KR20070011545A - 수용체 - Google Patents

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KR20070011545A
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사무엘 아파리시오
존 딕슨
알렌 헨드릭
제니퍼 마리 호우드
디크 잔
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패러다임 테라퓨틱스 리미티드
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Abstract

본 발명은 후보 분자가 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 Gpr100 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제인지 여부를 측정하는 단계를 포함한 Gpr100 관련 질환 특히, 당뇨병 및 비만의 치료, 예방 또는 완화에 적당한 분자의 확인 방법을 개시한다.
Figure 112006087769872-PCT00003
Gpr100, 수용체, 폴리펩타이드, 당뇨병, 비만, 작용제, 길항제

Description

수용체{Receptor}
본 발명은 신규하게 확인된 핵산, 이들에 의해 인코드되는 폴리펩타이드 및 그의 제조 및 이용에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명의 핵산 및 폴리펩타이드는 이하 "Gpr100 GPCR"로 표기되는 G-단백질 결합 수용체(GPCR)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 핵산 및 폴리펩타이드의 작용을 억제하거나 활성화하는 것에 관한 것이다.
의학적으로 유의적인 많은 생물학적 과정은 G-단백질 및/또는 cAMP와 같은 2차 메신저를 포함한 신호 전달 경로에 참여하는 단백질에 의해서 매개됨은 잘 수립되어 있다(Lefkowitz, Nature, 1991, 351 : 353-354). 이들 단백질은 G-단백질 또는 "PPG 단백질"과 함께 경로에 참여하는 단백질로서 표기된다. 이들 단백질의 일부 예는 아드레날린제 및 도파민에 대한 수용체와 같은 GPC 수용체(Kobilka, B. K., et al., Proc. Natl Acad. ScL, USA, 1987, 84: 46-50; Kobilka B. K., et al., Science, 1987, 238: 650-656; Bunzow, J. R., et al., Nature, 1988, 336: 783-787), G-단백질 자체, 포스포리파제 C, 아데닐레이트 사이클라제 및 포스포디에스테라제와 같은 효과기(effector) 단백질 및 단백질 키나제 A 및 단백질 키나제 C와 같은 작동기(actuator) 단백질(Simon, M. I., et al., Science, 1991, 252: 802-8)를 포함한다.
예를 들어 신호 전달의 한 형태로서 호르몬 결합의 효과는 세포 내 효소 아데닐레이트 사이클라제의 활성화이다. 호르몬에 의한 효소 활성화는 뉴클레오타이드, GTP의 존재에 의존적이다. 또한 GTP는 호르몬 결합에 영향을 미친다. G-단백질은 호르몬 수용체를 아데닐레이트 사이클라제에 연결시킨다. G-단백질은 GTP를 호르몬 수용체에 의한 활성화시 결합된 GDP와 교환하는 것으로 나타났다. 이후 GTP 운반 형태는 활성화된 아데닐레이트 사이클라제에 결합된다. G-단백질 자체에 의해 촉매되는 GTP에서 GDP로의 가수분해는 G-단백질을 그의 기초적인 불활성화 형태로 복귀시킨다. 따라서 G-단백질은 수용체로부터 효과기로 신호를 교대시키는 중개자로서 또한 신호의 지속기간을 제어하는 시계로서의 이중 작용을 한다.
G-단백질 결합 수용체(GPCR)의 막단백질 유전자 수퍼패밀리는 7개의 추정 막횡단 도메인을 지님을 특징으로 한다. 상기 도메인은 세포외 또는 세포질 루프(loop)에 의해 연결된 막횡단 α-헬릭스를 나타내는 것으로 간주된다. G-단백 질 결합 수용체는 호르몬, 바이러성, 생장 인자 및 신경수용체(neuroreceptor)와 같은 광범위한 생물학적 활성 수용체를 포함한다.
G-단백질 결합 수용체(7TM 수용체로도 알려짐)는 적어도 8개 이상의 분기 친수성 루프를 연결하는 약 20∼30개 아미노산의 7개의 보존된 소수성 스트레치(stretch)를 포함함을 특징으로 한다. 수용체에 결합된 G-단백질 패밀리는 정신이상 및 신경계장애의 치료에 사용되는 신경이완제에 결합하는 도파민 수용체를 포함한다. 이러한 패밀리 멤버의 다른 예는 칼시토닌, 아드레날린제, 엔도텔린, 키닌, 난포 자극 호르몬, 옵신, 내피세포 분화 유전자-1, 로돕신, 취기제 및 거대세포바이러스 수용체를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
대부분의 G-단백질 결합 수용체는 기능성 단백질 구조를 안정화시키는 것으로 판단되는 이황결합을 형성하는 첫 번째 2개 세포외 루프 각각에 단일 보존 시스테인 잔기를 지닌다. 7개 막횡단 영역은 TMl, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 및 TM7으로 명명된다. TM3은 신호 전달에 관련된다.
시스테인 잔기의 인산화 및 지질화(파미틸레이션(pamitylation) 또는 파네실레이션(farnesylation))는 일부 G-단백질 결합 수용체의 신호 전달에 영향을 미칠 수 있다. 대부분의 G-단백질 결합 수용체는 세 번째 세포질 루프 및/또는 카르복시 말단 내에 잠재적인 인산화 사이트를 포함한다. β-아드레날린수용체와 같은 일부 G-단백질 결합 수용체의 경우 단백질 키나제 A 및/또는 특정 수용체 키나제에 의한 인산화는 수용체 탈민감화를 매개한다. 일부 수용체의 경우 G-단백질 결합 수용체의 리간드 결합 사이트는 일부 G-단백질 결합 수용체 막횡단 도메인에 의해 형성된 친수성 소켓(socket)을 포함하는 것으로 판단되고, 이러한 소켓은 G-단백질 결합 수용체의 소수성 잔기에 의해 둘러싸인다. 각각의 G-단백질 결합 수용체 막횡단 헬릭스의 친수성 측면은 내향하고 극성 리간드 결합 사이트를 형성하는 것으로 판단된다. TM3은 TM3 아스파르트산 잔기와 같은 리간드 결합 사이트를 지닌 일부 G-단백질 결합 수용체 수용체에 관련된다. TM5 세린, TM6 아스파라긴 및 TM6 또는 TM7 페닐알라닌 또는 티로신도 리간드 결합에 관련된다.
G-단백질 결합 수용체는 이형삼량체 G-단백질에 의해 다양한 세포내 효소, 이온 채널 및 전달체에 세포내적으로 결합될 수 있다(Johnson et al., Endoc. Rev., 1989, 10: 317-331 참조). 다른 G-단백질 α-서브유니트는 특정 효과기를 우선적으로 자극하여 세포 내의 다양한 생물학적 기능을 조절한다. G-단백질 결합 수용체의 세포질 잔기의 인산화는 일부 G-단백질 결합 수용체의 G-단백질 결합의 조절에 중요한 메커니즘으로 확인되었다. G-단백질 결합 수용체는 포유류 숙주 내의 뉴런 사이트에서 내에서 발견된다. 지난 15년 간 7개 막횡단(7 TM) 수용체를 타겟으로 하는 약 350개 치료제가 시장에 성공적으로 도입되었다.
따라서 G-단백질 결합 수용체는 치료제 타겟으로서 수립되고 입증된 역사를 지닌다. 명백하게는 비만 또는 체증증가의 장애, 식욕 억제를 포함한 비만, 고지혈증, 유지질이상혈증(dyslipoidemia), 고중성지방혈증을 포함한 지질 대사 장애, 우울증 및 불안증, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 손상된 포도당내성, 인슐린 저항성 증후군, 증후군 X, 고혈당증, 급성 췌장염, 심혈관질환, 고혈압, 심장 비대 및 고콜레스테롤혈증을 포함하나 이에 한정적이지 않은 당뇨병 및 관련 질환을 포함하나 이에 한정적이지 않은 기능장애 또는 질환을 예방하거나 개선하거나 교정하는데 중요한 역할을 할 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 후보 분자가 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 Gpr100 폴리펩타이드의 작용제인지 또는 길항제인지 여부를 측정하는 단계를 포함한 Gpr100 관련 질환 특히, 당뇨병 및 비만의 치료, 예방 또는 완화에 적당한 분자의 확인 방법을 개시한다.
바람직하게는 Gpr100 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열에 의해 인코드된다.
바람직하게는 상기 방법은 후보 분자를 Gpr100 폴리펩타이드에 노출시키는 단계 및 이러한 노출의 결과로 세포내 칼슘 수치의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 상기 방법은 비-인간 동물 또는 그의 일부, 바람직하게는 세포, 조직 또는 기관을 후보 분자에 노출시키는 단계 및 접촉의 결과로 동물의 생물학적 파라미터가 변화되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 생물학적 파라미터는 혈당 수치, 체중, 글루카곤 수치, 지방 비율로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 두 번째 관점에 따라 포도당 조절 또는 Gpr100 관련 질환 바람직하게는 비만 또는 당뇨병에 대한 모델로서 기능적으로 분열된 내인성 Gpr100을 지닌 형질전환 비-인간 동물 또는 그의 분리된 세포 또는 조직의 이용이 제공된다.
바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 바람직하게는 Gpr100 유전자 또는 그의 일부의 결실을 포함한 기능적으로 분열된 Gpr100 유전자를 포함한다.
바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 야생형 동물과 비교시 하나 이상의 하기 표현형의 변화를 나타낸다: 감소된 혈당 수치, 증가된 체중, 높은 지방 비율.
바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 설치류, 바람직하게는 마우스이다.
본 발명자는 본 발명의 세 번째 관점에 따라 Gpr100 관련 질환, 바람직하게는 비만 또는 당뇨병의 치료, 예방을 위한 작용제 또는 길항제의 확인을 위해 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 Gpr100 폴리펩타이드의 이용을 제공한다.
본 발명의 네 번째 관점으로서 Gpr100 관련 질환, 바람직하게는 비만 또는 당뇨병의 치료, 예방을 위한 작용제 또는 길항제의 확인을 위해 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 Gpr100 폴리뉴클레오타이드의 이용이 제공된다.
본 발명자는 본 발명의 다섯 번째 관점에 따라 Gpr100 관련 질환, 바람직하게는 비만 또는 당뇨병의 치료, 예방 또는 완화에 이용되는 Gpr100 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법에 있어서 비-인간 동물 또는 그의 일부, 바람직하게는 세포, 조직 또는 기관의 이용을 제공한다.
여섯 번째 관점에 있어서 본 발명은 Gpr100 관련 질환, 바람직하게는 비만 또는 당뇨병의 치료, 예방 또는 완화를 위한 상기 항에 따른 방법 또는 이용에 의해 확인된 작용제 또는 길항제의 이용을 제공한다.
일곱 번째 관점에 있어서 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 개체 내 Gpr100 폴리펩타이드의 활성의 조절에 의한 개체 내 포도당 조절, 지방 대사 또는 체중 증가의 조절 방법이 제공된다.
바람직하게는 상기 방법은 Gpr100의 작용제 또는 길항제를 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 여덟 번째 관점에 있어서, 본 발명자는 개체내 Gpr100 폴리펩타이드의 활성 또는 함량을 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함한 Gpr100 관련 질환 증상을 지닌 개체의 치료 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 방법은 Gpr100 폴리펩타이드, Gpr100 폴리펩타이드의 작용제 또는 Gpr100 폴리펩타이드의 길항제를 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명자는 본 발명의 아홉 번째 관점에 따라 (a) Gpr100 관련 질환 증상을 지니거나 증상을 지니는 것으로 의심되는 동물 내의 Gpr100 폴리펩타이드의 발현 수치 또는 패턴을 검출하는 단계; 및 (b) 정상 동물과 발현 수치 또는 패턴을 비교하는 단계를 포함한 Gpr100 관련 질환의 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 열 번째 관점에 따라 Gpr100 관련 질환 증상을 지니는 것으로 의심되는 개체 내에서 상기 개시된 생물학적 파라미터의 변화를 검출하는 단계를 포함한 Gpr100 관련 질환의 진단 방법이 제공된다.
본 발명의 열한 번째 관점으로서 본 발명자는 하나 이상의 하기를 포함한 Gpr100 관련 질환 특히, 비만 또는 당뇨병의 감수성 진단 키트를 제공한다: Gpr100 폴리펩타이드 또는 그의 일부; Gpr100 폴리펩타이드의 항체; 또는 이를 인코드하는 것이 가능한 핵산.
바람직하게는 Gpr100 관련 질환은 비만 또는 체중 증가, 식욕 억제의 장애를 포함한 비만, 대사 장애, 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병을 포함한 당뇨병 및 관련 장애 및 체중 관련 장애, 손상된 포도당 내성, 인슐린 저항성 증후군, 증후군 X, 말초신경병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병 관련 단백뇨, 고혈당증, 고지혈증, 유지질이상혈증(dyslipoidemia), 고중성지방혈증을 포함한 지질 대사 장애, 급성 췌장염, 심혈관질환, 말초혈관질환, 고혈압, 심장 비대, 허혈성 심장병, 고콜레스테롤혈증, 비만, 비만 또는 체중 증가의 장애로 구성된 군으로부터 선택된다.
Gpr100 GPCR
본 발명자는 G-단백질 결합 수용체(GPCR) 특히, Gpr100 GPCR로 표기되는 희귀 G-단백질 결합 수용체, 그의 상동체, 변이체 또는 유도체뿐만 아니라 당뇨병 및 비만과 같은 Gpr100 관련 질환을 포함한 질환의 치료, 경감 또는 진단시 그의 이용을 개시한다. 본 발며의 이들 및 다른 실시태양은 하기 더욱 상세히 기술될 것이다.
Gpr100은 Gpcr 102 및 이완인자(relaxin)-3 수용체-2로도 알려져 있고, 인간 Gpr100을 인코드하는 증폭된 cDNA 생성물의 서열분석 결과에 나타난 바와 같이 G-단백질 결합 수용체 패밀리의 다른 단백질에 구조적으로 관련된다. 서열번호: 1의 cDNA는 서열번호: 3에 나타난 374개 아미노산 서열을 인코드하는 오픈 리딩 프레임(서열번호: 2, 뉴클레오타이드 수 112∼1039)을 포함한다. 인간 Gpr100은 호모 사피엔스(Homo sapiens) 염색체 1q22에 지도화된 것으로 나타났다.
본 발명의 실행은 특별히 나타내지 않는 한 당업자의 능력 내에 있는 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌 내에 설명된다. J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James OD. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson Immunocytochemistry: Theory and Practice, CRC Press inc., Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (ed); Immunochemical Protocols, vol 80, in the series: Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3; and The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (17th Edition, Beers, M. H., and Berkow, R, Eds, ISBN: 0911910107, John Wiley & Sons) 참조. 이들 일반 문헌 각각은 참고문헌으로 포함된다.
Gpr100의 발현 프로파일
Gpr100 cDNA의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭은 소장, 폐, 신장, 백혈구 및 비장 내 다량의 Gpr100 발현을 검출한다. Gpr100 GPCR의 발현 프로파일은 도 2에 나타나 있다. 서열번호: 1의 Gpr100 cDNA를 이용하여 BLASTN에 의한 인간 EST 데이터 소스를 검색하기 위해 동일성은 골수 기원의 라이브러리 유래의 cDNA 내에서 발견되었다(BF90022). 이는 Gpr100는 이들 정상 또는 비정상 조직 내에서 발현됨을 나타낸다. 따라서 Gpr100 폴리펩타이드, 핵산, 프로브, 항체, 발현 벡터 및 리간드는 이들 및 다른 조직 내 Gpr100 GPCR의 과-, 저- 및 비정상 발현과 관련된 질환의 검출, 진단, 치료 및 다른 분석에 유용하다.
본 발명의 이러한 및 다른 실시태양은 하기에 더욱 상세히 기술될 것이다.
Gpr100 GPCR 관련 질환
여기서 기술된 방법 및 조성물에 있어서, Gpr100 GPCR은 광범위한 질환을 치료하고 진단하는데 유용하다. 이들 질환은 편의상 "Gpr100 관련 질환"으로 표기된다.
따라서 Gpr100 결함 동물은 Gpr100 관련 질환에 대한 모델로서 이용된다. Gpr100, 그의 단편, 상동체, 변이체 및 유도체뿐만 아니라 특히 작용제 및 길항제를 포함한 조절제는 Gpr100 관련 질환을 진단하거나 치료하는데 이용된다. 특히 Gpr100은 그의 기능에 영향을 미치는 것이 가능한 분자를 선별하는데 이용되고 Gpr100 관련 질환을 치료하는데 이용된다.
본 발명자는 인간 Gpr100은 호모 사피엔스 염색체 1q22에 지도화된 것으로 나타났다. 따라서 특정한 실시태양에서 Gpr100 GPCR은 이러한 좌위, 염색체 밴드, 영역, 팔(arm) 또는 동일한 염색체에 지도화된 질환을 치료하거나 진단하는데 이용된다.
Gpr100 GPCR의 염색체 위치(즉, 호모 사피엔스 염색체 1q22)와 동일한 좌위, 염색체 밴드, 영역, 팔 또는 염색체에 결합된 것으로 측정된 알려진 질환은 하기를 포함한다: 간질(1q21), 고쉐병(1q21), 림프종 진행(1q22), 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Ttooth disease), 타입 1B(1q22), 선천성 저마이엘린화 신경병증(1q22) 및 가족성 연합 고지혈증 감수성(1q22-q23).
따라서 바람직한 실시태양에 따라 Gpr100 GPCR은 본 문헌에 기술된 방법에 의해 간질, 고쉐병, 림프종 진행, 샤르코-마리-투스병, 타입 1B, 선천성 저마이엘린화 신경병증 및 가족성 연합 고지혈증 감수성을 진단하거나 치료하는데 이용된다.
실시예에 나타난 바와 같이 Gpr100 결함 넉아웃 마우스는 광범위한 표현형을 나타낸다.
간략하게는 실시예에 기술된 실험은 제2형 당뇨병 및 비만에 대한 Gpr100 수용체의 기여를 나타낸다. Gpr100 결함 마우스는 GTT, 인슐린 억제 시험(IST) 및 포도당-자극 인슐린 분비 시험(GSIST)을 포함한 여러 처리가 시험되었다. 제2형 당뇨병에서 나타난 포도당불내성은 근육 무능력인 인슐린 무감응, 인슐린에 반응한 지방세포 또는 간세포의 포도당 흡수 또는 인슐린 결핍의 결과, 일반적으로 췌장 β-세포 기능장애의 결과 또는 이 둘 모두의 결과가 될 수 있다. 이들은 포도당을 대사하고/또는 저장하는 마우스의 능력, 외인성 인슐린에 대한 혈당 민감성 및 포도당에 반응하는 인슐린 분비를 측정한다. 또한 이들 시험은 음식 섭취량, 대사율, 호흡교환율, 활동 수준, 체지방 조성, 혈청 화학 파라미터 즉, 렙틴 및 관련 기관의 조직학과 같은 당뇨병 및 비만과 관련하여 관찰 가능한 인자에서 관찰된다.
실시예는 Gpr100 돌연변이 동물이 야간 금식의 대사 스트레스에 따른 심한 저혈당증을 보임을 나타낸다. 이는 음식물 부족 후 6시간 후 명백해졌다.
따라서 Gpr100은 포도당 조절에 관련되고 따라서 Gpr100 결함 동물은 포도당 조절 특히, 당뇨병과 같은 포도당 조절이 불충분한 질환에 대한 모델로 이용된다.
Gpr100은 그의 기능의 조절제를 선별하는데 이용되고; 이러한 조절제는 당뇨병과 같은 질환 증상을 지닌 동물에 투여된다. 일반적으로 본 발명자는 바람직하게는 당뇨병 치료를 위한 개체 내 Gpr100 수치 또는 활성을 감소시키는 단계를 포함한 개체 내 혈당 수치의 저하 방법을 개시한다. 주지된 바와 같이 이는 Gpr100의 발현을 하향-조절하거나 Gpr100의 길항제를 이용함으로서 달성될 수 있다.
또한 실시예는 돌연변이가 포도당에 대한 정상적인 내성을 지니고 글루카곤 수치 내 유의적인 변화를 보이지 않음을 나타낸다. 저혈당증 표현형과 함께 이들 결과는 돌연변이 동물은 연료 생성을 위한 지방산 산화로 스위치를 켜는 능력 상에 결함을 지님을 나타낸다.
따라서 특히 Gpr100 결함 동물이 기아시 연료 생성을 위한 지방산 산화 스위치 작동 상의 실패가 구성요소 또는 원인인 질환에 대한 모델로 이용된다. Gpr100은 이러한 질환을 치료하는데 이용되고 그의 기능에 영향을 미치는 것이 가능한 분자를 선별하는데 이용된다.
더욱이 실시예 3은 금식 조건 후 동형접합성 돌연변이 마우스가 연령 및 성 매치된 대조군 마우스와 비교시 증가된 백색 지방 조직 및 지방세포 크기를 나타낸다.
따라서 Gpr100은 비만 조절에 관련되고, 따라서 Gpr100 결함 동물은 비만에 대한 모델로서 이용된다. Gpr100, 그의 단편, 상동체, 변이체 및 유도체뿐만 아니라 작용제 및 길항제를 포함한 조절제는 비만을 진단하거나 치료하는데 이용된다. 특히 Gpr100은 비만을 치료하는데 이용되고 그의 기능에 영향을 미치는 것이 가능한 분자를 선별하는데 이용된다. 일반적으로 본 발명자는 바람직하게는 비만 치료를 위해 개체 내 Gpr100의 수치 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함한 개체 내 체지방 감소 방법을 개시한다. 주지된 바와 같이 이는 Gpr100 발현을 상향-조절하거나 Gpr100의 작용제를 이용함으로서 달성될 수 있다.
Gpr100 관련 질환
따라서 Gpr100 관련 질환은 하기를 포함한다: 비만 또는 체증증가의 장애, 식욕 억제를 포함한 비만, 대사장애, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병을 포함한 당뇨병 및 관련 장애 및 체중 관련 질환, 손상된 포도당내성, 인슐린 저항성 증후군, 증후군 X, 말초신경병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병 관련 단백뇨, 고혈당증, 고지혈증, 유지질이상혈증, 고중성지방혈증을 포함한 지질 대사 장애, 급성 췌장염, 심혈관질환, 말초혈관질환, 고혈압, 심장 비대, 허혈성 심장병, 고콜레스테롤혈증, 비만, 비만 또는 체중 증가의 장애로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 주지된 바와 같이 Gpr100 GPCR은 여기서 기술된 방법 및 조성물을 이용하여 이들 특정 질환을 진단하고/또는 치료하는데 이용된다. 더욱이 Gpr100 넉아웃이 억제된 식욕 및 수분 섭취를 지녔고 따라서 Gpr100 기능을 조절하는 것이 가능한 화합물은 다이어트 보충물로서 또는 다이어트 및 체중 감소 프로그램에 이용될 수 있음이 주지되었다.
본 발명자는 상기 기입된 특정 질환의 치료 또는 진단을 위해 Gpr100 GPCR 핵산, 폴리펩타이드, 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 핵산, 벡터, 약학적 조성물, 숙주 세포 및 Gpr100 GPCR 핵산 및/또는 폴리펩타이드를 포함한 형질전환 동물의 이용을 상세히 조사하였다. 더욱이 본 발명자는 상기 기술된 특정 질환 및 장애 또는 이상의 진단 또는 치료시 Gpr100 PPCR과 상호작용하거나 결합하는 것이 가능한 화합물, 바람직하게는 Gpr100 GPCR의 길항제, 바람직하게는 세포 내 순환성 AMP의 내인성 수치를 저하시키는 것이 가능한 화합물, Gpr100 GPCR의 항체의 이용뿐만 아니라 이들의 제조 또는 확인 방법을 조사하였다. 특히 본 발명자는 특정 질환의 치료 또는 예방을 위한 백신 제조시 이들 화합물, 조성물, 분자 등의 이용을 포함시켰다. 또한 본 발명자는 개체 내 특정 질환의 검출용 진단 키트를 개시한다.
Gpr100 GPCR에 의해 치료 가능하거나 진단 가능한 이러한 또는 다른 특정 질환을 확인하는 계통 지도화 방법은 당분야에 알려져 있고 또한 본 출원서에 기술되어 있다.
포도당 조절
포도당은 적절한 기능 및 모든 기관의 생존을 보증하는데 필수적이다. 저혈당증은 세포 사멸을 생성하는 반면 고혈당증은 기관 또는 조직 손상을 유발할 수 있다.
혈장 포도당은 일반적으로 4∼7 mM 사이의 좁은 범위에 존재하고 이는 소장으로부터의 포도당 흡수, 간에 의한 생성 및 말초 조직에 의한 흡수 및 대사 사이의 균형에 의해 제어되는 것이다. 식사 후와 같은 증가된 포도당의 혈장 수치에 반응하여 췌장 랑게르한스섬의 베타 세포가 인슐린을 분비하면 근육 및 지방 조직에 작용하여 이들 세포 내로 포도당 흡수를 자극하고 간세포에 작용하여 포도당 생성을 억제한다.
