JPH0380100A - 核酸の塩基配列変異検出方法及び試薬 - Google Patents
核酸の塩基配列変異検出方法及び試薬Info
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- JPH0380100A JPH0380100A JP1215490A JP21549089A JPH0380100A JP H0380100 A JPH0380100 A JP H0380100A JP 1215490 A JP1215490 A JP 1215490A JP 21549089 A JP21549089 A JP 21549089A JP H0380100 A JPH0380100 A JP H0380100A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、核酸の塩基配列変異検出方法及びそれに用い
られる試薬に関する。
られる試薬に関する。
［従来の技術］
従来より、遺伝子工学的手法により、微生物を宿主とし
て種々の有用物質が製造されている。
て種々の有用物質が製造されている。
これは−数的に有用物質をコードする遺伝子を宿主中で
自律増殖し得る適当なベクターに組込み。
自律増殖し得る適当なベクターに組込み。
得られた組換えベクターで宿主を形質転換し、形質転換
された宿主を培養して有用物質を回収することにより行
なわれる。しかしながら、組換えべフターが増殖する際
、その中に組込まれている有用遺伝子に突然変異が起き
、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変化する
おそれがある。
された宿主を培養して有用物質を回収することにより行
なわれる。しかしながら、組換えべフターが増殖する際
、その中に組込まれている有用遺伝子に突然変異が起き
、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変化する
おそれがある。
この危険性を避けるために、遺伝子が突然変異を起こし
ているか否かをチエツクする必要がある。
ているか否かをチエツクする必要がある。
また、遺伝子が突然変異を起こしているか否かのチエツ
クは遺伝病の診断においても行なわれている。
クは遺伝病の診断においても行なわれている。
従来、遺伝子の突然変異、特に遺伝病の点突然変異の有
無は以下のようにして検査されている。先ず、点突然変
異の存在する部位を含む部分を遺伝子増幅法により増幅
する。一方、正常型の遺伝子又はその部分に相補的な塩
基配列を有する正常型プローブと、点突然変異部位を含
む、異常型の遺伝子又はその部分に相補的な塩基配列を
有する異常型プローブを調製する。正常型及び異常型プ
ローブは放射標識、酵素標識又は蛍光標識のような適当
なマーカーで標識しておく。次いで、遺伝子増幅法によ
り増幅した遺伝子又は遺伝子部分をナイロンやニトロセ
ルロースメンブレンのような担体に固定する。担体」二
の非特異的結合部位をブロッキングした後、上記で作製
した正常型又は異常型プローブのいずれか一方を、担体
上に固定された試料とハイブリダイゼーションさせる。
無は以下のようにして検査されている。先ず、点突然変
異の存在する部位を含む部分を遺伝子増幅法により増幅
する。一方、正常型の遺伝子又はその部分に相補的な塩
基配列を有する正常型プローブと、点突然変異部位を含
む、異常型の遺伝子又はその部分に相補的な塩基配列を
有する異常型プローブを調製する。正常型及び異常型プ
ローブは放射標識、酵素標識又は蛍光標識のような適当
なマーカーで標識しておく。次いで、遺伝子増幅法によ
り増幅した遺伝子又は遺伝子部分をナイロンやニトロセ
ルロースメンブレンのような担体に固定する。担体」二
の非特異的結合部位をブロッキングした後、上記で作製
した正常型又は異常型プローブのいずれか一方を、担体
上に固定された試料とハイブリダイゼーションさせる。
洗浄後、担体上の標識を検出する。次いで、担体上の試
料をアルカリ処理して変性させ、もう一方のプローブと
ハイブリダイゼーションさせて標識を検出する。そして
、正常型及び異常型プローブをそれぞれ用いた際の担体
上の標識強度を比較して、その試料が正常型であるか異
常型であるかを判定する。
料をアルカリ処理して変性させ、もう一方のプローブと
ハイブリダイゼーションさせて標識を検出する。そして
、正常型及び異常型プローブをそれぞれ用いた際の担体
上の標識強度を比較して、その試料が正常型であるか異
常型であるかを判定する。
しかしながら、この従来方法は、極めて？ＦｔＥ４な操
作を必要とし、また、判定結果も必ずしもクリアーでは
なく、正常型か異常型かの判定が困難な場合も少なくな
い。これは次のような理由による。すなわち、例えば、
２０個のヌクレオチドがら成る（以下、２０ｍｅｒと記
載する）プローブを用いて遺伝子の点突然変異を検出す
