TWI222453B - Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1222453 A7 ________B7 _____ 五、發明説明（1 ) 發明範疇 本發明通常有關有用於調節免疫反應和病毒感染之化合 物和方法，及更特定地有用於抑制單純疱疹病毒感染之多 肽。 發明背景 單純疱疹病毒（HSV)，第1和2型，導致再發之感染，其 在嚴重性上自良性至危險性之範圍。H S V在神經元中潛在 出現，以在相當細胞免疫系統之存在下感染皮膚和其他組 織。HSV之D醣蛋白（gD)，位在病毒粒子鞘之穿透膜蛋白 質，由結合至細胞受體而起始感染[Spear等人（1993 )在病 毒融合機構，Bentz編者，CRC出版社，波卡拉頓（Boca Raton)]。近來，由HSV為感染所用之細胞蛋白質經鑑定 及給定名詞H S V入侵介體（HVEM) [Montgomery等人（1996) 細胞H ·· 427 ]。HVEM為具富含半胱胺酸細胞外功能部位 之穿透膜第1型蛋白質，其與為腫瘤壞死因子（TNF) -有關 細胞分裂素之受體展現顯著同質性[Smith等人（1994)細胞 丛：959 ; Ware等人（ 1995 )在細胞分解之途徑，Griffiths和

Tschopp 編者，Springer-Verlag，巴塞爾]。許多 TNF 超族 成員起始登上有效炎性和免疫反應所需之多種細胞反應。 TNF為弟2型穿透膜蛋白質[Pennica等人（ 1984)自然 312 : 724]，其經蛋白水解形成分泌之蛋白質[Biack等人 (1997)自然729]，而LTa缺乏穿透膜功能部位[Gray 等人（1984)自然3 12_ : 721 ]及排外地分泌為同質三體（以其 形式，其亦稱為TNF /3)。當表現為表面蛋白質時，[τα與 -4· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） " " •裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 1222453 A7 B7 五、發明説明（2 ) 33 kDa蛋白質有關[Androlewicz 等人（ 1992) J· Biol· Chem· 267 : 2542]，名為LT/3 [Browning 等人（1993)細胞 7 2 : 847]，亦與第2型穿透膜醣蛋白有關，其在alyS2和α 2^1 次單元比值之異質三體中[Androlewicz等人，如前， Browning 等人（1996) J. Biol. Chem. 271 : 8618] 〇 LT α 和 TNF兩者結合及經二種受體發出訊息，55-60 Kda TNF受體 (TNFR60 ; CD120a或第 1 型）[Schall 等人（ 1990)細胞江： 361 ; Loetscher 等人（ 1990)細胞 351]和 75-80 KDa TNFR(TNFR 80 ;第 2型或 CD120b)[Smith 等人（ 1990)科學 248 : 1019]。相反地，表面LTal/32複合物係特異地由LT 冷受體（LTySR)識別[Crowe等人（ 1994)科學2M: 707]，其 不結合LT α或TNF[Crowe等人（ 1994)科學2M: 707]，然 而TNFR兩者結合LTa 2/51異質三體[Crowe等人（ 1994)科學 264 : 707 ; Browning 等人（1995 ) J. Immunol· 154 : 33] ° 基因刪除在小鼠中之LTa和LT0基因已透露此兩種基因 在淋巴結和柏爾氏（Peyer’s)塾發展中之角色[De Togni等人 ( 1994)科學703 ; Banks 等人（ 1995) JL Immunol. 155 : 1685 ]，及與TNF和TNFR60—起，亦為重要的細胞分 裂素，其控制成人之免疫反應期間胚種中心之形成及免疫 球蛋白同型轉移（例如IgA產生[Matsumoto等人（ 1996)科學 271 ： 1289 ; Mariathasan 等人（1995) J· Inflammation 45 : 72]。大多數研究已指向LTaliS2/LTy3R作為重要之細胞 分裂素-受體系統，以控制此些功能[Crowe等人（1994)科學 Ml·· 707 ; Koni 等人（ 1997)免疫性呈：491 ; Ettinger 等人 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1222453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（4 ) 狀圖）或PMA和離子黴素（下柱狀圖）活化後，HVEM : Fc 融合蛋白質與11-23.D7細胞之結合。 圖1 B為一對流動細胞計數柱狀圖，顯示η VEM : F c融合 蛋白質與正常人CD4 + (上柱狀圖）和CD8 + (下柱狀圖）Τ細 胞之結合。 圖1 C為線形圖，顯示HVem : F c融合蛋白質與活化11_ 2 3 · D 7細胞之飽和結合。 圖2 A為一對圖形。上圖形為流動細胞計數柱狀圖，顯示 與活化11 - 2 3 · D 7細胞結合之HVEM : F c融合蛋白質係與LT /5R : Fc融合蛋白質競爭。下圖形為線形圖，顯示hVem : Fc融合蛋白質以LT/3R : Fc融合蛋白質之劑量依賴抑制。 圖2B為一對圖形。上圖形為流動細胞計數柱狀圖，顯示 HVEM : Fc融合蛋白質結合係由LTa同質三體競爭。下圖 形為線形圖，顯示H VEM : Fc融合蛋白質以LTa同質三體 之劑量依賴抑制。 圖3為一對圖形。上圖形為流動細胞計數柱形圖，顯示天 然來源LT α之Tyrl〇8Phe變異體不能與結合至Π_23Ι)7細 胞之HVEM : Fc競爭及下圖形為線形圖，顯 a(Tyrl08Phe)競爭結合分析。 圖4 A為自放射攝影圖，獲自沈澱物之乙次元等電焦點/ SDS-PAGE凝膠，其沈澱物係獲自活化11_23 ]〇7細胞之萃 取物以mLT : Fc融合蛋1 白質處。 圖4 B為自放射攝影圖，獲自沉澱物之2次元等電焦點/ SD S-PAGE凝膠，其沈澱物係自活化n_23 D7細胞之萃取 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公董） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1222453 A7 B7 五、發明説明（5 ) 物以TNFR60 : Fc融合蛋白質處理。 圖4 C為自放射攝影圖，獲自沉澱物之2次元等電焦點/ SDS-PAGE凝膠，其沈澱物係自活化II-23.D7細胞之萃取 物以HVEM : Fc融合蛋白質處理 圖5為一對圖形。上圖形為流動細胞計數柱形圖，顯示 HVEM : Fc融合蛋白質結合係與HSV gD-Ι醣蛋白質競爭。 下圖形為線形圖，顯示HVEM : Fc融合蛋白質結合以HSV gD- 1酷蛋白之劑量依賴抑制。 圖6為一對線形圖，顯示抗-HVEM抗體刺激新鮮分離周 圍血液T細胞（上線圖）和記憶T細胞（下線圖）之劑量依賴增 殖。 圖7為一對圖形。上圖形為流動細胞計數柱狀圖，顯示 HVEM在RAJI淋巴母細胞樣細胞之表現。下圖形為線形 圖，顯示RAJI細胞對抗-HVEM抗體反應之劑量依賴增殖。 詳細說明 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 涉及抑制結合含TNF受體（TNFR)有關多肽細胞外功能部 位之融合蛋白質HVEM之實驗顯示惡性和正常人T -細胞兩 者表現HVEM之細胞表面配體。競爭性抑制實驗顯示HVEM 配體具有與LTa冷異質三體和LTa —樣之特性，但亦具區 分其與LTal/32和TNF之特徵。因此，LTalyS2可為由 HVEM識別之推論表面配體，而在LTal02上之HVEM結合 部位則不同於TNFR60。可替代地，HVEM可識別新穎之配 體。生物化學之研究途徑經用以區分此些可能性。 免疫沉澱法和十二基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳法（SDS- -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1222453 A7 B7 五、發明説明（6 ) PAGE)研究展現在T細胞表面上HVEM之新穎30 kDa多肽配 體（p30)之存在，其在抗原上不同於LTy3和LTa雨者。親 和力層析法純化和二次元電泳法顯示ρ 3 0亦在物理上不同 於LTa和LT/5，在於其具30 kDa之分子量及約7-8.5之pi (圖4C)。此夕卜，此些研究顯示p30亦由LT /3R識別，但不 由 TNFR。 結合抑制實驗展現可溶性gD-Ι(自HSV-1之gD)和gD-1 之突變體、gD-l(A290-299t)結合至HVEM，但不至LT/3 R或TNFR60。此結果建議gD-Ι特定地為結合至HVEM而 共同引出，即使HVEM結合至由TNFR60和LT/3R識別之配 體。再者，發現指出gD-Ι為淋巴毒素之膜掛錨病毒素及在 H S V自感染細胞進入或離開期間，可調節H VEM訊息傳送 活性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在試管中之細胞培養物研究顯示抗HVEM抗體增強原始 和記憶Τ細胞兩者之增殖。相似實驗指出經HVEM發出訊息 提供對Β細胞之活化刺激物，及正刺激物，未經TNFR之對 平衡負刺激物，可為ρ 3 0 HVEM配體之獨特性質。此些結 果指出HVEM配體之生理功能似乎不同於TNF和LT α 1冷 2。新穎30 kDaHVEM配體鑑定升高以下之可能性，即此配 體可負責先前基於LTa或LT^S之生理反應。在此所示之發 現提供LT/TNF細胞分裂素系統和疱疹病毒之更深層瞭 解，其建議在疾病過程中控制此些細胞分裂素之新穎研究 途徑。 共同地，結果指出含HVEM或LT/3R之Fc融合蛋白質將 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1222453 A7 B7 五、發明説明（7 ) 調節LTa和30 kDa HVEM配體，p3 0之作用。相似地，融 合蛋白質HVEM可用以鑑定配體受體複合物之特定抑制 劑，如單株抗體或肽或小的有機化合物。p 3 0或LT α與 HVEM之交互作用，或ρ3 0與LT/3R之交互作用之抑制劑可 用以調節以下之疾病，其中發生不想要之淋巴細胞增殖， 包括Τ和Β淋巴瘤或白血病，或自免疫疾病，如風濕性關節 炎、胰島素依賴之糖尿病、多發性硬化、系統性紅斑性狼 瘡或重症肌無力。 同樣地，疱疹病毒gD-1可用以抑制免疫反應，其中LT α、p 3 0和HVEM訊息發出意味著作為效應物分子。LT α 或可溶性形式之30 kDa HVEM配體（由刪除其預測之細胞質 和穿透膜功能部位產生）可作用為疱疹病毒感染和復發之抑 制劑，藉由封阻癌療病毒進入細胞標的之能力。 如同TNFR —樣，HVEM具二元配體特異性，結合至LT α 和不同之30 kDa膜結合配體，ρ30。LTa Tyrl80Phe突變 體摧毁HVEM結合，正如其對TNFR60和TNFR80—樣。 TNFR60不能封阻HVEM結合至表面30 kDa形式係指出表面 LT α 2/3 1不是HVEM配體。 經濟部中央標準局員工消費合作杜印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 再者，p30不同於LTa，因為其在抗原上不同及保持細 胞相連的，不像LT α經排除地排出。因此，HVEM結合蛋 白質（p3 0)經推測含疏水性殘基之伸張，其形成穿透膜功能 部位，而相似於與TNF有關之其他蛋白質排列為第II型穿 透膜組織。此並不排除以下之可能性，即p 3 0亦可以其他 方式（例如脂質修飾）修飾，以允許連接至細胞表面。再 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1222453 Α7 Β7 五、發明説明（8 ) 者，此蛋白質應享有具LT α和LT々之序列同質性之區域， 其界定此超族之有關細胞分裂素及含約150 · 160個殘基之 C -端細胞外功能部位。 本發明之發現亦指出HVEM為LT α之特定受體，具清楚 區分其與TNF結合受體、TNFR60和TNFR80之性質。此性 質將允許HVEM融合蛋白質或相似之蛋白質特定地拮抗lt α，而不抑制TNF或LTa 1泠2功能。 本發明提供在實質上之純p 3 0多肽。p 3 0多肽係特徵為具 30 kDa之推測分子量，如由還原SDS-PAGE所測定及約7-8·5範圍之pi(圖4 C)。p3 0以少於1 〇個，較佳地少於8個， 更佳地少於6個（例如3、4或5個）異構形式存在。多肽為細 胞結合的，即不經排出及以其細胞表面形式，結合H Vem 和 LT)5 R。 ••實質上純π —詞，如在此所用，指P 3 0多肽，其實質無其 他蛋白質、脂質、醣類或天然有關之其他物質。熟諳此技 藝者可使用蛋白質純化之標準技術純化ρ 3 0。[蛋白質純 化，原理和實施，第 2 版（1987) Scopes，Springer Verlag， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 紐約。]貫質上純多肽將生成在還原SDS-PAGE凝膠上約30 kDa之單一主要條線。 本發明包括官能性多肽ρ 3 0及其官能性節片。如在此所 用’ έ能性多肽’’一岡指擁有生物功能或活性之多肽，其 經界定之官能性分析法鐘定及其與細胞中之特別生物、生 態或表現型改變有關。ρ 3 0多肽之，，官能性節片”包括祇要 能維持ρ 3 0活性之長度之ρ 3 0節片，例如，由結合至HVEM或 -11 - ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210χ^^趁) —- 1222453

