JP2001509373A - 単純ヘルペスウイルス侵入メディエーターのためのリガンドおよびその使用方法 - Google Patents
単純ヘルペスウイルス侵入メディエーターのためのリガンドおよびその使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
ヘルペスウイルス侵入メディエーターであるHVEMのための新規なリガンド(p30)を提供する。p30は免疫応答をモジュレートするのに有効であり、ヘルペスウイルスによる感染を抑制するのにも有用である。また、本発明のp30を利用した、リンパ系細胞疾患を有する被験体またはヘルペスウイルスに感染しているか感染が疑われる被験体の治療方法も提供する。
Description
【０００１】 〔発明の分野〕 本発明は一般的には免疫応答およびウイルス感染を調節するために有用な化合
物および方法に関し、さらに特定すると、単純ヘルペスウイルスによる感染を抑
制するために有用なポリペプチドに関する。
物および方法に関し、さらに特定すると、単純ヘルペスウイルスによる感染を抑
制するために有用なポリペプチドに関する。
【０００２】 〔発明の背景〕 単純ヘルペスウイルス(HSV)の１および２型は重症度が良性から重篤までの範 囲にわたる再発性感染症の原因となる。HSVはニューロン内での潜伏から出現し て、受容能力がある(competent)細胞免疫系の存在下で皮膚またはその他の組織 に感染する。HSVのD糖タンパク質(gD)はビリオンエンベロープ中に局在する膜貫
通タンパク質であるが、これが細胞受容体に結合することによって感染が開始す
る［Spearら、(1993) Viral Fusion Mechanisms.Bentz編.CRC発行,Boca Raton］
。最近、感染のためにHSVが利用する細胞タンパク質が同定され、HSV侵入メディ
エーター(HSV entry mediator)(HVEM)と命名された［Montgomeryら、(1996)Cell
87:427］。HVEMは、腫瘍壊死因子(TNF)関連サイトカインのための受容体と有意
な相同性を示す、システインに富む細胞外ドメインを有する膜貫通１型タンパク
質である［Smithら(1994) Cell 76:959；Wareら(1995) Pathways of Cytolysis.
Eds.Griffiths and Tschopp.Springer-Verlag,Basel］。TNFスーパーファミリー
メンバーの多くが効果的な炎症応答および免疫応答を起動させるのに必要な各種
の細胞応答を開始させる。
通タンパク質であるが、これが細胞受容体に結合することによって感染が開始す
る［Spearら、(1993) Viral Fusion Mechanisms.Bentz編.CRC発行,Boca Raton］
。最近、感染のためにHSVが利用する細胞タンパク質が同定され、HSV侵入メディ
エーター(HSV entry mediator)(HVEM)と命名された［Montgomeryら、(1996)Cell
87:427］。HVEMは、腫瘍壊死因子(TNF)関連サイトカインのための受容体と有意
な相同性を示す、システインに富む細胞外ドメインを有する膜貫通１型タンパク
質である［Smithら(1994) Cell 76:959；Wareら(1995) Pathways of Cytolysis.
Eds.Griffiths and Tschopp.Springer-Verlag,Basel］。TNFスーパーファミリー
メンバーの多くが効果的な炎症応答および免疫応答を起動させるのに必要な各種
の細胞応答を開始させる。
【０００３】 TNFは２型膜貫通タンパク質であり［Pennicaら(1984)Nature 312:724］、タン
パク質分解されて分泌タンパク質を形成し［Blackら(1997)Nature 385:729］、 一方、LTαは膜貫通ドメインを持たず［Grayら(1984)Nature 312:721］、もっぱ
らホモ三量体として分泌される（この形態はTNFβとしても知られていた）。表 面タンパク質として発現される場合、LTαはLTβと命名された［Browningら(199
3)Cell 72:847］33kDaのタンパク質と会合しており［Androlewiczら(1992)J.Bio
l.Chem.267:2542］、またα1β2およびα2β1のサブユニット比率のヘテロ三量 体として２型膜貫通糖タンパク質でもある［Androlewiczら、上記引用；Brownin
g ら(1996)J.Biol.Chem.271:8618］。LTαおよびTNFは両者ともに２つの受容体 、すなわち55〜60 kDa TNF受容体(TNFR60；CD120aまたは１型)［Schallら(1990)
Cell 61:361；Loetscherら(1990)Cell 61:351］および75〜80 kDa TNFR(TNFR80 ；２型またはCD120b)［Smithら(1990)Science 248:1019］を介して結合し、シグ
ナリングする。これに対して、表面LTα1β2複合体は、LTαにもTNFにも結合し ないLTβ受容体(LTβR)によって特異的に認識される［Croweら(1994)Science 26
4:707］が、他方、両型のTNFRはLTα2β1ヘテロ三量体に結合する［Crowら(1994
)Science 264:707；Browningら(1995) J. Immunol. 154:33］。
パク質分解されて分泌タンパク質を形成し［Blackら(1997)Nature 385:729］、 一方、LTαは膜貫通ドメインを持たず［Grayら(1984)Nature 312:721］、もっぱ
らホモ三量体として分泌される（この形態はTNFβとしても知られていた）。表 面タンパク質として発現される場合、LTαはLTβと命名された［Browningら(199
3)Cell 72:847］33kDaのタンパク質と会合しており［Androlewiczら(1992)J.Bio
l.Chem.267:2542］、またα1β2およびα2β1のサブユニット比率のヘテロ三量 体として２型膜貫通糖タンパク質でもある［Androlewiczら、上記引用；Brownin
g ら(1996)J.Biol.Chem.271:8618］。LTαおよびTNFは両者ともに２つの受容体 、すなわち55〜60 kDa TNF受容体(TNFR60；CD120aまたは１型)［Schallら(1990)
Cell 61:361；Loetscherら(1990)Cell 61:351］および75〜80 kDa TNFR(TNFR80 ；２型またはCD120b)［Smithら(1990)Science 248:1019］を介して結合し、シグ
ナリングする。これに対して、表面LTα1β2複合体は、LTαにもTNFにも結合し ないLTβ受容体(LTβR)によって特異的に認識される［Croweら(1994)Science 26
4:707］が、他方、両型のTNFRはLTα2β1ヘテロ三量体に結合する［Crowら(1994
)Science 264:707；Browningら(1995) J. Immunol. 154:33］。
【０００４】 マウスにおけるLTα遺伝子およびLTβ遺伝子の遺伝子欠失から、リンパ節およ
びパイエル板の発生におけるこれら２つの遺伝子の役割が明らかになった［De T
ogniら(1994) Science264:703；Banksら(1995)J.Immunol.155:1685］が、これら
はTNFおよびTNFR60とともに、胚中心の形成および成体における免疫応答の間の 免疫グロブリンアイソタイプのスイッチング（例えばIgAの生成）を制御する重 要なサイトカインでもある［Matsumotoら(1996)Science 271:1289；Mariathasan
ら(1995)J.Inflammation 45:72］。大部分の研究がこれらの機能を制御する重要
なサイトカイン−受容体系としてLTα1β2/LTβRに注目している［Croweら(1994
)Science 264:707；Koniら(1997)Immunity 5:491；Ettingerら(1996) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 93:13102；Rennertら(1996)J.Exp.Med.184:1999］。
びパイエル板の発生におけるこれら２つの遺伝子の役割が明らかになった［De T
ogniら(1994) Science264:703；Banksら(1995)J.Immunol.155:1685］が、これら
はTNFおよびTNFR60とともに、胚中心の形成および成体における免疫応答の間の 免疫グロブリンアイソタイプのスイッチング（例えばIgAの生成）を制御する重 要なサイトカインでもある［Matsumotoら(1996)Science 271:1289；Mariathasan
ら(1995)J.Inflammation 45:72］。大部分の研究がこれらの機能を制御する重要
なサイトカイン−受容体系としてLTα1β2/LTβRに注目している［Croweら(1994
)Science 264:707；Koniら(1997)Immunity 5:491；Ettingerら(1996) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 93:13102；Rennertら(1996)J.Exp.Med.184:1999］。
【０００５】 〔発明の概要〕 本発明は、以前にはHSV gDに結合することのみが知られていた、HVEMのための
リガンドとして機能する内在性ポリペプチドの同定に基づいている。このリガン
ド（p30と称する）、ならびにp30をコードする核酸配列およびp30に結合する抗 体を提供する。本発明はまた、HSV感染をモジュレートする化合物の同定方法、 およびリンパ系細胞の応答をモジュレートする方法も包含する。本発明の方法は
例えば自己免疫疾患、悪性リンパ腫およびHSV感染患者の治療に有用である。１ つの実施形態において、本発明はHVEM結合物質媒介型細胞応答に作用する化合物
を同定するためのアッセイを特徴とする。LTbR-p30媒介型細胞応答に作用する化
合物を同定するためのアッセイもまた本発明の範囲内である。
リガンドとして機能する内在性ポリペプチドの同定に基づいている。このリガン
ド（p30と称する）、ならびにp30をコードする核酸配列およびp30に結合する抗 体を提供する。本発明はまた、HSV感染をモジュレートする化合物の同定方法、 およびリンパ系細胞の応答をモジュレートする方法も包含する。本発明の方法は
例えば自己免疫疾患、悪性リンパ腫およびHSV感染患者の治療に有用である。１ つの実施形態において、本発明はHVEM結合物質媒介型細胞応答に作用する化合物
を同定するためのアッセイを特徴とする。LTbR-p30媒介型細胞応答に作用する化
合物を同定するためのアッセイもまた本発明の範囲内である。
【０００６】 特に定義しない限り、本明細書中で使用するすべての技術的および科学的用語
は本発明が属する技術分野の通常の技術者が普通に理解している意味と同一の意
味を有する。本発明の実施または試験においては、本明細書に記載されているも
のと同様または等価な方法および物質を使用することができるが、好適な方法お
よび物質を以下に記載する。本明細書中で言及するすべての刊行物、特許出願、
特許およびその他の引用文献はその全文を参照により本明細書に組み入れる。矛
盾する場合は、定義を含めて本出願のものが優先する。さらに、本明細書に記載
する物質、方法および実施例は単に説明のためのものであって、限定しようとす
るものではない。
は本発明が属する技術分野の通常の技術者が普通に理解している意味と同一の意
味を有する。本発明の実施または試験においては、本明細書に記載されているも
のと同様または等価な方法および物質を使用することができるが、好適な方法お
よび物質を以下に記載する。本明細書中で言及するすべての刊行物、特許出願、
特許およびその他の引用文献はその全文を参照により本明細書に組み入れる。矛
盾する場合は、定義を含めて本出願のものが優先する。さらに、本明細書に記載
する物質、方法および実施例は単に説明のためのものであって、限定しようとす
るものではない。
【０００７】 本発明のその他の特徴および利点、例えば各種のヒトの疾病の治療は、以下の
詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかになろう。
詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかになろう。
【０００８】 〔詳細な説明〕 TNF受容体(TNFR)に関連するポリペプチドであるHVEMの細胞外ドメインを含有 する融合タンパク質の結合の抑制が関与する実験から、悪性および正常ヒトT細 胞の両方がHVEMのための細胞表面リガンドを発現することが示された。競合抑制
実験から、このHVEMリガンドはLTαβヘテロ三量体およびLTαに共通する特性を
有するが、LTα1β2およびTNFとは異なる特徴も有することが示された。したが って、LTα2β1上のHVEM結合部位はTNFR60と同一でない点に注意は必要であるが
、LTα2β1はHVEMによって認識される推定表面リガンドとなり得る。あるいは、
HVEMは新規なリガンドを認識するかも知れない。これらの可能性を見極めるため
に、生化学的手法を使用した。
実験から、このHVEMリガンドはLTαβヘテロ三量体およびLTαに共通する特性を
有するが、LTα1β2およびTNFとは異なる特徴も有することが示された。したが って、LTα2β1上のHVEM結合部位はTNFR60と同一でない点に注意は必要であるが
、LTα2β1はHVEMによって認識される推定表面リガンドとなり得る。あるいは、
HVEMは新規なリガンドを認識するかも知れない。これらの可能性を見極めるため
に、生化学的手法を使用した。
【０００９】 免疫沈降およびドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SD
S-PAGE)による研究から、LTβおよびLTαの両方と抗原性が異なる、T細胞の表面
のHVEMのための新規な30 kDaポリペプチドリガンド(p30)の存在が証明された。 アフィニティクロマトグラフィー精製および二次元電気泳動により、分子量が30
kDaでありpIが約7〜8.5である点で、p30がLTβおよびLTαとは物理的にも異な ることが示された（図4C）。さらに、これらの研究から、p30もLTβRによって認
識されるがTNFRでは認識されないことが示された。
S-PAGE)による研究から、LTβおよびLTαの両方と抗原性が異なる、T細胞の表面
のHVEMのための新規な30 kDaポリペプチドリガンド(p30)の存在が証明された。 アフィニティクロマトグラフィー精製および二次元電気泳動により、分子量が30
kDaでありpIが約7〜8.5である点で、p30がLTβおよびLTαとは物理的にも異な ることが示された（図4C）。さらに、これらの研究から、p30もLTβRによって認
識されるがTNFRでは認識されないことが示された。
【００１０】 結合抑制実験では、可溶性gD-1（HSV-1由来のgD）およびgD-1の突然変異体で あるgD-1(△290-299t)がHVEMには結合するがLTβRまたはTNFR60には結合しない ことが証明された。この結果は、HVEMがTNFR60およびLTβRによって認識される リガンドに結合しても、gD-1はHVEMへの結合について、特異的に同時進化(co-ev
olved)してきたことを示唆している。さらに、この知見は、gD-1がリンホトキシ
ンの膜固定型ビロカイン(virokine)であり、そしてHSVの侵入または感染細胞か らの放出の際にHVEMシグナリング活性をモジュレートするらしいことを意味して
いる。
olved)してきたことを示唆している。さらに、この知見は、gD-1がリンホトキシ
ンの膜固定型ビロカイン(virokine)であり、そしてHSVの侵入または感染細胞か らの放出の際にHVEMシグナリング活性をモジュレートするらしいことを意味して
いる。
【００１１】 in vitro細胞培養の研究から、抗HVEM抗体が処女T細胞および記憶T細胞の両方
の増殖を増大させることが示された。同様の実験から、HVEMを介するシグナリン
グはB細胞に活性化刺激を与えること、およびTNFRを介した均衡する負の刺激を 伴わない正の刺激はこのp30 HVEMリガンドの独特の特性であるらしいことが示さ
れた。これらの結果はHVEMリガンドの生理学的機能はおそらくTNFおよびLTα1β
2とは異なるらしいことを意味するものである。HVEMのための新規なp30リガンド
の同定から、このリガンドがこれまではLTαまたはLTβによるものとされた生理
学的応答の原因であるかも知れないという可能性が出てくる。ここに示したこの
発見はLT/TNFサイトカイン系およびヘルペスウイルスのさらに深い理解をもたら
し、これによって疾病の経過においてこれらのサイトカインをコントロールする
ための新しい手法が示唆される。
の増殖を増大させることが示された。同様の実験から、HVEMを介するシグナリン
グはB細胞に活性化刺激を与えること、およびTNFRを介した均衡する負の刺激を 伴わない正の刺激はこのp30 HVEMリガンドの独特の特性であるらしいことが示さ
れた。これらの結果はHVEMリガンドの生理学的機能はおそらくTNFおよびLTα1β
2とは異なるらしいことを意味するものである。HVEMのための新規なp30リガンド
の同定から、このリガンドがこれまではLTαまたはLTβによるものとされた生理
学的応答の原因であるかも知れないという可能性が出てくる。ここに示したこの
発見はLT/TNFサイトカイン系およびヘルペスウイルスのさらに深い理解をもたら
し、これによって疾病の経過においてこれらのサイトカインをコントロールする
ための新しい手法が示唆される。
【００１２】 同時に、これらの結果はHVEMまたはLTβRを含有するFc融合タンパク質がLTα および30 kDa HVEMリガンド、p30の作用をモジュレートするであろうことを意味
している。同様に、モノクローナル抗体またはペプチドもしくは小さな有機化合
物などのリガンド受容体複合体の特異的インヒビターを同定するために、融合タ
ンパク質HVEMを使用することができるであろう。p30もしくはLTαとHVEMとの相 互作用、またはp30とLTβRとの相互作用のインヒビターを使用して、TおよびBリ
ンパ腫もしくは白血病を含む、望ましくないリンパ球の増殖が発生する疾病、ま
たはリウマチ様関節炎、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテ
マトーデスもしくは重症筋無力症などの自己免疫疾患をモジュレートすることが
できるかも知れない。
している。同様に、モノクローナル抗体またはペプチドもしくは小さな有機化合
物などのリガンド受容体複合体の特異的インヒビターを同定するために、融合タ
ンパク質HVEMを使用することができるであろう。p30もしくはLTαとHVEMとの相 互作用、またはp30とLTβRとの相互作用のインヒビターを使用して、TおよびBリ
ンパ腫もしくは白血病を含む、望ましくないリンパ球の増殖が発生する疾病、ま
たはリウマチ様関節炎、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテ
マトーデスもしくは重症筋無力症などの自己免疫疾患をモジュレートすることが
できるかも知れない。
【００１３】 同様に、LTα、p30およびHVEMシグナリングがエフェクター分子として含まれ る免疫反応を抑制するために、ヘルペスウイルス gD-1を使用することができる と考えられる。LTαまたは（予測される細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの
欠失によって作製した）可溶性形態の30 kDa HVEMリガンドはヘルペスウイルス 感染のインヒビターとして機能し、細胞標的に侵入するヘルペスウイルスの能力
をブロックすることによって回復(recrudesce)され得る。
欠失によって作製した）可溶性形態の30 kDa HVEMリガンドはヘルペスウイルス 感染のインヒビターとして機能し、細胞標的に侵入するヘルペスウイルスの能力
をブロックすることによって回復(recrudesce)され得る。
【００１４】 TNFR類と同様に、HVEMはLTαおよびこれと異なる30 kDaの膜結合リガンドであ
るp30に結合する、という二重のリガンド特異性を有する。LTαのTyr108Phe突然
変異はTNFR60およびTNFR80についてと同様に、HVEMとの結合性を破壊する。TNFR
60がHVEMの表面30 kDa形態への結合を阻止する能力がないということは、表面LT
α2β1がHVEMリガンドではないことを意味する。
るp30に結合する、という二重のリガンド特異性を有する。LTαのTyr108Phe突然
変異はTNFR60およびTNFR80についてと同様に、HVEMとの結合性を破壊する。TNFR
60がHVEMの表面30 kDa形態への結合を阻止する能力がないということは、表面LT
α2β1がHVEMリガンドではないことを意味する。
【００１５】 さらに、p30はLTαとは異なる。なぜならば、これは免疫原性において異なり 、そしてもっぱら分泌されるLTαとは違って、細胞に結合して残留するからであ
る。したがって、HVEM結合性タンパク質(p30)はTNFに関連するその他のタンパク
質と同様のII型膜貫通コンフィギュレーションとして配置されている膜貫通ドメ
インを形成する、一連の疎水性残基を含有すると予測される。このことは、p30 がその他の方法（例えば脂質改変）によっても改変(modify)されて細胞表面に付
着することができるようにする可能性を排除するものではない。さらに、このタ
ンパク質はLTαおよびLTβならびにこのスーパーファミリーを定義付ける関連サ
イトカインと配列相同な領域を共有し、そして約150〜160残基のC-末端細胞外ド
メインを含有するはずである。
る。したがって、HVEM結合性タンパク質(p30)はTNFに関連するその他のタンパク
質と同様のII型膜貫通コンフィギュレーションとして配置されている膜貫通ドメ
インを形成する、一連の疎水性残基を含有すると予測される。このことは、p30 がその他の方法（例えば脂質改変）によっても改変(modify)されて細胞表面に付
着することができるようにする可能性を排除するものではない。さらに、このタ
ンパク質はLTαおよびLTβならびにこのスーパーファミリーを定義付ける関連サ
イトカインと配列相同な領域を共有し、そして約150〜160残基のC-末端細胞外ド
メインを含有するはずである。
【００１６】 発明者らの知見は、HVEMがLTαに対する特異的受容体であり、TNF結合性受容 体であるTNFR60およびTNFR80と明確に識別される特性を有することをも意味して
いる。この特性によって、HVEM融合タンパク質または類似のタンパク質がTNFま たはLTα1β2機能を抑制することなくLTαと特異的に拮抗することが可能になる
。
いる。この特性によって、HVEM融合タンパク質または類似のタンパク質がTNFま たはLTα1β2機能を抑制することなくLTαと特異的に拮抗することが可能になる
。
【００１７】 本発明は実質的に純粋なp30ポリペプチドを提供する。p30ポリペプチドは還元
SDS-PAGEによって決定した場合の予測分子量が30 kDaであり、pIが約7〜8.5の範
囲であるという特徴がある（図4C）。p30は10未満、好ましくは8未満、より好ま
しくは6未満（例えば3、4または5）の異性体として存在する。このポリペプチド
は細胞に結合しており（すなわち分泌されない）、そしてその細胞表面形態でHV
EMおよびLTβRに結合する。
SDS-PAGEによって決定した場合の予測分子量が30 kDaであり、pIが約7〜8.5の範