る場合を例にとると、試料遺伝子が正常型の場合には、
正常型のプローブをハイブリダイズさせた場合には塩基
の相補性は２０／２０で完全に相補的である。一方、異
常型のプローブをハイブリダイズさせた場合には塩基の
相補性は１９／２（］である。２０／２０の相補性を有
する正常型プローブの方が１９７２（Ｉの相補性を有す
る異常型のプローブよりも試料との親和性が高いので、
この親和性の差を利用して、正常型プローブは洗浄除去
されないが異常型プローブは洗浄除去されるような温度
条件下で洗浄を行ない、洗浄後プローブが試料とハイブ
リダイズしたまま残留しているか否かにより判定を行な
う。しかしながら、２０／２０の相補性と１９７２０の
相補性との差異に起因する親和性の大きさの違いは極め
て小さく、この小さな親和性の差異を利用して判定を行
なうためには、洗浄の温度条件を極めて精密に、望まし
くはｌ／１００℃のオーダーで制御しなければならない
。しかしながら、洗浄液の温度を精密に制御することは
極めて困難である。このため、従来法によると、結果が
必ずしもクリアーに出ず、判定に苦しむことが少なくな
い。従って、判定結果の信頼性が低い。また、信頼性を
高めるために、上記操作は数回も繰り返して行なわれて
いる。このように、従来の方法では、精密な操作を必要
とする上に判定結果の信頼性も高くない。
作を必要とし、また、判定結果も必ずしもクリアーでは
なく、正常型か異常型かの判定が困難な場合も少なくな
い。これは次のような理由による。すなわち、例えば、
２０個のヌクレオチドがら成る（以下、２０ｍｅｒと記
載する）プローブを用いて遺伝子の点突然変異を検出す
る場合を例にとると、試料遺伝子が正常型の場合には、
正常型のプローブをハイブリダイズさせた場合には塩基
の相補性は２０／２０で完全に相補的である。一方、異
常型のプローブをハイブリダイズさせた場合には塩基の
相補性は１９／２（］である。２０／２０の相補性を有
する正常型プローブの方が１９７２（Ｉの相補性を有す
る異常型のプローブよりも試料との親和性が高いので、
この親和性の差を利用して、正常型プローブは洗浄除去
されないが異常型プローブは洗浄除去されるような温度
条件下で洗浄を行ない、洗浄後プローブが試料とハイブ
リダイズしたまま残留しているか否かにより判定を行な
う。しかしながら、２０／２０の相補性と１９７２０の
相補性との差異に起因する親和性の大きさの違いは極め
て小さく、この小さな親和性の差異を利用して判定を行
なうためには、洗浄の温度条件を極めて精密に、望まし
くはｌ／１００℃のオーダーで制御しなければならない
。しかしながら、洗浄液の温度を精密に制御することは
極めて困難である。このため、従来法によると、結果が
必ずしもクリアーに出ず、判定に苦しむことが少なくな
い。従って、判定結果の信頼性が低い。また、信頼性を
高めるために、上記操作は数回も繰り返して行なわれて
いる。このように、従来の方法では、精密な操作を必要
とする上に判定結果の信頼性も高くない。
［発明が解決しようとする問題点］
従って、本発明の目的は、従来法のような精密な操作を
必要とせず、それでいて従来法よりも結果がクリアーに
出て判定結果の信頼性が高い核酸の塩基配列変異検出方
法及び該方法に用いられる試薬を提供することである。
必要とせず、それでいて従来法よりも結果がクリアーに
出て判定結果の信頼性が高い核酸の塩基配列変異検出方
法及び該方法に用いられる試薬を提供することである。
［問題点を解決するための手段］
本願発明者は鋭意研究の結果、従来法において正常型プ
ローブと異常型プローブのそれぞれについて行なってい
たハイブリダイゼーションを、いずれか一方が標識され
た正常型プローブと異常型プローブとの混合プローブを
用いて単一の工程で行なうことにより、洗浄時に精密な
温度制御を行なわなくてち従来法よりもはるかにクリア
ーな結果が得られることを見出し本発明を完成した。
ローブと異常型プローブのそれぞれについて行なってい
たハイブリダイゼーションを、いずれか一方が標識され
た正常型プローブと異常型プローブとの混合プローブを
用いて単一の工程で行なうことにより、洗浄時に精密な
温度制御を行なわなくてち従来法よりもはるかにクリア
ーな結果が得られることを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、正常型塩基配列と相補的な塩基配
列を有する正常型プローブと、異常型塩基配列と相補的
な塩基配列を有する異常型プローブとの混合物であって
、前記正常型プローブ又は異常型プローブのいずれか一
方が標識された混合プローブを試料核酸と担体上でハイ
ブリダイズさせる工程と、未結合のプローブを洗浄除去
する工程と、前記担体上で前記標識を検出する工程とを
含む核酸の塩基配列変異検出方法を提供する。
列を有する正常型プローブと、異常型塩基配列と相補的
な塩基配列を有する異常型プローブとの混合物であって
