KR20070112155A - 가용성 Ｇ-단백질 연결 수용체(ｓＧＰＣＲ)와 관련된조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가용성 G-단백질 연결 수용체(sGPCR)와 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 양상에서 본 발명은, 이에 제한되는 것은 아니지만, CRFR2, CRFR1 및 이의 기능성 변이체 또는 시그날 전달가능 변이체를 포함하여, 가용성 부신피질자극호르몬 방출 인자 수용체 관련 단백질인 sCRFR2와 관련된 조성물 및 방법뿐만 아니라, sCRFR2가 CRFR 시그날 전달 및 CRF 계열 리간드와 CRFR 수용체간의 상호작용에 미치는 효과를 포함한다.

G-단백질 연결 수용체, CRFR 2, CRFR 1, CRF 계열 리간드

Description

가용성 Ｇ-단백질 연결 수용체(ｓＧＰＣＲ)와 관련된 조성물 및 방법{Compositions and methods related to soluble G-protein coupled receptors (sGPCRs)}

본 출원은, 그 전문이 본원에 참조로서 인용된, 2005년 2월 8일자로 출원된 미국 가특허 출원번호 제60/650,866호에 대하여 우선권을 주장한다.

미국 정부는 NIDDK로부터 허가번호 DK 26741에 따라 본 발명의 권리를 소유한다.

본 발명은 일반적으로 분자생물학, 신경학, 및 내분비학과 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특정 양상에서, GPCR 활성의 조절인자 및/또는 이러한 가용성 GPCR에 결합하는 리간드의 약리학적 효과의 조절인자로서, 가용성 G-단백질 연결 수용체(sGPCR)를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

수용체는, 일반적으로, 항원, 호르몬, 또는 신경전달물질과 같은 물질과 약하고 가역적인 결합을 형성하는, 세포막에 또는 세포안에 위치한 분자 구조이다. 각각의 수용체는 특정 물질(들)과 결합하도록 되어있다. 수용체 중의 하나의 특정한 계열은 7 막관통(seven transmembrane; "7TM") 또는 G-단백질 연결 수용체("GPCR")이다. 이들 수용체는, 적당한 물질이 수용체에 결합했을 때 시그날을 보내기 위해서 구아닌 뉴클레오타이드-결합 G-단백질("G-단백질")과 연결된다. G-단백질이 구아닌 디포스페이트("GDP")와 결합하면, G-단백질은 불활성화, 또는 "꺼진 상태"이다. 그리고, G-단백질이 구아닌 트리포스페이트("GTP")와 결합하면, G-단백질은 활성화, 또는 "켜진 상태"이고, 이에 의해 세포에서 생물학적 반응의 활성화가 매개된다.

GPCR은 공통적인 구조 모티프(motif)를 공유한다. 모든 이들 수용체에는, 7개의 22개 내지 24개 소수성 아미노산의 서열이 있어서, 7개의 알파 나선을 형성하고, 각각 막을 관통한다(즉, 막관통-1(TM-1), 막관통-2(TM-2), 등). 막관통 나선은, 세포막 외부, 즉 "세포외"측에서 막관통-2와 막관통-3, 막관통-4와 막관통-5, 및 막관통-6과 막관통-7 사이의 아미노산 가닥에 의해서 연결된다(이들은 "세포외 루프(loop)" 또는 "세포외"영역이라고 지칭된다). 막관통 나선은 또한, 세포막 내부, 즉 "세포내"측에서 막관통-1과 막관통-2, 막관통-3과 막관통-4, 및 막관통-5와 막관통-6 사이의 아미노산 가닥에 의해서 연결된다(이들은 "세포내루프" 또는 "세포내"영역이라고 지칭된다). 수용체의 "카복시"("C") 말단은 세포안의 세포내공간에 있고, 수용체의 "아미노"("N") 말단은 세포밖의 세포외공간에 있다.

일반적으로, 리간드가 수용체와 결합하여 수용체를 "활성화"시키면, 세포내영역의 구조가 변화하여 세포내영역과 세포내 "G-단백질"이 연결된다. GPCR은 G- 단백질에 관하여 "무차별적", 즉, GPCR은 하나 이상의 G-단백질과 상호작용할 수 있음이 보고되었다[참조: Kenakin, 1988]. 비록 다른 G-단백질이 존재하더라도, 현재, 동정된 G-단백질은 Gq, Gs, Gi, 및 Go이다. 리간드에 의해 활성화된 GPCR이 G-단백질과 연결되면, 시그날 전달 연속단계(signaling cascade) 과정 또는 시그날 전달(signal transduction)이 시작된다. 정상적인 조건하에서, 시그날 전달은 궁극적으로 세포를 활성화시키거나 억제한다. 수용체의 카복시 말단뿐만 아니라 세번째 세포내루프(IC-3)도 G-단백질과 상호작용하는 것으로 사료된다.

일반적으로, 신체에서 거의 모든 세포의 활성은 세포외 시그날에 의해서 조절된다. 사람뿐만 아니라 다양한 유기체에서 많은 생리학적 현상은 GPCR을 통한 단백질 매개 막관통 시그날 전달을 사용한다. 특정 GPCR로부터 발생한 시그날은 세포안에서 G-단백질을 활성화시킨다. 시그날의 대다수는 GPCR에 의해서 세포내부로 전달된다. 이 시그날 전달 과정에는 많은 다양한 양상이 있고, 이는 GPCR의 다수의 수용체 서브타입 및 GPCR의 G-단백질에 연결되는 상대뿐만 아니라 연결된 다양한 세포내 2차 메신저를 포함한다. 시그날 전달은, 관련되는 단백질에 따라서 세포내 과정 또는 과정들의 전체적 또는 부분적 활성화 또는 불활성화를 일으킬 수 있다. GPCR에 결합하는 중요한 시그날 전달 분자 또는 신경전달물질은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 부신피질자극호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 모르핀, 도파민, 히스타민, 5-하이드록시트립타민, 아데노신, 칼시토닌, 위장 억제 펩티드(GIP), 글루카곤, 성장호르몬-방출 호르몬(GHRH), 부갑상선 호르몬(PTH), PACAP, 세크레틴, 혈관작용 장관 폴리펩티드(VIP), 이뇨 호르몬, EMR1, 라트로필린, 뇌-특 이적 혈관형성 억제제(BAI), 카드헤린, EGF, LAG, (CELSR), 및 다른 유사한 단백질 또는 분자를 포함한다.

GPCR은 단백질 상위군(superfamily)을 구성한다. 현재 2000개 이상의 GPCR이 문헌에 보고되었고, 이는 적어도 3개의 계열로 분류된다: 로돕신-유사 계열(A계열), 칼시토닌 수용체(B계열), 및 대사자극성 글루타메이트 계열(C계열) [참조: Ji et al., 1998]. 보고된 GPCR에는, 특성이 규명된 수용체 및, 리간드가 아직 동정되지 않은 고아(orphan) 수용체가 포함되어 있다[참조: Wilson et al., 1999; Wilson et al., 1998; Marchese et al., 1999]. GPCR의 수가 많음에도 불구하고, 일반적으로, 각각의 GPCR은 유사한 분자 구조를 공유한다. 각각의 GPCR은 다양한 길이의 일련의 아미노산 잔기를 포함한다. 막관통이라고 부르는 7개의 구별되는 코일 형태로 GPCR은 세포막 안에 있다. GPCR의 아미노 말단은 세포외 루프와 함께 세포밖에 있는 반면에, 카복시 말단은 세포내루프와 함께 세포안에 있다.

GPCR에 대한 리간드는 작은 분자뿐만 아니라 펩티드 및 작은 단백질도 포함한다. 이들 리간드와 수용체 사이의 상호작용은 시스템마다 다르지만, 4개의 세포외 도메인과 N-말단 중의 몇개의 잔기와 상호작용을 해야할 수도 있다. 어떤 경우에는, N-말단이 단독으로 리간드와 상호작용 또는 결합할 수 있는 능력을 유지할 수 있다. 리간드가 알려진 GPCR은 다발성 경화증, 당뇨병, 류마티스 관절염, 천식, 알레르기, 염증성 장질환, 몇몇 암, 갑상선 장애, 심장 질환, 색소성 망막염, 비만, 신경학적 장애, 골다공증, 사람 면역결핍 바이러스("HIV") 감염 및 후천성 면역 결핍 증후군("AIDS")을 포함하는 많은 질병과 관련되어 있다[참조: Murphy et al., 2000; Mannstadt et al., 1999; Berger et al., 1999; Jacobson et al., 1997; Meij, 1996].

따라서, 치료제로서 사용하기 위하여 GPCR의 조절인자 및 GPCR에 결합하는 리간드를 생산하는 방법이 당해 기술분야에서 필요하다. 이들 치료제는 GPCR과 관련된 질병 및/또는 장애를 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

발명의 간단한 요약

본 발명은 sGPCR 리간드 결합 도메인과 관련된 조성물 및 방법뿐만 아니라, sGPCR이 GPCR 시그날 전달 및 GPCR 리간드와 GPCR 사이의 상호작용에 미치는 효과에 관한 것이다.

본 발명의 양태는 분리된 가용성 G-단백질 연결 수용체(sGPCR) 리간드 결합 도메인을 포함한다. sGPCR은 GPCR 세포외 도메인의 전체 또는 부분을 포함한다. 본 발명의 한 양상에서 sGPCR은 GPCR B계열 일원의 가용성 형태이다. 추가의 양상에서 sGPCR은 GPCR B1 하위군(subfamily) 일원이다. 추가의 양상에서, sGPCR은 가용성 세크레틴 수용체, VPAC₁ 수용체, VPAC₂ 수용체, PAC₁ 수용체, 글루카곤 수용체, 성장호르몬 방출 호르몬(GHRH) 수용체, 글루카곤-관련 펩티드 1(GLP-1) 수용체, 글루카곤-관련 펩티드 2(GLP-2) 수용체, 위장 억제 폴리펩티드(GIP) 수용체, 부신피질자극호르몬 방출 인자 1(CRF1) 수용체, 부신피질자극호르몬 방출 인자 2(CRF2) 수용체, 부갑상선 호르몬 1(PTH1) 수용체, 부갑상선 호르몬 2(PTH2) 수용체, 칼시토닌 수용체-유사 수용체, 또는 칼시토닌 수용체이다. sGPCR은 가용성 PTH1 수용체 또는 PTH2 수용체일 수 있다. 본 발명의 양태는 또한, 부신피질자극호르몬 방출 인자 수용체 2α형(sCRFR2α)의 가용성 형태인 sGPCR을 포함한다. sCRFR2α의 아미노산 서열은, CRFR2α 유전자의 엑손 3번, 4번, 및 5번에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하거나, 엑손 6번 이상을 포함하지 않는다. 본 발명의 재조합 sGPCR은, 아미노 말단 세포외 도메인의 전체 또는 부분을 포함하는, GPCR 세포외 도메인의 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 135, 140, 150, 155, 160, 180, 200개 이상(이들 사이의 모든 범위를 포함)의 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 양상에서, sGPCR 리간드 결합 도메인은 서열번호 4(sCRFR2α), 서열번호 8(sCRFR2β), 서열번호 12(sCRFR2γ), 또는 서열번호 15(mCRFR2α)의 50, 75, 100, 125, 150개 이상의 아미노산과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 98% 유사한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가의 양상에서, sCRFR은 서열번호 4, 8, 12, 15의 아미노산 서열 또는 이의 조합을 포함한다. 추가의 양상에서, 본 발명은, 친화성 태그(affinity tag), 표지(label), 검출가능한 또는 치료학적 화학적 부분, 비오틴/아비딘 표지, 방사성핵종(radionuclide), 검출가능한 또는 치료학적 효소, 형광 마커, 화학발광 마커, 면역글로불린 도메인 또는 이의 임의의 조합을 추가로 포함하는, 분리된 sGPCR을 포함한다. 한 양상에서, GPCR은 면역글로불린 도메인, 특히 Fc 도메인을 포함한다. sGPCR은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 중합체에 접합될 수 있다.

본 발명의 양태는 본 발명의 sGPCR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는, sGPCR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에, 작용가 능하게(operably) 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. sGPCR을 암호화하는 서열은 발현 카세트(expression cassette) 내에 포함될 수 있다. 발현 카세트는 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 발현 벡터는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 선형 핵산, 플라스미드 발현 벡터, 또는 바이러스 발현 벡터를 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 발현 벡터는 전달 벡터내에 포함되고, 이는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 리포좀, 폴리펩티드, 다가양이온, 지질, 세균, 또는 바이러스를 포함할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태는,

a) 표적 조직과 sGPCR을 접촉시키는 단계; 및

b) 표적 조직의 근처에 있는 GPCR 리간드와 결합시켜 조직의 GPCR 활성이 조절되는 단계를 포함하는, G-단백질 연결 수용체(GPCR)의 활성을 조절하는 방법을 포함한다. 리간드는 GPCR B계열 리간드, GPCR B1 하위군 리간드일 수 있다. 특정 양상에서, 리간드는 부신피질자극호르몬 방출 인자 (CRF), 유로코르틴 1, 유로코르틴 2, 유로코르틴 3, 스트레스코핀, 부갑상선 호르몬, PTH-관련 호르몬, TIP39, 칼시토닌, 아밀린, CGRP(CALCA 및 CALCB), 아드레노메둘린, 세크레틴, VIP, PACAP, 글루카곤, GHRH, GLP-1, GLP-2, GIP, 또는 이의 임의의 조합체이다. 방법은 또한,

a) 적당한 약제 용액 중에서 용해된 sGPCR 리간드 결합 도메인을 제조하는 단계; 및

b) 동물의 표적 조직에 있는 표적 리간드의 결합에 영향을 미치는 양으로, 동물, 사람, 피험자, 및/또는 환자에게 약제 용액을 투여하는 단계를 포함하는, 표 적 조직과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 투여는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 섭취, 주사, 내시경 또는 관류일 수 있다. 주사는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 두개내 또는 복막내 주사를 포함한다. 치료, 개선, 조절될 수 있는, 중증도가 감소될 수 있는 장애는, GPCR의 과활성화 또는 GPCR 리간드의 과다분비로부터 발생하는 장애를 포함한다. 특정 양상에서, 장애는 인슐린 민감성 또는 제2형 당뇨병이다. 장애는 또한, 불안-관련 장애; 기분 장애; 외상후 스트레스 장애; 핵상 마비(supranuclear palsy); 면역 억제; 약물 또는 알코올 금단 증상; 염증성 장애; 통증; 천식; 건선 및 알레르기; 공포증; 스트레스에 의한 수면 장애; 섬유근육통(fibromyalgia); 기분저하증(dysthymia); 양극성 장애; 순환성 기분장애(cyclothymia); 피로 증후군; 스트레스에 의한 두통; 암; 사람 면역결핍 바이러스 감염; 신경퇴행성 질환; 위장관 질환; 섭식 장애; 출혈성 스트레스; 스트레스에 의한 정신병적 에피소드; 정상갑상선 기능 증후군(euthyroid sick syndrome); 항이뇨 호르몬 이상 증후군(syndrome of inappropriate antidiuretic hormone); 비만; 불임; 두부 외상; 척수 외상; 허혈성 신경 손상; 흥분독성 신경 손상; 간질; 심혈관 및 심장 관련 장애; 면역 기능장애; 근육 경련; 요실금; 알츠하이머형 노인 치매; 다발 경색성 치매; 근위축성 측삭 경화증; 약물 의존증 및 중독증; 정신사회적 왜소증; 인슐린 과민성 또는 저민감성, 저혈당증, 피부 장애; 또는 탈모를 포함할 수 있다. 특정한 양상에서, 장애는 불안-관련 장애; 기분 장애; 양극성 장애; 외상후 스트레스 장애; 염증성 장애; 약물 의존증 및 중독증; 위장관 장애; 또는 피부 장애이다. 추가의 양상에서, 불안-관련 장애가 범불안 장애이거나, 기분 장애가 우울증이다. 추가의 양상에서, 위장관 장애는 과민성 장 증후군이다.

본 발명의 다른 양태는,

a) GPCR 리간드를 함유하는 것으로 짐작되는 샘플을 sGPCR 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및

b) sGPCR 폴리펩티드에 결합된 리간드의 존재 여부를 평가하는 단계를 포함하는, GPCR 리간드를 검출하는 방법을 포함한다. 당해 방법은, 결합된 리간드의 특성을 규명하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 결합된 리간드의 특성을 규명하는 단계는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 다양한 크로마토그래피, 질량분석법, 펩티드 서열결정 등을 포함한다. sGPCR 폴리펩티드는 기질 또는 표면에 작용가능하게 연결되거나 연결되지 않을 수 있다. 당해 방법은,

c) 방사성 표지된 GPCR 리간드를 투여하는 단계; 및

d) 방사성 표지된 GPCR 리간드의 sGPCR과의 결합 또는 결합에 대한 경쟁을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. GPCR 리간드는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 부신피질자극호르몬 방출 인자 (CRF), 유로코르틴 1, 유로코르틴 2, 유로코르틴 3, 부갑상선 호르몬, PTH-관련 호르몬, TIP39, 칼시토닌, 아밀린, CGRP(CALCA 및 CALCB), 아드레노메둘린, 세크레틴, VIP, PACAP, 글루카곤, GHRH, GLP-1, GLP-2, 또는 GIP를 포함할 수 있다.

다른 양태는,

a) sGPCR을 함유하는 것으로 짐작되는 샘플을 sGPCR 또는 관련된 표면에 결 합된 GPCR에 결합하는 리간드와 접촉시키는 단계; 및

b) GPCR 리간드와 샘플의 성분과의 결합을 평가하는 단계를 포함하는, sGPCR을 검출하는 방법을 포함한다. 당해 방법은, 결합된 sGPCR의 특성을 규명하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이는 크로마토그래피, 질량분석법, 단백질 단편화 및 서열결정 등을 포함할 수 있다. GPCR 리간드는 기질 또는 표면에 작용가능하게 연결될 수 있다. 당해 방법은,

c) 방사성 표지된 sGPCR을 투여하는 단계; 및

d) 시험하는 샘플의 존재 또는 부재하에, 방사성 표지된 sGPCR의 GPCR 리간드와의 결합 또는 결합에 대한 경쟁을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대표적인 리간드는, 부신피질자극호르몬 방출 인자 (CRF), 유로코르틴 1, 유로코르틴 2, 유로코르틴 3, 부갑상선 호르몬, PTH-관련 호르몬, TIP39, 칼시토닌, 아밀린, CGRP(CALCA 및 CALCB), 아드레노메둘린, 세크레틴, VIP, PACAP, 글루카곤, GHRH, GLP-1, GLP-2, GIP 또는 다른 알려진 GPCR 리간드를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, sGPCR에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 특정 양상에서, 항체는 sGPCR의 아미노 말단 또는 카복시 말단에 결합할 수 있다. 본 발명의 양상은, GPCR의 막관통 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 대체 판독 프레임(alternative reading frame)으로부터 유래할 수 있는(전형적으로 대체 스플라이싱(alternative splicing)의 결과이고, 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오타이드로 가공될 수 있다) 카복시 말단의 5, 10, 15, 20개 이상의 아미노산 서열에 결합하는 항체를 포함한다.

본 발명의 양태는, 단백질, 핵산 중의 하나 또는 단백질 및 핵산 둘다를 측정 또는 평가하여, sGPCR의 발현을 검출하는 방법을 포함한다. 본 발명의 양상은,

a) 분석될 핵산 샘플을 수득하는 단계; 및

b) sGPCR이 만들어지게 하는 스플라이스 접합(splice junction)을 포함하는 sGPCR 핵산의 존재를 평가하는 단계를 포함하는, sGPCR mRNA를 검출하는 방법을 포함한다. 당해 방법은, 핵산 하이브리드화, 핵산 증폭 또는 핵산을 분석하는 다른 방법에 의해서 특정 종류의 mRNA의 존재를 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 양상에서, sGPCR은 가용성 B형 GPCR, 가용성 B1형 GPCR, 가용성 CRFR, sCRFR1, sCRFR2, 또는 sCRFR2α이다. 폴리뉴클레오타이드는, GPCR의 아미노 말단 아미노산을 포함하는 엑손/엑손 접합을 포함할 수 있고, 막관통 도메인의 일부를 암호화하는 엑손의 부분을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 특정 양상에서, sCRFR2α의 스플라이스 접합은 엑손 5번/엑손 7번 접합이고, 이때 엑손은 CRFR2 엑손의 게놈적 명시에 기초하여 명시된다. CRFR2α 전사체에 기초하면 엑손은 각각 3번 및 5번으로 명시될 것이다(예: 도 1 참조).

"가용성" GPCR(sGPCR)은, 수용체의 세포외 도메인의 전체 또는 부분은 포함하고 있지만, 세포막에서 전체 길이 수용체를 정상적으로 유지하는 하나 이상의 막관통 도메인의 전체 또는 부분이 없는 GPCR을 의미하며, 가용성 형태는 세포막 안으로 통합되지 않는다. 따라서, 예를 들면, 이러한 가용성 수용체가 포유류 세포안에서 재조합에 의해 생산되면, 세포 표면에 남아있기보다는, 원형질막을 통해서 재조합 숙주 세포로부터 분비될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 가용성 수용체는 수용액에 용해된다. 그러나, 특정 조건하에서, 수용체는 봉입체(inclusion body)의 형태로 있을 수 있고, 이는 표준 절차에 의해서 쉽게 가용화된다. 이러한 sGPCR은, 가공된 핵산, 프로세싱된 단백질(예: 프로테아제에 의해 절단된(protealized) 단백질), 합성된 단백질, 또는 분리된 스플라이스 변이체로부터 유래할 수 있다. 이러한 sGPCR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 분리 또는 가공될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "분리된" 및 "정제된"이라는 용어는, 천연환경에서 발견되는 것과 같은 핵산 또는 폴리펩티드를 일반적으로 수반하는 또는 이와 상호작용하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는, 핵산 또는 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 부분을 의미하고, 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 분리된 또는 정제된 핵산 또는 폴리펩티드는, 재조합 기술에 의해 생산되는 경우에는 실질적으로 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 없고, 또는 화학적으로 합성되는 경우에는 실질적으로 화학전구체 또는 다른 화학물질이 없다.

"분리된" 핵산은, 핵산이 유래한 유기체의 게놈 DNA에서 본래 핵산의 양측면(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단)에 위치하는 서열(바람직하게는 단백질-암호화 서열)이 없다. 예를 들면, 다양한 양태에서, 분리된 핵산은 핵산이 유래한 세포의 게놈 DNA에서 본래 핵산의 양측면에 위치하는 뉴클레오타이드 서열의 약 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0.5kb, 또는 0.1kb 미만을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 지칭하기 위해 사용된 바와 같은 "분리된" 또는 "정제된"이라는 용어는, 분리된 단백질에 실질적으로 세 포 물질이 없음을 의미하고 오염 단백질이 약 30%, 20%, 10% 또는 5%이하(건조 중량으로) 미만인 단백질의 제조를 포함한다. 본 발명의 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분이 재조합에 의해 생산되는 경우, 배양 배지는 바람직하게는 약 30%, 20%, 10%, 또는 5%(건조 중량으로) 미만의 화학전구체 또는 원하지 않는 단백질 화학물질을 나타낸다.

"하나"라는 단어의 사용은, 청구항 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용되는 경우, "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와도 일치한다.

청구항에서 "또는"이라는 용어의 사용은, 본원에서 둘 중 하나만 및 "및/또는"을 의미하는 정의를 제공하더라도, 둘 중 하나만을 의미하거나 둘이 상호 배타적임을 의미하는 것으로 명시되지 않으면, "및/또는"을 의미한다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형은 상세한 설명으로부터 당해 기술분야의 숙련자에게 명백해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는, 본 발명의 특정 양태를 나타내지만, 단지 예시로서 주어지는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 상기한 특징, 장점, 및 목적뿐만 아니라 해결될 다른 것들이 달성되는 주제가 상세히 이해될 수 있도록, 위에 간단히 요약된 본 발명의, 보다 상세 한 설명 및 특정 양태를, 첨부된 도면에서 설명한다. 이들 도면은 본 명세서의 일부를 구성한다. 그러나, 첨부된 도면은 본 발명의 특정 양태를 설명하는 것이기 때문에 이들의 범위를 한정하는 것으로 생각되어서는 안 된다는 점을 주의해야 한다.

도 1A-1B. 가용성 GPCR, CRF 수용체 2α형(sCRFR2α)의 대표적인 뉴클레오타이드 및 해독된 아미노산 서열을 설명한다(도 1A). 밑줄친 아미노산은 유일한 C-말단 꼬리(tail)를 나타낸다. 사각형 안의 잔기는 추정되는 N-연결된 글리코실화 부위를 나타낸다. 마우스 CRFR2 유전자의 구조(상단), 마우스에서 2개의 알려진 기능성 전사체 α 및 β(중간단) 및 새로운 sCRFR2α 스플라이스 변이체(하단)의 도식적인 묘사(도 1B). 해독 개시 부위(ATG)의 위치가 표시되어 있다. N-말단 세포외 도메인(ECD), 7 막관통 도메인(7TM), 및 C-말단 세포질 도메인(CD)을 암호화하는 엑손이 표시되어 있다. 5' 및 3'-UTR은 음영이 들어간 사각형으로 표시되어 있다. 검은색 사각형은 암호화 영역을 나타내고 흰색 사각형은 종결 코돈 하류의 엑손을 나타낸다.