囲であるという特徴がある（図4C）。p30は10未満、好ましくは8未満、より好ま
しくは6未満（例えば3、4または5）の異性体として存在する。このポリペプチド
は細胞に結合しており（すなわち分泌されない）、そしてその細胞表面形態でHV
EMおよびLTβRに結合する。
【００１８】 本明細書で使用する用語「実質的に純粋」とは、天然状態では会合するその他
のタンパク質、脂質、炭水化物またはその他の物質を実質的に含まないp30ポリ ペプチドをいう。当業者ならばタンパク質精製の標準的技法を使用してp30を精 製することができる［Protein Purification,Principles and Practice,第2版(1
987)Scopes,Springer Verlag,N.Y.］。実質的に純粋なポリペプチドであれば、 還元SDS-PAGEゲル上に約30 kDaの一本の主要バンドを生成する。
のタンパク質、脂質、炭水化物またはその他の物質を実質的に含まないp30ポリ ペプチドをいう。当業者ならばタンパク質精製の標準的技法を使用してp30を精 製することができる［Protein Purification,Principles and Practice,第2版(1
987)Scopes,Springer Verlag,N.Y.］。実質的に純粋なポリペプチドであれば、 還元SDS-PAGEゲル上に約30 kDaの一本の主要バンドを生成する。
【００１９】 本発明には機能性ポリペプチドであるp30、およびその機能性フラグメントが 含まれる。本明細書で使用する用語「機能性ポリペプチド」とは、ある定義され
た機能的アッセイによって同定され、かつ細胞内の特定の生物的、形態的または
表現型の改変に関係する、生物学的機能または活性を有するポリペプチドをいう
。p30ポリペプチドの「機能性フラグメント」にはp30の活性、例えばHVEMもしく
はLTβRに結合することによるかまたはHSVのHVEMへの結合を抑制することによる
細胞応答のモジュレート、を保持している、p30のフラグメントが含まれる。p30
の生物学的活性を有するさらに小さなペプチドが本発明に含まれる。当業者であ
れば標準的な方法、例えばウイルスプラーク減少アッセイまたはサイトカイン生
成アッセイを含む細胞活性化アッセイによって、p30の機能的活性をアッセイす ることができる。
た機能的アッセイによって同定され、かつ細胞内の特定の生物的、形態的または
表現型の改変に関係する、生物学的機能または活性を有するポリペプチドをいう
。p30ポリペプチドの「機能性フラグメント」にはp30の活性、例えばHVEMもしく
はLTβRに結合することによるかまたはHSVのHVEMへの結合を抑制することによる
細胞応答のモジュレート、を保持している、p30のフラグメントが含まれる。p30
の生物学的活性を有するさらに小さなペプチドが本発明に含まれる。当業者であ
れば標準的な方法、例えばウイルスプラーク減少アッセイまたはサイトカイン生
成アッセイを含む細胞活性化アッセイによって、p30の機能的活性をアッセイす ることができる。
【００２０】 p30の一次アミノ酸配列をわずかに改変することにより、本明細書に記載する 天然に存在するp30ポリペプチドと比較して実質的に同等の活性を有するタンパ ク質が生じ得る。こうした改変は部位特異的突然変異誘発などによる意図的なも
のであってもよいし、または自然発生的なものであってもよい。p30の生物学的 活性、例えばHVEMもしくはLTβRに結合することによるかまたはHSVのHVEMへの結
合を抑制することによる細胞応答の改変、が存在するかぎり、これらの改変によ
って生成するポリペプチドのすべてが本発明に含まれる。さらに、１以上のアミ
ノ酸の欠失によっても、その活性の有意な改変を伴わない、生成分子の構造の改
変が生じ得る。これによって、より広い用途を有するより小さな活性分子の開発
がもたらされ得る。例えば、p30活性に必要でないアミノまたはカルボキシ末端 アミノ酸を除去することが可能である。
のであってもよいし、または自然発生的なものであってもよい。p30の生物学的 活性、例えばHVEMもしくはLTβRに結合することによるかまたはHSVのHVEMへの結
合を抑制することによる細胞応答の改変、が存在するかぎり、これらの改変によ
って生成するポリペプチドのすべてが本発明に含まれる。さらに、１以上のアミ
ノ酸の欠失によっても、その活性の有意な改変を伴わない、生成分子の構造の改
変が生じ得る。これによって、より広い用途を有するより小さな活性分子の開発
がもたらされ得る。例えば、p30活性に必要でないアミノまたはカルボキシ末端 アミノ酸を除去することが可能である。
【００２１】 本発明のp30ポリペプチドにはポリペプチド配列の同類変異も含まれる。本明 細書で使用する用語「同類変異」とは、アミノ酸残基の１つが生物学的に類似す
る別のアミノ酸により置換されることを意味する。同類変異の例としては、イソ
ロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどの疎水性残基の１つの別の
ものとの置換、あるいはリシンに代えてアルギニン、アスパラギン酸に代えてグ
ルタミン酸、またはアスパラギンに代えてグルタミンへの置換などの極性残基の
１つの別のものへの置換が含まれる。用語「同類変異」にはまた、置換されたポ
リペプチドに対して生起させた抗体が非置換ポリペプチドとも免疫反応する限り
、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含まれる。
る別のアミノ酸により置換されることを意味する。同類変異の例としては、イソ
ロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどの疎水性残基の１つの別の
ものとの置換、あるいはリシンに代えてアルギニン、アスパラギン酸に代えてグ
ルタミン酸、またはアスパラギンに代えてグルタミンへの置換などの極性残基の
１つの別のものへの置換が含まれる。用語「同類変異」にはまた、置換されたポ
リペプチドに対して生起させた抗体が非置換ポリペプチドとも免疫反応する限り
、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含まれる。
【００２２】 本発明はさらに、本発明のp30ポリペプチドをコードする単離された核酸配列 も提供する。本明細書で使用する用語「単離された」には、天然状態では会合す
るその他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物またはその他の物質を実質的に含
まないポリペプチドが含まれる。本発明のポリヌクレオチド配列にはp30をコー ドするDNA、cDNAおよびRNA配列が含まれる。p30活性を有するポリペプチドをコ ードする限り、p30の全体または一部をコードするポリヌクレオチドのすべてが 本発明に含まれるものと解釈すべきである。こうしたポリヌクレオチドとしては
、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチドおよび意図的に操作
されたポリヌクレオチドが含まれる。例えば、代替の(alternate)RNAスプライシ
ングパターンによるか、またはRNA転写のための代替のプロモーターの使用によ って、mRNA配列の部分を改変してもよい。別の例として、p30ポリヌクレオチド を部位特異的突然変異誘発させることもできる。p30のためのポリヌクレオチド 配列としてはアンチセンス配列も含まれる。本発明のポリヌクレオチドには遺伝
コードのために縮重性である配列が含まれる。天然には20種のアミノ酸があるが
、その大部分が２以上のコドンによって特定される。したがって、コードされる
p30ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化していない限り、すべての縮重 ヌクレオチド配列が本発明に含まれる。さらに、本発明には、p30の生物学的活 性を有し、p30ポリペプチドと免疫反応性の抗体のための１以上のエピトープを 有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた含まれる。
るその他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物またはその他の物質を実質的に含
まないポリペプチドが含まれる。本発明のポリヌクレオチド配列にはp30をコー ドするDNA、cDNAおよびRNA配列が含まれる。p30活性を有するポリペプチドをコ ードする限り、p30の全体または一部をコードするポリヌクレオチドのすべてが 本発明に含まれるものと解釈すべきである。こうしたポリヌクレオチドとしては
、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチドおよび意図的に操作
されたポリヌクレオチドが含まれる。例えば、代替の(alternate)RNAスプライシ
ングパターンによるか、またはRNA転写のための代替のプロモーターの使用によ って、mRNA配列の部分を改変してもよい。別の例として、p30ポリヌクレオチド を部位特異的突然変異誘発させることもできる。p30のためのポリヌクレオチド 配列としてはアンチセンス配列も含まれる。本発明のポリヌクレオチドには遺伝
コードのために縮重性である配列が含まれる。天然には20種のアミノ酸があるが
、その大部分が２以上のコドンによって特定される。したがって、コードされる
p30ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化していない限り、すべての縮重 ヌクレオチド配列が本発明に含まれる。さらに、本発明には、p30の生物学的活 性を有し、p30ポリペプチドと免疫反応性の抗体のための１以上のエピトープを 有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた含まれる。
【００２３】 本発明のp30核酸には(a)天然に存在するp30をコードする配列、ならびに(b)高
ストリンジェント条件、例えば0.5 M NaHPO４、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS
)、1 mM EDTA中、65℃でのフィルターに結合させたDNAとのハイブリダイゼーシ ョン、および68℃、0.1X SSC／0.1％ SDSでの洗浄［Ausubel F.M.ら編，(1989)C
urrent Protocols in Molecular Biology,Vol.I,Green Publishing Associates,
Inc.,and John Wiley & sons,Inc.,New York］においてその配列の相補体とハイ
ブリダイズし、かつ機能的に等価な遺伝子産物をコードするあらゆるヌクレオチ
ド配列が含まれる。配列(a)および(b)の縮重変異体もまた本発明に含まれる。
ストリンジェント条件、例えば0.5 M NaHPO４、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS
)、1 mM EDTA中、65℃でのフィルターに結合させたDNAとのハイブリダイゼーシ ョン、および68℃、0.1X SSC／0.1％ SDSでの洗浄［Ausubel F.M.ら編，(1989)C
urrent Protocols in Molecular Biology,Vol.I,Green Publishing Associates,
Inc.,and John Wiley & sons,Inc.,New York］においてその配列の相補体とハイ
ブリダイズし、かつ機能的に等価な遺伝子産物をコードするあらゆるヌクレオチ
ド配列が含まれる。配列(a)および(b)の縮重変異体もまた本発明に含まれる。
【００２４】 前段のヌクレオチド配列(a)および(b)とハイブリダイズし、したがってそれら
の相補体である核酸分子、好ましくはDNA分子もまた本発明に含まれる。これら のハイブリダイゼーション条件は上記のような高ストリンジェントであってもよ
いし、または例えば42℃、0.2X SSC／0.1％SDSでの洗浄［Ausubelら、上記引用 ］による中程度のストリンジェント条件などのあまり高ストリンジェントでない
ものでもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）である例
では、高ストリンジェント条件とは、例えば、（14塩基オリゴの場合は）37℃、
（17塩基オリゴの場合は）48℃、（20塩基オリゴの場合は）55℃、および（23塩
基オリゴの場合は）60℃で、6X SSC／0.05％ピロリン酸ナトリウムでの洗浄をい
う。これらの核酸分子は、例えば（p30核酸配列の増幅反応のため、および／ま たはその際のアンチセンスプライマーとして）p30の調節において有用なp30アン
チセンス分子をコードするかまたはそのようなp30アンチセンス分子として作用 する。さらに、こうした分子を、例えばp30遺伝子の存在を検出することができ るスクリーニング方法の成分として使用することもできる。
の相補体である核酸分子、好ましくはDNA分子もまた本発明に含まれる。これら のハイブリダイゼーション条件は上記のような高ストリンジェントであってもよ
いし、または例えば42℃、0.2X SSC／0.1％SDSでの洗浄［Ausubelら、上記引用 ］による中程度のストリンジェント条件などのあまり高ストリンジェントでない
ものでもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）である例
では、高ストリンジェント条件とは、例えば、（14塩基オリゴの場合は）37℃、
（17塩基オリゴの場合は）48℃、（20塩基オリゴの場合は）55℃、および（23塩
基オリゴの場合は）60℃で、6X SSC／0.05％ピロリン酸ナトリウムでの洗浄をい
う。これらの核酸分子は、例えば（p30核酸配列の増幅反応のため、および／ま たはその際のアンチセンスプライマーとして）p30の調節において有用なp30アン
チセンス分子をコードするかまたはそのようなp30アンチセンス分子として作用 する。さらに、こうした分子を、例えばp30遺伝子の存在を検出することができ るスクリーニング方法の成分として使用することもできる。
【００２５】 上記のヌクレオチド配列の他に、当分野で周知の分子生物学的技法によって、
過度の実験をすることなく、全長cDNAまたはゲノム配列を同定して容易に単離す
ることができる。本発明はこれらの核酸分子を包含する。
過度の実験をすることなく、全長cDNAまたはゲノム配列を同定して容易に単離す
ることができる。本発明はこれらの核酸分子を包含する。
【００２６】 本発明のDNA配列はいくつかの方法によって取得することができる。例えば、 当分野で周知のハイブリダイゼーションまたはコンピュータに基づく技法を使用
して、DNAを単離することができる。これらとしては、限定しようとするもので はないが、以下のものが含まれる：(a)相同性ヌクレオチド配列の検出のための 、ゲノムまたはcDNAライブラリーのプローブとのハイブリダイゼーション；(b) 共通した構造的特徴を有するクローン化DNA断片の検出ための、発現ライブラリ ーの抗体スクリーニング；(c)対象とするDNA配列とアニールできるプライマーを
使用するゲノムDNAまたはcDNA上でのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)；(d)類似の配 列に関する配列データベースのコンピュータ検索；(e)サブトラクションDNAライ
ブラリー(subtractive DNA library)の分別スクリーニング；および(f)T細胞cDN
Aライブラリーのエクスプレスド・シーケンス・タグ(EST)による大規模ゲノムシ
ークエンシング。
して、DNAを単離することができる。これらとしては、限定しようとするもので はないが、以下のものが含まれる：(a)相同性ヌクレオチド配列の検出のための 、ゲノムまたはcDNAライブラリーのプローブとのハイブリダイゼーション；(b) 共通した構造的特徴を有するクローン化DNA断片の検出ための、発現ライブラリ ーの抗体スクリーニング；(c)対象とするDNA配列とアニールできるプライマーを
使用するゲノムDNAまたはcDNA上でのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)；(d)類似の配 列に関する配列データベースのコンピュータ検索；(e)サブトラクションDNAライ
ブラリー(subtractive DNA library)の分別スクリーニング；および(f)T細胞cDN
Aライブラリーのエクスプレスド・シーケンス・タグ(EST)による大規模ゲノムシ
ークエンシング。
【００２７】 好ましくは、本発明のp30ポリヌクレオチドは哺乳類生物から誘導される。適 切なプローブが入手できるならば、核酸ハイブリダイゼーションに依拠するスク
リーニング操作によって、あらゆる生物からどんな遺伝子配列でも単離すること
が可能になる。問題とするタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴ
ヌクレオチドプローブを化学的に合成することができる。このためには短いオリ
ゴペプチドの一連のアミノ酸配列を知る必要がある。このタンパク質をコードす
るDNA配列はその遺伝コードから推定することができるが、コードの縮重性を考 慮に入れなければならない。配列が縮重している場合は、混合付加反応を実施す
ることが可能である。これには変性二本鎖DNAの異種混合物が含まれる。こうし たスクリーニングの場合、ハイブリダイゼーションは好ましくは一本鎖DNAまた は変性二本鎖DNAのいずれかで実施する。対象のポリペプチドに関連するmRNA配 列の存在量が非常に少ない起源から誘導されるcDNAクローンの検出においては、
ハイブリダイゼーションが特に有用である。つまり、非特異的結合を回避するよ
うにするストリンジェントハイブリダイゼーション条件を使用することによって
、例えば、標的DNAを混合物中のその完全相補体である１個のプローブとハイブ リダイズさせて、１個の特異的cDNAクローンをオートラジオグラフィーで可視化
することが可能である［Wallaceら(1981)Nucl.Acid Res.,9:879］。あるいは、 非特異的cDNAクローンを排除するために、サブトラクションライブラリーが有用
である。
リーニング操作によって、あらゆる生物からどんな遺伝子配列でも単離すること
が可能になる。問題とするタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴ
ヌクレオチドプローブを化学的に合成することができる。このためには短いオリ
ゴペプチドの一連のアミノ酸配列を知る必要がある。このタンパク質をコードす
るDNA配列はその遺伝コードから推定することができるが、コードの縮重性を考 慮に入れなければならない。配列が縮重している場合は、混合付加反応を実施す
ることが可能である。これには変性二本鎖DNAの異種混合物が含まれる。こうし たスクリーニングの場合、ハイブリダイゼーションは好ましくは一本鎖DNAまた は変性二本鎖DNAのいずれかで実施する。対象のポリペプチドに関連するmRNA配 列の存在量が非常に少ない起源から誘導されるcDNAクローンの検出においては、
ハイブリダイゼーションが特に有用である。つまり、非特異的結合を回避するよ
うにするストリンジェントハイブリダイゼーション条件を使用することによって
、例えば、標的DNAを混合物中のその完全相補体である１個のプローブとハイブ リダイズさせて、１個の特異的cDNAクローンをオートラジオグラフィーで可視化
することが可能である［Wallaceら(1981)Nucl.Acid Res.,9:879］。あるいは、 非特異的cDNAクローンを排除するために、サブトラクションライブラリーが有用
である。
【００２８】 所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が未知の場合、DNA配列の直接の 合成は不可能であるので、最良の方法はcDNA配列の合成である。対象のcDNA配列
を単離するための標準的手法の中に、高レベルの遺伝子発現をするドナー細胞中
に豊富なmRNAの逆転写から誘導される、プラスミドまたはファージに保有させた
cDNAライブラリーがある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組合せて使用すると、希
少な発現産物でもクローン化することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列の
有意な部分が既知の場合は、標的cDNA中に存在すると推定される配列の１つと重
複する標識一本鎖もしくは二本鎖DNAまたはRNAプローブ配列を作成して、一本鎖
形態に変性させたcDNAのクローン化コピー上で実施するDNA/DNAハイブリダイゼ ーション手法において、利用することができる［Jayら、(1983)Nucl.Acid Res.,
11:2325］。N-末端アミノ酸シークエンシングによって取得されるp30ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を「逆翻訳(Back-Translate)」することによって、適切なオリ
ゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを構築することができる。
を単離するための標準的手法の中に、高レベルの遺伝子発現をするドナー細胞中
に豊富なmRNAの逆転写から誘導される、プラスミドまたはファージに保有させた
cDNAライブラリーがある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組合せて使用すると、希
少な発現産物でもクローン化することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列の
有意な部分が既知の場合は、標的cDNA中に存在すると推定される配列の１つと重
複する標識一本鎖もしくは二本鎖DNAまたはRNAプローブ配列を作成して、一本鎖
形態に変性させたcDNAのクローン化コピー上で実施するDNA/DNAハイブリダイゼ ーション手法において、利用することができる［Jayら、(1983)Nucl.Acid Res.,
11:2325］。N-末端アミノ酸シークエンシングによって取得されるp30ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を「逆翻訳(Back-Translate)」することによって、適切なオリ
ゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを構築することができる。
【００２９】 p30に特異的な抗体を使用して、１以上のエピトープを有するp30ペプチドにつ
いて、λgt11などのcDNA発現ライブラリーを間接的にスクリーニングしてもよい
。こうした抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれとして誘導して
もよく、これを使用してp30cDNAの存在を指示する発現産物を検出することがで きる。
いて、λgt11などのcDNA発現ライブラリーを間接的にスクリーニングしてもよい
。こうした抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれとして誘導して
もよく、これを使用してp30cDNAの存在を指示する発現産物を検出することがで きる。
【００３０】 p30核酸の改変としては、遺伝子内突然変異（例えば点突然変異、ナンセンス （停止）、ミスセンス、スプライス部位およびフレームシフト）ならびにヘテロ
接合型またはホモ接合型欠失が含まれる。こうした改変の検出は、配列分析、サ