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 LT/3R或抑制HSV結合至hVEM而調節細胞反應。含p3〇 生物活性 < 較小肽係包含在本發明中。熟諳此技藝者可由 標準方法分析P30之官能性活性，例如病毒斑還原分析法 或包括細胞分裂素產生分析法之細胞活化分析法。 P 3 0初級胺基酸序列之次要修飾可造成具如與此所述之天 然來源p 3 0多肽相較下實質相當之活性之蛋白質。如此修 飾可為有計劃的，如由部位引導突變，或可為自發性的。 由此些修飾產生之所有多肽係在此包括在内，祇要存在 P 3 0之生物活性，例如由結合至hVEM和LT /3 R或抑制 H S V結合至H VEM而調節細胞反應。再者，1或多個胺基酸 之刪除亦可造成生成分子結構之修飾，而不顯著改變其活 性。此可導致較小之有效分子之發展，其應具更廣之利用 性。例如，可能的在除去胺基或羧基端胺基酸，其不為 ρ 3 0活性所必需的。 本發明之ρ30多肽亦包括保存變異之多肽序列。，，保存變 異11 一詞，如在此所用，指胺基酸殘基由另一個在生物上相 似之殘基置換。保存變異之實例包括一個疏水性殘基如異 白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸替代另一個，或一個 極性殘基替代另一個，如精胺酸替代離胺酸、越胺酸替代 天冬胺酸或麩醯胺酸替代天冬醯胺酸，及其類似情形。，，保 存變異”一詞亦包括使用取代之胺基酸替代未取代之母胺基 酸’其限制條件係對取代多肽所生之抗體亦與未取代多肽 免疫反應。 本發明亦提供編碼本發明ρ 3 0多肽之分離核酸序列。”分 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --------ITAw (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以2453

五、發明説明（1〇 ) 離”一詞，如在此所用，包括多核甞酸，其實質無其他核 酸、蛋白質、脂質、醋類或與其天然有關之其他物質。本 發明之多核芬酸序列包括編碼p30之DNA、CDNA和RNA 序列。當然地’編碼所有或一部分P 3 〇之全部多核嘗酸亦 包括於此，祇要其編碼具p30活性之多肽。如此多核菩酸 包括天然來源、合成和有意地巧妙處理之多核芬酸。例 如，mRNA序列之部分可改變，因為可替rRNA接合型態 或使用RN A轉譯之可替代啟動基因。作為另一個實例， P30多核苷酸可接受部位引導突變。p3〇之多核甞酸序列亦 包括抗感覺序列。本發明之多核甞酸包括因基因編碼退化 結果之序列。有20種天然胺基酸，其大多數由多於一種密 碼子所特定。因此，所有退化核甞酸序係包括在本發明 中，祇要由核茹酸序列密碼之p30多肽之胺基酸序列在官 能上未經改變。此外，本發明亦包括編碼多肽之多核茹 酸’其具p30之生物活性及具至少一個與p3〇多肽免疫反應 之抗體之抗原決定部位。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之p30核酸包括（a)編碼天然來源p3〇之序列及（b) 在咼度緊迫條件下與序列互補物雜交之任何核嘗酸序列， 例如在0.5莫耳濃度NaHP04、7 %十二基硫酸鈉（sd S )、1 毫莫耳濃度EDTA中在6 5 °C下與濾器結合之DNA雜交，及 在 0.1X SSC/ 0.1% SDS 中在 68 °C 下清洗[Ausubel F· M· 等，編者（ 1989)分子生物學之目前實驗計劃，第I卷，格陵 出版協會公司約翰•懷尼氏公司，紐約]及編碼在官能上相 當之基因產物。本發明亦包括序列（a)和（b)之退化變異 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公羡) 1222453 A7 B7 五、發明説明（11 體 本發明亦包括核酸分子，較佳地DNA分子、其雜交至， 及因此為前段之核甞酸序列（a)和（b)之互補物。如此雜交 條件可為高度緊迫的，如上述，或較不高度緊迫，如中度 緊迫條件，例如在0.2 X SSC/0.1% SDS中在42°C下清洗 [Ausubel等，如前所引]。在其中核酸分子為去氧寡核答酸 (noligos”）之核酸分子之例中，高度緊迫條件可例如指在6 X SSC/0.05%焦磷酸鈉中在37°C下（為14-鹼基〇ligOS)、 48°C 下（為 17-鹼基 oligos)、55°C 下（為 20-鹼基〇ligos)、 及60°C下（為23-鹼基oligos)清洗。此些核酸分子可編碼或 作用為p30抗感覺分子，有用於例如p3〇調節（為和/或作 為在p30核酸序列之放大反應中之抗感覺引子）。再進一 步，如此分子可作為篩選方法之成份，因而例如p 3 〇基因 之存在可予檢出。 除上述之核答酸序列外，全長CDNA或基因體序列可予鐘 定及輕易分離，而無不當實驗，藉由在技藝中熟知之分子 生物技術。本發明包涵此些核酸分子。 經 濟 部 中 央 標 準 員 工 消 費 ，合 作 社 印 製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之DNA序列可由一些方法獲得。例如，A可使 用在技藝中熟知之雜交或電腦基質之技術分離。此些包 括’但不限於··（a)基因體*cDNA庫與探針雜交以偵測同 質核菩酸序列；（b)表現庫之抗體篩選以偵測具分享結構特 徵之選殖DNA節片；（c)在基因體〇ΝΑ或cDNA上使用能退 火至所要DNA序列之引子之聚合酶鏈反應（pcr) ; (d)相 似序列之序列資料庫電腦搜尋；扣減DNA庫之差異性 14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210x297公董 1222453