더욱이 인슐린은 세포 성장 및 분화도 자극하고 지방생성, 글리코겐 및 단백질 합성을 자극하고 지질분해, 글리코겐분해 및 단백질 분해를 억제함으로서 지방, 간 및 근육 내 기질의 저장을 촉진시킨다.
당뇨병 및 비만은 당분야에 알려진 질환이다. 각각의 요약적 설명은 하기와 같다:
당뇨병
당뇨병은 탄수화물 지질 대사가 인슐린에 의해 부적당하게 조절되는 상태로 정의된다. 당뇨병의 2가지 주요 형태인 제1형 및 제2형이 확인되었다. 제1형 당뇨병은 덜 우세한 질환 형태를 나타내고, 당뇨병 환자의 5∼10%에 영향을 미친다. 췌장 랑게르한스섬의 인슐린-생성 베타 세포의 자가면역 분열로부터 유발되는 것으로 판단된다. 인슐린의 외인성 투여는 일반적으로 병태생리학을 완화시킨다. 제2형 당뇨병은 질환의 가장 일반적인 형태이고 인슐린 분비 및 작용 메커니즘 내 결함의 조합에 의해 유발된다. 제1형 및 제2형의 두 가지 형태 모두는 유사한 합병증을 지니나 뚜렷한 병태생리학을 지닌다.
제2형 당뇨병의 첫 번째 단계는 인슐린의 정상 순환 농도에 반응하는 근육 및/또는 다른 기관의 기능부전을 특징으로 한다. 이는 일반적으로 비만, 앉아서 일하는 생활양식 및/또는 유전적 소인과 관련된다. 이는 췌장 베타 세포로부터의 인슐린 분비 증가, 고인슐린혈증으로 불리는 이상에 의해 유발된다. 결국 췌장 베타 세포는 더 이상 보충될 수 없고 이는 손상된 포도당 내성, 만성 고혈당증 및 조직 손상을 유도한다. 혈당의 조절 및 대사와 관련된 복잡한 신호 전달 경로는 제2형 당뇨병 또는 비만과 같은 비정상적인 포도당 대사 이상의 치료를 위한 여러 잠재적인 타겟을 제공한다.
비만
비만은 적어도 3900만 이상의 미국인: 모든 성인의 4분의 1 및 약 5명의 소아중 1명에 영향을 미치는 질환이다. 매년 비만은 미국에서 적어도 300,000 이상의 사망을 유발하고 국가는 1억 달러 이상을 부담하고 있다. 지난 10년간 비만인 미국 인구의 비율이 25 퍼센트에서 32 퍼센트로 증가되었다. 비만은 사람이 비만 또는 과체중인지 여부를 측정하는데 이용되는 수학적 계산인 신체비만지수(Body Mass Index) 또는 BMI에 의해 측정된다. BMI는 사람의 킬로그램 단위의 체중을 미터 단위의 신장의 제곱으로 나눔으로서 계산된다. 30 이상의 BMI는 비만으로 간주되고 25∼29.9의 BMI는 과체중으로 간주된다. 그러나 진단 기준은 운동선수와 같은 정상보다 더 많은 근육량 및 더 적은 체지방을 지닌 사람에 대해서는 오도될 수 있다. 7000만 이상의 미국인은 과체중으로 간주된다.
심혈관질환, 혈압, 제2형 당뇨병, 고콜레스테롤, 통풍, 특정 형태의 암 및 골관절염을 포함하나 이에 한정적인 것은 아닌 건강 문제는 과체중 이상 및 비만과 관련된다.
Gpr100의 동일성 및 유사성
G-단백질 결합 수용체 SALPR 성장억제호르몬 및 안지오텐신-유사 펩타이드수용체.(동일성 = 141/322(43%), 양성 = 194/322(59%)).
pfam HMM 구조 예측 소프트웨어(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/ search.shtml)를 이용한 Gpr100 폴리펩타이드(서열번호: 3)의 분석은 Gpr100 폴리펩타이드가 7TM-1 구조적 분류의 GPCR임을 확인시킨다(도 1 참조).
인간 Gpr100 GPCR의 마우스 상동체가 클론되었고 그의 핵산 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호: 4 및 서열번호: 5에 나타나 있다. 서열번호: 4의 마우스 Gpr100 GPCR cDNA는 인간 Gpr100 GPCR(서열번호: 2)과 높은 정도의 동일성을 나타내고, 마우스 Gpr100 GPCR의 아미노산 서열(서열번호: 5)는 인간 Gpr100 GPCR(서열번호: 3)과 높은 정도의 동일성 및 유사성을 나타낸다(동일성 = 235/379(62%), 양성 = 264/379(69%)).
따라서 인간 및 마우스 Gpr100 GPCR은 G-단백질 결합 수용체(GPCR)의 많은 패밀리의 멤버이다.
Gpr100 GPCR 폴리펩타이드
여기서 사용된 "Gpr100 GPCR 폴리펩타이드"라는 용어는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리펩타이드를 나타낸다. 바람직하게는 폴리펩타이드는 서열번호: 3에 나타난 서열의 상동체, 변이체 또는 유도체이거나 이를 포함한다.
"폴리펩타이드"는 서로 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합 즉, 등가근(isostere)에 의해 결합된 2 이상의 아미노산을 포함한 펩타이드 또는 단백질을 나타낸다. "폴리펩타이드"는 일반적으로 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 올리고머로 표현되는 짧은 체인과 일반적으로 단백질로 표현되는 더 긴 체인 모두를 나타낸다. 폴리펩타이드는 20 유전자-인코드된 아미노산 이상의 아미노산을 포함한다.
"폴리펩타이드"는 후-번역 과정과 같은 자연적 과정에 의해 또는 당분야에 잘 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산을 포함한다. 이러한 변형은 일반 교본 및 더욱 상세한 모노그래프뿐만 아니라 여러 권의 연구 논문 내에 잘 기술되어 있다. 변형은 펩타이드 백본(backbone), 아미노산 사이드-체인 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함한 폴리펩타이드의 어떤 곳에서도 발생할 수 있다. 동일한 형태의 변형은 제공된 폴리펩타이드 내의 동일하거나 여러 사이트의 다양한 정도 내에 존재한다.
폴리펩타이드는 유비퀴틴화의 결과로서 분지되고, 이들은 분지가 있거나 또는 없이 환형일 수 있다. 환형, 분지된, 분지된 환형 폴리펩타이드는 후-번역 자연 과정으로부터 유발되거나 합성적 방법에 의해 제조된다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실레이션(ribosylation), 아미드화, 플라빈의 공유결합 부착, 헴 반족의 공유결합 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유결합 부착, 리피드 또는 리피드 유도체의 공유결합 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유결합 부착, 교차-결합, 순환, 이황결합 형성, 탈메틸화, 공유결합 교차-결합 형성, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀레이션(formylation), 감마-카르복실화, 글리코실레이션, GPI 앵커(anchor) 형성, 수산화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일레이션(myristoylation), 산화, 단백질분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일레이션(selenoylation), 황산화, 아르기닌화 및 유비퀴틴화와 같은 단백질로 아미노산의 전이-RNA 매개 첨가. 예를 들어, Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter, et al., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth Enzymol (1990) 182:626-646 and Rattan, et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62 참조.
본 발명과 관련된 "변이체", "상동체", "유도체" 또는 "단편"이라는 용어는 서열로부터 또는 그에 대한 하나(또는 그 이상의) 아미노산의 치환, 변이, 변형, 교체, 삭제 또는 첨가를 포함한다. 문장이 다른 경우를 허용하지 않는 한 "Gpr100" 및 "Gpr100 GPCR"에 대한 표기는 Gpr100의 이러한 변이체, 상동체, 유도체 및 단편을 포함한다.
바람직하게는 Gpr100에 적용시 수득된 아미노산 서열은 GPCR 활성을 지니고, 더욱 바람직하게는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 Gpr100 GPCR의 활성과 동일한 활성을 지닌다. 특히 "상동체"라는 용어는 수득된 아미노산 서열이 GPCR 활성을 지니는 조건으로 구조 및/또는 기능의 동일성을 포함한다. 서열 동일성(즉, 유사성)에 있어서 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 이상, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90% 이상의 동일성이 존재한다. 더욱 바람직하게는 이들 용어는 Gpr100 GPCR 핵산 서열의 대립유전자 변이인 아미노산 유래의 폴리펩타이드도 포함한다.
표기가 Gpr100와 같은 수용체의 "수용체 활성" 또는 "생물학적 활성"에 대해 이루어진 경우 이들 용어는 유사한 활성 또는 증가된 활성 또는 감소된 바람직하지 않은 부작용을 지닌 활성을 포함한 Gpr100 수용체의 대사적 또는 생리적 기능을 나타낸다. 또한 Gpr100 수용체의 항원성 및 면역원성 활성도 포함된다. GPCR 활성의 예 및 이들 활성을 분석하고 질량화하는 방법은 당분야에 알려져 있고, 본 문서에 상세히 기술되어 있다.
여기에 사용된 "결실"은 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 부재한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 내 변화로서 정의된다. 여기에 사용된 "삽입" 또는 "첨가"는 자연 발생적인 물질과 비교시 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 첨가를 유발한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 내의 변화이다. 여기에 사용된 "치환"은 각각 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의한 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교체를 유발한다.
또한 본 발명에 따른 Gpr100 폴리펩타이드는 무증후 변화를 생성하고 기능적으로 동일한 아미노산 서열을 유발하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 지닌다. 인공 아미노사 치환은 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 상의 유사성에 기초하여 이루어진다. 예를 들어 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 라이신, 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수서을 지닌 하전되지 않은 극성 두부(polar head group)를 지닌 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다.
예를 들어 보존적 치환은 하기에 따라 이루어진다. 두 번째 컬럼 내의 동일한 블록, 바람직하게는 세 번째 컬럼 내 동일한 줄 내의 아미노산은 서로 치환된다:
Figure 112006087769872-PCT00001
Gpr100 폴리펩타이드는 일반적으로 N-말단 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 이형성 아미노산 서열을 더욱 포함한다. 이형성 서열은 세포내 또는 세포외 단백질 타겟팅에 영향을 미치는 서열(리더 서열과 같은)을 포함한다. 또한 이형성 서열은 폴리펩타이드의 면역원성을 증가시키고/또는 폴리펩타이드의 식별, 추출 및/또는 정제를 촉진시키는 서열을 포함한다. 특히 바람직한 또다른 이형성 서열은 바람직하게는 N-말단인 폴리히스티딘과 같은 폴리아미노산 서열이다. 적어도 10개 이상, 바람직하게는 적어도 17개 이상의 아미노산이나 50개 이하의 아미노산의 폴리히스티딘 서열이 특히 바람직하다.
Gpr100 폴리펩타이드는 "성숙" 단백질의 형태이거나 융합 단백질과 같은 더 큰 단백질의 일부이다. 분비 또는 리더 사열, 전(pro)-서열, 다중 히스티딘 잔기와 같은 정제 촉진 서열 또는 재조합 생성동안 안정성에 대한 추가 서열을 포함한 추가 아미노산 서열을 포함한다.
Gpr100 폴리펩타이드는 알려진 기술을 이용한 재조합 방법에 의해 유리하게 이루어진다. 그러나 또한 이는 고형상 합성과 같은 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용한 합성 방법에 의해 이루어진다. 여기서 기술된 폴리펩타이드는 예를 들어 추출 및 정제를 촉진시키는 융합 단백질로서 제조되기도 한다. 융합 단백질 파트너의 예는 글루타티온-S-전이효소(GST), 6xHis, GAL4(DNA 결합 및/또는 전사 활성 도메인) 및 β-갈락토시다제를 포함한다. 또한 이는 트롬빈 분열 사이트와 같이 융합 단백질 파트너와 융합 단백질 서열의 제거를 가능하게 하는 목적 단백질 서열 사이의 단백질 분해성 분열 사이트를 포함하는 것이 편리하다. 바람직하게는 융합 단백질은 목적 서열의 단백질 기능을 저해하지 않을 것이다.
Gpr100 폴리펩타이드는 실질적으로 분리된 형태이다. 이러한 용어는 자연 상태로부터 인공적인 변화를 나타낸다. "분리된" 조성물 또는 물질이 자연적으로 발생하는 경우 그의 본래 환경으로부터 변화되거나 제거되었다. 예를 들어 생존 동물 내에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드, 핵산 또는 폴리펩타이드는 "분리된" 것이 아니나 그의 자연 상태의 동시 존재 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드, 핵산 또는 폴리펩타이드는 여기서 사용된 용어와 같이 "분리된" 것이다.
그러나 Gpr100 GPCR 단백질이 단백질의 의도된 목적을 방해하지 않는 담체 또는 희석제와 혼합되고 실질적으로 분리되는 것으로 간주됨이 이해될 것이다. 또한 여기서 기술된 바와 같은 폴리펩타이드는 실질적으로 정제된 형태이고, 이러한 경우 일반적으로 90% 이상, 예를 들어 제제 내 단백질의 95%, 98% 또는 99%가 Gpr100 폴리펩타이드인 제제 내 단백질을 포함한다.
또한 본 발명은 Gpr100 폴리펩타이드의 일부를 포함한 펩타이드에 관한 것이다. 따라서 Gpr100 GPCR의 단편 및 그의 상동체, 변이체 또는 유도체가 포함된다. 펩타이드는 2∼200개 길이의 아미노산, 바람직하게는 4∼40개 길이의 아미노산이다. 펩타이드는 예를 들어 트립신과 같은 적당한 효소로의 분해에 의해 여기서 사용된 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드로부터 유래된다. 대안으로 펩타이드, 단편 등은 재조합 방법으로 제조되거나 합성적으로 합성된다.
"펩타이드"라는 용어는 레트로인벌소(retroinverso) D 펩타이드와 같은 당분야에 알려진 다양한 합성 펩타이드 변이를 포함한다. 펩타이드는 항원 결정소 및/또는 T-세포 에피토프이다. 펩타이드는 생체 내에서 면역원이다. 바람직하게는 펩타이드는 생체 내 중화 항체를 유도하는 것이 가능하다.
다른 종으로부터의 Gpr100 GPCR 서열을 정렬시킴으로서 어떤 아미노산 서열 구역이 다른 종간에 보존되는지("상동성 구역") 및 어떤 구역이 다른 종간에 변화하는지("이형성 구역")를 측정하는 것이 가능하다.
따라서 Gpr100 폴리펩타이드는 상동성 구역의 적어도 일부에 상응하는 서열을 포함한다. 상동성 구역은 적어도 2종간의 높은 정도의 상동성을 나타낸다. 예를 들어 상동성 구역은 여기서 기술된 시험을 이용하여 아미노산 수치의 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 이상의 동일성을 나타낸다. 상동성 구역에 상응하는 서열을 포함한 펩타이드는 하기 더욱 상세히 설명된 치료 전략 내에서 사용된다. 대안으로 Gpr100 GPCR 펩타이드는 이형성 구역의 적어도 일부에 상응하는 서열을 포함한다. 이형성 구역은 적어도 2종간의 낮은 정도의 상동성을 나타낸다.
Gpr100 폴리뉴클레오타이드 및 핵산
또한 본 발명자는 본 출원서에 더욱 상세히 설명된 바와 같이 Gpr100 폴리뉴클레오타이드, Gpr100 뉴클레오타이드 및 Gpr100 핵산, 그의 제조방법 및 이용을 개시한다.
"Gpr100 폴리뉴클레오타이드", "Gpr100 뉴클레오타이드" 및 "Gpr100 핵산"이라는 용어는 상호교환 가능하게 사용되고 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리뉴클레오타이드/핵산을 나타낸다. 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드/핵산은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 가장 바람직하게는 서열번호: 2에 나타난 핵산 서열을 포함하거나 이의 상동체, 변이체 또는 유도체이다.
또한 이들 용어는 Gpr100 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드를 인코드하는 것이 가능한 핵산 서열을 포함한다. 따라서 Gpr100 폴리뉴클레오타이드 및 핵산은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리펩타이드를 인코드하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는 Gpr100 폴리뉴클레오타이드 및 핵산은 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리펩타이드를 인코드하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
"폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA인 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오타이드를 나타낸다. "폴리뉴클레오타이드"는 제한 없이 단일- 및 이중-나선 DNA, 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-나선 RNA 및 포함하나 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 RNA, 단일-나선 또는 더욱 일반적으로는 이중-나선 또는 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 DNA 및 RNA를 포함한 하이브리드 분자를 포함한다. 더욱이 "폴리뉴클레오타이드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 모두를 포함한 삼중-나선 구역을 나타낸다. 또한 폴리뉴클레오타이드라는 용어는 하나 이상의 변형된 염기를 포함한 DNA 또는 RNA 및 안정성 또는 다른 이유로 골격이 변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는 예를 들어 트리틸레이트된(tritylated) 염기 및 이노신과 같은 특정 염기를 포함한다. 다양한 변형은 DNA 및 RNA에서 이루어지고, 따라서 "폴리뉴클레오타이드"는 자연 내에서 일반적으로 발견되는 폴리펩타이드의 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특성의 화학적 형태를 포함한다. 또한 "폴리뉴클레오타이드"는 올리고뉴클레오타이드로 표기되는 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
많은 뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드의 퇴화 결과로 동일한 폴리펩타이드를 인코드할 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
여기에 나타난 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 뉴클레오타이드 서열, 올리고뉴클레오타이드 서열, 폴리뉴클레오타이드 서열 및 그의 변이체, 상동체, 단편 및 유도체(그의 일부분과 같은)를 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열은 센스 또는 안티센스 나선 또는 그의 결합에 관계없이 이중-나선 또는 단일-나선인 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원의 DNA 또는 RNA이다. 뉴클레오타이드 서열이라는 용어는 재조합 DNA 기술(예를 들어 재조합 DNA)의 이용에 의해 제조된다.
바람직하게는, "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 DNA를 의미한다.
본 발명과 관련된 "변이체", "상동체", 유도체" 또는 단편"이라는 용어는 Gpr100 뉴클레오타이드 서열로부터 또는 그에 대한 하나의(또는 그 이상의) 핵산의 치환, 변이, 변형, 교체, 결실 또는 첨가를 포함한다. 문장이 다른 경우를 허용하지 않는 한 "Gpr100" 및 "Gpr100 GPCR"에 대한 표기는 Gpr100의 이러한 변이체, 상동체, 유도체 및 단편을 포함한다.
바람직하게는 수득된 뉴클레오타이드 서열은 GPCR 활성, 바람직하게는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 GPCR과 적어도 동일한 활성을 지닌 폴리펩타이드를 인코드한다. 바람직하게는 "상동체"라는 용어는 구조 및/또는 기능에 대해 동일성을 포함하여 수득된 뉴클레오타이드 서열이 GPCR 활성을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하게 된다. 서열 동일성(즉, 유사성)에 있어서 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상의 서열 동일성이 존재한다. 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상의 서열 동일성이 존재한다. 또한 이들 용어는 서열의 대립유전자 변이를 포함한다.
서열 상동성의 계산
따라서 여기서 제공된 서열에 대한 서열 동일성은 다른 서열이 예를 들어 서열에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지니는지 여부를 관찰하기 위한 하나 이상의 서열을 또다른 서열과의 단순한 "안구" 비교(즉, 엄격 비교)에 의해 측정될 수 있다.
또한 상대 서열 동일성은 디폴트 파라미터를 이용하여 동일성을 측정하기 위한 적당한 알고리즘을 이용한 2 이상의 서열 사이의 % 동일성을 계산할 수 있는 통상적으로 구입 가능한 컴퓨터 프로그램에 의해 측정될 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램의 일반적인 예는 CLUSTAL이다. 2 서열 사이의 동일성 및 유사성을 측정하기 위한 다른 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 팩키지(Devereux et al 1984 Nucleic Acids Research 12:387) 및 FASTA(Atschul et al 1990 J Molec Biol 403-410)을 포함하나 이에 한정적이지 않다.
% 상동체는 인접 서열에 대해 계산된다 즉, 하나의 서열이 다른 서열과 정렬되고 하나의 서열 내 각 아미노산은 다른 서열 내 상응하는 아미노산과 한번에 하나의 잔기씩 직접 비교된다. 이는 "언갭된(ungapped)" 정렬로 명명된다. 일반적으로 이러한 언갭된 정렬은 상대적으로 짧은 수의 잔기에서만 수행된다.
이는 매우 간단하고 일정한 방법이나 예를 들어 서열의 동일한 쌍이 아닌 경우 하나의 삽입 또는 결실이 하기 아미노산 잔기를 정렬에서 제거하게 하고 따라서 전제 정렬이 수행될 때 % 상동성 상의 큰 감소를 잠재적으로 유발한다는 점을 고려하지 못한다. 따라서 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 득점을 부당하게 패널티를 과하지 않기 위해 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적 정렬을 생성하도록 고안된다. 이는 국부적 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬 내 "갭"을 삽입함으로서 달성된다.
그러나 이들 더욱 복잡한 방법은 정렬 내 발생하는 각 갭에 "갭 패널티"를 할당하여 가능한 적은 갭을 지닌 동일한 수의 동일한 아미노산의 경우 서열 정렬은 - 2개의 비교 서열 사이의 더 큰 관련성을 반영 - 많은 갭을 지닌 것보다 더 높은 득점을 달성할 것이다. 갭의 존재에 대해 매우 높은 비용을 부과하고 갭 내의 부차적 잔기에 대해 더 작은 패널티를 부가하는데 일반적으로 "아핀(affine) 갭 비용"이 이용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 득점 시스템이다. 물론 높은 갭 패널티는 적은 갭을 지닌 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변형되는 것을 가능하게 한다. 그러나 서열 비교시 이러하 소프트웨으를 사용할 때 디폴트 수치를 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG Wisconsin Bestfit 팩키지 사용시 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭의 경우 -12 및 각 연장의 경우 -4이다.
따라서 최대 % 상동성의 계산은 갭 패널티를 고려할 때 최적 정렬의 생성을 먼저 필요로 한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적당한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 팩키지이다(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 팩키지(Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18), FASTA(Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS suite of comparison tool이나 이에 한정적인 것은 아니다. BLAST 및 FASTA 모두 오프라인 및 온라인 검색에 유용하다(Ausubel et al 1999, 7-58 내지 7-60 참조).
최종 % 상동성이 동일성의 측면에서 측정될 수 있더라도 정렬 과정 그 자체는 일반적으로 전부-또는-전무(all-or-nothing) 쌍 비교에 기반하지 않는다. 대신에 일반적으로 눈금이 있는 유사성 득점 매트릭스가 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기반하여 각각의 이원비교(pairwise comparison)에 득점을 할당하는데 이용된다. 일반적으로 이용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스이다 - 프로그램 BLAST 한 벌에 대한 디폴트 매트릭스. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 수치 또는 공급되는 경우 맞춤 기호 비교를 이용한다. 일부 적용을 위해 GCG 팩키지의 경우 공개 디폴트 수치를 이용하고, 다른 소프트웨어의 경우 BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 이용하는 것이 바람직하다.
대안으로, 디폴트 수치에 맞춰진 파라미터를 지닌 BLAST 알고리즘이 사용된다. BLAST 알고리즘은 http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 상세히 기술되어 있고 이는 참고문헌에 포함되어 있다. 검색 파라미터는 한정될 수 있고 한정된 디폴트 파라미터에 대해 유리하게 맞춰질 수 있다.
대안으로, BLAST에 의한 평가시 "실질적인 동일성"은 적어도 약 7 이상, 바람직하게는 적어도 약 9 이상, 가장 바람직하게는 적어도 10 이상의 EXPECT 수치로 매치된 서열과 동등하다.
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)은 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 사용되는 발견적 검색 알고리즘이고; 이들 프로그램은 적은 증강으로 Karlin and Altschul(Karlin and Altschul 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7; http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html 참조)의 통계법을 이용하여 그들의 발견에 대한 유의성을 유추한다. BLAST 프로그램은 예를 들어 의문의 서열에 대한 상동체를 확인하기 위해 서열 유사성 검색을 위해 주문 제작된다. 서열 데이터베이스의 유사성 검색 내 기본적인 이슈의 논의를 위해 Altschul et al (1994) Nature Genetics 6:119-129 참조.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov에서 구입가능한 5개 BLAST 프로그램은 하기 태스크를 수행한다: blastp - 단백질 서열 데이터베이스에 대한 의문의 아미노선 사열 비교; blastn - 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스에 대한 의문의 뉴클레오타이드 서열을 비교; blastx - 단백질 서열 데이터베이스에 대한 의문의 뉴클레오타이드 서열(양쪽 나선 모두)의 6-프레임 개념 번역 생성물을 비교; tblastn - 모든 6개 리딩 프레임(양쪽 나선 모두) 내에서 역동적으로 번역된 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스에 대한 의문의 단백질 서열을 비교; tblastx - 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스의 6-프레임 번역에 대한 의문의 뉴클레오타이드 서열의 6-프레임 번역을 비교.
