容の１Ｍ NaCl 、0.3 Ｍクエン酸
ナトリウム、0.5 Ｍ Tris Cl(pH8.0) 及び１ＭHCl の溶
液を添加することにより中和する。よく混合し、直ちに
ＤＮＡ試料を氷中で急冷する。
ナトリウム、0.5 Ｍ Tris Cl(pH8.0) 及び１ＭHCl の溶
液を添加することにより中和する。よく混合し、直ちに
ＤＮＡ試料を氷中で急冷する。
6. 自動マイクロピペットを用いて５μのＤＮＡ溶液
を各フィルター上にスポットする。それを吸収させた後
もう一回５μをスポットする。この操作を各フィルタ
ーにほぼ２０μｇのＤＮＡが負荷されるまで繰返す。
を各フィルター上にスポットする。それを吸収させた後
もう一回５μをスポットする。この操作を各フィルタ
ーにほぼ２０μｇのＤＮＡが負荷されるまで繰返す。
7. フィルター１時間風乾させる。
8. 乾燥フィルターを無菌の５０ｍｌネジ栓を付した塩
水管に入れる。フィルターを５０ｍｌの６×ＳＳＣで室
温で二回洗浄する。これらのフィルターを新たなパラフ
ィルム上に再分布させる。
水管に入れる。フィルターを５０ｍｌの６×ＳＳＣで室
温で二回洗浄する。これらのフィルターを新たなパラフ
ィルム上に再分布させる。
9. フィルターをＫimwipes を用いてプロットして乾燥
する。フィルターを１時間風乾させる。
する。フィルターを１時間風乾させる。
10．乾燥フィルターをゆるい金属キャップを有した無菌
のガラス試験管に入れ、それらを真空オーブン中におい
て８０℃で２時間焼付ける。これらのフィルターを真空
下に室温で貯蔵する。
のガラス試験管に入れ、それらを真空オーブン中におい
て８０℃で２時間焼付ける。これらのフィルターを真空
下に室温で貯蔵する。
Ａppendix Ｂ プローブの５′エンドのラベル化方法（キナーゼ化） 1. 約２０ pmolのプローブを凍結乾燥する。
2. １０μのエタノールで濯ぎ、試料を再び乾燥して
塩のないＤＮＡを得る。
塩のないＤＮＡを得る。
3. 次のキナーゼ緩衝液１０×濃縮液を調製する： ７００ｍＭ Tris・HCl 、pH7.6 １００ｍＭ MgCl2 １ｍＭ KCl ５０ｍＭ ジチオスレイトール 4. 乾燥試料を次の溶液に溶解する： λ−ＤＮＡに対して： １μキナーゼ緩衝液１０×濃縮液 １μ未ラベルＡＴＰ、16.5μＭ（或いは16.5 pmol） １μスペルミジン、１０ｍＭ １μ γ-32Ｐ ＡＴＰ、特異活性1000Ci/mmol、濃度
3.3pmoｌ／μ 全容量が９μになるまでH2O を添加する。或いはヒト
ＤＮＡに対して： １μキナーゼ緩衝液１０×濃縮液 １μスペルミジン、１０ｍＭ ６μ γ-32Ｐ ＡＴＰ、特異活性1000Ci/mmol、濃度
3.3pmol／μ 結果（両場合）２０pmol、ＤＮＡ、19.8pmolＡＴＰ 5. 試料を溶解後少なくとも２単位の活性を含有する１
μのＴ４キナーゼ（例、Ａmersham No.Ｔ2020）を添
加する。（全容量１０μ） 6. 溶液を３７℃において３０分間インキュベートす
る。凍結する。
3.3pmoｌ／μ 全容量が９μになるまでH2O を添加する。或いはヒト
ＤＮＡに対して： １μキナーゼ緩衝液１０×濃縮液 １μスペルミジン、１０ｍＭ ６μ γ-32Ｐ ＡＴＰ、特異活性1000Ci/mmol、濃度
3.3pmol／μ 結果（両場合）２０pmol、ＤＮＡ、19.8pmolＡＴＰ 5. 試料を溶解後少なくとも２単位の活性を含有する１
μのＴ４キナーゼ（例、Ａmersham No.Ｔ2020）を添
加する。（全容量１０μ） 6. 溶液を３７℃において３０分間インキュベートす
る。凍結する。
第１Ａ図はα１−抗トリプシン欠陥に対する試験結果を
示す。この試験は正常なＭオリゴマープローブにハイブ
リッド化したクローン化α１−抗トリプシン遺伝子（ｐ
ＡＴ９．６）、ＭＭ（正常−正常）及びＺＺ（欠陥−欠
陥）ホモ接合体細胞ＤＮＡコントロール、両親、及び危
険性のある胎児からのＤＮＡ試料に対するサザンブロッ
トを使用した。2.4 kbにおけるハンドは正常遺伝子の存
在を示す。 第１Ｂ図は欠陥Ｚオリゴマープローブにハイブリッド化
した同一のＤＮＡ試料を示す。2.4 kbにおけるバンドは
欠陥遺伝子の存在を示す。 第２Ａ，２Ｂ，及び２Ｃ図は本発明の方法の各種段階を
図示する。 第３図はλ−ファージＤＮＡ試料にハイブリッド化した
１５量体及び同一基材上の１５量体に隣接してハイブリ
ッド化された６５量体に連結した同一の１５量体により
構成される８０量体の溶融曲線分析の結果を示す。
示す。この試験は正常なＭオリゴマープローブにハイブ
リッド化したクローン化α１−抗トリプシン遺伝子（ｐ