도 2A-2C. 마우스의 뇌 및 뇌하수체에서의 CRFR2α 및 sCRFR2α mRNA의 발현을 나타낸다. 도 2A는 마우스 CRFR2α(상단) 및 sCRFR2α(하단) 전사체의 증폭된 부분의 도식적인 묘사 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머 위치를 나타낸다. 각각 CRFR2α 및 sCRFR2α에 상응하는 418bp 및 309bp의 두 생성물의 증폭이 일어나게 하는, 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 위치가 엑손 3번 및 7번에 표시되어 있다. 도 2B는 mCRFR2α 및 sCRFR2α mRNA 및 리보솜 단백질 S16 mRNA(상단)에 대한 반정량적 RT-PCR의 전기영동 분석을 나타내는 그림이다. 증폭된 mCRFR2α 및 sCRFR2α cDNA 및 리보솜 단백질 S16 cDNA 단편의 서던 블럿 하이브리드화를 또한 수행하였다(하단). 방사성 밴드를 PhosphorImager에 의해 정량하고, 정규화시킨 값(S16 발현에 대해 상대적으로)을 상대 농도 단위로서 나타내었다(도 2C).

도 3A-3C. 마우스 sCRFR2α 단백질의 유일한 C-말단 꼬리(아미노산 113번 내지 143번)를 암호화하는 합성 펩티드 단편을 이용하여 래빗에서 만들어진 매우 특이적인 항혈청을 사용하여, 면역블럿 분석 및 면역세포화학을 위해 사용되는 sCRFR2α 방사면역분석법을 개발하였다. 도 3A는 항-sCRFR2α-(113-143) 혈청(좌) 또는 모노클로날 M2 항-FLAG(우)와 반응시킨 sCRFR2αFLAG 구성체(construct)로 일시적으로 형질감염(transfection)시킨 COS-M6 세포의 배지로부터 분리된 마우스 sCRFR2α의 웨스턴 면역블럿이다. 1번, 2번, 및 3번 레인은 각각 0.1, 1.0, 및 10㎕의 sCRFR2α-FLAG 추출물에 상응한다. 도 3B: 합성 sCRFR2α(아미노산 113-143) 및 COS-M6에서 발현된 정제된 sCRFR2α(아미노산 113-143)-FLAG에 의한, 래빗 항-sCRFR2α(아미노산 113-143)에 결합하는 [¹²⁵I]Tyr¹¹³ sCRFR2α(아미노산 113-143)의 치환. 도 3C: 항-sCRFR2α(아미노산 113-143)혈청에 이어서 Cy3-접합된 2차 항체에 의해서 가시화된, 마우스 sCRFR2α 구성체로 일시적으로 형질감염된 COS-M6 세포의 면역형광염색(도 3C(b)). 슬라이드를 DAPI로 대조염색하여, 형질감염된 세포 및 형질감염되지 않은 세포를 가시화하였다(도 3C(a)). 음성대조군으로서, 정상적인 래빗 혈청(NRS)에 이어서 Cy3-접합된 2차 항체와 함께 배양시킨 세포는 염색이 되지 않았다(도 3C(c)).

도 4A-4G. 면역조직화학 및 방사면역분석법(RIA)을 사용하여 마우스 뇌에서 sCRFR2α-유사 면역반응성(ir)의 존재를 나타낸다. 도 4A 내지 4F는 선택된 마우스 뇌 영역에서 sCRFR2α에 대한 면역과산화효소 염색을 나타낸다. 세포 발현의 주요 부위는, 후구(olfactory bulb)의 주 출력 뉴런(도 4A); 내측 중격핵(medial septal nucleus)(도 4B); 및 기저외측(basolateral; BLA)핵을 포함하였지만, 편도체(amygdala)의 중심(CeA)핵(도 4C); 대뇌 피질(염색된 세포가 주로 5 및 2/3층에 위치함)(도 4D); 및 적색핵(red nucleus)(도 4E)은 포함하지 않았다. 이들 각각의 부위에서, 세포 표지의 패턴은 CRFR1 mRNA 발현 패턴과 반드시 동일하지는 않았지만 유사하였다. 면역 표지된 신경섬유 및 염주(varicosity)는, 시상하부의 실방핵(paraventricular nucleus; PVH)을 포함하는, 소수의 세포 그룹에 제한되었다(도 4F). 도 4G: 마우스 뇌로부터 분리하여 산추출된 및 부분정제된 조직에서의 sCRFR2α-유사 면역반응성을 방사면역분석법에 의해 측정하였다. 조직 추출물을 5 내지 7배 용량 수준에서 시험하고, 래빗 항-sCRFR2α(아미노산 113-143)에 결합하는 [¹²⁵I]-표지된 Tyr¹¹³ sCRFR2α(아미노산 113-143)를 용량-의존적 방법으로 치환시켰다.

도 5A-5B. sCRFR2α 단백질은 Ucn 1 또는 CRF에 의해서 매개되는 cAMP의 유도 및 MAPK 시그날 전달을 방해한다. 도 5A는, 마우스 CRFR2α로 일시적으로 형질감염된 293T 세포에서, sCRFR2α로 전항온처리하거나 하지 않고, Ucn 1 또는 CRF에 의한 CRE-루시퍼라제 리포터의 활성화를 나타낸다. EVX1 유전자의 CRE 프로모터의 단편을 포함하는 루시퍼라제 리포터와 CRFR2α 발현 벡터를 293T 세포내로 함께 형 질감염시켰다. 0.1nM sCRFR2α의 존재 또는 부재하에, 0.0001 내지 100nM Ucn 1 또는 CRF로 처리(4시간)하고 이어서 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 분석은, 같이 형질감염된 β-갈락토시다제 활성으로 정규화되었다. 하나의 실험으로부터 6회 반복된 것의 대표적 평균값이 그래프에 제시되어 있다. 도 5B: 평형을 이룬 CATH.a 세포에, sCRFR2α(0.4 또는 4nM)를 함께 처리하거나 처리하지 않고, Ucn 1(10nM)을 처리하였다. 5분 동안의 수용체 자극 후에, 세포 용해물을 획득하고 인산-ERK1/2-p42,44 항체 및 ERK2-p44 항체를 사용하여 SDS-PAGE 면역블럿 분석을 하였다. 인산화된 ERK1/2-p42,44의 수준을 총 ERK2-p44에 정규화시켜 ERK 활성화를 계산하였다. 하나의 실험으로부터 3개 반복의 대표평균이 그래프에 제시되어 있다. *: 부형제 처리와 비교하여 P<0.05, #: Ucn 1 처리와 비교하여 P<0.05, UD=검출되지 않음.

GPCR 및 관련된 시그날 전달 경로와 관련된 질병의 치료를 위한 유용한 치료학적 접근법은, GPCR의 활성화 또는 억제의 억제 또는 조절을 포함한다. 한 접근법은 작은 분자 억제제를 개발하는 것인데, 이를 개발하고 시장에 내놓는데는 많은 비용이 든다. GPCR의 작은 분자 억제제 또는 길항제를 이용한 치료의 결점은, 특히 반복하여 사용할 때, 독성의 위험이다. 또한, 많은 GPCR은 작은 분자 수용체 길항제가 없다. 작은 분자 억제제보다 비용이 적게 들고/들거나 독성이 낮은 GPCR 길항제의 개발은 가치가 있다. 본 발명의 양태는, 가용성 GPCR(sGPCR) 리간드 결합 도메인과 관련된 조성물 및 방법뿐만 아니라, GPCR 시그날 전달 및 GPCR 리간드와 이들의 GPCR 사이의 상호작용에 미치는 효과에 관한 것이다. sGPCR은, 시험관내에서 및/또는 생체내에서 GPCR의 활성화 또는 억제에 대한 길항작용을 위해서 사용될 수 있다.

I. G-단백질 연결 수용체( GPCR )

GPCR은 단백질 상위군을 구성하고, 이는 3개의 계열로 분류된다: 로돕신-유사 계열(A계열), 칼시토닌 수용체(B계열), 및 대사자극성 글루타메이트 계열(C계열) [참조: Ji et al., 1998], 각각의 계열은 하위군으로 더 분류될 수 있다. 보고된 GPCR에는, 특성이 규명된 수용체 및, 리간드가 아직 동정되지 않은 고아 수용체가 포함되어 있다[참조: Wilson et al., 1999; Wilson et al., 1998; Marchese et al., 1999]. GPCR의 수가 많음에도 불구하고, 일반적으로, 각각의 GPCR은 유사한 분자 구조를 공유한다. 각각의 GPCR은 다양한 길이의 일련의 아미노산 잔기를 포함한다. 막관통이라고 부르는 7개의 구별되는 코일 형태로 GPCR은 세포막 안에 있다. GPCR의 아미노 말단은 세포외 루프와 같이 세포밖에 있는 반면에, 카복시 말단은 세포내루프와 함께 세포안에 있다.

GPCR A계열(로돕신 유사)는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아민, 펩티드, 호르몬 단백질, 로돕신, 후각의, 프로스타노이드, 뉴클레오타이드-유사, 카나비노이드, 혈소판 활성화 인자, 생식선자극호르몬-방출 호르몬, 갑상선자극호르몬-방출 호르몬 및 세크레타고그, 멜라토닌, 바이러스의, 리소스핑고리피드 및 LPA(EDG), 류코트리엔 B4 수용체 및 다른 유사한 수용체 단백질을 포함한다.

GPCR B계열(세크레틴 유사)는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 칼시토닌에 대한 수용체, 부신피질자극호르몬 방출 인자(CRF), 위장 억제 펩티드(GIP), 글루카곤, 성장호르몬-방출 호르몬(GHRH), 부갑상선 호르몬(PTH), 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제-활성화 폴리펩티드(PACAP), 세크레틴, 혈관작용 장관 폴리펩티드(VIP), 이뇨 호르몬, EMR1, 라트로필린, 뇌-특이적 혈관형성 억제제(BAI), 메투셀라-유사 단백질(MTH), 카드헤린/EGF/LAG(CELSR), 및 다른 유사한 리간드를 포함한다. 문헌[참조: Harmar (2001)]에 GPCR B계열의 3개의 하위군인 B1, B2 및 B3하위군이 기술되어 있다.

B1 하위군 -- B1 하위군은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 전형적인 호르몬 수용체를 포함하고, 이는 사람에 있는 적어도 15개의 유전자에 의해 암호화되며, 드로소필라(Drosophila)에는 적어도 5개의 추정되는 유전자가 있고 씨. 엘레강스(C. elegans)에는 3개의 유전자가 있다. 이 하위군에 속하는 수용체에 대한 리간드는 대략 27 내지 141개의 아미노산 잔기의 폴리펩티드 호르몬이고, 서로 구조적으로 관련된 리간드(글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드(GLP-1, GLP-2), 글루코스-의존적 인슐린자극성 폴리펩티드, 세크레틴, 혈관작용 장관 펩티드(VIP), PACAP, 및 성장호르몬-방출 호르몬(GHRH))에 적어도 9개의 포유류 수용체가 반응한다. 이 하위군의 모든 일원은, 자극성 G 단백질(Gs)을 통해서 아데닐레이트 사이클라제에 연결됨으로써 cAMP의 세포내 농도를 조절할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 하위군의 몇몇 일원은, 추가적인 G-단백질-연결 시그날 전달 경로를 통해서(예를 들면, 포스포리파제 C의 활성화를 통해서) 시그날 전달을 할 수 있다.

B2 하위군 -- B2 하위군은, 코어 7TM 모티프에 연결된 다양한 구조요소를 포함하는, 긴 세포외 아미노 말단이 있는 많은 수의 B계열 GPCR로 이루어져 있다. 이 하위군의 전형적인 일원은, 사람 신경외배엽 cDNA 라이브러리로부터 분리된 EGF-모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체(EMR1)[참조: Baud et al., 1995] 및 백혈구 세포-표면 항원 CD97[참조: Hamann et al., 1995]이었다. B2 하위군은 또한 α-라트로톡신(latrotoxin)에 대한 칼슘-비의존적 수용체를 포함한다. 칼슘-비의존적 라트로톡신 수용체를 암호화하는 3개의 유전자(CL-1, CL-2 및 CL-3)가 동정되었다. 두번째로, 신경교아세포종(glioblastoma)의 혈관형성에 관계된 단백질 그룹인, 뇌-특이적 혈관형성 억제제 1, 2 및 3(BAI1, BAI2, BAI3)도 이 하위군에 포함된다. 세번째로, 드로소필라 유전자 플라밍고(flamingo)에 의해서 암호화된 단백질 및 사람에서의 이의 오르토로그(ortholog)(카드헤린 EGF LAG 7-통과 G형 수용체 Celsr1, Celsr2 및 Celsr3) 및 씨. 엘레강스에서의 오르토로그(F15B9.7)도 B2 하위군에 포함된다. 마지막으로, 이 하위군은, B2 하위군에 속하는 수용체에 공통적인 몇몇 모티프를 포함하지만 구조적으로 관련이 없는, 네번째 다양한 수용체 그룹을 포함한다(사람 부정소 6(HE6), EGF-TM7-라트로필린-관련 단백질(ETL), 면역글로불린-반복-포함 수용체 Ig 헵타, G-단백질-연결 수용체 56(GPR56) 및 매우 큰 G-단백질-연결 수용체 1(VLGR1)). 서열 결정된 사람 게놈(2001년 4월 1일, UCSC 사람 게놈 프로젝트 작업 초안(genome.ucsc.edu))의 분석을 통해서, B2 하위군의 일원을 암호화하는 적어도 18개의 사람 유전자가 있고, 드로소필라에는 적어도 4개, 그리고 씨. 엘레강스에는 3개가 있음이 나타난다. B2 하위군의 일원의 구조 및 기능은 최근에 문헌[참조: Stacey et al. (2000)]에서 검토되었다.

B3하위군 -- B계열 GPCR의 세번째 그룹(B3하위군)의 전형은, 디. 멜라노가스터(D. melanogaster)에서 평균 수명을 연장시킨 단일-유전자 돌연변이에 대한 스크리닝에서 분리된 유전자인, 메투셀라(methuselah)(mth)이다[참조: Lin et al., 1998]. 이 유전자는 오직 TM7 영역내에서만 다른 B계열 GPCR과 서열 유사성을 나타내는 폴리펩티드를 암호화한다. 메투셀라의 적어도 8개의 파라로그(paralog)가 드로소필라 게놈 서열내에 암호화되어 있다.

모든 B계열 GPCR의 특징은 7TM 모티프이고, 이는 몇몇 다른 GPCR 계열의 유사한 영역과는 먼 관계에 있지만 B계열 내에서는 매우 보존되어 있다. 세포외 루프 EC1 및 EC2내에 보존된 시스테인 잔기는, 이 특징이 또한 보존된 A계열 GPCR과 유사하게, 대개는 이황화결합을 형성한다[참조: Palczewski et al., 2000]. 그러나, 많은 수가 내부의 소수성 서열에 의해서 원형질막으로 표적화(targeting)되는 것으로 보이는 A계열 GPCR과 대조적으로, 대부분의 B계열 GPCR은 아미노 말단 시그날 펩티드를 갖는 것으로 보인다. 부위-지시된 돌연변이유발 및 B계열의 호르몬 수용체간의 키메라(chimera) 작제를 이용한 연구에서, 아미노 말단 세포외 도메인이 리간드 결합을 위해서 필수적이지만, 수용체의 막관통 도메인 및 연관된 세포외 루프 영역이 리간드와의 특이적인 상호작용에 필요한 정보를 제공함이 밝혀졌다. B계열의 모든 호르몬 수용체는, 리간드 결합에서 역할을 할 수 있는 TM1에 가까운 아미노 말단 세포외 도메인내에, 보존된 영역을 포함한다. PAC1 수용체의 이 영역에서의 스플라이스 변이는 리간드-결합 특이성 및 친화도에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다[참조: Dautzenberg et al., 1999].

B2 하위군에 속하는 수용체는, 큰 아미노 말단 세포외 도메인에 다양한 추가적인 구조 모티프를 포함하여, 세포-세포 부착 및 시그날 전달에서 이 도메인의 역할을 시사한다. 이들은, EGF 도메인(Celsr1, Celsr2, Celsr3, EMR1, EMR2, EMR3, CD97 및 플라밍고에서), 라미닌 및 카드헤린 반복(플라밍고 및 이의 사람 오르토로그 Celsr1, Celsr2 및 Celsr3에서), 올팩토메딘(olfactomedin)-유사 도메인(라트로톡신 수용체에서), 트롬보스폰딘 1형 반복(BAI1, BAI2 및 BAI3에서) 및, Ig 헵타에서, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 수용체 2 및 신경 세포 부착 분자 L1에서 또한 발견된 면역글로불린 C-2형 도메인을 포함한다. VLGR1은, Na⁺-Ca²⁺ 교환기 및 인테그린 서브유닛 β4에 존재하는 두 카피의 모티프(Calx-베타)를 갖는다.

C계열(대사자극성 글루타메이트/페로몬) GPCR은, 대사자극성 글루타메이트, 칼슘-감지형, 잠정 페로몬 수용체, GABA-B, 고아 GPCR5, 고아 GPCR6, 브라이드 오브 세븐리스 단백질(bride of sevenless proteins)(BOSS), 미각 수용체(T1R) 및 다른 유사한 단백질을 포함한다.

특정 양태에서, 본 발명의 sGPCR은 B클래스 수용체이다. 양상에서, 본 발명의 sGPCR은 B1 하위군 수용체이고, 추가의 양상에서, sGPCR은 CRFR1 및 CRFR2, 및 부갑상선 호르몬 수용체이다. 표 1은 GPCR 계열의 대표적인 일원의 비제한적 집합, 수탁번호 및 관련된 UNIGENE 및 OMIM 엔트리(본 출원의 우선일 및 출원일로 본원에 참조로서 인용됨)를 포함한다. Unigene 엔트리는 OMIM 웹페이지에 포함된 인터넷 링크에 의해서 입수할 수 있다. 다른 많은 GPCR 및 이들의 수탁번호는, 월드 와이드 웹상의 다음의 어드레스로 정의된 웹사이트에서 찾을 수 있다 (gpcr.org/7tm/htmls/entries.html).

대표적인 GPCR

GPCR 종류	단백질 수탁번호 / mRNA 수탁번호 / OMIM 번호 (각각 참조로서 인용됨)
뇌-특이적 혈관형성 억제제 1(BAI 1)	O14514 / AB005297 / 602682
뇌-특이적 혈관형성 억제제 2(BAI 2)	O60241 / CR623649 / 602683
뇌-특이적 혈관형성 억제제 3(KIAA0550a)(BAI 3)	O60242 / AB005299 / 602684
칼시토닌 수용체(CT-R, CALCR)	P30988 / NM_001742 / 114131
백혈구 항원 CD97	P48960 / X84700 / 601211
칼시토닌 유전자-관련 펩티드 1형 수용체, CGRP 1형 수용체, CALCRL, CGRPR	Q16602 / NM_005795 / 114190
부신피질자극호르몬 방출 인자 수용체 1(CRF-R, CRF1, CRHR1, CRHR, CRFR)	P34998 / NM_004382 / 122561
부신피질자극호르몬 방출 인자 수용체 2(CRF-R, CRF2, CRHR2, CRF2R, CRH2R)	Q13324 / NM_001883 / 602034
세포 표면 당단백질 EMR1(EMR1 호르몬 수용체)	Q14246 / X81479 / 600493
EGF-유사 모듈 EMR2	AAF21974 / AF114491 / 606100
EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 수용체 EMR3	AAK15076 / AF239764 / 606101
위장 억제 폴리펩티드 수용체(GIP-R, 글루코스-의존적 인슐린자극성 폴리펩티드 수용체)	P48546 / NM_000164 / 137241
글루카곤-유사 펩티드 1 수용체(GLP-1 수용체, GLP-1-R, GLP1R)	P43220 / NM_002062 / 138032
글루카곤 수용체(GL-R, GCGR)	P47871 / NM_000160 / 138033
글루카곤-유사 펩티드 2 수용체(GLP-2 수용체, GLP-2-R, GLP-2R, GLP2R)	O95838 / NM_004246 / 603659
G 단백질-연결 수용체 56	AAD30545 / NM_005682 / 604110
성장호르몬-방출 호르몬 수용체(GHRH 수용체, GRF 수용체, GRFR, GHRHR)	Q02643 / NM_000823 / 139191
뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 폴리펩티드 I형 수용체(PACAP I형 수용체, PACAP-R-1, ADCYAP1R1)	P41586 / NM_001118 / 102981
부갑상선 호르몬 수용체(PTH2)	P49190 / NM_005048 / 601469
부갑상선 호르몬/부갑상선 호르몬-관련 펩티드 수용체(PTHR1)	Q03431 / NM_000316 / 168468
세크레틴 수용체(SCT-R, SCTR)	P47872 / NM_002980 / 182098
혈관작용 장관 폴리펩티드 수용체 1(VIPR1, VPAC1)	P32241 / NM_004624 / 192321
혈관작용 장관 폴리펩티드 수용체 2(VIPR2, VIP2R, VPAC2 등)	P41587/ NM_003382 / 601970

A. 부신피질자극호르몬 방출 인자( CRF ) 및 이의 수용체

본 발명에서 고려된 GPCR의 예로서, CRF 수용체를 상세히 기술한다. 당해 기술분야의 숙련자는, 이러한 특정 설명을, 다른 GPCR 계열의 일원에, 특히 B형 및 보다 특히 B1 하위군 수용체에, 적용시킬 수 있을 것이다. 특정 양상에서 본 발명은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 가용성 부신피질자극호르몬 방출 인자 수용체(sCRFR), 특히 sCRFR2α로부터 유래한 sGPCR을 포함한다. 원래 시상하부로부터 분리된[참조: Vale et al., 1981], 시상하부의 뇌하수체자극 펩티드 부신피질자극호르몬 방출 인자(CRF)는, 기본 조건 및 스트레스 조건하에서 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 축의 조절에 중요한 역할을 한다[참조: River and Vale, 1983; Muglia et al., 1995]. 게다가, CRF는 스트레서(stressor)에 대한 내분비, 자율신경, 및 행동 반응을 통합하는 작용을 한다[참조: River and Vale, 1983; Muglia et al., 1995; Koob and Heinrichs, 1999]. 포유류 CRF 펩티드 계열은, 유로코르틴 1(Ucn 1)[참조: Vaughan et al., 1995] 및, 각각 스트레스코핀-관련 펩티드[참조: Reyes et al., 2001; Hsu and Hsueh, 2001] 및 스트레스코핀[참조: Hsu and Hsueh, 2001; Lewis et al., 2001]으로도 알려진 펩티드인, 유로코르틴 2(Ucn 2) 및 유로코르틴 3(Ucn 3)을 포함한다.

CRF-관련 펩티드의 영향은 2개의 고친화도 막 수용체, CRFR1[참조: Chen et al., 1993; Vita et al., 1993; Chang et al., 1993] 및 CRFR2[참조: Perrin et al., 1995; Stenzel et al., 1995; Kishimoto et al., 1995; Lovenberg et al., 1995; Chen et al., 2005]의 활성화를 통해서 매개되고, 이들은 G-단백질에 연결되어 시그날을 전달하는 7-막관통 도메인(7TMD) 수용체의 B1 하위군에 속한다. CRFR1 유전자의 기능성 변이체의 하나는, 여러 엑손의 차별적 스플라이싱에 의해서 만들어지는 몇몇 비-기능성 변이체와 함께, 사람 및 설치류에서 발현된다[참조: Pisarchik and Slominski, 2004; Grammatopoulos et al., 1999]. CRFR2는 사람에서 3개의 기능성 스플라이스 변이체(α, β, 및 γ)가 있고 2개의 설치류 변이체(α 및 β)가 있으며, 이들은 교대(alternate) 5' 엑손을 사용하여 만들어진다[참조: Perrin et al., 1995; Stenzel et al., 1995; Kishimoto et al., 1995; Lovenberg et al., 1995; Chen et al., 2005; Grammatopoulos et al., 1999; Kostich et al., 1998]. CRFR1 mRNA는 포유류 뇌 및 뇌하수체에서 널리 발현되고, 뇌하수체 전엽, 대뇌 피질, 소뇌, 편도체, 해마, 및 후구에서는 높은 수준으로 발견된다[참조: Van Pett et al., 2000]. 말초에서, CRFR1은 정소, 난소, 피부, 및 비장에서 발현된다. CRFR2 mRNA는 뇌에서 불연속적인 패턴으로 발현되며, 외측 중격핵(lateral septal nucleus; LS), 분계선조의 침대핵(bed nuclues of stria terminalis; BNST), 복내측 시상하핵(ventromedial hypothalamic nucleus; VMH), 후구, 및 중뇌 솔기핵(mesencephalic raphe nuclei)에서 가장 높은 밀도로 발현된다[참조: Van Pett et al., 2000]. CRFR2α는 설치류의 뇌에서 발현되는 주요 스플라이스 변이체인 반면에[참조: Lovenberg et al., 1995], CRFR2β는 말초조직에서 발현되고, 골격근, 심장, 및 피부에서 가장 높은 수준으로 발현된다[참조: Perrin et al., 1995].

CRFR1 및 CRFR2의 분포는 구별되고, CRFR1 또는 CRFR2가 없는 마우스의 서로 다른 표현형에 의해 증명되었듯이, 다양한 생리학적 기능을 암시한다. CRFR1에 결함이 있는 마우스는 불안-유사 행동의 감소를 나타내고 스트레스 반응이 줄어드는 반면에[참조: Smith et al., 1998; Timpl et al., 1998], CRFR2가 없는 마우스는 불안-유사 행동이 증가하고 스트레스에 대한 과장된 HPA 반응을 나타낸다[참조: Zhu et al., 1999; Valerio et al., 2001; Khan et al., 1993]. 그러나, 특정 뇌 영역으로 CRFR2 작용제 및 길항제를 투여하여 나타나는 반응은, CRFR2에 대한 불안완화 및 불안유발 역할을 둘다 드러낸다[참조: Bale and Vale, 2004].