篩選；及（f)由T細胞cDNA庫之表現序列標籤（EST)大量地 基因體序列。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 較佳地，本發明之P 3 0多核甞酸係衍生自哺乳類生物。依 賴核酸雜交之篩選程序可能地自任何生物分離任何基因序 列，祇要得到適當的探針。寡核荅酸探針，其對應著一部 分編碼問題蛋白質之序列，可經化學合成。此需要胺基酸 序列之短寡核苷酸伸張必須是已知的。編碼蛋白質iDNA 序列可自基因岔碼中扣除，然而密碼之退化必須列入考 慮。可能地在序列退化時進行混合加成反應。此包括變性 雙股DNA之異質混合物。為如此篩選，雜交較佳地在單股 DNA或變性雙股DNA上進行。雜交特別有用於偵測〇〇1^八 選殖體，其衍生自其中存在有關於所要多肽之極低量 mRNA序列之來源。換言之，藉引導以避免非特異結合之 緊迫雜交條件，可能地例如允許特定cDna選殖體之自放射 攝影顯像’由標的D N A在混合物中與完全互補之單一探針 雜 X[Wallace 等（1981)Nucl· Acid Res•，义：879]。可替代 地’扣除性之庫係有用於消除非特異之〇]〇]^八選殖體。 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 當所要多肽之全部胺基酸殘基序列未知時，直接合成 DN A序列是不可能及選定之方法為合成cDNA序列。在分 離所要cDNA序列之標準程序間的是形成帶質體或噬菌體之 cDNA庫，其係衍生自mRNA逆轉錄，其在具高量基因表現 之供者細胞中係豐富的。當與聚合酶鏈反應技術組合時甚 至稀少之表現產品可經選殖。在其中多肽之顯著胺基酸序 列部位係已知時，複製推斷存在於標的CDNA之序列之標示 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） 1222453 A7 B7 五、 發明説明（13 ) 單或雙股DNA或RNA探針序列之產生可用於DNA/DNA 雜X程序，其在cDNA之選殖份上進行，其已變性成單股形 式[Jay 等（ 1983 )Nucl· Acid. Res·，II: 2325]。適當之寡核 菩酸探針和引子可以構築，由”回轉譯，自N_端胺基酸定序 所得之p30多肽胺基酸序列。 cDNA表現庫，如；lgtU，可間接篩選具至少1個抗原決 足部位之p30肽，使用p3〇特異之抗體。如此抗體可予多株 或單株衍生及用以偵測指示p3〇cDNA存在之表現產物。 在P 3 0核酸之變化包括基因内突變（例如點突變、非感覺 (停止）、誤感覺、接合部位和移碼）及異質接合或同質接合 刪除。如此改變之偵測可由熟諳此技藝者所知之標準方法 元成，包括序列分析、南方吸潰分析、1>(：尺基質分析（例如 多重PCR，序列標籤部位（STS))及原位雜交。如此蛋白質 可例如由標準SDS-PAGE和/或免疫沉澱法分析和/或西方 吸潰分析。 本發明亦包含DNA載體，其含任何前面p3 〇編碼序列和 /或其互補物（即反感覺）及表面載體，其含任何前面0〇編 碼序列。表現載體包括或含核酸，其中編碼本發明之肽或 多肽 < 多核：y：酸序列經操作地連結至啟動基因或促進基因_ 啟動基組合。啟動基因為轉錄調節元件，包括〇1^八分子之 區域，典型地在轉錄開始之點前（上游）1〇〇個核苷酸内。另 一個轉錄調節元件為促進基因。促進基因提供時間、位置 和表面量上之特異性。不似啟動基因，促進基因可在位於 轉錄邵位不同距離時作用，祇要存在著啟動基因。促進基 --------------1T------0 广褚先閲讀背面年：A意事項I填寫本 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -16 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 1222453 A7 一 " ----— B7 五、發明説明（Μ ) 因研可位在轉錄起始部位之下游。表現載體之編碼序列係 操作地連結至轉錄終止區域。在啟動基因之控制下為帶著 編碼序列，必要地將肽或多肽轉譯密碼之轉譯起始部位定 在啟動基因下游㈠^之丨至約15個核甞酸間。如此調節元件 包括，但不限於巨細胞病毒hCMV中前段基因、sv4〇腺病 毒之前段或後段啟動基因、^系統、系統、χΔ^系統、 系統、噬菌體a之主要操縱和啟動基因區域、fd套蛋白 質之控制區域、3-磷酸甘油酸激酶之啟動基因、酸性磷酸 酶之啟動基因及酵母α •配對因子之啟動基因。 表現載體和其構築之方法係熟諳此技藝者所知的。合適 之載體包括質體和病毒載體如疱疹病毒、逆轉錄酶病毒、 金絲雀痘病毒、腺病毒及腺有關病毒，在其他者間。 本發明包括合適之宿主細胞株，其以含所述之ρ3〇核酸序 列之表現載體轉移感染。用以轉移感染之細胞包括，但不 限於哺乳類本源之ΗΕΚ 293細胞或Sf9昆蟲細胞，例如以 其不同天然或工程形式表現p3〇。細胞由多種技藝中常用 之方法轉移感染，例如，電孔法或磷酸鈣沉澱法。基因亦 可由病毒載體，例如逆轉錄酶病毒之轉導而導入細胞中。 成功轉移感染之細胞株由熟諳此技藝者熟悉之適當方法選 定，例如使用以藥物如GeneticinTM( G418)或嘌呤為例補充 之組織培養基，因為其中相關表現載體含抗性基因。成功 轉移感染之細胞株由多種可能方法，例如流動細胞計數分 析篩選p30分子之細胞表面表現。 π宿主細胞”為其中載體可經增殖及其dNA經表現之細 -17- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ^批衣------1T------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1222453 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（15 胞。名到亦包括目標宿主細胞之任何子代。當然地，所有 子代不會與母細胞完全相同，因為在複製期間會有突變。 然而，如此子代係包括在當”宿主細胞"一詞使用時。 特異地識別在P 3 0胺基酸序列内抗原決定部位之抗體亦由 本發明所包涵。如此抗體包括但不限於多株抗體、單株抗 體、人、人化或嵌合型抗體、單鏈抗體、Fab節片、 F(ab’）2節片及任何以上之抗原決定部位結合節片。 本發明之抗體可用於例如治療自免疫疾病和淋巴細胞惡 性。其亦可用於測試p 3 〇在細胞之表現及因此可作為部分 篩選程序以選定特別個體之適當治療。例如，若淋巴瘤或 白血病病人之腫瘤細胞表現p3〇時，抗-p3〇抗體或抗邛3〇 抗體之免疫毒性共軛物或抗_ p 3 〇抗體之免疫毒性共軛物可 在該病人中作為療法之用。如此抗體亦可用於本發明之篩 選分析法中。 為產生本發明之抗體，宿主動物由注射以p3〇多肽或以表 現p30多肽之細胞而免疫化。可取代地，對應此些多肽 特異區域之肽可作為免疫原。如此宿主動物可包括但不限 於兔、小鼠和大鼠。不同佐劑可用以增加免疫反應，依宿 主物種而定，包括但不限於福洛德氏（Freund，s)(完全和不 %全）佐劑、礦膠如氫氧化鋁、離胺酸基卵磷脂、複合酸多 醇、聚陰離子、肽、油乳化液、BCG(bacille Calmette ·

Guerin)和棒狀桿菌。多株抗體為異質族群之抗體分子，其 衍生自免疫化動物之血清。 以期進一步增強免疫生成，免疫原可與載體偶合。如此 -__-18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -------—#^1 —----1T------0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1222453 A7 -----—— B7 五、發明説明（16 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 載也《Λ例為栓孔笠貝血藍蛋白(KLH)和牛血清白蛋白 (主BSA)。其他白蛋白如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血 々白蛋白亦可作為料。偶合肽至㈣之方㈣在技蔽中 熟^的及包括使用d羰：亞胺和間順丁缔二酿亞胺 基苄醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯。 抗原使用量可輕易由熟諳此技藝者測定，而無不當實 驗。抗原可由多種途徑施用（例如皮下、肌肉内、皮内、靜 脈内和腹膜内）。多株抗體之產生由取免疫化動物之血在施 用後不同時間下監測。當得到所要量之抗體時，動物經放 血及血清經保存。 單株抗體，其對特別抗原之同質族群抗體，可由任何技 術獲得，其由培養物中連續細胞株提供抗體分子之產生。 此些包括但不限於融合瘤[Kohler和Milstein( 1975)自然 21^: 495-497 ;美國專利號 4,376，11() ; Howell 和 Lane (1988)抗體’實驗室手冊，冷泉港出版社，紐約]，人6_細 胞融合瘤技術[Kosbor等（ 1983)免疫學今日4 : 72 ; Cole等 (1983) Proc· Natl· Acad· Sci. USA 姐：2026]，及EBV-融合 瘤技術[Cole等（ 1985)單株抗體和癌症療法，Alan R. Liss 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 公司]。如此抗體可為任何免疫球蛋白群的，包括IgG、 IgM、IgE、IgA、IgD及其任何次群。 此外，產生’’嵌合型抗體”之發展技術可以使用[Morrison 等（1984) Proc. Natl· Acad· Sci. USA 81 ： 6851 ； Neuberger 等（ 1984)自然 312 : 604 ; Takeda 等（1985)自然 314 ： 452 ]。此些涉及編碼適當抗原特異性小鼠抗體之基因部分 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1222453 A7 '-—-----B7 五、發明説明一~： 一 接口至編碼適當生物活性人抗體之基因部分。嵌合型抗體 為其中不同部位衍生自不同動物物種之分子，如該等具衍 生f鼠單株抗體之可變區域和人免疫球蛋白固定區域。如 此嵌合型抗體亦可產生，例如由含編碼IgH之人基因場所 及K和λ輕鏈場所之小鼠免疫化。 可替代地’所述為產生單鏈抗體之技術[美國專利號 4,946,778 ·’ Bird( 1988)科學 423 ; Hust〇n 等（1988)

Pr〇c. Natl· Acad· Sci USA 泣：5879 ;及 Ward 等（1989)自 然Hi·· 544]可經調適以產生對抗p3()抗原決定部位之單鏈 抗體。單鏈抗體經胺基酸橋由鍵結重和輕鏈Fv區域之節片 形成，生成單鏈多肽。其方便地由重組]〇1^八技術產生。 識別特定抗原決定部位之抗體節片可由已知技術產生。 例如，如此節片包括但不限於F(ab，）2節片，其可由胃蛋白 酶消化抗體分子產生，及Fab節片，其可由還原F(abf)2節 片之二硫橋生成。可替代地，Fab表現庫可經構築等 (1989)科學1275]，以允許快速和簡單鑑定具所要特 異性之單株F a b節片。 篩選結合特異性抗體之方法係在技藝中熟知的。此些包 括’但;F限於以下之測冑：⑷結合至表現細胞表面p3〇之 細胞；（b)無結合至不表現p30之細胞；（c)結合至p3〇多 肽；（d)無結合至非P3 0之多肽（例如ΤΝρ、、[I冷、 Fas配體、CD40配體或白蛋白）；及（e)由對應在_内重 要區域之肽而特定抑制結合&30，例如涉及結合至^履 或LT/3R之區域。 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS M4規格（210X297公董)~--- 裝 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1222453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（18 ) 本發明具試管中系統之特徵，其經設計以鑑定能調節經 HVEM或LT方R受體多肽中介之細胞反應之化合物。，，細胞 反應’’在此指HSV之細胞活化或細胞内在化。此些細胞反應 由以下之交互作用引出（^11¥]£%與1)3〇、gD或LTa :或 (b)LT 石R 與 p30。 ’’配體π —詞指多肽或化合物，其以高親和力和特定方式 以引出官能性反應下結合至受體蛋白質^例如本發明之配 體包括p30、gD或LTa。，，受體，，一詞在此指多肽，其在由 配體結合時，謗生細胞反應。本發明之受體包括HVem或 LT /3 R。”結合劑” 一詞指多肽或化合物，其以高親和力和 特定方式結合至受體或配體，及會或不會引出官能性反 應。測試化合物為界定、分離或純化之候選化合物（例如合 成之小分子），組合庫之成員或其可存在於生物樣品如生物 流體、組織萃取液、次細胞區分液或細胞解離物。 在具體實施例中，本發明具鑑定化合物之分析法之特 徵’其影響HVEM -結合劑·中介之細胞反應。此分析法涉 及：（a)培養化合物與HVEM多肽或表現HVEM多肽之細 胞，及H VEM結合劑，在允許組成交互作用之條件下；及 (b)測定化合物在HVEM-結合劑·中介細胞反應之作用。亦 在本發明内的是鑑定化合物之分析法，其影響LT冷R-p 3 〇 -中介細胞反應。此分析法涉及：a)培養化合物在LT々R多 肽或表現LT}3R多肽之細胞，及與p30，在允許組成交互作 用之條件下；及（b)測定化合物在LTiSR-p30-中介細胞反 應之影響。在本發明之分析法中，化合物係篩選其調節由 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） m am am· maemt9 i nn m 1^^^ 11 ml mi HB^i —1 mi 一 ) —^i_i am ·ϋϋ nn emm (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1222453 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（19 ) HVEM或LT /3 R與配體交互作用所中介細胞活化或抑制易 受細胞受HSV感染之能力。 本發明具細胞反應分析法之特徵。此些細胞反應分析法 測定H SV之細胞活化或細胞感染。 試驗化合物可經測試其調節由配體（例如p3〇、LTa或gD) 和對細胞適當之次最適劑量刺激物刺激之表現受體（例如 HVEM或LT万R)細胞之反應。”反應者”受體表現細胞可自 個體新鮮獲得或其可為培養之細胞株。細胞可内源地表現 編碼受體或由轉移感染基因編碼之受體。配體可以分離多 月太之形式加入細胞反應培養物中或由添加表現配體之細胞 至培養物中。配體表現細胞可表現編碼配體之内源基因及 可表現編碼配體之轉移感染基因。再者，配體可在細胞表 面上表現（p3 0或gD)或可經排出（p3〇、gD或LTa )。以期 P 3 0或gD經排出，編碼此之基因必須將編碼穿透膜功能部 位之區域刪除。 細胞活化可由例如細胞增殖、細胞表面活化標記之再表 現，或可溶性因子產生而測定。 在較佳之具體實施例中，細胞為淋巴細胞。在T細胞之例 中’受體（HVEM或LT石R)表現反應者τ細胞可在試驗化合 物、配體和次最適劑量之T細胞活化劑，例如抗_ c D 3抗 體、植物凝集素如植物凝血素（PHA)或超抗原如葡萄球菌 %毒素C(SEC)之存在下培養。控制組為含以下之培養物： (a)僅有T細胞；（b)T細胞與τ細胞活化劑、有配體及並無 試驗化合物，（c) T細胞與T細胞活化劑，無配體及無試驗 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公董） --------^裝------訂------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7

