CN101137668B - 与可溶性G蛋白偶联受体(sGPCR)有关的组合物与方法 - Google Patents
与可溶性G蛋白偶联受体(sGPCR)有关的组合物与方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及可溶性G-蛋白偶联受体(sGPCR)相关的组合物与方法。在某些方面,本发明包括涉及可溶性促肾上腺皮质素释放因子受体相关蛋白,sCRFR2的组合物与方法,及其对GPCR信号转导和GRF家族配体与CRFR受体间相互作用的影响,所述CRFR受体包括但不限于CRFR2、CRFR1和它们的功能变体或能转导信号的变体。
Description
本申请要求2005年2月8日提交的临时美国专利申请号60/650,866的优先权,该份申请全文纳入本文作为参考。
按照NIDDK的基金号DK26741,美国政府对本发明享有权利。
I.技术领域
本发明总体上涉及与分子生物学、神经学和内分泌学有关的方法和组合物。在某些方面,本发明涉及包含可溶性G蛋白偶联受体(sGPCR)的组合物和这种受体的用法,所述受体可作为GPCR活性的调节剂和/或结合这种可溶性GPCR的配体的药理学作用调节剂。
Ⅱ.发明背景
受体通常是位于细胞膜或细胞内的结构分子,其能与诸如抗原、激素或神经递质形成弱的可逆键。各种受体结合特定物质。一具体受体家族是7跨膜(“7TM”)或G蛋白偶联受体(“GPCR”)。当合适的物质与这些受体结合时,这类受体可与鸟嘌呤核苷酸-结合的G-蛋白(“G-蛋白”)连接以转导信号。当G-蛋白与鸟嘌呤二磷酸(“GDP”)结合时,G-蛋白失活或处于“关闭位置”。类似地,当G-蛋白与鸟嘌呤三磷酸(“GTP”)结合时,G-蛋白活化或处于“打开位置”,从而介导了细胞中生物学应答的活化。
GPCR具有共同的结构基序。所有这些受体均具有7段22-24个疏水性氨基酸的序列,形成7个α螺旋,各螺旋跨越细胞膜(即,跨膜-1(TM-1)、跨膜-2(TM-2)等)。这些跨膜螺旋通过细胞膜外部或“胞外”侧的跨膜-2和跨膜-3、跨膜-4和跨膜-5及跨膜-6和跨膜-7之间的氨基酸链相连(这些螺旋称为“胞外环”或“胞外”区域)。这些跨膜螺旋也通过细胞膜内部或“胞内”侧的跨膜-1和跨膜-2、跨膜-3和跨膜-4及跨膜-5和跨膜-6之间的氨基酸链相连(这些螺旋称为“胞内环”或“胞内”区域)。此类受体的“羧基”(“C”)末端位于细胞内的胞内空间,而受体的“氨基”(“N”)末端位于细胞外的胞外空间。
总体上,当配体与受体结合并“激活”受体时,胞内区域的构象发生变化而与胞内“G-蛋白”偶联。据报道,GPCR不区分G-蛋白,即GPCR能与多种G-蛋白相互作用(Kenakin,1988)。虽然存在其它G-蛋白,目前已鉴定的G蛋白是Gq、Gs、Gi和Go。配体激活的GPCR与G-蛋白偶联启动信号转导级联反应或信号转导。正常情况下,信号转导最终导致细胞激活或细胞抑制。据认为,受体的第三个胞内环(IC-3)以及羧基末端与G-蛋白相互作用。
总体上,几乎每个体内细胞的活性都受胞外信号的调节。人与各种生物中的许多生理活动利用蛋白质通过GPCR介导跨膜信号转导。特定GPCR信号可导致细胞中G-蛋白的激活。大多数信号通过GPCR传递到细胞内。该信号转导途径的许多不同方面涉及GPCR的多种受体亚型和它们的G-蛋白相连对应物及各种相连的胞内二级信使。根据所涉及的蛋白质,信号转导可导致一种或多种胞内途径的总体或部分激活或灭活。能与GPCR结合的重要信号转导分子或神经递质包括但不限于:促肾上腺皮质素释放因子、甲状旁腺素、吗啡、多巴胺、组胺、5-羟色胺、腺苷、降钙素、抑胃肽(GIP)、胰高血糖素、生长激素释放激素(GHRH)、甲状旁腺素(PTH)、PACAP、肠促胰液素、血管活性肠肽(VIP)、利尿激素、EMR1、latrophilin、脑特异性血管生成抑制剂(BAI)、钙粘蛋白、EGF、LAG、(CELSR)和其它相似的蛋白质或分子。
GPCR构成了一个蛋白质超家族。目前,参考文献报道有超过2000种GPCR,它们分成至少3个家族:视紫红质样家族(家族A)、降钙素受体(家族B)和亲代谢性谷氨酸盐家族(家族C)(Ji等,1998)。报道的GPCR包括已表征的受体和配体尚未鉴定的孤儿受体(Wilson等,1999;Wilson等,1998;Marchese等,1999)。虽然有许多GPCR,但各种GPCR通常具有相似的分子结构。各GPCR包含长度不同的氨基酸残基链。GPCR位于细胞膜内称为跨膜区的7个不同卷曲(coil)中。GPCR的氨基末端位于细胞外,含有胞外环,而羧基末端位于细胞内,含有胞内环。
GPCR的配体包括小分子以及肽和小蛋白质。这些配体与其受体间的相互作用在不同系统之间不同,但它们可能需要与4个胞外结构域中几个的残基和N-末端相互作用。在一些情况中,单单N-末端也可以保留与配体相互作用或结合的能力。GPCR及其已知的配体与许多疾病有关,包括多发性硬化症、糖尿病、类风湿性关节炎、哮喘、过敏症、炎性肠病、几种癌症、甲状腺病、心脏病、色素性视网膜炎、肥胖症、神经障碍、骨质疏松、人免疫缺陷病毒(“HIV”)感染和获得性免疫缺陷综合征(“AIDS”)(Murphy等,2000;Mannstadt等,1999;Berger等,1999;Jacobson等,1997;Meij,1996)。
因此,本领域需要产生GPCR和结合GPCR的配体的调节剂作为治疗剂的方法。这些治疗剂可用于预防或治疗GPCR相关疾病和/或病症。
发明简述
本发明涉及与sGPCR配体结合域有关的组合物和方法,以及sGPCR对GPCR信号转导和GPCR配体与其GPCR之间相互作用的影响。
本发明一实施方式包括分离的可溶性G-蛋白偶联受体(sGPCR)配体结合域。sGPCR包含GPCR的全部或部分胞外结构域。在本发明的一个方面,sGPCR是可溶形式GPCR家族B的成员。在另一方面,sGPCR是GPCR亚族B1的成员。在还有另一方面,sGPCR是可溶性肠促胰液素受体、VPAC1受体、VPAC2受体、PAC1受体、胰高血糖素受体、生长激素释放激素(GHRH)受体、胰高血糖素相关肽1(GLP-1)受体、胰高血糖素相关肽2(GLP-2)受体、抑胃肽(GIP)受体、促肾上腺皮质素释放因子1(CRF1)受体、促肾上腺皮质素释放因子2(CRF2)受体、甲状旁腺素1(PTH1)受体、甲状旁腺素2(PTH2)受体、降钙素受体-样受体或降钙素(calcitoinin)受体。sGPCR可以是可溶性PTH1受体或PTH2受体。本发明一实施方式也包括的sGPCR是可溶形式的2α型促肾上腺皮质素释放因子受体(sCRFR2α)。sCRFR2α的氨基酸序列包含CRFR2α基因的外显子3、4和5编码的氨基酸序列,或者不含有外显子6或更多外显子(编码的序列)。本发明的重组sGPCR可包括GPCR胞外结构域的75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、130、135、140、150、155、160、180、200或更多个(或之间的所有范围)氨基酸,包括氨基末端的全部或部分胞外结构域。在某些方面,sGPCR配体结合域可包含与SEQ ID NO:4(sCRFR2α)、SEQ ID NO:8(sCRFR2β)、SEQ ID NO:12(sCRFR2γ)或SEQ ID NO:15(mCRFR2α)的50、75、100、125、150或更多个氨基酸至少有70、75、80、85、90、95或98%相似的氨基酸序列。在另一方面,sCRFR包含SEQ ID NO:4、8、12、15或其组合的氨基酸序列。在还有另一方面,本发明包括的分离sGPCR还包含亲和标签、标记、可检测或治疗性化学部分、生物素/亲和素标记、放射性核素、可检测或治疗性酶、荧光标记、化学发光标记、免疫球蛋白结构域或它们的任何组合。在一方面,GPCR包含免疫球蛋白结构域,特别是Fc结构域。可将sGPCR与聚合物偶联,所述聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)。
本发明实施方式包括编码本发明sGPCR的多核苷酸。多核苷酸还可包含与编码sGPCR的多核苷酸操作性偶联的启动子。sGPCR编码序列可包含在表达盒中。表达盒可包含在表达载体中。表达载体可包括但不限于:线形核酸、质粒表达载体或病毒表达载体。在某些方面,表达载体包含在递送载体中,所述递送载体包括但不限于:脂质体、多肽、聚阳离子、脂质、细菌或病毒。
本发明其它实施方式包括调节G-蛋白偶联受体(GPCR)活性的方法,包括:a)使靶组织与sGPCR接触;和b)使GPCR配体结合于靶组织附近而调节靶组织中的GPCR活性得以调节。所述配体可以是GPCR家族B的配体、GPCR亚族B1的配体。在某些方面,所述配体是促肾上腺皮质素释放因子(CRF)、尿皮质醇1、尿皮质醇2、尿皮质醇3、stresscopin、甲状旁腺素、PTH-相关激素、TIP39、降钙素、胰岛淀粉样多肽、CGRP(CALCA和CALCB)、肾上腺髓质肽、肠促胰液素、VIP、PACAP、胰高血糖素、GHRH、GLP-1、GLP-2、GIP或它们的任何组合。这些方法也可包括接触靶组织,包括以下步骤:a)将sGPCR配体结合域配制成合适的药物溶液;和b)给予动物、人、对象和/或患者能影响所述动物靶组织中靶配体结合用量的该药物溶液。给药可以是但不限于:服食、注射、内窥镜给药或灌注。注射包括但不限于:静脉内、肌肉内、皮下、真皮内、颅内或腹膜内注射。可治疗、缓解、调节或减轻严重程度的疾病包括GPCR过度活化(hyperactivation)或GPCR配体分泌过多造成的疾病。在某些方面,所述疾病是胰岛素敏感或II型糖尿病。所述疾病也包括焦虑相关疾病;情感障碍;创伤后应激障碍;核上性麻痹;免疫抑制;药物或酒精戒除症状;炎性疾病;疼痛;哮喘;银屑病和过敏症;恐怖症;应激诱导的睡眠障碍;纤维肌痛;精神抑郁症(dysthemia);双相性精神障碍;循环性情感;疲劳综合征;应激诱导的头痛;癌症;人免疫缺陷病毒感染;神经变性疾病;胃肠道病症;进食障碍;出血性应激;应激诱导的精神病(stress-induced psychotic episodes);甲状腺机能正常的病态综合征(euthyroid sick syndrome);不合适的抗腹泻激素综合征(syndrome of inappropriate antidiarrhetic hormone);肥胖症;不育症;头部创伤;脊髓创伤;缺血性神经元损伤;兴奋性中毒神经元损伤(excitotoxic neuronaldamage);癫痫;心血管和心脏相关疾病;免疫机能障碍;肌肉痉挛;尿失禁;阿耳茨海默型老年性痴呆;多发性硬化性痴呆;肌萎缩性侧索硬化;化学品依赖和成瘾;心理社会性侏儒;胰岛素超敏或低敏感;低血糖;皮肤疾病;或脱发。在某些方面,所述疾病是焦虑相关疾病;情感障碍;双相性精神障碍;创伤后应激障碍;炎性疾病;化学品依赖和成瘾;胃肠道病症;或皮肤疾病。在还有一方面,焦虑相关疾病是广泛性焦虑症,或者情感障碍是抑郁症。在还有另一方面,胃肠道病症是肠应激综合征。
本发明的其它实施方式包括检测GPCR配体的方法,包括:a)使怀疑含GPCR配体的样品与sGPCR多肽接触;和b)评估是否存在sGPCR多肽结合的配体。这些方法还可包括表征该结合的配体。表征结合的配体包括但不限于各种层析、质谱、肽测序等方法。可将sGPCR多肽与或不与基质或表面操作性偶联。该方法还可包括:c)给予放射性标记的GPCR配体;和d)评估放射性标记的GPCR配体与sGPCR的结合或竞争与sGPCR结合。GPCR配体可包括但不限于:促肾上腺皮质素释放因子(CRF)、尿皮质醇1、尿皮质醇2、尿皮质醇3、甲状旁腺素、PTH-相关激素、TIP39、降钙素、胰岛淀粉样多肽、CGRP(CALCA和CALCB)、肾上腺髓质肽、肠促胰液素、VIP、PACAP、胰高血糖素、GHRH、GLP-1、GLP-2或GIP。
还有其它实施方式包括检测sGPCR的方法,包括:a)使怀疑含sGPCR的样品与能结合sGPCR或相关的表面结合GPCR的配体接触;和b)评估GPCR配体与样品组分的结合。该方法还可包括表征结合的sGPCR,包括但不限于层析、质谱、蛋白质片段化和测序等方法。可将GPCR多肽与基质或表面操作性偶联。这些方法还可包括:c)给予放射性标记的sGPCR;和d)评估在有和没有测试样品存在下,放射性标记的sGPCR与GPCR配体的结合或竞争与GPCR配体结合。示范性配体包括:促肾上腺皮质素释放因子(CRF)、尿皮质醇1、尿皮质醇2、尿皮质醇3、甲状旁腺素、PTH-相关激素、TIP39、降钙素、胰岛淀粉样多肽、CGRP(CALCA和CALCB)、肾上腺髓质肽、肠促胰液素、VIP、PACAP、胰高血糖素、GHRH、GLP-1、GLP-2、GIP或其它已知的GPCR配体。
本发明另一实施方式包括特异性结合sGPCR的抗体。在某些方面,该抗体可与sGPCR的氨基末端或羧基末端结合。本发明的各方面包括能结合羧基末端5、10、15、20或更多个氨基酸序列的抗体,所述序列源自编码GPCR跨膜区的核苷酸序列的另起读框(通常是因另路剪接所致或经工程改造的本发明重组多核苷酸)。
本发明实施方式包括用蛋白质、核酸或同时用蛋白质和核酸评价或评估来检测sGPCR表达的方法。本发明各方面包括检测sGPCR mRNA的方法,包括:a)获得待分析的核酸样品;和b)评估是否存在含有能产生sGPCR的剪接点的sGPCR核酸。该方法可包括通过核杂交、核酸扩增或分析核酸的其它方法来评估是否存在特定种类的mRNA。在一具体方面,sGPCR是可溶性B型GPCR、可溶性B1型GPCR、可溶性CRFR、sCRFR1、sCRFR2或sCRFR2α。多核苷酸可包含外显子/外显子连接点,该连接点包含GPCR的氨基末端氨基酸(的编码序列)但不包含编码跨膜结构域部分的所有外显子或只包含部分外显子。在一具体方面,sCRFR2α的剪接点是外显子5/外显子7连接点,其中根据CRFR2外显子的基因组名称命名外显子。根据CRFR2a转录物,这些外显子可以分别命名为3和5(例子见图1)。
“可溶性”GPCR(sGPCR)所表示的GPCR包含受体的全部或部分胞外结构域,但缺乏通常能使全长受体保留在细胞膜中的全部或部分跨膜结构域,可溶形式不与细胞膜整合。因此,例如当在哺乳动物细胞中重组产生这种可溶性受体时,它可经质膜从重组宿主细胞分泌出来,而不保留在细胞表面。本发明的可溶性受体通常可溶于水溶液。然而,在某些条件下,该受体可以是易用标准方法溶解的包涵体形式。这种sGPCR可源自工程改造的核酸、加工的蛋白质(例如,水解蛋白(protealizedprotein))、合成的蛋白质或分离的剪接变体。编码这种sGPCR的多核苷酸可以是分离的或工程改造的。
本文所用的术语“分离的”和“纯化的”可互换使用,表示核酸或多肽或其生物学活性部分实质上或基本上不含有天然环境中所见通常与该核酸或多肽相伴或相互作用的组分。因此,当采用重组技术产生时,分离或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基,或者当化学合成时,基本上不含化学前体或其它化学物质。
“分离的”核酸不含其所衍生的生物基因组DNA中天然侧接该核酸(即,位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(优选蛋白质编码序列)。例如,在各种实施方式中,分离的核酸含有其所衍生的细胞基因组DNA中天然侧接该核酸小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。
本文所用的术语“分离的”和“纯化的”指本发明多肽时表示该分离的蛋白质基本上不含细胞物质,并且包括所含污染性蛋白质低于约30%、20%、10%、5%或更低(以干重计)的蛋白质制品。当重组产生本发明蛋白质或其生物学活性部分时,其中的培养基化学前体或非感兴趣蛋白质化学物质最好少于约30%、20%、10%、5%或更低(以干重计)。
当权利要求书和/或说明书中联用词语“一个”与术语“包含”时,其可表示“一个”,但也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意义一致。
权利要求书中用术语“或”表示“和/或”,除非另有明确指出,表示一种选择或者相互排斥的两种选择之一,虽然其内涵支持该定义只是一种选择与“和/或”。
可从以下详述明白本发明的其它目标、特征和优点。虽然指出本发明的具体实施方式,但应该知道给予这些详述和具体实施例只是为了说明,因为本领域技术人员鉴于该详述可明白属于本发明构思和范围的各种变化和改进。
附图简述
所以,附图说明了能实现并详细了解上述本发明特征、优点和目标以及将会明白的其它特征、优点和目标及以上发明概述的更具体描述和某些实施方式。这些附图构成了说明书的一部分。然而,应该注意,附图描述了本发明的某些实施方式,因此不应认为限制了这些实施方式的范围。
图1A-1B.描述了可溶性GPCR、2α型CRF受体(sCRFR2α)的示范性核苷酸和翻译的氨基酸序列(图1A)。带下划线的氨基酸表明独特的C-末端尾部。有框的残基表明推测的N-连接糖基化位点。示意图代表小鼠CRFR2基因的结构(上图)、两种已知的小鼠功能转录物α和β(中图)和新的sCRFR2α剪接变体(下图)(图1B)。标明了翻译起始点(ATG)的位置。标明了编码N-末端胞外结构域(ECD)、7个跨膜结构域(7TM)和C-末端胞质结构域(CD)的外显子。阴影线框标明了5’和3’-UTR。黑框代表编码区,空心框代表终止密码子下游的外显子。