방사선수용체 및 기능 분석으로 CRFR1 및 CRFR2가 약리학적으로 다르다는 것이 증명되었다: Ucn 1은 두 수용체에 대한 친화도가 동일하고 CRFR2에 CRF보다 더 영향을 미치는 반면에, Ucn 2 및 Ucn 3는 CRFR2에 대해 선택적인 것으로 보인다[참조: Vaughan et al, 1995; Reyes et al., 2001; Lewis et al., 2001]. 수용체-선택적 CRF 펩티드에 의해, 다른 조직 및 세포 유형에서 특정 CRFR이 활성화되면, 다른 G-단백질과의 연결, PKB, PKC, 세포내 칼슘, 및 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK)의 자극을 포함하는, 다양한 시그날 전달 경로가 개시된다(검토 문헌[참조: Bale and Vale, 2004; Perrin and Vale, 1999; Brar et al., 2002]).

CRFR1 및 CRFR2는 다수의 스플라이스 변이체로서 존재한다. 발명자들은, CRFR2α를 암호화하는 핵산으로부터 엑손 6번이 결실된, sCRFR2α의 대표적인 스플라이스 변이체를 암호화하는 cDNA를 마우스 뇌로부터 동정하였다. 이 이소형(isoform)은 해독되어 143개 아미노산의 예측된 가용성 단백질을 생산한다. 해독된 단백질은, CRFR2α의 첫번째 세포외 도메인(ECD1)의 대부분을 포함하고, 그 뒤에는 엑손 6번의 결실에 의한 프레임 이동(frame shift)의 결과로 생기는 유일한 38개 아미노산의 친수성 C-말단이 있다. 연구에 의해 후구, 대뇌 피질, 및 중뇌 영역에서 sCRFR2α가 높은 수준으로 발현됨이 증명되었다. 포유류 또는 세균 세포 시스템으로부터 발현되고 정제된, sCRFR2α에 상응하는 단백질은, 낮은 나노몰의 친화도로 몇몇 CRF 계열 리간드에 결합한다. 게다가, 정제된 sCRFR2α 단백질은 CRF 및 유로코르틴 1에 대한 세포 반응을 억제한다. 따라서, sCRFR2α 단백질은 CRF 계열 리간드의 생물학적 조절인자일 수 있다. CRF 계열 리간드의 조절은 뇌에 한정되지 않고, CRF 계열 리간드의 하나 이상의 일원에 노출된 임의의 조직에서 사용될 수 있다.

본 발명의 양상은 일반적으로, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 호르몬 길항제(예: 작은 분자 길항제)와 함께 길항제로서, 이에 제한되는 것은 아니지만, CRF 계열 리간드(들)의 길항제를 포함하는, CRF 결합 폴리펩티드와 같은 가용성 GPCR 리간드 결합 폴리펩티드를 사용하여, CRF 계열 리간드와 같은 GPCR 리간드 활성을 조절하는 방법을 포함하는, 치료학적 효과를 달성하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

리간드의 작용에 대한 길항작용을 위한 한가지 방법은, 리간드에 유인(decoy) 수용체 또는 가용성 수용체를 가하여, 유인 수용체에 결합하는 리간드의 국부적인 농도를 제한하고, 세포 표면 수용체를 통해 시그날 를 전달하는 리간드의 능력을 조절하는 것이다. 막 수용체와 관련된 가용성 단백질은, GHRH 수용체[참조: Rekaski et al., 2000], 도파민 D3 수용체[참조: Liu et al., 1994], 및 칼시토닌 수용체[참조: Seck et al., 2003]에 대해 시사된 바와 같이, 막에 결합된 수용체의 효소에 의한 절두(truncation)에 의해서, 또는 글루타메이트 수용체의 경우에 대체 스플라이싱에 의해서[참조: Malherbe et al., 1999; Zhu et al., 1999; Valerio et al., 2001] 생성될 수 있다. GPCR의 세포외 영역만을 포함하는 스플라이스 변이체가 보고되었다[참조: Pisarchik and Slominski, 2004; Grammatopoulos et al., 1999; Kostich et al., 1998; Malherbe et al., 1999; Zhu et al., 1999; Valerio et al., 2001; Khan et al., 1993; Graves et al., 1992; You et al., 2000; Schwarz et al., 2000]. 대다수의 경우, 이들 단백질은 유인 수용체로도 지칭되는 결합, 비-시그날 전달 분자로서 역할을 한다. 엑손 3번 및 4번의 결실, 및 CRFR1에 숨은(cryptic) 엑손의 부가를 포함하는, 2개의 부분 cDNA 단편(CRFR1e 및 CRFR1h)이, 사람 피부에서 동정되었고 가용성 단백질로서 존재하는 것으로 예측되었다[참조: Pisarchik and Slominski, 2004]. 이들 단편 중의 하나인 CRFR1e는, 야생형 CRFR1과 함께 동시 형질감염되면 우성 음성(dominant negative) 효과를 나타낸다.

문헌[참조: Kehne and Lombaert (2002)]에는 불안, 우울, 및 스트레스 장애의 치료를 위한 비-펩티드 CRF 수용체 길항제가 논의되어 있다. CRF는 불안 및 우울과 같은 정신 장애와 관련된다. 부신피질자극호르몬 방출 인자(CRF)의 동정 이후, 광범위한 연구 노력으로, 스트레스에 대한 신체의 행동, 내분비, 및 자율신경 반응을 매개하는데 있어서, 이 41개 아미노산의 펩티드 및 관련된 계열 일원의 중요성이 확실해졌다.

전임상 및 임상 증거에 의해서, 일반적으로 CRF, 및 특히 CRF 수용체는 불안 및 우울에 관련된다. 임상 연구에 의해, 우울 및 몇몇 불안 장애에 있어서 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 축의 기능이상 및/또는 높아진 CRF 수준이 증명되었다. 상관법(correlation method), 유전자 모델, 및 외인성 CRF 투여 기술을 이용한 설치류 및 사람외 영장류에서의 전임상 데이터는, 과활성 CRF 경로와 불안 및 우울-유사 증상 사이의 관련성을 뒷받침한다. CRFR1의 수용체 녹아웃(knockout) 및 선택적, 비-펩티드 길항제를 사용한 연구에서, 특정 종류의 실험실 조건하에 불안완화 및 항우울 효과가 증명되었다. 주요 우울 장애의 임상2상, 개방 표지(open-label), 임상 실험에서, CRFR1 길항제는 안전하고 불안 및 우울 증상을 경감시키는데 효과적임이 보고되었다.

CRF 길항제의 다양한 비제한적 활성은 문헌[참조: Owens et al. (1991)]에 기술되어 있다. CRF 길항제는, 스트레스-관련 질병; 우울증, 주요 우울 장애, 단일 에피소드 우울증, 재발성 우울증, 아동 학대에 의한 우울증, 산후 우울증, 기분저하증, 양극성 장애, 및 순환성 기분장애와 같은 기분 장애; 만성 피로 증후군; 식욕 감퇴 및 신경성 거식증과 같은 섭식 장애; 일반화된 불안 장애; 공황 장애; 공포증; 강박장애(obsessive-compulsive disorder); 외상후 스트레스 장애; 섬유근육통과 같은 통증 인지; 두통; 위장관 질환; 출혈성 스트레스; 궤양; 스트레스에 의한 정신병적 에피소드; 열; 설사; 수술후 장폐쇄증(ileus); 결장 과민증; 과민성 장 증후군; 크론병; 경련성 결장; 류마티스 관절염 및 골관절염과 같은 염증 장애; 통증; 천식; 건선; 알레르기; 골다공증; 조산; 고혈압; 울혈성 심부전증; 수면 장애; 알츠하이머병, 알츠하이머형 노인 치매, 다발 경색성 치매, 파킨슨병, 및 헌팅턴병과 같은 신경퇴행성 질환; 두부 외상; 허혈성 신경 손상; 흥분독성 신경 손상; 간질; 뇌졸중; 척수 외상; 정신사회적 왜소증; 정상갑상선 기능 증후군; 항이뇨 호르몬 이상 증후군; 비만; 약물 의존증 및 중독증; 약물 및 알코올 금단 증상; 불임; 암; 근육 경련; 요실금; 저혈당증 및 스트레스에 의한 면역 기능장애, 면역 억제, 및 사람 면역결핍 바이러스 감염을 포함하는 면역 기능장애; 및 사람 및 동물에서의 스트레스에 의한 감염의 치료에 효과적인 것으로 기술되어 있다. CRF 조절에 영향을 받는 이들 및 다른 건강상태는 문헌에 제시되어 있고, 이는 문헌[참조: Lovenberg et al. (1995); Chalmers et al. (1996)]; 및 미국특허 제5,063,245호를 포함하며, 각각은 그 전문이 참조로서 인용된다.

II . 폴리펩티드

본 발명의 폴리펩티드는 GPCR의 가용성 형태 또는 가용성 수용체를 포함한다. 본 발명의 가용성 수용체는, 막에 결합된 형태로부터 가용성 형태로 변화된 서브유닛을 포함할 수 있다. 따라서, 가용성 펩티드는 폴리펩티드를 절두시켜서, 예를 들면, 7개의 막관통 영역 및/또는 세포질 꼬리를 제거함으로써 생산될 수 있다. 대안으로, 막관통 도메인은, 결실에 의해서, 또는 막관통 도메인을 구성하는 정상적인 소수성 아미노산 잔기를 친수성 잔기로 치환시킴으로써 파괴될 수 있다. 두 경우에, 실질적인 친수성 또는 가용성 폴리펩티드가 만들어지며, 이는 지질 친화도를 감소시키고 물에 대한 용해도를 향상시킬 것이다. 막관통 도메인의 결실은, 잠재적인 면역원성 항원결정기의 도입을 막기 때문에, 친수성 아미노산 잔기로 치환시키는 것보다 바람직하다. 본 발명의 가용성 수용체는 임의의 수의 잘 알려진 리더(leader) 서열을 N-말단에 포함할 수 있다. 이러한 서열은, 진핵생물 시스템에서 펩티드가 발현되고 분비 경로로 표적화되게 할 것이다.

A. 융합 단백질

수용체는, 생물학적 경로를 밝히고 면역글로불린 융합 단백질로 쉽게 전환되어 다양한 질병 상태를 치료하는 강력한 도구이다. 이들 이량체(dimer) 가용성 수용체 형태는, 분비되는 또는 표면에 결합된 리간드에 의해 매개되는 현상에 대한 좋은 억제제이다. 이들은 리간드에 결합함으로써 세포에 결합된 수용체와 리간드와의 상호작용을 방해한다. 이들 수용체-Ig 융합 단백질은 실험적인 의미로만 유용한 것이 아니라, TNF-R-Ig의 경우에는 임상적으로 염증성 장질환, 류마티스 관절염, 및 OKT3 투여를 수반하는 급성 임상 증후군을 치료하는데 성공적으로 사용되었다[참조: Eason et al., 1996; van Dullemen et al., 1995]. 발명자들은, GPCR을 통한 시그날 전달에 의해 매개되는 많은 현상의 조작이, GPCR과 관련된 질병의 치료에 폭넓게 적용될 수 있다고 생각한다.

바람직하게는, 전형적으로 포유류의 순환에서 수시간보다 긴 반감기를 갖는 안정한 혈장 단백질이, 수용체 융합 단백질을 작제하는데 사용될 수 있다. 이러한 혈장 단백질은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 면역글로불린, 혈청 알부민, 지질단백질, 아포지질단백질 및 트랜스페린을 포함한다. 가용성 수용체를 특정 세포 또는 조직 유형으로 표적화할 수 있는 서열이, 수용체 리간드 결합 도메인에 부착되어, 특이적으로 편재된 가용성 수용체 융합 단백질이 만들어질 수도 있다.

GPCR 리간드 결합 도메인을 포함하는 GPCR 세포외 영역의 전체 또는 기능성 단편은, 사람 IgG1 중쇄의 Fc 도메인과 같은 면역글로불린 불변 영역에 융합될 수 있다. 가용성 수용체-IgG 융합 단백질은 보통의 면역학적 시약이고 이들을 작제하는 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다(예: 그 전문이 참조로서 인용된, 미국특허 제5,225,538호 참조).

기능성 GPCR 리간드 결합 도메인은 면역글로불린(Ig) Fc 도메인에 융합될 수 있다. Ig Fc는, 이에 제한되는 것은 아니지만, IgG1을 포함하는 면역글로불린 클래스 또는 서브클래스로부터 유래할 수 있다. 다른 Ig 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 Fc 도메인은 다양한 2차 효과인자(effector) 기능을 활성화시킬 수 있다. 활성화는 Fc 도메인이 동족의 Fc 수용체에 결합되었을 때 일어난다. 2차 효과인자 기능은 보체 시스템을 활성화시키는 능력 또는 태반을 통과하는 능력을 포함한다. 면역글로불린의 다른 클래스 또는 서브클래스의 성질은 당해 기술분야에 기술되어 있다.

당해 기술분야의 숙련자는, 수용체-Ig 융합 단백질의 접합점을 형성하는 다른 아미노산 잔기가, 구조, 안정성 및 sGPCR 융합 단백질의 궁극적인 생물학적 활성을 변화시킬 수 있음을 인식할 것이다. 하나 이상의 아미노산을, 선택된 sGPCR 단편의 C-말단에 부가하여, 선택된 융합 도메인과의 접합점을 변형시킬 수 있다.

sGPCR 융합 단백질의 N-말단은 또한, 선택된 sGPCR DNA 단편이 재조합 발현 벡터내로 삽입되기 위해 5' 말단에서 절단되는 위치를 변화시킴으로써, 달라질 수 있다. 각각의 sGPCR 융합 단백질의 안정성 및 활성은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 리간드 결합 분석법을 포함하는 일상적인 실험법을 사용하여, 시험 및 최적화될 수 있다.

본원에서 제시된 바와 같은 세포외 도메인내의 sGPCR 리간드 결합 도메인 서열을 사용하여, 아미노산 서열 변이체를 작제하여 sGPCR 분자의 이의 리간드에 대한 친화도를 변형시킬 수도 있다. 본 발명의 가용성 분자는 결합하기 위해 내인성 수용체와 경쟁할 수 있다. 리간드에 결합하기 위해 천연 수용체와 경쟁할 수 있는, GPCR 리간드 결합 도메인을 포함하는 임의의 가용성 분자가, 본 발명의 범위내에 속하는 수용체 차단제 또는 리간드 포획제라고 구상된다.

B. 단백질 접합체

단백질의 반감기에 관하여, 단백질의 순환 반감기를 증가시키는 한가지 방법은, 특히 신장에 의한 제거 및 수용체-매개 제거를 통한, 단백질 제거율을 확실하게 감소시키는 것이다. 이는, 외견상 크기를 증가시킬 수 있는 화학적 부분에 단백질을 접합시켜 신장에 의한 제거를 감소시키고 생체내 반감기를 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 게다가, 단백질에 화학적 부분이 부착되면 단백질분해 효소가 단백질과 물리적으로 접촉하는 것을 효과적으로 차단할 수 있고, 따라서 비-특이적 단백질분해에 의한 분해를 방지할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 단백질 치료제의 제조에 사용되어 온 이러한 한가지 화학적 부분이다. 최근에, 단일의, N-말단에 연결된 20kDa PEG 그룹을 사용하여 변형된 G-CSF 분자(Neulastam)가 미국에서 판매 승인을 받았다. 이 PEG화된 G-CSF 분자는 비-PEG화된 G-CSF와 비교하여 반감기가 증가된 갖는 것으로 나타났고, 따라서 현재의 G-CSF 제품보다 덜 자주 투여해도 되지만, 비-PEG화된 G-CSF와 비교하여 현저하게 호중구감소증(neutropenia)의 지속기간을 감소시키지는 않는다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG) 변형은 약제학적 및 생명공학적 응용을 위해서 중요하다. PEG화(PEG의 공유결합적 부착)는, 예를 들면, 항원성 또는 면역원성 항원결정기가 은폐되게 한다. 게다가, 세망내피계에 의한 수용체-매개 흡수를 감소시키거나 단백질분해 효소에 의한 인지 및 분해를 방해한다. 단백질의 PEG화는 신장 여과를 감소시킴으로써 생체이용률을 증가시키는 것으로 나타났다.

"접합체"라는 용어는, 하나 이상의 폴리펩티드(전형적으로는 하나의 폴리펩티드)가, 중합체 분자, 친유성 화합물, 탄수화물 부분 또는 유기 유도체화제와 같은 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분에 공유결합적으로 부착되어 형성된 이질적인 분자를 나타내도록 의도된다. 공유결합적 부착이라는 용어는, 폴리펩티드와 비-폴리펩티드 부분이 서로 직접 공유결합적으로 연결되거나, 다리(bridge), 스페이서(spacer), 또는 연결(linkage) 부분 또는 부분들과 같이 중재하는 부분 또는 부분들을 통해서 간접적으로 서로 공유결합적으로 연결됨을 의미한다. 바람직하게는, 접합체는 적절한 농도 및 조건에서 가용성이다(즉, 혈액과 같은 생리적 체액에서 가용성이다). 본 발명의 접합체의 조성 및 이를 제조하는 방법은, 그 전문이 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제6,831,158호에 기술되어 있다. 미국특허 제6,831,158호에 기술된 방법은 G-CSF의 접합에 관한 것이지만, 본 발명의 sGPCR의 접합에 쉽게 적용될 수 있다.

"중합체 분자"는 2개 이상의 단량체가 공유결합적으로 연결되어 형성된 분자이다. "중합체"라는 용어는 "중합체 분자"라는 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이 용어는 생체내 N- 또는 O-글리코실화에 의해서 폴리펩티드에 부착된 탄수화물 분자(이러한 분자는 "올리고당 부분"이라고도 지칭됨)를 포함하는 탄수화물 분자를 포함하도록 의도된다. 중합체 분자의 수가 확실하게 나타난 경우를 제외하고는, 본 발명의 폴리펩티드에 포함된 또는 본 발명에 사용된 "하나의 중합체", "하나의 중합체 분자", "중합체" 또는 "중합체 분자"를 언급하는 것은 모두, 하나 이상의 중합체 분자를 언급하는 것으로 한다.

"부착 그룹"이라는 용어는 적절한 비-폴리펩티드 부분에 연결될 수 있는 폴리펩티드의 아미노산 잔기 그룹을 나타내도록 의도된다. 예를 들면, 특히 PEG와의, 중합체 접합을 위해서 자주 사용되는 부착 그룹은, 리신의 ε-아미노 그룹 또는 N-말단 아미노 그룹이다. 다른 중합체 부착 그룹은, 자유 카복실산 그룹(예: C-말단 아미노산 잔기 또는 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기에 있는 그룹), 적당하게 활성화된 카보닐 그룹, 산화된 탄수화물 부분 및 머캅토 그룹을 포함한다. 유용한 부착 그룹 및 이들과 맞는 비-펩티드 부분이 표 2에 예시되어 있다.

부착 그룹	아미노산	비-펩티드 부분의 예	접합 방법 / 활성화된 PEG	참조
-NH2	N-말단 Lys, Arg, His	중합체(예: 아미드 또는 이민 그룹이 있는 PEG)	mPEG-SPA 트레실화된 mPEG	Shearwater Corp. Delgado et al., 1992.
-COOH	C-말단 Asp 및 Glu	중합체(예: 에스테르 또는 아미드 그룹이 있는 PEG) 올리고당 부분	mPEG-Hz 시험관내 연결	Shearwater Corp.
-SH	Cys	중합체(예: 이황화, 말레이미드 또는 비닐 설폰 그룹이 있는 PEG) 올리고당 부분	PEG 비닐설폰 PEG-말레이미드 시험관내 연결	Shearwater Corp. Delgado et al., 1992.
-OH	Ser, Thr, -OH, Lys	올리고당 부분 에스테르, 에테르, 카바메이트, 카보네이트가 있는 PAG	생체내 O-연결된 글리코실화
-CONH2	N-글리코실화 부위의 일부분으로서의 Asn	올리고당 부분 중합체(예: PEG)	생체내 N-글리코실화
방향족-CONH2	Phe, Tyr, Trp, Gln	올리고당 부분	시험관내 연결	Yan and Wold, 1984
알데하이드 케톤	산화된 올리고당	중합체(예: PEG) PEG 하이드록사이드	PEG화	Andresz et al., 1978 WO 92/16655 WO 00/23114
구아니디노	Arg	올리고당 부분	시험관내 연결	Lunblad and Noyes, Chemical reagents for protein modification, CRC Press
이미다졸 환	His	올리고당 부분	시험관내 연결	Lunblad and Noyes, Chemical reagents for protein modification, CRC Press

C. 부위-특이적 돌연변이유발

한 양태에서, 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체가 제조될 수 있다. 이들은, 예를 들면, 개체군내에서의 자연적 변이 때문에 생겨난 소수의 폴리펩티드 서열 변이체이거나, 다른 종에서 발견된 동족체(homolog)일 수 있다. 이들은 또한, 자연적으로 발생하지 않지만 충분히 유사하여, 유사하게 기능을 하고/하거나 자연형의 폴리펩티드와 교차반응하는 면역 반응을 유도하는 서열일 수 있다. 서열 변이체는 하기와 같은 부위-지시된 돌연변이유발 표준 방법에 의해서 제조될 수 있다.

폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 치환, 삽입, 또는 결실 변이체일 수 있다. 결실 변이체는 기능 또는 면역원성 활성에 필수적이지 않은 천연 단백질의 하나 이상의 잔기가 없고, 막관통 서열이 없는 수용체 변이체에 의해 예시된다.

치환 변이체는 전형적으로, 단백질내의 하나 이상의 부위에서 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 교환을 포함하고, 단백질분해 절단에 대한 안정성 또는 면역원성과 같은 폴리펩티드의 하나 이상의 성질을 조절하기 위해서 설계될 수 있다. 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다(즉, 하나의 아미노산이 유사한 모양 및 전하를 갖는 하나의 아미노산으로 치환된다). 보존적 치환은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 리신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파르트산에서 글루탐산으로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루탐산에서 아스파르트산으로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 리신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 치환을 포함한다.

삽입 변이체는 폴리펩티드가 빠르게 정제되게 하기 위해 사용되는 것과 같은 융합 단백질을 포함하고, 다른 단백질 및 폴리펩티드로부터의 서열을 포함하는 하이브리드 단백질을 포함할 수도 있다. 예를 들면, 삽입 변이체는 하나의 종으로부터의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부와, 또다른 종으로부터의 상동성 폴리펩티드의 일부를 함께 포함할 수 있다. 다른 삽입 변이체는 폴리펩티드의 암호화 서열내로 추가적인 아미노산이 도입된 변이체를 포함할 수 있고, 예를 들면 프로테아제 절단 부위가 도입될 수 있다.

폴리뉴클레오타이드의 구조를 변형 및 변화시키면서도, 바람직한 특성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 기능성 분자가 수득될 수 있다. 다음은 동등한, 또는 보다 개선된, 제2세대 분자를 만들기 위한 단백질의 아미노산 치환에 기초한 논의이다. 아미노산 치환은 다음의 데이터에 따라서 DNA 서열의 코돈을 치환함으로써 달성될 수 있다.

예를 들면, 구조(예: 항체의 항원-결합 영역 또는 기질 분자상의 결합 부위)와 상호작용하는 결합 능력의 분명한 손실없이 단백질 구조에서 특정 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 상호작용하는 능력 및 성질이 그 단백질의 생물학적 활성을 특징짓기 때문에, 단백질 서열에서 특정 아미노산을 치환시키면서도 유사한 성질을 갖는 단백질을 수득할 수 있다. 따라서 발명자들은 생물학적 유용성 또는 활성의 분명한 손실없이 유전자, mRNA 또는 폴리뉴클레오타이드의 DNA 서열이 다양하게 치환될 수 있음을 고려한다.

이러한 치환에 있어서, 아미노산의 하이드로패틱 지수(hydropathic index)를 고려할 수 있다. 상호작용하는 생물학적 기능을 단백질에 부여함에 있어서 아미노산 하이드로패틱 지수의 중요성은 일반적으로 당해 기술분야에서 이해되고 있다[참조: Kyte & Doolittle, 1982].

아미노산			코돈
알라닌	Ala	A	GCA GCC GCG GCU
시스테인	Cys	C	UGC UGU
아스파르트산	Asp	D	GAC GAU
글루탐산	Glu	E	GAA GAG
페닐알라닌	Phe	F	UUC UUU
글리신	Gly	G	GGA GGC GGG GGU
히스티딘	His	H	CAC CAU
이소류신	Ile	I	AUA AUC AUU
리신	Lys	K	AAA AAG
류신	Leu	L	UUA UUG CUA CUC CUG CUU
메티오닌	Met	M	AUG
아스파라긴	Asn	N	AAC AAU
프롤린	Pro	P	CCA CCC CCG CCU
글루타민	Gln	Q	CAA CAG
아르기닌	Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGU
세린	Ser	S	AGC AGU UCA UCC UCG UCU
트레오닌	Thr	T	ACA ACC ACG ACU
발린	Val	V	GUA GUC GUG GUU
트립토판	Trp	W	UGG
티로신	Tyr	Y	UAC UAU

아미노산의 상대적인 친수성은 그 결과로서 생기는 단백질의 2차 구조에 기여하고, 이는 단백질과 다른 분자(예: 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등) 사이의 상호작용을 특징짓는다는 점이 인정된다. 특정 아미노산을 유사한 하이드로패틱 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환시키면서도, 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질이 만들어질 수 있음은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 치환에 있어서, 하이드로패틱 지수가 ±2 내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 내인 아미노산이 특히 바람직하며, ±0.5 내인 아미노산이 보다 특히 바람직하다.