、前記正常型プローブ又は異常型プローブのいずれか一
方が標識された混合プローブを試料核酸と担体上でハイ
ブリダイズさせる工程と、未結合のプローブを洗浄除去
する工程と、前記担体上で前記標識を検出する工程とを
含む核酸の塩基配列変異検出方法を提供する。
［発明の効果］
本発明の方法によると、試料核酸に対して正常型及び異
常型プローブが同時に競合的に反応するので、正常型プ
ローブと異常型プローブの試料に対する親和性の差が極
僅かなものであっても、１００％の相補性を有する方の
プローブがもう一方のプローブとの競合に勝って試料核
酸とハイブリダイズするので、精密な温度制御等を行な
わなくても極めてクリアーで信頼性の高い結果を得るこ
とができる。すなわち、本発明の方法は、従来法に比べ
て操作が簡便で信頼性が高い。本発明はまた、このよう
な効果を有する本発明の方法に用いられる新規な試薬を
提供した。
常型プローブが同時に競合的に反応するので、正常型プ
ローブと異常型プローブの試料に対する親和性の差が極
僅かなものであっても、１００％の相補性を有する方の
プローブがもう一方のプローブとの競合に勝って試料核
酸とハイブリダイズするので、精密な温度制御等を行な
わなくても極めてクリアーで信頼性の高い結果を得るこ
とができる。すなわち、本発明の方法は、従来法に比べ
て操作が簡便で信頼性が高い。本発明はまた、このよう
な効果を有する本発明の方法に用いられる新規な試薬を
提供した。
［発明の詳細な説明］
本発明の方法を適用し得る試料核酸としては、ＤＮＡ及
びＲＮＡを問わず核酸であれば良く、例えば遺伝子又は
その部分であるＤＮＡ、プロモーター等の遺伝子以外の
ＤＮＡ及びメツセンジャーＲＮＡ等のＲＮＡ等を挙げる
ことができる。
びＲＮＡを問わず核酸であれば良く、例えば遺伝子又は
その部分であるＤＮＡ、プロモーター等の遺伝子以外の
ＤＮＡ及びメツセンジャーＲＮＡ等のＲＮＡ等を挙げる
ことができる。
核酸試料は、生体等から分離したものをそのままで用い
ることもできるが、検査の精度を高めるために、いわゆ
る遺伝子増幅法により検査すべき核酸領域を増幅するこ
とが好ましい。すなわち、本発明の好ましい態様では、
試料核酸は、遺伝子増幅法により増幅されたものである
。遺伝子増幅法自体は公知であり、Ｒ，Ｋ、 ５ａｉｋ
ｉら、５ｃｉｅｎｃｅ、 ２３０．１３５０ ｆ１９８
５１）に記載されている。
ることもできるが、検査の精度を高めるために、いわゆ
る遺伝子増幅法により検査すべき核酸領域を増幅するこ
とが好ましい。すなわち、本発明の好ましい態様では、
試料核酸は、遺伝子増幅法により増幅されたものである
。遺伝子増幅法自体は公知であり、Ｒ，Ｋ、 ５ａｉｋ
ｉら、５ｃｉｅｎｃｅ、 ２３０．１３５０ ｆ１９８
５１）に記載されている。
この方法では、増幅すべきＤＮＡ領域を挟む部分、すな
わち、増幅すべきＤＮＡ領域の両端部に接する部分のぞ
れぞれと相補的な塩基配列を有する２種類のオリゴプラ
イマーを合成し、このオリゴプライマーを増幅すべきＤ
ＮＡとハイブリダイズさせ、ついでＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼを作用させて上記２つのプライマーを起点として
それぞれ相補的なりＮＡ鎖を伸長させ、伸長反応を停止
させた後に二本鎖ＤＮＡを変性し、再び上記２種類のプ
ライマーとハイブリダイズさせ、ＤＮＡの伸長、変性と
いうサイクルを繰返すことにより、２種類のプライマー
に挟まれたＤＮＡ領域を増幅する。サイクルをｎ回行な
えば、理論上、増幅すべき領域は２ｎ倍に増幅させる。
わち、増幅すべきＤＮＡ領域の両端部に接する部分のぞ
れぞれと相補的な塩基配列を有する２種類のオリゴプラ
イマーを合成し、このオリゴプライマーを増幅すべきＤ
ＮＡとハイブリダイズさせ、ついでＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼを作用させて上記２つのプライマーを起点として
それぞれ相補的なりＮＡ鎖を伸長させ、伸長反応を停止
させた後に二本鎖ＤＮＡを変性し、再び上記２種類のプ
ライマーとハイブリダイズさせ、ＤＮＡの伸長、変性と
いうサイクルを繰返すことにより、２種類のプライマー
に挟まれたＤＮＡ領域を増幅する。サイクルをｎ回行な
えば、理論上、増幅すべき領域は２ｎ倍に増幅させる。
従って、この遺伝子増幅法を適用すれば、極めて微量の
核酸であってもこれを例えば１００万倍程度に増幅させ
ることができるので、検査の限界及び精度を大きく高め
ることができる。
核酸であってもこれを例えば１００万倍程度に増幅させ
ることができるので、検査の限界及び精度を大きく高め
ることができる。
一方、正常型塩基配列と相補的な塩基配列を有する正常
型プローブと、異常型塩基配列と相補的な塩基配列を有
する異常型プローブとの混合プローブを調製する。プロ
ーブは従来と同様、化学合成により合成することもでき