图2A-2C.显示了小鼠大脑和垂体中CRFR2α和sCRFR2α mRNA的表达。图2A是小鼠CRFR2α(上图)和sCRFR2α(下图)转录物扩增部分的示意图和寡核苷酸引物位置。标明了外显子3和7处的寡核苷酸引物位置,扩增产生分别对应于CRFR2α和sCRFR2α的418(bp)和309(bp)两种产物。图2B是mCRFR2α和sCRFR2αmRNA及核糖体蛋白S16 mRNA半定量RT-PCR电泳分析的代表性图像(上图)。也进行了扩增的mCRFR2α和sCRFR2αcDNA及核糖体蛋白S16 cDNA片段的Sourthem印迹杂交(下图)。采用PhosphorImager定量测定放射性条带,标准化的数值(按照S16表达)以相对光密度单位表示(图2C)。
图3A-3C.利用编码小鼠sCRFR2α蛋白独特C-末端尾部(氨基酸113-143)的合成肽片段在家兔中产生高特异性抗血清,开发了用于免疫印迹分析和免疫细胞化学的sCRFR2α放射性免疫测定。图3A是从sCRFR2αFLAG构建物瞬时转染COS-M6细胞培养液分离的小鼠sCRFR2α与抗-sCRFR2α-(113-143)血清(左图)或单克隆M2抗-FLAG反应(右图)的蛋白质免疫印迹。泳道1、2和3分别对应于0.1、1.0和10μl的sCRFR2α-FLAG提取物。图3B,利用合成的sCRFR2α(氨基酸113-143)和纯化的COS-M6表达的sCRFR2α(氨基酸113-143)-FLAG取代[125I]Tyr113sCRFR2α(氨基酸113-143)与家兔抗-sCRFR2α(氨基酸113-143)结合。图3C,先用抗-sCRFR2α(氨基酸113-143)血清,再用Cy3-偶联的第二抗体目测观察用小鼠sCRFR2α构建物瞬时转染的COS-M6细胞的免疫荧光染色(图3C(b))。用DAPI复染载玻片来目测观察转染或未转染的细胞(图3C(a))。先用作为阴性对照的正常家兔血清(NRS)培育,再用Cy3-偶联的第二抗体培育细胞未显示有任何染色(图3C(c))。
图4A-4G.采用免疫组织化学和放射性免疫测定(RIA)显示小鼠大脑中存在sCRFR2α-样免疫反应性(ir)。图4A-4F显示了所选的小鼠大脑区域中sCRFR2α的免疫过氧化物酶染色。细胞表达的主要部位包括嗅球的主要输出神经元(图4A);中间的中隔核(图4B);和基底外侧(BLA),而不是扁桃体的中心(CeA)核(图4C);大脑皮层中染色细胞主要位于层5和2/3(图4D);和红核(图4E)。这些部位中细胞标记的模式与CRFR1 mRNA表达的模式相似,虽然不一定相同。免疫标记的纤维和膨体局限于多种细胞群,包括下丘脑的室旁核(PVH;图4F)。图4G,采用放射性免疫测定检测从小鼠大脑分离的酸提取和部分纯化组织中的sCRFR2α-样免疫反应性。检验5-7种剂量水平的组织提取物取代[125I]-标记Tyr113sCRFR2α(氨基酸113-143)以剂量依赖方式与家兔抗-sCRFR2α(氨基酸113-143)结合。
图5A-5B.sCRFR2α蛋白干扰了Ucn1或CRF介导的cAMP和MAPK信号转导的诱导。图5A显示了在用小鼠CRFR2α瞬时转染的293T细胞中(预先用或不用sCRFR2α培育)Ucn1或CRF激活CRE-萤光素酶报道基因。将包含EVX1基因CRE启动子片段的萤光素酶报道基因与CRFR2α表达载体共同转染入293T细胞。在有或没有0.1nM sCRFR2α存在下用0.0001-100nM Ucn1或CRF处理(4小时)后检测萤光素酶活性。按照共转染的β-半乳糖苷酶活性标准化这些试验。图中显示了一式六份实验的代表性平均值。图5B,用含或不含sCRFR2α(0.4-4 nM)的Ucn1(10nM)处理平衡的CATH.a细胞。受体刺激5分钟后,收集细胞裂解物,用磷酸-ERK1/2-p42,44抗体和ERK2-p44抗体进行SDS-PAGE免疫印迹分析。按照总ERK2-p44标准化磷酸化ERK1/2-p42的水平计算ERK活性。图中显示了一式三份实验的代表性平均值。*,P<0.05与载体处理,#,P<0.05与Ucn1处理,UD=未检测。
发明详述
治疗GPCR相关和信号转导途径相关疾病的有用治疗方法包括抑制或调节GPCR的活化或抑制。一种方法是开发小分子抑制剂,但该方法的开发和投入市场的耗费巨大。用GPCR的小分子抑制剂或拮抗剂治疗的缺陷之一是有毒性危险,特别是反复应用时。许多GPCR也没有小分子受体拮抗剂。值得开发成本和/或毒性低于小分子抑制剂的GPCR拮抗剂。本发明实施方式是关于可溶性GPCR(sGPCR)配体结合域,及其影响GPCR信号转导和GPCR配体与其GPCR间相互作用的组合物和方法。可用sGPCR拮抗GPCR的体外和/或体内激活或抑制。
I.G-蛋白偶联的受体(GPCR)
GPCR构成了一个蛋白质超家族,可分成至少3个家族:视紫红质样家族(家族A)、降钙素受体(家族B)和亲代谢性谷氨酸盐家族(家族C)(Ji等,1998),各家族还可再分成亚族。报道的GPCR包括已表征的受体和配体尚未鉴定的孤儿受体(Wilson等,1999;Wilson等,1998;Marchese等,1999)。虽然有许多GPCR,但各GPCR通常具有相似的分子结构。各GPCR包含长度不同的氨基酸残基链。GPCR处于细胞膜内称为跨膜区的7个独特卷曲)中。GPCR的氨基末端位于细胞外作为胞外环,而羧基末端位于细胞内,含有胞内环。
GPCR家族A(视紫红质样)包括但不限于:胺、肽、激素蛋白、视紫红质、嗅觉(受体)、类前列腺素、核苷酸样(物质)、大麻素、血小板活化因子、促性腺激素释放激素、促甲状腺激素释放激素和促泌素、褪黑素、病毒、溶血鞘脂(lysosphingolipid)和LPA(EDG)、白三烯B4的受体和其它相似的受体蛋白。
GPCR家族B(肠促胰液素样)包括但不限于以下物质的受体:降钙素、促肾上腺皮质素释放因子(CRF)、抑胃肽(GIP)、胰高血糖素、生长激素释放激素(GHRH)、甲状旁腺素(PTH)、垂体环腺苷酸酶激活多肽(PACAP)、肠促胰液素、血管活性肠肽(VIP)、利尿激素、EMR1、latrophilin、脑特异性血管生成抑制剂(BAI)、methuselah-样蛋白(MTH)、钙粘蛋白/EGF/LAG(CELSR)和其它相似的配体。Harmar(2001)描述了GPCR家族B的3个亚族,亚族B1、B2和B3。
亚族B1-亚族B1包括但不限于由人体中至少15种基因编码的典型激素受体,果蝇中有至少5种推定成员,秀丽线虫(C.elegans)中有3种。该家族受体的配体是约27-141个氨基酸残基的多肽激素;至少9种哺乳动物受体有对应的结构上彼此相关的配体(胰高血糖素、胰高血糖素样肽(GLP-1、GLP-2)、依赖于葡萄糖的促胰岛素多肽、肠促胰液素、血管活性肠肽(VIP)、PACAP和生长激素释放激素(GHRH))。该亚族的所有成员显示能通过刺激性G蛋白(Gs)与腺苷酸环化酶偶联来调节cAMP的胞内浓度。该亚族的一些成员能通过其它G-蛋白偶联的信号转导途径,例如通过磷脂酶C的活化来转导信号。
亚族B2-亚族B2包括许多含长胞外氨基末端的家族-B GPCR,其在核心7TM基序上连接有不同结构元件。该亚族的原型成员是从人神经外胚层cDNA文库和白细胞细胞表面抗原CD97(Hamann等,1995)分离的含EGF-模块的粘蛋白样激素受体(EMR1)(Baud等,1995)。亚族B2也包括α-黑寡妇蜘蛛毒素的钙不依赖性受体。已鉴定了编码钙不依赖性黑寡妇蜘蛛毒素受体(CL-1、CL-2和CL-3)的这些基因。第二,该亚族也包括脑-特异性血管生成抑制剂1、2和3(BAI1、BAI2、BAI3),它们是一组涉及成胶质细胞瘤血管化的蛋白质。第三,B2亚族也包括果蝇基因flamingo编码的蛋白质及其在人(钙粘蛋白EGF LAG七跨膜区G-型受体Celsr1、Celsr2和Celsr3)和秀丽线虫(F15B9.7)中的直向同源物。最后,该亚族包括含有与亚族B2受体共有,但结构上无关的一些基序的第四种不同受体组(人附睾6(HE6)、EGF-TM7-latrophilin-相关蛋白(ETL)、含免疫球蛋白Ig七重复的受体(immunoglobulin-repeat-containing receptor Ighepta)、G-蛋白偶联受体56(GPR56)和非常大的G-蛋白偶联受体1(VLGR1))。对测序的人基因组进行分析(2001年4月1日,UCSC Human Genome ProjectWorking Draft(UCSC人基因组项目工作草案)(genome.ucsc.edu))表明至少有18种人基因编码的亚族B2成员,果蝇有至少4种,秀丽线虫有3种。近年来,Stacey等,(2000)总结了亚族B2成员的结构和功能。
亚族B3-家族B GPCR的第三族(亚族B3)的原型是methuselah(mth),在筛选延长黑腹果蝇(D.melanogaster)平均寿命的单基因突变中分离的一种基因(Lin等,1998)。该基因编码的多肽与家族B的其它GPCR显示只在TM7区域内有序列相似性。果蝇基因组序列中至少编码8种methuselah的侧向同源物。
所有家族B GPCR的特征是7TM基序,其与其它一些GPCR家族相当区域远缘相关,但在家族B内高度保守。胞外环EC1和EC2内的保守性半胱氨酸残基可能形成二硫键,这是根据也有该保守特征的家族A GPCR类推得到(Palczewski等,2000)。然而。与许多家族A GPCR显示依赖于内部疏水序列靶向质膜相反,大多数家族B GPCR显示具有氨基末端信号肽。采用定点诱变和在家族B的激素受体之间构建嵌合体研究显示其氨基末端胞外结构域是配体结合必须的,但受体的跨膜结构域和相关的胞外环区提供了与配体特异性相互作用所需的信息。家族B的所有激素受体在接近TM1的氨基末端胞外结构域内含有在配体结合中可能起作用的保守区域。PAC1受体该区域中的剪接变体显示能影响配体结合的特异性和亲和力(Dautzenberg等,1999)。
亚族B2的受体在其氨基末端的大胞外结构域中有其它各种结构基序,提示该结构域在细胞-细胞黏附和信号转导中有作用。这些结构域包括EGF结构域(在Celsr1、Celsr2、Celsr3、EMR1、EMR2、EMR3、CD97和Flamingo中)、层粘连蛋白和钙粘蛋白重复(在Flamingo及其人直向同源物Celsr1、Celsr2和Celsr3中)、olfactomedin-样结构域(在黑寡妇蜘蛛毒素受体中)、血小板反应蛋白1型重复(在BAI1、BAI2和BAI3中)、也在成纤维细胞生长因子(FGF)受体2及神经细胞粘连分子L1中发现的免疫球蛋白C-2-型结构域(在七跨膜Ig中)。VLGR1在Na+-Ca2+交换体和整联蛋白亚基β4中存在两个拷贝基序(Calx-beta)。
家族C(亲代谢性谷氨酸盐/信息素)GPCR包括亲代谢性谷氨酸盐、钙传感样(蛋白)、推定的信息素受体、GABA-B、孤儿GPRC5、孤儿GPCR6、果蝇Boss蛋白(BOSS)、味觉受体(T1R)和其它相似的蛋白。
在某些实施方式中,本发明sGPCR是B类受体。在这方面,本发明sGPCR是亚族B1受体,在其它方面,sGPCR是CRFR1和CRFR2及甲状旁腺激素受体。表1包括了GPCR家族非限制性的一组示范性成员,登录号和相关的UNIGENE及OMIM条目,从本申请的优先权日期和递交日期起纳入本文作为参考。可利用OMIN网页中所含的因特网链接来评估Unigene条目。在万维网的以下地址所定义的网站可找到许多其它GPCR及其登录号:gpcr.org/7tm/htmls/entries.html。
表1.示范性GPCR
GPCR描述 | 蛋白质登录号/mRNA登录号/OMIM号(各自纳为参考) |
脑特异性血管生成抑制剂1(BAI1) | O14514/AB005297/602682 |
脑特异性血管生成抑制剂2(BAI2) | O60241/CR623649/602683 |
脑特异性血管生成抑制剂3(KIAA0550a)(BAI3) | O60242/AB005299/602684 |
降钙素受体(CT-R,CALCR) | P30988/NM_001742/114131 |
白细胞抗原CD97 | P48960/X84700/601211 |
降钙素基因相关肽1型受体,CGRP1型受体,CALCRL,CGRPR | Q16602/NM_005795/114190 |
促肾上腺皮质素释放因子1(CRF-R,CRF1,CRHR1,CRHR,CRFR) | P34998/NM_004382/122561 |
促肾上腺皮质素释放因子2(CRF-R,CRF2,CRHR2,CRF2R,CRH2R) | Q13324/NM_001883/602034 |
细胞表面糖蛋白EMR1(EMR1激素受体) | Q14246/X81479/600493 |
EGF-样模块EMR2 | AAF21974/AF114491/606100 |
含EGF-样模块的粘蛋白样受体EMR3 | AAK15076/AF239764/606101 |
抑胃多肽受体(GIP-R,依赖于葡萄糖的促胰岛素多肽受体) | P48546/NM_000164/137241 |
胰高血糖素-样肽1受体(GLP-1受体,GLP-1-R,GLP1R) | P43220/NM_002062/138032 |
胰高血糖素受体(GL-R,GCGR) | P47871/NM_000160/138033 |
胰高血糖素-样肽2受体(GLP-2受体,GLP-2-R,GLP-2R,GLP2R) | O95838/NM_004246/603659 |
G蛋白偶联受体56 | AAD30545/NM_005682/604110 |
生长激素释放激素受体(GHRH受体,GRF受体,GRFR,GHRHR) | Q02643/NM_000823/139191 |
垂体环腺苷酸酶激活多肽I型受体(PACAP I型受体,PACAP-R-1,ADCYAP1R1) | P41586/NM_001118/102981 |
甲状旁腺激素受体(PTH2) | P49190/NM_005048/601469 |
甲状旁腺激素/甲状旁腺激素相关肽受体(PTHR1) | Q03431/NM_000316/168468 |
肠促胰液素受体(SCT-R,SCTR) | P47872/NM_002980/182098 |
血管活性肠多肽受体1(VIPR1,VPAC1) | P32241/NM_004624/192321 |
血管活性肠多肽受体2(VIPR2,VIP2R,VPAC2等) | P41587/NM_003382/601970 |
A.促肾上腺皮质素释放因子(CRF)及其受体
CRF受体作为本发明考虑的GPCR的例子得到详细描述。本领域技术人员能将这些具体指导用于GPCR家族的其它成员,特别是B型,更具体说是亚族B1受体。在某些方面,本发明包括但不限于衍生自可溶性促肾上腺皮质素释放因子受体(sCRFR),特别是sCRFR2α的sGPCR。最初从下丘脑分离的(Vale等,1981)下丘脑促垂体肽促肾上腺皮质素释放因子(CRF)在基础和应激条件下,在下丘脑-垂体-疏水性(HPA)轴的调节中起重要作用(River和Vale,1983;Muglia等,1995)。此外,CRF起到组合针对应激物的内分泌、自发和行为反应的作用(River和Vale,1983;Muglia等,1995;Koob和Heinrichs,1999)。哺乳动物CRF肽家族包括尿皮质醇1(Ucn1)(Vaughan等,1995)和肽,尿皮质醇2(Ucn2)及尿皮质醇3(Ucn3),也分别称为stresscopin-相关肽(Reyes等,2001;Hsu和Hsueh,2001)和stresscopin(Hsu和Hsueh,2001;Lewis等,2001)。
通过激活两种高亲和力膜受体,CRFR1(Chen等,1993;Vita等,1993;Chang等,1993)和CRFR2(Perrin等,1995;Stenzel等,1995;Kishimoto等,1995;Lovenberg等,1995;Chen等,2005)来介导CRF-相关肽的作用,两种受体属于通过与G-蛋白偶联转导信号的七跨膜结构域(7TM)受体B1亚族。人和啮齿类动物能表达CRFR1基因的一种功能变体及7种无功能变体,这些变体由不同外显子的差异性剪接产生(Pisarchik和Slominski,2004;Grammatopoulos等,1999)。利用另路5’外显子,人的CRFR2可产生三种功能剪接变体(α、β和γ),啮齿类动物可产生两种变体(α和β)(Perrin等,1995;Stenzel等,1995;Kishimoto等,1995;Lovenberg等,1995;Chen等,2005;Grammatopoulos等,1999;Kostich等,1998)。CRFR1 mRNA在哺乳动物大脑和垂体中广泛表达,发现在垂体前叶、大脑皮层、小脑、扁桃体、海马体和嗅球中的水平高(Van Pett等,2000)。在外周组织中,CRFR1表达于睾丸、卵巢、皮肤和脾脏中。CRFR2 mRNA以离散方式表达于大脑中,其中在侧索中隔核(LS)、终纹床核(BNST)、下丘脑腹内侧核(VMH)、嗅球和中脑缝核中密度最高(Van Pett等,2000)。CRFR2α是啮齿类动物大脑中表达的主要剪接变体(Lovenberg等,1995),而CRFR2β表达于外周组织中,其中在骨骼肌、心脏和皮肤中水平最高(Perrin等,1995)。