1222453 五、發明説明（2〇 ) 化合物；（d ) T細胞與T細胞活化劑，無配體及無試驗化合 物；（e)T細胞但無Τ細胞活化劑，有配體及無試驗化合物 及（f) T細胞但無T細胞活化劑、無配體及無試驗化合物及 (g) T細胞但無T細胞活化劑、無配體及有試驗化合物。τ細 胞活化可以Τ細胞增殖測定，由併入3η -胸苷（見實施例 5 )、謗生活化標記如C D 6 9或C D 2 5 ’或產生細胞分裂素如 内白素-2(IL-2)、内白素_4(IL-4)或干擾素(INFr )。 在B淋巴細胞之例中’相似之反應分析法可進行。b細胞 活化劑可為絲裂素如商陸草絲裂素、葡萄球菌蛋白質A或 抗免疫球蛋白。細胞活化細胞可由細胞增殖（再由3H -胸智： 併入）或I g分泌測定。可替代地，B細胞在營養次最適培養 基上之殘存可測定（見實施例5 )。 試驗化合物抑制淋巴球活化之能力應為一個指標，即如 此之化合物可有用於治療大部分涉及T細胞（風濕性關節 炎、胰島素依賴糖尿病和多發性硬化為例）或T和B細胞（系 統性狼療紅斑和重症肌無力為例）之自免疫疾病。試驗化合 物刺激淋巴細胞活化之能力應為一個指標，即如此之化合 物可有用於在具感染性疾病之個體刺激免疫反應，或其中 個體經免疫抑制，如例如在經歷化學療法或放射療之癌症 病人或在具AIDS之病人中。 在防止H S V感染之試驗化合物分析法中，試驗化合物可 加入HSV易受之細胞和HSV之培養物中。病毒感染之許可 細胞株包括人皮纖維母細胞、以導致活化之劑（例如抗-C D 3抗體或植物凝血素）處理之周圍血淋巴細胞及轉形細胞 _ -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2ι〇χ297公董) — 一 --------^拍衣------1T------^ ί請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁〕 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1222453 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 實 可 發明説明（21 株(」H Held、、、田胞）。病毒產生可由熟諳此技藝者所知之任 何數目方法測定，包拓/主、 、杜—、主求 括届母斑y刀析法，產生由ELISA測定 n L 、 <使用重組病母，其含指示劑基因產物 如冷-半乳糖与：酶，一插且 種易由比色測定分析法偵測之酵素 [Montgomery等，如前所引]。 試驗化合物抑制由Hsv之細胞感染之能力應為一個指 標，即如此之化合物可有用於治療具HSV感染之個體。 =期4 4疋口化合物影響由結合相關受體-配體對之任一 成貝（細胞反應功能，其可經測試其結合至可溶性形式之 受體或配體之能力，藉由技藝中熟知之分析法，例如 ELISA ®方吸/貝法或放射免疫分析法。4者，為測試是 否試驗化合物結合至受體或配體造成抑制其互相結合，試 驗化合物可測試其抑制可溶性形式之受體和配體之結合能 力。此些分析法之實例為競爭性Elisa，競爭性西方吸潰 法及競爭性放射免疫分析法。 用於本發明篩選分析法中之肽和多肽可由多種方法獲 付。較小的肽（少於5 0個胺基酸長）可方便地由標準化學方 法合成。一些多肽（例如抗體）可購自商業來源。當他處不 可得時，抗體可如上述地生成。可偵測之標示抗體可購自 商業來源或輕易由熟諳此技藝者製備。 多肽如HVEM、LT /3 R、p3 0、gD或LT α可自生物來源 由熟諳此技藝者熟知之方法純化[蛋白質純化，原理和 施’第2版（ 1987)Scopes，Springer Verlag，紐約]。其亦 以其天然來源、截切、融合或嵌合型蛋白質形式產生，藉 -24 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） I 裝 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 1222453 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（22 ) 由重組DNA技術，使用技藝中熟知之技術。此些方法包 括’例如試管中重組DNA技術、合成技術和體内基因重 組。見例如，述於以下之技術：Sambrook等（ 1989)分子選 殖’實驗室手冊，冷泉港出版社，紐約及Ausbel等，如前 所引。可替代地，編碼蛋白質之RNA可經化學合成。見例 如述於以下之技術：寡核：y：酸合成，（ 1984)Gait，M.J.編 者’IRL出版社，牛津，其在此以其全體以提及之方式併 入。 多種宿主表現載體系統可用以表現核甞酸序列。當肽或 多肽為可溶性的時，其可自以下回收：（a)培養物，即自其 中肽或多肽並未排出例之宿主細胞或自培養基，其中肽 或多肽由細胞排出之例。表現系統亦包含原位表現多肽之 工程化宿主細胞，即掛錨在細胞膜上。自如此表現系統純 化或增純多肽可使用適當之清潔劑和脂微粒及熟諳此技藝 者熟知之方法完成。可替代地，如此工程化宿主細胞自身 可用於以下之情況，即其重要的不僅要保持蛋白質之結構 和官能特性，而且要評估生物活性。 可用於本發明目的之表現系統包括但不限於微生物如細 菌（例如大腸桿菌和枯草桿菌），以含核甞酸序列之重組噬 菌體DNA、質體DNA或黏接質體DNA表現載體轉形，以 重組酵母表現載體轉形之酵母；以重組病毒表現載體（桿病 毒）感染之昆蟲細胞；以重組病毒表現載體（例如花椰菜嵌 紋病毒，CaMV ;煙草嵌紋病毒，TMV)感染或以重組質體 表現載體轉形之植物細胞系統；或掛錨含自哺乳類細胞（例 -25 - 本紙張尺度適用中國g家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公董） ~ -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) # 項再填. 裝. 、1Τ 4 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 1222453 A7

_ * " ,., B 五、發明説明（23) 如金屬硫新質啟動基因）之基因體或自哺乳類病毒衍生啟動 基因之重組表現構體之哺乳類細胞（例如cos、CHo、 ΒΗΚ、293、3T3)。 在細菌系統中，多數表現载體可有利地選定，依要表現 基因產物之所要用途而纟。例如，當大量如此蛋白質要生 產時，例如為產生對蛋白質之抗體，引導表現高量而可輕 易純化（融合蛋白質產物之載體可為所要的。如此載體包 括但不限於大腸桿菌表現載體pUR278 [Rutha等（MM) EMBO J· 2_ · 1791 ] ’其中編碼序列可個別地連結至在密碼 中具Μ編碼區域之載體，使產生融合蛋白質；plN載體 [In〇Uye 和 In0uye( 1985)核酸研究辽：3101 ; Van Heeke 和 Schuster( 1989)J. Biol. Chem. 264. ： 5503];及其類似物。 pGEX載fa亦可用於表現外來多肽，作為與麩胱甘肽s_轉移 酶（GST)<融合蛋白質。通常，如此融合蛋白質為可溶性 的及可輕易自解離細胞純化，由吸附至麩胱甘肽瓊脂糖珠 體，接著在游離麩胱甘肽存在下溶析。pGEX載體經設計以 包括凝血酶或因子又3蛋白酶裂解部位，使選殖之標的基因 產物可自G S T部分釋出。當然地，篩選分析法所用之多肽 可為天然來源形式之多肽或含多肽之融合蛋白質。融合蛋 白貝之不相關部分可例如為免疫球蛋白G之F c部份、六組 胺酸或GST。 在哺乳類宿主細胞中，多數病毒基質表現載體系統可以 採用。在腺病毒作為表現載體之例中，重要之核荅酸序列 可連接至腺病毒轉錄//轉譯控制複合物，例如後段啟動基 -26- 本紙張尺度適财關家標準（c叫A4規格（21Gx297公董） ^^裝 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) . 1222453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（24 ) 因和二元組前導基因序列。此嵌合型基因然後可由試管中 或體内重組插入腺病毒基因體中。在病毒基因體之非必要 區域（例如區域E 1或E3 )之插入將生成重組病毒，其為有生 命的及能在感染宿主中表現基因產物見Logan* Shenk ( 1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8JL : 3655]。特定 起始訊息亦可為插入核：y：酸序列之有效轉譯所必要。此些 訊息包括ATG起始密碼子及相鄰序列。在全部基因或 cDNA之例中，包括其自身之起始密碼子和相鄰序列，經插 入適當之表現載體，無附加之轉譯控制訊息可為必要的。 然而，在僅一部份編碼序列經插入之例中，外源轉譯控制 訊息’包括或許A T G起始密碼子，必須經提供。再者，起 始密碼子必須與所要編碼序列之密碼同位相，以確保全部 插入物之椁譯。此些外源轉譯控制訊息及起始密碼子可為 多種本源的，天然或合成的兩種。表現效力可由包含適當 轉錄增強基因元件、轉錄終止基因等而增強[BiUner等 ( 1987)酵素學方法μ: 516]。 此外，宿主細胞株可予選定，其調節插入序列之表現， 或修飾及處理在所要特定型式之基因產物。如此蛋白質產 物之修飾（例如糖苷化）和加工（例如裂解）可為蛋白質功用 所重要的。適當之細胞株或宿主系統可經選定以確保表現 外來蛋白質之正確修飾和加工。哺乳類宿主細胞包括但不 限於 CHO、VER0、BHR、Held、⑽、mdck、、3τ3 及 WI38 〇 為長期、高產量之重組蛋白質生產，穩定表現係較佳 --------^^裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 訂