ザンブロット分析、PCRに基づく分析（例えば多重PCR、配列標識部位(STS)）、 およびin situハイブリダイゼーションを含む、当業者に既知の標準的方法によ って実施することができる。こうしたタンパク質は、例えば、標準的SDS-PAGEお
よび／または免疫沈降分析および／またはウエスタンブロット分析によって分析
することができる。
接合型またはホモ接合型欠失が含まれる。こうした改変の検出は、配列分析、サ
ザンブロット分析、PCRに基づく分析（例えば多重PCR、配列標識部位(STS)）、 およびin situハイブリダイゼーションを含む、当業者に既知の標準的方法によ って実施することができる。こうしたタンパク質は、例えば、標準的SDS-PAGEお
よび／または免疫沈降分析および／またはウエスタンブロット分析によって分析
することができる。
【００３１】 本発明は、前記のp30コード配列のいずれかおよび／またはその相補体（すな わちアンチセンス）を含有するDNAベクター、ならびに前記のp30コード配列のい
ずれかを含有する発現ベクターをも包含する。発現ベクターは、本発明のペプチ
ドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列がプロモーターもし
くはエンハンサー−プロモーターの組合せに機能し得る形で連結されている核酸
配列で構成されるかまたはこれを含有する。プロモーターは、転写開始位置の直
前（上流）の典型的には100ヌクレオチド対以内のDNA分子の領域で構成される転
写調節エレメントである。もう１つの転写調節エレメントがエンハンサーである
。エンハンサーは時間、位置および発現レベルに関する特異性を提供する。プロ
モーターとは異なり、エンハンサーはプロモーターが存在していれば、転写部位
から種々の距離に位置していても機能することができる。エンハンサーは転写開
始部位の下流に位置していてもよい。発現ベクターのコード配列を転写終結領域
に機能し得るように連結する。コード配列をプロモーターの制御下に置くために
は、ペプチドまたはポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を
プロモーターから1〜約50ヌクレオチド下流(3')に位置させる必要がある。こう した調節エレメントとしては、限定しようとするものではないが、サイトメガロ
ウイルスhCMV前初期遺伝子、SV40アデノウイルスの初期または後期プロモーター
、lac系、trp系、TAC系、TRC系、ファージAの主要オペレーターおよびプロモー ター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのた
めのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母α接合因
子のプロモーターが含まれる。
ずれかを含有する発現ベクターをも包含する。発現ベクターは、本発明のペプチ
ドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列がプロモーターもし
くはエンハンサー−プロモーターの組合せに機能し得る形で連結されている核酸
配列で構成されるかまたはこれを含有する。プロモーターは、転写開始位置の直
前（上流）の典型的には100ヌクレオチド対以内のDNA分子の領域で構成される転
写調節エレメントである。もう１つの転写調節エレメントがエンハンサーである
。エンハンサーは時間、位置および発現レベルに関する特異性を提供する。プロ
モーターとは異なり、エンハンサーはプロモーターが存在していれば、転写部位
から種々の距離に位置していても機能することができる。エンハンサーは転写開
始部位の下流に位置していてもよい。発現ベクターのコード配列を転写終結領域
に機能し得るように連結する。コード配列をプロモーターの制御下に置くために
は、ペプチドまたはポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を
プロモーターから1〜約50ヌクレオチド下流(3')に位置させる必要がある。こう した調節エレメントとしては、限定しようとするものではないが、サイトメガロ
ウイルスhCMV前初期遺伝子、SV40アデノウイルスの初期または後期プロモーター
、lac系、trp系、TAC系、TRC系、ファージAの主要オペレーターおよびプロモー ター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのた
めのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母α接合因
子のプロモーターが含まれる。
【００３２】 発現ベクターおよびその構築方法は当分野に習熟する者には公知である。好適
なベクターとしては数ある中でも、プラスミド、ならびにヘルペスウイルス、レ
トロウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス
などのウイルスベクターが含まれる。
なベクターとしては数ある中でも、プラスミド、ならびにヘルペスウイルス、レ
トロウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス
などのウイルスベクターが含まれる。
【００３３】 記載するp30核酸配列を含有する発現ベクターでトランスフェクトした好適な 宿主細胞系が本発明に含まれる。例えば、p30を各種の天然または工学操作され た形態で発現させるための、トランスフェクション用に使用する細胞としては、
限定しようとするものではないが、例えば哺乳類起源のHEK293細胞またはSf9昆 虫細胞が含まれる。当分野で通常使用される各種の方法、例えばエレクトロポレ
ーションまたはリン酸カルシウム沈殿によって、細胞をトランスフェクトする。
ウイルスベクター、例えばレトロウイルスでの形質導入によって遺伝子を細胞中
に導入することもできる。当分野の普通の技術者によく知られている適切な方法
、例えばGeneticinＴＭ(G418)またはピューロマイシンなどの薬剤を補充した組 織培養用培地を使用し、関連する発現ベクターにそのための耐性遺伝子を含有さ
せることなどによって、トランスフェクトが成功した細胞系を選択する。各種の
可能な方法、例えばフローサイトメトリー分析によって、p30分子の細胞表面発 現について、トランスフェクトが成功した細胞系をスクリーニングする。
限定しようとするものではないが、例えば哺乳類起源のHEK293細胞またはSf9昆 虫細胞が含まれる。当分野で通常使用される各種の方法、例えばエレクトロポレ
ーションまたはリン酸カルシウム沈殿によって、細胞をトランスフェクトする。
ウイルスベクター、例えばレトロウイルスでの形質導入によって遺伝子を細胞中
に導入することもできる。当分野の普通の技術者によく知られている適切な方法
、例えばGeneticinＴＭ(G418)またはピューロマイシンなどの薬剤を補充した組 織培養用培地を使用し、関連する発現ベクターにそのための耐性遺伝子を含有さ
せることなどによって、トランスフェクトが成功した細胞系を選択する。各種の
可能な方法、例えばフローサイトメトリー分析によって、p30分子の細胞表面発 現について、トランスフェクトが成功した細胞系をスクリーニングする。
【００３４】 「宿主細胞」とはその中でベクターが増殖してそのDNAを発現することができ る細胞である。この用語には対象宿主細胞の子孫もまた含まれる。複製中に発生
する突然変異があるかも知れないので、すべての子孫が親細胞と同一とはかぎら
ないことが理解される。しかし、用語「宿主細胞」を使用する場合、こうした子
孫も含まれる。
する突然変異があるかも知れないので、すべての子孫が親細胞と同一とはかぎら
ないことが理解される。しかし、用語「宿主細胞」を使用する場合、こうした子
孫も含まれる。
【００３５】 p30のアミノ酸配列内の抗原性エピトープを特異的に認識する抗体もまた本発 明に包含される。こうした抗体としては、限定しようとするものではないが、ポ
リクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体、一
本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')２フラグメント、および上記のいずれかの エピトープ結合性フラグメントが含まれる。
リクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体、一
本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')２フラグメント、および上記のいずれかの エピトープ結合性フラグメントが含まれる。
【００３６】 本発明の抗体は、例えば自己免疫疾患および悪性リンパ腫の治療において使用
することができる。これらは細胞上でのp30の発現について試験するために使用 することもでき、したがって特定の患者のために適切な治療を選択するためのス
クリーニング操作の一部として利用し得る。例えば、リンパ腫または白血病患者
の腫瘍細胞がp30を発現する場合、抗p30抗体または抗p30抗体のイムノトキシン 複合体をその患者の治療に使用することができる。これらの抗体は本発明のスク
リーニングアッセイにおいて使用することもできる。
することができる。これらは細胞上でのp30の発現について試験するために使用 することもでき、したがって特定の患者のために適切な治療を選択するためのス
クリーニング操作の一部として利用し得る。例えば、リンパ腫または白血病患者
の腫瘍細胞がp30を発現する場合、抗p30抗体または抗p30抗体のイムノトキシン 複合体をその患者の治療に使用することができる。これらの抗体は本発明のスク
リーニングアッセイにおいて使用することもできる。
【００３７】 本発明の抗体の作製のため、p30ポリペプチドまたはp30ポリペプチドを発現す
る細胞のいずれかの注射によって宿主動物を免疫する。あるいは、免疫原として
、これらのポリペプチドのp30として特異的な領域に相当するペプチドを使用し てもよい。こうした宿主動物としては、限定しようとするものではないが、ウサ
ギ、マウスおよびラットが含まれる。宿主の種類に応じて、免疫学的応答を増強
するために、各種のアジュバントを使用することができる。これらとしては、限
定しようとするものではないが、Freund（完全および不完全）アジュバント、水
酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロン酸ポリオール、
ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、BCG（Calmette-Guerin細菌）および
Corynebacterium parvumが含まれる。ポリクローナル抗体は免疫動物の血清から
誘導された抗体分子の異種集団である。
る細胞のいずれかの注射によって宿主動物を免疫する。あるいは、免疫原として
、これらのポリペプチドのp30として特異的な領域に相当するペプチドを使用し てもよい。こうした宿主動物としては、限定しようとするものではないが、ウサ
ギ、マウスおよびラットが含まれる。宿主の種類に応じて、免疫学的応答を増強
するために、各種のアジュバントを使用することができる。これらとしては、限
定しようとするものではないが、Freund（完全および不完全）アジュバント、水
酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロン酸ポリオール、
ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、BCG（Calmette-Guerin細菌）および
Corynebacterium parvumが含まれる。ポリクローナル抗体は免疫動物の血清から
誘導された抗体分子の異種集団である。
【００３８】 免疫原性をさらに増強するため、免疫原を担体に結合させることもある。こう
した担体の例はキーホールリンペット(keyhole limpet)ヘモシアニン(KLH)およ びウシ血清アルブミン(BSA)である。オボアルブミン、マウス血清アルブミンま たはウサギ血清アルブミンなどのその他のアルブミンも担体として使用すること
ができる。ペプチドを担体に結合させる方法は当分野で周知であり、グルタルア
ルデヒド、カルボジイミドおよびm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシ ンイミドエステルの使用が含まれる。
した担体の例はキーホールリンペット(keyhole limpet)ヘモシアニン(KLH)およ びウシ血清アルブミン(BSA)である。オボアルブミン、マウス血清アルブミンま たはウサギ血清アルブミンなどのその他のアルブミンも担体として使用すること
ができる。ペプチドを担体に結合させる方法は当分野で周知であり、グルタルア
ルデヒド、カルボジイミドおよびm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシ ンイミドエステルの使用が含まれる。
【００３９】 使用すべき抗原の量は、当業者であれば、過度の実験をすることなく容易に決
定することができる。抗原を多くの経路によって投与することができる（例えば
、皮下、筋内、皮内、静脈内および腹腔内）。免疫した動物の血液を投与後各種
の時点でサンプリングして、ポリクローナル抗体の産生をモニターする。所望の
レベルの抗体が得られたら、動物から採血し、血清を保存する。
定することができる。抗原を多くの経路によって投与することができる（例えば
、皮下、筋内、皮内、静脈内および腹腔内）。免疫した動物の血液を投与後各種
の時点でサンプリングして、ポリクローナル抗体の産生をモニターする。所望の
レベルの抗体が得られたら、動物から採血し、血清を保存する。
【００４０】 連続的継代培養細胞系によって抗体分子を産生させるための任意の技法によっ
て、特定の抗原に対する抗体の均質集団であるモノクローナル抗体を取得するこ
ともできる。これらの技法として、限定するわけではないが、以下のものが挙げ
られる：ハイブリドーマ技法［Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495-497 ；米国特 許第4,376,110号；Howell and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory M
anual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.］、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法［Kosb
orら(1983)Immunology Today 4:72；Coleら(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2
026］およびEBVハイブリドーマ技法［Coleら(1985),Monoclonal Antibodies And
Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.］。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA
、IgDを含む任意の免疫グロブリンクラスおよびそれらのあらゆるサブクラスの ものでよい。
て、特定の抗原に対する抗体の均質集団であるモノクローナル抗体を取得するこ
ともできる。これらの技法として、限定するわけではないが、以下のものが挙げ
られる：ハイブリドーマ技法［Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495-497 ；米国特 許第4,376,110号；Howell and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory M
anual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.］、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法［Kosb
orら(1983)Immunology Today 4:72；Coleら(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2
026］およびEBVハイブリドーマ技法［Coleら(1985),Monoclonal Antibodies And
Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.］。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA
、IgDを含む任意の免疫グロブリンクラスおよびそれらのあらゆるサブクラスの ものでよい。
【００４１】 その外、「キメラ抗体」の製造のために開発された技法を使用することができ
る［Morrisonら(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851；Neubergerら(1984)Nat
ure 312:604；Takedaら(1985)Nature 314:452］。これらの技法には、適切な生 物学的活性があるヒト抗体をコードする遺伝子の一部分への、適切な抗原特異性
を有するマウス抗体をコードする遺伝子の一部分のスプライシングが関与する。
キメラ抗体とは、別々の部分が別々の動物種に由来している分子で、マウスモノ
クローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの
などがある。こうしたキメラ抗体は、例えばIgHをコードするヒト遺伝子座なら びにκおよびλＬ鎖遺伝子座を含有するマウスを免疫することによって作製する
こともできる。
る［Morrisonら(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851；Neubergerら(1984)Nat
ure 312:604；Takedaら(1985)Nature 314:452］。これらの技法には、適切な生 物学的活性があるヒト抗体をコードする遺伝子の一部分への、適切な抗原特異性
を有するマウス抗体をコードする遺伝子の一部分のスプライシングが関与する。
キメラ抗体とは、別々の部分が別々の動物種に由来している分子で、マウスモノ
クローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの
などがある。こうしたキメラ抗体は、例えばIgHをコードするヒト遺伝子座なら びにκおよびλＬ鎖遺伝子座を含有するマウスを免疫することによって作製する
こともできる。
【００４２】 別法として、p30のエピトープに対する一本鎖抗体を製造するために、一本鎖 抗体の製造について記載された技法［米国特許第4,946,778号；Bird(1988)Scien
ce 242:423；Hustonら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879；およびWardら(1
989)Nature 334:544］を応用することができる。一本鎖抗体はFv領域のＨ鎖およ
びＬ鎖フラグメントをアミノ酸架橋を介して連結し、その結果一本鎖ポリペプチ
ドとすることによって形成される。それらは組換えDNA技法によって都合よく製 造される。
ce 242:423；Hustonら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879；およびWardら(1
989)Nature 334:544］を応用することができる。一本鎖抗体はFv領域のＨ鎖およ
びＬ鎖フラグメントをアミノ酸架橋を介して連結し、その結果一本鎖ポリペプチ
ドとすることによって形成される。それらは組換えDNA技法によって都合よく製 造される。
【００４３】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは既知の技法によって作製する
ことができる。例えば、こうしたフラグメントとして、限定するわけではないが
、抗体分子のペプシン消化によって作製することができるF(ab')2フラグメント 、およびF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を分解することによって作製 することができるFabフラグメントが挙げられる。あるいは、Fab発現ライブラリ
ーを構築する［Huseら(1989)Science 246:1275］ことによって、所望の特異性を
有するモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定が可能である。
ことができる。例えば、こうしたフラグメントとして、限定するわけではないが
、抗体分子のペプシン消化によって作製することができるF(ab')2フラグメント 、およびF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を分解することによって作製 することができるFabフラグメントが挙げられる。あるいは、Fab発現ライブラリ
ーを構築する［Huseら(1989)Science 246:1275］ことによって、所望の特異性を
有するモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定が可能である。
【００４４】 抗体を結合特異性についてスクリーニングする方法は当分野で周知である。こ
のような方法として、限定するわけではないが、以下の試験方法が挙げられる；
(a)細胞表面p30を発現する細胞との結合性；(b)p30を発現しない細胞との結合性
の欠如；(c)p30ポリペプチドとの結合性；(d)p30以外のポリペプチド（例えば、
TNF、LTα、LTβ、Fasリガンド、CD40リガンドまたはアルブミン）との結合性の
欠如；ならびに(e)p30内の対象領域、例えばHVEMまたはLTβRとの結合に関与す る領域に相当するペプチドによる、p30への結合性の特異的阻害。
のような方法として、限定するわけではないが、以下の試験方法が挙げられる；
(a)細胞表面p30を発現する細胞との結合性；(b)p30を発現しない細胞との結合性
の欠如；(c)p30ポリペプチドとの結合性；(d)p30以外のポリペプチド（例えば、
TNF、LTα、LTβ、Fasリガンド、CD40リガンドまたはアルブミン）との結合性の
欠如；ならびに(e)p30内の対象領域、例えばHVEMまたはLTβRとの結合に関与す る領域に相当するペプチドによる、p30への結合性の特異的阻害。
【００４５】 本発明は、HVEMまたはLTβR受容体ポリペプチドのいずれかによって媒介され る細胞応答をモジュレートすることが可能な化合物を同定するために設計された
in vitroシステムを特徴とする。「細胞応答」とは、本明細書中では、HSVの細 胞活性化または細胞インターナリゼーションをいう。これらの細胞応答は、(a)H
VEMとp30、gDもしくはLTα；または(b)LTβRとp30の相互作用によって誘発され る。
in vitroシステムを特徴とする。「細胞応答」とは、本明細書中では、HSVの細 胞活性化または細胞インターナリゼーションをいう。これらの細胞応答は、(a)H
VEMとp30、gDもしくはLTα；または(b)LTβRとp30の相互作用によって誘発され る。
【００４６】 用語「リガンド」は、受容体タンパク質に高アフィニティおよび特異的様式で
結合して機能的応答を誘発するポリペプチドまたは化合物をいう。例えば、本発
明のリガンドとしてp30、gDまたはLTαが挙げられる。用語「受容体」は、本明 細書中では、リガンドが結合したとき、細胞応答を誘導するポリペプチドをいう
。本発明の受容体としてHVEMまたはLTβRが挙げられる。用語「結合物質」は、 受容体またはリガンドに高アフィニティおよび特異的様式で結合するが、機能的