CRFR1或CRFR2在裸鼠中的趋异表型(divergent phenotype)证明CRFR1和CRFR2分布不同,涉及不同的生理功能。缺乏CRFR1的小鼠显示焦虑样行为降低,应激反应受损(Smith等,1998;Timpl等,1998),而CRFR2-裸鼠的焦虑样行为增加,对应激的HPA反应扩大(Zhu等,1999;Valerio等,2001;Khan等,1993)。然而,将CRFR激动剂和拮抗剂给予特定大脑区域后的反应显示CRFR2同时有抗焦虑和致焦虑(anxiogenic)作用(Bale和Vale,2004)。
放射性受体和功能试验证明CRFR1和CRFR2在药理学上不同:Ucn1对两种受体的亲和力相等,对CRFR2的亲和力比CRF强,而Ucn2和Ucn3看来对CRFR2有选择性(Vaughan等,1995;Reyes等,2001;Lewis等,2001)。受体选择性CRF肽通过激活不同类型组织或细胞中特异性CRFR可驱动各种信号转导途径,包括偶联不同的G-蛋白,刺激PKB、PKC、胞内钙和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)(其综述见Bale和Vale,2004;Perrin和Vale,1999;Brar等,2002)。
CRFR1和CRFR2均存在多种剪接变体。本发明人已在小鼠大脑中鉴定了编码sCRFR2α示范性剪接变体的cDNA,其中编码CRFR2α的核酸中删除了外显子6。翻译该同种型产生了预计的143个氨基酸的可溶性蛋白质。该翻译的蛋白质包含CRFR2α第一胞外结构域(ECD1)的大部分,其后是因删除外显子6导致读框移位所产生的38个氨基酸的独特亲水性C-末端。研究证明sCRFR2α在嗅球、皮层和中脑区域中高水平表达。在哺乳动物或细菌细胞系统中表达并经纯化的对应于sCRFR2α的蛋白质能以低至纳摩尔的亲和力与几种CRF家族配体结合。此外,纯化的sCRFR2α蛋白能抑制细胞对CRF和尿皮质醇1的反应。因此,sCRFR2α蛋白可以是CRF家族配体的生物学调节剂。对CRF家族配体的调节不限于大脑,可用于和CRF家族配体的一个或多个接触的任何组织。
本发明各方面通常涉及实现疗效的组合物和方法,包括单用可溶性GPCR配体结合多肽(例如,CRF结合多肽)作为拮抗剂或与一种或多种其它激素拮抗剂(例如,小分子拮抗剂),包括但不限于CRF家族配体的拮抗剂联用来调节GPCR配体(例如,CRF家族配体)的活性。
拮抗配体作用的一种方式是使配体与诱饵或可溶性受体(结合),从而限制结合诱饵的配体局部浓度而调节配体通过其细胞表面受体转导信号的能力。可通过酶法截短与膜结合的受体,例如GHRH受体(Rekaski等,2000)、多巴胺D3受体(Liu等,1994)和降钙素受体(Seck等,2003)或者通过谷氨酸受体的另路剪接(Malherbe等,1999;Zhu等,1999;Valerio等,2001)来产生与膜受体相关的可溶性蛋白。只含有GPCR胞外结构域的剪接变体已有报道(Pisarchik和Slominski,2004;Grammatopoulos等,1999;Kostich等,1998;Malherbe等,1999;Zhu等,1999;Valerio等,2001;Khan等,1993;Graves等,1992;You等,2000;Schwarz等,2000)。在大多数情况中,这些蛋白质作为结合性但不转导信号的分子,也称为诱饵受体。在人皮肤中鉴定到CRFR1的删除了外显子3和4和加入一个隐蔽外显子的两种cDNA片段(CRFRle和CRFRlh),预计存在可溶蛋白质(Pisarchik和Slominski,2004)。当这些片段之一的CRFRle与野生型CRFR1共转染时,显示出显性负效应。
Kehne和Lombaert(2002)讨论了治疗焦虑症、抑郁症和应激病症的非肽类CRF受体拮抗剂。CRF涉及精神病,例如焦虑症和抑郁症。自从鉴定了促肾上腺皮质素释放因子(CRF),广泛的研究工作巩固了这种41个氨基酸的肽及其相关的家族成员在介导机体对应激的行为、内分泌和自发反应中的重要性。
临床前和临床证据总体上表明CRF和CRF受体尤其涉及焦虑症和抑郁症。临床研究证明在抑郁症和一些焦虑疾病中下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能失调和/或CRF水平升高。采用相关法、遗传模型和外源性CRF给药技术在啮齿类和非人灵长类中获得的临床前数据支持过度活跃的CRF途径与致焦虑及抑郁样症状之间有联系。使用CRFR1的受体敲除和选择性非肽类拮抗剂的研究证明在某些类型的实验室条件下有抗焦虑和抗抑郁作用。严重的抑郁性障碍的II期、开放标记临床试验报道CRFR1拮抗剂能安全且有效地减轻焦虑症和抑郁症的症状。
Owens等(1991)描述了各种CRF拮抗剂的非限制性活性。CRF拮抗剂描述为能有效治疗应激相关疾病;情感障碍,例如抑郁症、严重的抑郁性障碍、单纯抑郁(single episode depression)、抑郁复发、儿童虐待诱导的抑郁、产后精神抑郁、精神抑郁症、双相性精神障碍和循环性情感;慢性疲劳综合征;进食障碍,例如厌食和神经性贪食;泛化性焦虑症;惊恐性障碍;恐怖症;强迫性神经失调;创伤后精神紧张性障碍;痛觉疾病,例如纤维肌痛;头痛;胃肠道病症;出血性应激;溃疡;应激诱导的精神病;发热;腹泻;手术后肠梗阻;结肠超敏反应;肠应激综合征;克罗恩病;结肠痉挛;炎性疾病,例如类风湿性关节炎和骨关节炎;疼痛;哮喘;银屑病;过敏症;骨质疏松;早产;高血压;充血性心力衰竭;睡眠障碍;神经变性疾病,例如阿耳茨海默病、阿耳茨海默型老年性痴呆、多发性硬化性痴呆、帕金森病和亨延顿舞蹈病;头部创伤;缺血性神经元损伤;兴奋性中毒神经元损伤;癫痫;中风;脊髓创伤;心理社会性侏儒;甲状腺机能正常的病态综合征;不合适的抗利尿激素综合征;肥胖症;化学品依赖和成瘾;药物或酒精戒除症状;不育症;癌症;肌肉痉挛;尿失禁;低血糖和免疫机能障碍,包括应激诱导的免疫机能障碍、免疫抑制和人免疫缺陷病毒感染;和人与动物中应激诱导的感染。适合于CRF调节的这些和其它病症列于参考文献,包括Lovenberg等,(1995);Chalmers等,(1996);和美国专利5,063,245,这些参考文献全文纳入本文作为参考。
II.多肽
本发明多肽包括可溶形式的GPCR或可溶性受体。本发明可溶性受体可包含从与某可溶形式膜结合的已改变的亚基。因此,可通过截短多肽以除去,例如7跨膜区和/或胞质尾部来产生可溶性多肽。或者,可通过删除包含跨膜结构域的正常疏水氨基酸残基或用亲水性氨基酸残基取代来消除跨膜结构域。在任一情况中可产生基本上亲水或可溶的多肽而降低了对脂质的亲和力并提高了水溶性。除去跨膜结构域优于用亲水性氨基酸残基取代,因为能避免引入潜在的免疫原性表位。本发明可溶性受体在N-末端可包含任何数量的熟知前导序列。这种序列使得肽可以在真核系统中表达并靶向分泌途径。
A.融合蛋白
受体因其易于转变成免疫球蛋白融合蛋白而成为阐明生物学途径和治疗各种疾病状态的有力工具。这些可溶性二聚受体形式是分泌的或表面结合的配体所介导反应的良好抑制剂。它们通过与这些配体结合来阻止配体与细胞相关受体结合。这些受体-Ig融合蛋白不仅可用于实验,而且在临床上已成功利用TNF-R-Ig和OKT3给药来治疗炎性肠病、类风湿性关节炎和急性临床综合征(Eason等,1996;vanDullemen等,1995)。本发明人考虑对通过GPCR转导信号介导的许多反应进行操控可广泛适用于治疗GPCR相关疾病。
优选用稳定的血浆蛋白(其在哺乳动物循环系统中的半衰期通常大于数小时)构建这种受体融合蛋白。这种血浆蛋白包括但不限于:免疫球蛋白、血清白蛋白、脂蛋白、载脂蛋白和转铁蛋白。也可将能使可溶性受体靶向特定类型细胞或组织的序列与受体的配体结合域相连以产生专门定位的可溶性受体融合蛋白。
可将包含GPCR配体结合域的整个GPCR胞外区或其功能片段与免疫球蛋白恒定区,例如人IgG1重链的Fc结构域融合。可溶性受体-IgG融合蛋白是常见的免疫学试剂,本领域熟知它们的构建方法(参见,例如全文纳入本文作为参考的美国专利5,225,538)。
可将功能GPCR配体结合域与免疫球蛋白(Ig)Fc结构域融合。Ig Fc可衍生自免疫球蛋白类或亚类,包括但不限于IgG1。属于不同Ig类或亚类的抗体的Fc结构域能活化不同的二级效应功能。当Fc结构域与同源Fc受体结合时发生活化。二级效应功能包括活化补体系统或穿过胎盘的能力。本领域描述了不同类和亚类免疫球蛋白的这种特性。
本领域技术人员应知道,形成受体-Ig融合蛋白连接点的氨基酸残基不同可能改变sGPCR融合蛋白的结构、稳定性及其最终的生物学活性。可在所选的sGPCR片段C-末端加入一个或多个氨基酸来修饰与所选融合结构域的连接点。
也可改变切割所选sGPCR DNA片段5’端以插入重组表达载体的位置来改变sGPCR融合蛋白的N-末端。可采用常规实验(包括但不限于配体结合试验)来检验并优化各种sGPCR融合蛋白的稳定性和活性。
也可利用本文所示胞外结构域内的sGPCR配体结合域序列来构建氨基酸序列变体以修饰sGPCR分子对其配体的亲和力。本发明的这些可溶性分子能与内源性受体竞争(与配体)结合。可以预见,包含GPCR配体结合域并能与天然受体竞争结合配体的任何可溶性分子是属于本发明范围的受体阻断剂或配体捕获剂。
B.蛋白偶联物
就蛋白质的半衰期而言,延长其循环半衰期的一种方法是确保减少蛋白质的清除,特别是通过肾脏的清除和受体介导的清除。将蛋白质与能增加表观大小从而减少肾脏清除并延长体内半衰期的化学部分偶联可实现此目的。此外,将化学部分与蛋白质相连能有效阻断蛋白水解酶与该蛋白质的物理接触,因而防止了非特异性蛋白水解所致的降解。聚乙二醇(PEG)是已用于制备治疗性蛋白质产品的一类所述化学部分。近年来,用单个N-末端连接的20kDa PEG基团修饰的G-CSF分子(Neulastam)已批准在美国销售。与非PEG化G-CSF相比,该PEG化G-CSF分子显示半衰期延长,因而其给药频率低于现有的G-CSF产品,但与非PEG化G-CSF相比,其未能显著降低嗜中性白细胞减少的持续时间。
聚乙二醇(PEG)修饰对于药物和生物技术应用至关重要。PEG化(共价连接PEG)可导致,例如屏蔽抗原性或免疫原性表位。此外,它能降低网状内皮系统的受体介导摄取,或者阻止蛋白水解酶的识别及降解。蛋白质的PEG化显示能通过降低肾脏滤过而提高它们的生物利用度。
术语“偶联物”表示通过将一种或多种多肽(通常是一种多肽)与一种或多种非多肽部分,例如聚合物分子、亲脂性化合物、碳水化合物部分或有机衍生物质共价相连形成的异质分子。术语“共价相连”表示所述多肽和非多肽部分可以彼此直接共价相连,或者通过一个或多个间插部分(例如桥键、间隔基团或一个或多个连接键部分)而彼此间接共价相连。偶联物优选在相关的浓度和条件下可溶,即可溶于生理液体,例如血液中。制备本发明偶联物的组合物和方法描述于全文纳入本文作为参考的美国专利6,831,158。美国专利6,831,158所述方法涉及G-CSF的偶联,但不难采纳用于本发明sGPCR的偶联。
“聚合物分子”是通过共价连接两个或多个单体形成的分子。术语“聚合物”可与术语“聚合物分子”互换使用。该术语应涵盖碳水化合物分子,包括可通过体内N-或O-糖基化而与多肽相连的碳水化合物,这种分子也称为“寡糖部分”。除了明确指出聚合物分子数目之外,提及本发明多肽或本发明所用其它物质所含的“聚合物”、“聚合物分子”、“该聚合物”或“该聚合物分子”时,指一个或多个聚合物分子。
术语“连接基团”表示多肽中与相关非多肽部分偶联的氨基酸残基。例如,对于聚合物(特别是PEG)偶联,常用的连接基团是赖氨酸的ε-氨基或N-末端氨基。其它聚合物的连接基团包括游离的羧酸基团(例如,C-末端氨基酸残基或天冬氨酸或谷氨酸残基的羧酸基团)、适当活化的羰基、氧化的碳水化合物部分和巯基。表2举例说明了有用的连接基团及它们的匹配非肽部分。
表2
连接基团 | 氨基酸 | 非肽部分的例子 | 偶联方法/活化的PEG | 参考文献 |
-NH2 | N-末端Lys,Arg,His | 聚合物,例如含有酰胺基或亚氨基的PEG | mPEG-SPA三氟乙基磺酸化的(Tresylated)mPEG | Shearwater Corp.Delgado等,1992. |
-COOH | C-末端Asp和Glu | PEG聚合物,例如含有酯基或酰胺基的PEG寡糖部分 | mPEG-Hz体外偶联 | Shearwater Corp. |
-SH | Cys | 聚合物,例如含有二硫键、马来酰亚胺或乙烯基砜基团的PEG寡糖部分 | PEG乙烯基砜PEG-马来酰亚胺体外偶联 | Shearwater Corp.Delgado等,1992 |
-OH | Ser,Thr,-OH,lys | 寡糖部分含酯、醚、氨基甲酸酯、碳酸酯基的PAG | 体内O-连接的糖基化 | |
-CONH2 | 作为N-糖基化位点一部分的Asn | 寡糖部分聚合物,例如PEG | 体内N-糖基化 | |
芳族-CONH2 | Phe,Tyr,Trp,Gln | 寡糖部分 | 体外偶联 | Yan和Wold,1984 |
醛酮 | 氧化的寡糖 | 聚合物,例如PEGPEG氢氧化物 | PEG化 | Andresz等,1978WO92/16655WO00/23114 |
胍基 | Arg | 寡糖部分 | 体外偶联 | Lunblad和Noyes,Chemical reagents forproteinmodification(《蛋白质修饰的化学试剂》),CRC Press |
咪唑环 | His | 寡糖部分 | 体外偶联 | Lunblad和Noyes,Chemical reagents forproteinmodification(《蛋白质修饰的化学试剂》),CRC Press |
C.位点特异性诱变
一个实施方式制备了多肽的氨基酸序列变体。这些变体可以是,例如因种群内天然变异导致的多肽微小序列变体,或者它们可以是在其它物种中发现的同源物。它们也可以是非天然产生的序列,但它们足够相似从而功能相似和/或能引发与该多肽天然形式交叉反应的免疫应答。可通过定点诱变的标准方法,例如下文所述的方法制备序列变体。
多肽的氨基酸序列变体可以是取代、插入或缺失变体、缺失变体缺乏天然蛋白质中对功能或免疫原性活性不重要的一个或多个残基,例如缺乏跨膜序列的受体变体。
取代变体通常含有蛋白质内一个或多个位点用另一氨基酸替换某一氨基酸,可设计这种取代变体来调节该多肽的一种或多种特性,例如对蛋白水解酶切割的稳定性或免疫原性。取代优选是保守性的,即用形状和荷电相似的氨基酸取代某一氨基酸。本领域熟知保守性取代,例如,包括以下改变:丙氨酸改变为丝氨酸;精氨酸改变为赖氨酸;天冬酰胺改变为谷氨酰胺或组氨酸;天冬氨酸改变为谷氨酸;半胱氨酸改变为丝氨酸;谷氨酰胺改变为天冬酰胺;谷氨酸改变为天冬氨酸;甘氨酸改变为脯氨酸;组氨酸改变为天冬酰胺或谷氨酰胺;异亮氨酸改变为亮氨酸或缬氨酸;亮氨酸改变为缬氨酸或异亮氨酸;赖氨酸改变为精氨酸;甲硫氨酸改变为亮氨酸或异亮氨酸;苯丙氨酸改变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸;丝氨酸改变为苏氨酸;苏氨酸改变为丝氨酸;色氨酸改变为酪氨酸;酪氨酸改变为色氨酸或苯丙氨酸;和缬氨酸改变为异亮氨酸或亮氨酸。
插入变体包括融合蛋白,例如用于快速纯化该多肽的那些融合蛋白,也可包括含有其它蛋白和多肽的序列的杂交蛋白。例如,插入变体可包含一种物种的多肽氨基酸序列诸部分以及另一物种的同源多肽的诸部分。其它插入变体可包括在该多肽的编码序列内引入其它氨基酸的那些变体,例如可引入蛋白酶切割位点。
可对多核苷酸的结构作出修饰和改变,但仍能获得编码具有所需特征的蛋白质或多肽的功能分子。下文讨论了根据蛋白质的氨基酸变化来产生等价物或甚至改进的第二代分子。可按照以下数据通过改变DNA序列的密码子来改变氨基酸。
例如,可用其它氨基酸取代蛋白质结构中的某些氨基酸,但不明显丧失与诸如底物分子结合位点或抗体的抗原结合区结构相互结合的能力。因为蛋白质的相互作用能力和性质决定了该蛋白质的生物学活性,可对蛋白质序列作出某些氨基酸取代而仍能获得具有相似特性的蛋白质。因此,本发明人考虑了可在基因的DNA序列、mRNA或多核苷酸中作出各种变化,而不明显丧失它们的生物学用途或活性。
在制作这种变化时,应考虑氨基酸的亲水(hydropathic)指数。氨基酸的亲水指数对赋予蛋白质相互作用生物学功能的重要性是本领域公知的(Kyte和Doolittle,1982)。
表3
氨基酸 | 密码子 | ||
丙氨酸 | Ala | A | GCA GCC GCG GCU |
半胱氨酸 | Cys | C | UGC UGU |
天冬氨酸 | Asp | D | GAC GAU |
谷氨酸 | Glu | E | GAA GAG |