친수성에 기초해서 비슷한 아미노산을 효과적으로 치환시킬 수 있음은 또한 당해 기술분야에서 이해되고 있다. 인접한 아미노산의 친수성에 의해 결정되는, 단백질의 국지적 평균 친수성의 최대값은, 단백질의 생물학적 성질과 서로 관련되어 있음이, 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제4,554,101호에 제시되어 있다.

아미노산을 유사한 친수성 값을 갖는 또다른 아미노산으로 치환시키면서도, 생물학적으로 동등하고 면역학적으로 동등한 단백질을 수득할 수 있음은 물론이다. 이러한 치환에 있어서, 친수성 값이 ±2 내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 내인 아미노산이 특히 바람직하며, ±0.5 내인 아미노산이 보다 특히 바람직하다.

부위-특이적 돌연변이유발은, 기본이 되는 DNA의 특이적 돌연변이유발을 통해서, 개별적인 펩티드, 또는 생물학적으로 기능성인 동등한 단백질 또는 펩티드의 제조에 유용한 기술이다. 이 기술은, 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 치환을 DNA내로 도입시킴으로써, 하나 이상의 상기한 고려사항을 통합하여, 서열 변이체를 제조 및 시험할 수 있는 신속한 능력을 추가로 제공한다. 일반적으로, 부위-특이적 돌연변이유발 기술은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 이 기술은 전형적으로, 일본쇄 및 이본쇄 형태로 존재하는 박테리오파지 벡터를 사용한다. 부위-지시된 돌연변이유발에 유용한 전형적인 벡터는 M13 파지와 같은 벡터를 포함한다. 이들 파지 벡터는 상업적으로 입수할 수 있고 이들의 사용은 일반적으로 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 이본쇄 플라스미드도 부위-지시된 돌연변이유발에서 일상적으로 사용되고, 이를 사용하면 원하는 유전자를 파지로부터 플라스미드로 전달하는 단계가 없어진다.

부위-지시된 돌연변이유발을 이용한, 이에 제한되는 것은 아니지만 sCRFR2α를 포함하는, GPCR 폴리뉴클레오타이드의 서열 변이체의 제조는, 잠재적으로 유용한 종(즉, 특정 리간드에 대한 증가된 친화도를 포함하는, 변화된 리간드 결합 성질을 갖는 종)을 생산하는 수단으로서 제공되고, 핵산의 서열 변이체를 수득할 수 있는 다른 방법들이 있기 때문에, 제한하도록 의도되는 것은 아니다. 예를 들면, 원하는 유전자를 암호화하는 재조합 벡터를, 하이드록실아민과 같은 돌연변이유발제로 처리하여 서열 변이체를 수득할 수 있다.

D. 폴리펩티드의 발현 및 정제

본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 특히 GPCR, B계열 GPCR, B1계열 GPCR을 암호화하는 DNA의 100, 150, 200, 250, 300, 400, 450, 500, 550개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드, 또는 첨부된 서열 목록에 명기된 서열(예: 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 또는 14)과 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오타이드는, 암호화된 펩티드 또는 단백질로서 발현될 수 있다. 특정 양상에서 DNA는, GPCR 세포외 도메인, 및 특히 아미노 말단 세포외 도메인의 전체 또는 부분을 암호화한다. 원핵생물 또는 진핵생물 시스템에서의 발현을 위한 DNA 단편의 조작은, 재조합 발현 분야의 숙련자에게 일반적으로 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 청구된 핵산 서열의 발현에서 사실상 임의의 발현 시스템이 사용될 수 있다고 생각된다.

특정 양태에서, 본 발명은 sGPCR, sCRFR, 또는 sCRFR2와 같은 적어도 하나의 단백질 분자를 포함하는 새로운 조성물에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단백질 분자", "단백질 조성물", "단백질 화합물", "단백질 쇄" 또는 "단백질 물질"은 일반적으로, 이에 제한되는 것은 아니지만, 약 200개의 아미노산보다 큰 단백질 또는 유전자로부터 해독된 전체 길이 내인성 서열; 약 100개의 아미노산보다 큰 폴리펩티드; 및/또는 약 3개 내지 약 100개의 아미노산의 펩티드를 의미한다. 상기한 모든 "단백질" 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 게다가, 이들 용어는 융합 단백질에도 적용될 수 있다.

특정 양태에서, 적어도 하나의 단백질 분자의 크기는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 서열번호 4, 8, 12, 또는 15의 전체 길이를 포함하는, GPCR, B계열 GPCR, B1계열 GPCR, 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 15의, 약 또는 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500개 이상의 아미노산 분자 잔기, 및 그 가운데에서 유도될 수 있는 임의의 범위, 특히 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190개 이상의 연속적인 아미노산 서열과 같은 길이를 포함할 수 있다. cDNA 및 게놈 서열은 둘다 진핵생물에서의 발현에 적당한데, 숙주 세포가 일반적으로 게놈 전사체를 프로세싱해서 단백질로 해독될 기능성 mRNA를 만들어낼 것이기 때문이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "조작된" 및 "재조합" 세포라는 용어는, cDNA 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은, 외인성 DNA 단편 또는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포를 의미하도록 의도된다. 그러므로, 조작된 세포는, 재조합에 의해 도입된 외인성 DNA 단편 또는 유전자를 포함하지 않는 천연 세포로부터 구별할 수 있다. 따라서 조작된 세포는 사람의 손을 거쳐서 도입된 유전자 또는 유전자들을 갖는 세포이다. 재조합 세포는 도입된 cDNA 또는 게놈 DNA를 갖는 세포를 포함하고, 도입된 특정한 유전자와 본래 관련되지 않은 프로모터의 근처에 위치한 유전자도 포함할 수 있다.

재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키기 위해서, 돌연변이체이든지 야생형이든지, 본 발명에 따라서, 하나 이상의 프로모터의 조절하에 있는 청구된 분리된 핵산 중의 하나를 포함하는 발현 벡터를 제조할 수 있을 것이다. 암호화 서열을 프로모터"의 조절하에" 놓기 위해서, 판독 프레임의 해독 개시 부위의 5' 말단을 일반적으로, 선택된 프로모터의 약 1 내지 50 뉴클레오타이드 "하류에"(즉, 3'에) 위치시킨다. "상류의" 프로모터는 삽입된 DNA의 전사를 촉진시키고 암호화된 재조합 단백질의 발현을 향상시킨다. 이것이 본원에서 사용된 문맥에서 "재조합 발현"의 의미이다.

다양한 숙주의 발현 시스템에서 단백질 또는 펩티드를 발현시키기 위해서, 적당한 핵산 및 전사/해독 조절 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제하기 위한 많은 표준 기술이 이용가능하다. 발현을 위해서 이용가능한 세포 유형은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 세균(예: 이. 콜라이(E. coli), 비. 섭틸리스(B. subtilis), 이. 콜라이 RR1 균주, 이. 콜라이 LE392, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 χ 1776(ATCC 31537)뿐만 아니라 이. 콜라이 W3110(F-, 람다-, 독립영양, ATCC 273325)); 바실리(bacilli)(예: 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)); 및 재조합 파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 다른 장내세균과(enterobacteriaceae)(예: 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 및 다양한 슈도모나스속(Pseudomonas)의 종)를 포함한다.

폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 단편은 표준 서브클로닝 기술에 의해서 발현 벡터내로 삽입될 수 있다. 한 양태에서, 융합 단백질로서 재조합 폴리펩티드를 생산하는 이. 콜라이 발현 벡터가 사용되고, 이는 단백질의 빠른 친화도 정제를 가능하게 한다. 이러한 융합 단백질 발현 시스템의 예는 글루타티온 S-트랜스퍼라제 시스템[구입원: Pharmacia, Piscataway, NJ], 말토스 결합-단백질 시스템[구입원: New England Biolabs, Beverley, MA], FLAG 시스템[구입원: IBI, New Haven, CT], 및 6xHis 시스템[구입원: Qiagen, Chatsworth, CA]이다. 추가의 유용한 벡터는, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 가용성 융합 단백질을 만드는데 사용하기 위한, pIN 벡터[참조: Inouye et al., 1985]; 및 pGEX 벡터를 포함한다. 다른 적당한 융합 단백질은 β-갈락토시다제, 유비퀴틴 등이 있는 단백질이다.

사카로마이세스(Saccharomyces)속에서의 발현을 위해서, 예를 들면, 플라스미드 YRp7이 일반적으로 사용된다[참조: Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980]. 이 플라스미드는 trp1 유전자를 포함하고, 이는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 없는 돌연변이 효모 균주(예: ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선별 마커를 제공한다[참조: Jones, 1977]. 효모 숙주 세포 게놈의 특성으로서 trp1 손상이 존재하면, 트립토판이 없을 때의 성장에 의해서 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경이 제공된다.

효모 벡터의 적당한 프로모터 서열은, 3-포스포글리세레이트 키나제[참조: Hitzeman et al., 1980] 또는 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포르포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제와 같은 다른 해당작용 효소[참조: Hess et al., 1968; Holland et al., 1978]의 프로모터를 포함한다. 적당한 발현 플라스미드를 작제함에 있어서, 이들 유전자와 관련된 종결 서열도, 발현되기를 원하는 서열의 발현 벡터 3'에 연결하여, mRNA의 폴리아데닐화 및 종결이 일어난다.

성장 조건에 의해서 전사가 조절되는 추가적인 장점이 있는, 다른 적당한 프로모터는, 알코올 데하이드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산성 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 및 상기한 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소의 프로모터 영역을 포함한다.

미생물 외에도, 다세포 생물로부터 유래한 세포의 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다. 원칙적으로, 포유류 및 곤충 세포를 포함하여 척추동물 세포든지 무척추동물 세포든지, 임의의 이러한 세포 배양물이 사용될 수 있다(예: 미국특허 제4,215,051호).

유용한 포유류 숙주 세포주의 예는, VERO 및 HeLa 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주, WI38, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN 및 MDCK 세포주이다. 게다가, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 프로세싱하는 숙주 세포가 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예: 글리코실화) 및 프로세싱(예: 절단)은 암호화된 단백질의 기능을 위해서 중요할 수 있다.

청구된 분리된 핵산 암호화 서열의 효율적인 해독을 위해서 특정 개시 시그날이 필요할 수도 있다. 이들 시그날은 ATG 개시 코돈 및 근처의 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 해독 조절 시그날이 추가적으로 제공될 필요가 있을 수 있다. 당해 기술분야의 보통의 숙련자는 쉽게 이 필요를 결정하고 필요한 시그날을 제공할 수 있을 것이다. 전체 삽입체가 확실하게 해독되기 위해서는, 원하는 암호화 서열의 판독 프레임이 개시 코돈과 같은 프레임에(또는 같은 위상으로) 있어야 함은 잘 알려져 있다. 적당한 전사 인핸서(enhancer) 또는 전사 터미네이터(terminator)를 포함시킴으로써 발현 효율이 향상될 수 있다[참조: Bittner et al., 1987].

재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위해서는, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들면, G-단백질을 암호화하는 구성체를 안정하게 발현하는 세포주를 제작할 수 있다. 바이러스의 복제 오리진을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것보다는, 적당한 발현 조절 요소(예: 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선별 마커에 의해 조절되는 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 외부 DNA를 도입시킨 후, 조작된 세포를 강화배지에서 1 내지 2일 동안 성장하게 하고, 이어서 선별배지로 교체할 수 있다. 재조합 플라스미드에 있는 선별 마커는 선별에 대한 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 세포의 염색체내로 안정적으로 통합하게 하며, 성장하여 포커스(focus)를 형성하게 하고, 이는 클로닝되어 세포주로 발전될 수 있다.

이에 제한되는 것은 아니지만, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제[참조: Wigler et al., 1977], 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제[참조: Szybalska et al., 1962] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자[참조: Lowy et al., 1980]을 포함하는 많은 선별 시스템은, 각각 tk ^-, hgprt ^- 또는 aprt ^- 세포에서 사용될 수 있다. 또한, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr[참조: Wigler et al., 1980; O'Hare et al., 1981]; 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt[참조: Mulligan et al., 1981]; 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo[참조: Colbere-Garapin et al., 1981]; 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro에 대한 선별의 기초로서 항대사물질 내성이 사용될 수 있다.

특정 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 결정 또는 제작되면, 폴리뉴클레오타이드는 적당한 발현 시스템내로 삽입될 수 있다. 이 경우에, 발명자들은 sGPCR 리간드 결합 도메인 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 수의 다른 재조합 DNA 발현 시스템에서 발현되어 많은 양의 폴리펩티드 산물이 생성될 수 있고, 이어서 정제 및/또는 분리되어 치료제로서 사용되거나 동물에게 예방접종하여 항혈청을 생성하는데 사용되거나, 본 발명의 특정 양상에서는 GPCR 리간드 및/또는 GPCR 활성화의 길항제로서 사용될 수 있다. 추가의 양상에서, 본 발명의 sGPCR은, 리간드, 수용체, 또는 GPCR의 작용제 및/또는 길항제를 검출, 스크리닝, 또는 동정하는 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 발현되어, GPCR 리간드 결합 도메인, B계열 GPCR 리간드 결합 도메인, B1계열 GPCR 리간드 결합 도메인, 서열 목록(예: 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 15)에 제시된 아미노산 서열의 전체 또는 부분을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 sCRFR 리간드 결합 도메인 또는 CRFR2 리간드 결합 도메인 폴리펩티드가 수득될 수 있다.

재조합 폴리펩티드에 대한 대안으로서, 본 발명의 폴리펩티드에 상응하는 합성 펩티드가 제조될 수 있다(예: 항원 펩티드). 이러한 항원 펩티드는 적어도 6개의 아미노산 잔기의 길이이고, 대략 35개의 잔기까지 포함할 수 있다. 자동 펩티드 합성 장치는 구입원[Applied Biosystems(Foster City, CA)]로부터 입수할 수 있는 장치를 포함한다. 예방접종을 위한 이러한 작은 펩티드를 사용하기 위해서는 전형적으로 펩티드를, B형 간염 표면 항원, 열쇠구멍삿갓조개 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 소의 혈청 알부민과 같은 면역원성 운반체 단백질에 접합시켜야 한다. 이 접합을 수행하는 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다.

1. 발현된 단백질의 정제

본 발명의 추가의 양상은, sGPCR 리간드 결합 도메인의 전체 또는 부분을 포함하는 단백질 또는 펩티드의, 분리를 위한 정체, 및 특정 양태에서는 실질적인 정제에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이 "정제된 또는 분리된 단백질 또는 펩티드"라는 용어는, 다른 성분으로부터 분리가능한 조성물을 의미하도록 의도되고, 이때 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 자연적으로 수득할 수 있는 상태와 비교하여(즉, 이 경우에는, 개체 또는 조직내에서의 순도와 비교하여) 임의의 정도로 정제된다. 그러므로 정제된 또는 분리된 단백질 또는 펩티드는 또한, 이들이 자연적으로 만들어질 수 있는 환경으로부터 독립된, 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 정제된 또는 분리된 단백질 또는 폴리펩티드의 순도는, 순도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 또는 99% 이상일 수 있다.

일반적으로, "정제된"은, 다양한 다른 성분을 제거하기 위한 분별 과정을 거치고, 발현되는 활성을 실질적으로 보유하는, 단백질 또는 펩티드 조성물을 의미할 것이다. "실질적으로 정제된"이라는 용어가 사용되는 경우, 이것은 조성물에서 단백질이 약 50% 이상을 구성하는 것과 같이, 단백질 또는 펩티드가 주성분을 이루는 조성물을 의미할 것이다.

단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량하는 다양한 방법은, 본 공개에 비추어 당해 기술분야의 숙련자에게 공지될 것이다. 이들은, 예를 들면, 활성 분획의 비활성(specific activity)(예: 이에 제한되는 것은 아니지만, CRF 또는 CRF 계열의 리간드를 포함하는 GPCR 리간드에 대한 결합 친화도)을 결정하는 것, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해서 분획내의 폴리펩티드의 수를 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 바람직한 방법은, 분획의 비활성을 계산하여 초기 추출물의 비활성과 비교함으로써 순도 정도(본원에서는 "-배수 정제"로 평가됨)를 계산하는 것이다. 결합 활성 또는 친화도를 포함할 수 있는, 활성의 양을 나타내는데 사용되는 실제 단위는, 물론, 선택되는 특정 분석 기술에 따라 달라질 것이다.

단백질 정제에 사용하기에 적당한 다양한 기술은 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있을 것이다. 이들은, 예를 들면, 황산암모늄, 폴리에틸렌 글리콜, 항체 등을 이용한 또는 열 변성에 의한 침전 후의 원심분리; 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록실인회석, 및/또는 친화도 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 단계; 등전점 전기영동; 겔 전기영동; 및 이러한 및 다른 기술의 조합을 포함한다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서가 바뀌거나 특정 단계가 생략될 수 있으면서도, 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드를 제조하는 적당한 방법이 된다고 생각된다.

단백질 또는 펩티드가 항상 가장 정제된 상태로 제공되어야 할 일반적인 필요성은 없다. 실제로, 덜 실질적으로 정제된 산물이 특정 양태에서 일관성을 가질 것으로 생각된다. 더 적은 수의 정제 단계의 조합을 사용함으로써, 또는 동일한 일반적 정제 체계의 다른 형태를 이용함으로써 부분정제를 할 수 있다. 예를 들면, HPLC 장치를 사용하여 양이온-교환 칼럼 크로마토그래피를 수행하면, 저압 크로마토그래피 시스템을 사용하여 동일한 기술을 수행할 때보다 일반적으로 더 큰 배수로 정제될 것으로 생각된다. 상대적으로 정제 정도가 더 낮은 방법은, 단백질 산물의 총 회수율에 있어서, 또는 발현된 단백질의 활성을 유지하는데 있어서 장점을 가질 수 있다.

E. sGPCR 에 특이적인 항체의 제조

몇몇 양태를 위해서, 이에 제한되는 것은 아니지만, sCRFR2α를 포함하는, sGPCR을 암호화하는 분리된 핵산의 단백질 산물에 높은 특이성으로 결합하는 항체를 제조하기 원할 것이다. 특정 양상에서, GPCR의 C-말단, 특히 sCRFR2α 스플라이스 변이체와 같은 스플라이스 변이체를 인식하거나 이와 결합하여, 막에 결합된 수용체로부터 sGPCR 폴리펩티드를 구별하는데 사용될 수 있는 항체를 제조하는 것이 고려된다. 이러한 항체는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 면역검출 방법, 면역침전 방법, ELISA 분석, 단백질 정제 방법 등을 포함하는, 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 임의의 다양한 응용에서 사용될 수 있다. 항체를 제조하고 특성을 규명하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다(예: 본원에 참조로서 인용된, 문헌[참조: Harlow and Lane, 1988]).

폴리클로날 항체를 만드는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 간단하게 설명하면, 폴리클로날 항체는, 항원성 조성물을 사용하여 동물을 면역시키고 면역된 동물로부터 항혈청을 수거함으로써 제조된다. 항혈청의 생산을 위해서 넓은 범위의 동물 종이 사용될 수 있다. 전형적으로 항혈청의 생산을 위해서 사용되는 동물은 래빗, 마우스, 쥐, 햄스터, 기니피그, 말, 또는 염소이다. 래빗의 혈액량이 상대적으로 많기 때문에, 래빗이 폴리클로날 항체의 생산을 위한 바람직한 선택이다.

당해 기술분야에서 잘 알려진 바와 같이, 주어진 조성물은 면역원성이 다를 수 있다. 그러므로 펩티드 또는 폴리펩티드 면역원을 운반체에 연결함으로써 달성될 수 있는 바와 같이, 많은 경우에 숙주 면역 시스템을 증강시키는 것이 필요하다. 대표적이고 바람직한 운반체는 열쇠구멍삿갓조개 헤모시아닌(KLH), 소의 혈청 알부민(BSA)이다. 난알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 래빗 혈청 알부민과 같은 다른 알부민도 운반체로서 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 운반체 단백질에 접합시키는 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있고, 글루타르알데하이드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르, 카보디이미드 및 비스-비아조화된 벤지딘을 포함한다.

당해 기술분야에서 또한 잘 알려진 바와 같이, 특정 면역원 조성물의 면역원성은, 어쥬반트(adjuvant)로 알려진 비특이적 면역반응 자극제를 사용하여 향상될 수 있다. 대표적이고 바람직한 어쥬반트는, 완전 프로인드 어쥬반트(complete Freund's adjuvant)(죽은 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 포함하는 비특이적 면역반응 자극제), 불완전 프로인드 어쥬반트 및 알루미늄 하이드록사이드 어쥬반트를 포함한다.

모노클로날 항체(MAb)는, 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제4,196,265호에 예시된 기술과 같은, 잘 알려진 기술을 사용하여 쉽게 제조될 수 있다. 전형적으로, 이 기술은 선택된 면역원 조성물(예: 정제된 또는 부분정제된 발현된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드)을 사용하여 적당한 동물을 면역시키는 단계를 포함한다. 면역시키는 조성물은 항체 생산 세포를 효과적으로 자극하는 방법으로 투여된다.

상기한 바와 같이 동물에 항원을 주사한다. 면역시킨 후에, MAb 생성 프로토콜에서 사용하기 위해, 항체를 생산할 수 있는 체세포, 특히 B 림프구(B 세포)를 선별한다. 대개, 다수의 동물을 면역시키고, 항체 역가가 가장 높은 동물의 비장을 적출하여, 주사기로 비장을 균질화시켜서 비장 림프구를 수득할 것이다.

그리고 나서, 면역된 동물로부터 수득된 항체 생산 B 림프구를, 면역된 동물과 일반적으로 동일한 종의 불멸 골수종 세포(immortal myeloma cell)와 융합시킨다. 하이브리도마(hybridoma)를 만드는 융합 과정에서 사용하기에 적당한 골수종 세포주는 바람직하게는, 항체를 생산하지 않고, 융합 효율이 높으며, 효소 결핍으로 인해서 특정한 선별 배지(원하는 융합된 세포(하이브리도마)만 성장할 수 있음)에서 자랄 수 없는 세포이다. 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 바와 같이, 많은 골수종 세포 중에 임의의 세포가 사용될 수 있다[참조: Goding, 1986]. 예를 들면, 면역된 동물이 마우스인 경우에는, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XX0 Bul이 사용될 수 있고; 쥐인 경우에는, R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210이 사용될 수 있으며; 사람 세포 융합과 관련되어 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6은 모두 유용하다.

한가지 바람직한 쥐의 골수종 세포는 NS-1 골수종 세포주(P3-NS-1-Ag4-1이라고도 함)이고, 이는 세포주 수탁번호 GM3573을 신청하여 수탁기관[NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository]으로부터 쉽게 입수할 수 있다. 사용될 수 있는 또다른 마우스 골수종 세포주는 8-아자구아닌-내성 마우스 쥐의 골수종 SP2/0 비생산자 세포주이다.

본 발명의 모노클로날 항체는, 생체내에서 하이브리도마를 증식시킴으로써 많은 양이 수득될 수도 있다. 모세포와 조직적합성을 갖는 포유류(예: 유전적동계(syngeneic) 마우스)에 세포 클론을 주사하여 항체 생산 종양이 성장하게 한다. 선택적으로, 주사하기 전에, 탄화수소, 특히 프리스탄(테트라메틸펜타데칸)과 같은 기름으로 동물을 초회항원자극(priming)시킨다.

본 발명에 따라서, 펩신 또는 파파인과 같은 효소에 의한 분해 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화결합의 절단을 포함하는 방법에 의해서, 모노클로날 항체의 단편이 수득될 수 있다. 대안으로, 자동 펩티드 합성장치를 사용하여, 또는 전체 길이 폴리뉴클레오타이드 또는 Mab의 전체 또는 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 단편의 발현에 의해서, 본 발명에 포함된 모노클로날 항체 단편이 합성될 수 있다.

항체 접합체는 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다(예: 글루타르알데하이드 또는 과요오도산염과 같은 결합제의 존재하에서 항체와 효소를 반응시킴). 플루오레세인 마커가 있는 접합체는, 이들 결합제의 존재하에서 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해서 제조된다. 금속 킬레이트가 있는 접합체는 유사하게 생산된다. 항체가 접합될 수 있는 다른 부분은 ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶Cl, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵²Eu, 및 ^{99 m}Tc와 같은 방사성핵종을 포함한다. 본 발명의 방사성 표지된 항체는 잘 알려진 방법에 따라 생산될 수 있다. 예를 들면, 요오도화나트륨 또는 요오도화칼륨 및 화학산화제(예: 차아염소산나트륨), 또는 효소산화제(예: 락토퍼옥시다제)와 접촉시킴으로써 항체가 요오드화될 수 있다. 본 발명에 따른 항체는, 리간드 교환 과정에 의해서(예: 주석액으로 과산화테크네튬을 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스(Sephadex) 칼럼상에 킬레이팅시키고, 이 칼럼에 항체를 가함), 또는 직접표지 기술에 의해서(예: 과산화테크네튬, 환원제(예: SnCl₂), 완충액(예: 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액), 및 항체를 항온처리함), 테크네튬⁹⁹로 표지될 수 있다.