BLAST는 하기 검색 파라미터를 이용한다:
HISTOGRAM(막대그래프) - 각각의 검색에 대한 득점의 히스토그램을 표시한다; 디폴트는 yes이다(BLAST 책자 내의 파라미터 H를 참조).
DESCRIPTIONS(설명) - 특성화된 숫자로 리포트되는 매치된 서열의 간단한 디스크립션(description)의 수를 제한한다; 디폴트 한계는 100 디스크립션이다(책자 페이지 내의 파라미터 V를 참조).
EXPECT(예상) - 리포트를 위한 통계적 유의성 역치는 데이터베이세스 서열에 대해 매치된다; 디폴트 값은 10이고, Karlin and Altschul(1990)의 추계학적 모델에 따라 10 매치는 단지 우연히 발견되는 것으로 기대된다. 매치의 통계적 유의성이 EXPECT 역치보다 클 경우 매치는 리포트되지 않을 것이다. 더 낮은 EXPECT 역치가 더 엄격하고, 리포트되는 매치 기회를 더 적게 한다. 분수 값이 수용될 수 있다(BLAST 책자내의 파라미터 E를 참조).
CUTOFF(컷오프) - 높은-득점 세그먼트(segment) 쌍을 리포팅하기 위한 득점을 차단함. 디폴트 값은 EXPECT 값(상기 참조)으로부터 산출된다. HSP는 통계적 유의성이 적어도 CUTOFF 값과 동일한 득점을 지닌 고립 HSP의 크기와 같을 때 데이터베이세스 서열에 대해 리포트된다. CUTOFF 값이 높을수록 더 엄격하여, 리포트되는 매치의 기회를 적게 한다(BLAST 책자 내의 파라미터 S를 참조). 일반적으로 유의성 역치는 EXPECT를 사용하여 더욱 강력하게 관리될 수 있다.
ALIGNMENTS(정렬) - 높은-득점 세그먼트(HSPs)가 보고되는 특정화된 숫자에 데이터베이세스 서열을 제한함; 디폴트 한계는 50이다. 이 보다 더 많은 데이터베이세스 서열이 리포팅을 위한 통계적 유의성 역치를 만족시키게 될 경우(하기의 EXPECT 및 CUTOFF를 참조) 가장 큰 통계적 유의성의 매치만이 리포트된다(BLAST 책자 내의 파라미터 B를 참조).
MATRIX(매트릭스) - BLASTP, BLASTX, TBLASTN 및 TBLASTX를 위한 다른 득점 매트릭스를 특성화함. 디폴트 매트릭스는 BLOSUM62(Henikoff & Henikoff, 1992)이다. 유효한 다른 선택은 PAM40, PAM120, PAM250 및 IDENTITY를 포함한다. BLASTN에 유용한 다른 득점 매트릭스는 없다; BLASTN 리퀘스트(request) 내에서 MATRIX 지시를 특성화시키는 것은 오류 반응으로 나타난다.
STRAND(스트랜드) - TBLASTN 검색을 데이터베이세스 서열의 상부 또는 하부로만 한정함; 또는 LASTP, BLASTX 또는 TBLASTX 검색을 질문 서열의 상부 또는 하부 상의 리딩 프레임에만 한정함.
FILTER(필터) - Wootton & Federhen(1993) Computers and Chemistry 17:149-163의 SEG 프로그램에 의해 측정된 바와 같이 낮은 구성 복잡성을 지닌 질문 서열의 세그먼트 또는 Claverie & States(1993) Computers and Chemistry 17:191-201의 XNU 프로그램 또는 BLASTN의 경우 Tatusov and Lipman (http://www.ncbi.nih.gov.를 참조)의 DUST 프로그램에 의해 측정된 바와 같이 짧은-주기성 간격 반복으로 구성된 세그먼트를 마스크 오프(mask off)함. 필터링(filtering)은 blast 출력으로부터 통계적으로는 유의적이나 생물학적으로는 흥미없는 리포트를 제거하고(즉, 공통의 산성-, 염기성- 또는 프롤린-풍부 구역), 데이터베이세스 서열에 대한 특정 매칭에 유용한 질문 서열의 생물학적으로 흥미 있는 더 많은 구역을 남긴다.
필터 프로그램에 의해 발견된 낮은 복잡성 서열은 뉴클레오타이드 서열 내에서 문자 "N"을 사용하여(즉, "NNNNNNNNNNNNN"), 단백질 서열 내에서 문자 "X"를 사용하여(즉, "XXXXXXXXX") 대치된다.
필터링은 데이터베이세스 서열이 아니라 질문 서열(또는 그의 번역 생성물)에만 적용된다. 디폴트 필터링은 BLASTN의 경우 DUST, 다른 프로그램의 경우는 SEG이다.
SWISS-PROT 내의 서열에 적용될 경우 SEG 또는 XNU 또는 이 둘 모두에 의해마스크된 어떤 것에도 전혀 특별하지 않아서 필터링이 항상 효과를 나타내지 않는다. 더욱이 일부의 경우 서열이 완전히 마스크되어 여과되지 않은 질문 서열에 대해 리포트된 어떤 매치의 통계적 유의성이 의심받을 수 있다는 것을 나타낸다.
NCBI-gi NCBI-gi 확인자가 접근 및/또는 로커스(locus) 명칭에 부가하여 출력 내에 나타나도록 유발한다.
가장 바람직하게는 서열비교는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 제공된 간단한 BLAST 검색 알고리즘을 이용하여 수행된다. 일부 실시태양에서 서열 동일성 측정시 어떠한 갭 패널티도 사용되지 않는다.
하이브리디제이션
또한 본 출원서는 여기서 제공된 서열 또는 그의 단편 또는 유도체 또는 상기 서열의 상보체에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하이브리디제이션은 "염기 짝짓기를 통해 핵산 나선이 상보적 나선과 결합하는 과정"(Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY) 뿐만 아니라 Dieffenbach CW and GS Dveksler(1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)에 개시된 중합효소 연쇄 반응 기술로 수행된 증폭 과정을 의미한다.
하이브리디제이션 조건은 Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)에 나타난 바와 같이 핵산 결합 복합체의 분해 온도(Tm)에 기반을 두고 있고, 하기 설명된 바와 같이 한정된 "스트린전시(stringency)"를 부여한다.
여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보체에 선택적으로 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 적어도 20개 이상, 바람직하게는 적어도 25개 또는 30개 이상, 예를 들어 적어도 40개, 60개, 또는 100개 이상의 인접 뉴클레오타이드 구역에 있어서 여기서 제공된 상응하는 뉴클레오타이드 서열에 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 98% 이상 상동성일 것이다. 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 1, 2 또는 4에 대해 상동적인, 바람직하게는 상기 서열 중의 하나에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상의 상동적인 구역을 포함할 것이다.
"선택적으로 하이브리다이즈하는 것이 가능한"이라는 용어는 프로브로 사용된 뉴클레오타이드 서열이 타겟 뉴클레오타이드 서열이 배경 수준보다 유의적으로 상위의 수준에서 프로브에 하이브리다이즈하는 것으로 나타나는 조건 하에서 사용됨을 의미한다. 배경 하이브리디제이션은 예를 들어 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리 선별시 존재하는 다른 뉴클레오타이드 서열로 인해 발생한다. 이러한 경우 배경은 타겟 DNA에서 관찰되는 특이적 상호작용에 비해 10배 이하, 바람직하게는 100배 이하의 강도인 라이브러리의 비-특이적 DNA 멤버와 프로브 사이의 상호작용을 의미한다. 상호작용의 강도는 예를 들어 프로브 즉, 32P를 방사선표지함으로서 측정된다.
또한 중간 내지 최대 스트린전시 조건 하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열이 포함된다. 하이브리디제이션 조건은 Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)에 나타난 바와 같이 핵산 결합 복합체의 분해 온도(Tm)에 기반을 두고 있고, 하기 설명된 바와 같이 한정된 "스트린전시(stringency)"를 부여한다.
최대 스트린전시는 일반적으로 약 Tm-5℃(프로브 Tm의 5℃ 이하)에서; 높은 스트린전시는 Tm의 5℃∼10℃ 이하에서; 중간 스트린전시는 Tm의 10℃∼20℃ 이하에서; 및 낮은 스트린전시는 Tm의 20℃∼25℃ 이하에서 발생한다. 당업자에 이해되는 바와 같이 최대 스트린전시 하이브리디제이션은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 이용될 수 있고 중간(또는 낮은) 스트린전시 하이브리디제이션은 유사하거나 관련된 뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 이용될 수 있다.
바람직한 실시태양에서 본 발명자는 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3 구연산 pH 7.0}) 하에서 하나 이상의 Gpr100 GPCR 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 개시한다. 뉴클레오타이드 서열이 이중-나선인 경우 이중 나선의 두 스트랜드 모두, 개별적으로 또는 결합된 형태 모두 포함된다. 뉴클레오타이드 서열이 단일-나선인 경우 뉴클레오타이드 서열의 상보적 서열도 이용됨이 이해된다.
또한 본 발명자는 여기서 제공된 서열에 상보적인 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열 또는 그의 단편 또는 유도체를 개시한다. 유사하게 본 발명은 상기 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이들 뉴클레오타이드 서열의 형태는 변이체 뉴클레오타이드 서열의 예이다. 이러한 관점에서 "변이체"라는 용어는 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 그러나 바람직하게는 "변이체"라는 용어는 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3 구연산 pH 7.0}) 하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
Gpr100 GPCR 및 상동체의 클로닝
본 발명자는 여기서 제공된 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 단편 또는 유도체를 개시한다. 상기 서열이 그의 단편에 상보적인 경우 상기 서열은 다른 생물체 내의 유사한 서브유니트 서열을 확인하고 클론하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 인간 및 쥐, 돼지, 양 등의 다른 종으로부터의 Gpr100, 그의 상동체 및 다른 구조적으로 또는 기능적으로 관련된 유전자의 클로닝을 가능하게 한다. 적당한 라이브러리로부터 Gpr100 GPCR을 인코드하는 일부 또는 전체-길이 cDNA 및 게놈 클론을 분리하기 위해 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 4에 포함된 뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 충분히 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 단편이 cDNA 및 게놈 DNA에 대한 하이브리디제이션 프로브로서 사용된다. 또한 이러한 프로브는 Gpr100 유전자에 대해 서열 유사성, 바람직하게는 높은 서열 유사성을 지닌 다른 유전자(인간 이외의 종으로부터의 상동체 및 오르쏠로그(orthologue)를 포함)의 cDNA 및 게놈 클론을 분리하는데 사용된다. 하이브리디제이션 선별, 클로닝 및 서열분석 기술은 당업자에게 알려져 있고 예를 들어 Sambrook et al(상동)에 기술되어 있다.
일반적으로 프로브로 사용하기 적당한 뉴클레오타이드 서열은 대상 서열에 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 95% 이상 동일하다. 일반적으로 프로브는 적어도 15개 뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 바람직하게는 이러한 프로브는 적어도 30개 뉴클레오타이드를 지닐 것이고 적어도 50개 뉴클레오타이드를 지닌다. 특히 바람직한 프로브는 150∼500개, 더욱 특별하게는 약 300개 뉴클레오타이드 범위일 것이다.
하나의 실시태양에서 인간 이외의 종으로부터 상동체 및 오르쏠로그를 포함한 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해 트린전트 조건 하에서 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 4 또는 그의 단편을 지닌 표지된 프로브로 적당한 라이브러리를 선별하는 단계 및 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한 일부 또는 전체-길이 cDNA 및 게놈 클론을 분리하는 단계를 포함한다. 이러한 하이브리디제이션 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 스트린전트 조건은 상기 한정된 바와 같거나 대안으로 50% 포름아마이드, 5XSSC(150 mM NaCl, 15 mM 구연산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5XDenhardt 용액, 10% 황산덱스트란 및 20 ㎍/ml 변성 절단 연어 정자 DNA를 포함한 용액 내에서 42℃에서의 밤새 인큐베이션한 후 약 65℃에서 0.1XSSC 내에서 필터를 세척하는 조건이다.
Gpr100 GPCR의 기능적 분석
클론된 추정 Gpr100 GPCR 폴리뉴클레오타이드는 서열 분석 또는 기능적 분석에 의해 증명된다. 예를 들어 추정 Gpr100 GPCR 또는 상동체는 하기와 같이 수용체 활성에 대해 분석된다. Gpr100 수용체 cDNA를 인코드하는 선형화 플라스미드 주형으로부터의 캡결합된(capped) RNA 전사체가 표준 절차에 따라 RNA 중합효소로 시험관 내에서 합성된다. 시험관 내에서 전사체는 0.2 mg/ml의 최종 농도로 물에 현탁된다. 난소엽은 성체 암컷 두꺼비로부터 제거되고, 단계 Ⅴ 탈난포화 난모세포가 수득되고 RNA 전사체(10 ng/난모세포)가 현미주사 기구를 이용하여 50 nl 환약으로 주입된다. 2개의 전극 전압 클램프가 작용제 노출에 대한 제노푸스 난모세포 개체로부터 전류를 측정하는데 사용된다. 기록은 상온에서 (mM 농도로) Ca2+ 없는 Barth 배지 내에서 이루어진다. 또한 제노푸스 시스템은 하기에 더욱 상세히 기술된 바와 같이 알려진 리간드 및 리간드 활성화용 조직/세포 추출물을 선별하는데 사용된다.
Gpr100에 대한 발현 분석
Gpr100 GPCR 관련 질환을 치료하기에 유용한 치료제를 고안하기 위해 Gpr100(야생형 또는 특정 돌열변이)의 발현 프로파일을 측정하는 것이 유용하다. 따라서 당분야에 알려진 방법은 Gpr100이 발현되는 기관, 조직 및 세포 형태를 측정하는데 이용된다. 예를 들어 통상의 또는 "전자적" 노던(Northern)이 수행된다. 또한 역-전사효소 PCR(RT-PCR)는 Gpr100 유전자 또는 돌연변이체의 발현을 분석하는데 이용된다. Gpr100의 발현 프로파일의 더욱 민감한 측정 방법은 당분야에 알려진 바와 같이 RNAse 보호 분석을 포함한다.
노던 분석은 유전자의 전사체의 존재를 검출하는데 이용되는 실험 기술이고 특정 세포 형태 또는 조직으로부터의 RNA가 결합된 멤브레인으로의 표지된 뉴클레오타이드 서열의 하이브리디제이션을 포함한다(Sambrook, supra, ch. 7 and Ausubel, F. M. et al. supra, ch. 4 and 16). BLAST를 적용하는 유사한 컴퓨터 기술("전자적 노던")은 GenBank 또는 LIFESEQ 데이터베이스(Incyte Pharmaceuticals)와 같은 뉴클레오타이드 데이터베이스와 동일하거나 관련된 분자를 검색하는데 이용된다. 이러한 형태의 분석은 다수의 멤브레인-기반 하이브리디제이션보다 더 빠르다는 점에서 유리하다. 더욱이 컴퓨터 검색의 민감도는 어떠한 특정 매치가 정확하거나 상동성인 것으로 분류되는지 여부를 측정하도록 변형될 수 있다.
상기 기술된 프로브를 포함하여 여기서 기술된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 본 출원서에 더욱 상세히 설명된 바와 같이 동물 및 인간 질환의 치료 및 진단의 발견을 위한 연구 시약 및 재료로서 이용된다.
Gpr100 폴리펩타이드의 발현
또한 본 발명은 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드의 제조 방법을 개시한다. 본 방법은 일반적으로 적당한 조건(즉, Gpr100 GPCR 폴리펩타이드가 발현되는 조건) 하에서 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
생물학적으로 활성인 Gpr100 GPCR을 발현하기 위해 Gpr100 GPCR을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체가 적당한 발현 벡턱 즉, 삽입된 코딩 서열의 전사 또는 번역을 위해 필요한 요소를 포함한 벡터 내로 삽입된다.
당업자에게 잘 알려진 방법은 Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열 및 적당한 전사 및 번역 조절 요소를 포함한 발현 벡터를 구축하는데 이용된다. 이들 방법은 시험관 내에서의 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내에서의 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술은 Sambrook, J. et al.(1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ch. 4, 8, and 16-17, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.) 및 Ausubel, F. M. et al.(1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)에 기술되어 있다.
다양한 발현 벡터/숙주 시스템은 Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열을 포함하고 발현시키는데 사용된다. 이들은 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(즉, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(즉, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 또는 담배 모자이크 바이러스(TMV)) 또는 박테리아 발현 벡터(즉, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 이는 사용되는 숙주 세포에 의해 제한되지 않는다.
"조절 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포성 단백질과 상호작용하는 벡터의 비-번역되는 구역이다(즉, 인핸서, 프로모터 및 5' 및 3' 비번역 구역). 이러한 요소는 그의 강도 및 특이성이 다양하다. 사용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라 달리 구성적 및 유도성 프로모터를 포함한 적당한 전사 및 번역 요소가 사용된다. 예를 들어 박테리아 시스템 내에서 클로닝시 BLUESCRIPT 파지미드(Stratagene, La Jolla, Calif.) 또는 PSPORT1 플라스미드(GIBCO/BRL)의 하이브리드 lacZ 프로모터 등과 같은 유도성 프로모터가 사용된다. 바큘로바이러스 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터는 곤충 세포에 사용된다. 식물 세포의 게놈 유래(즉, 열충격, RUBISCO 및 저장 단백질 유전자) 또는 식물 바이러스 유래(즉, 바이러스 프로모터 또는 리더 서열) 프로모터 또는 인핸서가 벡터 내로 클론된다. 포유류 세포 시스템에서 포유류 유전자 유래 또는 포유류 바이러스 유래 프로모터가 바람직하다. Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열의 다수 카피를 포함한 세포주를 생성할 필요가 있는 경우 SV40 또는 EBV 기반 벡터가 적당한 선택성 마커와 함께 사용된다.
박테리아 시스템에서 많은 발현 벡터는 Gpr100 GPCR에 대한 용도에 따라 다르게 선택된다. 예를 들어 많은 양의 Gpr100 GPCR이 항체 유도를 위해 필요한 경우 용이하게 정제되는 융합 단백질의 높은 발현 수준을 지시하는 벡터가 사용된다. 이러한 벡터는 다기능성 E. coli 클로닝 및 Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열이 β-갈락토시다제의 아미노-말단 Met 및 하위 7개 잔기에 대한 서열에 인프레임으로 벡터 내로 라이게이트되어 하이브리드 단백질이 생성되는 BLUESCRIPT(Stratagene), pIN 벡터(Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509) 등과 같은 발현 벡터를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 pGEX 벡터(Promega, Madison, Wis.)는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외부 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용된다. 일반적으로 이러한 융합 단백질은 용해성이고 글루타티온-아가로스 비드에 대한 흡착 후 글루타티온 부재시 용출에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 이러한 시스템 내에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈 또는 XA 프로테아제 분열 사이트를 포함하도록 고안되어 클론된 목적 폴리펩타이드는 GST 모이어티로부터 유리될 수 있다.
효모 사카로마이세스 세레시비에(Saccharomyces cerevisiae)에서 알파 인자, 알코올 산화제 및 PGH와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함한 많은 벡터가 사용된다. Ausubel (상동) 및 Grant et al.(1987; Methods Enzymol. 153:516-544) 참조.
식물 발현 벡터가 사용되는 경우 Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열의 발현은 어떠한 수의 프로모터에 의해서도 작동된다. 예를 들어 CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터는 단독으로 또는 TMV로부터의 오메가 리더 서열과 결합하여 사용된다(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311). 대안으로 RUBISCO의 작은 서브유니트와 같은 식물 프로모터 또는 열충격 프로모터가 사용된다(Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; 및 Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). 이들 컨스트럭트는 직접적인 DNA 형질전환 또는 병원균-매개 트랜스펙션에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 기술은 일반적으로 많은 이용 가능한 문헌에 기술되어 있다(예를 들어 Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196 참조).
또한 곤충 시스템이 Gpr100 GPCR을 발현시키는데 사용된다. 예를 들어 이러한 시스템 내에서 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스(polyhedrosis) 바이러스(AcNPV)는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충 내 외부 유전자를 발현하는 벡터로서 사용된다. Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열은 폴리헤드린 유전자와 같은 바이러스의 비-필수 구역 내로 클론되고 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 놓인다. Gpr100 GPCR의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성이 되게 하고 외피 단백질이 결여된 재조합 바이러스를 생성한다. 재조합 바이러스는 예를 들어 Gpr100 GPCR이 발현되는 스포돕테라 프루기페르다 세포 또는 트리코플루시아 유충을 감염시키는데 사용된다(Engelhard, E. K. et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227).
포유류 숙주 세포에서 많은 바이러스-기반 발현 시스템이 사용된다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우 Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열은 후반 프로모터 3부 리더 서열로 구성된 아데노바이러스 전사/번역 복합체 내로 라이게이트된다. 감염된 숙주 세포 내에서 Gpr100 GPCR을 발현할 수 있는 생존 가능한 바이러스를 수득하기 위해 바이러스 게놈의 비-필수 E1 또는 E3 구역 내로의 삽입이 이용된다(Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). 더욱이 라우스 육종 바이러스(RSV) 인핸서와 같은 전사 인핸서는 포유류 숙주 세포 내 발현을 증가시키는데 사용된다.
따라서 예를 들어 Gpr100 수용체는 인간 진핵성 신장 293(HEK293) 세포 또는 점착성 CHO 세포에서 발현된다. 발현을 최대화하기 위해 일반적으로 모든 5' 및 3' 비번역 구역(UTR)이 pCDN 또는 pCDNA3 벡터 내로의 삽입 전에 수용체 cDNA로부터 제거된다. 세포는 리포펙션(lipofection)에 의해 개체 cDNA으로 트랜스펙트되고 400 mg/ml G418의 존재하에서 선택된다. 선택 3주 후 개체 클론이 채취되고 또다른 분석을 위해 확장된다. 벡터 단독으로 트랜스펙트된 HEK293 또는 CHO 세포는 음성 대조군으로 작용한다. 개체 수용체를 안정하게 발현하는 세포주를 분리하기 위해 일반적으로 약 24개 클론이 선택되고 노던 블럿 분석에 의해 분석된다. 수용체 mRNA는 일반적으로 분석된 G4-18-저항성 클론의 약 50%로 검출 가능하다.
또한 인간 인공 염색체(HAC)는 플라스미드 내에서 포함되고 발현될 수 있는 것보다 더 큰 DNA 단편을 전달하는데 이용된다. 약 6∼10 kb의 HAC가 구축되고 치료를 목적으로 통상의 전달 방법(리포솜, 다양이온 아미노 폴리머 또는 소포)을 통해 전달된다.
또한 특이적 개시 신호는 Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열의 더욱 효율적인 번역을 달성하는데 사용된다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열 및 그의 개시 코돈 및 업스트림 서열이 적당한 발현 벡터 내로 삽입되는 경우 추가적인 전사 또는 번역 조절 신호는 필요하지 않다. 그러나 코딩 서열 또는 그의 단편만이 삽입되는 경우 ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 번역 조절 신호가 제공되어야 한다. 더욱이 개시 코돈은 전체 삽입의 번역을 안전하게 하기 위해 정확한 리딩 프레임 내에 존재해야 한다. 외인성 번역 요소 및 개시 코돈은 다양한 기원이고 자연적 및 합성적인 것 모두가 된다. 발현의 효율은 문헌에서 기술된 바와 같이 사용된 특정 세포 시스템에 적당한 인핸서의 포함에 의해 증가된다(Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).
더욱이 숙주 세포주는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 바람직한 형태로 발현된 단백질을 처리하는 그의 능력에 대해 선택된다. 이러한 폴리펩타이드의 변형은 아세틸화, 카르복실화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 단백질의 "프리프로(prepro)" 형태를 분열시키는 후-번역 처리도 정확한 삽입, 폴딩(folding) 및/또는 기능을 촉진시키는데 사용된다. 후-번역 활성에 대한 특이적 세포 가동기구 및 특성적 메커니즘을 지닌 다른 숙주 세포(즉, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 및 WI38)는 American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, Md.)로부터 입수 가능하고 외부 단백질의 정확한 변형 및 처리를 안전하게 하도록 선택된다.
재조합 단백질의 장기간의 높은 수율 제조를 위해 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어 Gpr100 GPCR을 안정하게 발현하는 것이 가능한 세포주는 동일하거나 별개의 벡터 상에 복제의 바이러스 기원 및/또는 내인성 발현 요소 및 선택가능한 마커 유전자를 포함한 발현 벡터를 사용하여 형질전환될 수 있다. 벡터의 도입 후 세포는 선택성 배지로 교체되기 전 영양강화 배지 내에서 약 1∼2일간 생장된다. 선택 가능한 마커의 목적은 선택에 대한 저항성을 부여하는 것이고 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현시키는 세포의 생장 및 회수를 가능하게 한다. 안정하게 형질전환된 세포의 저항성 클론은 세포 형태에 적당한 조직 배양 기술을 이용하여 증식된다.