ＡＴ９．６）、ＭＭ（正常−正常）及びＺＺ（欠陥−欠
陥）ホモ接合体細胞ＤＮＡコントロール、両親、及び危
険性のある胎児からのＤＮＡ試料に対するサザンブロッ
トを使用した。2.4 kbにおけるハンドは正常遺伝子の存
在を示す。 第１Ｂ図は欠陥Ｚオリゴマープローブにハイブリッド化
した同一のＤＮＡ試料を示す。2.4 kbにおけるバンドは
欠陥遺伝子の存在を示す。 第２Ａ，２Ｂ，及び２Ｃ図は本発明の方法の各種段階を
図示する。 第３図はλ−ファージＤＮＡ試料にハイブリッド化した
１５量体及び同一基材上の１５量体に隣接してハイブリ
ッド化された６５量体に連結した同一の１５量体により
構成される８０量体の溶融曲線分析の結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アレクサンダー エヌ．グレイザー アメリカ合衆国 カリフオルニア州 94563 オリンダ キヤノン ドライブ 135
Claims (27)
- 【請求項１】変性核酸を含む試料中の目標ヌクレオチド
配列を試験する方法において、 変性核酸を、目標配列の診断部分に相補的なプローブ及
びその診断部分に隣接するヌクレオチド配列に相補的な
プローブを用いて、診断プローブが目標配列を含む試料
核酸にのみ実質的に結合して残る条件下において処理
し、 診断プローブを隣接プローブに共有的に結合して目標配
列に相補的な目標プローブを与え、及び 試料中の目標プローブの存在或いは不存在を試験する 工程からなる目標核酸配列の試験方法。 - 【請求項２】変性ＤＮＡを目標配列の隣接部分に相補的
である第一のプローブで処理して、第一のプローブと変
性ＤＮＡの接合体を与え、 この接合体を第一のプローブよりも短かく且つ目標配列
の診断部分に相補的である第二のプローブで処理し、 第一のプローブが隣接部分を含有しない変性ＤＮＡに実
質的に結合せず且つ第二のプローブが診断部分を含有し
ない変性ＤＮＡに実質的に結合しない結合条件を提供
し、 第一のプローブと第二のプローブを連結し、 未連結プローブを除去する 工程を含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】変性された固定化核酸試料を高ストリンジ
ェンシー条件下に目標配列の隣接部分に相補的な第一の
プローブで処理し、 得られた生成物を、第二のプローブが診断部分を含有し
ない変性核酸とは実質的に結合しない低ストリンジェン
シー条件下において、目標配列の診断部分に相補的な第
二のより短いプローブで処理し、 第一及び第二のプローブを連結し、 未連結プローブを除去する 工程を含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】診断および隣接プローブの少なくとも一つ
がラベルされている特許請求の範囲第１〜３項のいずれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項５】ラベルが放射性ラベルである特許請求の範
囲第４項記載の方法。 - 【請求項６】ラベルが他のプローブの３′末端に連結さ
れる一つのプローブの５′末端における32Ｐである特許
請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】更に、結合されなかったプローブを除去し
た後、試料中の放射性活性の存在或いは不存在を検出す
る工程を含む特許請求の範囲第５または６項記載の方
法。 - 【請求項８】更に、結合されなかったプローブを除去し
た後、試料中に存在する放射性活性の量を測定する工程
を含む特許請求の範囲第５または６項記載の方法。 - 【請求項９】更に目標プローブを除去する工程を含む特
許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１０】目標プローブがストリンジェンシーを増
加することにより溶出される特許請求の範囲第９項記載
の方法。 - 【請求項１１】目標プローブが温度勾配を生じさせるこ
とにより溶出される特許請求の範囲第10項記載の方法。 - 【請求項１２】診断及び隣接プローブのラベルされてい
ない一方にフックが付着され、プローブの他方がラベル
を含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１３】目標プローブがフックを捕捉することに
より除去される特許請求の範囲第12項記載の方法。 - 【請求項１４】フックがビオチン部分を含んでなる特許
請求の範囲第13項記載の方法。 - 【請求項１５】フックがビオチン部分を結合するストレ