るし、天然の供給源から切り出したものを増幅すること
により調製することもできる。正常型プローブ及び異常
型プローブのいずれか一方が標識されている。標識は従
来と同様、酵素標識、蛍光標識又は放射標識等により行
なうことができる。混合プローブ中の標識プローブと非
標識プローブの配合比率は特に限定されないがモル比で
１＝１から１＝５の範囲が好ましい。
型プローブと、異常型塩基配列と相補的な塩基配列を有
する異常型プローブとの混合プローブを調製する。プロ
ーブは従来と同様、化学合成により合成することもでき
るし、天然の供給源から切り出したものを増幅すること
により調製することもできる。正常型プローブ及び異常
型プローブのいずれか一方が標識されている。標識は従
来と同様、酵素標識、蛍光標識又は放射標識等により行
なうことができる。混合プローブ中の標識プローブと非
標識プローブの配合比率は特に限定されないがモル比で
１＝１から１＝５の範囲が好ましい。
次いで、常法により担体の非特異的結合部位をブロッキ
ングした後、担体上にて試料核酸と混合プローブとのハ
イブリダイゼーションを行なう。担体は、特に限定され
ないが、従来と同様、ニトロセルロースメンブレンやナ
イロンフィルター等、核酸との親和性の高いものが好ま
しい。
ングした後、担体上にて試料核酸と混合プローブとのハ
イブリダイゼーションを行なう。担体は、特に限定され
ないが、従来と同様、ニトロセルロースメンブレンやナ
イロンフィルター等、核酸との親和性の高いものが好ま
しい。
担体上に固定される試料核酸は一本鎖でなければならな
いので、試料核酸をアルカリ処理等により変性して一本
鎖にした後、担体上に固定する。
いので、試料核酸をアルカリ処理等により変性して一本
鎖にした後、担体上に固定する。
本領核酸の担体上への固定は、従来と同様、単に一本鎖
試料核酸を含む溶液を担体と接触させることにより行な
うことができる。
試料核酸を含む溶液を担体と接触させることにより行な
うことができる。
ハイブリダイゼーションは、従来と同様、担体上で、前
記混合プローブを試料核酸に対して過剰に反応させるこ
とにより行なうことができる。
記混合プローブを試料核酸に対して過剰に反応させるこ
とにより行なうことができる。
ハイブリダイゼーションは、正常型及び異常型プローブ
のα温度の近傍で行なうことができる。ここで、α温度
とは、ハイブリダイゼーションが最も起こりやすい温度
のことであり、ハイブリダイズするプローブの大きさや
、ＧＣ含量によりそれぞれ異なるちのである。プローブ
の大きさが２０ｍｅｒ程度の場合には、Ｑ ２Ｍ度は５
０°Ｃないし６０°Ｃの範囲内に存在するが、プローブ
の大きさがより大きい場合にはより高い温度範囲内に、
より小さい場合にはより低い温度範囲内に存在する。
のα温度の近傍で行なうことができる。ここで、α温度
とは、ハイブリダイゼーションが最も起こりやすい温度
のことであり、ハイブリダイズするプローブの大きさや
、ＧＣ含量によりそれぞれ異なるちのである。プローブ
の大きさが２０ｍｅｒ程度の場合には、Ｑ ２Ｍ度は５
０°Ｃないし６０°Ｃの範囲内に存在するが、プローブ
の大きさがより大きい場合にはより高い温度範囲内に、
より小さい場合にはより低い温度範囲内に存在する。
本発明の好ましい態様では、ハイブリダイゼーションは
、正常型及び異常型プローブのα温度（α温度はそれぞ
れのプローブについて存在するからその２つのα温度よ
りも高い温度）よりも高い温度からこれらのプローブの
α温度よりも低１ い温度まで温度を降下させながら行なう。このように温
度を降下させながらハイブリダイゼーションを行なうと
、プローブのα温度を必ず通過するので、精密な温度制
御を行なうことなく、ハイブリダイゼーションを行なわ
せることができるので極めて有利である。α温度は上述
のように用いるプローブによって異なるが、上記操作は
、通常、反応液の温度を約７０°Ｃ程度から５０″Ｃま
で徐々に降下させることにより達成することができる。
、正常型及び異常型プローブのα温度（α温度はそれぞ
れのプローブについて存在するからその２つのα温度よ
りも高い温度）よりも高い温度からこれらのプローブの
α温度よりも低１ い温度まで温度を降下させながら行なう。このように温
度を降下させながらハイブリダイゼーションを行なうと
、プローブのα温度を必ず通過するので、精密な温度制
御を行なうことなく、ハイブリダイゼーションを行なわ
せることができるので極めて有利である。α温度は上述
のように用いるプローブによって異なるが、上記操作は
、通常、反応液の温度を約７０°Ｃ程度から５０″Ｃま
で徐々に降下させることにより達成することができる。
上記ハイブリダイゼーション工程において、正常型のプ
ローブと異常型のプローブが試料核酸に対して競合的に
反応し、１００％の相補性を有するプローブが競合に打
ち勝って試料核酸とＡイブリダイズし、他方のプローブ