苯丙氨酸 | Phe | F | UUC UUU |
甘氨酸 | Gly | G | GGA GGC GGG GGU |
组氨酸 | His | H | CAC CAU |
异亮氨酸 | Ile | I | AUA AUC AUU |
赖氨酸 | Lys | K | AAA AAG |
亮氨酸 | Leu | L | UUA UUG CUA CUC CUG CUU |
甲硫氨酸 | Met | M | AUG |
天冬酰胺 | Asn | N | AAC AAU |
脯氨酸 | Pro | P | CCA CCC CCG CCU |
谷氨酰胺 | Gln | Q | CAA CAG |
精氨酸 | Arg | R | AGA AGG CGA CGC CGG CGU |
丝氨酸 | Ser | S | AGC AGU UCA UCC UCG UCU |
苏氨酸 | Thr | T | ACA ACC ACG ACU |
缬氨酸 | Val | V | GUA GUC GUG GUU |
色氨酸 | Trp | W | UGG |
酪氨酸 | Tyr | Y | UAC UAU |
氨基酸的相对亲水特征提供了所得蛋白质的二级结构,进而决定该蛋白质与其它分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用是公认的。本领域已知可用具有相似亲水性指数或评分的其它氨基酸取代某些氨基酸,而仍能得到具有相似特性的蛋白质。在作出这种变化时,优选亲水性指数在±2以内的氨基酸取代,特别优选亲水性指数在±1以内的那些,甚至更尤其优选亲水性指数在±0.5以内的那些氨基酸取代。
本领域也知道可根据亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。纳入本文作为参考的美国专利4,554,101描述了受其毗邻氨基酸的亲水性控制的蛋白质的最高局部平均亲水性与该蛋白质的生物学特性相关。
应知道可用亲水性值相似的另一氨基酸取代某氨基酸,而仍能获得生物学等价和免疫学等价的蛋白质。在这种变化中,优选亲水性值在±2以内的氨基酸取代,特别优选亲水性值在±1以内的那些,甚至更尤其优选亲水性值在±0.5以内的那些氨基酸取代。
位点特异性诱变是通过特异性诱变潜在的DNA来制备各种肽或生物学功能等价蛋白质或肽的有用技术。该项技术还可通过在DNA中引入一个或多个核苷酸序列来方便地制备和测试掺入了上述一种或多种情况的序列变体。总之,本领域熟知位点特异性诱变技术。该项技术通常利用存在单链和双链形式的噬菌体载体。位点特异性诱变所用的典型载体包括例如M13噬菌体等载体。这些噬菌体载体可商品化购得,本领域技术人员通常熟知其用途。定点诱变也常规利用双链质粒,从而省去了将感兴趣基因从噬菌体转移入质粒的步骤。
为制备GPCR的序列变体(包括但不限于sCRFR2α),提供采用定点诱变产生的多核苷酸作为产生可能有用的物种(即配体结合特性改变的物种,所述特性包括对特定配体的亲和力提高)的方法,但不限于此,因为其它方法也可获得核酸序列变体。例如,可用诱变剂,例如羟胺处理编码所需基因的重组载体以获得序列变体。
D.多肽的表达和纯化
可将本发明多核苷酸,具体地说是编码GPCR、家族B GPCR、家族B1 GPCR的DNA中100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或更多个毗连核苷酸,或与序列表所示序列,例如SEQ ID NO:1、35、7、9、11、13或14有70、75、80、85、90、95、98或100%相同性的多核苷酸表达其编码的肽或蛋白质。在一具体方面,所述DNA编码完整或部分的GPCR胞外结构域,特别是氨基末端胞外结构域。为在原核或真核系统中表达,可采用重组表达领域技术人员公知的技术工程改造DNA区段。据信,实际上可用任何表达系统表达所主张的核酸序列。
在某些实施方式中,本发明涉及包含至少一种蛋白性分子,例如sGPCR、asCRFR或sCRFR2的新型组合物。本文所用的“蛋白质分子”、“蛋白质组合物”、“蛋白质化合物”、“蛋白质链”或“蛋白质物质”通常表示(但不限于)大于约200个氨基酸的蛋白质或基因翻译的全长内源性序列;大于约100个氨基酸的多肽;和/或约3-约100个氨基酸的肽。上述所有“蛋白质”术语在本文可互换使用。此外,这些术语也适用于融合蛋白,
在某些实施方式中,至少一种所述蛋白质分子的大小可包含但不限于:约或至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500个或更多个及其中任何范围的氨基分子残基,特别是这种长度的GPCR、家族B GPCR、家族B1 GPCR或SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12或15(包括SEQ ID NO:4、8、12或15的全长)的50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190个或更多个毗连氨基酸的序列。由于宿主细胞通常加工基因组转录物产生mRNA再翻译成蛋白质,故cDNA和基因组序列均适用于真核表达。
本文所用的术语“工程改造的”和“重组”细胞表示其中引入了外源性DNA区段或多核苷酸(例如cDNA或多核苷酸)的细胞。因此,工程改造的细胞与不含重组引入的外源性DNA区段或基因的天然细胞不同。因此,工程改造的细胞是人为引入一种或多种基因的细胞。重组细胞包括具有引入的cDNA或基因组DNA的那些细胞,也可包含与具体引入的基因天然无关的启动子位置毗邻的基因。
为表达重组蛋白或多肽(无论突变型或野生型),根据本发明制备的表达载体应含有受一个或多个启动子控制的本发明所主张的分离核酸之一。为使编码序列“受启动子控制”,通常应将读框翻译起始点的5’端置于所选启动子下游(即其3’端)约1-约50个核苷酸之间。“上游”启动子激活所插入DNA的转录,促进表达所编码的重组蛋白质。这是“重组表达”在本文中的意义。
可采用许多标准技术来构建含正确核酸和转录/翻译调控序列的表达载体,从而在各种宿主表达系统中表达蛋白质或肽。表达可用的细胞类型包括但不限于:用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌,例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、大肠杆菌菌株RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌x 1776(ATCC号31537)以及大肠杆菌W3110(F-,λ-,原养型,ATCC号273325);杆菌,例如枯草芽胞杆菌(B.subtilis);和其它肠杆菌科,例如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)和各种假单胞菌(Pseudomonas)种。
可通过标准亚克隆技术将编码多肽的多核苷酸或多核苷酸片段插入表达载体。一个实施方式利用大肠杆菌表达载体产生作为融合蛋白的重组多肽,从而能快速亲和纯化蛋白质。这种融合蛋白表达系统的例子是谷胱甘肽S-转移酶系统(Pharmacia,Piscataway,新泽西)、麦芽糖结合蛋白质系统(New England Biolabs,Beverley,MA)、FLAG系统(IBI,New Haven,CT)和6×His系统(Qiagen,Chatsworth,加利福尼亚)。其它有用的载体包括pIN载体(Inouye等,1985);和用于产生谷胱甘肽S-转移酶(GST)可溶性融合蛋白的pGEX载体。其它合适的融合蛋白是含β-半乳糖苷酶、泛素等的那些融合蛋白。
酵母菌(Saccharomyces)表达通常用质粒YRp7(Stinchcomb等,1979;Kingsman等,1979;Tschemper等,1980)。该质粒含有trp1基因,该基因提供了在色氨酸中不能生长的酵母菌突变菌株,例如ATCC号44076或PEP4-1的选择标记(Jones,1977)。那么将trp1存在损伤作为酵母菌宿主细胞基因组特征为检测在没有色氨酸存在时能够生长的转化体提供了有效环境。
酵母菌载体中合适的启动序列包括3-磷酸甘油激酶(Hitzeman等,1980)或其它糖酵解酶(Hess等,1968;Holland等,1978)的启动子,例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。在构建合适的表达质粒中,也将这些基因相关的终止序列连接入表达载体中需要表达序列的3’端以提供mRNA聚腺苷酸化和终止信号。
具有可通过生长条件调控转录额外优点的其它合适启动子包括以下的启动子区域:醇脱氢酶2、异细胞色素(isocytochrome)C、酸性磷酸酶、氮代谢有关的降解酶、上述甘油醛-3-磷酸脱氢酶及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。
除了微生物,也可用源自多细胞生物的细胞培养物作为宿主。原则上可利用任何这样的细胞培养物,无论脊椎动物或无脊椎动物培养物,包括哺乳动物和昆虫细胞(例如,美国专利号4,215,051)。
有用的哺乳动物宿主细胞系的例子有VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、WI38、BHK、COS-7、293、HepG2、NIH3T3、RIN和MDCK细胞系。此外,可选择宿主细胞以所需的特定方式调控所插入序列的表达,或修饰和加工基因产物。蛋白产物的这种修饰(例如,糖基化)和加工(例如,切割)可能对所编码蛋白质的功能至关重要。
也可能需要特定的起始信号来有效翻译本发明所主张的分离的核酸编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和毗邻序列。可能需要额外提供外源性翻译调控信号,包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员不难确定是否有这种需要并提供所需信号。为确保翻译全部插入物,起始密码子必须与所需编码序列的读框同框(in-frame)(或同相(in-phase))是熟知的。加入合适的转录增强子元件或转录终止子可提高表达效率(Bittner等,1987)。
为长期高产率地产生重组蛋白宜稳定表达。例如,可工程改造能稳定表达编码G-蛋白的构建物的细胞系。可用由合适的表达调控元件(例如,启动子、增强子序列、转录终止子、多腺苷酸位点等)和可选择标记控制的载体转化宿主细胞,而不用含病毒来源复制元件的表达载体。引入外来DNA后,可用加富培养基培养工程改造的细胞1-2天,然后转移至选择培养基。重组质粒中的可选择标记能赋予对选择压力的抗性,使细胞将该质粒稳定地整合入它们的染色体,生长形成菌落,进而克隆和扩增成细胞系。
可采用许多选择系统,包括但不限于:分别是tk-、hgprt-或aprt细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等,1977)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska等,1962)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(Lowy等,1980)。也可用抗代谢物耐受作为选择dhfr、gpt、neo和hygro的基础,其中dhfr赋予对甲氨喋呤的抗性(Wigler等,1980;O’Hare等,1981);gpt,赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等,1981);neo赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Colbere-Garapin等,1981);和hygro赋予对潮霉素的抗性。
一旦测定或工程改造了编码特定多肽的多核苷酸序列,可将该多核苷酸插入合适的表达系统。在此情况中,本发明人考虑的是编码sGPCR配体结合域多肽的多核苷酸。可用多种不同的重组DNA表达系统表达该多核苷酸来产生大量的多肽产物,然后可纯化和/或分离这些产物以用作治疗剂或用于接种动物产生抗血清,或者在本发明的某些方面,可用作GPCR配体和/或GPCR活化的拮抗剂。在其它方面,本发明sGPCR可用于检测、筛选或鉴定GPCR的配体、受体或激动剂和/或拮抗剂的方法。可表达本发明多核苷酸以获得GPCR配体结合域、家族B GPCR配体结合域、家族B1 GPCR配体结合域、sCRFR配体结合域或所含的氨基酸序列包含序列表所示氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12或15)的全部或部分的CRFR2配体结合域多肽。
作为重组多肽的备选物质,可制备对应于本发明多肽的合成肽,包括抗原性肽。这种抗原性肽至少长6个氨基酸,最多可含约35个残基。自动肽合成仪包括购自Applied Biosystems(Foster City,加利福尼亚)的那些。使用这种小肽进行疫苗接种通常要将肽与免疫原性载体蛋白,例如乙肝病毒表面抗原、匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白相偶联。本领域熟知进行这种偶联的方法。
1.纯化表达的蛋白质
本发明的其它方面涉及纯化或分离,具体实施方式基本上纯化了包含全部或部分sGPCR配体结合域的蛋白质或肽。本文所用的术语“纯化或分离的蛋白质或肽”指可与其它组分分离的组合物,其中所述蛋白质、多肽或肽相对于其天然可获得的状态(即在此情况中,相对于其在生物或组织中的纯度)被纯化至任何程度。因此,纯化的或分离的蛋白质或肽也指不含其天然产生环境中相伴成分的蛋白质或肽。纯化或分离的蛋白质或多肽的纯度可大于或至少为70、75、80、85、90、95、98或99%纯度。
总之,“纯化的”指经分级除去了各种其它组分的蛋白质或肽组合物,该组合物基本上保留了其显示的活性。在使用术语“基本纯”的地方,该术语指蛋白质或肽形成主要组分的组合物,例如组合物中蛋白质占50%或更多。
鉴于本文内容,本领域技术人员知道定量测定蛋白质或肽纯化程度的各种方法。这些方法包括,例如测定活性组分的比活性(例如,对GPCR配体(包括但不限于CRF或CRF家族的配体)的结合亲和力),或通过SDS/PAGE分析来评估某组分中多肽的含量。评估某组分纯度的优选方法是计算该组分的比活性,将其与初始提取物作比较,从而计算纯度,本文称为“纯化倍数”。用于表示活性的实际单位(可包括结合活性或亲和力)当然取决于所选的具体试验技术。
本领域技术人员熟知蛋白质纯化所用的各种技术。这些技术包括,例如用硫酸铵、聚乙二醇、抗体等沉淀或通过热变性沉淀,然后离心;层析步骤,例如有离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和/或亲和层析;等电点聚焦;凝胶电泳;及这些与其它技术的组合。与本领域公知的那样,据信可更改进行各种纯化步骤的顺序,或者可省去某些步骤,而仍能得到基本纯的蛋白质或肽制品的合适方法。
蛋白质或肽并不总需要以其最纯的状态提供。实际上,某些实施方式考虑可用基本纯的纯度略低的产物。联用较少的纯化步骤或使用同一纯化方案的不同形式可实现部分纯化。例如,应该知道使用HPLC设备进行的阳离子交换柱层析得到的纯化倍数通常大于利用低压层析系统的相同技术。显示纯化纯度相对较低的方法在蛋白质产物的总回收率或保留所表达蛋白质的活性上可能有优势。
E.制备sGPCR特异性抗体
一些实施方式需要产生能高特异性结合编码sGPCR(包括sCRFR2α)的分离核酸的蛋白质产物的抗体。某些方面考虑这种抗体制品应能识别或结合GPCR,特别是剪接变体,例如sGPCR2α的剪接变体的C-末端,因此可用于区分sGPCR多肽与膜结合受体。这种抗体可用于本领域技术人员已知的各种领域,包括但不限于:免疫检测方法、免疫沉淀方法、ELISA试验、蛋白质纯化方法等。本领域熟知制备和表征抗体的方法(参见,例如纳入本文作为参考的Harlow和Lane,1988)。
本领域熟知制备多克隆抗体的方法。简言之,可用抗原性组合物免疫动物,收集该免疫动物的抗血清来制备多克隆抗体。可用各种动物制备抗血清。用于产生抗血清的动物通常是家兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、马或山羊。由于家兔的供血量较大,首选家兔制备多克隆抗体。
如本领域熟知的,某给定组合物的免疫原性可以不同。因此,常要加强宿主免疫系统,这可通过将肽或多肽免疫原与载体偶联来实现。示范性的优选载体是匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其它白蛋白,例如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或家兔血清白蛋白也可用作载体。本领域熟知将多肽与载体蛋白偶联的方法,包括利用戊二醛、间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双-二氮化联苯胺(bis-biazotized benzidine)。