プトアビジンを用いて捕捉される特許請求の範囲第14項
記載の方法。 - 【請求項１６】より高いストリンジェンシーの条件下に
おいて、目標配列のその相補的部分に結合して残る診断
及び隣接プローブの一方をハイブリッド化し、 より低いストリンジェンシーの条件下に目標配列中のそ
の相補的部分に結合して残る診断及び隣接プローブの他
方をハイブリッド化し、 完全に結合されていない診断プローブの実質的部分を除
去し、 プローブを、それらが互に隣接して結合され、目標配列
に相補的な目標プローブを形成するように、核酸上の部
位において共有的に結合させ、 結合しなかったプローブを除去し、 試料中の目標プローブの存在を試験する 工程を含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１７】結合工程が、診断プローブの５′末端を
隣接プローブの３′末端と共有的に結合させることより
なる特許請求の範囲第16項記載の方法。 - 【請求項１８】結合工程が、隣接プローブの５′末端を
診断プローブの３′末端と共有的に結合させることより
なる特許請求の範囲第16項記載の方法。 - 【請求項１９】プローブをリガーゼを用いて結合する特
許請求の範囲第17または18項記載の方法。 - 【請求項２０】更に試料中の目標プローブの量を測定す
る工程を含む特許請求の範囲第16〜19項のいずれか１項
記載の方法。 - 【請求項２１】試験工程がストリンジェンシーを増加し
て目標プローブを除去することよりなる特許請求の範囲
第20項記載の方法。 - 【請求項２２】更に目標プローブの量を測定する工程を
含む特許請求の範囲第21項記載の方法。 - 【請求項２３】目標配列が公知の正常な配列からの遺伝
的突然変異に対応し、該方法が更に目標プローブの量を
遺伝的突然変異を有することが知られている核酸の検量
された標準と対比する工程を含む特許請求の範囲第20〜
22項のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２４】核酸試料中の目標配列を検出するための
診断キットであって、このキットは 目標配列の診断部分に相補的なプローブ、及び 目標配列の診断部分に隣接するヌクレオチド配列に相補
的なプローブ を含んでなり、これらのプローブが連結され得ることを
特徴とするキット。 - 【請求項２５】プローブの少なくとも一つがラベルされ
ている特許請求の範囲第24項記載のキット。 - 【請求項２６】プローブの一つがラベルされておらず、
それにフックを付着して有する特許請求の範囲第25項記
載のキット。 - 【請求項２７】更にフックを捕捉するための手段を含ん
でなる特許請求の範囲第26項記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/681,055 US4883750A (en) | 1984-12-13 | 1984-12-13 | Detection of specific sequences in nucleic acids |
| US681055 | 1984-12-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61191964A JPS61191964A (ja) | 1986-08-26 |
| JPH0644880B2 true JPH0644880B2 (ja) | 1994-06-15 |
Family
ID=24733629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60279367A Expired - Lifetime JPH0644880B2 (ja) | 1984-12-13 | 1985-12-13 | 目標核酸配列の試験方法およびキット |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4883750A (ja) |
| EP (1) | EP0185494B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0644880B2 (ja) |
| DE (1) | DE3586090D1 (ja) |
Families Citing this family (431)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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