は実質的に全く試料核酸とハイブリダイズすることがで
きない。これはプローブのα温度付近で反応を行なうこ
とによって、又は上記のように反応温度を降下させてプ
ローブのα温度を通過させることによって常に達成する
ことができる。
ローブと異常型のプローブが試料核酸に対して競合的に
反応し、１００％の相補性を有するプローブが競合に打
ち勝って試料核酸とＡイブリダイズし、他方のプローブ
は実質的に全く試料核酸とハイブリダイズすることがで
きない。これはプローブのα温度付近で反応を行なうこ
とによって、又は上記のように反応温度を降下させてプ
ローブのα温度を通過させることによって常に達成する
ことができる。
２
ハイブリダイゼーション後、結合しなかったプローブ、
すなわち、１００％の相補性を有さない方のプローブ及
び１００％の相補性を有する過剰のプローブを洗浄除去
する。上述のように、ハイブリダイゼーション工程にお
いて、競合反応により、試料核酸は、１００％の相補性
を有する方のプローブのみとハイブリダイズしているの
で、従来法におけるように精密な温度条件下で洗浄を行
なう必要はなく、単に未結合のプローブを洗浄除去する
だけでよいので、従来法に比べて操作がはるかに簡便で
ある。
すなわち、１００％の相補性を有さない方のプローブ及
び１００％の相補性を有する過剰のプローブを洗浄除去
する。上述のように、ハイブリダイゼーション工程にお
いて、競合反応により、試料核酸は、１００％の相補性
を有する方のプローブのみとハイブリダイズしているの
で、従来法におけるように精密な温度条件下で洗浄を行
なう必要はなく、単に未結合のプローブを洗浄除去する
だけでよいので、従来法に比べて操作がはるかに簡便で
ある。
次いで、上記担体上で正常型又は異常型プローブのいず
れか一方に付された上記標識を検出する。標識の検出は
、従来と全く同様に行なうことができる。本発明の方法
では、混合プローブ中の正常型又は異常型プローブのい
ずれか一方のみが標識されているので、担体上で標識を
検出することによって、その試料が正常型か異常型かを
容易に判別することができる。
れか一方に付された上記標識を検出する。標識の検出は
、従来と全く同様に行なうことができる。本発明の方法
では、混合プローブ中の正常型又は異常型プローブのい
ずれか一方のみが標識されているので、担体上で標識を
検出することによって、その試料が正常型か異常型かを
容易に判別することができる。
本発明の方法では、ハイブリダイゼーション工程におい
て、試料核酸に対して１００％の相補性を有するプロー
ブのみが試料と結合するので、結果が極めてクリアーに
出、従来法におけるように正常型か異常型かの判定に苦
しむようなこともなく、信頼性の高い判定結果を得るこ
とができる。また、上記説明から明らかなように、従来
法におけるような精密な温度制御を必要とはしない。
て、試料核酸に対して１００％の相補性を有するプロー
ブのみが試料と結合するので、結果が極めてクリアーに
出、従来法におけるように正常型か異常型かの判定に苦
しむようなこともなく、信頼性の高い判定結果を得るこ
とができる。また、上記説明から明らかなように、従来
法におけるような精密な温度制御を必要とはしない。
本発明の方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列が正常か
否かをチエツクするあらゆる場合に適用することができ
る。例えば、本発明の方法は、遺伝子工学的手法により
有用物質を生産する際の組換えベクターに組込まれた有
用物質をコードする遺伝子が組換えベクターの増幅に伴
って突然変異を起こしているかどうかをチエツクするた
めに用いることができる。また、遺伝病の診断に用いる
こともできる。さらに、化学合成した核酸の塩基配列の
チエツクにも適用することが可能である。
否かをチエツクするあらゆる場合に適用することができ
る。例えば、本発明の方法は、遺伝子工学的手法により
有用物質を生産する際の組換えベクターに組込まれた有
用物質をコードする遺伝子が組換えベクターの増幅に伴
って突然変異を起こしているかどうかをチエツクするた
めに用いることができる。また、遺伝病の診断に用いる
こともできる。さらに、化学合成した核酸の塩基配列の
チエツクにも適用することが可能である。
本発明の方法は、正常型と異常型プローブの試料核酸に
対する親和性が同程度である場合、すなわち、点突然変
異の検査にその真価を最も発揮するが、点突然変異以外
の突然変異、すなわち、２又はそれ以上の塩基が置換さ
れているような突然変異の検査にも適用することができ
る。さらに、本発明の方法は、突然変異以外の変異、例
えば、上述のように核酸を化学合成した場合に、その化
学合成が正しく行なわれたか否かをチエツクする場合等
に６適用することができる。
対する親和性が同程度である場合、すなわち、点突然変
異の検査にその真価を最も発揮するが、点突然変異以外