本领域也熟知可利用免疫应答的非特异性刺激剂,称为佐剂提高特定免疫原性组合物的免疫原性。示范性的优选佐剂包括完全弗氏佐剂(含有杀灭的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的非特异性免疫反应刺激剂),不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
采用熟知的技术,例如纳入本文作为参考的美国专利4,196,265所示范的那些技术不难制备单克隆抗体(MAb)。该技术通常包括用选择的免疫原组合物,例如纯化或部分纯化的表达蛋白质、多肽或肽免疫合适的动物。以能有效刺激产抗体细胞的方式给予免疫组合物。
给动物注射上述抗原。免疫接种后,选择具有产抗体潜能的体细胞,特别是B淋巴细胞(B细胞)用于MAb制备方案。常免疫一组动物,取出抗体滴度最高的动物的脾脏,用注射器匀浆脾脏获得脾淋巴细胞。
然后使免疫动物的产抗体B淋巴细胞与无限增殖骨髓瘤细胞融合,后者通常是与所免疫动物同品种的细胞。适用于产生杂交瘤的融合方法的骨髓瘤细胞系宜不产生抗体,融合效率高并有酶缺陷,使它们不能在只支持融合细胞(杂交瘤细胞)生长的某些选择培养基中生长。本领域技术人员可用已知任一种杂交瘤细胞(Goding,1986)。例如,免疫的动物是小鼠时,可用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0Bul;是大鼠时,可用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210;与人细胞融合可用U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
优选的鼠科骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也称为P3-NS-1-Ag4-1),向NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository(NIGMS人类遗传突变细胞保藏所)索取细胞系保藏号GM3575不难获得该细胞系。可用的另一小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮杂鸟嘌呤抗性的鼠科骨髓瘤SP2/0非生产细胞系(non-producer cell line)。
也可在体内增殖杂交瘤细胞来获得大量的本发明单克隆抗体。可将细胞克隆注射入与亲代细胞组织相容的哺乳动物,例如同系小鼠使产抗体的肿瘤生长。任选在注射前用烃类,特别是油,例如姥鲛烷(四甲基十五烷)致敏动物。
按照本发明,可通过包括酶(例如,胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或化学还原切割二硫键的方法获得单克隆抗体片段。或者,可利用自动肽合成仪或通过表达编码全部或部分Mab的全长多核苷酸或多核苷酸片段来合成本发明的单克隆抗体片段。
可通过本领域已知的方法制备抗体偶联物,例如在有偶联剂(如戊二醛或过碘酸盐)存在下使抗体与酶反应。可在有这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯反应制备含荧光标记的偶联物。可类似地制备含金属螯合剂的偶联物。可与抗体偶联的其它部分包括放射性核酸,例如3H、125I、131I 32p、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、58Co、59Fe、75Se、152Eu和99mTc。可按照熟知方法制备本发明的放射活性标记的抗体。例如,可将抗体与碘化钠或碘化钾和化学氧化剂,例如次氯酸钠或酶氧化剂,例如乳酸过氧化物酶接触而碘化。可通过配体交换方法用锝-99标记本发明抗体,例如用亚锡溶液还原高锝酸盐(pertechnate),将还原的锝螯合于Sephadex柱,再将抗体加载到该柱,或者可通过直接标记技术,例如培育高锝酸盐、还原剂(例如,SnCl2)、缓冲液(例如,邻苯二甲酸钠钾溶液)和抗体。
III.编码sGPCR多肽的核酸
本发明包括编码所有或部分sGPCR,例如但不限于:GPCR、家族B GPCR、家族B1 GPCR、CRFR或CRFR2多肽的核酸,也可包括递送该核酸序列以及转录和/或翻译核酸序列所需的各种核酸序列。本发明核酸分子可包含所述核酸的各种毗邻延伸段,例如约10、15、17、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2100个核苷酸,所述核酸包括序列表所示的全长核酸序列(例如,SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13或14)的全部或部分,或本文提及那些GPCR的多核苷酸,其片段,含有本文所述或提及序列的mRNA或cDNA,并考虑了各序列的突变体。也考虑了与上述序列互补在高度严谨条件下能与这些序列结合的分子。这些探针可用于各种杂交实施方式中,例如Southern和Northern印迹。
可围绕公开的核苷酸序列设计各种探针和引物。引物可以是任何长度,但一般长10-20个碱基。在具体的方面,可用探针或引物鉴定或筛选是否存在另路剪接形式的GPCR,例如但不限于包含外显子5/外显子7剪接点(对于CRFR2α转录也描述为外显子3/外显子5连接点)的CRFR2基因。这些探针或引物可与工程改造的核酸或剪接点的独特序列杂交,或者可扩增以该工程改造的核酸或剪接点为特征的核酸。通过给序列指定编号值,例如第一残基为1,第二残基为2等,提出了确定所有引物的算法:
n到n+y
其中n是1到该序列最后编号数字中的整数,y是引物的长度减1,其中n+y不超过该序列的最后编号数字。因此,对于10-聚体,探针对应于碱基1-10、2-11、3-12...等等。对于15-聚体,探针对应于碱基1-15、2-16、3-17...等等。对于20-聚体,探针对应于碱基1-20、2-21、3-22...等等。
在某些方面,可用本发明核酸序列编码本文所述的各种多肽。在本发明一实施方式中,该核酸序列可用作杂交探针或扩增引物。在某些实施方式中,这些探针和引物由寡核苷酸片段构成。这种片段应足够长从而能与从组织提取的RNA或DNA样品特异性杂交。所述序列通常是10-20个核苷酸,但可以更长。某些实施方式优选较长的序列,例如40、50、100、500个核苷酸和甚至全长。
利用长17-100个核苷酸的杂交探针可形成稳定且具有选择性的双螺旋分子。为提高杂交的稳定性和选择性,一般优选在长度大于20个碱基的延伸段上具有互补序列的分子,从而能提高所获得的具体杂交分子的质量和程度。视需要通常优选将核酸分子设计成具有20-30个核苷酸或者甚至更长的延伸段。例如,不难通过化学方法直接合成所述片段或将选择的序列引入重组载体来重组产生这种片段。因此,可用本发明核苷酸序列选择性地与基因、多核苷酸或RNA的互补延伸段形成双螺旋分子,或提供扩增组织DNA或RNA的引物。根据预计的应用,需要采用不同的杂交条件以实现探针对靶序列各种程度的选择性。
对于需要高度选择性的应用,通常要采用较严谨或高度严谨条件来形成杂交体,例如可选择低盐和/或高温条件,如约0.02M-约0.10M NaCl,温度约50℃-约70℃。这种高严谨性条件只允许探针和模板或靶链之间有极少的错配(如果有的话),特别适用于分离特定基因或检测特定mRNA转录物。通常知道加入含量渐增的甲酰胺可赋予更高的严谨性条件。
在某些实施方式中,优选联用本发明核酸序列与适当的检测方法,例如荧光或放射性标记来测定杂交。本领域知道各种合适的指示剂,包括荧光、放射性、酶或其它配体,例如可检测的亲和素/生物素。
对于将本发明核酸区段掺入表达载体(例如质粒、粘粒或病毒多核苷酸)的应用,可将这些区段与其它DNA序列,例如启动子、聚腺苷酸化信号、限制性酶切位点、多克隆位点、其它编码序列等组合,故而使得它们的总长度极为不同。预计可使用几乎任何长度的核酸片段,但为便于制备及用于预计的重组DNA方案,总长度最好有限。
可将编码特定多核苷酸的DNA区段引入重组宿主细胞并用于表达sGPCR,例如但不限于sGPCR2α多肽。或者,可通过遗传工程技术利用所选多核苷酸的次级部分或衍生物。
在本申请中,术语“表达构建物”包括的任何类型遗传构建物所含的核酸具有明确的产物(例如但不限于编码多肽的产物)的序列,其中部分或全部核酸序列能被转录。可将转录物翻译成蛋白质,但不一定需要。因此,在某些实施方式中,表达包括转录多核苷酸和将RNA翻译成多肽产物。
在优选的实施方式中,所述核酸受启动子的转录调控。“启动子”指细胞的合成机制或引入的合成机制能识别的,启动多核苷酸特异性转录所需的DNA序列。短语“受转录调控”表示所述启动子相对于所述核酸处于正确的位置和取向,从而能调控RNA聚合酶启动和多核苷酸的表达。本文用术语“启动子”指群集在RNA聚合酶,特别是RNA聚合酶II起始位点周围的一组转录调控模块。在某些方面,各启动子中至少有一个模块起到定位RNA合成起点的作用。这种模块的最佳已知例子是TATA盒,但在一些缺乏TATA盒的启动子,例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子中,有一与起点本身重叠的不连续元件可协助固定起始位置。
据信,用于控制核酸表达的具体启动子不重要,只要它能在靶细胞中表达核酸。因此,靶向人细胞时,优选将核酸编码区置于毗邻启动子处在其调控下以便能在人细胞中表达。一般说来,这种启动子可包括人或病毒启动子。
在各种其它实施方式中,可利用人巨细胞病毒(CMV)立即早期基于启动子、SV40早期启动子和Rous肉瘤病毒长末端重复序列来高水平表达转基因。考虑也可用本领域熟知的其它病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来表达转基因,只要表达水平足够符合给定目的。在本发明中可利用下述几种元件/启动子来调节多核苷酸,例如转基因的表达。该清单并未穷举参与启动转基因表达的所有可能元件,而只是示范性的。
也可用任何启动子/增强子组合(按照Eukaryotic Promoter Data Base(真核启动子数据库),EPDB)来驱动多核苷酸表达。利用T3、T7或SP6胞质表达系统是另一种可能的实施方式。如果能提供合适的细菌聚合酶(作为递送复合物的一部分或其它遗传表达构建物),真核细胞能支持某些细菌启动子的胞质转录。利用杆状病毒系统可包括用强效多角体蛋白启动子进行高水平表达。
启动子包括但不限于以下的启动子:免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链、T-细胞受体、HLA DQα和DQβ、β-干扰素、白介素-2、白介素-2受体、II类MHC5、II类MHC HLA-DRα、β-肌动蛋白、肌肉肌酸激酶、前白蛋白(运甲状腺素蛋白)、弹性蛋白酶I、金属硫蛋白、胶原酶、白蛋白基因、甲胎蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、c-fos、c-HA-ras、胰岛素、神经细胞黏着分子(NCAM)、α1-抗胰蛋白酶、H2B(TH2B)组蛋白、小鼠或I型胶原、葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)、大鼠生长激素、人血清淀粉样A(SAA)、肌钙蛋白I(TN I)、血小板衍生生长因子、假肥大型肌营养不良、SV40、多瘤、逆转录病毒、乳头瘤病毒、乙肝病毒、人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、长臂猿白血病病毒。
各种元件(诱导物)包括但不限于:MT II(佛波酯(TPA)重金属);MMTV(糖皮质激素,β-干扰素,聚(rI)X,聚(rc));腺病毒5 E2(E1a);c-jun(佛波酯(TPA)、H2O2);胶原酶(佛波酯(TPA));溶基质素(佛波酯(TPA)、IL-1);SV40(佛波酯(TPA));鼠科MX基因(干扰素,新城疫病毒);GRP78基因(A23187);α-2-巨球蛋白(IL-6);波形蛋白(血清);I类MHC基因H-2kB(干扰素);HSP70(Ela,SV40大T抗原);增殖蛋白(佛波酯-TPA);肿瘤坏死因子(FMA);和促甲状腺激素α基因(甲状腺激素)。
通常可包含聚腺苷酸化信号以实现转录物的正确聚腺苷酸化。据信,聚腺苷酸化信号的性质对于成功实施本发明不重要,可使用任何序列。优选的实施方式包括SV40聚腺苷酸化信号和牛生长激素聚腺苷酸化信号,这些信号方便且已知在各种靶细胞中具有功能。也考虑可包含终止子作为表达盒的元件。这些元件可用于提高信息水平并尽可能降低从表达盒连读入其它序列。
在本发明各种实施方式中,表达构建物可包含病毒或病毒基因组衍生的工程改造构建物。某些病毒能通过受体介导的内吞作用进入细胞、整合入宿主细胞基因组而稳定有效地表达病毒基因使得它们成为将外来基因转运入哺乳动物细胞的有吸引力候选对象(Ridgeway,1988;Nicolas和Rubenstein,1988;Baichwal和Sugden,1986;Temin,1986)。用作载体的第一种病毒是DNA病毒,包括乳多空病毒(猿猴病毒40,牛乳头瘤病毒和多瘤)(Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden,1986)和腺病毒(Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden,1986)及腺伴随病毒。与牛痘病毒(Ridgeway,1988)和腺伴随病毒(Ridgeway,1988)一样,逆转录病毒也是有吸引力的基因转运载体(Nicolas和Rubenstein,1988;Temin,1986)。这种载体可用于(i)体外转化细胞系以表达感兴趣的G-蛋白或(ii)体外或体内转化细胞系以提供基因疗法方案的治疗性多肽。
在另一实施方式中,所用的sGPCR编码核酸实际上可编码能在胞内条件下与sGPCR或其它编码序列杂交的反义构建物。术语“反义构建物”指与靶DNA或RNA的碱基序列互补的核酸,优选寡核苷酸。
本文所用的术语“互补”表示在其全长上基本互补和只有很少碱基错配的核酸序列。例如,当15个碱基长的(两条)核酸序列在13或14个位置具有互补的核苷酸,而只有一个错配时,其可称为互补。“完全互补”的核酸序列当然是其全长完全互补没有碱基错配的核酸序列。
A.核酸的检测和定量测定
本发明的一个实施方式包括通过扩增和检测对应于sGPCR的核酸来鉴定生物学样品中sGPCR核酸(例如但不限于CRFR2α)的方法。生物学样品可以是可能含有多核苷酸的任何组织或液体。按照标准方法分离生物学样品中所含细胞的核酸用作扩增模板(Sambrook等,1989)。所述核酸可以是分级的(fractionated)或全细胞RNA。
使能与对应于sGPCR的核酸杂交的各对引物在允许选择性杂交的条件下与分离的核酸接触。杂交后,使核酸:引物复合物与能促进模板依赖性核酸合成的一种或多种酶接触。进行多回合(也称为“多轮”)扩增直至获得足够量的扩增产物。可检测扩增产物。某些实施方式可通过目测方式进行检测。或者,检测可包括通过所掺入的放射性标记或荧光标记的化学发光、放射性闪烁显像,或者甚至通过利用电或热输入信号的系统来间接鉴定产物(Affymax technology;Bellus,1994)。
可用许多依赖于模板的方法来扩增某给定模板样品中的标记序列。一种最好的已知扩增方法是聚合酶链式反应(称为PCR),其详述于美国专利4,683,195;4,683,202和4,800,159及Innis等,1990,各篇文献全文纳入本文作为参考。本领域熟知聚合酶链式反应方法。
扩增的另一方法是全文纳入本文作为参考的EPA号320308公开的连接酶链式反应(“LCR”)。美国专利4,883,750描述了类似于LCR,将探针对与靶序列结合的方法。本发明也可用PCT申请号PCT/US87/00880所述的Qbeta复制酶作为另一扩增方法。也可采用恒温扩增方法扩增本发明核酸,所述方法用限制性内切核酸酶和连接酶扩增一条链中含有核苷酸5’-[α-硫代]-三磷酸限制性位点的靶分子(参见全文纳入本文作为参考的Walker等,(1992))。还有链置换扩增(SDA)是进行恒温扩增核酸的另一种方法,该方法包括多回合链置换和合成,即切口平移。称为修复链式反应(Repair Chain Reaction)(RCR)的类似方法包括在横跨靶扩增区域内进行几个探针的退火,然后在四种碱基只存在两种时进行修复反应。也可采用循环探针反应(cyclic probe reaction)(CPR)检测靶特异性序列。本发明还可采用GB申请号2202328和PCT申请号PCT/US89/01025所述的另一种扩增方法,两篇文献全文纳入本文作为参考。其它核酸扩增方法包括转录扩增系统(TAS),包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR(Kwoh等,1989;PCT申请WO88/10315,均全文纳入本文作为参考)。