応答を誘発するかまたは誘発しないポリペプチドまたは化合物をいう。試験化合
物は、確定され、単離され、そして精製された候補化合物（例えば合成小分子）
であるか、コンビナトリアルライブラリーのメンバーであってもよく、または生
物学的液体、組織抽出物、細胞画分もしくは細胞溶解物などの生物学的サンプル
中に存在してもよい。
結合して機能的応答を誘発するポリペプチドまたは化合物をいう。例えば、本発
明のリガンドとしてp30、gDまたはLTαが挙げられる。用語「受容体」は、本明 細書中では、リガンドが結合したとき、細胞応答を誘導するポリペプチドをいう
。本発明の受容体としてHVEMまたはLTβRが挙げられる。用語「結合物質」は、 受容体またはリガンドに高アフィニティおよび特異的様式で結合するが、機能的
応答を誘発するかまたは誘発しないポリペプチドまたは化合物をいう。試験化合
物は、確定され、単離され、そして精製された候補化合物（例えば合成小分子）
であるか、コンビナトリアルライブラリーのメンバーであってもよく、または生
物学的液体、組織抽出物、細胞画分もしくは細胞溶解物などの生物学的サンプル
中に存在してもよい。
【００４７】 １つの実施形態において、本発明はHVEM結合物質媒介型細胞応答に作用する化
合物を同定するためのアッセイを特徴とする。このアッセイには、(a)HVEMポリ ペプチドまたはHVEMポリペプチドを発現する細胞、およびHVEM結合物質とともに
、成分どうしが相互作用し得る条件下で、その化合物をインキュベートすること
；および(b)HVEM結合物質媒介型細胞応答に対するその化合物の作用を測定する ことが関与する。LTβR-p30媒介型細胞応答に作用する化合物を同定するための アッセイもまた本発明の範囲内である。このアッセイには、(a)LTβRポリペプチ
ドまたはLTβRポリペプチドを発現する細胞、およびp30とともに、成分どうしが
相互作用し得る条件下で、この化合物をインキュベートすること；および(b)LT βR-p30媒介型細胞応答に対するその化合物の作用を測定することが関与する。 本発明のアッセイにおいて、HVEMもしくはLTβRとリガンドとの相互作用によっ て媒介される細胞の活性化をモジュレートするか、またはHSVによる感受性細胞 の感染を抑制する能力について、化合物をスクリーニングする。
合物を同定するためのアッセイを特徴とする。このアッセイには、(a)HVEMポリ ペプチドまたはHVEMポリペプチドを発現する細胞、およびHVEM結合物質とともに
、成分どうしが相互作用し得る条件下で、その化合物をインキュベートすること
；および(b)HVEM結合物質媒介型細胞応答に対するその化合物の作用を測定する ことが関与する。LTβR-p30媒介型細胞応答に作用する化合物を同定するための アッセイもまた本発明の範囲内である。このアッセイには、(a)LTβRポリペプチ
ドまたはLTβRポリペプチドを発現する細胞、およびp30とともに、成分どうしが
相互作用し得る条件下で、この化合物をインキュベートすること；および(b)LT βR-p30媒介型細胞応答に対するその化合物の作用を測定することが関与する。 本発明のアッセイにおいて、HVEMもしくはLTβRとリガンドとの相互作用によっ て媒介される細胞の活性化をモジュレートするか、またはHSVによる感受性細胞 の感染を抑制する能力について、化合物をスクリーニングする。
【００４８】 本発明は細胞応答アッセイを特徴とする。これらの細胞応答アッセイは、細胞
の活性化またはHSVによる細胞の感染のいずれかを測定する。
の活性化またはHSVによる細胞の感染のいずれかを測定する。
【００４９】 リガンド（例えば、p30、LTαまたはgD）によって刺激される受容体（例えば 、HVEMまたはLTβR）を発現する細胞の応答、およびその細胞にとって適切な刺 激の次善の(suboptimal)量をモジュレートする能力について、試験化合物を試験
することができる。「応答体」である受容体発現細胞は被験体から新たに取得す
るか、または培養した細胞系でもよい。該細胞は、内在的にコードされる受容体
、またはトランスフェクトされた遺伝子によりコードされる受容体を発現するこ
とができる。リガンドは、単離されたポリペプチドの形態で細胞応答培養物に添
加するか、またはそのリガンドを発現する細胞の培養物への添加によって、添加
することができる。
することができる。「応答体」である受容体発現細胞は被験体から新たに取得す
るか、または培養した細胞系でもよい。該細胞は、内在的にコードされる受容体
、またはトランスフェクトされた遺伝子によりコードされる受容体を発現するこ
とができる。リガンドは、単離されたポリペプチドの形態で細胞応答培養物に添
加するか、またはそのリガンドを発現する細胞の培養物への添加によって、添加
することができる。
【００５０】 このリガンドを発現する細胞は、該リガンドをコードする内在性の遺伝子、あ
るいは該リガンドをコードするトランスフェクトされた遺伝子を発現し得る。さ
らにこのリガンドは、細胞表面上に発現されてもよいし(p30またはgD)、あるい は分泌されてもよい(p30、gDまたはLTα)。p30またはgDが分泌されるためには、
それをコードする遺伝子が、膜貫通ドメインをコードする領域の欠失を有する必
要がある。
るいは該リガンドをコードするトランスフェクトされた遺伝子を発現し得る。さ
らにこのリガンドは、細胞表面上に発現されてもよいし(p30またはgD)、あるい は分泌されてもよい(p30、gDまたはLTα)。p30またはgDが分泌されるためには、
それをコードする遺伝子が、膜貫通ドメインをコードする領域の欠失を有する必
要がある。
【００５１】 細胞の活性化は、例えば細胞の増殖、細胞表面活性化マーカーの新たな発現（ de novo expression）、または可溶性因子の産生に基づいて測定できる。
【００５２】 好ましい実施形態においては、この細胞はリンパ球である。T細胞の場合、受 容体(HVEMまたはLTβR)を発現する応答T細胞を、試験化合物、リガンドおよび最
適用量以下（suboptimal dose）のT細胞活性化因子(例えば抗CD3抗体、フィトヘ
マグルチニン(PHA)のようなレクチン、またはブドウ球菌エンテロトキシンC(SEC
)のような超抗原)の存在の下で培養することができる。対照は、(a) T細胞のみ を含む培養物、(b) T細胞活性化因子およびリガンドとともにT細胞を含み、試験
化合物を含まない培養物、(c) T細胞活性化因子とともにT細胞を含み、リガンド
および試験化合物を含まない培養物、(d) T細胞活性化因子とともにT細胞を含み
、リガンドを含まず、試験化合物を含む培養物、(e) T細胞を含み、T細胞活性化
因子を含まず、リガンドを含み、試験化合物を含まない培養物、(f) T細胞を含 み、T細胞活性化因子、リガンド、および試験化合物を含まない培養物、および(
g) T細胞を含み、T細胞活性化因子およびリガンドを含まず、試験化合物を含む 培養物とする。T細胞の活性化は、3H-チミジンの取り込みによるT細胞の増殖(実
施例5参照)、CD69またはCD25のような活性化マーカーの誘導、あるいはインター
ロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-4(IL-4)、またはインターフェロン-γ(IF
Nγ)のようなサイトカインの産生に基づいて測定できる。
適用量以下（suboptimal dose）のT細胞活性化因子(例えば抗CD3抗体、フィトヘ
マグルチニン(PHA)のようなレクチン、またはブドウ球菌エンテロトキシンC(SEC
)のような超抗原)の存在の下で培養することができる。対照は、(a) T細胞のみ を含む培養物、(b) T細胞活性化因子およびリガンドとともにT細胞を含み、試験
化合物を含まない培養物、(c) T細胞活性化因子とともにT細胞を含み、リガンド
および試験化合物を含まない培養物、(d) T細胞活性化因子とともにT細胞を含み
、リガンドを含まず、試験化合物を含む培養物、(e) T細胞を含み、T細胞活性化
因子を含まず、リガンドを含み、試験化合物を含まない培養物、(f) T細胞を含 み、T細胞活性化因子、リガンド、および試験化合物を含まない培養物、および(
g) T細胞を含み、T細胞活性化因子およびリガンドを含まず、試験化合物を含む 培養物とする。T細胞の活性化は、3H-チミジンの取り込みによるT細胞の増殖(実
施例5参照)、CD69またはCD25のような活性化マーカーの誘導、あるいはインター
ロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-4(IL-4)、またはインターフェロン-γ(IF
Nγ)のようなサイトカインの産生に基づいて測定できる。
【００５３】 Bリンパ球の場合も、同様の応答アッセイを行うことができる。B細胞活性化因
子は、アメリカヤマゴボウマイトジェンのようなマイトジェン、ブドウ球菌プロ
テインＡ、抗免疫グロブリン等とし得る。細胞活性化は、細胞の増殖(この場合 も同様に3Hチミジンの組み込みによる)、あるいはIgの分泌に基づいて測定する ことができる。あるいは、栄養面で最適未満の培地におけるB細胞の生存率を測 定してもよい(実施例5参照)。
子は、アメリカヤマゴボウマイトジェンのようなマイトジェン、ブドウ球菌プロ
テインＡ、抗免疫グロブリン等とし得る。細胞活性化は、細胞の増殖(この場合 も同様に3Hチミジンの組み込みによる)、あるいはIgの分泌に基づいて測定する ことができる。あるいは、栄養面で最適未満の培地におけるB細胞の生存率を測 定してもよい(実施例5参照)。
【００５４】 試験化合物がリンパ球の活性化を抑制する能力を有することは、その化合物が
、主としてT細胞が関与する自己免疫疾患(例えば慢性関節リウマチ、インスリン
依存性糖尿病、および多発性硬化症)や、T細胞およびB細胞が関与する自己免疫 疾患(例えば全身性エリテマトーデスや重症筋無力症)の治療に有用である可能性
があることを示すものである。試験化合物がリンパ球の活性化を刺激する能力を
有することは、その化合物が、感染症の患者、あるいは例えば化学療法や放射線
療法を受けている癌患者やAIDS患者のように免疫抑制状態にある患者において免
疫応答を刺激するのに有用である可能性があることを示すものである。
、主としてT細胞が関与する自己免疫疾患(例えば慢性関節リウマチ、インスリン
依存性糖尿病、および多発性硬化症)や、T細胞およびB細胞が関与する自己免疫 疾患(例えば全身性エリテマトーデスや重症筋無力症)の治療に有用である可能性
があることを示すものである。試験化合物がリンパ球の活性化を刺激する能力を
有することは、その化合物が、感染症の患者、あるいは例えば化学療法や放射線
療法を受けている癌患者やAIDS患者のように免疫抑制状態にある患者において免
疫応答を刺激するのに有用である可能性があることを示すものである。
【００５５】 HSV感染症を予防する試験化合物のアッセイでは、試験化合物をHSV感受性細胞
およびHSVの培養物に加えればよい。ウイルス感染についての許容細胞系として は、ヒト皮膚線維芽細胞、活性化を引き起こす物質(例えば抗CD3抗体またはフィ
トヘマグルチニン)で処理した末梢血リンパ球、形質転換された細胞系(例えばヘ
ルト細胞)等が挙げられる。ウイルス産生は、ウイルスプラークアッセイ等の当 業者に知られた任意の方法により測定することができ、特定のウイルスタンパク
質の産生は、ELISAにより、すなわち比色測定により容易に検出可能な酵素であ るβ-ガラクトシダーゼのような指示遺伝子産物を含む組換えウイルスを使用す ることにより測定できる[Montgomeryら、上記に引用]。
およびHSVの培養物に加えればよい。ウイルス感染についての許容細胞系として は、ヒト皮膚線維芽細胞、活性化を引き起こす物質(例えば抗CD3抗体またはフィ
トヘマグルチニン)で処理した末梢血リンパ球、形質転換された細胞系(例えばヘ
ルト細胞)等が挙げられる。ウイルス産生は、ウイルスプラークアッセイ等の当 業者に知られた任意の方法により測定することができ、特定のウイルスタンパク
質の産生は、ELISAにより、すなわち比色測定により容易に検出可能な酵素であ るβ-ガラクトシダーゼのような指示遺伝子産物を含む組換えウイルスを使用す ることにより測定できる[Montgomeryら、上記に引用]。
【００５６】 試験化合物が細胞へのHSV感染を抑制する能力を有することは、その化合物がH
SV感染症の患者の治療に有用である可能性があることを示すものである。
SV感染症の患者の治療に有用である可能性があることを示すものである。
【００５７】 化合物が関連する受容体-リガンド対の何れかのメンバーに結合することによ って細胞応答機能に作用するかどうかを試験するために、その化合物の可溶性形
態の受容体またはリガンドに結合する能力を、当分野で周知の方法、例えばELIS
A、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ等により試験することができ る。さらに、試験化合物が受容体かリガンドの何れかに結合することが受容体と
リガンドの相互の結合を阻害するかどうかを試験するためには、その試験化合物
の可溶性形態の受容体およびリガンドの結合を阻害する能力を調べることができ
る。このようなアッセイの例としては、競合ELISA、競合ウェスタンブロット、 競合ラジオイムノアッセイ等が挙げられる。
態の受容体またはリガンドに結合する能力を、当分野で周知の方法、例えばELIS
A、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ等により試験することができ る。さらに、試験化合物が受容体かリガンドの何れかに結合することが受容体と
リガンドの相互の結合を阻害するかどうかを試験するためには、その試験化合物
の可溶性形態の受容体およびリガンドの結合を阻害する能力を調べることができ
る。このようなアッセイの例としては、競合ELISA、競合ウェスタンブロット、 競合ラジオイムノアッセイ等が挙げられる。
【００５８】 本発明のスクリーニングアッセイにおいて用いられるペプチドおよびポリペプ
チドは、様々な手段によって得ることができる。小さいペプチド(50アミノ酸長 未満)は、標準的な化学的方法で合成するのが便利である場合がある。ある種の ポリペプチド(例えば抗体)は、市販されているものを購入することができる場合
がある。そのように入手できない場合には、前記したように抗体を作製すること
ができる。検出可能なように標識した抗体は、市販されているものを購入するか
、あるいは当業者が容易に作製することができる。
チドは、様々な手段によって得ることができる。小さいペプチド(50アミノ酸長 未満)は、標準的な化学的方法で合成するのが便利である場合がある。ある種の ポリペプチド(例えば抗体)は、市販されているものを購入することができる場合
がある。そのように入手できない場合には、前記したように抗体を作製すること
ができる。検出可能なように標識した抗体は、市販されているものを購入するか
、あるいは当業者が容易に作製することができる。
【００５９】 HVEM、LTβR、p30、gDまたはLTαのようなポリペプチドは、当業者に周知の方
法により生物学的供給源から精製することができる[Protein Purification, Pri
nciples and Practice, second edition (1987) Scopes, Springer Verlag, N.Y
.]。これらのポリペプチドは、当分野で周知の手法を用いた組換えDNA技術によ り、それらの天然形態、切断形態、融合タンパク質すなわちキメラタンパク質形
態で生成することもできる。このような方法としては、例えばin vitro組換えDN
A技術、合成法、in vivo遺伝子組換え等が挙げられる。例えば、Sambrookら、(1
989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N
.Y.および 上記に引用したAusbelらに記載された技術を参照されたい。あるいは
、このようなタンパク質をコードするRNAを化学的に合成することも可能である 。例えば、Oligonucleotide Synthesis, (1984) Gait, M.J. ed., IRL Press, O
xfordに記載された技術を参照されたい。この文献は引用によりその全体を本明 細書の一部とする。
法により生物学的供給源から精製することができる[Protein Purification, Pri
nciples and Practice, second edition (1987) Scopes, Springer Verlag, N.Y
.]。これらのポリペプチドは、当分野で周知の手法を用いた組換えDNA技術によ り、それらの天然形態、切断形態、融合タンパク質すなわちキメラタンパク質形
態で生成することもできる。このような方法としては、例えばin vitro組換えDN
A技術、合成法、in vivo遺伝子組換え等が挙げられる。例えば、Sambrookら、(1
989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N
.Y.および 上記に引用したAusbelらに記載された技術を参照されたい。あるいは
、このようなタンパク質をコードするRNAを化学的に合成することも可能である 。例えば、Oligonucleotide Synthesis, (1984) Gait, M.J. ed., IRL Press, O
xfordに記載された技術を参照されたい。この文献は引用によりその全体を本明 細書の一部とする。
【００６０】 このようなヌクレオチド配列を発現させるために様々な宿主発現ベクター系を
利用することができる。ペプチドまたはポリペプチドが可溶性である場合、(a)
そのペプチドまたはポリペプチドが分泌されない場合には、培養物、即ち宿主の
細胞から、あるいは(b) そのペプチドまたはポリペプチドが細胞から分泌される
場合には培地から、そのペプチドまたはポリペプチドを回収することができる。
このような発現系には、in situでポリペプチドを発現する、即ち細胞膜に固着 したポリペプチドを発現する人工的な宿主細胞も含まれる。そのような発現系か
らのポリペプチドの精製または濃縮は、適当な界面活性剤および脂質ミセルと当
業者に周知の方法を用いて行うことができる。あるいは、タンパク質の構造的特
性および機能的特性をを保持することだけではなく、生物学的活性を評価するこ
とも重要である場合には、そのような人工的な宿主細胞そのものを用いてもよい
。
利用することができる。ペプチドまたはポリペプチドが可溶性である場合、(a)
そのペプチドまたはポリペプチドが分泌されない場合には、培養物、即ち宿主の
細胞から、あるいは(b) そのペプチドまたはポリペプチドが細胞から分泌される
場合には培地から、そのペプチドまたはポリペプチドを回収することができる。
このような発現系には、in situでポリペプチドを発現する、即ち細胞膜に固着 したポリペプチドを発現する人工的な宿主細胞も含まれる。そのような発現系か
らのポリペプチドの精製または濃縮は、適当な界面活性剤および脂質ミセルと当
業者に周知の方法を用いて行うことができる。あるいは、タンパク質の構造的特
性および機能的特性をを保持することだけではなく、生物学的活性を評価するこ
とも重要である場合には、そのような人工的な宿主細胞そのものを用いてもよい
。
【００６１】 本発明の目的に用いることができる発現系としては、限定するものではないが
、前記ヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、
またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、大腸菌(E. coli)
や枯草菌(B. subtilis)）のような微生物、組換え酵母発現ベクターで形質転換 した酵母、組換えウイルス発現ベクター(バキュロウイルス)を感染させた昆虫細
胞、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaM
V)、タバコモザイクウイルス(TMV)）を感染させた植物細胞系または組換えプラ スミド発現ベクターで形質転換された植物細胞系、哺乳動物細胞のゲノムに由来
するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイ
ルスに由来するプロモーターを含む組換え発現構築物を含む哺乳動物細胞(例え ばCOS、CHO、BHK、293、3T3)等が挙げられる。
、前記ヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、
またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、大腸菌(E. coli)
や枯草菌(B. subtilis)）のような微生物、組換え酵母発現ベクターで形質転換 した酵母、組換えウイルス発現ベクター(バキュロウイルス)を感染させた昆虫細
胞、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaM
V)、タバコモザイクウイルス(TMV)）を感染させた植物細胞系または組換えプラ スミド発現ベクターで形質転換された植物細胞系、哺乳動物細胞のゲノムに由来
するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイ
ルスに由来するプロモーターを含む組換え発現構築物を含む哺乳動物細胞(例え ばCOS、CHO、BHK、293、3T3)等が挙げられる。
【００６２】 細菌系においては、発現される遺伝子産物の用途に応じて多くの発現ベクター
を有利に選択することができる。例えば、そのようなタンパク質を大量に製造( 例えばそのタンパク質に対する抗体の産生のため)しようとするときは、容易に 精製できる大量の融合タンパク質産物を高レベルで発現するベクターが望ましい
場合がある。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、コード配
列をベクターのフレーム内でLacZコード領域に個々に結合でき、融合タンパク質
が産生されるような大腸菌発現ベクターpUR278[Rutherら、(1983) EMBO J. 2:17
91]、pINベクター[Inouye & Inouye (1985) Nucleic Acids Res. 13:3101; Van
Heeke & Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503]等が挙げられる。またpGEX
ベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST
)との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、そのような融合 タンパク質は可溶性で、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後、遊離
グルタチオンの存在下で溶出させることによって溶解細胞から容易に精製するこ
とができる。このpGEXベクターは、トロンビン、すなわち第Xa因子タンパク質分
解酵素切断部位を有するように設計されており、クローン化された標的遺伝子産
物をGST部分から切り離すことができる。スクリーニングアッセイで使用される ポリペプチドは、天然形態のポリペプチド、そのようなポリペプチドを含む融合
タンパク質のいずれでもよいことは理解されよう。融合タンパク質における無関
係な部分としては、例えば免疫グロブリンGのFc部分、ヘキサヒスチジン、GST等
がある。
を有利に選択することができる。例えば、そのようなタンパク質を大量に製造( 例えばそのタンパク質に対する抗体の産生のため)しようとするときは、容易に 精製できる大量の融合タンパク質産物を高レベルで発現するベクターが望ましい