の突然変異、すなわち、２又はそれ以上の塩基が置換さ
れているような突然変異の検査にも適用することができ
る。さらに、本発明の方法は、突然変異以外の変異、例
えば、上述のように核酸を化学合成した場合に、その化
学合成が正しく行なわれたか否かをチエツクする場合等
に６適用することができる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
もっとも、本発明は、下記実施例に限定される６のでは
ない。
ない。
［実施例］
プリン代謝系酵素であるＡＰＲＴ （アデニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ）ＤＮＡの突然変異分析 ｌ、試料の調製 ヒト末梢血（５−１０μｍ）から比重液を用いてリンパ
球を分離し常法に従ってＤＮＡを抽出した。
ボシルトランスフェラーゼ）ＤＮＡの突然変異分析 ｌ、試料の調製 ヒト末梢血（５−１０μｍ）から比重液を用いてリンパ
球を分離し常法に従ってＤＮＡを抽出した。
５
２ 遺伝子増幅法による特定領域の増幅増幅に必要な以
下のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成器で合成した。
下のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成器で合成した。
Ｊ突然変異域ニ
プライマー１． ＰＮ−１０（センス、２０塩基）プラ
イマー１’、ＰＮ−５（センス、２０塩基）プライマー
２、ＰＮ−９（アンチセンス、２０塩基） （５’−ＣＡＧ ＣＤＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧ
−３’のアンチセンス） ＰＮ−１０／ＰＮ−９で挟まれる増幅域は２３４塩基、
ＰＮ−５／ＰＮ−９で挟まれる増幅域は４２７塩基であ
り、これらのどちらかの組合せを用いて増幅したＤＮＡ
と以下のそれぞれのプローブとのハイブリタイゼション
を行なった。
イマー１’、ＰＮ−５（センス、２０塩基）プライマー
２、ＰＮ−９（アンチセンス、２０塩基） （５’−ＣＡＧ ＣＤＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧ
−３’のアンチセンス） ＰＮ−１０／ＰＮ−９で挟まれる増幅域は２３４塩基、
ＰＮ−５／ＰＮ−９で挟まれる増幅域は４２７塩基であ
り、これらのどちらかの組合せを用いて増幅したＤＮＡ
と以下のそれぞれのプローブとのハイブリタイゼション
を行なった。
６
正常型プロ
ブ、
ＰＮ
４（１９塩基）
Ｊ型（異常型）プローブ、ＰＮ−３＋１９塩基）３、遺
伝子増幅法 （ａｌ →）−ンプルの調製 上記１で調製したＤＮＡ試料の一部をとり、Ｔｒｉｓ−
ＥＤＴＡ （ＴＥＩ で０．１ ｔＬｇ／μｌに濃度調
整し、５０μｌとした。次いて９５℃で５分間加熱し、
変性した。−度かくはん後６．００Ｏｒｐｍ、 ３０秒
遠心し以下の操作に用いた（保存するときはこのままで
４°Ｃか一２０°Ｃで）。
伝子増幅法 （ａｌ →）−ンプルの調製 上記１で調製したＤＮＡ試料の一部をとり、Ｔｒｉｓ−
ＥＤＴＡ （ＴＥＩ で０．１ ｔＬｇ／μｌに濃度調
整し、５０μｌとした。次いて９５℃で５分間加熱し、
変性した。−度かくはん後６．００Ｏｒｐｍ、 ３０秒
遠心し以下の操作に用いた（保存するときはこのままで
４°Ｃか一２０°Ｃで）。
（ｂ１反応混合物の作製
１チューブ当り以下の容量でサンプル数に合わせて作製
した。
した。
１０Ｘバッファー：
５００μｍ
ｄＮＴＰ混合物ｆ４ＮＴＰ） ：
８．００μｌ
ポリメラーゼ。
０．５０μ↓
計 １４．００μｍ
（Ｃ１遺伝子増幅 上記１４．００μｍの反応混合物を蒸留水３１００μｌ
及び上記ｌで得られたＤＮＡ試料（０，１）Ｌｇ／μｍ
）５．圓ＬＬ１と混合し、遠心した後、鉱油を２滴加え
、再度遠心した。これを自動温度コントロラーにセット
し、９４℃２分間、６５°Ｃ３分間及び７２°Ｃ３分間
のサイクルを３５回繰返して２つのプライマーで挟まれ
た領域を増幅し、最後は４℃で保存した。
（Ｃ１遺伝子増幅 上記１４．００μｍの反応混合物を蒸留水３１００μｌ
及び上記ｌで得られたＤＮＡ試料（０，１）Ｌｇ／μｍ
）５．圓ＬＬ１と混合し、遠心した後、鉱油を２滴加え
、再度遠心した。これを自動温度コントロラーにセット
し、９４℃２分間、６５°Ｃ３分間及び７２°Ｃ３分間
のサイクルを３５回繰返して２つのプライマーで挟まれ
た領域を増幅し、最後は４℃で保存した。
４、ドットブロッナインク法
（ａ＋上記３（Ｃ）の反応液５０ｕｌ中４０μｍをとり
、０．４Ｍ ＮａＯＨ溶液（２５ｍＭ ＥＤＴＡ ２Ｎ
ａを含む）４００μｌと混合した。
、０．４Ｍ ＮａＯＨ溶液（２５ｍＭ ＥＤＴＡ ２Ｎ
ａを含む）４００μｌと混合した。
ｆｂｌ ハイブリドツト（バイオラッド社製）の器具に
ろ紙及びナイロンフィルター（いずれも予めＺ ｘ Ｓ