어떠한 수의 선택 시스템도 형질전환 세포주를 회수하는데 사용된다. 이들은 각각 tk- 또는 arp- 세포에서 사용될 수 있는 단순포진바이러스 티미딘 키나제 유전자(Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자(Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 항대사물질, 항생제 또는 제초제 저항성이 선택에 대한 근거로서 사용될 수 있다. 예를 들어 dhfr은 메토트렉세이트(methotrexate)(Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70)에 저항성을 부여하고; npt는 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418에 저항성을 부여하고(Colbere-Garapin, F. et al (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); als 또는 pat는 각각 클로르설푸론(chlorsulfuron) 및 포스피노트리신(phosphinotricin) 아세틸트랜스퍼라제에 대한 저항성을 부여한다(Murry, 상동). 예를 들어 세포가 트립토판 대신에 인돌을 사용하게 하는 trpB 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하게 하는 hisD와 같은 추가적인 선택 가능한 유전자가 기술되었다(Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). 최근 안토시아닌, β-글루쿠로니다제 및 그의 기질 GUS 및 루시페라제 및 그의 기질 루시페린과 같은 시각적으로 표시되는 마커의 이용이 대중적이 되고 있다. 이들 마커는 형질전환체를 확인할 뿐만 아니라 특이적 벡터 시스템에 의한 일시적 또는 안정한 단백질 발현의 양을 정량화하는데 사용될 수 있다(Rhodes, C. A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
마커 유전자 발현의 존재/부재가 목적 유전자도 존재함을 나타내더라도 유전자의 존재 및 발현은 확인될 필요가 있다. 예를 들어 Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열이 마커 유전자 서열 내에 삽입된 경우 Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열을 포함한 형질전환 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 대안으로, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절 하에 Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열과 일렬로 놓일 수 있다. 유도 또는 선택에 반응하는 마커 유전자의 발현은 일반적으로 일렬 유전자의 발현을 나타낸다.
대안으로 Gpr100 GPCR을 인코드하는 핵산 서열을 포함하고 Gpr100 GPCR을 발현하는 숙주 세포는 당업자에게 알려진 다양한 처리에 의해 확인된다. 이들 처리는 핵산 또는 단백질 서열의 검출 및/또는 정량화에 대한 멤브레인, 용액 또는 칩 기반 기술을 포함한 DNA--DNA 또는 DNA-RNA 하이브리디제이션 및 단백질 생물학적 검정 또는 면역측정 기술을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
Gpr100 GPCR을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재는 프로브 또는 Gpr100 GPCR을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드의 단편 또는 단편들을 이용한 DNA--DNA 또는 DNA-RNA 하이브리디제이션 또는 증폭에 의해 검출될 수 있다. 핵산 증폭 기반 분석은 Gpr100 GPCR을 인코드하는 DNA 또는 RNA를 포함한 형질전환체를 검출하기 위한 Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열을 기반으로 하는 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고머의 이용을 포함한다.
단백질에 대해 특이적인 폴리클론 또는 단일클론 항체를 사용한 Gpr100 GPCR의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜이 당분야에 알려져 있다. 이러한 기술의 예는 효소면역측정법(ELISA), 방사면역측정법(RIA) 및 형광표지세포세포분리(FACS)를 포함한다. Gpr100 GPCR 상에 2개의 비-간섭 에피토프에 반응성인 단일클론 항체를 이용한 2-사이트 단일클론-기반 면역측정법이 바람직하나 경합성결합분석법도 이용된다. 이들 및 다른 분석은 예를 들어 Hampton, R. et al.(1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, Section IV, APS Press, St Paul, Minn.) 및 Maddox, D. E. et al.(1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)과 같이 당분야에 잘 알려져 있다.
다양한 표지 및 컨쥬게이션 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 이용된다. Gpr100 GPCR을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드에 관련된 서열을 검출하기 위한 표지된 하이브리디제이션 또는 PCR 프로브의 제조 방법은 올리고표지, 틈(nick) 번역, 말단-표지 또는 표지된 뉴클레오타이드를 사용한 PCR 증폭을 포함한다. 대안으로 Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열 또는 그의 단편은 mRNA 프로브의 제조용 벡터 내로 클론된다. 이러한 벡터는 당분야에 알려져 있고 통상적으로 구입 가능하고 T7, T3 또는 SP6와 같은 적당한 RNA 중합효소 및 표지된 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 시험관 내에서 RNA 프로브를 합성하는데 사용된다. 이들 처리는 Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo, Mich.), GE Healthcare(UK) 및 U.S. Biochemical Corp.(Cleveland, Ohio)에 의해 구입된 것과 같은 다양한 통상적으로 구입 가능한 키트를 사용하여 수행된다. 검출에 용이하게 이용되는 적당한 수용체 분자 또는 표지는 방사선핵종, 효소, 형광제, 화학발광제 또는 핵원체뿐만 아니라 기질, 보조인자, 억제제, 자기 입자 등을 포함한다.
Gpr100 GPCR을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양액으로부터의 단백질의 발현 및 회수에 적당한 조건 하에서 배양된다. 형질전환 세포에 의해 생성된 단백질은 세포막에 위치하고 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 다르게 세포내적으로 분비되거나 포함된다. 당업자에게 이해되는 바와 같이 Gpr100 GPCR을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터는 원핵성 또는 진핵성 세포막을 통해 Gpr100 GPCR의 분비를 지시하는 신호 서열을 포함하도록 고안된다. 다른 구성은 Gpr100 GPCR을 인코드하는 서열을 용해성 단백질의 정제를 촉진시키는 폴리펩타이드 도메인을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열에 결합시키는데 이용된다. 이러한 정제 촉진 도메인은 고정된 금속 상의 정제를 가능하게 하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트 펩타이드, 고정된 면역글로불린 상의 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 연장/친화성 정제 시스템(Immunex Corp., Seattle, Wash)에 사용되는 도메인을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 정제 도메인과 Gpr100 GPCR 인코딩 서열 사이에 인자 XA 또는 엔테로키나제(Invitrogen, San Diego, Calif.)에 특이적인 것과 같은 분열가능 링커 서열을 포함시키는 것은 정제를 촉진시키는데 이용된다. 이러한 발현 벡터는 타이오레독신 또는 엔테로키나제 분열 사이트 바로 앞에 Gpr100 및 6개 히스티딘 잔기를 인코드하는 핵산을 포함한 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMIAC; described in Porath, J. et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281) 상에서의 정제를 촉진시키고, 엔테로키나제 분열 사이트는 융합 단백질로부터 Gpr100 GPCR의 정제 방법을 제공한다. 융합 단백질을 포함한 벡터의 논의는 Kroll, D. J. et al.(1993; DNA Cell Biol. 12:441-453)에 제공되어 있다.
Gpr100 GPCR의 단편은 재조합 제조뿐만 아니라 고형상 기술을 이용한 직접적 펩타이드 합성에 의해 제조된다(Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행된다. 자동화된 합성은 예를 들어 Applied Biosystems 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer)를 이용하여 달성된다. Gpr100 GPCR의 다양한 단편은 개별적으로 합성된 후 결합되어 전체 길이 분자를 생성한다.
생체센서
Gpr100 폴리펩타이드, 핵산, 프로브, 항체, 발현 벡터 및 리간드는 생체센서로서(또는 그의 제조에) 유용하다.
Aizawa (1988), Anal. Chem. Symp. 17: 683에 따라 생체센서는 예를 들어 고정된 항체 또는 Gpr100 G-단백질 결합 수용체와 같은 수용체를 지닌 선택층과 같은 분자 인식용 수용체 및 측정된 수치를 전송하기 위한 변환기의 특정한 결합으로 한정된다. 일군의 이러한 생체센서는 수용체의 주변 매체와의 상호작용에 의한 표면층의 광학적 성질에 기인한 변화를 감지할 것이다. 이러한 기술 중에서 특히 엘립소-메트리(ellipso-metry) 및 표면 플라스몬 공명이 논의된다. Gpr100을 도입시킨 생체센서는 Gpr100 리간드의 존재 또는 수치를 검출하는데 사용된다. 이러한 생체센서의 구축은 당분야에 잘 알려져 있다.
따라서 Gpr100 수용체를 발현하는 세포주는 [3H]이노시톨 포스페이트 또는 다른 2차 메신저의 수용체-촉진 형성을 통한 ATP와 같은 리간드의 검출을 위한 수용체 시스템으로서 사용된다(Watt et al., 1998, J Biol Chem May 29;273(22):14053-8). 또한 수용체-리간드 생체센서는 Hoffman et al., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A Oct 10;97(21):11215-20에 기술되어 있다. 또한 Gpr100을 포함한 광학적 및 다른 생체센서는 예를 들어 Figler et al, 1997, Biochemistry Dec 23;36(51):16288-99 및 Sarrio et al., 2000, Mol Cell Biol 2000 Jul;20(14):5164-74)에 기술된 바와 같이 G-단백질 및 다른 단백질과의 상호작용의 수준 또는 존재를 검출하는데 사용된다. 생체센서용 센서 유니트는 예를 들어 미국특허 제5,492,840호에 기술되어 있다.
선별 분석
천연 또는 재조합에 관계없이 상동체, 변이체 및 유도체를 포함한 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드는 수용체에 결합하고 Gpr100의 활성화를 활성화시키거나(작용제) 억제하는(길항제 또는 차단제) 화합물의 선별 방법에 사용된다. 따라서 이러한 폴리펩타이드는 예를 들어 세포, 무-세포 제제, 화학적 라이브러리 및 천연 생성물 혼합물 내의 소분자 기질 및 리간드의 결합을 평가하는데 사용된다. 이들 기질 및 리간드는 천연 기질 또는 리간드이거나 구조적 또는 기능적 모방물질이다. Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991) 참조.
Gpr100 GPCR 폴리펩타이드는 많은 병리학을 포함한 많은 생물학적 기능에 중요하다. 따라서 한편으로는 Gpr100 GPCR 자극하고 다른 한편으로는 Gpr100 GPCPR의 기능을 억제할 수 있는 화합물 및 약물을 발견하는 것이 바람직하다. 일반적으로 작용제 및 길항제는 Gpr100 관련 질환과 같은 이상에 대한 치료 또는 예방 목적으로 사용된다.
Gpr100 GPCR 단백질과 상호작용하는 것이 가능한 후보 화합물의 추론적 고안은 폴리펩타이드의 분자 형태의 구조적 연구에 기반한다. 어떤 사이트가 특이적인 다른 단백질과 상호작용하는 여부를 측정하는 한 가지 방법은 물리적 구조 측정 즉, X-선 결정학 또는 2차원 NMR 기술이다. 이들은 어떤 아미노산 잔기가 분자적 접촉 구역을 형성하는지에 대한 지침을 제공할 것이다. 단백질 구조적 측정의 상세한 설명을 위해 Blundell and Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York 참조.
추론적 고안의 대안으로 일반적으로 표면 상에 Gpr100 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 적당한 세포를 생성하는 단계를 포함한 선별 절차를 이용하는 것이다. 이러한 세포는 동물, 효모, 초파리(Drosophila) 또는 E. coli 유래의 세포를 포함한다. 이후 수용체를 발현하는 세포(또는 발현된 단백질을 함유하는 세포막)는 결합 또는 기능적 반응의 자극 또는 억제를 관찰하기 위해 시험 화합물에 접촉된다. 예를 들어 하기 상세히 설명된 바와 같이 제노푸스 난모세포는 Gpr100 mRNA 또는 폴리펩타이드이 주입되고 시험 화합물로의 노출에 의해 유도된 전류는 전압 클램프를 사용하여 측정된다.
더욱이 마이크로피지오메트릭 에세이(microphysiometric assay)가 Gpr100 수용체 활성을 분석하는데 이용된다. 다양한 2차 메신터 시스템의 활성화는 세포로부터의 소량의 산의 배출을 유발한다. 형성된 산은 크게는 세포내 신호전달 과정에 연료를 공급하는데 필요한 증가된 대사 활성의 결과이다. 세포 주변의 배지 내 pH 변화는 매우 적으나 예를 들어 CYTOSENSOR 마이크로피지오미터(Molecular Devices Ltd., Menlo Park, Calif.)에 의해 검출 가능하다. 따라서 CYTOSENSOR는 Gpr100 G-단백질 결합 수용체와 같은 세포내 신호전달 경로를 이용하는 에너지에 결합되는 수용체의 활성화를 측정하는 것이 가능하다.
Gpr100 수용체로 각각의 후보 화합물을 개별적으로 시험하는 대신 후보 리간드의 라이브러리 또는 뱅크가 유리하게 제조되고 선별된다. 따라서 예를 들어 200개 이상의 추정 리간드의 뱅크가 선별을 위해 수집되었다. 상기 뱅크는 인간 7개 막횡단(7TM) 수용체; 인간 7TM 수용체에 대한 추정 작용제인 자연 발생적 화합물, 포유류 대응물이 아직 확인되지 않은 비-포유류 생물학적 활성 펩타이드; 및 자연상태에서 발견되지 않으나 알려지지 않은 천연 리간드로 7TM 수용체를 활성화시키는 화합물을 포함한다. 이러한 뱅크는 다른 문헌에서 더욱 상세히 설명된 바와 같이 기능적 분석(즉 칼슘, cAMP, 마이크로피지오미터, 난모세포 전기생리학 등)뿐만 아니라 결합 분석을 이용하여 알려진 리간드에 대한 수용체를 선별하는데 이용된다. 그러나 아직 동족 활성화 리간드(작용제) 또는 불활성화 리간드(길항제)가 없는 것으로 남아 있는 많은 포유류 수용체가 존재한다. 따라서 이들 수용체에 대한 활성화 리간드는 현재 확인된 리간드 뱅크 내에 포함되지 않는다. 따라서 Gpr100 수용체도 천연 리간드를 확인하기 위해 조직 추출물에 대해 기능적으로 선별된다(칼슘, cAMP, 마이크로피지오미터, 난모세포 전기생리학 등을 이용, 기능적 선별). 양성 기능적 반응을 생성하는 추출물은 활성화 리간드가 분리되고 확인될 때까지 여기서 기술된 바와 같이 분석되는 분획으로 연속적으로 하위분획화될 수 있다.
HEK 293 세포 내에서 발현되는 7TM 수용체는 PLC의 활성화 및 칼슘 동원 및/또는 cAMP 자극 또는 억제에 기능적으로 결합된 것으로 나타났다. 따라서 하나의 선별 기술은 수용체 활성화에 의해 유발된 세포외 pH 또는 세포내 칼슘 변화를 측정하는 시스템 내 Gpr100 GPCR 수용체(예를 들어 트랜스펙트된 제노푸스 난모세포 CHO 또는 HEK293 세포)를 발현하는 세포의 이용을 포함한다. 이러한 기술에서 화합물은 Gpr100 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 세포와 접촉된다. 이후 2차 메신저 반응 즉, 신호 전달, pH 변화 또는 칼슘 수치 변화가 잠재적인 화합물이 수용체를 활성화시키거나 억제시키는지 여부를 결정하기 위해 측정된다.
이러한 실험에서 수용체-트랜스펙트된 세포 또는 벡터 대조군 세포 내 HEK 293 세포의 기초 칼슘 수치는 100 nM 내지 200 nM의 정상으로 관찰된다. Gpr100 GPCR 또는 재조합 Gpr100 GPCR을 발현하는 HEK 293 세포는 fura 2가 로드되고 1일 내에 150개 이상의 선택된 리간드 또는 조직/세포가 작용제 유도된 칼슘 동원이 평가된다. 유사하게는 Gpr100 GPCR 또는 재조합 Gpr100 GPCR을 발현하는 HEK 293 세포는 표준 cAMP 정량 분석을 이용하여 cAMP 생성의 자극 또는 억제가 평가된다. 칼슘 과도현상 또는 cAMP 변동을 나타내는 작용제는 반응이 수용체를 발현하는 트랜스펙트된 세포에서 유일한 것인지 여부를 측정하기 위해 벡터 대조군 세포에서 시험된다.
또다른 방법은 Gpr100 수용체-매개 cAMP의 억제 또는 자극 및/또는 아데닐레이트 사이클라제 축적의 측정에 의한 수용체 억제제에 대한 선별을 포함한다. 이러한 방법은 Gpr100 수용체로 진핵성 세포를 트랜스펙트시켜 세포 표면 상에서 수용체를 발현시키는 단계를 포함한다. 이후 세포는 수용기의 존재하에 잠재적인 길항제에 노출된다. 이후 cAMP 축적의 양이 측정된다. 잠재적인 길항제가 수용체에 결합하면 수용체 결합을 억제하게 되고 수용체-매개 cAMP의 수치 또는 아데닐레이트 사이클라제, 활성이 감소되거나 증가될 것이다.
바람직한 실시태양에서 선별은 Gpr100의 작용제 및 길항제를 선별하기 위해 세포내 칼슘 농도 변화의 검출을 이용한다. 특히 본 발명자는 Gpr100의 길항제가 적당하게 트랜스펙트된 세포의 리간드 유도된 세포내 칼슘 분비를 감소시키거나 저하시키거나 차단하는 방법을 개시한다. 바람직하게는 세포내 칼슘 수치 증가는 Gpr100의 길항제의 존재시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상까지 감소된다. 바람직하게는 세포내 칼슘 분비는 Gpr100 길항제의 존재시 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 25 mM, 35 mM, 45 mM, 60 mM, 70 mM 이상까지 저하된다.
또한 본 발명자는 Gpr100의 작용제가 적당하게 트랜스펙트된 세포의 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 방법을 개시한다. 바람직하게는 세포내 칼슘 농도는 Gpr100의 작용제의 존재시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상까지 증가된다. 바람직하게는 세포내 칼슘 농도는 Gpr100의 작용제의 존재시 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 25 mM, 35 mM, 45 mM, 60 mM, 70 mM 이상까지 증가된다.
Gpr100 수용체의 작용제 또는 길항제를 검출하기 위한 또다른 방법은 참고문헌에 포함된 미국특허 제5,482,835호에 기술된 효모 기반 기술이다.
후보 화합물이 단백질, 특히 항체 또는 펩타이드인 경우 후보 화합물의 라이브러리는 파지 디스플레이 기술을 이용하여 선별된다. 파지 디스플레이는 재조합 박테리오파지를 이용하는 분자적 선별 프로토콜이다. 본 기술은 후보 화합물의 라이브러리로부터의 하나의 화합물을 인코드하는 유전자로 박테리오파지를 형질전환시켜 각각의 파지 또는 파지미드가 특정 후보 화합물을 발현하게 하는 단계를 포함한다. 형질전환된 박테리오파지(바람직하게는 고형 지지대에 고정된)는 적당한 후보 화합물을 발현하고 그의 파지 외부 상에 이를 디스플레이한다. Gpr100 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 결합하는 것이 가능한 특정 후보 화합물은 친화성 상호작용에 기반한 선택 전략에 의해 강화된다. 이후 성공적인 후보 약제가 특성화된다. 파지 디스플레이는 표준 친화성 리간드 선별 기술보다 유리하다. 파지 표면은 그의 자연 발생적 입체형태와 더욱 밀접하게 유사한 3차원 입체형태로 후보 약제를 디스플레이한다. 이는 선별 목적에 있어서 더욱 특이적이고 더욱 높은 친화성 결합을 가능하게 한다.
화합물 라이브러리를 선별하는 또다른 방법은 화합물 라이브러리를 발현하는 재조합 DNA 분자로 안정하게 형질전환된 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포를 이용한다. 이러한 생존 가능하거나 고정된 형태의 세포는 표준 결합-파트너 분석에 사용될 수 있다. 세포 반응을 검출하는 민감성 반응을 기술한 Parce et al. (1989) Science 246:243-247; and Owicki et al. (1990) Proc. Natl Acad. Sci. USA 87;4007-4011을 참조. 화합물 라이브러리를 발현하는 세포가 125I-항체와 같은 Gpr100 폴리펩타이드에 결합하는 것으로 알려진 표지된 항체 및 결합 조성물에 대한 결합 친화력이 측정된 후보 화합물과 같은 시험 표본과 접촉되거나 인큐베이트되는 경우 경합 분석은 특히 유용하다. 이후 상기 폴리펩타이드에 대해 결합되고 자유 표지된 결합 파트너가 분리되어 결합 정도를 평가한다. 결합된 시험 표본의 양은 폴리펩타이드에 결합한 표지된 항체의 양에 역비례한다.
많은 기술 중 어느 하나도 결합 정도를 평가하기 위해 자유 결합 파트너로부터 결합된 것을 분리시키는데 이용될 수 있다. 이러한 분리 단계는 일반적으로 필터로의 부착 후 세척, 플라스틱으로의 부착 후 세척 또는 세포막의 원심분리와 같은 처리를 포함한다.
또다른 접근은 예를 들어 형질전환된 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포로부터 추출된 용해되고 정제되지 않거나 용해되고 정제된 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 사용하는 것이다. 이는 증가된 특이성, 자동화 능력 및 높은 약물 시험 작업 처리량의 이점으로 "분자적" 결합 분석을 가능하게 한다.
후보 화합물 선별을 위한 또다른 기술은 적당한 즉, Gpr100 폴리펩타이드에 대한 결합 친화성을 지닌 신규한 화합물에 대한 높은 처리 작업량의 선별을 제공하는 접근을 포함하고, 1984년 9월 13일 공보된 국제특허출원 WO 84/03564(Commonwealth Serum Labs.)에 상세히 기술되어 있다. 먼저, 많은 다른 작은 펩타이드 시험 화합물이 고형 기질 즉, 플라스틱 핀 또는 일부 다른 적당한 표면 상에서 합성된다; Fodor et al.(1991) 참조. 이후 모든 핀은 합성된 Gpr100 폴리펩타이드와 반응되고 세척된다. 다음 단계는 결합된 폴리펩타이드를 검출하는 것을 포함한다. 따라서 상기 폴리펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 화합물이 확인될 것이다.
리간드 결합 분석은 약물학의 직접적인 확인 방법을 제공하고 높은 작업 처리량 포맷으로 개조 가능하다. 정제된 리간드는 결합 조사를 위해 높은 특이적 활성(50∼2000 Ci/mmol)으로 방사선표지된다. 이후 방사선표지 과정이 그의 타겟에 대한 리간드 활성을 감소시키지 않도록 측정이 이루어진다. 완충액, 이온, pH 및 뉴클레오타이드와 같은 다른 조절제에 대한 분석 조건은 멤브레인과 전체 세포 수용체 근원에 대한 잡음 비율에 대한 작업 가능한 신호를 수립하도록 최적화된다. 이들 분석을 위해 특정한 결합은 총 결합 방사성에서 과도한 표지되지 않은 경합 리간드의 존재시 측정된 방사성을 감하는 것으로 한정된다. 가능한 경우 하나 이상의 경합 리간드가 잔여 비특이적 결합을 한정하는데 사용된다.
분석은 수용체를 지닌 세포에 대한 부착이 후보 화합물과 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 표지에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 후보 화합물의 간단한 결합 시험이거나 다른 분석의 경우 표지된 경쟁자와 경합시키는 단계를 포함한다. 또한 이들 분석은 그의 표면에서 타겟을 지닌 세포에 적당한 검출 시스템을 이용하여 후보 화합물이 타겟의 활성에 의해 생성된 신호를 유발하는지 여부를 시험한다. 활성화 억제제는 일반적으로 알려진 길항제의 존재시 분석되고 후보 화합물의 존재시 작용제에 의한 활성화의 효과가 관찰된다.
또한 분석은 후보 화합물을 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드를 포함한 용액과 혼합하여 혼합물을 형성시키는 단계, 혼합물 내의 Gpr100 GPCR 활성을 측정하는 단계 및 혼합물의 Gpr100 GPCR 활성을 표준물질과 비교하는 단계를 간단하게 포함한다.
또한 Gpr100 GPCR cDNA, 단백질, 단백질에 대한 항체는 세포 내 Gpr100 GPCR mRNA 및 단백질의 생성 상의 첨가된 화합물의 효과를 검출하는 방법을 형성하는데 사용된다. 예를 들어 당분야에 알려진 표분 방법에 의해 단일클론 및 폴리클론 항체를 이용하여 Gpr100 GPCR 단백질의 분비 수치 또는 세포 결합 수치를 측정하기 위해 ELISA가 구축되고, 이는 적당하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 Gpr100 GPCR의 생성을 억제하거나 증가시키는 약제(또한 각각 길항제 또는 작용제로 명명됨)를 발견하는데 이용될 수 있다. 선별 분석을 수행하기 위한 표준 방법은 당분야에서 잘 이해된다.
잠재적 Gpr100 GPCR 길항제의 예는 항체 또는 일부의 경우 퓨린 및 퓨린 아날로그를 포함한 뉴클레오타이드 및 그의 아날로그, Gpr100 GPCR의 리간드와 밀접하게 관련된 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질 즉, 리간드의 단편 또는 수용체에 결합하나 반응을 유도하지 않아서 수용체의 활성이 방지되는 소분자를 포함한다.