III . sGPCR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산

본 발명은, 이에 제한되는 것은 아니지만, GPCR, B계열 GPCR, B1계열 GPCR, CRFR, 또는 CRFR2 폴리펩티드와 같은 sGPCR의 전체 또는 부분을 암호화하는 핵산을 포함하고, 핵산 서열의 전달뿐만 아니라 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 위해 필요한 다양한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는, 서열 목록(예: 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 또는 14)에 있는 전체 길이 핵산 서열의 전체 또는 부분을 포함하는, 다양한 길이의 연속적인 핵산 가닥(예: 약 10, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2100), 또는 본원에서 참조된 이들 GPCR의 폴리뉴클레오타이드, 이의 단편, 본원에서 기술된 또는 참조된 서열을 포함하는 mRNA, 또는 cDNA를 포함할 수 있고, 각각의 돌연변이체가 고려된다. 상기한 서열에 상보적이고 고엄중성 조건(high stringency condition)하에서 이들 서열과 결합하는 분자도 고려된다. 이들 프로브는 서던 및 노던 블럿과 같은 다양한 하이브리드화 양태에서 유용할 것이다.

공개된 뉴클레오타이드 서열을 중심으로 다양한 프로브 및 프라이머가 설계될 수 있다. 프라이머는 임의의 길이일 수 있지만, 전형적으로, 길이가 10 내지 20 염기이다. 특정 양상에서, 프로브 또는 프라이머를 사용하여, 이에 제한되는 것은 아니지만, 엑손 5번/엑손 7번 스플라이스 접합(CRFR2α 전사와 관련해서 엑손 3번/엑손 5번 접합이라고 기술될 수도 있음)을 포함하는 CRFR2 유전자와 같은, GPCR의 대체 스플라이싱된 형태의 존재를 동정 또는 스크리닝할 수 있다. 이들 프로브 또는 프라이머는, 조작된 핵산 또는 스플라이스 접합의 유일한 서열과 하이브리드화하거나, 조작된 핵산 또는 스플라이스 접합의 특성이 있는 핵산을 증폭시킬 수 있다. 서열에 숫자를 부여함으로써(예: 첫번째 잔기는 1, 두번째 잔기는 2, 등), 모든 프라이머를 정의하는 알고리듬을 제안할 수 있다:

n 내지 n+y

이때 n은 1 내지 서열의 마지막 번호인 정수이고, y는 프라이머의 길이에서 1을 뺀 값이며, 이때 n+y는 서열의 마지막 번호를 초과하지 않는다. 따라서, 10합체의 경우, 프로브는 염기 1번 내지 10번, 2번 내지 11번, 3번 내지 12번 …등에 상응한다. 15합체의 경우, 프로브는 염기 1번 내지 15번, 2번 내지 16번, 3번 내지 17번 …등에 상응한다. 20합체의 경우, 프로브는 염기 1번 내지 20번, 2번 내지 21번, 3번 내지 22번 …등에 상응한다.

특정 양상에서, 본 발명의 핵산 서열을 사용하여 본원에서 기술된 다양한 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 핵산 서열은 하이브리드화 프로브 또는 증폭 프라이머로서 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 이들 프로브 및 프라이머는 올리고뉴클레오타이드 단편으로 이루어진다. 이러한 단편은 충분히 길어야 조직으로부터 추출된 RNA 또는 DNA 샘플에 특이적으로 하이브리드화 할 수 있다. 전형적으로, 서열은 10 내지 20 뉴클레오타이드이지만, 보다 길 수 있다. 보다 긴 서열(예: 40, 50, 100, 500 및 전체 길이까지도)이 특정 양태를 위해서 바람직하다.

길이가 17 내지 100 뉴클레오타이드인 하이브리드화 프로브를 사용하면, 안정하고 선택적인 이중(duplex) 분자의 형성이 가능하다. 길이가 20 염기 이상인 상보적인 서열을 갖는 분자가 일반적으로 바람직하고, 이는 하이브리드의 안정성 및 선택성을 증가시킴으로써, 수득된 특정 하이브리드 분자의 질 및 등급을 향상시킨다. 20 내지 30 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 또는 원하는 경우에는 보다 긴, 핵산 분자를 설계하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다. 예를 들면, 이러한 단편은 화학적 방법으로 단편을 직접 합성함으로써, 또는 선택된 서열을 재조합 벡터내로 도입시켜 재조합체를 생산함으로써 쉽게 제조될 수 있다. 따라서, 유전자, 폴리뉴클레오타이드 또는 RNA의 상보적인 가닥과 선택적으로 이중 분자를 형성하거나, 조직으로부터 DNA 또는 RNA를 증폭시키기 위한 프라이머를 제공하는 능력 때문에, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열이 사용될 수 있다. 구상된 응용에 따라, 표적 서열에 대한 프로브의 선택성의 정도를 변화시키기 위해서 다양한 하이브리드화 조건을 사용하기 원할 것이다.

높은 선택성이 필요한 응용에서는, 전형적으로, 하이브리드를 형성하는 상대적으로 엄중한 또는 고엄중성 조건을 사용하기 원할 것이다(예: 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.10M NaCl에 의해서 제공되는 조건과 같은, 상대적으로 낮은 농도의 염 및/또는 고온 조건을 선택할 것이다). 이러한 고엄중성 조건은, 프로브와 주형 또는 표적 가닥 사이에 미스매치(mismatch)가 만약 있다면 이를 거의 허용하지 않으며, 특정 유전자를 분리하거나 특정 mRNA 전사체를 검출하는데 특히 적당할 것이다. 포름아미드의 양을 증가시키면서 첨가함으로써, 보다 엄중한 조건이 될 수 있다고 일반적으로 생각된다.

특정 양태에서, 하이브리드화를 측정하기 위해서, 형광 또는 방사성 표지와 같은 적당한 검출방법과 함께 본 발명의 핵산 서열을 사용하는 것이 유리할 것이다. 검출될 수 있는 형광, 방사능, 효소 또는 다른 리간드(예: 아비딘/비오틴)를 포함하는, 많은 종류의 적당한 지시약법이 당해 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명의 핵산 단편이 발현 벡터(예: 플라스미드, 코스미드 또는 바이러스의 폴리뉴클레오타이드)내로 통합되는 응용의 경우, 이들 단편은 다른 DNA 서열(예: 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 암호화 단편 등)과 결합되어, 이들의 전체 길이가 상당히 변화될 수 있다. 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조 및 사용을 용이하게 하기 위해서 바람직하게는 총 길이가 제한되면서, 거의 모든 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있다고 생각된다.

특정 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 DNA 단편은, 재조합 숙주 세포내로 도입되어, 이에 제한되는 것은 아니지만, sCRFR2α 폴리펩티드와 같은, sGPCR을 발현시키기 위해서 사용될 수 있다. 대안으로, 유전자 조작 기술의 응용을 통해서, 선택된 폴리뉴클레오타이드의 일부 또는 유도체가 사용될 수 있다.

본 출원에서, "발현 구성체"이라는 용어는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 폴리펩티드를 암호화하는 산물과 같은, 산물을 정의하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 임의의 종류의 유전자 구성체를 포함하도록 의도되고, 이때 핵산 서열의 부분 또는 전체가 전사될 수 있다. 전사체는 단백질로 해독될 수 있지만, 해독될 필요는 없다. 따라서, 특정 양태에서, 발현은 폴리뉴클레오타이드가 전사되는 것과 RNA가 폴리펩티드 산물로 해독되는 것을 둘다 포함한다.

바람직한 양태에서, 핵산은 프로모터의 전사적 조절하에 있다. "프로모터"는, 폴리뉴클레오타이드의 특정한 전사를 개시하는데 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해서 인식되는 DNA 서열을 의미한다. "전사적 조절하에서"라는 어구는, 프로모터가 핵산과 관련되어 정확한 위치 및 방향에 있어서 RNA 폴리머라제 개시 및 폴리뉴클레오타이드의 발현이 조절되는 것을 의미한다. 프로모터라는 용어는, RNA 폴리머라제, 특히 RNA 폴리머라제 II를 위한 개시 부위를 중심으로 밀집된, 전사적 조절 모듈의 그룹을 의미하기 위해서 본원에서 사용될 것이다. 특정 양태에서, 각각의 프로모터에서 적어도 하나의 모듈은 RNA 합성을 위한 개시 부위의 위치를 지정하는 기능을 한다. 이것의 가장 잘 알려진 예는 TATA box이지만, 포유류의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 후기 유전자(late gene)에 대한 프로모터와 같이, TATA box가 없는 몇몇 프로모터에서는, 개시 부위의 위에 놓인 별개의 요소 그 자체의 도움으로 개시 위치가 정해진다.

핵산의 발현을 조절하기 위해 사용되는 특정 프로모터는, 표적 세포에서 핵산을 발현시킬 수 있는 한, 결정적이라고 생각되지는 않는다. 따라서, 표적 세포가 사람 세포인 경우, 사람 세포에서 발현될 수 있는 프로모터의 근처 및 이의 조절하에 핵산의 암호화 영역을 위치시키는 것이 바람직하다. 일반적으로, 이러한 프로모터는 사람 또는 바이러스 프로모터를 포함할 수 있다.

다양한 다른 양태에서, 사람 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus; CMV) 즉시적인 초기 유전자(immediate early gene) 프로모터, SV40 초기 프로모터(early promoter) 및 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 긴 말단 반복(long terminal repeat)을 사용하여 외부 유전자(transgene)를 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 주어진 목적에 대해 발현 수준이 충분한 경우, 외부 유전자를 발현시키기 위해서, 당해 기술분야에서 잘 알려진 다른 바이러스 또는 포유류 세포 또는 세균 파지 프로모터의 사용이 고려된다. 외부 유전자와 같은 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하기 위해서, 본 발명의 상황에서, 하기한 바와 같은 몇몇 요소/프로모터가 사용될 수 있다. 이 목록은, 외부 유전자 발현의 촉진에 관련된 모든 가능한 요소의 전부가 아닌, 단지 대표적인 것만을 열거하도록 의도되었다.

임의의 프로모터/인핸서 조합(Eukaryotic Promoter Data Base EPDB에 의한 바와 같은)을 사용하여 폴리뉴클레오타이드가 발현되게 할 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또다른 가능한 양태이다. 전달 복합체의 일부로서 또는 추가적인 유전자 발현 구성체로서, 적당한 세균 폴리머라제가 제공되면, 진핵생물 세포는 특정 세균 프로모터로부터의 세포질 전사를 지원할 수 있다. 바큘로바이러스(baculovirus) 시스템을 사용하면 강력한 폴리헤드린 프로모터로부터 높은 수준으로 발현이 될 것이다.

프로모터는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄, T-세포 수용체, HLA DQ α 및 DQ β, β-인터페론, 인터루킨-2, 인터루킨-2 수용체, MHC Class II 5, MHC Class II HLA-DRα, β-액틴, 근육 크레아틴 키나제, 프레알부민(트랜스티레틴), 엘라스타제 I, 메탈로티오네인, 콜라게나제, 알부민 유전자, α-태아단백질, α-글로빈, β-글로빈, c-fos, c-HA-ras, 인슐린, 신경세포부착분자(NCAM), α₁-항-트립신, H2B(TH2B) 히스톤, 마우스 또는 제1형 콜라겐, 글루코스-조절 단백질(GRP94 및 GRP78), 쥐 성장 호르몬, 사람 혈청 아밀로이드 A(SAA), 트로포닌 I(TN I), 혈소판-유래 성장 인자, 뒤셴 근위축증(Duchenne Muscular Dystrophy), SV40, 폴리오마, 레트로바이러스, 파필로마 바이러스, B형 간염 바이러스, 사람 면역결핍 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(Gibbon Ape Leukemia Virus)를 포함한다.

다양한 요소(유도인자(inducer))는, 이에 제한되는 것은 아니지만, MT II (포르볼(Phorbol) 에스테르(TPA)중금속); MMTV (글루코코르티코이드, β-인터페론, 폴리(rI)X, 폴리(rc)); 아데노바이러스 5 E2 (Ela); c-jun (포르볼 에스테르(TPA), H₂O₂); 콜라게나제(포르볼 에스테르(TPA)); 스트로멜리신(포르볼 에스테르(TPA), IL-1); SV40 (포르볼 에스테르(TPA)); 쥐의 MX 유전자(인터페론, 뉴캐슬병 바이러스); GRP78 유전자(A23187); α-2-매크로글로불린(IL-6); 비멘틴(혈청); MHC Class I 유전자 H-2kB(인터페론); HSP70 (Ela, SV40 큰 T 항원); 프롤리페린(포르볼 에스테르-TPA); 종양 괴사 인자(FMA); 및 갑상선 자극 호르몬 α 유전자 (갑상선 호르몬)를 포함한다.

전형적으로, 전사체가 적절하게 폴리아데닐화 되게 하는 폴리아데닐화 시그날을 포함할 것이다. 폴리아데닐화 시그날의 성질은 본 발명의 성공적인 실시에 결정적이라고 생각되지는 않으며, 임의의 이러한 서열이 사용될 수 있다. 바람직한 양태는, 다양한 표적 세포에서 기능을 잘 하는 것으로 알려져 있고 편리한, SV40 폴리아데닐화 시그날 및 소의 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그날을 포함한다. 발현 카세트의 요소로서 터미네이터의 포함이 또한 고려된다. 이들 요소는 메시지(message) 수준을 향상시키는 역할을 하고, 카세트에서부터 다른 서열내까지 판독(reading)되는 것을 최소화시킬 수 있다.

본 발명의 다양한 양태에서, 발현 구성체는 바이러스 또는 바이러스 게놈으로부터 유래한 조작된 구성체를 포함할 수 있다. 특정 바이러스는 수용체-매개 엔도사이토시스를 통해 세포내로 들어가서 숙주 세포 게놈내로 통합되어 바이러스 유전자를 안정적이고 효율적으로 발현할 수 있는 능력이 있기 때문에, 외래 유전자를 포유류 세포내로 전달하기 위한 좋은 후보가 된다[참조: Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986]. 벡터로서 처음 사용된 바이러스는 파포바바이러스(원숭이 바이러스 40, 소의 파필로마 바이러스, 및 폴리오마)[참조: Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986] 및 아데노바이러스[참조: Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986] 및 아데노-관련 바이러스를 포함하는 DNA 바이러스였다. 레트로바이러스는 또한, 백시니아(vaccinia) 바이러스[참조: Ridgeway, 1988] 및 아데노-관련 바이러스[참조: Ridgeway, 1988]와 같이, 좋은 유전자 전달 운반체이다[참조: Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986]. 이러한 벡터를 사용하여,

(i) 원하는 G-단백질을 발현시키기 위한 목적으로 시험관내에서 세포주를 형질전환시키거나,

(ii) 유전자 치료 시나리오에서 치료 폴리펩티드를 제공하기 위하여 시험관내에서 또는 생체내에서 세포를 형질전환시킬 수 있다.

다른 양태에서, 사용된 sGPCR 암호화 핵산은, sGPCR 또는 다른 암호화 핵산과, 세포내 조건하에서, 하이브리드화하는 안티센스 구성체를 실제로 암호화할 수 있다. "안티센스 구성체"라는 용어는, 표적 DNA 또는 RNA의 염기 서열에 상보적인, 핵산, 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드를 의미하도록 의도된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "상보적인"이라는 용어는, 핵산의 전체 길이에 걸쳐서 실질적으로 상보적이고, 염기 미스매치가 거의 없는 핵산 서열을 의미한다. 예를 들면, 길이가 15 염기인 핵산 서열이, 오직 하나의 미스매치만 있고 13개 또는 14개의 위치에서 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 경우, 상보적이라고 할 수 있다. 본래, "완전히 상보적인" 핵산 서열은 전체 길이가 모두 완전히 상보적이고 염기 미스매치가 없는 핵산 서열일 것이다.

A. 핵산의 검출 및 정량

본 발명의 한 양태는, sGPCR에 상응하는 핵산을 증폭 및 검출함으로써, 생물학적 샘플내의, 이에 제한되는 것은 아니지만, CRFR2α 핵산과 같은, sGPCR 핵산을 동정하는 방법을 포함한다. 생물학적 샘플은 폴리뉴클레오타이드가 존재할지도 모르는 임의의 조직 또는 체액일 수 있다. 증폭을 위해 주형으로서 사용되는 핵산은, 표준 방법론에 따라서, 생물학적 샘플내에 포함된 세포로부터 분리된다[참조: Sambrook et al., 1989]. 핵산은 분획된 또는 전세포(whole cell) RNA일 수 있다.

sGPCR에 상응하는 핵산에 선택적으로 하이브리드화하는 프라이머 쌍을, 선택적 하이브리드화가 가능한 조건하에서, 분리된 핵산과 접촉시킨다. 일단 하이브리드화되면, 핵산:프라이머 복합체를, 온도-의존성 핵산 합성을 용이하게 하는 하나 이상의 효소와 접촉시킨다. 충분한 양의 증폭 산물이 생성될 때까지, 여러 회("사이클"로도 지칭됨)의 증폭을 수행한다. 증폭 산물을 검출할 수 있다. 특정 응용에서, 시각적인 방법으로 검출을 할 수 있다. 대안으로, 검출은, 화학발광, 혼입된 방사성 표지 또는 형광 표지의 방사성 섬광조영법(scintigraphy)을 통한, 또는 전기 또는 온도 임펄스 시그날을 사용하는 시스템[참조: Affymax technology; Bellus, 1994]을 통한, 산물의 간접적 동정을 포함할 수 있다.

주어진 주형 샘플에 존재하는 마커 서열을 증폭시키기 위해서, 많은 주형 의존적 과정이 사용될 수 있다. 가장 잘 알려진 증폭 방법 중의 하나는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR로도 지칭됨)이고, 이는 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호, 및 문헌[참조: Innis et al., 1990]에 상세히 기술되어 있으며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 폴리머라제 연쇄 반응 방법론은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다.

또다른 증폭 방법은 리가제 연쇄 반응("LCR")이고, 유럽특허 제320308호에 공개되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 미국특허 제4,883,750호에는 표적 서열에 프로브 쌍을 결합시키는 LCR과 유사한 방법이 기술되어 있다. 또한, PCT 출원번호 PCT/US87/00880에 기술된 큐베타 레플리카제(Qbeta Replicase)는, 본 발명에서 또다른 증폭 방법으로서 사용될 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제를 사용하여, 제한 부위의 한쪽 가닥에 뉴클레오타이드 5'-[알파-티오]-트리포스페이트를 포함하는 표적 분자를 증폭시키는, 등온 증폭 방법도 본 발명에서 핵산을 증폭시키는데 유용할 수 있다[참조: Walker et al., (1992)(그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)]. 추가로, 가닥 교환 증폭(Strand Displacement Amplification; SDA)은 핵산의 등온 증폭을 수행하는 또다른 방법이고, 이는 여러 번의 가닥 교환 및 합성(즉, 닉(nick) 해독)을 포함한다. 복구 연쇄 반응(Repair Chain Reaction; RCR)이라고 하는 유사한 방법은, 증폭시키려는 영역의 곳곳에 다수의 프로브를 어닐링(annealing)시키는 단계에 이어서, 4개의 염기 중에 단지 2개만 존재하는 복구 반응을 시키는 단계를 포함한다. 표적 특이적 서열은 반복 프로브 반응(cyclic probe reaction; CPR)을 사용하여 검출될 수도 있다. 각각 그 전문이 본원에 참조로서 인용된, 영국특허 제2202328호 및 PCT 출원번호 PCT/US89/01025에 기술된 또다른 증폭 방법이, 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 다른 핵산 증폭 과정은, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 및 3SR[참조: Kwoh et al., 1989]을 포함하는, 전사-기반 증폭 시스템(TAS)을 포함한다[참조: PCT 출원 WO88/10315(그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)].

증폭시킨 후에, 특이적 증폭이 일어났는지의 여부를 결정하기 위한 목적으로, 주형 및 과량의 프라이머로부터 증폭 산물을 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 한 양태에서, 표준 방법을 사용하여 아가로스, 아가로스-아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서 증폭 산물을 분리한다[참조: Sambrook et al., 1989].

분리를 위해서 크로마토그래피 기술이 사용될 수 있다. 많은 종류의 크로마토그래피가 본 발명에서 사용될 수 있다: 흡착(adsorption), 분할(partition), 이온 교환 및 분자체(molecular sieve), 및 이들을 사용하기 위한 많은 특수화된 기술(예: 칼럼, 종이, 박막 및 가스 크로마토그래피)[참조: Freifelder, 1982].

IV . sGPCR 유전자 발현 방법

본 발명의 한 양태에서, 이에 제한되는 것은 아니지만, sCRFR2α 발현과 같은, 세포내에서의 증가된 sGPCR 발현을 위한 방법이 제공된다. 단백질에 변형(aberration)이 있거나 정상적인 기능을 하기에 단백질 발현이 충분하지 않은 경우에, 이는 특히 유용하다. 이는, sGPCR 결핍, GPCR 과활성화 또는 GPCR 리간드 과다의 결과로서 겪게 되는 질병의 증상을 완화시킬 것이다.

sGPCR을 증가시키는 일반적인 접근법은, 세포, 조직, 동물, 또는 피험자에게 sGPCR 폴리펩티드를 접촉 또는 투여하는 것이다. 단백질이 직접 전달될 수 있는 것이 바람직하지만, 생각할 수 있는 양태는, sGPCR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 세포 또는 인접한 세포에 제공하는 것을 포함한다. 이렇게 공급한 이후에, sGPCR 폴리펩티드는, 숙주 세포의 전사 및 해독 기구에 의해서 합성될 뿐만 아니라 발현 구성체에 의해서 제공될 수도 있다. sGPCR 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지원하기 위해 필요한 시스(cis)-작용 조절 요소는, 발현 구성체의 형태로 제공될 것이다. 바이러스에 의해 암호화된 sGPCR의 발현을 자극 또는 향상시키거나, 발현된 폴리펩티드를 안정화시킴으로써, 동일한 또는 유사한 효과를 달성하는 것도 가능하다.

sGPCR 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 구성체를 발현시키기 위해서는, 전달 벡터에 의해서 발현 구성체가 세포내로 전달되어야 한다. 전달을 위한 하나의 메커니즘은 바이러스 감염을 통한 것이고, 이때 발현 구성체가 바이러스 입자내에 단백질로 둘러싸여(encapsidation), 복제되는 또는 복제되지 않는 핵산이 전달될 것이다.

특정 바이러스는 수용체-매개 엔도사이토시스를 통해 세포내로 들어가서 숙주 세포 게놈내로 통합되어 바이러스 유전자를 안정적이고 효율적으로 발현할 수 있는 능력이 있기 때문에, 외래 유전자를 포유류 세포내로 전달하기 위한 좋은 후보가 된다[참조: Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986]. 유전자 벡터로서 처음 사용된 바이러스는 파포바바이러스(원숭이 바이러스 40, 소의 파필로마 바이러스, 및 폴리오마)[참조: Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986] 및 아데노바이러스[참조: Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986]를 포함하는 DNA 바이러스였다. 이들은 외래 DNA 서열에 대한 용량이 상대적으로 낮고 숙주의 범위가 제한되어 있다. 게다가, 이들은 허용세포(permissive cell)내에서 종양을 유발할 가능성이 있고 세포변성 효과(cytopathic effect)로 인해서 안전성 문제를 일으킨다. 이들은 8kb 이하의 외래 유전물질만 수용할 수 있지만, 다양한 세포주 및 실험동물에 쉽게 도입될 수 있다[참조: Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986].

레트로바이러스는, 감염된 세포내에서 자신의 RNA를 이본쇄 DNA로 전환시킬 수 있는 능력이 특징인, 일본쇄 RNA 바이러스의 그룹이다; 이들은 또한 벡터로서 사용될 수 있다. 본 발명에서 발현 구성체로서 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스[참조: Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988], 아데노-관련 바이러스(AAV)[참조: Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Hermonat and Muzycska, 1984] 및 헤르페스바이러스와 같은 바이러스로부터 유래한 벡터가 사용될 수 있다. 이들은 다양한 포유류 세포에 대해서 몇가지 좋은 특징을 제공한다[참조: Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990].

배양된 포유류 세포내로 발현 구성체를 전달하기 위하여, 바이러스를 이용하지 않는 몇몇 방법 또한 본 발명에서 고려된다. 이들은, 인산칼슘 침전[참조: Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990], DEAE-덱스트란[참조: Gopal, 1985], 전기천공[참조: Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984], 직접 미량주입[참조: Harland and Weintraub, 1985], DNA-적재 리포좀[참조: Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979] 및 리포펙타민-DNA 복합체, 세포 음파파쇄(sonication)[참조: Fechheimer et al., 1987], 고속 미세투사체(microprojectile)를 이용한 유전자총(gene bombardment)[참조: Yang et al., 1990], 및 수용체-매개 형질감염[참조: Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988]을 포함한다. 이들 기술 중의 몇몇은 하기와 같이 생체내 또는 생체외에서의 사용에 성공적으로 적용될 수 있다.

본 발명의 또다른 양태에서, 발현 구성체는 단순히 나출형(naked) 재조합 DNA 또는 플라스미드로 이루어질 수 있다. 구성체의 전달은, 물리적 또는 화학적으로 세포막을 투과화(permeabilization)시키는 상기한 임의의 방법에 의해서 수행될 수 있다. 이는 특히 시험관내에서의 전달에 적용될 수 있고, 또한 생체내에서의 사용에도 적용될 수 있다. 나출형 DNA 발현 구성체를 세포내로 전달하기 위한 본 발명의 또다른 양태는, 입자총(particle bombardment)을 포함한다. 이 방법은, DNA로 코팅된 미세투사체를 고속으로 가속시켜, 세포를 죽이지 않으면서, 세포막을 뚫고 세포 안으로 들어가게 하는 능력에 따라 달려있다[참조: Klein et al., 1987]. 작은 입자를 가속시키기 위한 몇몇 장치가 개발되었다. 이러한 한 장치는 고전압 방전을 일으켜서 전류를 발생시키고, 이어서 기전력을 제공한다[참조: Yang et al., 1990]. 사용되는 미세투사체는 텅스텐 또는 금 구슬과 같이 생물학적으로 불활성인 물질로 이루어졌다.