ＳＣ液に浸したもの）をセットし、吸引しながら上記ｆ
ａｌの試料２００μｍを各社に施した。完全に吸引後、
２ ｘ ＳＳＣ液２１］［）μｍを施し洗浄を行なった
。
ろ紙及びナイロンフィルター（いずれも予めＺ ｘ Ｓ
ＳＣ液に浸したもの）をセットし、吸引しながら上記ｆ
ａｌの試料２００μｍを各社に施した。完全に吸引後、
２ ｘ ＳＳＣ液２１］［）μｍを施し洗浄を行なった
。
（ｃｌ ハイブリドツト器具からフィルターをはずし、
紫外線で２分間照射後、後述のハイブリダイゼーション
操作を行なった。
紫外線で２分間照射後、後述のハイブリダイゼーション
操作を行なった。
５、オリゴプローブの５°末端標識
常法により、下記組成を有する反応液を３７℃で１時間
インキュベートした後、Ｑｕｉｃ ５ｐｉｎＧ２５カラ
ム（ベーリンガーーマンハイム社製）により分離した（
３００口ｒｐｍで２分間遠心）。
インキュベートした後、Ｑｕｉｃ ５ｐｉｎＧ２５カラ
ム（ベーリンガーーマンハイム社製）により分離した（
３００口ｒｐｍで２分間遠心）。
オリゴプローブ
０．６
Ｌ１
蒸留水
５．４
μｍ
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ ２．０μｌγ−３２Ｐ
−ＡＴＰ ｌＯ９０μｍ 計 ２０．
０ μ１６、プレハイブリダイゼーション及びハイブリ
ダイゼーション ｆａｔ ブレハイブリダイゼーション 下記組成を有する溶液を１０ ｃｍ ｘ ２０ ｃｍの
フィルター当たり２０ｍ１施し、５６℃で２時間インキ
ュベートした。
−ＡＴＰ ｌＯ９０μｍ 計 ２０．
０ μ１６、プレハイブリダイゼーション及びハイブリ
ダイゼーション ｆａｔ ブレハイブリダイゼーション 下記組成を有する溶液を１０ ｃｍ ｘ ２０ ｃｍの
フィルター当たり２０ｍ１施し、５６℃で２時間インキ
ュベートした。
５ ｘ ５ＳＰＥ
５Ｘデンハルツ溶液
０゜５％５Ｏ３
（ｂｌ ハイブリダイゼーション
ｌＬＬｇのアンチプローブ（標識プローブがＰＮ−３の
場合には非標識ＰＮ−４、標識プロー ０ ブがＰＮ−４の場合には非標識ＰＮ−３）を含む上記標
識プローブ溶液（２〜５ｘ１０６ｄｐｍ／ｍ１）４〜５
ｍｌをフィルターに加え、先ず６０℃で３０分インキュ
ベートし、次いで温度を３０分かけて６０°Ｃから５０
℃に降下させ、さらに５０’Ｃで３０分間インキュベー
トした。
場合には非標識ＰＮ−４、標識プロー ０ ブがＰＮ−４の場合には非標識ＰＮ−３）を含む上記標
識プローブ溶液（２〜５ｘ１０６ｄｐｍ／ｍ１）４〜５
ｍｌをフィルターに加え、先ず６０℃で３０分インキュ
ベートし、次いで温度を３０分かけて６０°Ｃから５０
℃に降下させ、さらに５０’Ｃで３０分間インキュベー
トした。
７、洗浄
２ ｘ ５ＳＰＥ７０．１％ＳＯ３で、（１）室温で１
０分間２回、（２）５′０℃で３０分間１回洗浄した。
０分間２回、（２）５′０℃で３０分間１回洗浄した。
８、オートラジオグラフィー
ｆａ）常法により、オートラジオグラフィーを３〜１２
時間行なった。
時間行なった。
（ｂｌ結果
結果を図に示す。
図から明らかなように、試料ＤＮＡのＡＰＲＴの遺伝子
型がＮ／Ｎである場合には、正常型プローブを標識した
混合プローブを用いると濃いスポットが検出されたがＪ
型（異常型）プローブを標識した混合プローブを用いた
場合には、スポットは全く検出されなかった。同様に、
試料ＤＮＡのＡＰＲＴの遺伝子型がＪ／Ｊである場合に
は、正常型プローブを標識した混合プローブを用いると
スポットは全く検出されず、Ｊ型（異常型）プローブを
標識した混合プローブを用いると濃いスポットが検出さ
れた。さらに、遺伝子型がＪ／Ｊの場合には、いずれの
混合プローブを用いた場合にも上記両者の中間程度の濃
度のスポットが検出された。
型がＮ／Ｎである場合には、正常型プローブを標識した
混合プローブを用いると濃いスポットが検出されたがＪ
型（異常型）プローブを標識した混合プローブを用いた
場合には、スポットは全く検出されなかった。同様に、
試料ＤＮＡのＡＰＲＴの遺伝子型がＪ／Ｊである場合に
は、正常型プローブを標識した混合プローブを用いると
スポットは全く検出されず、Ｊ型（異常型）プローブを
標識した混合プローブを用いると濃いスポットが検出さ
れた。さらに、遺伝子型がＪ／Ｊの場合には、いずれの
混合プローブを用いた場合にも上記両者の中間程度の濃
度のスポットが検出された。
上記結果から、本発明の方法を用いると、精密な温度制
御を必要とすることなく、極めてクリアーな結果が得ら
れることがわかる。
御を必要とすることなく、極めてクリアーな結果が得ら
れることがわかる。
図は、本発明の方法を適用してＡＰＲＴの遺伝子型を決
定した際のオートラジオグラフィーの結果を示す。
定した際のオートラジオグラフィーの結果を示す。
Claims (5)
- （１）正常型塩基配列と相補的な塩基配列を有する正常