따라서 본 발명자는 Gpr100 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 화합물을 제공한다.
"화합물"이라는 용어는 생물학적 대분자(즉, 핵산, 단백질, 비-펩타이드 또는 유기 분자)와 같은 화학적 화합물(자연 발생적 또는 합성) 또는 박테리아, 식물, 진균 또는 동물(특히 포유류)의 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로부터 제조된 추출물 또는 무기 원소 또는 분자를 나타낸다. 바람직하게는 화합물은 항체이다.
이러한 선별이 수행되는데 필요한 물질은 선별 키트로 포장된다. 이러한 선별 키트는 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드 또는 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드의 생성을 감소시키거나 증가시키는 화합물에 대한 작용제, 길항제, 리간드, 수용체, 기질, 효소 등을 확인하는데 유용하다. 선별 키트는: (a) Gpr100 GPCR 폴리펩타이드; (b) Gpr100 GPCR 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 세포; (c) Gpr100 GPCR 폴리펩타이드를 발현하는 세포막; 또는 (d) Gpr100 GPCR 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함한다. 선별 키트는 선택적으로는 사용 지침을 포함한다.
형질전환 동물
또한 본 발명자는 정상적인 발현 수준과 비교시 정상적이거나 증가되거나 감소된 수준으로 천연 또는 재조합 Gpr100 GPCR 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 발현하는 것이 가능한 형질전환 동물을 개시한다. 바람직하게는 이러한 형질전환 동물은 돼지, 양 또는 설치류와 같은 비-인간 포유류이다. 가장 바람직하게는 형질전환 동물은 마우스 또는 래트이다. 이러한 형질전환 동물은 Gpr100 GPCR의 작용제 및/또는 길항제를 확인할 뿐만 아니라 생체 내 질환의 치료제로서 그의 효능을 시험하는 선별 절차에 이용된다.
예를 들어 Gpr100 GPCR의 생성에 결함이 있도록 설계된 형질전환 동물은 Gpr100 GPCR의 작용제 및/또는 길항제를 확인하는 분석에 이용된다. 한가지 분석은 Gpr100 GPCR 수용체의 부재시 생리적 반응을 생성하는지 여부를 측정하기 위해 잠재적 약물(후보 리간드 또는 화합물)을 평가하도록 고안된다. 이는 상기 논의된 바와 같이 형질전환 동물에 약물을 투여한 후 특정 반응에 대해 동물을 분석함으로서 달성된다. 어떠한 생리적 파라미터도 이러한 분석에서 측정될 수 있으나 바람직한 반응은 하나 이상의 하기를 포함한다: 질환 저항성의 변화; 변경된 염증 반응; 변경된 종양 감수성; 혈압 변화; 신혈관생성; 식이 행동 변화; 체중 변화; 골밀도 변화; 체온 변화; 인슐린 분비; 식샘자극호르몬 분비; 비강 및 기관지 분비; 혈관수축; 기억 상실; 불안; 변화된 불안 상태; 반사감퇴 또는 반사이상항진; 통증 또는 스트레스 반응.
Gpr100 넉아웃 동물 유래의 조직은 잠재적 약물(후보 리간드 또는 화합물)이 Gpr100 수용체에 결합하는지 여부를 측정하기 위한 결합 분석에 사용된다. 이러한 분석은 Gpr100 수용체 제조시 결함이 있도록 설계된 형질전환 동물로부터 첫 번째 수용체 제제를 수득하고 어떠한 확인된 Gpr100 리간드 또는 화합물에 결합하는 것으로 알려진 원료로부터 두 번째 수용체 제제를 수득함으로서 수행될 수 있다. 일반적으로 첫 번째 및 두 번째 수용체 제제는 수득되는 원료를 제외하고 모든 면에서 유사할 것이다. 예를 들어 형질전환 동물로부터의 뇌 조직(상기 및 하기 기술된 바와 같은)이 분석에 사용되는 경우 정상(야생형) 동물로부터의 비교 가능한 뇌 조직은 두 번째 수용체 제제의 원료로서 사용된다. 각각의 수용체 제제는 단독 및 후보 리간드 또는 화합물의 존재시 모두에 대해 Gpr100 수용체에 결합하는 것으로 알려진 리간드와 인큐베이트된다. 바람직하게는 후보 리간드 또는 화합물은 일부 다른 농도에서 조사될 것이다.
알려진 리간드에 의한 결합이 시험 화합물에 의해 표시되는 정도는 첫 번째 및 두 번째 수용체 제제 모두에 대해 측정된다. 형질전환 동물 유래의 조직은 분석에 직접 사용되거나 조직은 그 자체로 분석에 사용되는 막 또는 막 단백질을 분리하도록 처리된다. 바람직한 형질전환 동물은 마우스이다. 리간드는 결합 분석에 적합한 방법을 이용하여 표지된다. 이는 방사선, 효소, 형광 또는 화학발광 표지(뿐만 아니라 상기 더욱 상세히 설명된 다른 표지 기술)를 포함하나 한정적인 것은 아니다.
더욱이 Gpr100 GPCR 수용체의 길항제는 후보 화합물 등을 기능적 Gpr100을 발현하는 동물 및 Gpr100 수용체 기능의 감소되거나 제거된 발현과 관련된 표현형적 특성을 나타내는 것으로 확인된 동물에 투여함으로서 확인된다.
비-인간 형질전환 동물을 생성하는 상세한 방법은 하기에 더욱 상세히 설명되어 있다. 형질전환 유전자 컨스트럭트는 동물의 생식계 내로 도입되어 형질전환 포유류를 생성할 수 있다. 예를 들어 하나 또는 일부의 컨스트럭트 카피가 표준 형질전환 기술에 의해 포유류 배아의 게놈 내로 도입된다.
예시적 실시태양에서 형질전환 비-인간 동물은 비-인간 동물의 생식계 내로 트랜스유전자를 도입시킴으로서 생성된다. 다양한 발달 단계의 배아성 타겟 세포는 트랜스유전자를 도입하는데 사용될 수 있다. 배아성 타겟 세포의 발달 단계에 따라 다른 방법이 이용된다. 동물의 특정 계통(들)이 일반적인 우수한 건강, 우수한 배아 산출량, 우수한 배아내 전핵 가시도 및 우수한 재생 적합성에 대해 선택된다. 더욱이 일배체형은 유의적인 인자이다.
트랜스유전자의 배아 내로의 도입은 예를 들어 현미주사, 일렉트로포레이션 또는 리포펙션과 같은 당분야에 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어 하나 이상의 컨스트럭트 카피가 발달 포유류(들)의 세포 내에서 유지되게 하기 위해 포유류 수정란의 전핵 내로 컨스트럭트의 현미주사에 의해 Gpr100 수용체 트랜스유전자가 포유류 내로 도입될 수 있다. 수정란 내로 트랜스유전자 컨스트럭트의 도입 후 수정란은 다양한 시간 동안 시험관 내에서 인큐베이트되거나 대리 숙주 내로 재이식되거나 또는 이 둘 모두가 수행된다. 시험관 내의 성숙을 위한 인큐베이션도 수행된다. 일반적인 하나의 방법에서 종에 따라 다르게 약 1∼7일간 시험관 내에서 배아를 인큐베이트한 후 대리 숙주 내로 이를 재이식한다.
형질전환적으로 조작된 배아의 자손은 조직 세그먼트의 서던 블럿 분석에 의해 컨스트럭트의 존재에 대해 시험되었다. 하나 이상의 외인성 클론된 컨스트럭트 카피가 이러한 형질전환 배아의 게놈 내로 안정하게 도입되어 유지되는 경우 형질전환적으로 첨가된 컨스트럭트를 지닌 영구적 형질전환 포유류 계통을 수립하는 것이 가능하다.
형질전환적으로 변화된 포유류 자손은 자손의 게놈 내로의 컨스트럭트 도입에 대해 출생 후 분석될 수 있다. 바람직하게는 이러한 분석은 자손으로부터의 염색체 물질 상에서 원하는 재조합 단백질 생성물 또는 그의 세그먼트를 코드하는 DNA 서열에 상응하는 프로브를 하이브리다이즈함으로서 달성된다. 그의 게놈 내에 적어도 하나 이상의 컨스트럭트 카피를 포함한 것으로 나타난 이들 포유류 자손은 생장하여 성숙된다.
본 출원서의 목적으로, 접합자는 완전한 생물체 내로 발달하는 것이 가능한 이배체 세포의 형태이다. 일반적으로 접합자는 생식세포 또는 생식세포들로부터의 2개의 반수체 핵의 융합에 의해 자연적으로 또는 인공적으로 형성된 핵을 포함한 난으로 구성될 것이다. 따라서 생식세포 핵은 자연적으로 적합한 것 즉, 분화를 착수하고 기능적 생물체로 발달하는 것이 가능한 생존 가능한 접합자를 유발하는 것이어야 한다. 일반적으로 정배수체 접합자가 바람직하다. 이수배수체 접합자가 수득되는 경우 염색체 수는 기원된 생식세포 생물체의 정배수체 수에 있어서 하나 이상까지 차이가 나지 않아야 한다.
유사한 생물학적 고찰에 더하여 물리적인 고찰도 접합자의 핵 또는 접합자 핵의 일부를 형성하는 유전 물질에 첨가될 수 있는 외인성 유전 물질의 양(즉, 부피)을 제어한다. 어떠한 유전 물질도 제거되지 않은 경우 첨가될 수 있는 외인성 유전 물질의 양은 물리적으로 분열되지 않고 흡수되는 양으로 제한된다. 일반적으로 삽입되는 외인성 유전 물질의 부피는 약 10 피코리터를 초과하지 않을 것이다. 첨가의 물리적 효과는 접합자의 생존율을 물리적으로 분열시키는 정도로 크지 않아야 한다. 수득되는 접합자의 외인성 유전 물질을 포함한 유전 물질은 접합자의 기능적 생물체로의 분화 및 발달을 생물학적으로 개시하고 유지시키는 것이 가능하여야 하기 때문에 DNA 서열의 수 및 종류의 생물학적 제한 특정한 접합자 및 외인성 유전 물질의 기능에 따라 달라질 것이고 당업자에게 용이하게 명백화될 것이다.
접합자에 첨가되는 트랜스유전자 컨스트럭트의 카피 수는 첨가되는 외인성 유전 물질의 총량에 따라 달라지고 유전적 형질전환을 발생하게 할 수 있는 양이 될 것이다. 이론적으로는 하나의 카피만이 필요하다; 그러나 일반적으로 하나의 카피가 기능적임을 보증하기 위해 예를 들어 트랜스유전자 컨스트럭트의 1,000∼20,000개 카피와 같은 많은 카피가 사용된다. 외인성 DNA 서열의 표현형적 발현을 증가시키기 위해 삽입된 외인성 DNA 서열 각각의 하나 이상의 기능성 카피를 지니는 것이 종종 유리하다.
세포, 핵막 또는 다른 존재하는 세포성 또는 유전성 구조물을 파괴하지 않는 한 외인성 유전 물질의 핵 유전 물질 내로의 첨가를 가능하게 하는 어떠한 기술도 이용될 수 있다. 외인성 유전 물질은 현미주사에 의해 핵 유전 물질 내로 우선적으로 삽입된다. 세포 및 세포 구조물의 현미주사는 알려져 있고 당분야에 이용된다.
재이식은 표준 방법을 이용하여 달성된다. 일반적으로 대리 숙주가 마취되고 배아가 난관 내로 삽입된다. 특정 숙주 내로 이식된 배아의 수는 종에 따라 달라질 것이나 일반적으로 종이 자연적으로 생산하는 자손의 수에 비교 가능할 것이다.
대리 숙주의 형질전환 자손은 적당한 방법에 의해 트랜스유전자의 존재 및/또는 발현에 대해 선별된다. 선별은 종종 적어도 일부의 트랜스유전자에 상보적인 프로브를 이용한 서던 블럿 또는 노던 블럿 분석에 의해 달성된다. 트랜스유전자에 의해 인코드되는 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석이 트랜스유전자 생성물의 존재에 대한 대안적 또는 추가적 선별 방법으로 이용된다. 일반적으로 DNA는 꼬리 조직으로부터 준비되고 트랜스유전자에 대한 서던 블럿 분석 또는 PCR에 의해 분석된다. 대안으로 어떠한 조직 또는 세포 형태도 본 분석에 사용되나 최대 수준으로 트랜스유전자를 발현하는 것으로 판단되는 조직 또는 세포가 서던 분석 또는 PCR을 이용하여 트랜스유전자의 존재 및 발현에 대해 시험된다.
트랜스유전자의 존재를 평가하는 대안적 또는 추가적 방법은 효소 및/또는 면역 분석과 같은 적당한 생화학적 분석, 특정 마커 또는 효소 활성에 대한 조직학적 염색, 유속 세포분석 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 혈액 분석이 혈액 내 트랜스유전자 생성물의 존재를 검출할 뿐만 아니라 다양한 형태의 혈액 세포의 수준 및 다른 혈액 구성물 상의 트랜스유전자의 효과를 조사하는데 유용하다.
형질전환 동물의 자손은 적당한 파트너와의 형질전환 동물의 교미 또는 형질전환 동물로부터 수득된 난자 및/또는 정자의 시험관 내 수정에 의해 수득된다. 파트너와의 교미가 수행되는 경우 파트너는 형질전환 및/또는 넉아웃이거나 그렇지않고; 형질전환인 경우 동일하거나 다른 트랜스유전자 또는 이 둘 모두를 포함한다. 대안으로 파트너는 모계이다. 시험관 내 수정이 이용되는 경우 수정된 배아는 대리 숙주 내로 이식되거나 시험관 내에서 인큐베이트되거나 또는 이 둘 모두가 수행된다. 이들 방법을 이용하여 자손은 상기 기술된 방법 또는 다른 적당한 방법을 이용하여 트랜스유전자의 존재에 대해 조사된다.
본 출원서에 따라 생성된 형질전환 동물은 외인성 유전 물질을 포함할 것이다. 상기 나타난 바와 같이 외인성 유전 물질은 특정한 실시태양에서 Gpr100 GPCR 수용체의 생성을 유발하는 DNA 서열이다. 또한 이러한 실시태양에서 서열은 바람직하게는 특정한 형태의 세포 내에서 트랜스유전자 생성물의 발현을 가능하게 하는 전사 조절 요소 즉, 프로모터에 부착될 것이다.
또한 레트로바이러스 감염이 비-인간 동물 내로 트랜스유전자를 도입시키는데 이용될 수 있다. 발달하는 비-인간 배아는 시험관 내에서 배반포 단계로 배양될 수 있다. 이러한 기간 동안 할구는 레트로바이러스 감염에 대한 타겟이 될 수 있다(Jaenich, R. (1976) PNAS 73:1260-1264). 할구의 유효 감염은 투명대를 제거하는 효소 처리에 의해 수득된다(Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986)). 트랜스유전자를 도입시키는데 사용되는 바이러스 벡터 시스템은 일반적으로 트랜스유전자를 운반하는 복제-결함 레트로바이러스이다(Jahner et al. (1985) PNAS 82:6927-6931; Van der Putten et al. (1985) PNAS 82:6148-6152). 트랜스펙션은 바이러스-생산 세포의 단일층 상에 할구를 배양함으로서 용이하고 효과적으로 수득된다((Van der Putten, supra; Stewart et al. (1987) EMBO J. 6:383-388). 대안으로, 감염은 후기 단계에서 수행될 수 있다. 바이러스 또는 바이러스-생산 세포가 포배강 내로 주입될 수 있다(Jahner et al. (1982) Nature 298:623-628). 도입이 형질전환 비-인간 동물을 형성하는 세포의 서브세트에서만 발생하기 때문에 대부분의 시조물질은 트랜스유전자의 모자이크가 될 것이다. 또한 시조물질은 일반적으로 자손에서 격리되는 게놈 내 다른 위치에서 트랜스유전자의 다양한 레트로바이러스성 삽입을 포함한다. 더욱이 미드게스테이션(midgestation) 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염에 의해 생식 계열 내로 트랜스유전자를 도입시키는 것이 가능하다(Jahner et al. (1982) 상동).
트랜스유전자 도입을 위한 타겟 세포의 세 번째 형태는 배아줄기세포(ES)이다. ES 세포는 시험관 내에서 배양되고 배아와 융합된 이식-전 배아로부터 수득된다(Evans et al. (1981) Nature 292:154-156; Bradley et al. (1984) Nature 309:255-258; Gossler et al. (1986) PNAS 83: 9065-9069; and Robertson et al. (1986) Nature 322:445-448). 트랜스유전자는 DNA 트랜스펙션 또는 레트로바이러스-매개 형질도입에 의해 ES 세포 내로 유효하게 도입될 수 있다. 이렇게 형질전환된 ES 세포는 이후 비-인간 동물로부터의 배반포와 결합될 수 있다. 이후 ES 세포는 배아를 집락화하고 키메라 동물의 생식 계열에 기여한다. Jaenisch, R. (1988) Science 240:1468-1474 참조.
또한 본 발명자는 바람직하게는 상기 기술된 바와 같이 Gpr100 수용체 기능에 대한 모델로서 변화된 Gpr100 유전자를 지님으로서 특성화된 비-인간 형질전환 동물 제공한다. 유전자의 변화는 결실 또는 기능 손실 돌연변이, 타겟되거나 무작위 돌연변이화된 뉴클레오타이드 서열을 지닌 외인성 유전자의 도입, 다른 종으로부터의 외인성 유전자의 도입 또는 그의 결합을 포함한다. 형질전환 동물은 변이에 대해 동형접합성이거나 이형접합성이다. 이로부터 유래된 동물 및 세포는 Gpr100 수용체 기능을 조절하는 생물학적으로 활성인 약제를 선별하는데 유용하다. 선별 방법은 비만 특히 식욕 억제, 지질 대사에 대한 잠재적 치료제의 특이성 및 작용을 측정하는데 특히 유용하다.
또다른 관점은 기능적으로 분열된 내인성 Gpr100 유전자를 지니고 그의 게놈 내에서 운반되고 이형성 Gpr100 단백질(즉, 또다른 종으로부터의 Gpr100)를 인코드하는 트랜스유전자를 발현하는 형질전환 비-인간 동물에 관한 것이다. 바람직하게는 동물은 마우스이고 이형성 Gpr100은 인간 Gpr100이다. 인간 Gpr100으로 재구성된 동물 또는 이러한 동물 유래의 세포주는 생체 내 및 시험관 내에서 인간 Gpr100을 억제하는 약제를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 인간 Gpr100을 통해 신호전달을 유도하는 자극은 시험되는 약제의 존재 및 부재시 동물 또는 세포주에 투여될 수 있고, 동물 또는 세포주의 반응이 측정될 수 있다. 생체 내 및 시험관 내에서 인간 Gpr100을 억제하는 약제는 약제의 부재시 반응 대비 약제의 존재시 반응을 감소시키는지에 따라 확인될 수 있다.
또한 본 발명자는 Gpr100 GPCR 결함 형질전환 비-인간 동물("Gpr100 GPCR 넉-아웃")을 제공한다. 이러한 동물은 바람직하게는 내인성 Gpr100 GPCR 게놈 서열이 분열되거나 결실됨으로서 저하되거나 전혀 없는 Gpr100 GPCR 활성을 발현하는 것이다. 바람직하게는 이러한 동물은 GPCR 활성을 발현하지 않는다. 더욱 바람직하게는 상기 동물은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 Gpr100 GPCR의 활성을 발현하지 않는다. Gpr100 넉-아웃은 하기 더욱 상세히 기술된 바와 같이 당분야에 알려진 다양한 방법으로 생성된다.
또한 본 발명은 숙주 세포 내에서 Gpr100 유전자를 기능적으로 분열시키기 위한 핵산 컨스트럭트에 관한 것이다. 핵산 컨스트럭트는: a) 비-상동성 대치 부분; b) 첫 번째 Gpr100 유전자 서열에 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지닌, 비-상동성 대치 부분의 업스트림에 위치한 첫 번째 상동성 구역; 및 c) 두 번째 Gpr100 유전자 서열에 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지니고 자연 발생적 내인성 Gpr100 유전자 내의 첫 번째 Gpr100 유전자의 다운스트림 위치를 지닌, 비-상동성 대치 부분의 다운스트림에 위치한 두 번째 상동성 구역. 더욱이 핵산 분자가 숙주 세포 내로 도입시 첫 번째 및 두 번째 상동성 구역은 핵산 컨스트럭트와 숙주 세포 내 내인성 Gpr100 유전자 사이의 상동적 재조합에 충분한 길이다. 바람직한 실시태양에서 비-상동성 대치 부분은 바람직하게는 lacZ 및 양성 선택 발현 카세트를 포함하고, 바람직하게는 조절 요소(들)에 실시 가능하게 결합되는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 포함한 발현 수용체를 포함한다.
바람직하게는 첫 번째 및 두 번째 Gpr100 유전자 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체로부터 유래한다.
또다른 관점은 상기 기술된 핵산 컨스트럭트가 도입되는 재조합 벡터에 관한 것이다. 또다른 관점은 핵산 컨스트럭트가 도입되어 핵산 컨스트럭트와 숙주 세포의 내인성 Gpr100 유전자 사이의 상동적 재조합을 가능하게 하여 내인성 Gpr100 유전자의 기능적 분열을 유발하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 간, 뇌, 비장 또는 심장 또는 마우스 배아줄기세포와 같은 다기능성 세포로부터의 Gpr100을 정상적으로 발현하는 포유류 세포가 될 수 있다. 또한 핵산 컨스트럭트가 도입되고 내인성 Gpr100 유전자로 상동적으로 재조합된 배아줄기세포의 발달은 배아줄기세포로부터 유전되고 따라서 그의 게놈 내에 Gpr100 유전자를 운반하는 세포를 지닌 형질전환 비인간 동물을 생성한다. 이후 그의 생식 계열 내에 Gpr100 유전자 분열을 운반하는 동물이 선택되고 모든 체세포 또는 생식 세포 내 Gpr100 유전자 분열을 지닌 동물이 번식될 수 있다. 이후 이러한 마우스가 Gpr100 유전자 분열에 대한 동형접합성으로 번식될 수 있다.
시험관 내 시스템이 고안되어 Gpr100 수용체 유전자 생성물에 결합하는 것이 가능한 화합물을 확인하였다. 이러한 화합물은 D-및/또는 L-BR BR 배열 아미노산으로 이루어진 펩타이드(예를 들어 무작위 펩타이드 라이브러리 형태와 같은), 포스펩타이드(phosphopeptide)(예를 들어 무작위 또는 부분적 퇴화 지시 포스포펩타이드 라이브러리 형태와 같은), 항체 및 작은 유기물 또는 무기물을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 확인된 화합물은 예를 들어 Gpr100 수용체 유전자 단백질, 바람직하게는 돌연변이 Gpr100 수용체 유전자 단백질의 활성을 조절하거나; Gpr100 수용체 유전자 단백질의 생물학적 기능을 정교화하거나; 정상 Gpr100 슈용체 유전자 상호작용을 분열시키는 화합물 또는 이러한 상호작용을 분열시키는 자체를 선별하는데 유용하다.
특정 Gpr100 수용체 유전자 생성물에 결합하는 것으로 나타난 화합물은 Gpr100 수용체 유전자 단백질로부터의 생화학적 반응을 유도할 수 있는 그의 능력에 대해 더욱 시험될 수 있다. 발현 생성물의 작용제, 길항제 및/또는 억제제는 당분야에 잘 알려진 에세이를 이용하여 확인될 수 있다.
항체
본 출원서의 목적에 있어서, "항체"라는 용어는 상세한 기술이 없는 한 폴리클론, 단일클론, 키메라, 단일 사슬, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 이러한 단편은 타겟 물질에 대한 결합 활성을 보유한 전체 항체의 단편, Fv, F(ab'), F(ab')2 단편뿐만 아니라 단일 사슬 항체(scFv), 융합 단백질 및 항체의 항원-결합 사이트를 포함한 다른 합성 단백질을 포함한다. 항체 및 그의 단편은 예를 들어 EP-A-23900에 기술된 바와 같은 인간화 항체이다. 더욱이 예를 들어 미국특허 제5,545,807호 및 6,075,181호에 기술된 바와 같이 전체 인간 변이가능 구역(또는 그의 단편)을 지니 항체도 이용된다. 중화 항체 즉, 아미노산 서열 물질의 생물학적 활성을 억제하는 것이 진단제 및 치료제로서 특히 바람직하다.
항체는 면역법 또는 파지 디스플레이 라이브러리의 이용과 같은 표준 기술에 의해 생성된다.
Gpr100 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 알려진 기술에 의해 항체를 발달시키는데 사용된다. 이러한 항체는 Gpr100 GPCR 단백질 또는 상동체, 단편 등에 특이적으로 결합하는 것이 가능하다.