-JAW -27 - 1222453 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（25 的。例如，穩定表現上述序列之細胞株可予工程化。與其 使用含病毒複製本源之表現載體，宿主細胞可以由適當表 現控制元件（例如啟動基因、增強基因序列、轉錄終止基 因、聚腺苷化部位等）和可選定之標記所控制之DN A轉 形。導入外來DNA後，工程化細胞可允許在強化培養基中 生長1-2天，及然後轉至選擇性培養基。可選定之標記在重 組質體中賦予對選擇之抗性及允許細胞穩定整合質體至其 染色體中及生長以形成位址，其依序可予選殖及擴張至細 胞株中。此方法可有利地用於工程化細胞株，其表現基因 產物。如此工程化細胞株可特別有用於篩選和評估影響基 因產物内在活性之化合物。 融合蛋白質可輕易由採用抗體或特定地結合至要表現之 融合蛋白質之部分而純化。例如，由janknecht等[(1991)

Pi*〇c· Natl· Acad· Sci· USA M_: 8972]所述之系統允許輕易 純化在人細胞株中表現之非變性融合蛋白質。在此系統 中，重要基因經次選殖至疫苗重組質體中，使基因之開放 密碼子經轉譯融合至包括6個組胺酸殘基之胺基端標籤。自 以重組疫苗病毒感染之細胞之萃取物經載A Ni2+_腈基乙 酸-、瓊脂糖管柱及組胺酸標籤蛋白質經選擇性以含咪唑緩衝 液/合析在而要時，組胺酸標籤可選擇性以適當之酵素裂 解。 、 嵌合型蛋白質亦可由熟諳此技藝者所知之方法衍生。此 些涉及接合編碼給定蛋白質之基因之一部分至i或多個自i 或多個編碼不同蛋白質之基因衍生之部分。嵌合型多肽為 ^^裝 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -28-

1222453 A7 B7 五、發明説明（26 ) 其中不同部分係自不同蛋白質衍生之分子。例如，嵌合型 蛋白質可含HVEM之功能部位或LT /3 R之另一個功能部 位。 本發明提供調節HVEM中介之細胞反應，藉由表現受體 多肽HVEM之細胞與HVEM結合劑接觸。可替代地，HVEM 中介之細胞反應由HVEM之配體以配體結合劑接觸而調 節。如此配體包括p 3 0、LT α或gD。通常，p30在細胞表 面上表現，LTa經排除及gD在HSV病毒粒子上或在HSV-感染細胞之表現上表現。’’細胞反應π —詞在此再指細胞活 化或H S V由細胞之内在化。本發明亦具調節LT /5 R-中介細 胞反應之方法之特徵，由表現LT0R之細胞或表現LT/3R受 體ρ30之細胞與結合HVEM或ρ30之結合劑接觸。 如在此所用，”接觸”一詞指受體或配體暴露於受體-調節 有效量之結合劑，使結合劑可有效調節由配體與受體交互 作用所起始之細胞反應。調節可造成細胞反應之抑制或活 化。特別受體-配體對之特別結合劑之此些可替代性質可事 先使用所述之篩選分析法測試。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 有關受體結合劑，HVEM結合劑包括可溶性gD、可溶性 p30或LTa之肽節片，較佳地在天然來源LTa之N-端位置 108對應之位置上含胺基酸Tyr之肽節片。LTySR結合劑為 可溶性ρ 3 0。 關於配體結合劑，p 3 0結合劑包括可溶性HVEM、可溶性 LT /3 R或特異結合ρ 3 0之抗體。LT a結合劑為可溶性 HVEM。 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1222453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __________B7 五、發明説明（27 ) 接觸可為試管中，例如由添加結合劑至表現HVEM或LT 冷R之細胞之培養物，例如淋巴細胞，經歷由HVEM配體 (p30、LTa或gD)或LT/3 R配體p3〇之活化。結合劑亦可 加入例如HVEM表現細胞之培養物，暴露至HSV病毒粒子 表面上或H S V感染細胞表面上之gD。結合劑調節此些細胞 反應之能力可事先使用所述之篩選方法測試。結合劑可以 分離多肽或以含編碼核酸分子結合劑之表現載體轉移感染 之細胞加入。在此些試管方法中，結合劑之"受體調節有效 量"為調節細胞活化或HSV感染大於20%所需之量，較佳 地大於5 0%，更佳地大於80%及最佺地大於95 %。 接觸在個體中可為體内的。個體可為哺乳類，較佳地人 類’具自免疫疾病如風濕性關節炎、胰島素依賴之糖尿 病、多發性硬化、系統性狼瘡紅斑或重症肌無力、淋巴樣 (T或B細胞）惡性、HSV感染、非HSV或免疫壓抑之生物感 染。HVEM-p30或LTyS R-P30中介細胞反應之抑制可有利 於具自免疫疾病或淋巴樣惡性之病人中，因其可防止τ細胞 增殖（如於風濕性關節炎、胰島素依賴之糖尿病、多發性硬 化、系統性狼瘡紅斑' 重症肌無力和Τ細胞惡性）及6細胞 增殖（如於系統性浪瘡紅斑、重症肌無力和Β細胞惡性）。 HVEM-gD中介細胞反應（即Hs ν内在化）之抑制可治療具 HSV感染之個體’因其將防止在細胞外空間存在之^^-表 現HSV病毒粒子内在化所中介之或自表現gD在其表面上之 HSV -感染細胞之病毒散佈。HVEM_p30或LT点R-p3〇中 介細胞反應之刺激將有用於治療具非HSV或免疫壓抑個體 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公楚) "~ -- (請先閲讀背面之注意事'

Jf 項再填· 裝-- :寫本頁} 、π 1222453 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（28 感染之個體（例如病人經歷癌症之放射和/或化學療法，非 淋巴樣惡性）或AIDS病人，因T和B細胞兩者增殖將被刺 激。自然地，吾人應避免在具HSV感染之個體中使用刺激 H VEM - p 3 0中介細胞反應之結合劑，其中如此之劑也許會 增強HVEM-gD細胞反應，及因而散佈HSV病毒。然而， 在有關結合劑中之此活性可事先使用前述之篩選分析法測 試。相同地，此些刺激性結合劑將不用於淋巴樣惡性，因 其可促進腫瘤細胞之生長。 用以體内調節細胞反應之結合劑包括天然來源形式之 11¥丑14、1^；311、1)30、8〇和1^〇;。此些將由前述之方法 產生。亦包括的是對p30之抗體。自LTa衍生之肽及其調 節HVEM-LTa交互作用將予使用。肽將含少於2〇5個，較 佳地少於100個，更佳地少於50個及最佳地少於2〇個胺基 酸。例如其可含5、8、12、15或18個胺基酸。肽較佳地將 在自天然來源LTa之N-端胺基酸殘基1〇8對應之位置上含 殘基T y r，或其保留性置換。 亦包括作為結合劑的是前述肽之肽基類似物。肽基類似 化合物為具三級結構之合成化合物（即”肽主題”），基於選 定肽之三級結構。肽主題提供具調節細胞反應活性之肽基 類似化合物，其係相同或大於自其中肽基類似物所衍生之 肽之活性。肽基類似物化合物可具附加之特性，其增強其 治療應用如更大之親和力和//或渴望及延長之生物半生 期。本發明之肽基類似物典型地具部分或完全非肽之主 鏈，但具完全與在肽上發生而肽基類似物所基於之胺基酸 ------->10^-------1T------9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -31 - 1222453 A7 B7 五、發明説明（29 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 殘基側基相同之側基。一些類型之化學鍵，例如酯、硫 酯、硫酿胺、退酸胺、還原羰基、二伸甲基和酮伸甲基 鍵，在技藝中係已知為構築蛋白酶抗性肽基類似物中肽鍵 之通常有用取代物。 多肽和肽結合劑可由在封阻劑之胺基和羧基端之一或兩 者上添加而修飾，以期促進有關多肽或肽在體内之殘留。 此可用於該等情況，其中肽端傾向於蛋白酶之降解（”輕咬 ")。如此封阻劑可包括，而無限制於附加有關或無關之肽 序列，其可連接至要施用之多肽或肽之胺基和/或羧基端 殘基。此可在肽或多肽合成期間化學地合成或由重組DNa 技術。可替代地，封阻劑如焦麩胺酸或熟諳此技藝者所知 之其他分子可連接至胺基和/或羧基端殘基，或以不同部 分替換在胺基端上之胺基或在羧基端上之羧基。同樣地， 結合劑可在施用前共價或非共價偶合至醫藥上可接受之，，載 體’’蛋白質。 體内傳送涉及施至個體之結合劑自身、編碼結合劑之核 酸、編碼結合劑之表現載體或以載體轉移感染或轉導之細 結合劑可傳送至哺乳類之細胞，使用實質相同於該等前 述傳送至人個體之技術。適當哺乳類之實例包括但不限於 人類、非人之靈長類、馬、牛、綿羊、狗、貓、小藏、大 鼠、天竺鼠、大頰鼠、兔和山羊。 結合劑可以其未修飾狀態，溶於適當之生理溶液，例如 生理鹽水傳送至病人之細胞。自然地，想要地此些肽經選 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝- 訂 it -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNs ) μ規格（210 X 297公嫠） 1222453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（3〇) 擇地標的至有關之組織和細胞類型^此可由直接以影響之 器官或組織接觸而達成，例如定位注射或植入。因此，在 自免疫疾病如風濕性關節炎或胰島素依賴之糖尿病中，肽 可直接分別導入影響之關節或胰臟，或較佳地至枯竭之淋 巴樣組織’其中發生活性之自免疫反應。 可替代地，結合劑在微脂粒中傳送至已併入受體之配體 在有關細胞（例如T細胞或B細胞）上或抗體至由此些細胞表 現之細胞表現標記上。因此，C D 4 T細胞表面標記特異之 抗體可引導含抗-C D 4抗體和有關結合劑之微脂粒至c D 4 + T細胞中。此途徑可用於自免疫疾病和η SV感染兩者。在 自免疫疾病中，其中由優勢病原Τ細胞選體表現之τ細胞受 體（TCR)經界定，有關τC R組成特異之抗體（例如ν冷）可 使用。後者方法將代表理想形式免疫療法，其中病原效應 物細胞經特異地標的抑制，而免疫系統之全部及標的器官 之細胞保持未解決的。 在淋巴瘤或白血病病人中，抗增殖結合劑較佳地經引導 至瘤細胞。肽可例如在手術除去腫瘤後直接注射至圍繞淋 巴瘤腫瘤部位之組織上，以期抑制殘留腫瘤細胞之生長。 除手術外’腫瘤可經治療，由原位注射結合劑在腫瘤中。 前述之微脂粒方法亦可利用。在此例中，腫瘤特異抗原 (TSA)或腫瘤有關抗原（ταα)特異之抗體將予採用。 在醫學技藝中熟知地，任一個病人之劑量依許多因子而 定，以及要施用之特別化合物、施用之時間和途徑及要共 同施用之其他藥物。本發明之結合劑劑量將變化，但在靜 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） --------^^裝------訂------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1222453 五 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 ---~~----- —__B7 、發明説％ (31^ ~~ 一 ---- 脈内施用時，可為約0.01毫克至1〇毫克/毫升血量。施用 义途㈣劑量對熟練藥學家和醫生係熟决口的。㊣ 等前述者外，包括但不限於：腹膜内、肌肉内、肺内 黏膜、皮下及靜脈内。 ^ 體内基因療法途徑需要基因構體直接傳送至病人，較佳 地將其標的至重要的細胞或組織。例如，在手術除去初級 腫瘤後，《留細胞可予標的，由含編碼抗增殖結合劑之逆 轉錄酶病毒載體之組合物治療腫瘤之附近。可替代地，除 手術外，初級腫瘤可由直接原位注射載體至腫瘤而治療;; 初級腫瘤部位末梢之惡性細胞可由靜脈傳送載體而到達。 相似地，在自免疫攻擊之標的組織可由直接注射載體而達 成。標的腫瘤細胞或活化淋巴細胞，例如可由使用逆轉錄 酶病毒完成，其穩定地轉移感染主要增殖之細胞。 組織特異之標的亦可達成，由使用由質體或其他載體由 靜電或共價力連接至聚-L-離胺酸組成之分子共轭物。聚_ L -離胺酸結合至可結合至腫瘤細胞上受體之配體[CrisUan〇 等（ 1995)J. Mol. Med· 73 : 479]。相似地，前述型之腫瘤和 細胞特異之抗體可結合至載體及因而將其標的至淋巴樣腫 瘤或細胞如丁-淋巴細胞。後者可用於自免疫疾病和H sV感 染。啟動基因誘生之相對腫瘤特異之表現可用以達成進一 步程序之標的。用於自免疫或移植病人之組織特異啟動基 因包括，例如可謗生 IL-2 [Thompson 等（1992) 1^〇1. €〇11· Biol· 11: 1043]、IL-4[Todd 等（ 1993) J· Exp· Med. 177 ： 1663]和 r -干擾素[Penix 等（（1993 ) J· Exp. Med. 178 : -34- 用中國國豕標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I ^^裴 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁j 1222453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（32 ) 483 ] T -細胞標的啟動基因。如此可誘生之啟動基因具無價 之附加優點，即表現將選擇性地在活化之T _細胞中發生。 包括在此群體之活化T -細胞中的是效應物細胞，即理想之 免疫治療模式應選擇性地抑制於自免疫病人中。 載體亦可由併入微脂粒或其他傳送媒體單獨或與如前述 之細胞特異抗體共同併入而傳送。 當有關結合劑通常結合至細胞膜（HVEM、LT石R、p30 或gD)時，編碼結合劑穿透膜功能部位之核酸區域將自内 含於表現載體之核酸中刪除。 DNA或轉移感染細胞可在醫藥上可接受之載體中施用。 在醫藥上可接受之載體為生物上相容之媒體，其係適合施 至人體，例如生理鹽水。治療有效量為本發明之DNA量， 其能在治療之動物中產生醫學上所要之結果。如在醫學技 藝中熟知地，任一個病人之劑量依許多因子而定，包括病 人之大小、體表面積、年齡、施用之特別化合物、性別、 施用之時間和途徑、一般健康及要共同施用之其他藥物。 劑量將變化，但DNA靜脈施用之較佳劑量係自約1〇6至 1 0 12份之DN A分子。此劑量可在需要時重複施用。 以下之實施例意在說明本發明及不在將其限制。 實施例 材料 以人IgGl之Fc區域與Fas : ρ c [Brunner·等（1995)自然 --· 441 ]、TNFR60 [Crowe 等（1994) J. Immunol. Methods 79]和人 LT)SR : Fc[Crowe 等（1994)科學 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I-------------T------0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 1222453 A7 —_B7 五、發明説明（33 )