본 발명의 추가의 양상에서, 발현 구성체는 리포좀내에 포집(entrapping)될 수 있다. 리포좀은 인지질 이중층 막과 내부의 수성 매질이 특징인 소포 구조이다. 다중층(multilamellar) 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 여러 개의 지질층이 있다. 이들은, 인지질을 과량의 수용액에 현탁시키면 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 닫힌 구조를 형성하기 전에 자연적으로 재배열되고, 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 포집한다[참조: Ghosh and Bachhawat, 1991]. 리포펙타민-DNA 복합체 또한 고려된다.

sCRFR2α 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 핵산을 세포내로 전달하기 위해 사용될 수 있는 다른 발현 구성체는, 수용체-매개 전달 운반체이다. 이들은, 거의 모든 진핵생물 세포에서, 수용체-매개 엔도사이토시스에 의한 거대분자의 선택적 흡수를 이용한다. 다양한 수용체들이 세포 유형에 특이적으로 분포되어 있기 때문에, 전달이 매우 특이적으로 일어날 수 있다[참조: Wu and Wu, 1993].

V. 질병의 치료를 위한 약제 및 방법

추가의 양태에서, 본 발명은, 본원에서 공개된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩티드, 및/또는 항체 조성물을, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 양식과의 조합으로, 세포, 조직, 동물, 환자, 또는 피험자에게 투여하기 위하여, 약제학적으로 허용되는 용액으로 제형화하는 것에 관한 것이다.

본 발명의 수성 약제학적 조성물은, sGPCR 발현 구성체, sGPCR과 함께 치료 유전자를 암호화하는 발현 구성체, 또는 GPCR 리간드 활성 또는 민감성 또는 다른 내분비 기능을 조절하는 sGPCR 단백질 및/또는 화합물의 유효량을 포함할 것이다. 이러한 조성물은 일반적으로, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질에 용해 또는 분산될 것이다. "유효량"은, 치료의 목적으로, 피험자의 건강상태에 있어서 임상적으로 측정가능한 차이를 일으키는 양으로 정의된다. 유효량은, 물질, 환자의 상태, 치료의 유형 등에 따라 달라질 것이다.

"약제학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"이라는 어구는, 동물 또는 사람에게 투여되었을 때, 현저한 부작용(adverse reaction), 알레르기 반응 또는 다른 부반응(untoward reaction)을 일으키지 않는 분자체(molecular entity) 및 조성물을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제, 흡수지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 약제의 사용은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 약제가 활성 성분과 적합하지 않는 경우를 제외하고, 치료학적 조성물에서 이들의 사용이 고려된다.

정맥내 또는 근육내 주사와 같은 비경구투여를 위해 제형화된 화합물 외에, 다른 약제학적으로 허용되는 형태는, 예를 들면 경구투여를 위한 정제(tablet) 또는 다른 고체; 시간 지연(time release) 캡슐; 및 현재 사용되는 임의의 다른 형태(예: 크림, 로션, 흡입제 등)를 포함한다.

본 발명의 활성 화합물은 대개, 비경구투여를 위해 제형화될 것이다(예: 정맥내, 근육내, 피하, 또는 복강내 경로를 통한 주사를 위해 제형화됨). 단독으로 또는 통상적인 치료제와의 조합으로, 활성 성분으로서 sGPCR을 포함하는 수성 조성물의 제조는, 본 공개에 비추어 당해 기술분야의 숙련자에게 공지될 것이다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 주사제로서 제조될 수 있다; 주사 전에 액체를 첨가하여 용액 또는 현탁액을 제조하는데 사용하기에 적당한 고체 형태도 제조될 수 있다; 그리고 제제는 유화될 수도 있다.

주사제용으로 적당한 약제학적 형태는, 멸균 수용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩 기름 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 많은 경우에, 이들 형태는 멸균되어야 하고, 쉽게 주사할 수 있을 정도의 유체이어야 한다. 제조 및 보관 조건하에서 안정해야하고, 세균 또는 진균과 같은 미생물의 오염작용으로부터 보존되어야 한다.

담체는 또한, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적당한 혼합물, 및 식물성 기름을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅을 사용함으로써, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기를 유지함으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 미생물의 작용은, 다양한 향균제 및 항진균제(예: 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등)로써 예방할 수 있다. 많은 경우에, 등장화제(예: 당 및 염화나트륨)를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사제 조성물의 흡수는, 조성물에 흡수지연제(예: 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)를 사용함으로써 오래 지속될 수 있다.

필요한 양의 활성 화합물을, 필요에 따라, 위에 열거된 다양한 다른 성분과 함께, 적당한 용매에 혼합시키고, 이어서 여과 멸균을 함으로써 멸균 주사액이 제조된다. 일반적으로, 다양한 멸균된 활성 성분을, 기본 분산 매질 및, 위에 열거된 성분 중에서 필요한 다른 성분을 포함하는 멸균된 담체내로 혼합시킴으로써, 분산액이 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 진공건조 및 냉동건조 기술이고, 이 기술에 의해서 이전에 멸균여과된 용액으로부터 활성 성분 및 추가적인 원하는 성분의 분말이 얻어진다.

제형화되면, 제형에 적합한 방법 및 치료학적으로 유효한 양으로 용액이 투여될 것이다. 제형은, 사용하기에 적합한 약물 방출 캡슐 등과 함께, 상기한 주사액 유형과 같은 다양한 투여형태로 쉽게 투여된다.

수용액의 비경구 투여를 위해서는, 예를 들면, 필요한 경우에 용액은 적당하게 완충되어야 하고 액체 희석액은 우선 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장액이 되어야 한다. 이들 특정 수용액은, 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적당하다. 이러한 점에서, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은, 본 공개에 비추어 당해 기술분야의 숙련자에게 공지될 것이다. 예를 들면, 1회 투여량을 1mL의 등장 NaCl 용액에 용해시켜서, 1000mL의 피하주입액에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다(예: 문헌[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1980)]). 치료받는 피험자의 건강상태에 따라서 반드시 투여량의 변화가 있을 것이다. 투여를 책임지는 사람은, 여하튼, 피험자 개인에 대해 적당한 투여량을 결정할 것이다.

본 발명의 방법의 특정 양상에서, 치료학적 조성물이 투여되는 경로는 비경구투여일 수 있다. 비경구투여는 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 척수내 주사, 섭식 또는 이의 조합일 수 있다. 특정 양상에서, sGPCR을 포함하는 조성물은 1회 투여당 약 0.1 내지 약 10마이크로그램/kg/체중으로 투여된다. 특정 양상에서, sGPCR을 포함하는 조성물은 1회 투여당 약 1 내지 약 5마이크로그램/kg/체중으로 투여된다. 특정 양상에서, sGPCR을 포함하는 조성물은 1회 투여당 약 1.2 내지 약 3.6마이크로그램/kg/체중으로 투여된다. 특정 양상에서, sGPCR을 포함하는 조성물은 1회 투여당 약 1.2 내지 약 2.4마이크로그램/kg/체중으로 투여된다. 바람직한 양상에서, 1회 투여당 투여되는 sGPCR의 양은 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 약 3.0, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 약 9.0, 약 9.1, 약 9.2, 약 9.3, 약 9.4, 약 9.5, 약 9.6, 약 9.7, 약 9.8, 약 9.9, 약 10.0마이크로그램/kg/체중 이상일 수 있다.

다양한 치료 계획(예: 경구, 비경구, 정맥내, 비강내, 및 근육내 투여) 및 제형화에서 본원에서 기술된 특정 조성물을 사용하기 위한 적당한 투여 및 치료 계획의 개발과 마찬가지로, 약제학적으로 허용되는 부형제 및 담체 용액의 제형화는 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.

A. 소화관 전달

"소화관 전달"이라는 용어는, 직접 또는 다른 방법으로, 동물의 소화관 일부에 투여하는 것을 의미한다. "소화관"이라는 용어는, 입에서부터 항문까지 이어져 있고, 음식물의 소화와 흡수 및 잔류 음식물 제거의 기능을 하는, 동물에 있는 통 모양의 관, 및 이의 부분 또는 구획의 어떤 부분 및 전체(예: 구강, 식도, 위장, 소장, 대장 및 결장)뿐만 아니라 이의 복합 부분(예: 위장관)을 의미한다. 따라서, "소화관 전달"이라는 용어는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 경구, 직장, 내시경 및 설하/구강 투여를 포함하는 몇몇 투여 경로를 포함한다. 이들 투여 방식의 일반적인 요건은 소화관의 일부 또는 전체에 걸쳐 흡수되는 것이고, 핵산의 효율적인 점막 투과를 위해서는 이렇게 투여되는 것이 필요하다.

1. 경구 전달

특정 응용에서, 본원에서 공개된 약제학적 조성물은 경구투여를 통해서 동물, 환자, 또는 피험자에게 전달될 수 있다. 이러한 것으로서, 이들 조성물을, 불활성 희석제 또는 동화될 수 있는(assimilable) 식용 담체와 함께 제형화하거나, 단단한 또는 연한 껍질의 젤라틴 캡슐안에 넣거나, 정제로 압축하거나, 식품과 직접 혼합할 수 있다.

활성 성분은 부형제와 혼합될 수 있고 섭취가능한 정제, 구강 정제, 구내정(troche), 캡슐, 엘릭서, 현탁액, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다[참조: Mathiowitz et al., 1997; Hwang et al., 1998; 미국특허 제5,641,515호; 제5,580,579호 및 제5,792,451호(각각 특히 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)]. 정제, 구내정, 환약, 캡슐 등은 또한 다음을 포함한다: 결합제(예: 트라가칸트 고무, 아카시아, 옥수수전분, 또는 젤라틴); 부형제(예: 인산이칼슘); 붕해제(예: 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등); 윤활제(예: 마그네슘 스테아레이트); 및 감미제(예: 슈크로스, 락토스 또는 사카린); 또는 향미제(예: 박하, 노루발풀(wintergreen) 기름, 또는 체리 향미료)가 첨가될 수 있다. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우에는, 상기 종류의 물질 외에도 액체 담체를 포함할 수 있다. 코팅으로서 다양한 다른 물질이 존재하거나, 투여 단위의 물리적인 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환약, 또는 캡슐은 셸락(shellac), 당, 또는 둘다로 코팅될 수 있다. 엘릭서의 시럽은 활성 성분, 감미제로서의 슈크로스, 보존제로서의 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 향미료(예: 체리 또는 오렌지 향미료)를 포함할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위 형태를 제조하는데 사용되는 임의의 물질은, 약제학적으로 순수해야 하고 사용되는 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 게다가, 활성 화합물은 서방형(sustained-release) 제제 및 제형내로 혼합될 수 있다.

전형적으로, 이들 제형은 적어도 약 0.1% 이상의 활성 화합물을 포함할 수 있지만, 활성 성분의 비율은, 물론, 달라질 수 있고, 알맞게 전체 제형의 무게 또는 부피의 약 1 또는 2% 내지 약 60% 또는 70% 이상일 수 있다. 본래, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물내의 활성 화합물의 양은, 임의의 주어진 화합물의 단위 투여에서 적당한 투여량이 얻어지도록 제조될 수 있다. 이러한 약제학적 제형을 제조하는 기술분야의 숙련자는, 다른 약리학적 고려사항뿐만 아니라, 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 유효기간과 같은 요인을 고려할 것이고, 이러한 것으로서, 다양한 투여량 및 치료계획이 바람직할 수 있다.

2. 직장투여

경구 경로로 투여되는 치료제는 대개 대안적으로, 하부 장 경로(lower enteral route)로, 즉, 항문부를 통해서 직장 또는 하부 장관내로 투여될 수 있다. 직장 좌약, 정체관장(retention enema) 또는 직장 카테터(catheter)는 이 목적을 위해서 사용될 수 있고, 환자의 복약이행이 어려운 경우에 바람직할 수 있다(예: 소아 및 노인의 경우, 또는 환자가 구토를 하거나 의식이 없는 경우). 직장투여를 하면 경구 경로보다 혈액내 농도가 더 빠르게 그리고 보다 높아질 수 있지만, 그 반대도 역시 사실일 수 있다[참조: Harvey, 1990]. 직장으로부터 흡수되는 치료제의 약 50%는 간을 우회할 것이기 때문에, 이 경로에 의한 투여는 초회통과 대사작용(first-pass metabolism)의 가능성을 현저하게 감소시킨다[참조: Benet et al., 1996].

B. 비경구 전달

"비경구 전달"이라는 용어는 본 발명의 치료제를, 소화관을 통한 방법 이외의 방법으로 동물, 환자 또는 피험자에게 투여하는 것을 의미한다. 비경구 약제학적 조성물의 제조 및 투여 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다(예: 문헌[참조: Avis, 1990]).

C. 관내( intraluminal ) 투여

분리된 관모양의 기관 또는 조직(예: 동맥, 정맥, 요관 또는 요도)의 일부에 치료제를 직접 전달하기 위한 관내 투여는, 이러한 기관 또는 조직의 내강에 영향을 주는 질병 또는 건강상태가 있는 환자를 치료하기 위해서 필요할 수 있다. 이 투여 방식을 달성하기 위해서, 적당한 방법으로 카테터 또는 삽입관(cannula)을 외과적으로 삽입한다. 치료를 하려는 관모양의 기관 또는 조직의 일부를 분리한 후에, 본 발명의 치료제를 포함하는 조성물을 삽입관 또는 카테터를 통해서 분리된 구획내로 주입한다. 치료제가 관의 내강 세포에 흡수 또는 접촉되도록 약 1 내지 약 120분 동안 항온처리한 후에, 주입 삽입관 또는 카테터를 제거하고, 관모양의 기관 또는 조직의 일부를 분리시키는 봉합사를 제거함으로써 그 안으로 체액이 다시 흐르게 한다[참조: Morishita et al., 1993]. 본 발명의 치료학적 조성물은 또한, 생체적합성 매트릭스(예: 수화겔 물질)와 결합되어, 생체내에서 혈관조직에 직접 사용될 수 있다.

D. 뇌실내 투여

환자의 뇌에 치료제를 직접 전달하기 위한 뇌실내 투여는, 뇌에 영향을 주는 질병 또는 건강상태가 있는 환자를 치료하기 위해서 필요할 수 있다. 이 투여 방식을 달성하는 하나의 방법은, 사람 환자 뇌의 뇌실 안으로 실리콘 카테터를 외과적으로 삽입하고, 외과적으로 복부에 이식된, 피하에 있는 주입 펌프[구입원: Medtronic Inc., Minneapolis, Minn.]에 연결시키는 것이다[참조: Zimm et al., 1984; Shaw, 1993]. 펌프는 치료제를 주입하는데 사용되고, 외부의 프로그래밍 장치에 의해서 정확한 투여량 조절 및 투여 계획의 변화가 가능하다. 펌프의 저장 용량은 18 내지 20mL이고, 주입 속도는 0.1mL/h 내지 1mL/h의 범위이다. 투여 빈도(범위: 매일 내지 매월) 및 투여될 약물의 투여량(범위: 체중 kg당 0.01㎍ 내지 100g)에 따라서, 펌프의 저장소는 3 내지 10주 간격으로 다시 채워질 수 있다. 펌프의 자동-누수방지 격막의 경피 구멍에 의해서 펌프가 다시 채워질 수 있다.

E. 척수강내 약물 투여

환자의 척추내로 치료제를 도입시키기 위한 척수강내 약물 투여는, 중추신경계 질환이 있는 환자를 치료하기 위해서 필요할 수 있다. 이 투여 방식을 달성하기 위해서, 실리콘 카테터를 사람 환자의 제3-4요추(L3-4) 사이에 외과적으로 이식하고, 외과적으로 상복부에 이식된, 피하에 있는 주입 펌프에 연결한다[참조: Luer and Hatton, 1993; Ettinger et al., 1978; Yaida et al., 1995]. 펌프는 치료제를 주입하는데 사용되고, 외부의 프로그래밍 장치에 의해서 정확한 투여량 조절 및 투여 계획의 변화가 가능하다. 펌프의 저장 용량은 18 내지 20mL이고, 주입 속도는 0.1mL/h 내지 1mL/h의 범위이다. 약물 투여 빈도(범위: 매일 내지 매월) 및 투여될 약물의 투여량(범위: 체중 kg당 0.01㎍ 내지 100g)에 따라서, 펌프의 저장소는 3 내지 10주 간격으로 다시 채워질 수 있다. 펌프의 자동-누수방지 격막의 경피 구멍에 의해서 펌프가 다시 채워질 수 있다.

이 방법을 통해 뇌 또는 척추 이외의 범위로 전달하기 위해서, 예를 들면, 간으로 전달하기 위해서, 피하에 있는 주입 펌프가 간동맥에 연결되도록 실리콘 카테터를 구성한다[참조: Kemeny et al., 1993].

F. 질 전달

질 전달은 국부 치료를 제공하고 초회통과 대사작용, 소화효소에 의한 분해, 및 잠재적인 전신 부작용을 예방한다. 이 전달 방식을 위해서 질 좌약[참조: Block, Chapter 87 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 1609-1614] 또는 국소 연고가 사용될 수 있다.

G. 리포좀-, 나노캡슐-, 및 미세입자-매개 전달

특정 양태에서, 본 발명의 조성물을 적당한 숙주 세포내로 도입시키기 위해서, 발명자들은 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 미세구체(microsphere), 지질 입자, 소포 등의 사용을 고려한다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포좀, 소포, 나노구체, 또는 나노입자 등 안에 캡슐화되어 전달되도록 제형화될 수 있다.

이러한 제형화는 본원에서 공개된 핵산 또는 구성체의 약제학적으로 허용되는 제형의 도입을 위해서 바람직할 수 있다. 리포좀의 형성 및 사용은 당해 기술분야의 숙련자에게 일반적으로 공지되어 있다(예: 문헌[참조: Couvreur et al., 1977; Lasic, 1998]에 세포내 세균 감염 및 질병을 표적으로 하는 항생제 치료법에서의 리포좀 및 나노캡슐의 사용이 기술되어 있다). 최근에, 향상된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 갖는 리포좀이 개발되었다[참조: Gabizon and Papahadjopoulos, 1988; Allen and Choun, 1987; 미국특허 제5,741,516호(특히 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)]. 추가로, 잠재적인 약물 담체로서 리포좀 및 리포좀 유사 제제의 다양한 방법이 검토되었다[참조: Takakura, 1998; Chandran et al., 1997; Margalit, 1995; 미국특허 제5,567,434호; 제5,552,157호; 제5,565,213호; 제5,738,868호 및 제5,795,587호(각각 특히 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)].

리포좀은 인지질로부터 형성되는데, 인지질은 수성 매질에 분산되어 자발적으로 다중층 동심원 이중층 소포(multilamellar concentric bilayer vesicle)(다중층 소포(multilamellar vesicle; MLV)라고도 함)를 형성한다. MLV의 지름은 일반적으로 25nm 내지 4㎛이다. MLV를 음파파쇄하면, 중심에 수용액을 포함하는, 지름이 200 내지 500Å 범위인 작은 단일층 소포(small unilamellar vesicle; SUV)가 형성된다.

정맥내로 주사된 리포좀의 운명 및 침착(disposition)은 이들의 물리적인 성질(예: 크기, 유동성, 및 표면 전하)에 따라 달라진다. 이들은 이들의 조성 및 혈액에서의 반감기(범위: 수분 내지 수시간)에 따라, 조직에서 수시간 또는 수일 동안 잔존할 수 있다. 보다 큰 리포좀(예: MLV 및 LUV)은 세망내피계의 식세포에 의해서 빠르게 흡수되지만, 대부분의 부위에서 순환계의 생리기능에 의해 이러한 큰 종류의 유출은 억제된다. 이들은, 간 또는 비장의 동양혈관(sinusoid)과 같이, 모세혈관 내피에 큰 구멍 또는 작은 구멍이 존재하는 곳에서만 유출될 수 있다. 따라서, 이들 기관이 주된 흡수 부위이다. 반면에, SUV는 보다 폭넓은 조직 분포를 나타내기는 하지만, 주로 간 및 비장에 격리되어 있다. 일반적으로, 이러한 생체내 작용에 의해, 리포좀의 큰 크기로 접근할 수 있는 기관 및 조직으로만 리포좀이 잠재적으로 표적화되도록 제한된다. 이들은 혈액, 간, 비장, 골수, 및 림프기관을 포함한다.

대안으로, 본 발명에서는, 본 발명의 조성물의 약제학적으로 허용되는 나노캡슐 제형을 제공한다. 나노캡슐은 안정적이고 재생가능한 방법으로 화합물을 일반적으로 포획할 수 있다[참조: Henry-Michelland et al., 1987; Quintanar-Guerrero et al., 1998; Douglas et al., 1987]. 세포내 중합체의 과적(overloading)으로 인한 부작용을 예방하기 위해서, 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 이러한 초미세입자(약 0.1㎛ 크기)를 설계해야 한다. 본 발명에서의 사용을 위해서, 이들 요건을 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 고려된다. 문헌[참조: Couvreur et al., 1980; 1988; zur Muhlen et al., 1998; Zambaux et al. 1998; Pinto-Alphandry et al., 1995 및 미국특허 제5,145,684(특히 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)]에 기술된 바와 같이, 이러한 입자는 쉽게 만들어질 수 있다.

다음 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 설명하기 위한 목적으로 주어져 있고, 어떤 방식으로도 본 발명을 한정하도록 의도되지 않는다. 당해 기술분야의 숙련자는, 본 발명에 내재된 목적, 목표 및 장점뿐만 아니라, 언급된 목적을 수행하고 목표 및 장점을 달성하기에 본 발명이 매우 적당하다는 점을 쉽게 인식할 것이다. 본 실시예는, 본원에서 기술된 세포 및 방법과 함께, 현재 바람직한 양태를 대표하고, 전형적인 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 의도되지 않는다. 당해 기술분야의 숙련자는, 청구의 범위에 의해서 정의된 바와 같은 본 발명의 정신에 포함되는 변경 및 다른 용도를 생각할 것이다.

A. 재료 및 방법

마우스의 가용성 CRFR2α cDNA의 분리. 마우스의 CRFR2α 오르토로그의 스플라이스 변이체와 동시에, 가용성 CRFR2α 스플라이스 변이체를 분리하였다. 알려진 포유류 CRFR2 유전자간의 상동성에 기초하여 PCR 프라이머를 설계하였다. 다음의 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 5' CCCCGAAGCTGCCCGACTGG 3'(서열번호 16)(센스) 및 5' GGAAGGCTGTAAAGGATGGAGAAG 3'(서열번호 17)(안티센스)를 사용해서, 올리고 dT 또는 무작위 프라이머를 사용하여 역전사된 마우스 전뇌(whole brain) 폴리(A)+RNA로부터 제조된 cDNA를 스크리닝하였다. 72℃에서 90초 동안의 신장(extension)을 포함하는 35 사이클의 PCR을 62℃에서 수행하였다. 증폭된 단편을, pCRIITOPO 벡터[구입원: Invitrogen, Carlsbad, CA]내로 서브클로닝하고, 서열결정을 해서, 엑손 6번이 없는 전체 길이 CRFR2α의 새로운 스플라이스 변이체 (sCRFR2α)를 암호화함을 밝혔다[참조: Chen et al., 2005].

반정량적 RT-PCR 및 서던 분석. 다음의 마우스 말초 및 CNS 조직을 절개하여 상기한 바와 같이 직접 전체 RNA 분리를 하였다[참조: Chen et al., 2005]: 전체 뇌, 후구, 시상하부, 대뇌 피질, 소뇌, 해마, 중뇌, 뇌교/연수, 척수 및 뇌하수체. 주형으로서 cDNA 산물을 사용하고, CRFR2α, sCRFR2α 및 리보솜 단백질 S16에 대한 특이적 프라이머를 사용하여, 반정량적 RT-PCR 분석을 하였다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 엑손 3번 및 7번에 위치한 결과, CRFR2α 및 sCRFR2α에 각각 상응하는 418bp 및 309bp의 두 산물이 증폭되었다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 서열 및 PCR 조건은 참고도서에서 찾을 수 있다.

세포외 수용체 키나제 1/2(ERK1/2) 분석. CATH.a 세포를, 1%(w/v) 소의 혈청 알부민(BSA)을 보충한 DMEM으로 6시간 동안 평형을 이루게 하고, 이어서 0.1% DMEM/BSA에 희석된 0.4 또는 4nM sCRFR2α의 존재 또는 부재하에 0.1% DMEM/BSA(부형제) 또는 10nM Ucn I으로 자극시켰다. 세포를 즉시 회수하고, 상기한 바와 같이 인산화된 ERK1/2-p42,44에 대한 분석을 하였다[참조: Chen et al., 2005].

일시적인 형질감염 및 루시퍼라제 분석. HEK293T 세포를, 강력한 CRE 부위를 포함하는 EVX1 유전자의 단편을 포함하는 루시퍼라제 리포터로 형질감염시켰다. 세포를 회수하고, 상기한 바와 같이 루시퍼라제 리포터 활성을 분석하였다[참조: Chen et al., 2005]. 20시간 동안의 후-형질감염 후에, 0.1nM sCRFR2α의 존재 또는 부재하에 세포를 4시간 동안 부형제 또는 Ucn 1(0.0001 내지 100nM)으로 처리하였다.