폴리클론 항체가 바람직한 경우 선택된 포유류(즉, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)는 Gpr100 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함한 면역원성 조성물로 면역된다. 숙주 종에 따라 다르게 다양한 보조제가 면역 반응을 증가시키기 위해 사용된다. 이러한 보조제는 수산화알루미늄과 같은 Freund 미네랄 겔 및 리소레시틴과 같은 표면 활성 물질, 플루론산 폴리올, 다음이온, 펩타이드, 오일 에멀젼, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 및 디니트로페놀을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. BCG(Bacillus Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 전신 방어를 자극하는 목적으로 면역학적으로 절충된 개체에 투여되는 아미노산 서열 물질을 정제시 이용되는 잠재적으로 유용한 인간 보조제이다.
면역된 동물로부터의 혈청이 수집되고 알려진 절차에 따라 처리된다. Gpr100 폴리펩타이드로부터 수득 가능한 에피토프에 대한 폴리클론 항체를 포함한 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 포함하는 경우 폴리클론 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 폴리클론 항혈청을 생성하고 처리하는 기술은 당분야에 알려져 있다. 이러한 항체가 제조되기 위해서는 본 발명자는 동물 또는 인간에서 면역원으로 사용하기 위한 또다른 아미노산 서열로 합텐화된(haptenised) Gpr100의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 Gpr100 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 수득 가능한 에피토프에 대해 지시된 단일클론 항체가 당업자에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 하이브리도마에 의해 단일클론 항체를 제조하는 일반적인 방법론이 잘 알려져 있다. 영구적 항체-생성 세포주는 세포 융합 및 발암성 DNA로의 B 림프구의 직접적인 형질전환 또는 에브스타인-바 바이러스로의 트랜스펙션과 같은 다른 기술에 의해 생성될 수 있다. 궤도 에피토프에 대해 생성된 단일클론 항체의 패널은 다양한 특성 즉, 동형 및 에피토프 친화성에 대해 선별될 수 있다.
단일클론 항체는 배양액 내 지속적인 세포주에 의한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술도 이용하여 제조된다. 이는 Koehler and Milstein (1975 Nature 256:495-497)에 의해 처음으로 기술된 하이브리도마 기술, 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al (1983) Immunol Today 4:72; Cote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
더욱이 적당한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 지닌 분자를 수득하기 위해 "키메라 항체"의 생성을 위해 개발된 기술, 마우스 항체 유전자의 인간 항체 유전자로의 스플라이싱(splicing)이 이용될 수 있다(Morrison et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger et al (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al (1985) Nature 314:452-454). 대안으로 단일 사슬 항체의 생성을 위해 설명된 기술(미국특허 제4,946,779호)이 특정 단일 사슬 항체 물질을 생성하도록 개조될 수 있다.
Gpr100 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 수득 가능한 에피토프에 대한 단일클론 항체 및 폴리클론 항체 모두 진단에 특히 유용하고, 중화된 것은 수동 면역화에 유용하다. 특히 단일클론 항체는 항-유전형 항체를 유발하는데 사용된다. 항-유전형 항체는 보호가 바람직한 물질 및/또는 약제의 "내부 이미지"를 운반하는 면역글로불린이다. 항-유전형 항체를 유발하는 기술은 당분야에 알려져 있다. 이들 항-유전형 항체는 치료에도 유용하다.
또한 항체는 림프구 집단 내에서 생체 내 생성을 유도하거나 Orlandi et al (1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837) 및 Winter G and Milstein C(1991; Nature 349:293-299)에 개시된 매우 특이적 결합 시약의 재조합 면역글로불린 라이브러리 또는 패널을 선별함으로서 생성된다.
또한 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대한 특이적 결합 사이트를 포함한 항체 단편이 생성된다. 예를 들어 이러한 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 이황 결합을 환원시킴으로서 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 대안으로, Fab 발현 라이브러리가 구축되어 원하는 특이성을 지닌 단일클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 가능하게 한다(Huse WD et al (1989) Science 256:1275-1281).
또한 단일 사슬 항체의 생성 기술(미국특허 제4,946,778호)이 Gpr100 폴리펩타이드에 대한 단일 사슬 항체를 생성하도록 개조될 수 있다. 또한 형질전환 마우스 또는 다른 포유류를 포함한 다른 생물체가 인간화 항체를 발현시키는데 사용된다.
상기-기술된 항체는 폴리펩타이드를 발현하는 클론을 분리하거나 확인하기 위해 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩타이드를 정제하기 위해 사용된다.
또한 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드에 대한 항체는 Gpr100 관련 질환을 치료하는데 용될 수 있다.
진단 분석
또한 본 발명은 진단 시약으로서의 진단 또는 유전자 분석에 이용하기 위한 Gpr100 GPCR 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드(뿐만 아니라 그의 상동체, 변이체 및 유도체)의 이용에 관한 것이다. 또한 Gpr100 GPCR 핵산에 상보적이거나 이에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 핵산(상동체, 변이체 및 유도체 포함)뿐만 아니라 Gpr100 폴리펩타이드에 대한 항체가 이러한 분석에 유용하다.
기능장애와 관련된 Gpr100 GPCR 유전자의 돌연변이화된 형태의 검출은 Gpr100 GPCR의 저-발현, 과-발현 또는 변화된 발현으로부터 유발된 질병의 진단 또는 감수성의 진단에 첨가되거나 이를 한정할 수 있는 진단 도구를 제공할 것이다. Gpr100 GPCR 유전자(대조군 서열을 포함) 내 돌연변이를 지닌 개체는 다양한 기술에 의해 DNA 수준에서 검출된다.
예를 들어 DNA는 환자로부터 분리되고 Gpr100의 DNA 다형성 패턴이 측정된다. 확인된 패턴은 Gpr100의 과-, 저- 또는 비정상 발현과 관련된 질환 증세를 나타내는 환자의 대조군과 비교된다. 이후 Gpr100 관련 질환과 관련된 유전자 다형성 패턴을 발현하는 환자가 확인된다. Gpr100 GPCR 유전자 분석은 당분야에 알려진 기술에 의해 수행된다. 예를 들어 개체는 RFLP 또는 SNP 분석 등에 의해 Gpr100 대립유전자의 DNA 서열을 측정함으로서 선별된다. 환자는 Gpr100에 대한 유전자 서열 또는 그의 발현을 조절하는 어떠한 서열 내 DNA 다형성의 존재를 검출함으로서 Gpr100의 과-, 저- 또는 비정상 발현과 관련된 질환에 대한 유전자 소인을 지닌 것으로 확인된다.
이후 이렇게 확인된 환자는 Gpr100 관련 질환의 발생을 예방하도록 또는 더욱 적극적으로는 Gpr100 관련 질환의 초기 단계에서 질환의 발생 또는 발달을 예방하도록 치료될 수 있다.
또한 본 발명자는 Gpr100 관련 질환과 관련된 환자의 유전자 다형성 패턴의 확인용 키트를 개시한다. 상기 키트는 DNA 표본 수집기 및 환자의 Gpr100 관련 질환에 대한 감수성을 측정하기 위해 대조군 표본에 비교되는 유전자 다형성 패턴을 측정하는 기구를 포함한다. 또한 Gpr100 폴리펩타이드 및/또는 이러한 폴리펩타이드(또는 그의 단편)에 대한 항체를 포함한 Gpr100 관련 질환의 진단용 키트가 제공된다.
진단용 핵산은 혈액, 소변, 타액, 생검 또는 부검 조직 물질과 같은 피험자의 세포로부터 수득된다. 바람직한 실시태양에서 DNA는 환자의 손가락을 찔러 흡수지 상에서 수집된 혈액으로부터 수집된 혈액 세포로부터 수집된다. 또다른 바람직한 실시태양에서 혈액은 AmpliCardTM(University of Sheffield, Department of Medicine and Pharmacology, Royal Hallamshire Hospital, Sheffield, England S10 2JF) 상에서 수집될 것이다.
DNA는 검출을 위해 직접적으로 이용되거나 분석 전 PCR 또는 다른 증폭 기술을 이용함으로서 효소적으로 증폭된다. 목적 유전자 내 특정 다형성 DNA 구역을 타겟하는 올리고뉴클레오타이드 DNA 프라이머가 제조되어 타겟 서열의 PCR 반응 증폭이 달성되게 된다. 또한 RNA 또는 cDNA는 유사한 형태로 주형으로 사용된다. 이후 주형 DNA으로부터 증폭된 DNA 서열이 제한효소를 이용하여 분석되어 증폭된 서열 내에 존재하는 유전자 다형성을 측정하여 환자의 유전자 다형성 프로파일을 제공한다. 제한 단편 길이는 겔 분석에 의해 확인된다. 대안으로 또는 그와 결합하여 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 분석과 같은 기술이 이용된다.
결실 및 삽입은 정상 유전형과 비교시 증폭된 생성물 크기 상의 변화에 의해 검출될 수 있다. 점돌연변이는 증폭된 DNA를 표지된 Gpr100 GPCR 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈시킴으로서 확인될 수 있다. 완벽하게 매치된 서열은 RNase 분해 또는 분해 온도 상의 차이에 의해 미스매치된 이중나선과 구별될 수 있다. 또한 DNA 서열 차이는 변성제와 함께 또는 변성제 없이 겔 내에서의 DNA 단편의 전기영동 이동 상의 변화 또는 직접적인 DNA 서열분석에 의해 검출된다. Myers et al, Science (1985)230:1242 참조. 특정 위치에서의 서열 변화는 RNAse 및 S1 보호와 같은 뉴클레아제 보호 분석 또는 화학적 분열방법에 의해 판명된다. Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401 참조. 또다른 실시태양에서 Gpr100 GPCR 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 단편을 포함한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 어레이가 구축되어 유전자 돌연변이의 유효한 선별을 수행할 수 있게 한다. 어레이 기술 방법은 잘 알려져 있고 일반적인 적용 가능성을 지니고 유전자 발현, 유전자 결합 및 유전자 변이성을 포함한 다양한 분자유전학 상의 의문을 설명하는데 사용될 수 있다(예를 들어 M.Chee et al., Science, Vol 274, pp 610-613 (1996) 참조).
단일 나선 구조 다형성(SSCP)은 돌연변이와 야생형 핵산 사이의 전기영동 이동 상의 차이를 검출하는데 이용된다(Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA: 86:2766, see also Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; and Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79). 표본 및 대조군 핵산의 단일-나선 DNA 단편은 변성되고 복원을 가능하게 한다. 단일-나선 핵산의 2차 구조는 서열에 따라 다르고 결과적인 전기영동 이동 상의 차이는 단일 염기 변화의 검출을 가능하게 한다. DNA 단편은 표지되거나, 표지된 프로브로 검출된다. 분석 민감도는 RNA(DNA 보다는)를 이용하여 증가되고, 2차 구조는 서열 변화에 더욱 민감하다. 바람직한 실시태양에서 주된 방법은 전기영동 이동 상의 변화를 기반으로 이중 나선 이질이중나선 분자를 분리하는 이질이중나선 분석을 이용한다(Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5).
진단 분석은 기술된 방법에 의한 Gpr100 GPCR 유전자 돌연변이의 검출을 통해 Gpr100 관련 질환과 같은 장애에 대한 감수성을 진단하거나 측정하는 방법을 제공한다.
Gpr100 GPCR 폴리펩타이드 및 핵산의 존재는 표본 내에서 검출된다. 따라서 상기 기입된 감염 및 질병은 피험자 유래의 표본으로부터 비정상적으로 감소되거나 증가된 수준의 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드 또는 Gpr100 GPCR mRNA를 측정하는 단계를 포함한 방법에 의해 진단될 수 있다. 표본은 증가되거나 감소되거나 비정상적인 Gpr100 GPCR 발현과 관련된 질환 증세를 나타내거나 나타낼 것으로 의심되는 생물체로부터의 세포 또는 조직 표본을 포함한다. 이러한 질환 증세를 나타내거나 나타낼 것으로 의심되는 생물체의 Gpr100 발현 수준 또는 패턴은 질환의 진단에 의해 정상 생물체 내 발현 수준 또는 패턴과 유용하게 비교된다.
따라서 일반적으로 본 발명자는 핵산에 특이적인 적어도 하나 이상의 핵산 프로브에 표본을 접촉시키는 단계 및 핵산의 존재에 대해 상기 표본을 모니터하는 단계를 포함한 표본 내 Gpr100 GPCR 핵산을 포함한 핵산 존재의 검출 방법을 개시한다. 예를 들어 핵산 프로브는 Gpr100 GPCR 핵산 또는 그의 일부에 특이적으로 결합하고 그 둘 사이의 결합이 검출되고; 복합체 자체의 존재도 검출된다. 더욱이 본 발명자는 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드에 결합하는 것이 가능한 항체에 세포 표본을 접촉시키고 폴리펩타이드의 존재에 대해 상기 표본을 모니터함으로서 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 이는 항체와 폴리펩타이드 사이에 형성된 복합체의 존재를 모니터하거나 폴리펩타이드와 항체 사이의 결합을 모니터함으로서 편리하게 달성된다. 두 실체 사이의 결합의 검출 방법은 당분야에 알려져 있고 FRET(형광 공명 에너지 전달), 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
감소되거나 증가된 발현은 예를 들어 PCR, RT-PCR, RNAse 보호, 노던 블럿팅 및 다른 하이브리디제이션 방법과 같은 폴리뉴클레오타이드의 정량화를 위한 당분야에 잘 알려진 어떠한 방법을 이용하여도 RNA 수준에서 측정될 수 있다. 숙주 유래의 표본 내 Gpr100 GPCR과 같은 단백질 수준을 측정하는데 이용되는 분석 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 분석 방법은 방사면역측정법, 경합-반응분석, 웨스턴 블럿 분석 및 ELISA 분석을 포함한다.
또한 본 발명자는 예를 들어 비만, 식욕 억제, 대사 장애와 같은 질병(감염을 포함) 또는 이러한 질병에 대한 감수성용 진단 키트를 개시한다. 진단 키트는 Gpr100 GPCR 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 단편; 상보성 뉴클레오타이드 서열; Gpr100 GPCR 폴리펩타이드 또는 그의 단편 또는 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함한다.
염색체 분석
또한 여기서 기술된 뉴클레오타이드 서열은 염색체 확인에 유용하다. 상기 서열은 인간 개체 염색체 상의 특정 위치에 특이적으로 타겟되고 이와 하이브리다이즈할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 인간 Gpr100 GPCR은 호모 사피엔스 염색체 1q22에 지도화된 것으로 나타났다.
염색체로의 관련 서열의 지도화는 이들 서열을 유전자 관련 질환과 연관시키는 중요한 첫 번째 단계이다. 서열이 정확한 염색체 위치로 지도화되면 염색체 상의 서열의 물리적 위치는 유전자 지도 데이터와 상호관련될 수 있다. 이러한 데이터는 예를 들어 V. McKusick, Mendelian heritance in Man(온라인 상의 Johns Hopkins University Welch Medical Library에서 이용 가능)에 나타나 있다. 이후 동일한 염색체 구역으로 지도화된 유전자와 질병 사이의 관계는 계통 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공동상속)을 통해 확인된다.
또한 영향 받은 개체와 영향 받지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열 상의 차이가 측정될 수 있다. 돌연변이가 영향 받은 개체의 일부 또는 전부에서 관찰되나 정상 개체에서는 관찰되지 않는 경우 돌연변이는 질병의 유발 요인으로 간주된다.
예방 및 치료 방법
또한 본 발명자는 과도하고 불충분한 양의 Gpr100 GPCR 활성 모두에 관련한 비정상적 이상의 치료 방법을 제공한다.
Gpr100 GPCR 활성이 과도한 경우 일부 접근이 이용 가능하다. 하나의 접근은 상기 기술된 억제제 화합물(길항제)을 Gpr100 GPCR에 대한 리간드의 결합을 차단하거나 두 번째 신호를 억제하여 비정상적 이상을 완화시킴으로서 활성화를 억제하는데 효과적인 양으로 약학적으로 수용 가능한 담체와 함께 피험체에 투여하는 것을 포함한다.
또다른 접근에서 내인성 Gpr100 GPCR과 경합하는 리간드에 결합하는 것이 가능한 용해성 형태의 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드가 투여된다. 이러한 경합제의 일반적인 실시태양은 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드의 단편을 포함한다.
또다른 접근에서 내인성 Gpr100 GPCR을 인코드하는 유전자의 발현이 발현 차단 기술을 이용하여 억제될 수 있다. 이러한 알려진 기술은 내부적으로 생성되거나 별도로 투여되는 안티센스 서열의 이용을 포함한다. 예를 들어 O'Connor, J Neurochem (1991) 56:560 in Oligodeoxvnucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988) 참조. 대안으로 유전자와 함께 삼중 헬릭스를 형성하는 올리고뉴클레오타이드가 보충될 수 있다. Lee et al., Nucleic Acids Res (1979) 6:3073; Cooney et al., Science (1988) 241:456; Dervan et al., Science (1991) 251:1360 참조. 이들 올리고머는 그 자체로 투여될 수 있거나 관련 올리고머가 생체 내에서 발현될 수 있다.
Gpr100 GPCR의 저-발현 및 그의 활성과 관련한 비정상적 이상을 치료하기 위해 일부 접근이 유용하다. 하나의 접근은 Gpr100 GPCR을 활성화시키는 화합물 즉, 상기 기술된 작용제를 약학적으로 수용 가능한 담체와 결합하여 피험체에 투여하여 비정상적 이상을 완화시키는 것을 포함한다. 대안으로, 피험체 내의 관련 세포에 의한 Gpr100 GPCR의 내인성 생성에 효과를 나타내지 위해 유전자 치료가 이용된다. 예를 들어 Gpr100 폴리뉴클레오타이드는 상기 기술된 바와 같이 복제 결함 레트로바이러스 벡터 내 발현을 위해 설계된다. 이후 레트로바이러스 발현 컨스트럭트가 분리되고 Gpr100 폴리펩타이드를 인코드하는 RNA를 포함한 레트로바이러스 플라스미드 벡터로 형질도입된 팩키징 세포 내로 도입되어 팩키징 세포가 목적 유전자를 포함한 감염성 바이러스 입자를 생성하게 된다. 이들 생산자 세포는 생체 내 세포의 설계 및 생체 내 폴리펩타이드의 발현을 위해 피험체에 투여된다. 유전자 치료의 개요를 위해 Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches,(및 참고문헌) in Human Molecular Genetics, T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996) 참조.
포뮬레이션 및 투여
용해성 형태의 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드와 같은 펩타이드 및 작용제 및 길항제 펩타이드 또는 소분자가 적당한 약학적 담체와 결합하여 포뮬레이트된다. 이러한 포뮬레이션은 치료적으로 효과적인 양의 폴리펩타이드 또는 화합물 및 약학적으로 수용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 그의 결합을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 포뮬레이션은 투여 형태를 만족시켜야 하고 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한 본 발명자는 하나 이상의 상기 기술된 조성물 성분으로 충진된 하나 이상의 용기를 포함한 약학적 팩 및 키트를 기술한다.
폴리펩타이드 및 다른 화합물은 단독으로 또는 치료 화합물과 같은 다른 화합물과 결합하여 이용된다.
약학적 조성물의 전신 투여의 바람직한 형태는 일반적으로 정맥주사에 의한 주사를 포함한다. 피하, 근육내 또는 복막내와 같은 다른 경로 주사도 이용될 수 있다. 전신 투여의 대안적 수단은 담즙산염 또는 푸시딘산 또는 다른 세정제를 포함한다. 더욱이 창자용 또는 캡슐화된 포뮬레이션으로 적당히 포뮬레이트되는 경우 구강 투여도 가능하다. 이들 화합물의 투여는 연고, 페이스트, 겔 등의 형태로 국부적이 되고/또는 집중화된다.
필요한 용량 범위는 펩타이드의 선택, 투여 경로, 포뮬레이션 성질, 피험체 조건의 특성 및 주치의의 판단에 따라 달라진다. 그러나 적당한 용량은 피험체의 0.1∼100 ㎍/kg의 범위이다. 그러나 유용한 화합물의 다양성 및 다양한 투여 경로의 다른 효율의 견지에서 필요한 용량 내의 광범위한 변화가 예측된다. 예를 들어 구강 투여는 정맥주사에 의한 투여보다 더 높은 용량을 요구한다. 이들 용량 수준 상의 차이는 당분야에 잘 이해되는 바와 같이 최적조건을 위한 표준 경험상 관례를 이용하여 조정될 수 있다.
또한 치료에 사용되는 폴리펩타이드는 상기 기술된 바와 같이 "유전자 치료"로 표기되는 치료 양상으로 피험체 내에서 내인적으로 생성될 수 있다. 따라서 예를 들어 피험체 유래의 세포는 예를 들어 레트로바이러스 플라스미드 벡터의 이용에 의해 생체 외에서 폴리펩타이드를 인코드하기 위해 DNA 또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오타이드로 설계된다. 이후 세포는 피험체 내로 도입된다.
약제적 조성물
또한 본 발명자는 약학적으로 효과적인 양의 Gpr100 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 벡터 또는 그의 항체 및 선택적으로는 약제적으로 수용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제(그의 결합을 포함)를 투여하는 것을 포함한 약제적 조성물을 개시한다.
약학적 조성물은 인간 및 가축 약물에서 인간 또는 동물 용도가 되고 일반적으로 하나 이상의 약학적으로 수용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다. 치료제로서 수용 가능한 담체 또는 희석제는 제약 분야에 잘 알려져 있고 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다. 약학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 투여의 의도된 경로 및 표준 약학적 실습에 따라 선택될 수 있다. 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제, 어떠한 적당한 바인더(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 용해제(들)를 포함한다.
방부제, 안정화제, 염료 및 향미제가 약학적 조성물에 제공된다. 방부제의 예는 벤조산나트륨, 소르빈산, p-하이드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁제도 사용된다.
다른 전달 시스템에 따라 다른 조성물/포뮬레이션 필요조건이 존재한다. 예로서 여기서 기술된 약학적 조성물은 조성물이 미니-펌프를 이용하거나 흡입용 비강 스프레이 또는 에어로졸 또는 섭취가능 용액에 의해 또는 조성물이 전달을 위해 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하 경로와 같은 주사형태로 포뮬레이트된 비경구적으로 전달되도록 포뮬레이트된다. 대안으로 포뮬레이션은 두 경로 모두에 의해 전달되도록 고안된다.
약제가 위장 점막을 통해 점막으로 전달되는 경우 위장관을 통과하는 동안 안정하게 유지될 수 있어야 한다; 예를 들어 단백질 분해성 분해에 저항적이고 산 pH에 안정적이고 담즙의 세정 효과에 저항적이어야 한다.
적당한 경우 약제적 조성물은 좌약 또는 페서리 형태로 흡입에 의해, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포 분말 형태 및 피부 패취의 이용에 의해 국부적으로, 전분 또는 락토오스와 같은 부형제를 포함한 정제 형태 또는 캡슐 또는 오불(ovule) 단독 또는 부형제와 결합된 형태 또는 향미제 또는 착색제를 함유한 엘릭서(elixir), 용액 또는 현탁액 형태로 투여될 수 있거나, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하와 같은 비경구적으로 주입될 수 있다. 비경구적 투여의 경우 조성물은 예를 들어 혈액과 등장액을 생성기에 충분한 염 또는 모노사카라이드와 같은 다른 물질을 함유한 멸균 수용액 형태로 사용되는 것이 최상이다. 구강 또는 설하 투여의 경우 조성물은 편리한 형태로 포뮬레이트될 수 있는 정제 또는 로젠지(lozenge) 형태로 투여된다.
백신
또다른 실시태양은 비만, 식욕 억제, 대자 장애로부터 상기 동물을 보호하기 위해 항체 및/또는 T 세포 면역 반응을 생성하기에 충분한 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드 또는 그의 단편으로 포유류를 접종시키는 단계를 포함한 포유류 내 면역 반응의 유도 방법에 관한 것이다.
또다른 실시태양은 질병으로부터 상기 동물을 보호하도록 이러한 면역 반응을 유도하기 위해 생체 내에서 Gpr100 GPCR 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시하는 벡터를 통해 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드를 전달하는 단계를 포함한 포유류 내 면역 반응의 유도 방법에 관한 것이다.
또다른 실시태양은 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드 또는 Gpr100 유전자를 포함한 조성물이 포유류 숙주 내로 도입시 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드에 대해 포유류 내에서 면역 반응을 유도하는 면역적/백신 포뮬레이션(조성물)에 관한 것이다. 백신 포뮬레이션은 적당한 담체를 더욱 포함한다.