場合がある。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、コード配
列をベクターのフレーム内でLacZコード領域に個々に結合でき、融合タンパク質
が産生されるような大腸菌発現ベクターpUR278[Rutherら、(1983) EMBO J. 2:17
91]、pINベクター[Inouye & Inouye (1985) Nucleic Acids Res. 13:3101; Van
Heeke & Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503]等が挙げられる。またpGEX
ベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST
)との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、そのような融合 タンパク質は可溶性で、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後、遊離
グルタチオンの存在下で溶出させることによって溶解細胞から容易に精製するこ
とができる。このpGEXベクターは、トロンビン、すなわち第Xa因子タンパク質分
解酵素切断部位を有するように設計されており、クローン化された標的遺伝子産
物をGST部分から切り離すことができる。スクリーニングアッセイで使用される ポリペプチドは、天然形態のポリペプチド、そのようなポリペプチドを含む融合
タンパク質のいずれでもよいことは理解されよう。融合タンパク質における無関
係な部分としては、例えば免疫グロブリンGのFc部分、ヘキサヒスチジン、GST等
がある。
【００６３】 哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルス発現系を利用することができる。発現
ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合は、対象のヌクレオチド配列を、ア
デノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターや三分割リーダー
配列に結合することができる。次いで、このキメラ遺伝子を、in vitroまたはin
vivo組換えによりアデノウイルスのゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必 須領域(例えば領域E1またはE3)に挿入することにより、感染した宿主において生
存可能で、遺伝子産物の発現が可能な組換えウイルスが得られる[例えば、Logan
& Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655参照]。挿入されたヌク レオチド配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要なことがある。こ
のシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。遺伝子またはc
DNAの全体が、それ自身の開始コドンおよび隣接する配列を含めて適当な発現ベ クターに挿入される場合には、追加の翻訳制御シグナル配列は不要なこともある
。しかし、コード配列部分のみが挿入される場合は、通常はATG開始コドンを含 む外来翻訳制御シグナル配列を与えなければならない。さらに、インサート全体
の翻訳を確保するために、開始コドンは所望のコード配列のリーディングフレー
ムと位相が一致していなければならない。これらの外来翻訳制御シグナル配列お
よび開始コドンは、天然および合成いずれかの様々な起源に由来するものであり
得る。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター
等を含めることによって増強することができる[Bittnerら、(1987) Methods in
Enzymol. 153:516]。
ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合は、対象のヌクレオチド配列を、ア
デノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターや三分割リーダー
配列に結合することができる。次いで、このキメラ遺伝子を、in vitroまたはin
vivo組換えによりアデノウイルスのゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必 須領域(例えば領域E1またはE3)に挿入することにより、感染した宿主において生
存可能で、遺伝子産物の発現が可能な組換えウイルスが得られる[例えば、Logan
& Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655参照]。挿入されたヌク レオチド配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要なことがある。こ
のシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。遺伝子またはc
DNAの全体が、それ自身の開始コドンおよび隣接する配列を含めて適当な発現ベ クターに挿入される場合には、追加の翻訳制御シグナル配列は不要なこともある
。しかし、コード配列部分のみが挿入される場合は、通常はATG開始コドンを含 む外来翻訳制御シグナル配列を与えなければならない。さらに、インサート全体
の翻訳を確保するために、開始コドンは所望のコード配列のリーディングフレー
ムと位相が一致していなければならない。これらの外来翻訳制御シグナル配列お
よび開始コドンは、天然および合成いずれかの様々な起源に由来するものであり
得る。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター
等を含めることによって増強することができる[Bittnerら、(1987) Methods in
Enzymol. 153:516]。
【００６４】 さらに、宿主細胞株として、挿入された配列の発現をモジュレートするものや
、あるいは遺伝子産物を所望の特定の形態で修飾およびプロセシングするものを
選択することができる。このようなタンパク質産物の修飾(例えばグリコシル化)
およびプロセシング(例えば切断)がそのタンパク質の機能に関して重要な場合が
ある。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングが確実に行わ
れるように、適当な細胞系または宿主系を選択することができる。哺乳動物の宿
主細胞としては、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、Held、COS、MDCK 、293、3T3、WI38等が挙げられる。
、あるいは遺伝子産物を所望の特定の形態で修飾およびプロセシングするものを
選択することができる。このようなタンパク質産物の修飾(例えばグリコシル化)
およびプロセシング(例えば切断)がそのタンパク質の機能に関して重要な場合が
ある。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングが確実に行わ
れるように、適当な細胞系または宿主系を選択することができる。哺乳動物の宿
主細胞としては、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、Held、COS、MDCK 、293、3T3、WI38等が挙げられる。
【００６５】 組換えタンパク質の長期間にわたる高収量の産生のために、安定した発現が好
ましい。例えば、上述のような配列を安定して発現する細胞系を製造することが
できる。ウイルスの複製起点を有する発現ベクターを用いるのではなく、適当な
発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネ ーター、ポリアデニル化部位等)により制御されるDNAと、選択マーカーとを用い
て宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAを導入した後、製造した細胞 を栄養培地中で1〜2日間増殖させ、次に選択培地に切り換える。組換えプラスミ
ド中の選択マーカーは、その選択に対する耐性を与えるとともに、細胞がそのプ
ラスミドを安定に細胞の染色体に組み込み、増殖して増殖巣を形成できることを
可能とする。この増殖巣をクローン化して細胞系に拡張することができる。この
方法を用いてその遺伝子産物を発現する細胞系を製造することができ、有利であ
る。このような人工的な細胞系は、その遺伝子産物の内在的活性に作用する化合
物のスクリーニングや評価のために特に有用であり得る。
ましい。例えば、上述のような配列を安定して発現する細胞系を製造することが
できる。ウイルスの複製起点を有する発現ベクターを用いるのではなく、適当な
発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネ ーター、ポリアデニル化部位等)により制御されるDNAと、選択マーカーとを用い
て宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAを導入した後、製造した細胞 を栄養培地中で1〜2日間増殖させ、次に選択培地に切り換える。組換えプラスミ
ド中の選択マーカーは、その選択に対する耐性を与えるとともに、細胞がそのプ
ラスミドを安定に細胞の染色体に組み込み、増殖して増殖巣を形成できることを
可能とする。この増殖巣をクローン化して細胞系に拡張することができる。この
方法を用いてその遺伝子産物を発現する細胞系を製造することができ、有利であ
る。このような人工的な細胞系は、その遺伝子産物の内在的活性に作用する化合
物のスクリーニングや評価のために特に有用であり得る。
【００６６】 融合タンパク質は、発現されるその融合タンパク質に特異的に結合する抗体ま
たは部分を利用することによって容易に精製することができる。例えば、Jankne
chtら[(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972]により記載された系により
、ヒト細胞系において発現された非変性融合タンパク質を容易に精製できる。こ
の系では、対象の遺伝子をワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングして
、その遺伝子のオープンリーディングフレームが6個のヒスチジン残基からなる アミノ末端タグに翻訳可能な形で融合するようにする。組換えワクシニアウイル
スが感染した細胞からの抽出物を、Ni2+ニトリロ酢酸-アガロースカラムにロー ドし、イミダゾール含有バッファーでヒスチジン標識タンパク質を選択的に溶出
させる。必要ならば、適当な酵素でヒスチジンタグを選択的に切断することがで
きる。
たは部分を利用することによって容易に精製することができる。例えば、Jankne
chtら[(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972]により記載された系により
、ヒト細胞系において発現された非変性融合タンパク質を容易に精製できる。こ
の系では、対象の遺伝子をワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングして
、その遺伝子のオープンリーディングフレームが6個のヒスチジン残基からなる アミノ末端タグに翻訳可能な形で融合するようにする。組換えワクシニアウイル
スが感染した細胞からの抽出物を、Ni2+ニトリロ酢酸-アガロースカラムにロー ドし、イミダゾール含有バッファーでヒスチジン標識タンパク質を選択的に溶出
させる。必要ならば、適当な酵素でヒスチジンタグを選択的に切断することがで
きる。
【００６７】 キメラタンパク質も当業者に知られた方法で得ることができる。この方法では
、所定のタンパク質をコードする遺伝子の部分を、異なる複数のタンパク質をコ
ードする1種以上の遺伝子に由来する1以上の部分にスプライシングする。キメラ
ポリペプチドは、異なる種類のタンパク質に由来する異なる部分を有する分子で
ある。例えば、キメラタンパク質はHVEMのドメインとLTβRの他のドメインとを 有し得る。
、所定のタンパク質をコードする遺伝子の部分を、異なる複数のタンパク質をコ
ードする1種以上の遺伝子に由来する1以上の部分にスプライシングする。キメラ
ポリペプチドは、異なる種類のタンパク質に由来する異なる部分を有する分子で
ある。例えば、キメラタンパク質はHVEMのドメインとLTβRの他のドメインとを 有し得る。
【００６８】 本発明は、受容体ポリペプチドHVEMを発現する細胞をHVEM結合物質に接触させ
ることによってHVEM媒介型細胞応答をモジュレートする方法を提供する。あるい
は、HVEMのリガンドをリガンド結合物質に接触させることによってHVEM媒介型細
胞応答をモジュレートする。そのようなリガンドとしては、p30、LTα、gD等が 挙げられる。一般にp30は細胞の表面で発現され、LTαは分泌され、gDはHSVビリ
オン上またはHSVが感染した細胞の表面上に発現される。本明細書中で使用する 用語「細胞応答」は同様に、細胞の活性化または細胞によるHSVのインターナリ ゼーションをいう。本発明は、LTβRを発現する細胞またはLTβRリガンドp30を 発現する細胞を、HVEMまたはp30の何れかに結合する結合物質と接触させること によってLTβR媒介型細胞応答をモジュレートする方法も提供する。
ることによってHVEM媒介型細胞応答をモジュレートする方法を提供する。あるい
は、HVEMのリガンドをリガンド結合物質に接触させることによってHVEM媒介型細
胞応答をモジュレートする。そのようなリガンドとしては、p30、LTα、gD等が 挙げられる。一般にp30は細胞の表面で発現され、LTαは分泌され、gDはHSVビリ
オン上またはHSVが感染した細胞の表面上に発現される。本明細書中で使用する 用語「細胞応答」は同様に、細胞の活性化または細胞によるHSVのインターナリ ゼーションをいう。本発明は、LTβRを発現する細胞またはLTβRリガンドp30を 発現する細胞を、HVEMまたはp30の何れかに結合する結合物質と接触させること によってLTβR媒介型細胞応答をモジュレートする方法も提供する。
【００６９】 本明細書において使用する用語「接触」は、受容体またはリガンドを、受容体
をモジュレートするのに有効な量の結合物質に露出することを意味し、これによ
り結合物質がリガンドと受容体との相互作用により開始される細胞応答を有効に
モジュレートし得るものである。モジュレーションにより細胞応答が阻害される
か、活性化される。これらの特定の受容体-リガンドペアに対する特定の結合物 質の相反するいずれかの特性は、上述したスクリーニングアッセイを用いて前も
って調べておくことができる。
をモジュレートするのに有効な量の結合物質に露出することを意味し、これによ
り結合物質がリガンドと受容体との相互作用により開始される細胞応答を有効に
モジュレートし得るものである。モジュレーションにより細胞応答が阻害される
か、活性化される。これらの特定の受容体-リガンドペアに対する特定の結合物 質の相反するいずれかの特性は、上述したスクリーニングアッセイを用いて前も
って調べておくことができる。
【００７０】 受容体結合物質に関し、HVEM結合物質としては、可溶性gD、可溶性p30、また はLTαのペプチドフラグメント、好ましくは天然のLTαのN末端から108番目の位
置に対応する位置にアミノ酸Tyrを有するペプチドフラグメント等が挙げられる 。LTβR結合物質としては可溶性p30がある。
置に対応する位置にアミノ酸Tyrを有するペプチドフラグメント等が挙げられる 。LTβR結合物質としては可溶性p30がある。
【００７１】 リガンド結合物質に関し、p30結合物質としては、可溶性HVEM、可溶性LTβR、
p30に特異的に結合する抗体等が挙げられる。LTα結合物質としては、可溶性HVE
Mがある。
p30に特異的に結合する抗体等が挙げられる。LTα結合物質としては、可溶性HVE
Mがある。
【００７２】 接触はin vitroで行ってもよく、例えばHVEMリガンド(p30、LTαまたはgD)ま たはLTβRリガンド、p30によって活性化されたHVEMまたはLTβRを発現する細胞(
例えばリンパ球)の培養物に結合物質を加えることにより行うことができる。ま た、結合物質を、例えばHSVビリオンの表面またはHSVが感染した細胞の表面上の
gDに曝されたHVEM発現細胞の培養物に加えてもよい。結合物質のこれらの細胞応
答をモジュレートする能力を、上述したスクリーニングアッセイを用いて前もっ
て調べておくことができる。この結合物質は、単離したポリペプチドとして、あ
るいは結合物質をコードする核酸分子を含む発現ベクターでトランスフェクトさ
れた細胞として添加し得る。これらのin vitro法において、結合物質の「受容体
をモジュレートするために有効な量」とは、細胞の活性化またはHSV感染を、20%
以上、好ましくは50%以上、より好ましくは80%以上、最も好ましくは95%以上モ ジュレートするために必要な量である。
例えばリンパ球)の培養物に結合物質を加えることにより行うことができる。ま た、結合物質を、例えばHSVビリオンの表面またはHSVが感染した細胞の表面上の
gDに曝されたHVEM発現細胞の培養物に加えてもよい。結合物質のこれらの細胞応
答をモジュレートする能力を、上述したスクリーニングアッセイを用いて前もっ
て調べておくことができる。この結合物質は、単離したポリペプチドとして、あ
るいは結合物質をコードする核酸分子を含む発現ベクターでトランスフェクトさ
れた細胞として添加し得る。これらのin vitro法において、結合物質の「受容体
をモジュレートするために有効な量」とは、細胞の活性化またはHSV感染を、20%
以上、好ましくは50%以上、より好ましくは80%以上、最も好ましくは95%以上モ ジュレートするために必要な量である。
【００７３】 接触は被験体中においてin vivoで行ってもよい。被験体は、例えば慢性関節 リウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスや
重症筋無力症のような自己免疫疾患、リンパ球(T細胞またはB細胞)の悪性腫瘍、
HSV感染症、HSV以外の生物の感染症、または免疫抑制状態を示す哺乳動物、好ま
しくはヒトとすることができる。自己免疫疾患やリンパ球の悪性腫瘍の患者にお
いて、HVEM-p30またはLTβR-p30媒介型細胞応答を阻害することは、(慢性関節リ
ウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重
症筋無力症、T細胞の悪性腫瘍の場合におけるように)T細胞増殖を防止する点、 および(全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、B細胞の悪性腫瘍の場合におけ
るように)B細胞増殖を防止する点において有益である。HVEM-gD媒介型細胞応答(
すなわちHSVインターナリゼーション)を阻害することは、細胞外空間に存在する
gD発現HSVビリオンのインターナリゼーションにより媒介されるウイルスの拡散 、あるいはその表面上でgDを発現する、HSVが感染した細胞からのウイルスの拡 散をそれが防止するという点で、HSV感染症の被験体の治療となる可能性がある 。HVEM-p30またはLTβR-p30媒介型細胞応答を刺激することは、T細胞とB細胞の 両方の増殖が刺激されるという点で、HSV以外の感染症の被験体の治療、もしく は免疫抑制状態の被験体(例えば、リンパ球悪性腫瘍以外の癌に対する放射線療 法および／または化学療法を受けている患者)の治療、またはAIDSの患者の治療 に有用である。通常、HSV感染症の被験体に対してHVEM-p30媒介型細胞応答を刺 激する結合物質を用いるのは避ける。そのような物質がHVEM-gD細胞応答をも促 進してそれによりHSVウイルスの拡散を促進するからである。しかし、関連する 結合物質のこの活性は上述したスクリーニングアッセイを用いて前もって調べて
おくことができる。同様に、これらの刺激性結合物質は、腫瘍細胞の成長を促進
し得ることから、リンパ球の悪性腫瘍の場合は用いない。
重症筋無力症のような自己免疫疾患、リンパ球(T細胞またはB細胞)の悪性腫瘍、
HSV感染症、HSV以外の生物の感染症、または免疫抑制状態を示す哺乳動物、好ま
しくはヒトとすることができる。自己免疫疾患やリンパ球の悪性腫瘍の患者にお
いて、HVEM-p30またはLTβR-p30媒介型細胞応答を阻害することは、(慢性関節リ
ウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重
症筋無力症、T細胞の悪性腫瘍の場合におけるように)T細胞増殖を防止する点、 および(全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、B細胞の悪性腫瘍の場合におけ
るように)B細胞増殖を防止する点において有益である。HVEM-gD媒介型細胞応答(
すなわちHSVインターナリゼーション)を阻害することは、細胞外空間に存在する
gD発現HSVビリオンのインターナリゼーションにより媒介されるウイルスの拡散 、あるいはその表面上でgDを発現する、HSVが感染した細胞からのウイルスの拡 散をそれが防止するという点で、HSV感染症の被験体の治療となる可能性がある 。HVEM-p30またはLTβR-p30媒介型細胞応答を刺激することは、T細胞とB細胞の 両方の増殖が刺激されるという点で、HSV以外の感染症の被験体の治療、もしく は免疫抑制状態の被験体(例えば、リンパ球悪性腫瘍以外の癌に対する放射線療 法および／または化学療法を受けている患者)の治療、またはAIDSの患者の治療 に有用である。通常、HSV感染症の被験体に対してHVEM-p30媒介型細胞応答を刺 激する結合物質を用いるのは避ける。そのような物質がHVEM-gD細胞応答をも促 進してそれによりHSVウイルスの拡散を促進するからである。しかし、関連する 結合物質のこの活性は上述したスクリーニングアッセイを用いて前もって調べて
おくことができる。同様に、これらの刺激性結合物質は、腫瘍細胞の成長を促進
し得ることから、リンパ球の悪性腫瘍の場合は用いない。
【００７４】 in vivoでの細胞応答のモジュレーションのために用いられる結合物質として は、天然形態のHVEM、LTβR、p30、gD、LTα等が挙げられる。これらの結合物質
は上述の方法によって製造できる。また、p30に対する抗体も含まれる。LTαに 由来し、HVEM−LTα相互作用をモジュレートするペプチドも用いられる。これら
のペプチドは、205個未満のアミノ酸を含み、好ましくは100個未満、より好まし
くは50個未満、最も好ましくは20個未満のアミノ酸を含む。例えば、これらのペ
プチドは、5個、8個、12個、15個、または18個のアミノ酸を有する。これらのペ
プチドは、好ましくは、天然のLTαのN末端から108番目のアミノ酸残基に対応す
る位置にTyr残基、またはその保存的置換を有する。
は上述の方法によって製造できる。また、p30に対する抗体も含まれる。LTαに 由来し、HVEM−LTα相互作用をモジュレートするペプチドも用いられる。これら
のペプチドは、205個未満のアミノ酸を含み、好ましくは100個未満、より好まし
くは50個未満、最も好ましくは20個未満のアミノ酸を含む。例えば、これらのペ
プチドは、5個、8個、12個、15個、または18個のアミノ酸を有する。これらのペ
プチドは、好ましくは、天然のLTαのN末端から108番目のアミノ酸残基に対応す
る位置にTyr残基、またはその保存的置換を有する。
【００７５】 また、結合物質として、上述のペプチドのペプチド模倣体も挙げられる。ペプ
チド模倣体化合物は、選択されたペプチドの三次元構造をベースとした三次元構