型プローブと、異常型塩基配列と相補的な塩基配列を有
する異常型プローブとの混合物であって、前記正常型プ
ローブ又は異常型プローブのいずれか一方が標識された
混合プローブを担体上で試料核酸とハイブリダイズさせ
る工程と、未結合のプローブを洗浄除去する工程と、前
記担体上で前記標識を検出する工程とを含む核酸の塩基
配列変異検出方法。 - （２）前記ハイブリダイゼーションは、正常型及び異常
型プローブのα温度よりも高い温度から該α温度よりも
低い温度まで温度を降下させながら行なう請求項１記載
の方法。 - （３）点突然変異の検出方法である請求項１又は２記載
の方法。 - （４）試料核酸は遺伝子増幅法で増幅されたものである
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。 - （５）正常型塩基配列と相補的な塩基配列を有する正常
型プローブと、異常型塩基配列と相補的な塩基配列を有
する異常型プローブとの混合物であって、前記正常型プ
ローブ又は異常型プローブのいずれか一方が標識された
混合プローブから成る核酸の塩基配列変異検出試薬。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1215490A JPH0380100A (ja) | 1989-08-22 | 1989-08-22 | 核酸の塩基配列変異検出方法及び試薬 |
| EP19900309206 EP0415638A3 (en) | 1989-08-22 | 1990-08-22 | Methods for detecting variations in base sequences of nucleic acids and reagents therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1215490A JPH0380100A (ja) | 1989-08-22 | 1989-08-22 | 核酸の塩基配列変異検出方法及び試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0380100A true JPH0380100A (ja) | 1991-04-04 |
Family
ID=16673249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1215490A Pending JPH0380100A (ja) | 1989-08-22 | 1989-08-22 | 核酸の塩基配列変異検出方法及び試薬 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0415638A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0380100A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0304184A1 (en) * | 1987-07-31 | 1989-02-22 | Gen-Probe Incorporated | Assay for polynucleotides employing oligonucleotides to eliminate undesirable cross reactions |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4883750A (en) * | 1984-12-13 | 1989-11-28 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
-
1989
- 1989-08-22 JP JP1215490A patent/JPH0380100A/ja active Pending
-
1990
- 1990-08-22 EP EP19900309206 patent/EP0415638A3/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0304184A1 (en) * | 1987-07-31 | 1989-02-22 | Gen-Probe Incorporated | Assay for polynucleotides employing oligonucleotides to eliminate undesirable cross reactions |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0415638A3 (en) | 1993-07-21 |
| EP0415638A2 (en) | 1991-03-06 |
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