Gpr100 GPCR 폴리펩타이드가 위에서 분해되기 때문에 바람직하게는 비경구적으로(피하, 근육내, 정맥내, 피내 등의 주사를 포함) 투여된다. 비경구적 투여에 적당한 포뮬레이션은 항산화제, 완충액, 세균발육저지제 및 포뮬레이션이 수용체의 혈액과 등장성을 이루게 하는 용질을 함유한 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 또는 농화제를 포함한 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 포뮬레이션은 밀봉된 앰플 및 바이알과 같은 단위-투여 또는 다중-투여 용기로 제공되고, 사용하기 바로 전에 멸균 액체 담체의 첨가가 필요한 동결-건조 조건으로 보관된다. 또한 백신 포뮬레이션은 오일-인 워터 시스템 및 당분야에 알려진 다른 시스템과 같은 포뮬레이션의 면역원성을 증가시키기 위한 보강 시스템을 포함한다. 용량은 백신의 특이적 활성에 따라 달라질 것이고 일반 실험에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
백신은 하나 이상의 Gpr100 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 제조된다.
활성 성분(들)로서 면역원성 폴리펩타이드(들) 또는 펩타이드(들)을 포함한 백신의 제조는 당업자에게 알려져 있다. 일반적으로 이러한 백신은 액체 용액 똔느 현탁액과 같은 주사제로서 제조되고; 주사 전 액체 내 용액 또는 현탁액에 적당한 고형 형태로도 제조된다. 또한 제제는 에멀젼화되거나 리포솜 내에 캡슐화된 단백질이다. 활성 면역원성 성분은 약제적으로 수용 가능하고 활성 성분과 양립 가능한 부형제와 혼합된다. 적당한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 그의 결합이다.
더욱이 바람직한 경우 백신은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 및/또는 백신의 유효성을 증가시키는 보조제와 같은 최소량의 보조 물질을 포함한다. 효과적인 보조제의 예는 하기를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다: 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, nor-MDP로 표기), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴록시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로 표기), 및 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼 내에 박테리아로부터 추출된 3가지 성분인 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디마이콜레이트 및 세포벽 골격(MPL+TDM+CWS)을 포함한 RIBI.
보조제 및 다른 약제의 또다른 예는 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산칼륨알루미늄(백반), 황산베릴리움, 실리카, 카올린, 탄소, 워터-인-오일 에멀젼, 오일-인-워터 에멀젼, 무라밀 디펩타이드, 박테리아 내독소, 지질 X, 코리네박테리움 파르붐(프로피오노박테리움 아크네스(Propionobacterium acnes)), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 폴리리보뉴클레오타이드, 알긴산나트륨, 라놀린, 리소레시틴, 비타민 A, 사포닌, 리포솜, 레바미솔, DEAE-덱스트란, 차단된 코폴리머 또는 다른 합성 보조제를 포함한다. 이러한 보조제는 예를 들어 Merck Adjuvant 65(Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.) 또는 Freund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)와 같은 다양한 원료로부터 상업적으로 구입 가능하다.
일반적으로 Amphigen(오일-인-워터), Alhydrogel(수산화알루미늄) 또는 Amphigen과 Alhydrogel의 혼합물과 같은 보조제가 사용된다. 수산화알루미늄만이 인간 용도로 승인된다.
면역원 및 보조제의 비율은 효과적인 양으로 존재하는 한 광범위한 범위로 변화될 수 있다. 예를 들어 수산화알루미늄은 백신 혼합물의 약 0.5%의 양으로 존재할 수 있다(Al2O3 기초). 편리하게는 백신은 0.2∼200 ㎍/ml, 바람직하게는 5∼50 ㎍/ml, 가장 바람직하게는 15 ㎍/ml 범위의 최종농도의 면역원을 포함하도록 포뮬레이트된다.
포뮬레이션 후 백신은 멸균 용기에 포함된 후 밀봉되고 예를 들어 4℃와 같은 저온에서 보관되거나 동결-건조된다. 동결건조는 안정한 형태로 장기간 보관을 가능하게 한다.
백신은 통상적으로 피하로 또는 근육내로 같은 주사에 의해 비경구적으로 투여된다. 다른 형태의 투여에 적당한 추가 포뮬레이션은 좌약을 포함하고, 일부의 경우 구강 포뮬레이션을 포함한다. 좌약의 경우 통상의 바인더 및 담체는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함하고; 이러한 좌약은 0.5∼10%, 바람직하게는 1∼2% 범위로 활성 성분을 함유한 혼합물로부터 형성된다. 구강 포뮬레이션은 약제 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 지효성 포뮬레이션 또는 분말의 형태를 취하고 10∼95%, 바람직하게는 25∼70%의 활성 성분을 포함한다. 백신 조성물이 동결건조되는 경우 동결건조된 물질은 투여 전 현택액으로 재구성된다. 재구성은 바람직하게는 완충액 내에서 효과적이다.
환자로의 구강 투여를 위한 캡슐, 정제 및 환약은 예를 들어 Eudragit "S", Eudragit "L", 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로스를 포함한 장 코팅제와 함께 제공된다.
Gpr100 폴리펩타이드는 중성 또는 염 형태로서 백신 내로 포뮬레이트된다. 약학적으로 수용 가능한 염은 산 첨가 염(펩타이드의 자유 아미노기로 형성된)을 포함하고 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 수산, 주석산 및 말레산과 같은 유기산으로 형성된다. 또한 자유 카르복실기로 형성된 염은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘 및 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유래된다.
투여
일반적으로 의사는 피험 개체에 가장 적당한 실질적인 용량을 결정할 것이고, 이는 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다. 하기 용량은 평균 사례의 예이다. 물론 더 높거나 더 낮은 용량 범위가 적당한 개인적 경우도 존재한다.
여기서 기술된 약학적 및 백신 조성물은 직접 주입에 의해 투여된다. 조성물은 비경구적, 점막, 근육내, 정맥내, 피하, 안구내 또는 경피성 투여를 위해 포뮬레이트된다. 일반적으로 각각의 단백질은 0.01∼30 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.1∼10 mg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 0.1∼1 mg/kg 체중의 용량으로 투여된다.
"투여된"이라는 용어는 바이러스성 또는 비-바이러스성 기술에 의한 전달을 포함한다. 바이러스 전달 메커니즘은 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 바큘로바이러스 벡터를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 비-바이러스성 전달 메커니즘은 지질 매개 트랜스펙션, 리포솜, 면역리포솜 리포펙틴, 양이온 안면 양친매성물질(CFA) 및 이들의 결합을 포함한다. 이러한 전달 메커니즘의 경로는 점막, 비강, 구강, 비경구, 위장, 국부 또는 설하 경로를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
"투여된"이라는 용어는 흡입용 비강 스프레이 또는 에어로졸 또는 섭취 용액과 같은 점막 경로; 정맥내, 근육내 또는 피하 경로와 같은 주입 가능 형태에 의해 전달되는 비경구 경로를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
"동시-투여된"이라는 용어는 예를 들어 Gpr100 폴리펩타이드 및 보조제와 같은 추가 실체 각각의 투여 사이트 및 시간이 면역체계의 필요한 조절이 달성되게 하는 것을 의미한다. 따라서 폴리펩타이드 및 보조제가 동일한 순간 및 동일한 사이트에 투여되는 경우 폴리펩타이드를 보조제와 다른 시간 및 다른 사이트에 투여하는 것보다 이점이 있다. 폴리펩타이드 및 보조제는 동일한 전달 운반체 내에서 전달되고 - 폴리펩타이드 및 항원은 결합되고/또는 결합되지 않고/또는 유전적으로 결합되고/또는 결합되지 않는다.
상기 기술된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 뉴클레오타이드, 그의 항체 및 선택적으로는 보조제는 단일 투여 또는 다수 투여로 숙주 피험체에 개별적으로 투여되거나 동시-투여된다.
백신 조성물 및 약학적 조성물은 주입(비경구, 피하 및 근육내 주입), 비강내, 점막, 구강, 질내, 요도 또는 안구 투여와 같은 많은 다른 경로에 의해 투여된다.
여기서 기술된 백신 및 약학적 조성물은 통상적으로 예를 들어 피하 또는 근육내 주사에 의해 비경구적으로 투여된다. 다른 형태의 투여에 적당한 추가 포뮬레이션은 좌약 및 일부의 경우 구강 포뮬레이션을 포함한다. 좌약의 경우 통상의 바인더 및 담체는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함하고; 이러한 좌약은 0.5∼10%, 바람직하게는 1∼2% 범위로 활성 성분을 함유한 혼합물로부터 형성된다. 구강 포뮬레이션은 약제 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 지효성 포뮬레이션 또는 분말의 형태를 취하고 10∼95%, 바람직하게는 25∼70%의 활성 성분을 포함한다. 백신 조성물이 동결건조되는 경우 동결건조된 물질은 투여 전 현택액으로 재구성된다. 재구성은 바람직하게는 완충액 내에서 효과적이다.
대안으로 여기서 기술된 방법에 의해 확인된 치료제 화합물은 당뇨병 관련 장애 또는 체중 관련 장애의 치료 또는 예방에 이용된다. 하나의 관점에서 화합물 또는 약제는 천연, 합성, 반-합성 또는 재조합 Gpr100 수용체 유전자, Gpr100 수용체 유전자 생성물 또는 그의 단편뿐만 아니라 상기 유전자의 아날로그, 유전자 생성물 또는 단편이다. 또다른 관점에서 화합물은 상기 유전자 또는 유전자 생성물에 특이적인 항체, 안티센스 DNA 또는 RNA 또는 유기 또는 무기 소분자이다. 바람직한 실시태양에서 화합물 또는 약제는 Gpr100 수용체 유전자 또는 Gpr100 수용체 유전자 생성물의 활성, 발현 또는 기능에 영향을 미칠 것이다.
당뇨병 관련 장애 또는 체중 관련 장애의 치료 방법이 제공된다. 하나의 관점에서 Gpr100 수용체를 조절하는 것이 가능한 약제의 치료적으로 효과적인 양이 필요에 따라 피험체에 투여된다. Gpr100 수용체를 조절하는 것이 가능한 약제는 상기 유전자 또는 유전자 생성물에 특이적인 항체, 안티센스 DNA 또는 RNA 또는 유기 또는 무기 소분자를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. Gpr100 수용체 조절제는 단독으로 또는 약학적으로 수용 가능한 조성물의 일부로 투여된다. 예를 들어 Gpr100 수용체 조절제는 Gpr100 수용체 작용제 또는 길항제와 또는 다른 약학적으로 수용 가능한 화합물과 결합하여 투여된다. 예를 들어 추가 약학적 활성 화합물은 당분야에 알려진 항-당뇨제 또는 항-비만제 또는 다른 증후군 또는 질환의 치료를 위한 약제를 포함한다.
당뇨병 관련 장애 또는 체중 관련 장애의 치료 방법은 필요에 따라 피험체에 Gpr100 수용체 유전자 또는 Gpr100 수용체의 치료적으로 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함한다.
또다른 관점
본 발명의 또다른 관점 및 실시태양은 하기 항에 나타나 있고; 본 발명이 이들 관점을 포함함이 이해되어야 한다.
1항. 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드
2항. 1항에 따른 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산
3항. 2항에 있어서, 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함함을 특징으로 하는 핵산
4항. 1항에 따른 폴리펩타이드의 단편을 포함한 폴리펩타이드
5항. 3항에 있어서, 서열번호: 3과 서열번호: 5 사이에서 상동적인 하나 이상의 영역을 포함하거나 서열번호: 3과 서열번호: 5 사이에서 이형적인 하나 이상의 영역을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩타이드
6항. 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산
7항. 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산을 포함한 벡터
8항. 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 7항에 따른 벡터를 포함한 숙주 세포
9항. 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 7항에 따른 벡터를 포함한 형질전환 비-인간 동물
10항. 9항에 있어서, 마우스임을 특징으로 하는 형질전환 비-인간 동물
11항. G-단백질 결합 수용체와 특이적으로 상호작용하는 것이 가능한 화합물의 확인 방법에서의 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드의 이용
12항. G-단백질 결합 수용체와 특이적으로 상호작용하는 것이 가능한 화합물의 확인 방법에서의 9항 또는 10항에 따른 형질전환 비-인간 동물의 이용
13항. 후보 화합물에 Gpr100 수용체를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계 및 세포 내 순환성 AMP(cAMP)의 수치가 상기 접촉 결과에 의해 저하되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한 Gpr100 GPCR 길항제의 확인 방법
14항. 후보 화합물에 Gpr100 GPCR을 발현하는 세포를 접촉시키는 단계 및 상기 세포 내 순환성 cAMP(cAMP)의 수치가 상기 접촉 결과에 의해 저하되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한 순환성 AMP의 내인성 수치를 저하시키는 것이 가능한 화합물의 확인 방법
15항. 후보 화합물에 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드를 접촉시키는 단계 및 상기 후보 화합물이 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드에 결합하는지 여부를 측정하는 단계를 포함한 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드에 결합하는 것이 가능한 화합물의 확인 방법
16항. 11항 내지 15항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인된 화합물
17항. 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 화합물
18항. 항체의 제조 방법에서의 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부 또는 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산의 이용
19항. 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부 또는 2항, 3항 또는 6항에 따른 뉴클레오타이드에 의해 인코드되는 폴리펩타이드 또는 그의 일부에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 항체
20항. 약학적으로 수용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 하나 이상의 하기를 포함한 약학적 조성물: 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체
21항. 하나 이상의 하기를 포함한 백신 조성물: 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체
22항. 하나 이상의 하기를 포함한 질병 또는 질병 감수성에 대한 진단 키트: 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체
23항. 환자에게 Gpr100 GPCR의 길항제를 투여하는 단계를 포함한 증가된 Gpr100 GPCR 활성과 관련된 질환 증세를 나타내는 환자의 치료 방법
24항. 환자에게 Gpr100 GPCR의 작용제를 투여하는 단계를 포함한 감소된 Gpr100 GPCR 활성과 관련된 질환 증세를 나타내는 환자의 치료 방법
25항. 23항 또는 24항에 있어서, 상기 Gpr100 GPCR은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 서열을 지닌 폴리펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 방법
26항. 하나 이상의 하기를 환자에게 투여하는 단계를 포함한 환자 질병의 치료 및/또는 예방 방법: 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 19항에 따른 항체; 20항에 따른 약학적 조성물; 및 20항에 따른 백신
27항. 질병의 치료 또는 예방 방법에서 이용하기 위한 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체를 포함한 약제
28항. 질병의 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 제조시 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16항 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체의 이용
29항. 형질전환 동물이 변화된 Gpr100 유전자를 포함함을 특징으로 하는 비-형질전환 동물
30항. 29항에 있어서, 상기 변화는 Gpr100의 결실, 기능 손실을 유발하는 Gpr100의 돌연변이, 타겟되거나 무작위 돌연변이를 포함한 뉴클레오타이드 서열을 지닌 외인성 유전자의 Gpr100 내로의 도입, 또다른 종으로부터의 외인성 유전자의 Gpr100 내로의 도입 및 이들의 결합으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 비-인간 형질전환 동물
31항. 형질전환 동물이 그의 게놈 내에서 이형성 Gpr100 단백질을 인코드하는 트랜스유전자를 포함하고 발현하는, 기능적으로 분열된 내인성 Gpr100 유전자를 지닌 비-인간 형질전환 동물
32항. (a) 비-상동성 대치 부분; (b) 첫 번째 Gpr100 유전자 서열에 대해 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는, 비-상동성 대치 부분의 업스트림에 위치한 첫 번째 상동성 구역; 및 (c) 두 번째 Gpr100 유전자 서열에 대해 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지니고 자연발생적 내인성 Gpr100 유전자 내에서 첫 번째 Gpr100 유전자 서열의 다운스트림 위치를 지님을 특징으로 하는, 비-상동성 대치 부분의 다운스트림에 위치한 두 번째 상동성 구역을 포함한, 숙주 세포 내 Gpr100 유전자를 기능적으로 분열시키는 핵산 컨스트럭트
33항. Gpr100 GPCR 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산이 발현되는 조건 하에서 8항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한 Gpr100 GPCR 폴리펩타이드의 제조 방법
34항. 표본을 핵산에 특이적인 적어도 하나 이상의 핵산 프로브에 접촉시키는 단계 및 핵산의 존재에 대해 상기 표본을 모니터하는 단계를 포함한, 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 존재의 검출 방법
35항. 표본을 19항에 따른 항체에 접촉시키는 단계 및 폴리펩타이드의 존재에 대해 상기 표본을 모니터하는 단계를 포함한, 1항, 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 존재의 검출 방법
36항. Gpr100 GPCR의 증가되거나 감소되거나 비정상적인 발현에 의해 유발되거나 이에 관련된 질환의 진단 방법에 있어서, 상기 방법은 (a) 이러한 질환 증세를 나타내거나 나타낼 것으로 의심되는 동물 내에서의 Gpr100 GPCR 발현 수준 또는 패턴을 검출하는 단계; 및 (b) 발현 수준 또는 패턴을 정상 동물과 비교하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
도 1은 pfam의 HMM 구조 예측 소프트웨어(http://www.sanger.ac.uk/Software /Pfam/search.shtml)를 이용한 인간 Gpr100 폴리펩타이드(서열번호: 3)의 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 넉아웃 플라스미드의 도면이다.
도 3은 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 생성된 인간 Gpr100의 발현 프로파일을 나타낸 도면이다.
도 4는 Gpr100 넉아웃 마우스 및 야생형 대조군의 지방 조직의 조직학적 섹션을 나타낸 것이다.
도 5는 Gpr100 동물 유래의 혈액 표본의 분석 그래프를 나타낸 것이다.
도 5A는 Gpr100 수컷 동물 유래의 혈액 표본의 분석 그래프를 나타낸 것이다. 도 5B는 Gpr100 암컷 동물 유래의 혈액 표본의 분석 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은 야생형 동물 및 Gpr100 넉아웃 동물의 금식시 혈당 수치의 그래프이다.
도 7은 야생형 동물 및 Gpr100 넉아웃 동물 유래의 혈액 표본의 분석 그래프이다.
도 8은 야생형 동물 및 Gpr100 넉아웃 동물의 글루카곤 수치의 그래프이다.
도 9는 야간 금식된(16시간) 야생형 동물 및 Gpr100 넉아웃 동물의 당 내성 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 야간 금식된(16시간) 야생형 동물 및 Gpr100 넉아웃 동물의 당 수치의 그래프이다.
도 11은 야간 금식된(16시간) 야생형 동물 및 Gpr100 넉아웃 동물의 종말 혈액 표본 내 글루카곤 수치의 RIA 분석을 나타낸 그래프이다.
도 12는 당 내성 (GTT) 시험 후 0분, 60분 및 120분에서 인슐린 수치를 나타낸 것이다.
도 13은 금식 동안 0분, 60분 및 120분에서의 인슐린 수치를 나타낸 것이다.
서열번호
서열번호: 1은 인간 Gpr100의 cDNA 서열을 나타낸다. 서열번호: 2는 서열번호: 1 유래의 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. 서열번호: 3은 인간 Gpr100의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 4는 마우스 Gpr100 cDNA의 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. 서열번호: 5는 마우스 Gpr100의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 6-19는 벡터 컨스트럭트 프로모터 및 넉아웃 벡터 서열을 나타낸다.
(실시예 1) 형질전환 Gpr100 넉아웃 마우스
Gpr100 유전자 타겟 벡터의 구축
Gpr100 유전자는 게놈 데이터베이스의 상동성 검색을 이용하여 생물-정보학적으로 확인된다. 62 kb 게놈 컨티크(contig)는 다양한 데이터베이스로부터 집합되었다. 이러한 컨티크는 상동성 팔의 고안이 타겟 벡터 내로 클론될 수 있게 하는 충분한 측면 서열 정보를 제공하였다.
쥐과 Gpr100 유전자는 1개 코딩 엑손을 지닌다. 타겟 전략은 주요 막횡단 도메인을 포함한 코딩 서열 대부분을 제거하도록 고안된다. 구역의 측면에 위치한 3.1 kb 5'상동성 팔 및 1.8 kb 3' 상동성 팔은 PCR에 의해 증폭되고 단편은 타겟 벡터 내로 클론된다. 팔을 증폭시키는데 사용되는 각 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 5' 말단은 절단이 드문 제한 효소에 대한 다른 인식 사이트를 포함하고 벡터 폴리링커의 클로닝 사이트와 양립 가능하고 팔 자체가 결손되도록 합성된다. Gpr100의 경우 프라이머는 NotI/SpeI의 5' 팔 클로닝 사이트 및 AscI/FseI의 3' 팔 클로닝 사이트(관련 제한 효소를 포함한 사용된 타겟 벡터의 구조가 도 2에 나타나 있다)를 지니고 하기 프라이머 표에 기입된 바와 같이 고안된다.
팔 프라이머쌍(5'armF/5'armR) 및 (3'armF/3'armR)에 더하여 Gpr100 좌위에 대해 특이적인 또다른 프라이머가 하기 목적으로 고안된다: 분리된 추정 타겟 클론 내에서 타겟된 좌위의 서던 분석을 가능하게 하기 위해 각 팔 외부 및 그 이상으로 연장된 비-반복 게놈 DNA의 2개의 짧은 150∼300 bp 단편을 증폭시키는 5' 및 3' 프로브 프라이머쌍(5'prF/5'prR 및 3'prF/3'prR); 벡터 특이적 프라이머, 이러한 경우에는 Asc350과 함께 다중 PCR에 사용시 야생형, 이형접합성 및 동형접합성 마우스 사이의 구별을 가능하게 마우스 유전형 프라이머쌍(hetF 및 hetR); 및 마지막으로 벡터(TK5IBLMNL)의 3' 말단에 특이적인 프라이머, 이러한 경우 DR1과 쌍을 이룰 때 3' 팔 구역 말단의 다운tm트림을 어닐하고(anneal) 타겟 이벤트 특이적 1.9 kb 증폭기를 생성하는 타겟 선별 프라이머(3'scr). 바람직한 게놈 변화가 발생하고 무작위로 통합된 벡터 카피를 포함한 클론 배경으로부터 정확히 타겟된 세포의 확인을 가능하게 하는 경우 이러한 증폭기는 세포 유래의 주형 DNA로부터 유래될 수 있다. 타겟 전략에 사용된 이들 프라이머의 위치 및 Gpr100 좌위 구역의 게놈 구조가는 서열번호: 19에 나타나 있다.
Figure 112006087769872-PCT00002
상동성 팔의 위치는 Gpr100 유전자를 기능적으로 분열시키도록 선택된다. 타겟 벡터는 결실되는 Gpr100 영역이 Gpr100 유전자와 동일한 방향으로 배열된 촉진된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo) 유전자로 구성된 선택 카세트의 업스트림의 내인성 유전자 발현 수용체(프레임 독립적 lacZ 유전자)로 구성된 비-상동성 서열로 대치되도록 제조된다.
5' 및 3' 상동성 팔이 타겟 벡터 TK5IBLMNL 내로 클론되면 표준 분자생물학 기술을 이용하여 크고 매우 순수한 DNA 제제가 제조된다. 신선하게 준비된 무-내독소 DNA 20 ㎍이 암피실린 저항성 유전자와 박테리아의 복제 기원 사이의 벡터 백본 내에 특정 사이트에 존재하는 또다른 절단이 드문 제한효소 PmeI로 제한된다. 이후 선형화된 DNA가 침전되고 일렉트로포레이션을 위해 100 ㎕의 인산 완충 식염수 내에 재현탁된다.
일렉트로포레이션 24시간 후 트랜스펙트된 세포는 200 ㎍/ml 네오마이신을 함유한 배지 내에서 9일간 배양된다. 상동성 재조합이 내인성 Gpr100 유전자와 타겟 컨스트럭트 사이에서 발생한 클론을 확인하기 위해 클론은 96웰 플레이트 내로 수집되고 PCR(상기 기술된 프라이머 3'scr 및 Asc53을 사용하여)에 의해 선별되기 전에 복제되고 팽창된다. 양성 클론은 1∼5%의 비율로 확인될 수 있다. 이들 클론은 팽창되어 상기 기술된 바와 같이 표준 절차를 이용하여(Russ et al, Nature 2000 Mar 2;404(6773):95-99) 제조된 외부 5' 및 3' 프로브를 이용한 타겟 이벤트의 서던 블럿 확인을 위해 복사체가 동결되고 충분히 우수한 질의 DNA게 제조될 수 있게 한다. 진단 제한효소로 분해된 DNA의 서던 블럿이 외부 프로브와 하이브리다이즈되면 상동적으로 타겟된 ES 세포 클론은 돌연변이 밴드뿐만 아니라 변화되지 않은 야생형 밴드의 존재에 의해 증명된다. 예를 들어 5' 프로브를 이용하여 SpeI으로 분해된 게놈 DNA는 15.7 kb 야생형 밴드 및 8.5 kb 타겟된 밴드를 제공할 것이고; 3' 프로브를 이용한S peI 절단 DNA는 15.7 kb 야생형 밴드 및 11.5 kb 타겟된 밴드를 제공할 것이다.