造(即ち「ペプチドモチーフ」)を有する合成化合物である。このペプチドモチー
フは、そのペプチド模倣体が由来するペプチドの活性と同程度かそれ以上の細胞
応答モジュレーション活性を有するペプチド模倣体化合物を提供するものである
。ペプチド模倣体化合物は、例えばより高いアフィニティおよび／またはアビデ
ィティや、より長い生物学的半減期のようなその治療上の用途を増強する追加の
特性を有し得る。本発明のペプチド模倣体は、通常バックボーンを有し、このバ
ックボーンは部分的にまたは完全に非ペプチドであるが、そのペプチド模倣体が
ベースとするペプチドに存在するアミノ酸残基の側鎖と同一の側鎖を有する。プ
ロテアーゼ耐性のペプチド模倣体の構築においてペプチド結合の代替として、い
くつかのタイプの化学結合、例えば、エステル結合、チオエステル結合、チオア
ミド結合、レトロアミド結合、還元カルボニル結合、ジメチレン結合、ケトメチ
レン結合等が一般に有用であることは当分野で知られている。
チド模倣体化合物は、選択されたペプチドの三次元構造をベースとした三次元構
造(即ち「ペプチドモチーフ」)を有する合成化合物である。このペプチドモチー
フは、そのペプチド模倣体が由来するペプチドの活性と同程度かそれ以上の細胞
応答モジュレーション活性を有するペプチド模倣体化合物を提供するものである
。ペプチド模倣体化合物は、例えばより高いアフィニティおよび／またはアビデ
ィティや、より長い生物学的半減期のようなその治療上の用途を増強する追加の
特性を有し得る。本発明のペプチド模倣体は、通常バックボーンを有し、このバ
ックボーンは部分的にまたは完全に非ペプチドであるが、そのペプチド模倣体が
ベースとするペプチドに存在するアミノ酸残基の側鎖と同一の側鎖を有する。プ
ロテアーゼ耐性のペプチド模倣体の構築においてペプチド結合の代替として、い
くつかのタイプの化学結合、例えば、エステル結合、チオエステル結合、チオア
ミド結合、レトロアミド結合、還元カルボニル結合、ジメチレン結合、ケトメチ
レン結合等が一般に有用であることは当分野で知られている。
【００７６】 対象のポリペプチドまたはペプチドのin vivoでの残存性を高めるために、ポ リペプチドおよびペプチド結合物質を、そのアミノ末端およびカルボキシ末端の
両方あるいは何れか一方にブロッキング物質を付加して修飾することができる。
この修飾は、ペプチドの末端がプロテアーゼにより分解される(「削られる」)傾
向がある場合に有用であり得る。このようなブロッキング物質としては、限定す
るものではないが、投与されるポリペプチドまたはペプチドのアミノ末端および
／またはカルボキシ末端残基に結合し得る追加の関連ペプチド配列または関連の
無いペプチド配列等が挙げられる。この修飾は、ペプチドまたはポリペプチドの
合成の際に化学的に行うこともでき、また組換えDNA技術によって行うこともで きる。あるいは、当業者に知られるピログルタミン酸またはその他の分子のよう
なブロッキング物質を、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の残基、ある
いは異なる部分により置換したアミノ末端のアミノ基またはカルボキシ末端のカ
ルボキシル基に付加することができる。同様に、この結合物質を投与の前に医薬
上許容される「担体」タンパク質に共有結合または非共有結合によって結合する
ことができる。
両方あるいは何れか一方にブロッキング物質を付加して修飾することができる。
この修飾は、ペプチドの末端がプロテアーゼにより分解される(「削られる」)傾
向がある場合に有用であり得る。このようなブロッキング物質としては、限定す
るものではないが、投与されるポリペプチドまたはペプチドのアミノ末端および
／またはカルボキシ末端残基に結合し得る追加の関連ペプチド配列または関連の
無いペプチド配列等が挙げられる。この修飾は、ペプチドまたはポリペプチドの
合成の際に化学的に行うこともでき、また組換えDNA技術によって行うこともで きる。あるいは、当業者に知られるピログルタミン酸またはその他の分子のよう
なブロッキング物質を、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の残基、ある
いは異なる部分により置換したアミノ末端のアミノ基またはカルボキシ末端のカ
ルボキシル基に付加することができる。同様に、この結合物質を投与の前に医薬
上許容される「担体」タンパク質に共有結合または非共有結合によって結合する
ことができる。
【００７７】 in vivo送達では、結合物質自体、結合物質をコードする核酸、結合物質をコ ードする発現ベクター、またはそのようなベクターによりトランスフェクトもし
くは形質導入した細胞の何れかを被験体に投与する。
くは形質導入した細胞の何れかを被験体に投与する。
【００７８】 結合物質は、下記のようなヒト患者への送達と実質的に同一の技術を用いて哺
乳動物の細胞に送達することができる。適当な哺乳動物の例としては、限定する
ものではないが、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ等が挙げられる。
乳動物の細胞に送達することができる。適当な哺乳動物の例としては、限定する
ものではないが、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ等が挙げられる。
【００７９】 結合物質は、未修飾の状態で、例えば生理食塩水のような適当な生理学的溶液
に溶解して患者の細胞に送達し得る。当然、これらのペプチドが対象の組織およ
び細胞の型を選択的に標的とすることが望ましい。これはそのようなペプチドを
、例えば局所注射や移植によって患部の器官または組織に直接接触させることに
よって達成することができる。従って、慢性関節リウマチやインスリン依存性糖
尿病のような自己免疫疾患では、そのようなペプチドをそれぞれの患部の関節や
膵臓に、あるいは好ましくは活性自己免疫応答が生じている排出性リンパ系組織
に直接導入することができる。
に溶解して患者の細胞に送達し得る。当然、これらのペプチドが対象の組織およ
び細胞の型を選択的に標的とすることが望ましい。これはそのようなペプチドを
、例えば局所注射や移植によって患部の器官または組織に直接接触させることに
よって達成することができる。従って、慢性関節リウマチやインスリン依存性糖
尿病のような自己免疫疾患では、そのようなペプチドをそれぞれの患部の関節や
膵臓に、あるいは好ましくは活性自己免疫応答が生じている排出性リンパ系組織
に直接導入することができる。
【００８０】 あるいは、結合物質を、対象の細胞(例えばT細胞またはB細胞)上の受容体に対
するリガンド、またはこれらの細胞が発現した細胞表面のマーカーに対する抗体
を封入したリポソームに入れて送達してもよい。これによりCD4 T細胞表面マー カーに特異的な抗体は、抗CD4抗体および対象の結合物質の両方を含むリポソー ムをCD4+ T細胞に誘導し得る。この手法は、自己免疫疾患およびHSV感染症のい ずれにも用いることができる。優勢な病原性T細胞クローンにより発現されるT細
胞受容体(TCR)が特定されている自己免疫疾患では、対象のTCR成分(例えばVβ) に特異的な抗体を用いることができる。後者の方法は、病原性のエフェクター細
胞が特異的に阻害の標的となるが、免疫系全体および標的の器官の細胞が損なわ
れない理想的な免疫療法となる。
するリガンド、またはこれらの細胞が発現した細胞表面のマーカーに対する抗体
を封入したリポソームに入れて送達してもよい。これによりCD4 T細胞表面マー カーに特異的な抗体は、抗CD4抗体および対象の結合物質の両方を含むリポソー ムをCD4+ T細胞に誘導し得る。この手法は、自己免疫疾患およびHSV感染症のい ずれにも用いることができる。優勢な病原性T細胞クローンにより発現されるT細
胞受容体(TCR)が特定されている自己免疫疾患では、対象のTCR成分(例えばVβ) に特異的な抗体を用いることができる。後者の方法は、病原性のエフェクター細
胞が特異的に阻害の標的となるが、免疫系全体および標的の器官の細胞が損なわ
れない理想的な免疫療法となる。
【００８１】 リンパ腫や白血病の患者では、抗増殖性の結合物質を癌細胞に誘導するのが好
ましい。このようなペプチドは、例えば、腫瘍を切除する外科手術の後に残存し
た腫瘍細胞の増殖を阻害するために、リンパ腫の腫瘍部位周囲の組織に直接注射
することができる。外科手術の代わりに、結合物質を腫瘍にin situで注射する ことによって腫瘍を治療することができる。上述したリポソームを用いる方法も
利用することができる。この場合、腫瘍特異性抗原(TSA)または腫瘍関連抗原(TA
A)に特異的な抗体を利用する。
ましい。このようなペプチドは、例えば、腫瘍を切除する外科手術の後に残存し
た腫瘍細胞の増殖を阻害するために、リンパ腫の腫瘍部位周囲の組織に直接注射
することができる。外科手術の代わりに、結合物質を腫瘍にin situで注射する ことによって腫瘍を治療することができる。上述したリポソームを用いる方法も
利用することができる。この場合、腫瘍特異性抗原(TSA)または腫瘍関連抗原(TA
A)に特異的な抗体を利用する。
【００８２】 特定の患者に対する投与量は、投与される具体的な化合物、投与の時期および
経路、および同時に投与される他の薬物に加えて、多くの要因によって決定され
ることは医学の分野では周知である。本発明の結合物質の投与量は様々であるが
、静脈内投与の場合は血液量に対して約0.01〜10 mg/mlとし得る。投与経路およ
び投与量は、薬理学者および外科医には周知である。投与経路としては、上述し
たものに加えて、限定するものではないが、腹腔内投与、筋内投与、肺内投与、
経粘膜投与、皮下投与、静脈内投与等が挙げられる。
経路、および同時に投与される他の薬物に加えて、多くの要因によって決定され
ることは医学の分野では周知である。本発明の結合物質の投与量は様々であるが
、静脈内投与の場合は血液量に対して約0.01〜10 mg/mlとし得る。投与経路およ
び投与量は、薬理学者および外科医には周知である。投与経路としては、上述し
たものに加えて、限定するものではないが、腹腔内投与、筋内投与、肺内投与、
経粘膜投与、皮下投与、静脈内投与等が挙げられる。
【００８３】 in vivo遺伝子療法では、遺伝子構築物の患者への直接の送達、好ましくは目 的の細胞や組織をその遺伝子構築物の標的にすることが必要である。例えば、原
発腫瘍の外科手術による除去の後、抗増殖性結合物質をコードするレトロウイル
スベクターを含む組成物で腫瘍の周辺を処置することにより、残存細胞を標的と
することができる。あるいは、外科手術の代わりにベクターを直接腫瘍にin sit
uで注射することにより、原発腫瘍を治療することができる。原発腫瘍部位から 遠位にある悪性細胞には、ベクターの静脈内送達によって到達させることができ
る。同様に、ベクターを直接注射することにより、自己免疫の攻撃を受けている
組織を標的にすることができる。例えば、増殖当初の細胞を安定にトランスフェ
クトするレトロウイルスを用いることによって腫瘍細胞または活性化リンパ球を
標的にすることができる。
発腫瘍の外科手術による除去の後、抗増殖性結合物質をコードするレトロウイル
スベクターを含む組成物で腫瘍の周辺を処置することにより、残存細胞を標的と
することができる。あるいは、外科手術の代わりにベクターを直接腫瘍にin sit
uで注射することにより、原発腫瘍を治療することができる。原発腫瘍部位から 遠位にある悪性細胞には、ベクターの静脈内送達によって到達させることができ
る。同様に、ベクターを直接注射することにより、自己免疫の攻撃を受けている
組織を標的にすることができる。例えば、増殖当初の細胞を安定にトランスフェ
クトするレトロウイルスを用いることによって腫瘍細胞または活性化リンパ球を
標的にすることができる。
【００８４】 静電的な力または共有結合の力によってポリL-リシンに付着させたプラスミド
またはその他のベクターからなる分子コンジュゲートを用いることにより、組織
特異的な標的化を行うこともできる。ポリL-リシンは、腫瘍細胞上の受容体に結
合し得るリガンドに結合する[Cristianoら、(1995) J. Mol. Med 73:479]。同様
に、上述した種類の腫瘍および細胞に特異的な抗体をベクターに結合させること
により、そのベクターをリンパ系腫瘍やTリンパ球のような細胞に標的化するこ とができる。後者は自己免疫疾患やHSV感染症の場合に有用である。比較的腫瘍 特異的な発現を誘導するプロモーターを用いて、さらに高いレベルの標的化を達
成することができる。自己免疫疾患の患者または移植患者において使用するため
の組織特異的プロモーターとしては、例えば、誘導性のIL-2[Thompsonら、(1992
) Mol. Cell. Biol. 12: 1043]、IL-4[Toddら、(1993) J. Exp. Med. 177: 1663
]、およびγ-インターフェロン[Penixら、(1993) J. Exp. Med. 178: 483]T細胞
標的プロモーター等が挙げられる。そのような誘導性プロモーターは、発現が活
性化T細胞で選択的に起こる点で極めて有益である。この活性化T細胞の集団には
エフェクター細胞が含まれ、これは自己免疫疾患の患者において選択的に阻害す
るものであり、理想的な免疫療法の形態である。
またはその他のベクターからなる分子コンジュゲートを用いることにより、組織
特異的な標的化を行うこともできる。ポリL-リシンは、腫瘍細胞上の受容体に結
合し得るリガンドに結合する[Cristianoら、(1995) J. Mol. Med 73:479]。同様
に、上述した種類の腫瘍および細胞に特異的な抗体をベクターに結合させること
により、そのベクターをリンパ系腫瘍やTリンパ球のような細胞に標的化するこ とができる。後者は自己免疫疾患やHSV感染症の場合に有用である。比較的腫瘍 特異的な発現を誘導するプロモーターを用いて、さらに高いレベルの標的化を達
成することができる。自己免疫疾患の患者または移植患者において使用するため
の組織特異的プロモーターとしては、例えば、誘導性のIL-2[Thompsonら、(1992
) Mol. Cell. Biol. 12: 1043]、IL-4[Toddら、(1993) J. Exp. Med. 177: 1663
]、およびγ-インターフェロン[Penixら、(1993) J. Exp. Med. 178: 483]T細胞
標的プロモーター等が挙げられる。そのような誘導性プロモーターは、発現が活
性化T細胞で選択的に起こる点で極めて有益である。この活性化T細胞の集団には
エフェクター細胞が含まれ、これは自己免疫疾患の患者において選択的に阻害す
るものであり、理想的な免疫療法の形態である。
【００８５】 ベクターは、上述のように単独で、もしくは細胞特異的抗体とともにリポソー
ムまたは他の送達用ビヒクルに組み入れて送達することもできる。
ムまたは他の送達用ビヒクルに組み入れて送達することもできる。
【００８６】 使用する結合物質が通常は細胞膜に結合する場合は(HVEM、LTβR、p30またはg
D)、結合物質の膜貫通ドメインをコードする核酸の領域は、発現ベクターに含め
る核酸から除去する。
D)、結合物質の膜貫通ドメインをコードする核酸の領域は、発現ベクターに含め
る核酸から除去する。
【００８７】 DNAまたはトランスフェクトされた細胞は、医薬上許容される担体に含めて投 与することができる。医薬上許容される担体は、例えば生理食塩水のような、ヒ
トに投与するのに適した生物学的に適合するビヒクルである。治療上有効な量は
、処置を受けた動物において所望の医学的な結果が得られるような本発明のDNA の量である。医学の分野で周知のように、特定の患者に対する投与量は、患者の
体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時期および投与経
路、全般的な健康状態、同時に投与される他の薬剤等の多くの要因に依存する。
投与量は様々であるが、DNAの静脈内投与のための好ましい投与量は、約106〜10 12 コピーのDNA分子である。この用量を、必要に応じて繰り返し投与することが できる。
トに投与するのに適した生物学的に適合するビヒクルである。治療上有効な量は
、処置を受けた動物において所望の医学的な結果が得られるような本発明のDNA の量である。医学の分野で周知のように、特定の患者に対する投与量は、患者の
体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時期および投与経
路、全般的な健康状態、同時に投与される他の薬剤等の多くの要因に依存する。
投与量は様々であるが、DNAの静脈内投与のための好ましい投与量は、約106〜10 12 コピーのDNA分子である。この用量を、必要に応じて繰り返し投与することが できる。
【００８８】 以下の実施例は、本発明を例示することを意図したものであり、本発明を限定
することを意図したものではない。
することを意図したものではない。
【００８９】 〔実施例〕材料 ヒトIgG1のFc領域およびFas:Fcのリガンド結合ドメイン[Brunnerら、(1995) N
ature 373:441]、TNFR60[Croweら、(1994) J. Immunol. Methods 168:79]および
ヒトLTβR:Fc[Croweら、(1994) Science 264:707]で形成した二価のキメラタン パク質の構築、発現および精製についてはこれまでに記載されている。HVEMの細
胞外領域は、1-K184をコードするpBEC 10 DNAからのTaq DNAポリメラーゼ増幅配
列を使用するPCR法により、順方向プライマー5'-CGGAGATCTGA GTTCATCCTGCTAGCT
GG-3'(配列番号1)および逆方向プライマー5'-ATAGGA TCCCTTGGTCTGGTGCTGACATTC
C-3'(配列番号2)を使用して生成した。増幅したHVEM産物を、ヒトFc IgG1を含む
バキュロウイルスベクターpVL1392 (Pharmingen)にインフレームで結合した。ウ
サギIgG1のFc領域を有するHVEM:Fcの同様な構築物をCHO細胞内で作製し、精製し
、免疫原として使用してウサギ抗HVEM抗体を生成した。LTβR:Fcは、Taq DNAポ リメラーゼを使用するPCR法により、順方向プライマー5'-GACGTCAGATCTTCCCAC C
TTTCCTCCTA-3'(配列番号3)および逆方向プライマー5'-GAACAGAGATCTC ATTGCTCCT
GGCTCTG-3'(配列番号4)を使用して、前記細胞外ドメインのアミノ酸残基1〜Met2
21をコードするマウスLTβR(mLTβR)DNA断片[Forceら、(1996) J. Immunol. 199
5. 1 155:5280]から構築した。LTαおよびLTαTyr108Pheは、記載されたように 組換えバキュロウイルスを用いて昆虫の細胞で作製した[Croweら、(1994) J. Im
munol. Methods 168:79]。可溶性の組換えLTα1β2 [Browningら、(1996)、前記
に引用]、TNF [BrowningおよびRibolini (1989) J. Immunol. 143:1859]、およ びLTα(BF7)に対するモノクローナル抗体、およびLTβ(C37、B9およびB27) [Bro
wningら、(1995)、前記に引用]は、Jeffrey Browning (Biogen, Inc)の好意によ
り譲り受けたものである。免疫沈降性の抗LTα抗体(クローン9B9)は、Boehringe
r Mannheimから入手した。抗CD3 (OKT3)は、BALB/cマウスの腹水で生成し、1 μ
g/mlのタンパク質の量で使用した。精製した組換えHSV gD-1タンパク質および変
異体は、これまでに詳細に説明されているように[Nicolaら、(1996) J. Virol. 6 :3815]、バキュロウイルスで生成した。FITC-抗-CD4およびCD8抗体は、Becton-
Dickensonから入手した。
ature 373:441]、TNFR60[Croweら、(1994) J. Immunol. Methods 168:79]および
ヒトLTβR:Fc[Croweら、(1994) Science 264:707]で形成した二価のキメラタン パク質の構築、発現および精製についてはこれまでに記載されている。HVEMの細
胞外領域は、1-K184をコードするpBEC 10 DNAからのTaq DNAポリメラーゼ増幅配
列を使用するPCR法により、順方向プライマー5'-CGGAGATCTGA GTTCATCCTGCTAGCT
GG-3'(配列番号1)および逆方向プライマー5'-ATAGGA TCCCTTGGTCTGGTGCTGACATTC
C-3'(配列番号2)を使用して生成した。増幅したHVEM産物を、ヒトFc IgG1を含む
バキュロウイルスベクターpVL1392 (Pharmingen)にインフレームで結合した。ウ
サギIgG1のFc領域を有するHVEM:Fcの同様な構築物をCHO細胞内で作製し、精製し
、免疫原として使用してウサギ抗HVEM抗体を生成した。LTβR:Fcは、Taq DNAポ リメラーゼを使用するPCR法により、順方向プライマー5'-GACGTCAGATCTTCCCAC C
TTTCCTCCTA-3'(配列番号3)および逆方向プライマー5'-GAACAGAGATCTC ATTGCTCCT
GGCTCTG-3'(配列番号4)を使用して、前記細胞外ドメインのアミノ酸残基1〜Met2
21をコードするマウスLTβR(mLTβR)DNA断片[Forceら、(1996) J. Immunol. 199
5. 1 155:5280]から構築した。LTαおよびLTαTyr108Pheは、記載されたように 組換えバキュロウイルスを用いて昆虫の細胞で作製した[Croweら、(1994) J. Im
munol. Methods 168:79]。可溶性の組換えLTα1β2 [Browningら、(1996)、前記
に引用]、TNF [BrowningおよびRibolini (1989) J. Immunol. 143:1859]、およ びLTα(BF7)に対するモノクローナル抗体、およびLTβ(C37、B9およびB27) [Bro
wningら、(1995)、前記に引用]は、Jeffrey Browning (Biogen, Inc)の好意によ
り譲り受けたものである。免疫沈降性の抗LTα抗体(クローン9B9)は、Boehringe
r Mannheimから入手した。抗CD3 (OKT3)は、BALB/cマウスの腹水で生成し、1 μ
g/mlのタンパク質の量で使用した。精製した組換えHSV gD-1タンパク質および変
異体は、これまでに詳細に説明されているように[Nicolaら、(1996) J. Virol. 6 :3815]、バキュロウイルスで生成した。FITC-抗-CD4およびCD8抗体は、Becton-
Dickensonから入手した。
【００９０】実施例１ T細胞上でのHVEMリガンドの発現 方法 HVEMのII.23.D7細胞への結合 II-23.D7細胞系は、ヒトCD4+ T細胞ハイブリドーマであり[Wareら、(1986) Ly
mphokine Res. 5:313]、10%ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質を含むRPMI1640培
地に維持する。II-23.D7細胞は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)(100
ng/ml)、またはPMA(100 ng/ml)およびイオノマイシン(1μg/ml)を用いて37℃で4
時間活性化した。この細胞を洗浄し、5 μg/mlのHVEM:Fc、LTβR:FcまたはヒトI
gGを含むハンクス液(HBSS)(10%ウシ胎児血清および0.1% NaN3を加えたもの)中で