방사면역분석 ( RIA ). 인히빈(inhibin) 서브유닛에 대한 상기한 프로토콜을 사용하여, 열쇠구멍삿갓조개 헤모시아닌에 접합된, 마우스 sCRFR2α의 유일한 C-말단 꼬리(아미노산 113번 내지 143번)를 암호화하는 합성 펩티드 단편으로 면역된 래빗에서 항혈청을 만들었다[참조: Vaughan et al., 1989]. 클로라민-T를 사용하여 Na¹²⁵I로 유사체(analog) Tyr¹¹³ sCRFR2α(113-143)를 방사성 표지하고, HA에서 트레이서(tracer)로서 사용하기 위해서 HPLC에 의해 정제하였다[참조: Vaughan et al., 1989]. sCRFR2α RIA의 절차는, 인히빈 서브유닛에 대해 상세히 상기한 절차와 유사하였다[참조: Vaughan et al., 2005]. 간단하게 설명하면, 항-sCRFR2α를 최종적으로 1/300,000로 희석하여 사용하고, 기준으로서 합성 sCRFR2α(113-143)를 사용하였다. 쥐의 조직을 산 추출하고, 기술한 바와 같이 옥타데실 실리카 카트리지를 사용하여 부분정제하였다[참조: Vaughan et al., 1989]. 동결건조된 샘플을 3 내지 7배 용량 수준에서 시험하였다. 양 항-래빗 γ-글로불린 및 10%(wt/vol) 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여, 결합된 트레이서로부터 자유 트레이서를 분리시켰다. sCRFR2α에 대한 EC50 및 최소 검출가능 투여량은 각각 튜브당 5pg 이하 및 100pg이다.

면역조직화학. 성체 수컷 C57B6J 마우스[구입원: Jackson Laboratories] 및 Sprague-Dawley 알비노 랫트(Harlan Sprague-Dawley)를 클로랄 하이드레이트(350mg/kg, 복강내 주사)로 마취시키고, 잠보니 고정액(Zamboni's fixative)로 관류시킨 후[참조: Bittencourt et al., 1999], 0 내지 4시간 동안 후고정시켰다. 벡타스테인 엘리트(Vectastain Elite) 시약[구입원: Vector Laboratories, Burlingame, CA]을 사용하여 니켈-강화 아비딘-비오틴-면역과산화효소로 sCRFR2α-ir 의 위치결정을 하기 위해서, 뇌 전체의 30㎛ 두께의 일정한 간격(4개 중 1개)의 연속적인 정면섹션(frontal section)을 준비하였다. 1차 sCRFR2α 항혈청을 담체에 흡착시키고, 친화도 정제를 하여, 1:2000으로 희석시켜 사용하였다. 면역염색의 특이성은, 0 내지 300μM의 합성 면역원으로 4℃에서 하룻밤 동안 전항온처리한 1차 항혈청을 사용하여 평가되었다. 표지는 또한, CRFR 중의 하나 또는 둘다 결핍된 돌연변이 마우스에서 평가되었다[참조: Smith et al., 1998; Bale et al. 2000]. sCRFR2α로 형질감염된 COSM6 세포의 형광 면역세포화학 분석의 상세한 설명은 참고도서에서 찾을 수 있다.

포유류의 sCRFR2α 발현: PCR에 의해 변형되어 아미노산 143번 다음에 FLAG 항원결정기를 포함하는, 아미노산 1번 내지 143번에 상응하는 cDNA를, pSec-Tag2 HygroA[구입원: Invitrogen, Carlsbad, CA]내로 서브클로닝하고, 기술한 바와 같이 COSM6 세포를 형질감염시키기 위해서 사용하였다[참조: Perrin et al., 2001]. 4일 후에, 배지를 수거하고, FLAG-아가로스[구입원: Sigma, St. Louis, MO] 면역친 화도 크로마토그래피를 사용하여 정제함으로써 sCRFR2α를 농축시켰다. 항-FLAG 항체 또는 유일한 sCRFR2α C-말단에 대해 만들어진 항체를 사용하여 면역블럿 분석을 함으로써 단백질을 검출하였다.

세균의 sCRFR2α 발현: 주형으로서 mCRFR2α를 사용하여 PCR을 함으로써 아미노산 20번 내지 143번에 상응하는 cDNA를 만들었다. cDNA를 pET-32a(+)[구입원: Novagen, La Jolla, CA]내로 서브클로닝하고, 기술된 바와 같이 S-단백질 친화도 크로마토그래피에 의해서 단백질을 정제하였다[참조: Perrin et al., 2001]. 유일한 sCRFR2α C-말단에 대해 만들어진 항체를 사용하여 면역블럿 분석을 함으로써 단백질을 검출하였다.

방사선수용체 분석. COS M6 세포 배지 또는 이. 콜라이로부터 정제된, 가용성 단백질을, 기술된 바와 같이 표지되지 않은 펩티드의 농도를 증가시키면서 [¹²⁵I-DTyr^O]-아스트레신(astressin)과 함께 삼중 웰(triplicate well)에서 항온처리하였다[참조: Perrin et al., 2003].

B. 결과

마우스 CRFR2α를 분리하는 동안에 더 작은 크기(약 100bp)의 cDNA 전사체가 관찰되었다[참조:Van Pett et al., 2000]. 이 단편을 분리하여, 엑손 6번이 결실된 CRFR2α의 변이체를 암호화함을 밝혔다. 변이 전사체를 해독하면, 새로운 143개 아미노산의 단백질인 sCRFR2α가 예측되는데, 이 단백질은 CRFR2α의 첫번째 세포외 도메인의 대부분을 포함하고 그 뒤에는 유일한 38개 아미노산의 C-말단이 있다(도 1A). GenBank 스크리닝을 한 결과, C-말단은 다른 어떤 단백질과도 상동성 을 나타내지 않았다. sCRFR2α의 게놈 배열은 도 1B에 제시되어 있다.

sCRFR2α mRNA가 단지 스플라이싱 오류의 산물이라면, 정확하게 스플라이싱된 RNA보다 양이 훨씬 더 적어야 한다. 이 문제를 조사하기 위해서, 반정량적 RT-PCR을 하고 이어서 서던 하이브리드화 분석을 하여, 몇몇 뇌 영역에서 CRFR2α 및 sCRFR2α mRNA의 상대적인 양을 비교하였다. 마우스 조직으로부터 준비한 전체 RNA를 역전사하여 cDNA를 만들어, 이를 주형으로서 사용하고 특이적 프라이머 및 CRFR2α와 sCRFR2α에 대한 프로브를 사용하여 반정량적 RT-PCR을 하고, 이어서 서던 하이브리드화를 하였다(도 2). 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍(엑손 3번 및 7번에 위치함)으로, 가용성 형태 및 막에 결합된 전체 길이 수용체가 하나의 반응에서 동시에 증폭되었다(도 2A). sCRFR2α는 후구, 대뇌 피질, 중뇌 및 뇌하수체에서 많이 발현되었다(도 2B 및 2C). 해마, 시상하부, 뇌교, 연수 및 척수에서는 낮은 수준으로 발현되었다(도 2B 및 2C). 도 2에 제시된 바와 같이, sCRFR2α mRNA의 양은, CRFR2α mRNA의 양보다 더 적지만 비슷하다. RT-PCR로부터 얻은 cDNA 단편의 서열은 마우스 CRFR2α 유전자의 스플라이스 변이체를 암호화하는 것으로 밝혀졌다(도 1A).

서열을 컴퓨터 분석한 결과, 처음의 19개 아미노산은 추정되는 시그날 펩티드의 역할을 하는 것으로 예측되었다. 막에 부착되는 분명한 부위가 서열에 포함되어 있지 않기 때문에, 단백질이 가용성 형태로서 분비된다고 가설을 세웠다. 이 가설을 조사하기 위해서, 단백질을 COS M6 세포에서 발현시켰다. 배지로부터 정제한 후에, 항-FLAG 항혈청 또는 항-sCRFR2α(sCRFR2α 단백질(아미노산 113-143)의 유일한 C-말단 꼬리를 암호화하는 합성 펩티드 단편에 대해 만들어진 항혈청)을 사용하여 면역블럿 분석을 함으로써, 30kD 이하의 단백질 밴드가 가시화되었다(도 3A). cDNA로부터 예측된 단백질과 비교하여 더 큰 크기의 단백질은 아마도 글리코실화의 결과일 것이다.

더 많은 양의 sCRFR2α를 수득하기 위해서, 추정되는 시그날 펩티드가 없는 단백질을 이. 콜라이에서 융합 단백질로서 발현시켰다[참조: Perrin et al., 2001]. 절단 및 정제 후에, (항-sCRFR2α를 사용하여) 면역블럿 분석을 함으로써 크기가 약 20kD인 좁은 밴드로서 단백질이 가시화되었다. 항-sCRFR2α 혈청은, 방사면역분석(도 3B)에서 뿐만 아니라, 면역세포화학(도 3C)에서도 sCRFR2α 단백질을 검출한다.

항-sCRFR2α 혈청을 이용한 면역조직화학 연구를 통해서 설치류의 뇌에서의 sCRFR2α-ir의 분포가 밝혀졌다. sCRFR2α-ir에 대한 면역표지의 세포 분포는 넓게 퍼져있었고, CRFR2보다 CRFR1 mRNA 발현 패턴의 위치와 더 가깝게 일치하였다(도 4A 내지 4F). 기술한 결과는 마우스에서의 연구로부터 얻은 것이다; 유사한 표지 패턴이 쥐에서 관찰되었다. 세포 발현의 주요 부위는, 후구의 승모세포(mitral cell) 및 술모양세포(tufted cell), 내측 중격대/대각선조 복합체(medial septal/diagonal band complex), 이상피질(piriform cortex), 흑색질(substantia nigra), 적색핵, 기저외측 편도(basolateral amygdaloid), 깊은 소뇌핵(deep cerebellar nucleus) 및 후주핵(dorsal column nucleus)을 포함하고, 이들 모두는 CRFR1 발현의 주요 부위이다. CRFR1과 유사하게, sCRFR2α-ir 세포체는 등피질(isocortex) 전체에 많이 있지만, 층 분포는 일부만 겹친다. 따라서, CRFR1- 및 sCRFR2α-발현 세포체는 2/3층에 많이 있지만, 대뇌 피질에서 CRFR1 발현의 주요 위치는 4층이고, sCRFR2α의 경우에는 5층이다. 외측 중격핵, 중뇌 솔기핵, 복내측 시상하핵 및 편도핵을 포함하는, CRFR2 발현의 주요 부위에는 모두, sCRFR2α-염색된 세포체가 없지만, 흥미롭게도 마지막 두 부위는 표지된 염주(발명자들은 sCRFR2α-ir 말단부를 대표한다고 생각함)로 둘러싸인 얼마 없는 부위에 가운데 있었다. 시상하부의 실방핵도 보통의 밀도의 추정되는 sCRFR2α-ir 말단부를 포함하였다.

면역원으로서 사용된 낮은 마이크로몰농도(≥30μM)의 sCRFR2α(113-143) 펩티드로 항혈청을 전항온처리함으로써 뇌 전체가 표지되는 것을 차단하였다; CRFR1 서열로부터 예측된 상응하는 펩티드와의 경쟁은 3mM 정도의 농도에서 면역표지되는 것을 방해하지 않았다. 표지의 특이성을 추가로 뒷받침하는 것은 CRFR1- 및/또는 CRFR2-결실된 마우스에서 모든 면역위치결정이 지속된 것이 관찰된 것이다; 각각의 존재하는 수용체-녹아웃 계통을 만들기 위해서 사용된 표적화 구성체에는 sCRFR2α 암호화 영역이 없다고 예상될 것이라는 점을 유의해야 한다[참조: Smith et al., 1998; Timpl et al., 1998; Bale et al., 2000].

뇌에서 sCRFR2α형 ir의 존재를 결정하기 위해서, 항-sCRFR2α 및 트레이서로서 [¹²⁵I-Tyr¹¹³] sCRFR2α(113-143)을 사용하는 매우 특이적인 방사면역분석법이 개발되었다. 마우스의 뇌로부터 조직을 산 추출하여, C18 카트리지 상에서 부분정제하고, 여러 투여량에서 방사면역분석으로 분석하였다. 조직 추출물은, 항- sCRFR2α에 결합된 [¹²⁵I-Tyr¹¹³] sCRFR2α(113-143)을 용량-의존적 방식으로 치환하였다(도 4G). 후구, 시상하부, 대뇌 피질 및 중뇌에서 가장 높은 수준으로 발현되었고, 이들 모두는 ir 세포 및 신경섬유의 존재와 서로 관련이 있으며, 면역조직화학 연구에 의해서 결정되었다(도 4). CRFR1의 추정되는 가용성 형태(엑손 5번의 결실에 의해서 생성됨)는 다른 유일한 C-말단 서열을 포함할 것이다. 그 서열에 상응하는 단백질은 방사면역분석에서 [¹²⁵I-Tyr¹¹³] sCRFR2α(113-143)을 치환하지 않았다. 이러한 결과로 설치류 CNS에서의 sCRFR2α 단백질의 존재가 추가로 확인된다.

sCRFR2α에 결합된 [¹²⁵I-D Tyr^O]-아스트레신의 경쟁적 치환을 사용하는 방사선수용체 분석에 의해서, sCRFR2α와 CRF 계열 리간드와의 상호작용을 평가하였다. COS M6 세포에 의해서 분비되거나 세균에서 생산된, 가용성 단백질은, 효능제인 Ucn 1 및 CRF뿐만 아니라, 길항제인 아스트레신과 나노몰의 친화도로 결합하지만, Ucn 2 및 Ucn 3에 대한 친화도는 매우 낮다(표 4).

sCRFR2 α 단백질에 결합하는 CRF 리간드에 대한 결합억제상수 Ki( nM )

단백질	CRF	rUcn1	mUcn2	mUcn3	아스트레신
포유류 sCRFR2α	23 (14-39)	6.6 (3.5-12)	113 (68-190)	>200	6.7 (3.6-12)
세균 sCRFR2α	14.8 (9.2-24)	5.8 (2.5-13.3)	116 (85-158)	>200	10 (7.9-12.5)

COS M6 세포 배지로부터 정제된 sCRFR2α 단백질(포유류 sCRFR2α) 또는 이. 콜라이로부터 정제된 sCRFR2α 단백질(세균 sCRFR2α)과 CRF 계열 일원의 결합. 상세한 설명은 "방법"을 참조.

sCRFR2α의 가능성 있는 기능의 윤곽을 그리기 위해서, 발명자들은 sCRFR2α가 CRF 계열 리간드에 의한 시그날 전달에 미치는 영향을 연구하였다. 포유류 및 세균에 의해서 발현된 sCRFR2α 단백질은 둘다, 용량 의존적 방식으로, 마우스 CRFR2α로 형질감염된 HEK293T 세포에서, Ucn 1 및 CRF에 대한 cAMP 반응을 억제하였고, 이는 EVX1 유전자의 CRE 루시퍼라제 활성에 의해 측정되었다(도 5A). 유로코르틴은 MAPK 시그날 전달을 활성화시키기 때문에[참조: Brar et al., 2002], 발명자들은 내생적으로 CRFR1 및 CRFR2α가 발현되는 CATH.a 세포에서, Ucn 1에 의해 ERK1/2-p42,44가 활성화되는 것을 억제시키는 sCRFR2α의 능력을 측정하였다. CATH.a 세포에서 sCRFR2α는 Ucn 1에 의한 인산화된 ERK의 유도를 억제시킨다(도 5B).

본 발명 및 이의 장점을 상세히 기술하였지만, 첨부된 청구항에 의해서 정의된 바와 같은 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서, 본 발명에서 다양한 변화, 대체 및 변경이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 게다가, 본 출원의 범위는, 본 명세서에 기술된 과정, 기계장치, 제작, 물질의 조성, 수단, 방법 및 단계의 특정 양태에 한정되도록 의도되지 않는다. 당해 기술분야의 보통의 숙련자가 본 발명의 공개로부터 쉽게 인식하겠지만, 본원에서 기술된 상응하는 양태와 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 결과에 도달하는, 현재 존재하거나 나중에 개발될, 과정, 기계장치, 제작, 물질의 조성, 수단, 방법, 또는 단계들이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 따라서, 첨부된 청구항은 청구의 범위에 이러한 과정, 기계장치, 제작, 물질의 조성, 수단, 방법, 또는 단계를 포함하도록 의도된다.

참고문헌

아래에 열거된 참고문헌은, 본 발명에서 사용된 방법론, 기술, 및/또는 조성을 설명하거나, 이에 대한 배경지식을 보충, 설명, 제공하는 정도까지 본원에 참조로서 인용된다.