Gpr100 GPCR 결함 마우스의 생성
C57BL/6 암컷 및 수컷 마우스가 교미되고 배반포가 임신 3.5일에 분리된다. 선택된 클론으로부터의 10∼12개 세포가 배반포 당 주입되고 7∼8개 배반포가 가임신된 F1 암컷의 자궁 내로 이식된다. 키메라 새끼의 새끼는 일부 높은 수준(100%까지)의 아구티 수컷(아구티 외피색은 타켓된 클론으로부터 유전된 세포의 기여를 나타냄)을 포함하여 태어난다. 이들 수컷 키메라는 암컷 MF1 및 129 마우스와 교미되고 생식계열 전달은 각각 아구티 외피색 및 PCR 유전형에 의해 측정된다.
PCR 유전형분석은 세 번째 벡터 특이적 프라이머(Asc350)와 함께 프라이머 hetF 및 hetR을 이용하여 용해된 꼬리 클립 상에서 수행된다. 이러한 다중 PCR은 285 bp 밴드를 제공하는 프라이머 hetF 및 hetR로부터 야생형 좌위(존재하는 경우)로부터의 증폭을 가능하게 한다. hetF에 대한 사이트는 넉아웃 마우스 내에서 결실되고, 따라서 이러한 증폭은 타겟된 대립유전자로부터 실패될 것이다. 그러나 Asc350 프라이머는 3' 팔의 바로 내부의 영역을 어닐하는 hetR 프라이머와 결합하여 타겟된 좌위로부터 397 bp 밴드를 증폭시킬 것이다. 따라서 이러한 다중 PCR은 하기와 같은 새끼의 유전형을 나타낸다: 야생형 표본은 단일 285 bp 밴드를 나타내고; 이형접합성 DNA 표본은 285 bp 및 397 bp의 2개 밴드를 산출하고; 동형접합성 표본은 타겟 특이적 397 bp 밴드만을 나타낼 것이다.
Gpr100 수용체 유전자 내 결함을 지닌 형질전환 마우스는 대사 이상을 나타낸다. 특히 높은 지방 식이 노출 후 형질전환 마우스는 야생형 대조군과 비교시 체중, 신장 및 체지방이 더 적게 증가되었고 이는 Gpr100 수용체의 분열이 높은 지방 식이에 반응한 체중 증가 및 체지방 증가에 대한 일부 저항성을 제공함을 나타낸다. 이러한 체중 증가에 대한 저항성은 당뇨병 및 비만과 같은 관련 장애의 치료 및/또는 예방에 대한 가치 유용한 견지를 제공한다. 이와 같이 Gpr100 수용체는 당뇨병 관련 장애의 치료를 위한 치료제의 개발을 위한 타겟으로서 유용하다.
(실시예 2) 생물학적 데이터: 혈청 화학: 혈액
표본은 주시기 내 종말 심장 관통을 통해 수집되었다. 각각의 전체 혈액 표본의 100 ㎕가 EDTA로 미리-충진된 시험관에 옮겨졌다. 잔여 혈액 표본은 겔 분리기를 지닌 혈청 시험관 내에서 원심분리에 의해 혈청으로 전환되었다. 이후 각 혈청 표본은 하기에 기술된 바와 같이 분석되었다. 노화 마우스에 대한 비-종말 혈액 표본이 모세관 내 눈뒤 정맥 관통을 통해 수집된다. 이러한 절차는 혈청 화학 분석(하기 참조)을 위해 겔 분리기를 지닌 혈청 시험관 내로 옮겨지거나 혈액학 분석을 위해 EDTA로 미리-충진된 시험관 내로 옮겨지는 전체 혈액의 약 200 ㎕를 산출한다.
혈청은 표준 실험 기술을 이용하여 분석되었고 하기 파리미터에 대해 분석되었다: 인슐린, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 알부민, 알칼리성 포스파타제, 아스파라긴산 트랜스퍼라제, 중탄산염, 총 빌리루빈, 혈중 요소 질소, 칼슘, 염소, 콜레스테롤, 크레아틴 키나제, 크레아티닌, 글로불린, 포도당, 고밀도 지단백질(HDL), 유산 탈수소효소, 저밀도 지단백질(LDL), 몰랄삼투압농도, 칼륨, 총 단백질, 나트륨 및 트리글리세라이드.
(실시예 3) 생물학적 데이터: 조직학 및 밀도계측 분석
금식 후 지방 조직 조직학
마우스(돌연변이 및 야생형 모두 n=4)는 16시간 동안 금식 후 사살되었고 백색 지방 조직이 해부되어 표준 조직학 프로토콜에 따라 4% 파라포름알데하이드 내에서 고정되었고 왁스 내에 함몰되어 절단되고 헤마톡실린 및 에오신을 이용하여 염색되었다.
결과는 도 4에 나타나 있다. 도 4는 4마리의 돌연변이체 및 4마리의 야생형 유래의 백색 지방 조직을 나타내고, 상단 패널은 금식되지 않은 대조군 동물을 나타내고, 하단 3개 패널은 금슥된 동물 유래 조직을 나타낸다.
데이터는 금식 후 야생형 마우스는 지방세포 크기의 감소를 지님을 나타낸다. 이러한 감소는 KO 마우스에서 관잘되지 않고 따라서 이는 KO가 금식 동안 지방을 동원할 수 없음을 나타낸다.
밀도계측
마우스는 사살되었고 PiximusTM 밀도계측기를 이용하여 분석되었다. x-선 소스는 마우스를 고에너지 및 저에너지 x-선의 빔에 노출시켰다. 고에너지 및 저에너지의 감쇠는 연조직으로부터 또한 조직 표본, 기름기 없는 부분 및 지방으로부터 뼈의 분리를 가능하게 하였다. 골 무기질 밀도(Bone Mineral Density)(g/㎠로 표기되는 BMD), 골 무기질 함량(Bone Mineral Content)(g으로 표기되는 BMC), 골 및 조직 면적, 총 조직 중량 및 신체 연소직의 비율로서 지방(지방 %로 표기)가 수득되었고 기록되었다.
연령- 및 성-매치된 대조군 마우스와 비교시 동형접합성 돌연변이 마우스는 증가된 신체 연조직의 비율로서 지방(지방 %)을 나타내었다. 이러한 증가된 지방 비율은 약 49일령의 암컷 동형접합성 돌연변이 마우스에서 관찰되었다. 지방 비율의 이러한 증가는 마우스가 정상 식이(고 지방 식이가 아닌)에 노출시 더욱 관찰되었다.
미터법: 신장 및 체중은 고 지방 식이 시험에 걸쳐 기록되었다.
결과: 넉아웃 마우스는 당뇨병 및 비만의 대사적 특성을 나타내었다.
넉아웃 마우스는 약 8주간 고 지방 식이 시험이 수행되었고 포도당 내성 시험이 수행되었다. 또한 밀도계측 측정 및 체중 및 신장도 고 지방 식이 시험 후 기록되었다.
포도당 내성 시험(GTT): 마우스는 약 5시간 동안 금식되었고 꼬리 말단으로부터 약 5∼10 ㎕의 혈액을 수집하고 글루코미터(Glucometer Elite, Bayer Corporation, Mishawaka, IN)를 이용하여 주사전에 꼬리 정맥 혈당 수치가 측정되었다. 포도당 수치는 T=0 이산에 대해 이용되었다. 마우스는 t=0에 체중이 측정되었고 포도당이 체중 킬로그램 당 약 2 그램의 용량으로 경구 투여 또는 복막내 주입되었다. 혈장 포도당 농도는 기초(T=0) 혈당을 측정하는데 이용한 것과 동일한 방법에 의해 주입 후 약 15분, 30분, 60분, 90분 및 120분에 측정되었다.
마우스는 약 1주간 음식물 및 자유가 허락된 우리에 복귀되었고 GTT가 반복되었다. 두 시험에 대한 포도당 수치는 통계 분석으로 평균을 내었다. 이원 통계 유의성은 Student t-test를 이용하여 수립되었다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 정의된다.
(실시예 4) 생물학적 데이터: 인슐린 억제 시험(IST)
꼬리 정맥 포도당 수치 및 체중은 상기 GTT에서와 동일하게 t=0에서 측정되었다. 인슐린(Humulin R, Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN)은 중국식 식이(또는 고 지방 식이)의 수컷 마우스에 대해 체중 킬로그램 당 약 0.5∼0.7 유니트로 복막내 주입에 의해 투여된다. 암컷 마우스가 사용되는 일부의 경우 체중 킬로그램 당 0.5 유니트의 인슐린이 사용된다. 혈장 포도당 수치는 인슐린 주입 후 약 15분, 30분, 60분, 90분 및 120분에 측정되고 기초 포도당의 퍼센트로 표기된다. 수득된 포도당 수치는 예를 들어 인슐린에 반응한 특정 조직의 포도당 흡수 능력과 같은 인슐린에 대한 마우스의 민감도를 나타낸다.
(실시예 5) 생물학적 데이터: 포도당-자극 인슐린 분비 시험(GSIST)
T=0에서의 혈청 인슐린 수치를 측정하기 위해 꼬리 정맥 혈액 표본이 시험 전 수집되었다. 포도당은 마우스 체중 킬로그램 당 약 2 그램으로 경구로 또는 복막내 주입에 의해 투여된다. 이후 꼬리 정맥 혈액 표본은 포도당 로딩 후 약 7.5분, 15분, 30분 및 60분에 수집된다. 혈청 인슐린 수치는 ELISA 키트(Crystal Chem Inc., Chicago, II)에 의해 측정된다.
대사 챔버
마우스는 대사 챔버(Columbus Instruments, Columbus, Ohio). 내에 개별적으로 하우스된다. 대사율(VO2/Kg/hr), 호흡교환율(RER = VC02/V02), 활동/운동 활성 및 음식물 및 수분 섭취는 약 48시간 동안 모니터된다. 데이터는 48분 마다 기록된다. 이후 야간 금식의 식욕항진성 반응을 관찰하기 위해 마우스는 약 18시간 동안 야간 금식되고 동일한 데이터는 다음 약 24시간 동안 수집된다.
밀도계측
체지방 조성 및 골 무기질 밀도(BMD)는 DEXADEXA(이중 에너지 X-선 흡수계측) 밀도계측기(Piximus, GE Medical Systems Lunar, Madison, WI)에 의해 분석된다.
부검
혈액은 표준 혈청 화학 및 ELISA에 의한 렙틴의 혈청 수치 측정을 위해 심장 관통에 의해 수집된다. 장간막, 부고환, 서혜부 및 갈색 지방 패드는 개별적으로 측량되어 지방 분포를 평가한다. 췌장, 간 및 신장은 조직학적 분석을 위해 수집된다.
당뇨병 및 포도당 내성에서의 Gpr100 수용체 유전자의 역할은 Gpr100 수용체 유전자 결함이 야생형 마우스와 비교시 상기 시험에서 차별적인 행동을 나타냄으로서 지지된다.
(실시예 6) 생물학적 데이터: 금식 동안 시간 경과에 따른 혈당 수치의 측정
돌연변이 및 야생형 동물은 16시간 금식되고 꼬리 정맥 혈액 표본이 OneTouch Ultra Glucometer(LifeScan)를 이용하여 채취된다.
도 5는 수컷(돌연변이 및 야생형에 대해 n=7) 및 암컷(돌연변이 및 야생형에 대해 n=7) 유래의 혈당 수치를 나타낸다. 도면은 동일 연령에서 두 성의 시험된 돌연변이는 유의적으로 감소된 혈당을 지님을 나타낸다.
(실시예7) 생물학적 데이터: 금식 동안 시간 경과에 따른 혈당 및 인슐린 수치의 측정
기초 혈당(OneTouch Ultra Glucometer(LifeScan)를 이용)이 돌연변이 및 연령 매치된 WT 수컷 동물(n=5)로부터 채취된다. 음식물이 제거된 후 동물은 청결한 우리로 이동되고 포도당 측정이 매시간 마다 이루어진다.
결과(도 6)는 돌연변이의 혈당 수치가 금식 5시간과 6시간 사이에 야생형 동물 보다 유의적으로 낮게 저하됨을 나타낸다. 이는 글리코겐 저장의 고갈 후 FAO의 스위치를 작동시키는 동물 능력의 결함에 기인할 수 있다.
금식 시도 실험은 6마리의 n 돌연변이 및 야생형에서 반복된다(도 7 참조). 다시 초기 혈당 표본이 시험되고 동일한 시간에 혈액 표본(약 50 ㎕)이 기초 인슐린 측정을 위해 꼬리로부터 채취된다. 음식물이 제거된 후 동물은 청결한 우리로 이동되고 포도당 측정이 매시간 마다 이루어진다. 혈액 표본은 6시간에 인슐린 측정을 위해 꼬리 정맥으로부터 채취되고; 이러한 표본 및 기초 표본은 30분간 상온에서 응혈되도록 방치된 후 5분간 10,000 rpm에서 원심분리된다. 혈청이 제거되고 추가 분석때까지 -80℃에서 보관된다.
본 실험에서 금식은 12시간까지 연장된다. 실험 종료시점에서 항응고제로서 EDTA를 이용하여 종말 혈액 표본이 CO2 과잉 투여에 노출된 동물의 대정맥으로부터 채취되고, 이러한 표본의 50㎕가 인슐린 측정을 위해 채취되고 이는 상기 파라미터에 따라 원심분리되고 수득된 혈청은 추가 분석때까지 -80℃에서 보관된다. 잔여 전체 혈액은 500 KIU/ml의 최종 농도를 제공하기 위해 첨가된 아프로티닌(aprotinin)을 지녔고, 이후 이는 상기와 같이 원심분리되고 혈청이 채취되어 추가 분석때까지 -80℃에서 보관된다.
결과는 도 7 및 도 13에 나타나 있다. 이들 실험은 음식물 제거 6시간 후 야생형보다 유의적으로 저하된 돌연변이 동물의 혈당 수치를 나타내고, 인슐린 수치는 야생형 동물보다 돌연변이에서 증가됨을 나타내고, 이는 돌연변이가 고인슐린혈증임을 나타낸다.
(실시예 8) 생물학적 데이터: 금식 동안 시간 경과에 따른 글루카곤 수치의 측정
글루카곤 수치는 제조사의 지침에 따라 Glucagon RIA(Linco)를 이용하여 상기 기술된 종말 표본 내에서 측정된다.
도 8에 나타난 바와 같이 돌연변이와 야생형 간의 차이는 존재하지 않는다. 따라서 감소된 포도당 수치의 존재시 돌연변이는 일반적으로 저혈당 상태로 예측되는 글루카곤의 증가를 나타내지 않는다. 이는 상기 동물이 글리코겐의 공급 고갈시 지방산 산화의 스위치를 작동시킬 수 없다는 가설을 유도한다.
(실시예 9) 생물학적 데이터: 포도당/인슐린 내성 시험
포도당 내성 및 인슐린 분비는 2 mg/g(용량/그램 체중)으로 복막내 주입 후 야간 금식된 마우스에서 측정된다. 기초 혈당은 OneTouch Ultra Glucometer (LifeScan)로 측정되고 50 ㎕의 표본이 인슐린 측정을 위해 꼬리로부터 채취된다. 이러한 표본은 상온에서 30분간 응혈된 후 미리 원심분리된다. 이후 각각의 동물(n=7)은 포도당 시험된 후 포도당 측정이 주입 후 15분, 30분, 60분 및 120분에 수행된다. 주입 후 60분에 또다른 혈액 표본이 인슐린 측정을 위해 꼬리로부터 채취되고; 이는 기초 표본과 동일한 방법을 이용하여 준비된다. 실험 결론으로서 종말 혈액 표본이 상기 12시간 금식 시험에 대해 기술된 바와 같이 채취된다. Guerre-Millo, M., et al. (2001) "PPAR-α-null mice are protected from high-fat diet-induced insulin resistance." Diabetes 50: 2809-2814 참조.
결과는 도 9, 도 10 및 도 12에 나타나 있다.
돌연변이 동물은 0 시간에 혈당 수치를 저하시켰고 이는 앞선 결과에 기반한 16시간 금식 후 이들 동물에서 예측되는 것이고, 이러한 저하는 곡선 분석 하의 GTT 면적이 통계적으로 다름을 의미한다(데이터는 나타내지 않음). 그러나 데이터가 정상화되어 기초 이상으로 변화되면 돌연변이 동물과 야생형 동물의 포도당 시험 반응 사이의 차이점이 존재하지 않는다.
종말 혈액 표본 내 글루카곤 수치의 RIA 분석은 유의적으로 변경된 글루카곤 수치를 지님을 나타낸다. 결과는 도 11에 나타나 있다.
인슐린 수치의 ELISA 분석은 인슐린 수치가 야생형 동물보다 돌연변이에서 더 높은 수치로 증가됨을 나타내고, 이는 돌연변이가 고인슐린혈증임을 나타낸다.
요약적으로 Gpr100 돌연변이 동물은 야간 금식의 대사 스트레스 후 심한 저혈당증을 나타내고, 이는 음식물 고갈 6시간 후 명백해진다. 돌연변이는 포도당에 대한 정상 내성을 지니고 글루카곤 수치의 유의적인 변화를 나타내지 않는다. 총괄적으로 이들 데이터는 돌연변이 동물이 연료 생성을 위한 지방산 산화 스위치 작동 능력의 결함을 지님을 나타낸다.
참고문헌: Steneberg, P., et al. (2005) "The FFA receptor GPR40 links hyperinsulinemia, hepatic steatosis, and impaired glucose homeostasis in mouse." Cell Metabolism 1: 245-258.
상기 명세서에 기술된 모든 문헌은 참고문헌에 포함된다. 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 정신에 위배됨이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 결합하여 기술되었으나 청구된 본 발명은 이러한 특정한 실시태양에 부당하게 한정되지 않고 이에 대한 많은 변형 및 추가가 본 발명의 범위 내에서 이루어짐이 이해되어야 한다. 실제로 분자생물학 또는 관련 분야의 숙련자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방법의 다양한 변형은 청구범위 내에 존재한다.
SEQUENCE LISTING <110> PARADIGM THERAPEUTICS LIMITED <120> RECEPTOR <130> P020555WO <140> PCT/GB2005/002434 <141> 2005-06-21 <150> GB0413872.3 <151> 2004-06-21 <150> US 60/586,618 <151> 2004-07-09 <150> GB 0423327.6 <151> 2004-10-20 <150> US 60/620,854 <151> 2004-10-21 <160> 25 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1237 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gagaagcact taattctaca gcctccttcc tagagccttc agtggcctct gccagtctgg 60 cagacacttg cagacctctc ttctcagcac caccaatctc tgatgccctg cgatgcccac 120 actcaatact tctgcctctc cacccacatt cttctgggcc aatgcctccg gaggcagtgt 180 gctgagtgct gatgatgctc cgatgcctgt caaattccta gccctgaggc tcatggttgc 240 cctggcctat gggcttgtgg gggccattgg cttgctggga aatttggcgg tgctgtgggt 300 actgagtaac tgtgcccgga gagcccctgg cccaccttca gacaccttcg tcttcaacct 360 ggctctggcg gacctgggac tggcactcac tctccccttt tgggcagccg agtcggcact 420 ggactttcac tggcccttcg gaggtgccct ctgcaagatg gttctgacgg ccactgtcct 480 caacgtctat gccagcatct tcctcatcac agcgctgagc gttgctcgct actgggtggt 540 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Thr Cys Glu Leu Glu Arg Val Leu Pro Thr Ala 225 230 235 240 Leu Leu Val Thr Leu Trp Leu Ala Tyr Val Asn Ser Cys Leu Asn Pro 245 250 255 Ile Ile Tyr <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence <400> 21 Leu Thr Leu Pro 1 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence <400> 22 Trp Pro Phe Gly 1 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence <400> 23 Ala Leu Cys Lys 1 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence <400> 24 Tyr Ala Ser Ile 1 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence <400> 25 Asn Ser Cys Leu Asn Pro 1 5

Claims (22)

  1. 후보 분자가 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 Gpr100 폴리펩타이드의 작용제인지 또는 길항제인지 여부를 측정하는 단계를 포함한 Gpr100 관련 질환 특히, 당뇨병 및 비만의 치료, 예방 또는 완화에 적당한 분자의 확인 방법
  2. 제 1항에 있어서, 상기 Gpr100 폴리펩타이드는 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 핵산 서열에 의해 인코드됨을 특징으로 하는 방법
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 후보 분자를 Gpr100 폴리펩타이드에 노출시키는 단계 및 이러한 노출의 결과로서 세포내 칼슘 수치의 변화를 검출하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 비-인간 동물 또는 그의 일부, 바람직하게는 세포, 조직 또는 기관을 후보 분자에 노출시키는 단계 및 상기 동물의 생물학적 파 라미터가 상기 접촉 결과에 의해 변화되는지 여부를 측정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
  5. 제 4항에 있어서, 상기 생물학적 파라미터는 혈청 포도당 수치, 체중, 글루카곤 수치, 지방 비율로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
  6. 포도당 조절 또는 Gpr100 관련 질환, 바람직하게는 비만 또는 당뇨병에 대한 모델로서 기능적으로 분열된 내인성 Gpr100을 지닌 형질전환 비-인간 동물 또는 그의 분리된 세포 또는 조직의 이용
  7. 제 6항에 있어서, 상기 형질전환 비-인간 동물은 기능적으로 분열된 Gpr100 유전자를 포함하고, 바람직하게는 Gpr100 유전자 또는 그의 일부 내의 결실을 포함함을 특징으로 하는 이용
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 형질전환 비-인간 동물은 야생형 동물과 비교시 하나 이상의 하기 표현형의 변화를 나타냄을 특징으로 하는 이용: 감소된 혈청 포도당 수치, 증가된 체중, 높은 지방 비율
  9. 제 6항, 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 형질전환 비-인간 동물은 설치류, 바람직하게는 마우스임을 특징으로 하는 이용
  10. Gpr100 관련 질환, 바람직하게는 비만 또는 당뇨병의 치료, 예방을 위한 작용제 또는 길항제의 확인을 위한 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 Gpr100 폴리펩타이드의 이용
  11. Gpr100 관련 질환, 바람직하게는 비만 또는 당뇨병의 치료, 예방을 위한 작용제 또는 길항제의 확인을 위한 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 Gpr100 폴리뉴클레오타이드의 이용
  12. Gpr100 관련 질환, 바람직하게는 당뇨병 또는 비만의 치료, 예방 또는 완화 에 이용하기 위한 Gpr100 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법에서의 비-인간 동물 또는 그의 일부, 바람직하게는 세포, 조직 또는 기관의 이용
  13. Gpr100 관련 질환, 바람직하게는 비만 또는 당뇨병의 치료, 예방 또는 완화를 위한 상기 어느 한 항에 따른 방법 또는 이용에 의해 확인된 작용제 또는 길항제의 이용
  14. 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 90% 이상 동일한 서열을 포함한 개체 내 Gpr100 폴리펩타이드의 활성을 조절함으로서 개체 내 포도당 조절, 지방 대사 또는 체중 증가의 조절 방법
  15. 제 14항에 있어서, Gpr100의 작용제 또는 길항제를 개체에 투여하는 단계를 포함한 방법
  16. 개체 내의 Gpr100 폴리펩타이드의 활성 또는 함량을 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함한 Gpr100 관련 질환 증세를 나타내는 개체의 치료 방법
  17. 제 16항에 있어서, Gpr100 폴리펩타이드, Gpr100 폴리펩타이드의 작용제 또는 Gpr100의 길항제를 개체 내로 투여하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
  18. (a) Gpr100 관련 질환의 증세를 나타내거나 증세를 나타낼 것으로 의심되는 동물의 Gpr100 폴리펩타이드의 발현 수치 또는 패턴을 검출하는 단계; 및 (b) 상기 발현 수치 또는 패턴을 정상 동물과 비교하는 단계를 포함한 Gpr100 관련 질환의 진단 방법
  19. Gpr100 관련 질환의 증세를 나타내는 것으로 의심되는 개체 내에서 제 5항에 나타난 생물학적 파라미터의 변화를 검출하는 단계를 포함한 Gpr100 관련 질환의 진단 방법
  20. 하나 이상의 하기를 포함한 Gpr100 관련 질환, 바람직하게는 비만 또는 당뇨병에 대한 감수성용 진단 키트: Gpr100 폴리펩타이드 또는 그의 일부; Gpr100 폴리펩타이드에 대한 항체; 또는 이를 인코드하는 것이 가능한 핵산
  21. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 Gpr100 관련 질환은 비만 또는 체중 증가, 식욕 억제의 장애를 포함한 비만, 대사 장애, 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병을 포함한 당뇨병 및 관련 장애 및 체중 관련 장애, 손상된 포도당 내성, 인슐린 저항성 증후군, 증후군 X, 말초신경병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병 관련 단백뇨, 고혈당증, 고지혈증, 유지질이상혈증(dyslipoidemia), 고중성지방혈증을 포함한 지질 대사 이상, 급성 췌장염, 심혈관질환, 말초혈관질환, 고혈압, 심장 비대, 허혈성 심장병, 고콜레스테롤혈증, 비만, 비만 또는 체중 증가의 장애로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법
  22. 수반된 도 1 내지 13을 참고로 전술된 방법 또는 이용
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