4℃で30分間インキュベートし、次にフィコエリトリンとコンジュゲートしたヤ ギ抗ヒトIgG(抗huIgG-PE)で染色した。染色された細胞をフローサイトメトリー(
FACSCaliber, Becton-Dickenson)で解析した。各ヒストグラムは104個を示す。
mphokine Res. 5:313]、10%ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質を含むRPMI1640培
地に維持する。II-23.D7細胞は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)(100
ng/ml)、またはPMA(100 ng/ml)およびイオノマイシン(1μg/ml)を用いて37℃で4
時間活性化した。この細胞を洗浄し、5 μg/mlのHVEM:Fc、LTβR:FcまたはヒトI
gGを含むハンクス液(HBSS)(10%ウシ胎児血清および0.1% NaN3を加えたもの)中で
4℃で30分間インキュベートし、次にフィコエリトリンとコンジュゲートしたヤ ギ抗ヒトIgG(抗huIgG-PE)で染色した。染色された細胞をフローサイトメトリー(
FACSCaliber, Becton-Dickenson)で解析した。各ヒストグラムは104個を示す。
【００９１】 HVEMの正常なヒトT細胞への結合 Ficoll Hypaqueにより正常なドナーから得た末梢血の単核細胞をIL-2を含む培
地において抗CD3抗体で5日間活性化した。細胞を、PMAまたはPMAおよびイオノマ
イシンで4時間再刺激し、次にこの細胞をFITC-CD4またはFITC-CD8および上述の 抗huIgG-PEで検出されるHVEM:Fcで二重に染色した。補正したFITC蛍光を用いて 、CD4およびCD8 T細胞サブ集団を選択した。
地において抗CD3抗体で5日間活性化した。細胞を、PMAまたはPMAおよびイオノマ
イシンで4時間再刺激し、次にこの細胞をFITC-CD4またはFITC-CD8および上述の 抗huIgG-PEで検出されるHVEM:Fcで二重に染色した。補正したFITC蛍光を用いて 、CD4およびCD8 T細胞サブ集団を選択した。
【００９２】 受容体への結合 段階的な濃度のHVEM:Fcまたは対照のIgGを上記の活性化されたII-23.D7細胞と
インキュベートして受容体への結合を測定した。受容体への結合は、蛍光の強度
＝(平均蛍光チャネル)(陽性の蛍光事象数(％))を計算することによって求めた。
陽性の事象とは、正常なIgGの値の98%を越える蛍光値を有するものである。比蛍
光強度は、対照IgGの値を差し引いた蛍光強度値を示す。
インキュベートして受容体への結合を測定した。受容体への結合は、蛍光の強度
＝(平均蛍光チャネル)(陽性の蛍光事象数(％))を計算することによって求めた。
陽性の事象とは、正常なIgGの値の98%を越える蛍光値を有するものである。比蛍
光強度は、対照IgGの値を差し引いた蛍光強度値を示す。
【００９３】結果 HVEMに対する推定上のリガンドを試験するために、HVEMの細胞外ドメインおよ
びヒトIgGのFc領域を含む融合タンパク質(HVEM:Fc)を構築した。PMA単独ではな く、カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、およびPMAによって活性化した 後のヒトCD4+ T細胞ハイブリドーマ、II.23.D7 [Wareら、(1986)、前記に引用] に結合したHVEM:Fcの比結合をフローサイトメトリーで検出した(図1A)。ヒト末 梢血由来のTリンパ球についてのHVEM:Fcの比結合も検出した(図1B)。これらの所
見は、悪性のヒトT細胞と正常なヒトT細胞の両方がHVEMに対する細胞表面リガン
ドを発現したことを示す。HVEM:FcのII.23.D7への半値最大結合は、約20 nMで達
成された(図1C)。またこのII.23.D7細胞系は、PMAでの誘導によってもLTαおよ びβおよびTNFを発現する[Wareら、(1992) J. Immunol. 149:3881]。
びヒトIgGのFc領域を含む融合タンパク質(HVEM:Fc)を構築した。PMA単独ではな く、カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、およびPMAによって活性化した 後のヒトCD4+ T細胞ハイブリドーマ、II.23.D7 [Wareら、(1986)、前記に引用] に結合したHVEM:Fcの比結合をフローサイトメトリーで検出した(図1A)。ヒト末 梢血由来のTリンパ球についてのHVEM:Fcの比結合も検出した(図1B)。これらの所
見は、悪性のヒトT細胞と正常なヒトT細胞の両方がHVEMに対する細胞表面リガン
ドを発現したことを示す。HVEM:FcのII.23.D7への半値最大結合は、約20 nMで達
成された(図1C)。またこのII.23.D7細胞系は、PMAでの誘導によってもLTαおよ びβおよびTNFを発現する[Wareら、(1992) J. Immunol. 149:3881]。
【００９４】実施例２ HVEMリガンドの結合特性 方法 LTβR:Fcによる結合の競合 活性化II-23.D7細胞(実施例1に記載のようにPMAおよびイオノマイシンで活性 化)を、LTβR:FcまたはTNFR60:Fc (100 μg/ml)とともに4℃で30分間プレインキ
ュベートした。次にHVEM:Fc-ウサギ (2 μg/ml)を加え、30分間インキュベート し、ヤギ抗ウサギIgG-PEで細胞を染色してHVEM:Fc-ウサギを検出した。ウサギIg
Gを用いてバックグラウンド染色を測定した。活性化II-23.D7細胞へのHVEM:Fcの
結合は、上述のように段階的濃度のLTβR:Fc、TNFR60、Fas:Fc、またはIgGと競 合した。
ュベートした。次にHVEM:Fc-ウサギ (2 μg/ml)を加え、30分間インキュベート し、ヤギ抗ウサギIgG-PEで細胞を染色してHVEM:Fc-ウサギを検出した。ウサギIg
Gを用いてバックグラウンド染色を測定した。活性化II-23.D7細胞へのHVEM:Fcの
結合は、上述のように段階的濃度のLTβR:Fc、TNFR60、Fas:Fc、またはIgGと競 合した。
【００９５】 LTαホモ三量体による結合の競合 II-23.D7細胞を活性化し、HVEM:Fcを組換えLTαまたはLTα1β2と4℃で30分間
プレインキュベートした。この混合物を活性化II-23.D7細胞に加え、次に抗huIg
G-PEで染色した。HVEM:Fc＋LTαによる蛍光染色は、正常なIgGによるバックグラ
ウンドと等しいものであった。
プレインキュベートした。この混合物を活性化II-23.D7細胞に加え、次に抗huIg
G-PEで染色した。HVEM:Fc＋LTαによる蛍光染色は、正常なIgGによるバックグラ
ウンドと等しいものであった。
【００９６】結果 HVEMがTNFまたはLTαβ複合体に結合し得るか否かを判定するために、ウサギI
gG Fcを有するHVEM:Fc構築物を使用する、PMAおよびイオノマイシンによって活 性化したII-23.D7細胞へのHVEM:Fcの結合に対する競合インヒビターとして、LT βR:FcおよびTNFR:Fcを使用した[Montgomeryら、上記に引用]。LTβR:FcおよびH
VEM:Fc(ヒトIgGIのFc)がHVEM:Fc(ウサギ)の結合について競合したが、TNFR60:Fc
は競合しなかった(図2A)。さらに、関連する受容体融合タンパク質であるFas:Fc
およびTNFR80:FcはいずれもHVEM:Fcの結合に対して競合しなかった。しかし驚く
べきことに、LTαホモ三量体がHVEM:Fc結合に対して競合し、TNFまたはLTα1β2
はしなかった(図2B)。108番目のチロシン(Tyr)がフェニルアラニン(Phe)で置換 された(Tyr108Phe)、LTαのTNFR60結合変異体[Gohら、(1991) Protein Eng. 4:7
85]は競合しなかった(図3)。これらの結果は、推定HVEMリガンドが、LTαβヘテ
ロ三量体およびLTαと共通する特性を有しているが、LTα1β2およびTNFからは 区別される特徴も有することを示している。従ってLTα2β1は、HVEM:Fcにより 認識される推定表面リガンドであり得る。但し、LTα2β1上のHVEM結合部位はTN
FR60と同一ではないことに注意する必要がある。あるいは、HVEM:Fcは新しいリ ガンドを認識した可能性がある。これらの可能性を区別するために生化学的方法
を用いた。
gG Fcを有するHVEM:Fc構築物を使用する、PMAおよびイオノマイシンによって活 性化したII-23.D7細胞へのHVEM:Fcの結合に対する競合インヒビターとして、LT βR:FcおよびTNFR:Fcを使用した[Montgomeryら、上記に引用]。LTβR:FcおよびH
VEM:Fc(ヒトIgGIのFc)がHVEM:Fc(ウサギ)の結合について競合したが、TNFR60:Fc
は競合しなかった(図2A)。さらに、関連する受容体融合タンパク質であるFas:Fc
およびTNFR80:FcはいずれもHVEM:Fcの結合に対して競合しなかった。しかし驚く
べきことに、LTαホモ三量体がHVEM:Fc結合に対して競合し、TNFまたはLTα1β2
はしなかった(図2B)。108番目のチロシン(Tyr)がフェニルアラニン(Phe)で置換 された(Tyr108Phe)、LTαのTNFR60結合変異体[Gohら、(1991) Protein Eng. 4:7
85]は競合しなかった(図3)。これらの結果は、推定HVEMリガンドが、LTαβヘテ
ロ三量体およびLTαと共通する特性を有しているが、LTα1β2およびTNFからは 区別される特徴も有することを示している。従ってLTα2β1は、HVEM:Fcにより 認識される推定表面リガンドであり得る。但し、LTα2β1上のHVEM結合部位はTN
FR60と同一ではないことに注意する必要がある。あるいは、HVEM:Fcは新しいリ ガンドを認識した可能性がある。これらの可能性を区別するために生化学的方法
を用いた。
【００９７】実施例３ HVEMリガンドの生化学的特性化 方法 SDS-PAGEによる分析 II-23.D7細胞を、(実施例1に記載のように)PMA、またはPMAおよびイオノマイ シンで2.5時間活性化し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄し、システイン-メチ
オニンを含まないRPMIで1回洗浄し、次に10%の透析したFBS、それぞれ250μCiの 35 S-メチオニンおよび35S-システイン、および活性化剤を含む前記培地に1.5時 間再懸濁した。培養上清を回収し、細胞を2% NP40、HEPES pH7.0、20 mM EDTA、
ロイペプチンおよびアプロチニン(10 μg/ml)を含む150 mM NaCl、PMSF(1 mM)、
およびヨードアセトアミド(20mM)を含むバッファー中で溶解した。この抽出物を
、ヒトIgG(10 μg)、指示のある場合には抗LT抗体、およびプロテインGビーズを
用いて予備清澄化した。次に受容体:Fc融合タンパク質(10 μg/ml)をサンプルに
加え、プロテインGビーズで沈殿させた。標識したタンパク質を還元SDS-PAGEお よびホスホイメージ(画素数範囲6〜200)により分析した。
オニンを含まないRPMIで1回洗浄し、次に10%の透析したFBS、それぞれ250μCiの 35 S-メチオニンおよび35S-システイン、および活性化剤を含む前記培地に1.5時 間再懸濁した。培養上清を回収し、細胞を2% NP40、HEPES pH7.0、20 mM EDTA、
ロイペプチンおよびアプロチニン(10 μg/ml)を含む150 mM NaCl、PMSF(1 mM)、
およびヨードアセトアミド(20mM)を含むバッファー中で溶解した。この抽出物を
、ヒトIgG(10 μg)、指示のある場合には抗LT抗体、およびプロテインGビーズを
用いて予備清澄化した。次に受容体:Fc融合タンパク質(10 μg/ml)をサンプルに
加え、プロテインGビーズで沈殿させた。標識したタンパク質を還元SDS-PAGEお よびホスホイメージ(画素数範囲6〜200)により分析した。
【００９８】 上記段落に記載のように調製した細胞抽出物を、最初に10 μgのマウスIgGま たはLTαまたはLTβに対するモノクローナル抗体で予備清澄化し、次にHVEM:Fc を加えてリガンドを沈殿させた。次にHVEM:Fcに結合したこのタンパク質を、還 元SDS-PAGEで分離し、ホスホイメージで検出した。
【００９９】 HVEMリガンドであるp30の精製 II-23.D7細胞を、PMA(100 ng/ml)またはPMAおよびイオノマイシン(1μg/ml)で
2.5時間活性化し、次に上記の2つの段落に記載のように35S-メチオニンおよび35 S-システインで標識した。細胞抽出物をヒトIgG(5 μg)およびプロテインGビー ズで予備清澄化し、非特異的に結合するタンパク質を取り除いた。次にこの抽出
物をTNFR60:FcおよびプロテインGビーズで処理することによりLTαを除去した。
そしてこの抽出物にHVEM:FcおよびプロテインGビーズを加えてインキュベートし
た。それぞれの場合につき、このビーズを3回洗浄して非結合分画の汚染タンパ ク質を取り除いた。このビーズは8 Mの尿素を含むバッファー中で溶出させ、等 電点電気泳動(pIが5〜7(50%)、3〜10(40%)、2〜11(10%)の両性混合物で形成した
勾配)で第１の次元の分析を行い、還元SDS-PAGE(15%ゲル)で第２の次元の分析を
行った。
2.5時間活性化し、次に上記の2つの段落に記載のように35S-メチオニンおよび35 S-システインで標識した。細胞抽出物をヒトIgG(5 μg)およびプロテインGビー ズで予備清澄化し、非特異的に結合するタンパク質を取り除いた。次にこの抽出
物をTNFR60:FcおよびプロテインGビーズで処理することによりLTαを除去した。
そしてこの抽出物にHVEM:FcおよびプロテインGビーズを加えてインキュベートし
た。それぞれの場合につき、このビーズを3回洗浄して非結合分画の汚染タンパ ク質を取り除いた。このビーズは8 Mの尿素を含むバッファー中で溶出させ、等 電点電気泳動(pIが5〜7(50%)、3〜10(40%)、2〜11(10%)の両性混合物で形成した
勾配)で第１の次元の分析を行い、還元SDS-PAGE(15%ゲル)で第２の次元の分析を
行った。
【０１００】 HVEM:Fcによるp30の精製を、LTβR:FcまたはTNFR60:Fcで精製したサンプルと の比較によりモニターした。LTβR:Fc精製タンパク質、LTα1β2をPMAで刺激し たII-23.D7細胞から単離した。これを図4Aに示す。抽出物からLTαを取り除くの
に使用したTNFR60:Fcに結合したタンパク質を図4Bに示し、上述のようにHVEM:Fc
により精製したp30を図4Cに示す。
に使用したTNFR60:Fcに結合したタンパク質を図4Bに示し、上述のようにHVEM:Fc
により精製したp30を図4Cに示す。
【０１０１】 各ゲルの第1レーンに14C標識した分子量マーカーを示し、第2レーンは第２の 次元方向のみに移動する受容体:Fc結合タンパク質を示す。
【０１０２】結果 LTαは、PMAで活性化された後のII23.D7細胞によって分泌される[Wareら、(19
92)、上記に引用; Croweら、(1994) Science 264:707]。HVEM:FcおよびTNFR:Fc は、SDS-PAGEで示されるように、PMAおよびイオノマイシンで刺激されたII-23.D
7細胞から分泌されたLTαを沈殿させた。LTαは、グリコシル化の不均一性のた めに一定の範囲の分子量にわたって移動する[Browningら、(1991)、上記に引用]
。TNFR60:FcもTNF(17 kDa)を沈殿させたが、HVEM:Fcは沈殿させず、これにより 上述の競合実験の結果が確認された。LTβR:Fcは予想通り分泌されるタンパク質
の何れにも結合しなかったが、PMAで活性化したII-23.D7細胞の界面活性剤によ る抽出物からLTβ(33 kDa)およびLTα(23〜25 kDa)複合体を沈殿させた。しかし
、イオノマイシンとPMAで刺激した場合は、LTβR:Fcは、30 kDaの主要なバンド と少量の33 kDaのLTβおよび23〜25 kDaのLTαを沈殿させた。TNFR60:Fcは、LT α前駆物質とサイズが同一の23 kDaのタンパク質を沈殿させた。対照的に、HVEM
:Fcは、30 kDaと23 kDaの両タンパク質を沈殿させた。3種の異なる受容体をブロ
ックするLTβに対するモノクローナル抗体では、HVEM:Fcを加える前の抽出物か ら30 kDaのタンパク質を取り除くことができず、p30タンパク質がLTβと抗原性 について関連がないことを示している。しかし、抗LTα抗体は抽出物から23 kDa
のバンドを除去し、これはそのLTαとの関連性を示している。LTα抗体が、30 k
Daおよび23 kDaの両バンドを予備清澄化できないことは、これらのタンパク質が
ヘテロ三量体を形成するLTαおよびLTβの場合とは異なり[Androlewiczら、上記
に引用]、互いに関連性を有していないことを示すものである。
92)、上記に引用; Croweら、(1994) Science 264:707]。HVEM:FcおよびTNFR:Fc は、SDS-PAGEで示されるように、PMAおよびイオノマイシンで刺激されたII-23.D
7細胞から分泌されたLTαを沈殿させた。LTαは、グリコシル化の不均一性のた めに一定の範囲の分子量にわたって移動する[Browningら、(1991)、上記に引用]
。TNFR60:FcもTNF(17 kDa)を沈殿させたが、HVEM:Fcは沈殿させず、これにより 上述の競合実験の結果が確認された。LTβR:Fcは予想通り分泌されるタンパク質
の何れにも結合しなかったが、PMAで活性化したII-23.D7細胞の界面活性剤によ る抽出物からLTβ(33 kDa)およびLTα(23〜25 kDa)複合体を沈殿させた。しかし
、イオノマイシンとPMAで刺激した場合は、LTβR:Fcは、30 kDaの主要なバンド と少量の33 kDaのLTβおよび23〜25 kDaのLTαを沈殿させた。TNFR60:Fcは、LT α前駆物質とサイズが同一の23 kDaのタンパク質を沈殿させた。対照的に、HVEM
:Fcは、30 kDaと23 kDaの両タンパク質を沈殿させた。3種の異なる受容体をブロ
ックするLTβに対するモノクローナル抗体では、HVEM:Fcを加える前の抽出物か ら30 kDaのタンパク質を取り除くことができず、p30タンパク質がLTβと抗原性 について関連がないことを示している。しかし、抗LTα抗体は抽出物から23 kDa
のバンドを除去し、これはそのLTαとの関連性を示している。LTα抗体が、30 k
Daおよび23 kDaの両バンドを予備清澄化できないことは、これらのタンパク質が
ヘテロ三量体を形成するLTαおよびLTβの場合とは異なり[Androlewiczら、上記
に引用]、互いに関連性を有していないことを示すものである。
【０１０３】 p30は、II-23.D7細胞からアフィニティクロマトグラフィによって精製した。 連続したTNFR60:Fc工程およびHVEM:Fc工程を用いて、TNFR60により抽出物からLT
αを取り除き、LTαがp30のHVEM:Fcへの結合を干渉しないようにした。HVEM:Fc 、TNFR60:FcまたはマウスLTβR:Fcに結合するタンパク質の2次元(2D)電気泳動に
より、p30が、LTαおよびLTβと比較して異なる電荷-質量比を有することがわか
った。LTβR:Fcで沈殿させたLTα1β2複合体におけるLTβは酸性で、酸性型のも
のの質量が検出可能な程度まで増加した、pIが5〜6.5にわたる異なる4種の電荷 異性体が認められる(図4A)。LTαは、LTβとの複合体として、あるいはTNFR60に
結合したLTαホモ三量体として(図4B)、pIが7〜8.5の範囲の7種の異なる異性体 を有し、23 kDaのLTα前駆物質は最も塩基性のpI(≧9)を有する。シグナル配列 を有していないLTαのpIは8.9である。これらの結果は、グリコシル化付加物の 特徴であり、従前のLTαおよびLTβについての研究結果と完全に一致する[Brown
ingら、(1991)、前記に引用]。対照的にp30は広い範囲のバンド(pI7〜8.5)とし て移動し、このバンドはより低い強度で3本のバンドに分離する(図4C)。p30が認
識可能な質量の変化なしに電荷の不均一性を有することは、例えばリン酸エステ
ルまたはリン脂質の付加のような翻訳後修飾の結果である可能性がある。これら
の結果は、LTβとは抗原性の点および物理的に異なる、pI7〜8.5の異性体を有す
る30 kDaの新規な細胞表面タンパク質(p30またはHVEMリガンドと称する)にHVEM が結合することを明らかに示すものである。HVEMリガンドはLTβR:Fcによっても
認識されるが、TNFRによっては認識されない。
αを取り除き、LTαがp30のHVEM:Fcへの結合を干渉しないようにした。HVEM:Fc 、TNFR60:FcまたはマウスLTβR:Fcに結合するタンパク質の2次元(2D)電気泳動に
より、p30が、LTαおよびLTβと比較して異なる電荷-質量比を有することがわか
った。LTβR:Fcで沈殿させたLTα1β2複合体におけるLTβは酸性で、酸性型のも
のの質量が検出可能な程度まで増加した、pIが5〜6.5にわたる異なる4種の電荷 異性体が認められる(図4A)。LTαは、LTβとの複合体として、あるいはTNFR60に
結合したLTαホモ三量体として(図4B)、pIが7〜8.5の範囲の7種の異なる異性体 を有し、23 kDaのLTα前駆物質は最も塩基性のpI(≧9)を有する。シグナル配列 を有していないLTαのpIは8.9である。これらの結果は、グリコシル化付加物の 特徴であり、従前のLTαおよびLTβについての研究結果と完全に一致する[Brown
ingら、(1991)、前記に引用]。対照的にp30は広い範囲のバンド(pI7〜8.5)とし て移動し、このバンドはより低い強度で3本のバンドに分離する(図4C)。p30が認
識可能な質量の変化なしに電荷の不均一性を有することは、例えばリン酸エステ
ルまたはリン脂質の付加のような翻訳後修飾の結果である可能性がある。これら
の結果は、LTβとは抗原性の点および物理的に異なる、pI7〜8.5の異性体を有す
る30 kDaの新規な細胞表面タンパク質(p30またはHVEMリガンドと称する)にHVEM が結合することを明らかに示すものである。HVEMリガンドはLTβR:Fcによっても
認識されるが、TNFRによっては認識されない。
【０１０４】実施例４ HSV gDエンベロープ糖タンパク質は、HVEM:Fcへ結合する内在性HVEM リガンド(p30)と競合する 方法 HVEM:Fc (2 μg/ml)を、gD-1 (250 μg/ml)またはgD-1 (Δ290-299)(100 μg/
ml)とともに4℃で30分間プレインキュベートし、次に(実施例1に記載のように)P
MAとイオノマイシンで活性化したII-23.D7細胞に加えた。huIgGを用いてバック グラウンド染色を測定したところ、HVEM:Fc＋gD-1(Δ290-299)に等しかった。HV
EM:Fcの活性化II-23.D7細胞への結合を、実施例1の場合のように段階的濃度のgD
-1またはgD-1(Δ290-299)と競合させた。
ml)とともに4℃で30分間プレインキュベートし、次に(実施例1に記載のように)P
MAとイオノマイシンで活性化したII-23.D7細胞に加えた。huIgGを用いてバック グラウンド染色を測定したところ、HVEM:Fc＋gD-1(Δ290-299)に等しかった。HV
EM:Fcの活性化II-23.D7細胞への結合を、実施例1の場合のように段階的濃度のgD
-1またはgD-1(Δ290-299)と競合させた。
【０１０５】結果 HSV gD-1タンパク質がHVEMに結合することにより、HSV gDがHVEM細胞リガンド