扩增后,为测定是否发生了特异性扩增,优选将扩增产物与模板和过量的引物分离。在一个实施方式中,采用标准方法通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。参见Sambrook等,1989。
可采用层析技术实现分离。本发明可用多种层析:吸附层析、分配层析、离子交换层析和分子筛层析,以及采用它们的许多专门技术,包括柱层析、纸层析、薄层层析和气相层析(Freifelder,1982)。
IV.sGPCR基因表达的方法
本发明的一个实施方式提供了提高细胞中sGPCR表达(例如但不限于sCRFR2α表达)的方法。当所示蛋白质有异常或表达不足以实现正常功能时,这特别有用。该方法能缓解sGPCR缺乏、GPCR过度活化或GPCR配体丰富所致疾病的症状。
提高sGPCR的通用方法是使细胞、组织、动物或对象与sGPCR多肽接触或给予该多肽。虽然优选直接递送该蛋白质,但可以预计的实施方式包括给予细胞或毗邻细胞编码sGPCR多肽的核酸。按照此规定,sGPCR多肽由宿主细胞的转录和翻译机制合成,以及由表达构建物提供该多肽。支持sGPCR多核苷酸表达所需的顺式调控元件以表达构建物的形式提供。也可刺激或提高病毒编码sGPCR的表达,或者使表达的多肽稳定,从而获得相同或相似的作用。
为有效表达sGPCR多核苷酸编码的构建物,必须用递送载体将表达构建物递送入细胞。当表达构建物包裹在能递送复制型或非复制型核酸的病毒颗粒中时,一种递送机制是通过病毒感染。
某些病毒能通过受体介导的内吞作用进入细胞,整合入宿主细胞基因组并稳定而有效地表达病毒基因使得它们成为将外来基因转移入哺乳动物细胞的有吸引力候选对象(Ridgeway,1988;Nicolas和Rubenstein,1988;Baichwal和Sugden,1986;Temin,1986)。用作基因载体的第一种病毒是DNA病毒,包括乳多空病毒(猿猴病毒40,牛乳头瘤病毒和多瘤)(Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden,1986)和腺病毒(Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden,1986)。这些病毒对外来DNA序列的容量较低,宿主谱系有限。此外,它们的致癌可能性及在受纳细胞中有细胞病变作用而导致了安全顾虑。它们最多只能容纳8kb外来遗传物质,但能方便地引入各种细胞系和实验室动物中(Nicolas和Rubenstein,1988;Temin,1986)。
逆转录病毒是特征在于能在受感染细胞中将其RNA转变为双链DNA的一群单链RNA病毒;它们也能用作载体。其它病毒载体可用作本发明表达构建物。可用源自病毒,例如牛痘病毒(Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden,1986;Coupar等,1988)、腺伴随病毒(AAV)(Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden,1986;Hermonat和Muzycska,1984)和疱疹病毒的载体。对于各种哺乳动物细胞,它们提供的几种特征有吸引力(Friedmann,1989;Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden,1986;Coupar等,1988;Horwich等,1990)。
本发明也考虑了将表达构建物转移入所培养哺乳动物细胞中的几种非病毒方法。这些方法包括磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb,1973;Chen和Okayama,1987;Rippe等,1990)、DEAE-葡聚糖(Gopal,1985)、电穿孔(Tur-Kaspa等,1986;Potter等,1984)、直接微量注射(Harland和Weintraub,1985)、加载DNA的脂质体(Nicolau和Sene,1982;Fraley等,1979)和脂质转染胺-DNA复合物、细胞超声处理(Fechheimer等,1987)、利用高速微粒的基因轰击(Yang等,1990)和受体介导的转染(Wu和Wu,1987;Wu和Wu,1988)。如下所述,这些技术中的一些可成功用于体内或离体应用。
在本发明的另一实施方式中,所示表达构建物可简单地由裸重组DNA或质粒构成。可采用上述物理或化学渗透细胞膜的任一方法转移该构建物。这特别适用于体外转移,但也适用于体内。将裸DNA表达构建物转移入细胞的本发明另一实施方式包括颗粒轰击。该方法取决于能否加速包被DNA的微粒至高速从而刺穿细胞膜并进入细胞但不杀伤细胞(Klein等,1987)。已开发了几种加速小颗粒的装置。一种这样的装置依赖于高电压放电产生电流,进而提供推动力(Yang等,1990)。所用的微粒由生物学惰性物质,例如钨或金珠构成。
在本发明还有的实施方式中,可将表达构建物包裹在脂质体中。脂质体是特征在于磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时,脂质体自发形成。脂质组分先经过自身重排,再形成封闭结构,将水和溶解的溶质包裹在脂双层之间(Ghosh和Bachhawat,1991)。也考虑了脂质转染胺-DNA复合物。
可用于将编码sCRFR2α多核苷酸的核酸递送入细胞的其它表达构建物是受体介导的递送载体。这些载体利用几乎所有真核细胞均可通过受体介导内吞作用而选择性摄取大分子。由于各种受体分布对细胞类型具有特异性,这种递送具有高度特异性(Wu和Wu,1993)。
V.治疗疾病的药物和方法
在其它实施方式中,本发明涉及用药学上可接受的溶液配制的本文所述一种或多种多核苷酸、多肽和/或抗体组合物的制剂,该制剂可单独或与一种或多种其它治疗方式联合给予细胞、组织、动物、患者或对象。
本发明的水性药物组合物含有效量的sGPCR表达构建物,其是编码治疗性基因和sGPCR,或sGPCR蛋白和/或能调节GPCR配体活性或敏感性或其它内分泌功能的化合物的表达构建物。通常将这种组合物溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。为治疗目的,“有效量”定义为导致对象的疾病发生临床上可检测变化的用量。该用量根据药物、患者疾病、治疗类型等而不同。
短语“药学上或药理学上可接受”指给予动物或人时不产生明显相反、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。本文所用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。本领域熟知用于药学活性物质的这种介质和试剂。可考虑将任何常规介质或试剂用于治疗性组合物中,除非其与活性成分不相容。
除了为胃肠外给药配制的化合物(例如那些用于静脉内或肌肉内注射的),其它药学上可接受的形式包括,例如用于口服给药的片剂或其它固体;缓释胶囊;和目前使用的任何其它形式,包括乳膏、洗剂、吸入剂等。
常将本发明活性化合物配制为用于胃肠外给药,例如配制为用于静脉内、肌肉内、皮下或甚至腹膜内途径注射。本领域技术人员借鉴本文内容可以知道如何制备只含有sGPCR或与作为活性成分的常规治疗药物组合的水性组合物。这种组合物一般可制备成液体溶液或混悬液的注射剂;也可制备成适用于在注射前加入液体来制成溶液或混悬液的固体形式;也可乳化这些制剂。
适合于注射用的药物形式包括无菌水溶液和分散液;含芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂;和临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在许多情况中,所述形式必须无菌并且易于注射的液体。这些形式在制备和保藏条件下必须稳定,保藏时必须防止微生物,例如细菌和真菌的污染。
载体也可以是溶剂或分散介质,包括例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和聚乙二醇液体等)、它们合适的混合物和植物油的。例如,可用包衣(如卵磷脂),维持所需颗粒大小(以分散液为例)以及利用表面活性剂来维持合适的流动性。可利用各种抗细菌剂和抗真菌剂,例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等预防微生物的作用。在许多情况中,优选包含等渗剂,例如糖或氯化钠。可在该组合物中使用延迟吸收试剂,例如单硬脂酸铝和明胶获得可注射组合物的延长吸收。
将所需量的活性化合物掺入含上述各种其它成分(视需要)的合适溶剂,然后除菌过滤制备无菌可注射溶液。通常将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和需要的上述其它成分的无菌载体中以制备分散液。以制备无菌可注射溶液的无菌粉末为例,优选的制备方法是用真空干燥和冻干技术得到预先过滤除菌溶液的活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
配制后,以与剂量制剂相容方式和治疗有效量给予溶液。不难以各种剂型给予这些制剂,例如上述可注射溶液的类型,甚至可使用药物释放胶囊等。
例如,对于水性溶液的胃肠外给药,如果需要应适当缓冲所述溶液并先用足够的盐水或葡萄糖赋予液体稀释剂等渗性。这些具体的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。就此而言,本领域技术人员借鉴本文内容可以知道可用的无菌水性介质。例如,可将1份剂量溶解于1mL等渗NaCl溶液中,加入1000mL皮下灌注液体中或注射于打算灌注的部位(参见,例如“Remington’sPharmaceutical Sciences”(《雷明顿药物科学》),(1980))。按照所治疗患者的情况,剂量必定有一些差异。无论如何,负责给药之人应为每位对象确定合适剂量。
在本发明方法的某些方面,治疗性组合物的给药途径可以是胃肠外给药。胃肠外给药可以是静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、髓内注射、服食或它们的组合。在某些方面,含sGPCR的组合物每剂量给予约0.1-约10微克/kg/体重。在某些方面,含sGPCR的组合物每剂量给予约1-约5微克/kg/体重。在某些方面,含sGPCR的组合物每剂量给予约1.2-约3.6微克/kg/体重。在某些方面,含sGPCR的组合物每剂量给予约1.2-约2.4微克/kg/体重。在优选的方面,每剂量给予的sGPCR量可以是约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、约9.0、约9.1、约9.2、约9.3、约9.4、约9.5、约9.6、约9.7、约9.8、约9.9、约10.0或更高的微克/kg/体重。
与开发采用本文所述特定组合物的合适剂量和治疗方案(包括例如口服、胃肠外、鼻内和肌肉内给药)及制剂所述的那样,本领域技术人员熟知如何配制药学上可接受的赋形剂和载体溶液。
A.饮食递送
术语“饮食递送”指直接或以其它方式给予至动物消化道的一部分。术语“消化道”指动物的口腔到肛门,起到消化和吸收食物及排出食物残渣功能的管状通道和其任一部分或区段,例如口腔、食道、胃、小肠、大肠和结肠及它们的组合部分,例如胃肠道。因此,术语“饮食递送”包括几种给药途径,包括但不限于:口服、直肠、内窥镜法和舌下/口腔含化给药。这些给药方式的共同要求是经部分或全部消化道吸收,如此给予的核酸需要有效穿过粘膜。
1.口服递送
在某些应用中,本文公开的药物组合物可经口服给药递送至动物、患者或对象。因此,可用惰性稀释剂或用可吸收可食用的载体配制这些组合物,或者可将这些组合物包裹在硬壳或软壳明胶胶囊中,或者可将其压成片剂,或者可将其直接掺入食物中。
甚至可用赋形剂掺合活性组分,使用可服食的片剂、口腔含化片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂等形式(Mathiowitz等,1997;Hwang等,1998;美国专利5,641,515;5,580,579和5,792,451,各篇文献专门全文纳入本文作为参考)。片剂、锭剂、丸剂。胶囊等也可含有以下物质:黏合剂,例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶;赋形剂,例如磷酸氢二钙;崩解剂,例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等;润滑剂,例如硬脂酸镁;甜味剂,例如可加入蔗糖、乳糖或糖精,或调味剂,例如薄荷、冬青油或樱桃调味品。当单位剂型是胶囊时,除上述类型的材料外,它可含有液体载体。可存在各种其它材料,例如包衣,或用于改进单位剂量的物理形式。例如,可用紫胶、糖或二者包衣片剂、丸剂或胶囊。酏剂糖浆精可含有活性组分蔗糖作为甜味剂,对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂,色素和调味品,例如樱桃或橙子味。当然,制备任何单位剂型所用的任何材料应是药学纯的并且基本上无毒。此外,可将活性化合物掺入缓释制品和制剂。
这些制剂通常含有至少约0.1%或更多的活性化合物,虽然活性成分的百分比当然可变,但以制剂的总重或总体积计宜在约1或2%-约60%或70%之间。治疗上有用的各组合物中活性化合物的含量当然应制备为能在任何给定的化合物单位剂量中获得合适剂量。制备这种药物制剂领域的技术人员应考虑诸如溶解性、生物利用度、生物学半衰期、给药途径、产品储存期限等因素以及其它药理学考虑的因素,因而可能需要各种剂量和治疗方案。
2.直肠给药
通过口服途径给予的治疗剂常可通过下端肠道途径给予,即通过肛门给予直肠或下端小肠。直肠栓剂、滞留灌肠剂或直肠导管可用于此目的,当患者配合程度可能难以实现时(例如,应用于儿童或老年人,或者患者在呕吐或意识不清时),优选该途径。直肠给药比口服途径更快捷,能获得更高的血液水平,但也可能相反(Harvey,1990)。由于直肠吸收的约50%治疗剂不经过肝脏,通过此途径给药可明显降低首过代谢的可能性(Benet等,1996)。
B.胃肠外给药
术语“胃肠外给药”指将本发明治疗剂不通过消化道途径给予动物、患者或对象。本领域已知胃肠外药物组合物的制备和给药方法(参见,例如Avis,1990)。
C.管腔内给药
对于将治疗剂直接递送给管状器官或组织(例如,动脉、静脉、输尿管或尿道)的分离部分,可能需要管腔内给药来治疗患有这种器官或组织内腔受影响的疾病或病症的患者。为实现该给药方式,可用合适装置经外科手术插入导管或套管。隔离要治疗的管状器官或组织部分后,将含本发明治疗剂的组合物经导管或套管灌注入该隔离部分。培育约1-约120分钟使治疗剂被吸收或与管道内腔的细胞接触后,取出灌注导管或套管,除去隔离灌注器官或组织部分的结扎线使其内部恢复流动(Morishita等,1993)。本发明治疗组合物也可与生物相容的基质(例如水凝胶物质)混合,直接体内应用于血管组织。
D.脑室内给药
对于将治疗剂直接递送给患者的大脑,可能需要脑室内给药来治疗患有大脑受影响的疾病或病症的患者。实现该给药方式的一种方法是通过外科手术将硅导管插入人患者大脑的脑室,使之与通过外科手术植入腹部区域的皮下灌注泵(Medtronic Inc.,明尼阿波利斯,明尼苏达)相连(Zimm等,1984;Shaw,1993)。可用该泵注射治疗剂并能借助外部程序化装置精确调节剂量及改变剂量方案。泵的储量是18-20mL,灌注速率可以是0.1mL/h-1mL/h。根据给药频率(每日一次到每月一次)和所给予药物的剂量(0.01μg-100g/kg体重),可以间隔3-10周重新充满泵的储器。经皮穿刺该泵的自封闭隔板重新充满泵。
E.鞘内给药
对于将治疗剂引入患者的脊柱,可能需要鞘内给药来治疗患有中枢神经系统疾病的患者。为实现该给药方式,可通过外科手术将硅导管植入人患者L3-4腰椎间隙,使之与通过外科手术植入上腹部区域的皮下灌注泵相连(Luer和Hatton,1993;Ettinger等,1978;Yaida等,1995)。可用该泵注射治疗剂并能借助外部程序化装置精确调节剂量及改变剂量方案。泵的储量是18-20mL,灌注速率可以是0.1mL/h-1mL/h。根据给药频率(每日一次到每月一次)和所给予药物的剂量(0.01μg-100g/kg体重),可以间隔3-10周重新充满泵的储器。一次经皮穿刺该泵的自封闭隔板重新充满泵。
为通过该方法实现对大脑或脊柱以外区域的递送,可将硅导管配置为连接皮下灌注泵与,例如肝动脉从而能对肝脏递送(Kemeny等,1993)。
F.阴道递送
阴道递送能提供局部治疗,避免首过代谢、消化酶降解以及可能的全身性副作用。可利用阴道栓剂(Block,第87章,刊于:Remington′s PharmaceuticalSciences(《雷明顿药物科学》),第18版,Gennaro编,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990,第1609-1614页)或局部软膏实现该递送方式。
G.脂质体、纳米胶囊和微粒介导的递送