264 : 707]之配體結合功能部位形成二價嵌合型蛋白質之構 築、表現和純化先前經描述。HVEM之細胞外區域由PCR 生成，使用TaqDNA聚合酶自編碼1-K184之pBECIO DNA 放大序 列 ， 使用前 進引子 5’-CGGAGATCTGAGTTCATCCTGCT AGCTGG-3，(SEQ ID NO ： 1) 和逆 轉引子 5丨-ATAGGATCCC TTGGTCTGGTGCTGACATTCC-3f (SEQ ID NO ·· 2)。放大 之HVEM產物在密碼上連結至含人Fc IgGl之桿病毒載體 pVL1392(Pharmingen)。HVEM ·· Fc 與自兔 IgG l 之Fc 區域 之相似構體在CHO細胞中產生，經純化及作為免疫原以生 成兔抗HVEM抗體。LT冷R : Fc自小鼠LT冷R(mLT冷R) DN A節片構築，其編碼細胞外功能部位之胺基酸殘基1 -Met221 [Force 等（ 1996) J· Immunol· 1995· 1 1_55_ ： 5280]， 由PCR，使用Taq DNA聚合酶，具前進引子5-’GACGTCAG ATCTTCCCACCTTTCCTCCTA-3, (SEQ ID NO : 3)和逆 轉引子 5f-GAACAGAGATCTCATTGCTCCTGGCTCTG-3, (SEQ ID NO : 4)。LTa 和 LTa Tyrl08Phe在昆蟲細胞中產 生’使用如述之重組桿病毒[Crowe等（1994) J. Immunol. Methods 168. : 79]。重組可溶性 LT α 1 冷 2 [Browning 等 ( 1996)如前所引]、TNF[Browning 和 Ribolini ( 1989) J· Immunol. 141 ： 1859 ]，和對 LT α 之單株抗體（B F 7)及LT/3 (C37、B9和B27) [Browning等（ 1995)如前所引]為傑夫里 •布朗尼之慷慨贈品（Biogen公司）。免疫沉澱之抗-LTa抗 體（選體 9B9)係來自 Boehringer Mannheim。抗 CD3 (OKT3) -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公董 1 I 批衣n 訂 AW (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1222453 A7 B7 五、發明説明（34 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在BALB/c小鼠在腹水中產生及以1微克/亳升蛋白質使 用。純化重組HSV gD_l蛋白質和突變物在桿病毒中如前詳 述地產生（Nicola 等（ 1996)J· Virol· 6 : 3815]。FITC_ 抗-C D 4 和 C D 8 抗體係獲自 Becton-Dickenson。 實施例1 · HVEM配體在T細胞之表現 方法 HVEM結合至II-23.D7細胞II-23.D7細胞株為人CD4 + T 細胞融合瘤[Ware等（ 1986)淋巴素研究5 : 313]及維持在具 10%牛胎兒血清）FBS)和抗生素之RPMI 1640培養基中。 ί 1-23 .D7細胞在37 °C下以脫鎂葉綠醇肉豆酸酯乙酸酯 (PMA)(100毫微克/毫升）或PMA(100毫微克/毫升）和離 子黴素（1微克/毫升）活化4小時。細胞經清洗及在4 °C下在 含HVEM : Fc、LT冷R : Fc或人IgG在5微克/毫升下之漢 克斯平衡鹽溶液（HBSS)(補充以1 〇 %小牛血清和〇. 1% NaN3) 中培養3 0分鐘，及然後以與藻紅血球素共軛之山羊抗人 I g G (抗-hulg - P E)染色。染色之細胞由流動細胞計數器 (FACS 口徑’ Becton-Dickenson)分析。各柱狀圖代表104個 事件。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 HVEM結合至正常人T細胞自正常供者由Ficoll-Hypaque獲 得之周圍血液單核細胞以抗CD3抗體在具IL-2之培養基中 活化5天。細胞以Ρ Μ A或Ρ Μ A和離子黴素再刺激4小時及 然後以FITC-CD4或FITC-CD8二元染色，及HVEM : Fc以 抗-huIgG-PE如上述地偵測。具補償之FITC螢光經用以在 CD4和CD4 T細胞次群體上限制外出。 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1222453 A7 B7 五、發明説明（36 ) 景染色。HVEM : Fc結合至活化11-23 .D7細胞係以分級濃 度之 LT/5R : Fc、TNFR60、Fas : Fc 或 IgG 如上述地競 爭0 · LT α同質三體之結合競爭 11-23 .D7細胞經活化及 HVEM : Fc與重組LTa或LTal)S2在4°C下預培養30分 鐘。混合液經加入以活化11-23 .D7細胞及然後以抗-huIgG_PE染色。以HVEM ·· Fc + LTa染色之螢光等於正常 IgG之背景。、 結果 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 為決定是否HVEM可結合至TNF或LTa石複合物，LTyS R ·· Fc和TNFR ·· Fc經作為HVEM ·· Fc結合至以PMA和離 子黴素活化之II-23.D7細胞之競爭抑制劑，採用具兔IgG Fc 之 HVEM : Fc 構體[Montgomery 等，如前所引]。LT /3 R : Fc 和 HVEM : Fc(人 IgGl 之 Fc)，但非TNFR60 : Fc 競 爭HVEM : Fc(兔）之結合（圖2A)。此外，有關受體融合蛋 白質、F a s : F c和TNFR 80 : Fc中無一競爭HVEM : F c之 結合。然而，令人驚奇地，LTa同質三體，但非TNF或LT 競爭 HVEM : Fc 結合（圖 2B)。LTa 之 TNFR60 結合 突變體，其中酪胺酸（Tyr)在位置108上以苯基丙胺酸（Phe) 置換（Tyrl08Phe)[Goh等（1991)蛋白質工程: 785 ]並不競 爭（圖3 )〇此些結果指出推斷HVEM配體具LTa石異質三體 和LTa —樣之特性，而且具區分其與LTal)52和TNF之特 徵。因此，LT α 2点1可為HVEM : F c識別之推斷表面配 體，其限制條件係在LT α 2 /3 1上HVEM結合部位不同於 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1222453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（37 ) TNFR60。可替代地，HVEM : Fc可識別新穎配體。生化 途徑經用以區分此些可能性。 實施例3 . HVEM配體之生化牿性化 方法 SDS-PAGE分析II-23.D7細胞以PMA或PMA和離子黴素 活化2.5小時（如在實施例1中），以磷酸鹽緩衝鹽水（pbS) 清洗2次，以半胱胺酸-甲硫胺酸缺乏之RPMI—次，及然後 再懸浮於含10%透析FBS、各250微居里之35S-甲硫胺酸和 35S -半胱胺酸及活化劑之此培養基中1.5小時。培養物上清 液經採收及細胞在含2% NP40、HEPES pH 7.0、20毫莫耳 濃度EDTA、150毫莫耳濃度NaCl具白肽素和非蛋白素（在 10微克/毫升下）、PMSF(1毫莫耳濃度）和碘乙醯胺（20毫 莫耳濃度）之緩衝液中解離。萃取液以人IgG(10微克），在 指出時，抗-LT抗體和蛋白質G球預清淨。受體：Fc融合 蛋白質（1 0微克/毫升）然後經加入樣品及以蛋白質G珠沉 澱。標示之蛋白質由還，原SDS-PAGE和磷酸影像（粒徑範圍 6-200)分析。 如上段製備之細胞萃取物先以1 0微克小鼠I g G或對LT α 或LT/3之單株抗體預清淨及然後HVEM : Fc經加入以沉澱 配體。結合至HVEM : F c之蛋白質然後由還原SDS-PAGE 解析及由磷酸影像偵測。 HVEM配體，p3 0之純化11-23 .D7細胞以PMA( 100亳微克 /毫升）或PMA和離子黴素（1微克/毫升）活化2.5小時，接 著如以上2段地以35S-甲硫胺酸和-半胱胺酸標示。細胞萃 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ΙΦ •項再填* 裝.