のアンタゴニストとして機能する可能性が示唆された。可溶性gD-1、およびHVEM
への結合力が強化されたgDの変異体であるgD-1(Δ290-299t)は、両者共に活性化
II-23.D7細胞表面へのHVEMの結合の阻止に関して有効であった(図5A)。gD-1タン
パク質の有効な阻害濃度は、そのHVEMへの親和性と相関性を有していた(図5B)。
PMAまたはPMA／イオノマイシンで活性化したII-23.D7細胞へのLTβR:FcまたはTN
FR60:Fcの結合は、gD-1(Δ290-299t)によっては阻害されなかった。これはHVEM:
gD-1相互作用が高度に特異的であることを示している。この結果は、たとえTNFR
60およびLTβRにより認識されるリガンドにHVEMが結合するとしても、gD-1がHVE
Mへの結合について特異的に同時進化してきたことを示唆している。これらの結 果は、gD-1がリンホトキシンの膜固着型バイロカインであり、HSVの侵入または 感染細胞からの放出の際にHVEMシグナリング活性をモジュレートし得ることを示
している。
のアンタゴニストとして機能する可能性が示唆された。可溶性gD-1、およびHVEM
への結合力が強化されたgDの変異体であるgD-1(Δ290-299t)は、両者共に活性化
II-23.D7細胞表面へのHVEMの結合の阻止に関して有効であった(図5A)。gD-1タン
パク質の有効な阻害濃度は、そのHVEMへの親和性と相関性を有していた(図5B)。
PMAまたはPMA／イオノマイシンで活性化したII-23.D7細胞へのLTβR:FcまたはTN
FR60:Fcの結合は、gD-1(Δ290-299t)によっては阻害されなかった。これはHVEM:
gD-1相互作用が高度に特異的であることを示している。この結果は、たとえTNFR
60およびLTβRにより認識されるリガンドにHVEMが結合するとしても、gD-1がHVE
Mへの結合について特異的に同時進化してきたことを示唆している。これらの結 果は、gD-1がリンホトキシンの膜固着型バイロカインであり、HSVの侵入または 感染細胞からの放出の際にHVEMシグナリング活性をモジュレートし得ることを示
している。
【０１０６】実施例５ HVEMの結合はリンパ球の活性化を起こす 方法 T細胞の活性化 新たに単離した末梢血リンパ球を、段階希釈したウサギ抗HVEMまたは予備免疫
血清[Montgomeryら、上記に引用]、および有糸分裂促進量未満(1 μg/ml)のPMA を含む培地でインキュベートした。β-シンチレーションのカウントによって評 価して3H-チミジンのDNAへの取り込みにより3日後に増殖を測定した。
血清[Montgomeryら、上記に引用]、および有糸分裂促進量未満(1 μg/ml)のPMA を含む培地でインキュベートした。β-シンチレーションのカウントによって評 価して3H-チミジンのDNAへの取り込みにより3日後に増殖を測定した。
【０１０７】 新たに単離した末梢血リンパ球を5 μg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA)で活 性化し、IL-2を含む培地で培養した。17日後、段階希釈した抗HVEM抗血清と有糸
裂促進濃度未満(1.5 μg/ml)の抗CD3(OKT3)抗体で再刺激した。上記のように3日
後に増殖を測定した。
裂促進濃度未満(1.5 μg/ml)の抗CD3(OKT3)抗体で再刺激した。上記のように3日
後に増殖を測定した。
【０１０８】 B細胞のフローサイトメトリーによる分析 ヒトのリンパ芽球系RAJI細胞を、抗HVEM抗血清(1:100希釈)または対照のウサ ギIgGとともに4℃でインキュベートし、フィコエリトリンとコンジュゲートした
ヤギ抗ウサギIgGで染色することにより、フローサイトメトリーで分析した。各 ヒストグラムにつき104個の細胞を分析した。
ヤギ抗ウサギIgGで染色することにより、フローサイトメトリーで分析した。各 ヒストグラムにつき104個の細胞を分析した。
【０１０９】 B細胞の活性化 RAJIを2%のFBSを含む培地に移して24時間おき、そして示した濃度のウサギ抗H
VEM抗体の希釈物の存在下、または培地単体中で3日間インキュベートした。細胞
の増殖を上記のように評価した。
VEM抗体の希釈物の存在下、または培地単体中で3日間インキュベートした。細胞
の増殖を上記のように評価した。
【０１１０】結果 HVEMは休止したCD4+ T細胞上に発現されるが、これはHVEMが免疫応答の初期相
において細胞増殖のための同時刺激分子として機能し得るということを示唆して
いる。最適未満のPMA濃度で、抗HVEM抗体は、末梢血リンパ球の増殖の亢進を促 進した。これは3日間の培養後に測定した3H-チミジンの取込みの増加によって示
された(図6A)。PHAによる活性化後10〜17日経過した連続培養物で生成された記 憶リンパ球も、抗CD3抗体の最適未満の濃度において抗HVEM抗体により再活性化 された(図6B)。この結果は、免疫応答におけるエフェクター相においてHVEMが機
能することを示すものである。抗体はTNF関連リガンドの作用に似た作用をする
[Engelmannら、(1990) J. Biol. Chem. 265:14497]ことから、これらの結果は、
細胞関連の30 kDaのHVEMリガンドが、T細胞に対する増殖誘導シグナルとして機 能し得ることを示すものである。
において細胞増殖のための同時刺激分子として機能し得るということを示唆して
いる。最適未満のPMA濃度で、抗HVEM抗体は、末梢血リンパ球の増殖の亢進を促 進した。これは3日間の培養後に測定した3H-チミジンの取込みの増加によって示
された(図6A)。PHAによる活性化後10〜17日経過した連続培養物で生成された記 憶リンパ球も、抗CD3抗体の最適未満の濃度において抗HVEM抗体により再活性化 された(図6B)。この結果は、免疫応答におけるエフェクター相においてHVEMが機
能することを示すものである。抗体はTNF関連リガンドの作用に似た作用をする
[Engelmannら、(1990) J. Biol. Chem. 265:14497]ことから、これらの結果は、
細胞関連の30 kDaのHVEMリガンドが、T細胞に対する増殖誘導シグナルとして機 能し得ることを示すものである。
【０１１１】 LTαは、エプスタイン-バーウイルスで形質転換された細胞系を含むBリンパ球
に対する増殖亢進活性を刺激することが以前に示されている[Abkenら、(1992) J
. Immunol. 149:2785; Estrovら、(1993) J. Exp. Med. 177:76; Kehrlら、(198
7) Science 238:1144; Gibbonら、(1994) Eur. J. Immunol. 24:1879]。HVEMは 、リンパ芽球系細胞系においても発現される(図7A)。抗HVEM抗体は、2%の血清を
含む培地中のRAJI B細胞系の培養物に加えると、用量依存的に3H-チミジンの取 込みを促進した。これはHVEMが低濃度の血清の下でB細胞の生存度を維持するシ グナルを与え得ることを示している(図7B)。このアッセイで、LTαは2〜3倍の刺
激効果を示した。負の増殖因子としてのTNFR60およびTNFR80が存在すると、LTα
に対する応答が低下し得る。抗HVEM抗体の正の効果は、p30 HVEMリガンドに特有
の性質であり得る。
に対する増殖亢進活性を刺激することが以前に示されている[Abkenら、(1992) J
. Immunol. 149:2785; Estrovら、(1993) J. Exp. Med. 177:76; Kehrlら、(198
7) Science 238:1144; Gibbonら、(1994) Eur. J. Immunol. 24:1879]。HVEMは 、リンパ芽球系細胞系においても発現される(図7A)。抗HVEM抗体は、2%の血清を
含む培地中のRAJI B細胞系の培養物に加えると、用量依存的に3H-チミジンの取 込みを促進した。これはHVEMが低濃度の血清の下でB細胞の生存度を維持するシ グナルを与え得ることを示している(図7B)。このアッセイで、LTαは2〜3倍の刺
激効果を示した。負の増殖因子としてのTNFR60およびTNFR80が存在すると、LTα
に対する応答が低下し得る。抗HVEM抗体の正の効果は、p30 HVEMリガンドに特有
の性質であり得る。
【０１１２】 現時点での好ましい態様により本発明を説明したが、本発明の概念を逸脱する
ことなく本発明を種々改変することができることは理解されよう。従って、本発
明は特許請求の範囲のみにより限定されるものである。
ことなく本発明を種々改変することができることは理解されよう。従って、本発
明は特許請求の範囲のみにより限定されるものである。
配列番号：１ 配列の長さ：２９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 配列 CGGAGATCTG AGTTCATCCT GCTAGCTGG 29 配列番号：２ 配列の長さ：３１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 配列 ATAGGATCCC TTGGTCTGGT GCTGACATTC C 31 配列番号：３ 配列の長さ：２９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 配列 GACGTCAGAT CTTCCCACCT TTCCTCCTA 29 配列番号：４ 配列の長さ：２９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 配列 GAACAGAGAT CTCATTGCTC CTGGCTCTG 29
【図１Ａ】 図1Aは、PMA（上部ヒストグラム）またはPMAおよびイオノマイシン（下部ヒス
トグラム）で活性化した後のHVEM:Fc融合タンパク質のII-23.D7細胞への結合を 示 す一組のフローサイトメトリーヒストグラムである。
トグラム）で活性化した後のHVEM:Fc融合タンパク質のII-23.D7細胞への結合を 示 す一組のフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図１Ｂ】 図1Bは、HVEM:Fc融合タンパク質の正常ヒトCD4+（上部ヒストグラム）およびC
D8+（下部ヒストグラム）T細胞への結合を示す一組のフローサイトメトリーヒス
トグラムである。
D8+（下部ヒストグラム）T細胞への結合を示す一組のフローサイトメトリーヒス
トグラムである。
【図１Ｃ】 図1Cは、HVEM:Fc融合タンパク質の活性化II-23.D7細胞への飽和結合を示す線 グ ラフである。
【図２Ａ】 図2Aは、一組の図である。上図はLTβR:Fc融合タンパク質がHVEM:Fc融合タン パク質の活性化II-23.D7細胞への結合に競合することを示すフローサイトメトリ
ーヒストグラムである。下図はLTβR:Fc融合タンパク質によるHVEM:Fc融合タン パ ク質の結合の用量依存的抑制を示す線グラフである。
ーヒストグラムである。下図はLTβR:Fc融合タンパク質によるHVEM:Fc融合タン パ ク質の結合の用量依存的抑制を示す線グラフである。
【図２Ｂ】 図2Bは、一組の図である。上図はLTαホモ三量体がHVEM:Fc融合タンパク質のI
I-23.D7細胞への結合に競合することを示すフローサイトメトリーヒストグラム である。下図はLTαホモ三量体によるHVEM:Fc融合タンパク質の結合の用量依存 的抑制を示す線グラフである。
I-23.D7細胞への結合に競合することを示すフローサイトメトリーヒストグラム である。下図はLTαホモ三量体によるHVEM:Fc融合タンパク質の結合の用量依存 的抑制を示す線グラフである。
【図３】 図3は、一組の図である。上図は天然に存在するLTαのTyr108Phe変異体がHVEM
:FcのII-23.D7細胞への結合に競合しないことを示すフローサイトメトリーヒス トグラムであり、下図はLTαおよびLTα(Tyr108Phe)の競合結合分 析を示す線グ
ラフである。
:FcのII-23.D7細胞への結合に競合しないことを示すフローサイトメトリーヒス トグラムであり、下図はLTαおよびLTα(Tyr108Phe)の競合結合分 析を示す線グ
ラフである。
【図４Ａ】 図4Aは、活性化II-23.D7細胞抽出物をmLTβR:Fc融合タンパク質で処理するこ とによって得た沈殿物の二次元等電点電気泳動／SDS-PAGEゲルから得られたオー
トラジオグラムである。
トラジオグラムである。
【図４Ｂ】 図4Bは、活性化II-23.D7細胞抽出物をTNFR60:Fc融合タンパク質で処理するこ と によって得た沈殿物の二次元等電点電気泳動／SDS-PAGEゲルから得られたオ ートラジオグラムである。
【図４Ｃ】 図4Cは、活性化II-23.D7細胞抽出物をHVEM:Fc融合タンパク質で処理すること に よって得た沈殿物の二次元等電点電気泳動／SDS-PAGEゲルから得られたオー トラジオグラムである。
【図５】 図5は、一組の図である。上図はHSV gD-1糖タンパク質がHVEM:Fc融合タンパク
質の結合に競合することを示すフローサイトメトリーヒストグラムである。下図
はHSV gD-1糖タンパク質によるHVEM:Fc融合タンパク質の結合の用量依存的抑制 を示 す線グラフである。
質の結合に競合することを示すフローサイトメトリーヒストグラムである。下図
はHSV gD-1糖タンパク質によるHVEM:Fc融合タンパク質の結合の用量依存的抑制 を示 す線グラフである。
【図６】 図6は、抗HVEM抗体が新たに単離した末梢血T細胞（上の線グラフ）および記憶
T 細胞（下の線グラフ）内で用量依存的増殖を刺激することを示す一組の線グラ
フである。
T 細胞（下の線グラフ）内で用量依存的増殖を刺激することを示す一組の線グラ
フである。
【図７】 図7は、一組の図である。上図はRAJIリンパ芽球細胞上でのHVEMの発現を示す フロ ーサイトメトリーヒストグラムである。下図は抗HVEM抗体に応答したRAJI 細胞の用量依存的増殖を示す線グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/21 33/50 Ｚ 5/10 33/569 Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA40 CB01 CB17 CB21 DA36 DA77 FB03 FB04 4B024 AA01 AA11 BA21 CA04 DA02 DA05 EA04 GA11 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 4C084 AA02 BA22 BA44 DC50 MA56 MA66 ZB012 ZB262 ZB272 ZB332 ZC422 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA51 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74 HA05 HA17 HA18
Claims (66)
- 【請求項１】 以下の特徴： ａ）還元SDS-PAGEによって判定した分子量が30 kDaである、 ｂ）pIが約7〜8.5である、 ｃ）ヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)ポリペプチドに結合する、お
よび ｄ）リンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合する、 を有する実質的に精製されたポリペプチド。 - 【請求項２】 請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離された核
酸配列。 - 【請求項３】 請求項２に記載の核酸配列を含有する発現ベクター。
- 【請求項４】 請求項３に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
- 【請求項５】 請求項１に記載のポリペプチドに結合する抗体。
- 【請求項６】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の抗
体。 - 【請求項７】 HVEM結合物質媒介型細胞応答に作用する化合物を同定する方
法であって、 ａ）該化合物を、HVEMポリペプチドもしくはHVEMポリペプチドを発現する細胞
、およびHVEM結合物質とともに、成分どうしが相互作用し得る条件下でインキュ
ベートし；そして ｂ）HVEM結合物質媒介型細胞応答に対する該化合物の作用を判定する、 ことを含む前記方法。 - 【請求項８】 前記作用がHVEM媒介型細胞応答の抑制である、請求項７に記
載の方法。 - 【請求項９】 前記作用がHVEM媒介型細胞応答の刺激である、請求項７に記
載の方法。 - 【請求項１０】 前記HVEM結合物質がp30である、請求項７に記載の方法。
- 【請求項１１】 前記HVEM結合物質がgDである、請求項７に記載の方法。
- 【請求項１２】 前記HVEM結合物質がリンホトキシンa（LTα）である、請 求項７に記載の方法。
- 【請求項１３】 前記細胞応答が細胞活性化である、請求項７に記載の方法
。 - 【請求項１４】 前記細胞応答がHSVインターナリゼーションである、請求 項７に記載の方法。
- 【請求項１５】 細胞がリンパ球である、請求項７に記載の方法。
- 【請求項１６】 LTβR-p30媒介型細胞応答に作用する化合物を同定する方 法であって、 ａ）該化合物を、LTβRポリペプチドもしくはLTβRポリペプチドを発現する細
胞、およびp30とともに、成分どうしが相互作用し得る条件下でインキュベート し；そして ｂ）LTβR-p30媒介型細胞応答に対する化合物の作用を判定する、 ことを含む前記方法。 - 【請求項１７】 前記作用がLTβR-p30媒介型細胞応答の抑制である、請求 項16に記載の方法。
- 【請求項１８】 前記作用がLTβR-p30媒介型細胞応答の刺激である、請求 項16に記載の方法。
- 【請求項１９】 前記応答が細胞活性化である、請求項16に記載の方法。
- 【請求項２０】 細胞がリンパ球である、請求項16に記載の方法。
- 【請求項２１】 HVEMを発現する細胞を、HVEMをモジュレートするのに有効
な量のHVEM結合物質またはp30結合物質と接触させることを含む、HVEM媒介型細 胞応答をモジュレートする方法。 - 【請求項２２】 前記結合物質がHVEM媒介型細胞応答を抑制する、請求項21
に記載の方法。 - 【請求項２３】 前記結合物質がHVEM媒介型細胞応答を刺激する、請求項21
に記載の方法。 - 【請求項２４】 前記HVEM結合物質がgDである、請求項21に記載の方法。
- 【請求項２５】 前記HVEM結合物質がp30である、請求項21に記載の方法。
- 【請求項２６】 前記HVEM結合物質がLTαのHVEM結合性ペプチド断片または
該ペプチド断片のペプチド模倣体である、請求項21に記載の方法。 - 【請求項２７】 前記ペプチドが天然に存在するLTαのＮ末端から108番目 に相当する位置にアミノ酸Tyrを含む、請求項26に記載の方法。
- 【請求項２８】 前記p30結合物質がLTβRである、請求項21に記載の方法。
- 【請求項２９】 前記p30結合物質がp30に結合する抗体である、請求項21に
記載の方法。 - 【請求項３０】 in vitroで接触を行う、請求項21に記載の方法。
- 【請求項３１】 被験体においてin vivoで接触を行う、請求項21に記載の 方法。
- 【請求項３２】 前記被験体が哺乳動物である、請求項31に記載の方法。
- 【請求項３３】 前記被験体がHVEM関連疾患を有する、請求項31に記載の方
法。 - 【請求項３４】 前記被験体が自己免疫疾患、白血病およびリンパ腫からな
る群から選択されるHVEM関連疾患を有する、請求項33に記載の方法。 - 【請求項３５】 HVEMを発現する細胞を、HVEMをモジュレートするのに有効
な量のHVEM結合物質またはLTα結合物質と接触させることを含む、HVEM媒介型細
胞応答をモジュレートする方法。 - 【請求項３６】 前記結合物質がHVEM媒介型細胞応答を抑制する、請求項35
に記載の方法。 - 【請求項３７】 前記結合物質がHVEM媒介型細胞応答を刺激する、請求項35
に記載の方法。 - 【請求項３８】 前記HVEM結合物質がgDである、請求項35に記載の方法。
- 【請求項３９】 前記HVEM結合物質がLTαのHVEM結合性ペプチド断片または
該ペプチド断片のペプチド模倣体である、請求項35に記載の方法。 - 【請求項４０】 前記ペプチドが天然に存在するLTαのＮ末端から108番目 に相当する位置にアミノ酸Tyrを含む、請求項39に記載の方法。
- 【請求項４１】 LTα結合物質がHVEMである、請求項35に記載の方法。
- 【請求項４２】 in vitroで接触を行う、請求項35に記載の方法。
- 【請求項４３】 被験体においてin vivoで接触を行う、請求項35に記載の 方法。
- 【請求項４４】 前記被験体が哺乳動物である、請求項35に記載の方法。
- 【請求項４５】 前記被験体がHVEM関連疾患を有する、請求項43に記載の方
法。 - 【請求項４６】 前記被験体が自己免疫疾患、白血病およびリンパ腫からな
る群から選択されるHVEM関連疾患を有する、請求項45に記載の方法。 - 【請求項４７】 LTβRを発現する細胞を、LTβRをモジュレートするのに有
効な量のLTβR結合物質またはp30結合物質と接触させることを含む、LTβR媒介 型細胞応答をモジュレートする方法。 - 【請求項４８】 前記結合物質がLTβR媒介型細胞応答を抑制する、請求項4
7に記載の方法。 - 【請求項４９】 前記結合物質がLTβR媒介型細胞応答を刺激する、請求項4
7に記載の方法。 - 【請求項５０】 前記LTβR結合物質がp30である、請求項47に記載の方法。
- 【請求項５１】 前記p30結合物質がLTβRである、請求項47に記載の方法。
- 【請求項５２】 前記p30結合物質がp30に結合する抗体である、請求項47に
記載の方法。 - 【請求項５３】 in vitroで接触を行う、請求項47に記載の方法。
- 【請求項５４】 被験体においてin vivoで接触を行う、請求項47に記載の 方法。
- 【請求項５５】 前記被験体が哺乳動物である、請求項54に記載の方法。
- 【請求項５６】 前記被験体がLTβR関連疾患を有する、請求項54に記載の 方法。
- 【請求項５７】 前記被験体が自己免疫疾患、白血病およびリンパ腫からな
る群から選択されるLTβR関連疾患を有する、請求項56に記載の方法。 - 【請求項５８】 細胞の単純ヘルペスウイルス感染(HSV)を抑制する方法で あって、HSV感染に感受性の細胞を、抑制に有効な量のHVEM結合物質と接触させ ることにより、HSV感染を抑制することを含む前記方法。
- 【請求項５９】 前記HVEM結合物質がgDである、請求項58に記載の方法。
- 【請求項６０】 前記HVEM結合物質がp30である、請求項58に記載の方法。
- 【請求項６１】 前記HVEM結合物質がLTαのHVEM結合性ペプチド断片または
該ペプチド断片のペプチド模倣体である、請求項58に記載の方法。 - 【請求項６２】 前記ペプチド断片が天然に存在するLTαのＮ末端から108 番目に相当する位置にアミノ酸Tyrを含む、請求項61に記載の方法。
- 【請求項６３】 in vitroで接触を行う、請求項58に記載の方法。
- 【請求項６４】 被験体においてin vivoで接触を行う、請求項58に記載の 方法。
- 【請求項６５】 前記被験体が哺乳動物である、請求項64に記載の方法。
- 【請求項６６】 前記被験体がHSV感染の危険性があるかまたはHSVに感染し
ている、請求項64に記載の方法。
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