在某些实施方式中,本发明人考虑了用脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等将本发明组合物引入合适的宿主细胞。具体地说,可将本发明组合物包裹在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米微球或纳米颗粒等中递送。
优选这种制剂包括本文所公开核酸或构建物的药学上可接受的制剂。本领域技术人员公知脂质体的制备和应用(参见,例如Couvreur等,1977;Lasic,1998;这些文献描述了脂质体和纳米胶囊在胞内细菌感染和疾病的靶向抗生素疗法中的应用)。近年来,开发了血清稳定性和循环半衰期改善的脂质体(Gabizon和Papahadjopoulos,1988;Allen和Choun,1987;美国专利5,741,516;这些文献专门全文纳入本文作为参考)。此外,脂质体和脂质体样制品作为潜在药物载体的各种方法已见评述(Takakura,1998;Chandran等,1997;Margalit,1995;美国专利5,567,434;5,552,157;5,565,213;5,738,868和5,795,587,各篇文献专门全文纳入本文作为参考)。
将磷脂分散在水性介质中,其自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))从而制得脂质体。MLV的直径一般为25nm-4μm。超声处理MLV形成在核心中含有水溶液的直径200-500的小单层囊泡(SUV)。
静脉内注射脂质体的结局和分布取决于它们的物理特性,例如大小、流动性和表面电荷。根据其构成,这些脂质体可滞留在组织中1小时到数天,血液中的半衰期可以是1分钟到几天。网状内皮系统的吞噬细胞快速摄入较大的脂质体,例如MLV和LUV,但在大多数部位,循环系统的生理特性抑制了这种大脂质体的排出。它们只能在毛细血管内皮中存在大开口或孔处,例如肝脏或脾脏的窦状隙排出。因此,这些器官是摄取的主要部位。另一方面,SUV显示组织分布较广,但高度聚集于肝脏和脾脏中。该体内特性通常将脂质体的潜在靶子局限于它们大体积可接近的那些器官和组织。这些器官和组织包括血液、肝脏、脾脏、骨髓和淋巴器官。
或者,本发明提供本发明组合物的药学上可接受的纳米胶囊制剂。纳米胶囊一般可以稳定和可再生的方式包裹化合物(Henry-Michelland等,1987;Quintanar-Guerrero等,1998;Douglas等,1987)。为避免胞内聚合物过载导致的副作用,应该利用能在体内降解的聚合物设计这种超细颗粒(大小约0.1μm)。本发明考虑了使用符合这些要求的生物可降解聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒。如Couvreur等,1980;1988;zur Muhlen等,1998;Zambaux等,1998;Pinto-Alphandry等,1995和美国专利号5,145,684(各篇文献专门全文纳入本文作为参考)所述,这种颗粒不难制备。
实施例
给予以下实施例是为说明本发明各种实施方式的目的,不是要以任何方式限制本发明。本领域技术人员不难理解本发明很好地适合于实现这些目标和获得所述结果和优点及本文固有的那些目标、结果和优点。这些实施例以及本文所述的细胞和方法代表了目前优选实施方式,是示范性的,不是对本发明范围的限制。本领域技术人员可以想到其中的变化和其它应用,这些变化和其它应用属于权利要求书范围所定义的本发明构思。
A.材料与方法
分离小鼠可溶性CRFR2αcDNA.可溶性CRFR2α剪接变体与小鼠CRFR2α直向同源物的同时分离。根据已知的哺乳动物CRFR2基因之间的同源性设计PCR引物。用寡聚dT或随机引物从小鼠全脑poly(A)+RNA逆转录制备cDNA,用以下寡核苷酸引物筛选该cDNA:5’CCCCGAAGCTGCCCGACTGG 3’(SEQ ID NO:16)(有义)和5’GGAAGGCTGTAAAGGATGGAGAAG 3’(SEQ ID NO:17)(反义)。62℃进行35轮PCR,72℃延伸90秒。将扩增的片段亚克隆入pCRIITOPO载体中(Invitrogen,Carlsbad,加利福尼亚),测序,找到编码缺乏外显子6的全长CRFR2α的新型剪接变体,sCRFR2α(Chen等,2005)。
半定量RT-PCR和Sourthern分析.切下以下小鼠外周和CNS组织并如以前所述(Chen等,2005)直接分离总RNA:全脑、嗅球、下丘脑、皮质、小脑、海马体、中脑、脑桥/延髓、脊髓和垂体。利用cDNA产物作为模板,用CRFR2α、sCRFR2α和核糖体蛋白S16特异性引物进行半定量和RT-PCR分析。寡核苷酸引物在外显子3和7中的定位导致分别扩增了对应于CRFR2α和sCRFR2α的两种产物,418和309。寡核苷酸引物序列和PCR条件见支持性教材(supporting text)。
胞外受体激酶1/2(ERK1/2)试验. 用补加了1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的DMEM平衡CATH.a细胞6小时,然后在有或没有用0.1%DMEM/BSA稀释的0.4或4nM sCRFR2α存在下用0.1%DMEM/BSA(载体)或10nM Ucn I激活。立即收集细胞,如以前所述(Chen等,2005)分析磷酸化的ERK1/2-p42,44。
瞬时转染和萤光素酶试验.用含EVX1基因的片段(含强效CRE位点)的萤光素酶报道基因转染HEK293T细胞。收集细胞,如以前所述(Chen等,2005)检验萤光素酶报道基因活性。转染20小时后,在有或没有0.1nM sCRFR2α存在下用载体或Ucn1(0.0001-100 nM)处理细胞4小时。
放射免疫试验(RIA).采用以前所述抑制素亚基的方法(Vaughan等,1989),用编码小鼠sCRFR2α独特C-末端尾(氨基酸113-143)与匙孔血蓝蛋白偶联的合成肽片段免疫家兔产生抗血清。利用氯胺-T以Na125I放射性标记类似物Tyr113sCRFR2α(113-143),HPLC纯化(Vaughan等,1989)用作HA的示踪剂。sCRFR2αRIA的方法类似于以前详述的抑制素亚基的方法(Vaughan等,2005)。简言之,用最终稀释度为1/300,000的抗-sCRFR2α,将合成的sCRFR2α(113-143)用作标准品。用酸提取小鼠组织,如Vaughan等(1989)所述用十八烷基硅柱部分纯化。检验3-7剂量水平的冻干样品。加入绵羊抗-家兔γ-球蛋白和10%(重量/体积)聚乙二醇分离游离与结合的示踪剂。sCRFR2α的EC50和最低可检测剂量分别是每试管约5pg和100pg。
免疫组织化学.用水合氯醛(350mg/kg,腹膜内)麻醉成年雄性C57B6J小鼠(Jackson Laboratories)和Sprague-Dawley白化病大鼠(Harlan Sprague-Dawley),用Zambon固定剂灌注(Bittencourt等,1999),然后0-4小时后固定。对整个大脑作规定间隔的(四分之一(1-in-4))一系列30μm厚前额切片,使用VectastainElite试剂(Vector Laboratories,Burlingame,加利福尼亚)进行sCRFR2α-ir的镍增强亲和素-生物素-免疫过氧化物酶定位(nickel-enhancedavidin-biotin-immunoperoxidase localization)。用载体吸附第一sCRFR2α抗血清,亲和纯化,以1∶2000稀释度使用。将第一抗血清在4℃与0-300μM合成免疫原预先培育过夜,评估免疫染色的特异性。也评估了一种或两种CRFR有缺陷的突变型小鼠中的标记情况(Smith等,1998;Bale等,2000)。用sCRFR2α转染COSM6细胞的荧光免疫细胞化学分析详述见支持性教材。
哺乳动物表达sCRFR2α:如Perrin等(2001)所述将对应于氨基酸1-143并通过PCR修饰在氨基酸143后加入FLAG表位的cDNA亚克隆入pSec-Tag2 HygroA中(Invitrogen,Carlsbad,加利福尼亚),用其转染COSM6细胞。4天后,收集培养液,用FLAG-琼脂糖(Sigma,St.Louis,MO)免疫亲和层析纯化富集sCRFR2α。用抗-FLAG抗体或抗独特sCRFR2αC-末端的抗体作免疫印迹分析检测该蛋白质。
细菌表达sCRFR2α:用mCRFR2α作为模板通过PCR产生对应于氨基酸20-143的cDNA。将该cDNA亚克隆入pET-32a(+)中(Novagen,La Jolla,加利福尼亚),如Perrin等(2001)所述通过S-蛋白亲和层析纯化该蛋白质。用抗独特sCRFR2α C-末端的抗体作免疫印迹分析检测该蛋白质。
放射性受体试验.如Perrin等(2003)所述将从COS M6细胞培养液或大肠杆菌纯化的可溶性蛋白质与[125I-DTyrO]-astressin和浓度渐增的未标记肽在三复孔中培育。
B.结果
在分离小鼠CRFR2α期间观察到尺寸较小(约100bp)的cDNA转录物(VanPett等,2000)。分离该较小的片段,找到其编码外显子6缺失(标记)CRFR2α变体(的片段)。翻译该变体转录物预示了一种新型143个氨基酸的蛋白质sCRFR2α,其包含了CRFR2α第一胞外结构域的大部分后接独特的38个氨基酸C末端(图1A)。筛选GenBank显示该C-末端没有其它同源性蛋白质。图1B显示了sCRFR2α的基因组重排。
如果sCRFR2αmRNA只是剪接错误的产物,其丰度应远低于正确剪接的RNA。为检验该疑问,依次采用半定量RT-PCR与Southern杂交分析来比较CRFR2α和sCRFR2αmRNA在几个脑区域中的相对丰度。将制备的小鼠组织总RNA逆转录产生cDNA用作半定量RT-PCR分析的模板,然后用CRFR2α和sCRFR2α的特异性引物和探针进行进行Southern杂交(图2)。该寡核苷酸引物对(位于外显子3和7中)能在一次反应中同时扩增可溶形式受体和全长膜结合受体(图2A)。嗅球、皮质、中脑和垂体中sCRFR2α高度表达(图2B和2C)。发现在海马体、下丘脑、脑桥、髓质和脊髓中表达水平较低(图2B和2C)。如图2所示,sCRFR2αmRNA丰度较低,但与CRFR2αmRNA的相当。发现RT-PCR产生的cDNA片段序列能编码小鼠CRFR2α基因的剪接变体(图1A)。
该序列的计算机分析预计前19个氨基酸作用是推测的信号肽。由于该序列不含明显的膜附着位点,推测该蛋白质以可溶形式分泌。为研究该假设,在COS M6细胞中表达该蛋白。从培养液纯化后,用抗-FLAG抗血清或抗-sCRFR2α(用编码sCRFR2α蛋白独特C-末端尾(氨基酸113-143)的合成肽片段产生)抗血清作免疫印迹分析观察到一条约30kD的蛋白质条带(图3A)。与从该cDNA预计的相比,此蛋白质的体积较大可能是糖基化所致。
为获得大量的sCRFR2α,在大肠杆菌中将缺乏推定信号肽的蛋白质表达为融合蛋白(Perrin等,2001)。切割和纯化后,通过免疫印迹分析观察到该蛋白质是大小约20kD的狭窄条带。放射性免疫测定(图3B)以及免疫细胞化学(图3C)(试验)中均用抗-sCRFR2α血清检测sCRFR2α蛋白。
用抗-sCRFR2α血清作免疫组织化学研究揭示了sCRFR2α-ir在啮齿类动物脑中的分布。sCRFR2α-ir免疫标记的细胞分布广泛,更符合CRFR1 mRNA表达模式的位置,而不是CRFR2(图4A-4F)。所述结果是来自小鼠研究;在大鼠中也观察到的类似的标记模式。细胞表达的主要部位包括嗅球的僧帽细胞和簇状毛细胞、medial septavdiagonal band complex、梨状皮质、黑质、红核、基底侧索扁桃体(basolateral arnygdaloid)、深小脑和背柱核,所有这些是CRFR1表达的主要部位。与CRFR1相似,整个新皮质层中有许多sCRFR2α-ir细胞体,虽然各层分布只有部分重叠。因此,虽然层2/3中有许多表达CRFR1和sCRFR2α的细胞体,但CRFR1表达的主要皮质座(cortical seat)在层4中,而sCRFR2α在层5中。CRFR2表达的主要部位(包括侧缩中隔(lateral septal)、中脑脊(midbrainraphe)、下丘脑腹内侧正中核和扁桃体中间核(medial amygdaloid nuclei))均缺乏着色的sCRFR2α细胞体,虽然感兴趣的后两个部位包埋有极少的标记膨体(labeled varicosity)研究,本发明人将其作为sCRFR2α-ir末端区域的代表。下丘脑的室旁核也含有中等密度的假定sCRFR2α-ir末端区域。
将抗血清与用作免疫原的低微摩尔浓度(≥30μM)sCRFR2α(113-143)肽预培育后阻断了对整个大脑的标记;与浓度高达3mM的CRFR1序列预计的相应肽竞争不干扰免疫标记。标记特异性的其它证据是观察到所有免疫定位在CRFR1和/或CRFR2缺失小鼠中均存留;应注意,预计产生各种现有受体敲除品系所用的靶向构建物可以省去sCRFR2α编码区(Smith等,1998;Timpl等,1998;Bale等,2000)。
为测定脑中是否存在sCRFR2α-样ir,开发了用抗-sCRFR2α-和[125I-Tyr113]sCRFR2α(113-143)抗体作为示踪剂的高特异性放射免疫测定。酸提取小鼠脑组织,用C18柱部分纯化,采用多剂量放射免疫测定进行检验。该组织提取物以剂量依赖性方式取代与抗-sCRFR结合的[125I-Tyr113]sCRFR2α(113-143)(图4G)。发现嗅球、下丘脑、皮质和中脑中表达水平最高,这些部位均与免疫组织化学研究测定到存在ir细胞和纤维相关(图4)。推定的可溶形式CRFR1(通过删除外显子5产生)包含不同的独特C-末端序列。放射性免疫测定中对应于该序列的蛋白质不取代[125I-Tyr113]sCRFR2α(113-143)。这些结果进一步证实啮齿类动物CNS中存在sCRFR2α蛋白。
采用竞争性取代与sCRFR2α结合的[125I-D Tyro]-astressin作放射性受体试验评估sCRFR2α与CRF家族配体的相互作用。COS M6细胞分泌的或细菌产生的可溶性蛋白以纳摩尔级亲和力与激动剂Ucn1和CRF以及拮抗剂astressin结合,而其对Ucn2和Ucn3的亲和力很低(表2)。
表2.抑制性结合常数,CRF配体与sCRFR2α蛋白结合的Ki(nM)
蛋白质 | CRF | rUcnl | mUcn2 | mUcn3 | Astressin |
哺乳动物sCRFR2α | 23 (14-39) | 6.6(3.5-12) | 113(68-190) | >200 | 6.7(3.6-12) |
细菌sCRFR2α | 14.8(9.2-24) | 5.8(2.5-13.3) | 116(85-158) | >200 | 10(7.9-12.5) |
CRF家族成员与从COS M6细胞培养液(哺乳动物sCRFR2α)或大肠杆菌(细菌sCRFR2α)纯化的sCRFR2α蛋白质结合。细节见方法。
为刻画sCRFR2α潜在的功能,本发明人研究了其对CRF家族配体信号转导的影响。通过EXV1基因的CRE萤光素酶活性检测到哺乳动物和细菌表达的sCRFR2α蛋白在用小鼠CRFR2α转染的HEK293T细胞中均能以剂量依赖方式抑制cAMP对Ucn1和CRF的反应(图5A)。由于尿皮质激素(urocortin)能活化MAPK信号转导(Brar等,2002),本发明人检测了sCRFR2α是否能在内源性表达CRFR1和CRFR2α的CATH.a细胞中抑制Ucn 1激活ERK1/2-p42,44。SCRFR2α在CATH.a细胞中能抑制Ucn1诱导的ERK磷酸化(图5B)。
虽然详细描述了本发明及其优点,应该知道可在本文中作出各种修改、替代和变化而不脱离附加的权利要求书所定义的本发明构思和范围。此外,本申请范围不应局限于说明书所述的具体实施方式或工艺、机制、生产、物质组成、工具、方法和步骤。因为本领域普通技术人员鉴于本发明内容不难知道本发明可以利用目前已有的或以后开发的工艺、机器、生产、物质的组成、方式、方法或步骤来执行与本文所述相应实施方式基本相同的功能或达到基本相同的结果。因此,附加的权利要求书的范围应包括这种过程、机器、生产、物质的组成、方式、方法或步骤。
参考文献
以下列出的参考文献纳入本文作为参考,其纳入程度补充、解释、提供了本文所用方法、技术和/或组合物的背景或指导了本文所用的方法、技术和/或组合物。
美国专利4,196,265
美国专利4,215,051
美国专利4,554,101
美国专利4,683,195
美国专利4,683,202
美国专利4,800,159
美国专利4,883,750
美国专利5,795,587
美国专利5,063,245
美国专利5,145,684
美国专利5,225,538
美国专利5,552,157
美国专利5,565,213
美国专利5,567,434
美国专利5,580,579
美国专利5,641,515
美国专利5,738,868
美国专利5,741,516
美国专利5,792,451
美国专利6,831,158
Allen和Choun,FEBS Lett.,223:42-46,1987.