、1T 4 1222453 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（38 ΓΓ2Γ微克)和蛋白質。球預清淨，以除去非特異 結合Μ白f β萃取物然後由萃取物與TNFR6G: Fc和蛋

白質G球處理而耗盡LTa eHVEM: ^和蛋白質G球然後 加入年取物及培養。在各例中，球體經清洗3次以除去非結 合區分物，污染蛋白質。球體以含8莫耳濃度尿素之緩衝液 落析及罘一級中由等電焦點（以pI 5_7(5〇%)、L ^(40%)、2-10(10%)之兩性電解質混合液形成之梯度） 及還原SDS-PAGE(15%膠）在第二級中分析。 p3 0由HVEM : Fc之純化由比較由LTy3R :卜或 TNFR6 0 · F c純化之樣品而監測。LT姐：F c純化蛋白 質，LT a 1/32，係自以PMA刺激之11-23 .D7細胞分離，經 示於圖4A及結合至TNFR6 0:Fc之蛋白質，其用以自萃取 液中耗盡LT a ’經示於圖4 B。如上述地由HVEM : F c純化 之p30經示於圖4C。 示於各膠之第1列的是14C -標示之分子量標記及在第2列 的是僅在第二級中展開之受體：F c結合蛋白質。 結果 LT a在以PMA活化後由11-23 .D7細胞分泌[Ware等 ( 1992)，如前所引；Crowe 等（ 1994)科學 707]。 HVEM : Fc和TNFR : Fc沉澱自PMA和離子黴素刺激之II-23 .D7細胞分泌之LT α，如由SDS-PAGE所示。LT α遷移 為一範圍之分子量，因為酷嘗化之異質性[Browning等 (1991)，如前所引]。TNFR60 ·· Fc，但非 HVEM : Fc，亦 沉殿TNF( 17 kDa)，因而確認如前所述之競爭研究結果。 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公瘦） I 裝 訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1222453 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（39 ) LT沒R : F c如預期地並不結合任何分泌之蛋白質，但自 PMA活化11-23 .D7細胞之清潔劑萃取物中沉澱LT石（33 kDa)和LTa (2 3 -2 5 kDa)複合物。然而，當刺激物包括離 子黴素和PMA時，LT冷R : Fc沉澱在3 0 kDa之主要紋線， 以及在33 kDa之少量LT/5和在23-25 kDa之LTa。 TNFR60 : Fc沉澱在尺寸上與LT乂先質完全相同之23 kDa 〇相反地，HVEM · F c沉;殿3 〇 kDa和2 3 kDa蛋白質兩 者。對LT /5之三種不同受體封阻單株抗體在添加HVEM : F c前不能自萃取物除去3 0 kDa蛋白質，指出p30蛋白質在 抗原上與LT冷無關。然而，抗_LTa抗體自萃取物除去23 kDa紋線，指出其與LT a之相關性。lt a抗體不能預清淨 3 0 kDa和2 3 kDa紋線之能力展現此些蛋白質彼此並不相 關’不像LT α和LT Θ形成異質三體[Androlewicz等，如前 所引]。 p3 0自II·2 3 .D7細胞由親和力層析法純化。連續 TNFR60 : Fc和HVEM : Fc步驟經使用，使LTa自萃取物 由TNFR60除去及因此不干擾P30與HVEM : Fc結合。結合 HVEM : Fc、TNFR6 0 : Fc 或鼠 LT0R : Fc 之蛋白質之二 級（2 D)電泳透露p30當與LTa和LTyS比較時，具明顯之電 荷對質量比值。在由LT /3R : F c沉殿之LT α 1 /3 2複合物中 之LT冷為酸性的，具自5-6·5之pi範圍之4個明顯電荷異構 物，而有著酸性形式質量之可偵測增加（圖4 A)、LT α，以 與LT/3之複合物或結合至TNFR60之LT α同質三體（圖 4B)，具自7-8.5之pi範圍之7個明顯異構物；23 kDa LT -42- (請先閲讀背面之注意事 項再填寫· 裝丨— 本頁} -訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1222453 A7 ___B7_ 五、發明説明（4〇 ) α先質具最鹼之pI(>或=9)。無訊息序列之LTa之pi為 8.9。此些結果為醣甞化加成物之特性及全然同意先前出版 之LT α和LT /3之研究[Browning等，如前所引]。相反地， P30遷移為廣線（pi 7-8.5)，其在較低強度下解析為3條紋 線（圖4C)。在p30質量具無可辨認變化之電荷異質性可能 是轉譯後修飾之結果，如磷酸鹽或磷脂質之加成。此些結 果清楚地展現HVEM結合至具pi 7-8.5異構物之30 kDa新 穎細胞表面蛋白質（稱為p30或HVEM配體），其在抗原和物 理上不同於LT/3。HVEM配體亦由LT^SR : Fc識別，但非 TNFR 〇 f施例4. HSV gD鞘套醣蛋白皙輿内源HVEM配體競爭 結合至HVEM : Fc之 方法 HVEM : Fc(2微克/毫升）在4°C下與gD-l(250微克/亳 升）或gD-1(Λ290 - 299)( 100微克/毫升）預培養30分鐘及 然後加入PMA和離子黴素活化之II-23 .D7細胞（如在實施 例1中）。背景染色以huIgG測定及等於11\^1^:?〇+8〇-1(Δ 290 - 299)。HVEM ·· Fc 結合至活化 n-23.D7 細胞與 分級濃度gD -1或gD -1 (△ 290 - 299)如在實施例1中地競 爭。 結果 HSV gD可作用為HVEM細胞配體之拮抗劑之可能性係由 HSV gD-Ι蛋白質結合至HVEM所建議。可溶性gD-l和gD 之突變體，具對HVEM增強結合性之gD-l( △ 290 - -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1222453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（41 ) 299t )，皆有效在封阻HVEM結合至活化Π-23.D7細胞之 表面（圖5 A)。有效抑制性濃度之g D -1蛋白質與其對ηVEM 之親和力相關（圖5Β)。LT/3R : Fc或TNFR60 : Fc結合至 PMA或PMA /離子黴素活化之II-23.D7細胞並不由gD-l (△290 - 2991)所抑制，指出HVEM : gD-1交互作用為高度 特異性。此結果建議g D _ 1共同引出特異地結合至η VEM， 即使HVEM結合至由TNFR60和LT冷R所識別之配體。此些 結果指出gD-Ι為淋巴毒素之膜掛錨病毒素及可在^^乂自感 染細胞進或出期間調節HVEM信息發出活性。 |_遂例5 · HVEM之連結造成鈦π細和法仆 方法 Τ細胞活化新鮮分離之周圍血液淋巴細胞在含分級稀釋之 兔抗- HVEM和預免疫血清[Montogmery等，如前所述]及 Ρ Μ A在次有絲分裂劑量（1微克/亳升）下之培養基中培 養。增殖在3天後，由併入3h-胸苷至DN A測定，如由石-閃爍計數評估。 新鮮分離之周圍血液淋巴細胞以植物凝血素（ρ Η A )在5微 克/毫升下活化及在具IL-2之培養基中培養。17天後，細 胞以分級稀釋之抗-HVEM抗血清和抗-C D 3 (OKT3 )抗體在 次有絲分裂濃度（1 ·5微克/毫升）下再刺激。增殖在3天後 如上測定。 Β細胞流體細胞計數分析人淋巴母細胞樣raji細胞接受流 體細胞計數分析，由與抗-HVEM抗血清（1 : 100稀釋）或控 制組兔I g G在4。(：下培養及以與藻紅血球素共軛之山羊抗· _ -44- :紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（：似297公董) 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝·

、1T 1222453 A7 B7 五、發明説明（42 ) 兔IgG染色。104個細胞經分析各柱狀圖。 B細胞活化RAJI經轉入含2% FBS之培養基24小時及然後 在指示稀釋之兔抗-HVEM抗體存在下或培養單獨下培養3 天。細胞增殖如上述地評估。 結果 HVEM在靜止CD4+ T細胞上表現建議其可在免疫反應之 起始相期間作用為細胞增殖之共同刺激分子。在次最適濃 度之P AM下，抗-HVEM抗體促進周圍血液淋巴細胞之增強 增殖，由3天後在培養物中測定3H-胸甞攝取之增加所指示 (圖6A)。記憶淋巴細胞，在以PHA活化後連續培養10-17 天所生成，亦以抗-HVEM抗體在次最適濃度之抗-CD3抗 體下再活化（圖6B)。此結果指出HVEM作用在免疫反應之 效應物相。因為抗體模擬TNF-有關配體之作用[Engelmann 等（ 1990)J· Biol· Chem. 265. ： 14497 ]，此些結果指出細胞 有關之3 0 kDa HVEM配體可作用為T細胞之增殖謗導訊 息。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) LT α先前已顯示刺激Β淋巴細胞包括Epstein-Barr病毒轉 形細胞株之生長增強活性[Abken等（ 1992) J· Immunol· 149 : 2785 ; Estrov 等（ 1993) J. Exp. Med. HI ： 76 ； Kehrl 等（ 1987)科學 238 ·· 1144 ; Gibbons 等（ 1994)Eur. J.