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<110> Research Development Foundation <120> Compositions and Methods Related to Soluble G-Protein Coupled Receptors (sGPCRs) <130> CLFR:247WO <150> US 60/650,866 <151> 2005-02-08 <160> 17 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 2107 <212> DNA <213> homo sapien <220> <221> CDS <222> (1)..(1233) <400> 1 atg gac gcg gca ctg ctc cac agc ctg ctg gag gcc aac tgc agc ctg 48 Met Asp Ala Ala Leu Leu His Ser Leu Leu Glu Ala Asn Cys Ser Leu 1 5 10 15 gcg ctg gct gaa gag ctg ctc ttg gac ggc tgg ggg cca ccc ctg gac 96 Ala Leu Ala Glu Glu Leu Leu Leu Asp Gly Trp Gly Pro Pro Leu Asp 20 25 30 ccc gag ggt ccc tac tcc tac tgc aac acg acc ttg gac cag atc gga 144 Pro Glu Gly Pro Tyr Ser Tyr Cys Asn Thr Thr Leu Asp Gln Ile Gly 35 40 45 acg tgc tgg ccc cgc agc gct gcc gga gcc ctc gtg gag agg ccg tgc 192 Thr Cys Trp Pro Arg Ser Ala Ala Gly Ala Leu Val Glu Arg Pro Cys 50 55 60 ccc gag tac ttc aac ggc gtc aag tac aac acg acc cgg aat gcc tat 240 Pro Glu Tyr Phe Asn Gly Val Lys Tyr Asn Thr Thr Arg Asn Ala Tyr 65 70 75 80 cga gaa tgc ttg gag aat ggg acg tgg gcc tca aag atc aac tac tca 288 Arg Glu Cys Leu Glu Asn Gly Thr Trp Ala Ser Lys Ile Asn Tyr Ser 85 90 95 cag tgt gag ccc att ttg gat gac aag cag agg aag tat gac ctg cac 336 Gln Cys Glu Pro Ile Leu Asp Asp Lys Gln Arg Lys Tyr Asp Leu His 100 105 110 tac cgc atc gcc ctt gtc gtc aac tac ctg ggc cac tgc gta tct gtg 384 Tyr Arg Ile Ala Leu Val Val Asn Tyr Leu Gly His Cys Val Ser Val 115 120 125 gca gcc ctg gtg gcc gcc ttc ctg ctt ttc ctg gcc ctg cgg agc att 432 Ala Ala Leu Val Ala Ala Phe Leu Leu Phe Leu Ala Leu Arg Ser Ile 130 135 140 cgc tgt ctg cgg aat gtg att cac tgg aac ctc atc acc acc ttt atc 480 Arg Cys Leu Arg Asn Val Ile His Trp Asn Leu Ile Thr Thr Phe Ile 145 150 155 160 ctg cga aat gtc atg tgg ttc ctg ctg cag ctc gtt gac cat gaa gtg 528 Leu Arg Asn Val Met Trp Phe Leu Leu Gln Leu Val Asp His Glu Val 165 170 175 cac gag agc aat gag gtc tgg tgc cgc tgc atc acc acc atc ttc aac 576 His Glu Ser Asn Glu Val Trp Cys Arg Cys Ile Thr Thr Ile Phe Asn 180 185 190 tac ttc gtg gtg acc aac ttc ttc tgg atg ttt gtg gaa ggc tgc tac 624 Tyr Phe Val Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Val Glu Gly Cys Tyr 195 200 205 ctg cac acg gcc att gtc atg acc tac tcc act gag cgc ctg cgc aag 672 Leu His Thr Ala Ile Val Met Thr Tyr Ser Thr Glu Arg Leu Arg Lys 210 215 220 tgc ctc ttc ctc ttc atc gga tgg tgc atc ccc ttc ccc atc atc gtc 720 Cys Leu Phe Leu Phe Ile Gly Trp Cys Ile Pro Phe Pro Ile Ile Val 225 230 235 240 gcc tgg gcc atc ggc aag ctc tac tat gag aat gaa cag tgc tgg ttt 768 Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Asn Glu Gln Cys Trp Phe 245 250 255 ggc aag gag cct ggc gac ctg gtg gac tac atc tac caa ggc ccc atc 816 Gly Lys Glu Pro Gly Asp Leu Val Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Ile 260 265 270 att ctc gtg ctc ctg atc aat ttc gta ttt ctg ttc aac atc gtc agg 864 Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Val Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg 275 280 285 atc cta atg aca aag tta cgc gcg tcc acc aca tcc gag aca atc cag 912 Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln 290 295 300 tac agg aag gca gtg aag gcc acc ctg gtg ctc ctg ccc ctc ctg ggc 960 Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu Gly 305 310 315 320 atc acc tac atg ctc ttc ttc gtc aat ccc ggg gag gac gac ctg tca 1008 Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Asp Leu Ser 325 330 335 cag atc atg ttc atc tat ttc aac tcc ttc ctg cag tcg ttc cag ggt 1056 Gln Ile Met Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Gln Ser Phe Gln Gly 340 345 350 ttc ttc gtg tct gtc ttc tac tgc ttc ttc aat gga gag gtg cgc tca 1104 Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Phe Asn Gly Glu Val Arg Ser 355 360 365 gcc gtg agg aag agg tgg cac cgc tgg cag gac cat cac tcc ctt cga 1152 Ala Val Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp His His Ser Leu Arg 370 375 380 gtc ccc atg gcc cgg gcc atg tcc atc cct aca tca ccc aca cgg atc 1200 Val Pro Met Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg Ile 385 390 395 400 agc ttc cac agc atc aag cag acg gcc gct gtg tgacccctcg gtcgcccacc 1253 Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Thr Ala Ala Val 405 410 tgcacagctc ccctgtcctc ctccaccttc ttcctctggg ttctctgtgc tgggcaggct 1313 ctcgtggggc aggagatggg aggggagaga ccagctctcc agcctggcag gaaagagggg 1373 gtgcggcagc caagggggac tgcaagggac agggatgagt gggggccacc aggctcagcg 1433 caagaggaag cagagggaat tcacaggacc ccctgagaag agccagtcag atgtctgcag 1493 gcatttgccc atcccagcct ctctggccag ggccttactg ggcccagagc agagaaggac 1553 ctgtccaaca cacacagcta tttatagtag cagacacagg gctcccctgc cctactcatg 1613 gagccagcag ccaggcaatg gtgtggccct gcactggccc ttggactcca cactcagtgg 1673 tgccctgcag ttgggtgggt tacgccagca aaggatcagt ttggctgcct tatcccaggg 1733 ctgtcaccta gagaggctca cttgtacccc accctgttcc tgtgtcccct ccccagccat 1793 cctcccgcct tgggggctcc atgaaggatg caggcttcca ggcctggctt cctctcttgg 1853 gagacccctt ctctgcctag tccacagatt aggcaatcaa ggaagacgcc atcagggaag 1913 ccacatcctt agtcaaccag ttgcatcgtg cggggcaaaa tgaggagcag aggcatggag 1973 gagggaggcg tgggatggga atagcagaac caccatgtct tcagtgattg aaactcatac 2033 cccattgccc tttgccctcc agtctcccct tcagaaacat ctctgctctc tgtgaaataa 2093 accatgcctc ttgg 2107 <210> 2 <211> 411 <212> PRT <213> homo sapien <400> 2 Met Asp Ala Ala Leu Leu His Ser Leu Leu Glu Ala Asn Cys Ser Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ala Glu Glu Leu Leu Leu Asp Gly Trp Gly Pro Pro Leu Asp 20 25 30 Pro Glu Gly Pro Tyr Ser Tyr Cys Asn Thr Thr Leu Asp Gln Ile Gly 35 40 45 Thr Cys Trp Pro Arg Ser Ala Ala Gly Ala Leu Val Glu Arg Pro Cys 50 55 60 Pro Glu Tyr Phe Asn Gly Val Lys Tyr Asn Thr Thr Arg Asn Ala Tyr 65 70 75 80 Arg Glu Cys Leu Glu Asn Gly Thr Trp Ala Ser Lys Ile Asn Tyr Ser 85 90 95 Gln Cys Glu Pro Ile Leu Asp Asp Lys Gln Arg Lys Tyr Asp Leu His 100 105 110 Tyr Arg Ile Ala Leu Val Val Asn Tyr Leu Gly His Cys Val Ser Val 115 120 125 Ala Ala Leu Val Ala Ala Phe Leu Leu Phe Leu Ala Leu Arg Ser Ile 130 135 140 Arg Cys Leu Arg Asn Val Ile His Trp Asn Leu Ile Thr Thr Phe Ile 145 150 155 160 Leu Arg Asn Val Met Trp Phe Leu Leu Gln Leu Val Asp His Glu Val 165 170 175 His Glu Ser Asn Glu Val Trp Cys Arg Cys Ile Thr Thr Ile Phe Asn 180 185 190 Tyr Phe Val Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Val Glu Gly Cys Tyr 195 200 205 Leu His Thr Ala Ile Val Met Thr Tyr Ser Thr Glu Arg Leu Arg Lys 210 215 220 Cys Leu Phe Leu Phe Ile Gly Trp Cys Ile Pro Phe Pro Ile Ile Val 225 230 235 240 Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Asn Glu Gln Cys Trp Phe 245 250 255 Gly Lys Glu Pro Gly Asp Leu Val Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Ile 260 265 270 Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Val Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg 275 280 285 Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln 290 295 300 Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu Gly 305 310 315 320 Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Asp Leu Ser 325 330 335 Gln Ile Met Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Gln Ser Phe Gln Gly 340 345 350 Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Phe Asn Gly Glu Val Arg Ser 355 360 365 Ala Val Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp His His Ser Leu Arg 370 375 380 Val Pro Met Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg Ile 385 390 395 400 Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Thr Ala Ala Val 405 410 <210> 3 <211> 1997 <212> DNA <213> homo sapien <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <400> 3 atg gac gcg gca ctg ctc cac agc ctg ctg gag gcc aac tgc agc ctg 48 Met Asp Ala Ala Leu Leu His Ser Leu Leu Glu Ala Asn Cys Ser Leu 1 5 10 15 gcg ctg gct gaa gag ctg ctc ttg gac ggc tgg ggg cca ccc ctg gac 96 Ala Leu Ala Glu Glu Leu Leu Leu Asp Gly Trp Gly Pro Pro Leu Asp 20 25 30 ccc gag ggt ccc tac tcc tac tgc aac acg acc ttg gac cag atc gga 144 Pro Glu Gly Pro Tyr Ser Tyr Cys Asn Thr Thr Leu Asp Gln Ile Gly 35 40 45 acg tgc tgg ccc cgc agc gct gcc gga gcc ctc gtg gag agg ccg tgc 192 Thr Cys Trp Pro Arg Ser Ala Ala Gly Ala Leu Val Glu Arg Pro Cys 50 55 60 ccc gag tac ttc aac ggc gtc aag tac aac acg acc cgg aat gcc tat 240 Pro Glu Tyr Phe Asn Gly Val Lys Tyr Asn Thr Thr Arg Asn Ala Tyr 65 70 75 80 cga gaa tgc ttg gag aat ggg acg tgg gcc tca aag atc aac tac tca 288 Arg Glu Cys Leu Glu Asn Gly Thr Trp Ala Ser Lys Ile Asn Tyr Ser 85 90 95 cag tgt 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actgcttctt 975 caatggagag gtgcgctcag ccgtgaggaa gaggtggcac cgctggcagg accatcactc 1035 ccttcgagtc cccatggccc gggccatgtc catccctaca tcacccacac ggatcagctt 1095 ccacagcatc aagcagacgg ccgctgtgtg acccctcggt cgcccacctg cacagctccc 1155 ctgtcctcct ccaccttctt cctctgggtt ctctgtgctg ggcaggctct cgtggggcag 1215 gagatgggag gggagagacc agctctccag cctggcagga aagagggggt gcggcagcca 1275 agggggactg caagggacag ggatgagtgg gggccaccag gctcagcgca agaggaagca 1335 gagggaattc acaggacccc ctgagaagag ccagtcagat gtctgcaggc atttgcccat 1395 cccagcctct ctggccaggg ccttactggg cccagagcag agaaggacct gtccaacaca 1455 cacagctatt tatagtagca gacacagggc tcccctgccc tactcatgga gccagcagcc 1515 aggcaatggt gtggccctgc actggccctt ggactccaca ctcagtggtg ccctgcagtt 1575 gggtgggtta cgccagcaaa ggatcagttt ggctgcctta tcccagggct gtcacctaga 1635 gaggctcact tgtaccccac cctgttcctg tgtcccctcc ccagccatcc tcccgccttg 1695 ggggctccat gaaggatgca ggcttccagg cctggcttcc tctcttggga gaccccttct 1755 ctgcctagtc cacagattag gcaatcaagg aagacgccat cagggaagcc 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(1)..(1314) <400> 5 atg agg ggt ccc tca ggg ccc cca ggc ctc ctc tac gtc cca cac ctc 48 Met Arg Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Leu Leu Tyr Val Pro His Leu 1 5 10 15 ctc ctc tgc ctg ctc tgc ctc ctc cca ccg ccg ctc caa tac gca gcc 96 Leu Leu Cys Leu Leu Cys Leu Leu Pro Pro Pro Leu Gln Tyr Ala Ala 20 25 30 ggg cag agc cag atg ccc aaa gac cag ccc ctg tgg gca ctt ctg gag 144 Gly Gln Ser Gln Met Pro Lys Asp Gln Pro Leu Trp Ala Leu Leu Glu 35 40 45 cag tac tgc cac acc atc atg acc ctc acc aac ctc tca ggt ccc tac 192 Gln Tyr Cys His Thr Ile Met Thr Leu Thr Asn Leu Ser Gly Pro Tyr 50 55 60 tcc tac tgc aac acg acc ttg gac cag atc gga acg tgc tgg ccc cgc 240 Ser Tyr Cys Asn Thr Thr Leu Asp Gln Ile Gly Thr Cys Trp Pro Arg 65 70 75 80 agc gct gcc gga gcc ctc gtg gag agg ccg tgc ccc gag tac ttc aac 288 Ser Ala Ala Gly Ala Leu Val Glu Arg Pro Cys Pro Glu Tyr Phe Asn 85 90 95 ggc gtc aag tac aac acg acc cgg aat gcc tat cga gaa tgc ttg gag 336 Gly Val Lys Tyr Asn Thr Thr Arg Asn Ala Tyr Arg Glu Cys Leu Glu 100 105 110 aat ggg acg tgg gcc tca aag atc aac tac tca cag tgt gag ccc att 384 Asn Gly Thr Trp Ala Ser Lys Ile Asn Tyr Ser Gln Cys Glu Pro Ile 115 120 125 ttg gat gac aag cag agg aag tat gac ctg cac tac cgc atc gcc ctt 432 Leu Asp Asp Lys Gln Arg Lys Tyr Asp Leu His Tyr Arg Ile Ala Leu 130 135 140 gtc gtc aac tac ctg ggc cac tgc gta tct gtg gca gcc ctg gtg gcc 480 Val Val Asn Tyr Leu Gly His Cys Val Ser Val Ala Ala Leu Val Ala 145 150 155 160 gcc ttc ctg ctt ttc ctg gcc ctg cgg agc att cgc tgt ctg cgg aat 528 Ala Phe Leu Leu Phe Leu Ala Leu Arg Ser Ile Arg Cys Leu Arg Asn 165 170 175 gtg att cac tgg aac ctc atc acc acc ttt atc ctg cga aat gtc atg 576 Val Ile His Trp Asn Leu Ile Thr Thr Phe Ile Leu Arg Asn Val Met 180 185 190 tgg ttc ctg ctg cag ctc gtt gac cat gaa gtg cac gag agc aat gag 624 Trp Phe Leu Leu Gln Leu Val Asp His Glu Val His Glu Ser Asn Glu 195 200 205 gtc tgg tgc cgc tgc atc acc acc atc ttc aac tac ttc gtg gtg acc 672 Val Trp Cys Arg Cys Ile Thr Thr Ile Phe Asn Tyr Phe Val Val Thr 210 215 220 aac ttc ttc tgg atg ttt gtg gaa ggc tgc tac ctg cac acg gcc att 720 Asn Phe Phe Trp Met Phe Val Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala Ile 225 230 235 240 gtc atg acc tac tcc act gag cgc ctg cgc aag tgc ctc ttc ctc ttc 768 Val Met Thr Tyr Ser Thr Glu Arg Leu Arg Lys Cys Leu Phe Leu Phe 245 250 255 atc gga tgg tgc atc ccc ttc ccc atc atc gtc gcc tgg gcc atc ggc 816 Ile Gly Trp Cys Ile Pro Phe Pro Ile Ile Val Ala Trp Ala Ile Gly 260 265 270 aag ctc tac tat gag aat gaa cag tgc tgg ttt ggc aag gag cct ggc 864 Lys Leu Tyr Tyr Glu Asn Glu Gln Cys Trp Phe Gly Lys Glu Pro Gly 275 280 285 gac ctg gtg gac tac atc tac caa ggc ccc atc att ctc gtg ctc ctg 912 Asp Leu Val Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Ile Ile Leu Val Leu Leu 290 295 300 atc aat ttc gta ttt ctg ttc aac atc gtc agg atc cta atg aca aag 960 Ile Asn Phe Val Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys 305 310 315 320 tta cgc gcg tcc acc aca tcc gag aca atc cag tac agg aag gca gtg 1008 Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr 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Ala Leu Val Glu Arg Pro Cys Pro Glu Tyr Phe Asn 85 90 95 ggc gtc aag tac aac acg acc cgg aat gcc tat cga gaa tgc ttg gag 336 Gly Val Lys Tyr Asn Thr Thr Arg Asn Ala Tyr Arg Glu Cys Leu Glu 100 105 110 aat ggg acg tgg gcc tca aag atc aac tac tca cag tgt gag ccc att 384 Asn Gly Thr Trp Ala Ser Lys Ile Asn Tyr Ser Gln Cys Glu Pro Ile 115 120 125 ttg gat gac aag cag agg aag tat gac ctg cac tac cgc atc gcc ctt 432 Leu Asp Asp Lys Gln Arg Lys Tyr Asp Leu His Tyr Arg Ile Ala Leu 130 135 140 gtc gag cat tcg ctg tct gcg gaa tgt gat tca ctg gaa cct cat cac 480 Val Glu His Ser Leu Ser Ala Glu Cys Asp Ser Leu Glu Pro His His 145 150 155 160 cac ctt tat cct gcg aaa tgt cat gtg gtt cct gct gca gct cgt 525 His Leu Tyr Pro Ala Lys Cys His Val Val Pro Ala Ala Ala Arg 165 170 175 tgaccatgaa gtgcacgaga gcaatgaggt ctggtgccgc tgcatcacca ccatcttcaa 585 ctacttcgtg gtgaccaact tcttctggat gtttgtggaa ggctgctacc tgcacacggc 645 cattgtcatg acctactcca ctgagcgcct gcgcaagtgc ctcttcctct tcatcggatg 705 gtgcatcccc 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tgtttgcctt actggccccc 840 tctcttcttc tcatccagcc cacaggaccc gtctctgctg atggactttg caagtggaat 900 gtgctatcat ccacagagac acaggcctgc atagacacct cgccagtgcc ctgtgcagag 960 acaggcaagt gtattcctct ggagtgttcg gaagctccca ggccctaggg gctgtgtctg 1020 ctctttgctc catgtcctca tccaccccag cccaggtacg agtgcgcttc ttccctgcgt 1080 cagctgcact ggggctttgg gcctcatgat tggcttgcac atgccaagct tcacggccgc 1140 ctgactcccc agagcctgct cttggtgtgt gggcttttct gtggcaggta gcgggggaat 1200 gtgctggtct ctcttctgct ccctgagtcc atacagacct gattgcttgg cacacatctc 1260 tttctggaag cttccttctg tcaccacctc tgctctggct tctctcttcc atgaggccct 1320 gcggcctggg cttccttgct cacccagctc tgagtgcaca tgtggggtgc tggcatgtta 1380 tttcggggct gcatagttga ccttctaaac tggctccagc ccctgtgaga aggattcctg 1440 ttcccctaag gccgggtggt atctcaaggc ttcctctccc tggcactcca gcaaggccgg 1500 gcagcaccaa tggagctgcc ctggagtggg gtctgaggac ctggatatcc caggccaccc 1560 cgagggccca gcttcatacc tctccattga agaagcagta gaagacagac acgaagaaac 1620 cctggaaagg agggaaagga gggagtggtc agtgacctac ctgcggagct gttctgcctg 1680 gtggggtggc actggggaca agatggtggg ggggggacaa tttgacccag gaacccctgg 1740 agtcagagct gggtggggtc ctagcctcag ggtgcagata ttccacggtc cactctgagt 1800 gagcagtggt cacaggcctg gagccaggca gactccggtc tcctcaatat tgtgtgacct 1860 gtcccagggc atttggttgg gctgcctgca tcctcagaac aggtgctggg acagtaggtg 1920 cgggctggta ggatgaagac ccaggctggg atggggataa ctggccaggc tcaggctgag 1980 catgtacggg cttctaactc tgtggatgta actgagccat gggtgtgcca gtcccacggg 2040 acccccttag tgagggcatg gctgccagag cagcctcagg aaagctcact gtggggcccc 2100 catctggtca caggccccac ctggaacgac tgcaggaagg agttgaaata gatgaacatg 2160 atctgtgaca ggtcgtcctc cccgggattg acgaagaaga gcatgtaggt gatgcccagg 2220 aggggcagga gcaccagggt ggccttcact gccttcctgg gggcgagagg tggacacagg 2280 tctgagccca tgcggcaggc agggcctcac ccagtgggcg gcgggagaca gtggtggtgt 2340 ttcttccggg agcttgagcg agctccctgg gtgaggcctg gggcagaggg ctctgccagg 2400 aagcaggggg acggcccgat gacctcctcc tgtccccatt gtggggtcaa gggaccccct 2460 cacatacctg tactggattg tctcggatgt ggtggacgcg cgtaactttg tcattaggat 2520 cctgacgatg ttgaacagaa atacgaaatt gatctggagg gagggcgggc atgggaaaga 2580 gggaaaagga aggagcacgt gtttgagatg agccgagagg cagccccctt ccccgcagac 2640 ccctggaaac cgatgtccca cgcacacacc tatcctacct gtccccctag cacctgccag 2700 catcccaagg cctgtgctcc tccctcgcca ggatggggag acagccccat tttccagggc 2760 ctgtgtctcc agcccaggac tgaggaggaa aggtggcagc ctctgtgggt cgtgaccgag 2820 agcacggggc atgccctctg aggctgagaa agcccccaac cctctcccca gtatagggac 2880 cctatgggag cccccttccc ctcactgcca cggggtccct acttgttgac tgcggggctc 2940 tctgagtccc ttgcactgtc actggctcta ggtcggcctg aggtccttct gactgaggac 3000 agcactgcca tggtggggcg gacaaggcca gatggaggga ttaagaactc agttgccgaa 3060 tgagtgatta atctgccagc atcccacccc tgtgcccagg aactccagag ccttcgtagg 3120 caccctagac agggaagatg gatgggctgt ggggctggct ctgaggcccc aggaagggcc 3180 tcatttatct tcattctgag ttttccctca gcaccagagc ctccccaccc agcacctggc 3240 cctggaactg gcctgtgtgg ctccccagct gctccctgct gggtgtgggt ccccatgggc 3300 ctgcgagtgt ctgttcatct gtattggctg tgactatgac 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aggtcagccc atgtattcac agggcaatag 30840 tgtccctcat atacaaggga tagcccttca cacagcacgg tgcagcacag aggaagggag 30900 aaatcctaag ccaagcttaa gttattatcc ttgttcatta ctgcagccac cacctaggtg 30960 gtgcctaaag cacctataga tgcagctatg tcaagaggtg gtgtgctccc aatgaccaga 31020 ggccagggac ttctcatctc atgcagattt ctgcagaaca gagggttggc ctgggtgaac 31080 tggattgctc ttaactggga gagctcacat accaaagatt cttctgggaa gtgaccattt 31140 cagtggcaga gtcaaaggct gttctgcatc ctgaatgagc agttggggtc tgagcacata 31200 cccacagacc cacagacccg aggtcccctg gatgtggggc catttcttca tggatcttat 31260 tattataggc acagttgtca ttcgagatgt gacagaggga aaactagaaa aggtagcagt 31320 ttgggaacaa attgatttta cagctcactt tagtgtctgc aaacaggcaa atgaggaaga 31380 aattgggaag agccccaaaa ttccctcaat tttactaaat ccaagtacaa acaaacaaag 31440 acaggggcat ttttgctaac taaagaagca gaggtagatt agaggctttg ggatagtgat 31500 gggttcccag cgctgcaggc cagccccatc ccagctggag gccaggaatt aggggataag 31560 tatttggaac agtttgtgtg tccccaagct gttggggaca ggttggcaaa taggttcagg 31620 gaagtgtgac aggtactttg gaagacccct gtgtaccatg agcagcagag taaggcaggt 31680 gcctctggtg ccctgcatcc catcccatgg cccacctctg atgtcagctg cagcagcagt 31740 ggacagttcc aggccagctc agacacactt gcaaagccta atacatggca tcaaacaggc 31800 atgtaggcac aacagaatca cacacagagc cacagttatg catcttcacc atgcacacac 31860 attctctctc taattcatcc cctaccactc aaatgtcagc tggaaaacag gatttaaagg 31920 gacaggatgc atctttgctt ctctaaggga ctgtccttgg ttagactaca tagagaggga 31980 gtctattcag gcacagctgg aatagtcgtg gtgtttcctg ggaattacga cggggttgct 32040 gagggcacag aggttccaga ggggcctgaa ggtgctgcac ttttgccctg tagcactgga 32100 gacaggggtc ccaggccagg caccccctcc tcaccctatc ctactccact gcaggacaga 32160 ggaattggcc tggtgtcttc atgtcaaacc atgggactaa gctgtgggga cagaaaggac 32220 tctcagtgac atccaatccc acattcttgt tttacagatg gacaatagga ttcccagaca 32280 agcaaaagag gtttccctcc cttacttctc ccaggccatc ctcatctctg cagcagccca 32340 aatgggctcc ctgtctcctc atggcagata aaacgatgtt ttataattac gatcctgtca 32400 ctcttcctca taggagtgcc gccaacccat tgcccttgag atggagacca cctctttggt 32460 attgcaaaga aggtccttcg taatcatcta tccctcatcc tcacccttct gctccatttg 32520 aaaggccctc cagaacaaca tgtcattcct gggaaccatc tttggtattg caaagaaggt 32580 tcttcatgat catcgtcccc catcctcacc ctcctgcttc atttgaaagg ccctccagaa 32640 caatgtgtca ctaccagaaa ccattcgcta tctctgttcc ttgtttgtat ttctgcactg 32700 gaaatggcct tacagctcca cactcatcct tcagacatgc agctccttgg tgaccccatc 32760 tgctgggtgc tggcctatgt cacatccagg ttgcttttta ttcattgtct catctaccag 32820 cccatgcctc cccaagggca gggctggtcc tggttcacta acccatcccc agcacccatt 32880 ggaatgctct agacttcagc ccagtgagtc actaagaaag gacagatacc ttggcagaag 32940 agctgaggaa agcccaggtc cctgtcttca ggccaaggct ctcttcccat 32990 <210> 14 <211> 644 <212> DNA <213> mus musculus <220> <221> CDS <222> (213)..(521) <400> 14 gcggcccctc agctccgcga gccccgcggc ttctcttggc aaggtcctgg ggtgatcgat 60 caattgcgga gccccgaagc tgcccgactg gccggggtgg gcggggagga gcctggacgc 120 tgcactctct ggctgctcct cgtcgcgccc gctccctcgc agccacgcgg ggcgcgcact 180 cccactccct ctgcgcgcgg ctccggggcg ca atg gac gcg gcg ctg ctc ctc 233 Met Asp Ala Ala Leu Leu Leu 1 5 agc ctg ctg gag gcc caa ctg cag cct ggc gct ggc cga aga gct gct 281 Ser Leu Leu Glu Ala Gln Leu Gln Pro Gly Ala Gly Arg Arg Ala Ala 10 15 20 cct gga cgg ctg ggg agt gcc ccc gga ccc cga agg tcc cta cac cta 329 Pro Gly Arg Leu Gly Ser Ala Pro Gly Pro Arg Arg Ser Leu His Leu 25 30 35 ctg caa cac gac ctt gga cca gat cgg gac ctg ctg gcc aca gag cgc 377 Leu Gln His Asp Leu Gly Pro Asp Arg Asp Leu Leu Ala Thr Glu Arg 40 45 50 55 acc cgg agc cct agt aga gag acc gtg ccc cga gta ctt caa tgg cat 425 Thr Arg Ser Pro Ser Arg Glu Thr Val Pro Arg Val Leu Gln Trp His 60 65 70 caa gta caa cac gac ccg gaa tgc cta cag aga gtg cct gga gaa cgg 473 Gln Val Gln His Asp Pro Glu Cys Leu Gln Arg Val Pro Gly Glu Arg 75 80 85 gac ctg ggc ctc aag ggt caa cta ctc aca ctg cga acc cat ttt gga 521 Asp Leu Gly Leu Lys Gly Gln Leu Leu Thr Leu Arg Thr His Phe Gly 90 95 100 tgacaaggag tatccgctgc ctgaggaatg tgatccactg gaactcatca ccaccttcat 581 tctgagaaac atcgcgtggt tcctgctgca actcatcgac cacgaagtgc acgagggcaa 641 tga 644 <210> 15 <211> 103 <212> PRT <213> mus musculus <400> 15 Met Asp Ala Ala Leu Leu Leu Ser Leu Leu Glu Ala Gln Leu Gln Pro 1 5 10 15 Gly Ala Gly Arg Arg Ala Ala Pro Gly Arg Leu Gly Ser Ala Pro Gly 20 25 30 Pro Arg Arg Ser Leu His Leu Leu Gln His Asp Leu Gly Pro Asp Arg 35 40 45 Asp Leu Leu Ala Thr Glu Arg Thr Arg Ser Pro Ser Arg Glu Thr Val 50 55 60 Pro Arg Val Leu Gln Trp His Gln Val Gln His Asp Pro Glu Cys Leu 65 70 75 80 Gln Arg Val Pro Gly Glu Arg Asp Leu Gly Leu Lys Gly Gln Leu Leu 85 90 95 Thr Leu Arg Thr His Phe Gly 100 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> synthetic <400> 16 ccccgaagct gcccgactgg 20 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic <400> 17 ggaaggctgt aaaggatgga gaag 24

Claims (33)

1. 분리된, 가용성 부신피질자극호르몬 방출 인자 수용체 2형(sCRFR2).
2. 제1항에 있어서, 부신피질자극호르몬 방출 인자 수용체 2형의 아미노 말단 세포외 도메인을 포함하는 sCRFR2.
3. 제1항에 있어서, CRFR2 유전자의 엑손 3번, 4번 및 5번에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 sCRFR2.
4. 제1항에 있어서, 서열번호 4, 서열번호 8 또는 서열번호 12의 아미노산 서열과 70% 이상 유사한 50개 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 sCRFR2.
5. 제4항에 있어서, 서열번호 4, 서열번호 8 또는 서열번호 12의 아미노산 서열과 90% 이상 유사한 50개 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 sCRFR2.
6. 제5항에 있어서, 서열번호 4, 서열번호 8 또는 서열번호 12의 아미노산 서열과 95% 이상 유사한 50개 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 sCRFR2.
7. 제6항에 있어서, 서열번호 4, 서열번호 8 또는 서열번호 12의 50개 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 sCRFR2.
8. 제1항에 있어서, 친화성 태그(affinity tag), 표지(label), 방사성핵종(radionuclide), 효소, 형광 마커, 화학발광 마커, 면역글로불린 도메인 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 분리된 sCRFR2.
9. 제8항에 있어서, 친화성 태그를 추가로 포함하는 분리된 sCRFR2.
10. 제8항에 있어서, 형광 마커를 추가로 포함하는 분리된 sCRFR2.
11. 제8항에 있어서, 면역글로불린 도메인을 추가로 포함하는 분리된 sCRFR2.
12. 제11항에 있어서, 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 sCRFR2.
13. 제1항에 있어서, 리더(leader) 서열을 추가로 포함하는 sCRFR2.
14. 제1항에 있어서, 중합체에 접합된 sCRFR2.
15. 제14항에 있어서, 중합체가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인, sCRFR2.
16. sCRFR2의 50개 이상의 연속적인 아미노산을 암호화하는 분리된 핵산.
17. 제16항에 있어서, sCRFR2를 암호화하는 핵산에 작용가능하게(operably) 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 핵산.
18. 제17항에 있어서, 발현 카세트(expression cassette)인 핵산.
19. 제18항에 있어서, 발현 카세트가 발현 벡터내에 포함된 핵산.
20. 제19항에 있어서, 발현 벡터가 선형 핵산, 플라스미드 발현 벡터 또는 바이러스 발현 벡터인 핵산.
21. 제19항에 있어서, 발현 벡터가 전달 벡터에 작용가능하게 연결된 핵산.
22. 제21항에 있어서, 전달 벡터가 리포좀, 폴리펩티드, 다가양이온, 지질, 세균 또는 바이러스인 핵산.
23. 유효량의 sCRFR2를 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여, GPCR 리간드와 세포 표면 GPCR과의 결합이 감소되는, G-단백질 연결 수용체(GPCR)의 활성 조절 방법.
24. 제23항에 있어서, 리간드가 부신피질자극호르몬 방출 인자(CRF), 유로코르틴 1, 유로코르틴 2, 유로코르틴 3 또는 스트레스코핀인 방법.
25. 제23항에 있어서, 섭취, 주사, 내시경 또는 관류에 의해서 투여하는 방법.
26. 제25항에 있어서, 주사에 의해서 투여하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 주사가 정맥내주사, 근육내주사, 피하주사, 피내주사, 두개내주사 또는 복막내주사인 방법.
28. 제23항에 있어서, 피험자가 사람인 방법.
29. 제23항에 있어서, GPCR의 과활성화 또는 GPCR 리간드의 과다분비로부터 발생하는 장애를 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
30. 제29항에 있어서, 장애가 제2형 당뇨병인 방법.
31. 제29항에 있어서, 장애가 제2형 당뇨병, 인슐린 민감성, 불안-관련 장애; 기분 장애; 양극성 장애; 외상후 스트레스 장애; 염증 장애; 약물 의존증 및 중독증; 위장관 장애 또는 피부 장애인 방법.
32. 제31항에 있어서, 불안-관련 장애가 범불안 장애이거나 기분 장애가 우울증인 방법.
33. 제31항에 있어서, 위장관 장애가 과민성 장 증후군인 방법.

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