Andresz等,Makromol.Chem,179:301,1978。
Avis,Remington′s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》),第18版,Gennaro(编),Mack Publishing Co.,Pa.,84:1545-1569,1990。
Baichwal和Sugden,刊于:Gene Transfer(《基因转移》),Kucherlapati(编),纽约,Plenum Press,117-148,1986。
Bale和Vale,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,44,525-557,2004。
Bale等,Nat.Genet.,24,410-414,2000。
Baud等,Genomics,26(2):334-344,1995。
Bellus,J.Macromol.Sci.Pure Appl.Chem.,A31(1):1355-1376,1994。
Benet等,刊于:Goodman & Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics(《古德曼和吉尔曼的治疗药理学基础》),Hardman等(编),McGraw-Hill,纽约,第1章,第9版,1996。
Berger等,Annu.Rev.Immunol.,17:657-700,1999。
Bittencourt等,J.Comp.Neurol.,415,285-312,1999。
Bittner等,Methods in Enzymol,153:516-544,1987。
Block,Remington′s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》),第18版,Gennaro(编),Mack Publishing Co.,Pa.,87:1609-1614,1990。
Brar等,刊于:Encyclopedia of Hormones & Related Cell Regulators(《激素和相关细胞调节剂的百科全书》),Henry(编),AN(Academic Press),3:13-325,2002。
Chalmers等,Trends Pharmacol.Sci.,17(4):166-172.1996。
Chandran等,Indian J.Exp.Biol.,35(8):801-809.,1997。
Chang等,Neuron.,11,1187-1195,1993。
Chen和Okayama,Mol.Cell Biol.,7(8):2745-2752,1987。
Chen等,Mol.Endocrinol.,19:441-458,2005。
Chen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:8967-8971,1993。
Colbere-Garapin等,J.Mol.Biol.,150:1-14,1981。
Coupar等,Gene,68:1-10,1988。
Couvreur等,FEBS Lett.,84(2):323-326,1977。
Couvreur等,J.Pharm.Sci.,69(2):199-202,1980。
Couvreur,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.,5(1):1-20,1988。
Dautzenberg等,J.Neuroendocrinol.,11(12):941-949,1999。
Delgado等,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.,9(3-4):249-304,1992。
Douglas等,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.,3(3):233-61,1987
Eason等,Transplantation,61(2):224-228,1996
Ettinger等,Cancer,41:1270,1978
Fechheimer等,Proc Natl.Acad.Sci.USA,84:8463-8467,1987。
Fraley等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:3348-3352,1979。
Freifelder,刊于:Physical Biochemistry Applications to Biochemistry andMolecular Biology(《生物化学和分子生物学的物理生物化学应用》),第2版,Wm.Freeman and Co.,纽约,1982。
Friedmann,Science,244:1275-1281,1989。
Gabizon和Papahadjopoulos,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85(18):6949-6953,1988。
英国申请2202328
Ghosh和Bachhawat,刊于:Liver Diseases,Targeted Diagnosis and Therapy UsingSpecific Receptors and Ligands(《肝病,利用特异性受体和配体的靶向诊断和治疗》),Wu等(编),Marcel Dekker,纽约,87-104,1991。
Goding,刊于:Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(《单克隆抗体:原理和实践》),第2版,Academic Press,奥兰多,佛罗里达,第60-61页,71-74,1986。
Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190,1985。
Graham和Van Der Eb,Virology,52:456-467,1973。
Grammatopoulos等,Mol.Endocrinol.,13:2189-2202,1999。
Graves等,Biochem.Biophys.Res.Commun.,187:1135-1143,1992。
Hamann等,J.Immunol.,155(4):1942-1950,1995。
Harlow和Lane,刊于:Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体:实验室手册》),冷泉港实验室,冷泉港,纽约,346-348,1988。
Harvey,Remington′s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》),第18版,Gennaro(编),Mack Publishing Co.,Pa.,35:711,1990。
Henry-Michelland等,Int J Pharm,35:121-7,1987。
Hermonat和Muzycska,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466-6470,1984。
Hess等,J.Adv.Enzyme Reg.,7:149,1968。
Hitzeman等,J.Biol.Chem.,255:2073,1980。
Holland等,Biochemistry,17:4900,1978。
Horwich等,J.Virol.,64:642-650,1990。
Hsu和Hsueh,Nat.Med.,7605-611,2001。
Hwang等,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.,15(3):243-284,1998。
Innis等,刊于:PCR Protocols.A guide to Methods and Application(《PCR方案:方法与应用指南》),Academic Press,Inc.,圣迭哥,1990。
Jacobson等,J.Acquir.Immune.Defic.Syndr.,21(1):S34-41,1999。
Ji等,Biochem.Biophys.Res.Commun.,247:414-419,1998。
Jones,Genetics,85:12,1977。
Kehne和Lombaert,Curr.Drug Targets CNS Neurol.Disord.,1(5):467-493,2002。
Kemeny等,Cancer,71:1964,1993。
Kenakin,Life Sci.,43(14):1095-1101,1988。
Khan等,Biochem.Biophys.Res.Commun.,190:888-894,1993。
Kingsman等,Gene,7:141,1979。
Kishimoto等,Proc Natl.Acad.Sci.USA,92:1108-1112,1995。
Klein等,Nature,327:70-73,1987。
Koob和Heinrichs,Brain Res.,848:141-152,1999。
Kostich等,Mol.Endocrinol.,12:1077-1085,1998。
Kwoh等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1173,1989。
Kyte和Doolittle,J.Mol.Biol.,157(1):105-132,1982。
Lasic,Trends Biotechnol.,16(7):307-321,1998。
Lewis等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98:570-7575,2001。
Lin等,Science,282(5390):943-946,1998。
Liu等,J.Biol.Chem.,269:29220-29226,1994。
Lovenberg等,Endocrinology,136:4139-4142,1995。
Lovenberg等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:836-840,1995。
Lowy等,Cell,22:817-823,1980。
Luer和Hatton,刊于:The Annals of Pharmacotherapy(《药物疗法年报》),27:912,1993。
Malherbe等,Brain Res.Mol.Brain Res.,67:201-210,1999。
Mannstadt等,Am.J.Physiol.,277(5部分2):F665-675,1999。
Marchese等,Trends Pharmacol Sci.,20(9):370-375.,1999。
Margalit,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.,12(2-3):233-261,1995。
Mathiowitz等,Nature,386(6623):410-414,1997。
Meij等,Mol.Cell Biochem.,157(1-2):31-38,1996。
Morishita等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:8474,1993。
Muglia等,Nature,373:427-432,1995。
Mulligan等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072,1981。
Murphy等,J.Virol.,74(17):7745-7754,2000。
Nicolas和Rubinstein,刊于:Vectors:A survey of molecular cloning vectorsand their uses(《载体:分子克隆载体及其应用综述》),Rodriguez和Denhardt编,Stoneham:Butterworth,第494-513页,1988。
Nicolau和Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190,1982。
O’Hare等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:1527,1981。
Owens等,J.Pharmacol.Exp.Ther.,258(1):349-356,1991。
Palczewski等,Science,289(5480):739-745,2000。
PCT申请WO88/10315
PCT申请PCT/US87/00880
PCT申请PCT/US89/01025
PCT申请WO00/23114
PCT申请WO92/16655
Perrin和Vale,Ann.N.Y.Acad.Sci.,885:312-328,1999。
Perrin等,J.Biol.Chem.,276:31528-31534,2001。
Perrin等,J.Biol.Chem.,278:15595-15600,2003。
Perrin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:2969-2973,1995。
Pinto-alphandary等,J.Drug Target,3(2):167-169,1995。
Pisarchik和Slominski,Eur.J.Biochem.,2′71:2821-2830,2004。
Potter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:7161-7165,1984。
Quintanar-Guerrero等,Pharm.Res.,15(7):1056-1062,1998。
Rekasi等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,.97:0561-10566,2000。
Remington’s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》),第15版,第1035-1038页和1570-1580页,Mack Publishing Company,Easton,PA,1980。
Reyes等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,.98:2843-2848,2001。
Ridgeway,刊于:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and theiruses(《载体:分子克隆载体及其应用综述》),Stoneham:Butterworth,第467-492页,1988。
Rippe等,Mol.Cell Biol.,10:689-695,1990。
Rivier和Vale,Nature,305:325-327,1983。
Sambrook等,刊于:Molecular cloning:a laboratory manual(分子克隆:实验室手册),第2版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989。
Schwarz等,J.Biol.Chem.,275:32174-32181,2000。
Seck等,J.Biol.Chem.,278:23085-23093,2003。
Shaw,Cancer,72(11):3416,1993。
Smith等,Neuron.,20:1093-1102,1998。
Stacey等,Trends Biochem.Sci.,25(6):284-289,2000。
Stenzel等,Mol.Endocrinol.,9:637-645,1995。
Stinchcomb等,Nature,282(5734):39-43,1979。
Szybalska等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:2026,1962。
Takakura,Nippon Rinsho.,56(3):691-695,1998。
Temin,刊于:Gene Transfer(《基因转移》),Kucherlapati(编),纽约,PlenumPress,149-188,1986。
Timpl等,Nat.Genet.,19:162-166,1998。
Tschemper等,Gene,10:157,1980。
Tur-Kaspa等,Mol.Cell Biol.,6:716-718,1986。
Vale等,Science,213:1394-1397,1981。
Valerio等,Neuroreport,12:2711-2715,2001。
van Dullemen等,Gastroenterology,109,129-35,1995。
VanPett等,J.Comp.Neurol.,428:191-212,2000。
Vaughan等,Methods Enzymol.,168:588-617,1989。
Vaughan等,Nature,378:287-292,1995。
Vita等,FEBS Lett.,335:1-5,1993。
Walker等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:392-396,1992。
Wigler等,Cell,11(1):223-232,1977。
Wigler等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77(6):3567-3570,1980。
Wilson等,Br.J. Pharmacol.,125(7):1387-1392,1998。
Wilson等,刊于:G-protein-coupled receptors(《G-蛋白偶联受体》),CRCpress,Boca Raton,97-116,1999。
Wu和Wu,Adv.Drug Delivery Rev.,12:159-167,1993。
Wu和Wu,Biochemistry,27:887-892,1988。
Wu和Wu,J.Biol.Chem.,262:4429-4432,1987。
Yaida等,Regul.Pept.,59:193,1995。
Yan和Wold,Biochemistry,23(16):3759-3765.1984。
Yang和Russell,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:4144-4148,1990。
You等,Biol.Reprod.,62:108-116,2000。
Zambaux等,J.Control Release,50(1-3):31-40,1998。
Zhu等,Brain Res.Mol.Brain Res.,73:3-103,1999。
Zimm等,Cancer Research,44:1698,1984。
zur Muhlen et al.,Eur.J.Pharm.Biopharm.,45(2):149-155,1998。
Claims (19)
1.一种分离的、可溶性2型促肾上腺皮质素释放因子α(sCRFR2α),所述sCRFRα是SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的sCRFR2α,其特征在于,所述分离的sCRFR2α还包含亲和标签、标记物、放射性核素、酶、荧光标记、化学发光标记、免疫球蛋白结构域或它们的组合。
3.如权利要求2所述的sCRFR2α,其特征在于,所述分离的sCRFR2α还包含亲和标签。
4.如权利要求3所述的sCRFR2α,其特征在于,所述分离的sCRFR2α还包含荧光标记。
5.如权利要求3所述的sCRFR2α,其特征在于,所述分离的sCRFR2α还包含免疫球蛋白结构域。
6.如权利要求5所述的sCRFR2α,其特征在于,所述sCRFR2α包含免疫球蛋白Fc结构域。
7.如权利要求1所述的sCRFR2α,其特征在于,还包含前导序列。
8.如权利要求1所述的sCRFR2α,其特征在于,所述sCRFR2α与聚合物偶联,所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
9.一种编码权利要求1所述的sCRFR2α的分离核酸。
10.如权利要求9所述的核酸,其特征在于,还包含与编码所述sCRFR2α的核酸操作性偶联的启动子。
11.如权利要求10所述的核酸,其特征在于,所述核酸是一种表达盒。
12.如权利要求11所述的核酸,其特征在于,所述表达盒包含在表达载体中。
13.如权利要求12所述的核酸,其特征在于,所述表达盒是线形核酸、质粒表达载体或病毒表达载体。
14.如权利要求12所述的核酸,其特征在于,所述表达载体与递送载体操作性偶联。
15.如权利要求14所述的核酸,其特征在于,所述递送载体是脂质体、多肽、聚阳离子、脂质、细菌或病毒。
16.如权利要求1-8任一所述的sCRFR2α的用途,其特征在于,用于制备治疗II型糖尿病、胰岛素敏感、焦虑相关疾病;情感障碍;双相性精神障碍;创伤后精神障碍;炎性疾病;化学品依赖和成瘾;胃肠道疾病;或皮肤疾病的药物。
17.如权利要求16所述的用途,其特征在于,所述药物用于治疗II型糖尿病。
18.如权利要求16所述的用途,其特征在于,所述焦虑相关疾病是广泛性焦虑症,或者所述情感障碍是抑郁症。
19.如权利要求16所述的用途,其特征在于,所述胃肠道疾病是肠应激综合征。
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---|---|
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Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007090087A2 (en) * | 2006-01-27 | 2007-08-09 | Research Development Foundation | Use of corticotropin releasing factor receptor-2 inhibitors for treating insulin-related diseases |
US20100197586A1 (en) * | 2007-09-11 | 2010-08-05 | Dorian Bevec | Use of secretin and optionally urodilatin as therapeutic agents |
WO2009046874A1 (en) * | 2007-09-11 | 2009-04-16 | Mondobiotech Laboratories Ag | Therapeutic combination of trh-potentiating peptide and stresscopin |
WO2009039979A1 (en) * | 2007-09-11 | 2009-04-02 | Mondobiotech Laboratories Ag | Use of the peptide pro-gly-thr-cys-glu-ile-cys-ala-tyr-ala-ala-cys-thr-gly-cys as a therapeutic agent |
KR20100056515A (ko) * | 2007-09-11 | 2010-05-27 | 몬도바이오테크 래보래토리즈 아게 | 치료제로서의 펩티드의 용도 |
CA2771769C (en) | 2009-08-28 | 2019-10-29 | Research Development Foundation | Urocortin 2 analogs and uses thereof |
WO2011062935A1 (en) * | 2009-11-17 | 2011-05-26 | The Regents Of The University Of California | Compositions and assay systems for intracellular processes |
US9981017B2 (en) | 2010-04-02 | 2018-05-29 | Hanmi Science Co., Ltd. | Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment |
AR081066A1 (es) * | 2010-04-02 | 2012-06-06 | Hanmi Holdings Co Ltd | Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina |
WO2012116203A1 (en) * | 2011-02-23 | 2012-08-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Water soluble membrane proteins and methods for the preparation and use thereof |
DK2814513T3 (en) * | 2012-02-14 | 2018-02-26 | Univ California | Systemic administration and regulated expression of paracrine for cardiovascular disease and other conditions |
JOP20170153A1 (ar) | 2016-07-15 | 2019-01-30 | Lilly Co Eli | نظائر urocortin-2 جديدة معدلة بحمض دهني لعلاج داء السكري وأمراض الكلى المزمنة |
EP3568411B1 (en) * | 2017-01-13 | 2024-03-06 | Pietro P. Sanna | Methods and compositions for treating hpa hyperactivity |
US10995361B2 (en) | 2017-01-23 | 2021-05-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Multiplexed signal amplified FISH via splinted ligation amplification and sequencing |
WO2018157048A1 (en) | 2017-02-24 | 2018-08-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for examining podocyte foot processes in human renal samples using conventional optical microscopy |
US11180804B2 (en) | 2017-07-25 | 2021-11-23 | Massachusetts Institute Of Technology | In situ ATAC sequencing |
WO2019046699A1 (en) * | 2017-09-01 | 2019-03-07 | Massachustetts Institute Of Technology | NON-DETERGENT GPCR BIOELECTRONIC INTERFACES COUPLED TO THE 2D S-PROTEIN NETWORK, DEVICES AND METHODS OF USE THEREOF |
US11173992B2 (en) | 2017-12-28 | 2021-11-16 | Legionarus, Llc | Buoyancy garment |
US11873374B2 (en) | 2018-02-06 | 2024-01-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Swellable and structurally homogenous hydrogels and methods of use thereof |
US11471112B2 (en) | 2018-11-21 | 2022-10-18 | Legionarius, Llc | Mobile application for wearable device |
USD905935S1 (en) | 2019-02-20 | 2020-12-29 | Legionarius, Llc | Shirt with back pocket |
US11802822B2 (en) | 2019-12-05 | 2023-10-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Multiplexed expansion (MultiExM) pathology |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4196265A (en) | 1977-06-15 | 1980-04-01 | The Wistar Institute | Method of producing antibodies |
US4215051A (en) | 1979-08-29 | 1980-07-29 | Standard Oil Company (Indiana) | Formation, purification and recovery of phthalic anhydride |
US4554101A (en) | 1981-01-09 | 1985-11-19 | New York Blood Center, Inc. | Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity |
US4883750A (en) | 1984-12-13 | 1989-11-28 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
US5225538A (en) | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
US5549910A (en) | 1989-03-31 | 1996-08-27 | The Regents Of The University Of California | Preparation of liposome and lipid complex compositions |
US5063245A (en) | 1990-03-28 | 1991-11-05 | Nova Pharmaceutical Corporation | Corticotropin-releasing factor antagonism compounds |
JP3218637B2 (ja) | 1990-07-26 | 2001-10-15 | 大正製薬株式会社 | 安定なリポソーム水懸濁液 |
JP2958076B2 (ja) | 1990-08-27 | 1999-10-06 | 株式会社ビタミン研究所 | 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法 |
US5145684A (en) | 1991-01-25 | 1992-09-08 | Sterling Drug Inc. | Surface modified drug nanoparticles |
US5792451A (en) | 1994-03-02 | 1998-08-11 | Emisphere Technologies, Inc. | Oral drug delivery compositions and methods |
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