Immunol.丛：1879] 〇 HVEM亦在B淋巴母細胞樣株上表現 (圖7A)。抗-HVEM抗體當加入在具2%血清之培養基中 RAJI B細胞株之培養物時，以劑量依賴之方式刺激3H-胸 甞之攝取，指出HVEM可在低血清中訊息維持B細胞生存力 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1222453 A7 B7 五、發明説明（43 ) (圖7B卜LT α在此分析中展現2至3倍刺激效果。TNFR6〇 和TNFR8G之存在作為負生長因子可，LTa貢獻低反應。 抗-HVEM抗體之正效果可為p3〇 HVEM配體獨特之性質。 雖然本發明以參閱目前較佳之具體實施例而描述，但是 當然地不同之修飾法可以製作，而不偏離本發明之精神。 於是，本發明僅由以下之申請專利範園所限制。 ---------------1T------0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本I) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 -46 -

1222453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 、發明説明（44 序列表列 (1) 一般資料： (〇 申請人：過敏和免疫學之拉荷拉（La Jolla)研究所 (u) 發明標題：單純疱疹病毒入侵介體之配體及其用法 (i i i)序列數目：4 (iv)通訊地址： (A) 收件人·非式（Fish)和里查生（Richardson) P.c (B) 街：4225執行廣場，1400室 (C )市：拉荷拉 (D) 州：加州 (E) 國：美國 (F) ZIP ： 92037 (v) 電腦可讀形式： (A) 媒體類型：軟碟片 (B) 電腦：IBM相容 (C )操作系統：視窗9 5 (D)軟體：快速SEq供視窗2〇6版 (vii)先前申請數據： (A) 申請號：60/051,964 (B) 建檔日期：1997年7月7日 (vii) 先前申請數據： (A) 申請號：〇8/898,234 (B) 建檔日期：1997年7月30日 (viii) 律師/代理人資料： -47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公羡） —- --------^^裳 ^ 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 1222453 A7 B7 五、發明説明（45 ) (A) 名：海爾（Haile)，麗莎A. (B) 註冊號：38,347 (C) 參考 / 登記號：07246/022TW1 (ix)電訊資料： (A) 電話：619/678-5070 (B) 電傳：619/678-5099 (2)SEQ ID NO : 1 之資料： (i) 序列特性： (A) 長度：29個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股性··單 (D) 拓樸：線性 (ii) 分子類型：引子 (xi)序列描述：SEQ ID NO : 1 : · CGGAGATCTG AGTTCATCCT GCTAGCTGG 29 (2)SEQ ID NO ·· 2 之資料： (i) 序列特性： (A) 長度：3 1個鹼基對 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (B) 類型：核酸 (C) 股性：單 (D) 拓樸：線性 (ii) 分子類型：引子 (xi)序列描述：SEQ ID NO : 2 : ATAGGATCCC TTGGTCTGGT GCTGACATTC C 31 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1222453 A7 B7 五、發明説明（46 ) (2)SEQ ID NO : 3之資料： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (i) 序列特性： (A) 長度：29個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股性：單 (D) 拓樸：線性 (ii) 分子類型：引子 (X i)序列描述：SEQ ID NO : 3 : GACGTCAGAT CTTCCCACCT TTCCTCCTA 29 (2)SEQ ID NO : 4 之資料： (i) 序列特性： (A) 長度：29個鹼基對 (B) 類型：核酸 ， （C)股性：單 (D)拓樸：線性 (ii) 分子類型：引子 (xi)序列描述：SEQ ID NO : 4 : GAACAGAGAT CTCATTGCTC CTGGCTCTG 29 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1222453 第087110978號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(93年6月）C8 93· 6 28祐本

修正 1 . 一種實質純之p 3 〇多肽，其特徵在： a) 經還原SDS-PAGE測定，具約3〇 kDa之明確分子 f， b) 具約7至8.5之pi ;及 c) 當存在於2% NP 40，pH 7.0，150毫莫耳濃度 NaCl清潔劑萃取液時，結合至疱疹病毒入侵介體 (HVEM)多肽或淋巴毒素冷受體（lt/Jr)多 月太。 2 ·如申請專利範圍第1項之實質純p 3 〇多肽，其中該多 肽’當存在於人T細胞之清潔劑萃取液時，其包括一種 組合物，其結合HSV入侵介體（HVEM)蛋白質和淋 巴毒素冷受體（LT/3R)。 3 ·如申請專利範圍第2項之實質純p3 〇多肽，其中τ細胞 係以脫鎂葉綠醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（Ρ Μ A )活化。 4 ·如申請專利範圍第2項之實質純p3 0多肽，其中τ細胞 係以脫鎂葉綠醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA )和離子黴素 活化。 5 ·如申請專利範圍第2項之實質純ρ 3 0多肽，其中τ細胞 為C D 4 + T細胞。 6 ·如申請專利範圍第5項之實質純P 3 0多肽，其中人 CD4 + T細胞為ii-23.D7人T細胞融合瘤。 7 ·如申請專利範圍第2項之實質純ρ 3 0多肽，其中ρ 3 〇多 肽在較低等電荷密度下解析成三條紋帶，其在30 kDa 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) ^22453 A8

質量上，在約pi 7至約pi 8·5間不具可識別之變化。 8·如申請專利範圍第2項之實質純p3〇多肽，其中清潔劑 萃取液為2% NP 40，pH 7.0，15〇毫莫耳濃度仏二 緩衝之清潔劑萃取液。 9·如申請專利範圍帛1項之實質純p3〇多月太，其係如申請 專利範圍第7項之等電聚焦 '電荷解析之p3〇多肽之實 質純異構物。 10·如申請專利範圍第i項之實質純p3 〇多肽，其實質無其 他蛋白質、脂質、醣類及其他與其天然有關之物質，包 括以下之性質： (a) (i)當由還原SDS-PAGE膠體純化時，多肽實質僅以 約3 0 k D a之單一膠體紋帶存在，或 (i丨）當由等電聚焦膠體純化時，多肽實質僅存在於約 pi 7至約pi 8.5間之膠體；及 (b) 當存在於人τ細胞之清潔劑萃取液時，多肽結合H s v 入侵介體（HVEM)蛋白質及淋巴毒素受體（LT沒 R)。 U.如申請專利範圍第1項之實質純P3 0多肽，其係由以下 方法純化： (i) 提供活化人C D 4 + T細胞之清潔劑萃取液， (ii) 將萃取液與包括 55至 60 kDa TNF受體 (TNFR60)之組合物反應及除去清潔劑萃取液反 應之TNF受體， (iii) 將步驟（ii)中除去之萃取液反應TNF受體之萃取 -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝 訂 1222453 A B c D 、申請專利範圍 液與包括HSV入侵介體蛋白質之組合物反應及除去 清潔劑萃取液反應之H S V入侵介體蛋白質，及 (1 ν)將步驟（i i i )之清潔劑萃取液反應之H S V入侵介 體蛋白質以電泳法處理及純化，以還原S D S - P A G Ε 測定在約3 0 kD a之分子量下遷移之蛋白質。 12. 如申請專利範圍第1 1項之實質純p 3 0多肽，其進一步 由等電聚焦法分離，其中該多肽具在約pI 7至約p I 8 · 5間之電荷異質性。 13. 如申請專利範圍第1項之實質純p 3 0多肽，其實質無其 他蛋白質、脂質、醣類及其他與其天然有關之物質，其 係以下之方法純化： (i) 提供活化人CD4 + T細胞之清潔劑萃取液， (ii) 將萃取液與包括55至60 kDa TNF受體 (TNFR60)之組合物反應及除去清潔劑萃取液反 應之TNF受體， (ill)將步驟（ii)中除去之萃取液反應TNF受體之萃取 液與包括H S V入侵介體蛋白質之組合物反應及純化 HSV入侵介體蛋白質邛3〇多肽複合物。 14·如申請專利範圍第13項之實質純ρ3〇多肽，其中ρ3〇 多肽係經進一步純化，由Hsv入侵介體蛋白質·ρ3〇多 肽複合物與8莫耳濃度尿素反應及由膠體層析法純化。 15. —種結合至如申請專利範圍第i至i 4項中任一項之 p30多肽之多株抗體。 ~ 16· —種專一地結合至如申請專利範圍第i至14項中任一 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X297公复 1 1222453

項之p 3 0多肽之單株抗體。 Π·如申請專利範圍$ 16㉟之單株抗體，其中抗體為— 段片、F(ab，）2段片或結合段片之表位，其專一地識 P30多肽。 18. 如申請專利範圍第16項之單株抗體，其中p3〇多肽為 疱疹病毒入侵介體（HVEM)受體配體或淋巴毒素石受 體（LT冷R)配體。 19. 如申請專利範圍第16項之單株抗體，其中多肽配 體包括以下之性質： a)經由還原SDS-PAGE測定，具約3〇kDa之視分子 量； b )具約7至8.5之pi ;及 Ο當存在於2 % NP 40，pH 7.0，150毫莫耳濃度 NaCl清潔劑萃取液時，結合至疱疹病毒入侵介體 (HVEM )多肽或.淋巴毒素冷受體（LT 0 R )多 月太。 20. 如申請專利範圍第16項之單株抗體，其中p3〇配體包 括約3 0 k D a之明確分子量和在約p I 7至約p I 8.5間 之等電荷（p I )，及當存在於人T細胞之清潔劑萃取液 時’結合HSV入侵介體（HVEM )蛋白質或淋巴毒素 石受體（LT/SR)。 21·如申請專利範圍第i 9或2 0項之單株抗體，其中抗體專 一地識別p 3 0多肽段片。 22·—種用於調節淋巴細胞增殖及抑制H S V感染之醫藥組 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) k 訂

A^453 A8 B8

合物，包括如申請專利範圍第1 i 14項中任一项之 P3〇多肽，及在醫藥上可接受之載劑。 23·種洞節淋巴細胞增殖和自體免疫疾病之醫藥組合物， 包括如申請專利範圍第15或16項之抗體，其中該抗體 抑制HVEM多肽與p30多肽之結合。 24.如申凊專利範圍第2 3項之醫藥組合物，其中自體免疫 疾病包括類風濕性關節炎、依賴胰島素之糖尿病、多= 性硬化、全身性紅斑狼瘡和重症肌無力。 25· —種用於篩選細胞上p 3 〇表現之套組，其包括如申請專 利範圍第15或16項之抗體。 26·如申請專利範圍第25項之套組，其中細胞為衍生自淋 巴瘤或白血病患者之腫瘤細胞。 27.如申請專利範圍第i 6項之抗體，其中抗體特定結合至τ 細胞。 28·如申請專利範圍第2 7項之抗體，其中τ細胞係涉及炎 症或炎性反應。 29·如申請專利範圍第2 7項之抗體，其中τ細胞係涉及自 免疫疾病或移植反應。 ：>0·如申请專利範圍弟1 6項之抗體，其中抗體特定結合至 腫瘤細胞。 31. —種製造專一地識別P3 0之抗體之方法，其包括以分離 或重組p 3 0多肽免疫注射動物。 32. —種製造專一地識別p 3 0多肽之抗體之方法，其包括以 包括p 3 0多肽抗原表位之肽免疫注射動物。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 訂 1222453 ABCD 六、申請專利範圍 33. —種筛選專一地識別p 3 〇多肽之抗體之方法，其包括以 下之步驟： ⑻提供自以p 3 0多肽或肽免疫注射動物之血清或抗體樣 品’或自以在其表面上表現p 3 0之細胞免疫注射動物 之血清或抗體樣品， (b)提供p 3 0多肽；及 ⑹鑑定包括專一地識別p3〇多肽之抗體之樣品。 34. 如申請專利範圍第3 7項之方法，進一步包括提供在其 表面上表現p3〇多肽之細胞及不在其表面上表現p30之 細胞； 其中鑑定結合至在其表面上表現p3〇多肽之細胞及不 結合至不在其表面上表現p 3 〇多肽之細胞之抗體，以篩 選包括專一地識別p 3 0多肽抗體之樣品之正反應。 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)