KR20010021579A - 헤르페스 심플렉스 바이러스 유입 매개체에 대한 리간드및 사용 방법 - Google Patents

헤르페스 심플렉스 바이러스 유입 매개체에 대한 리간드및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헤르페스 바이러스 유입 매개체인 HVEM에 대한 신규 리간드(p30)를 제공한다. p30은 면역 반응을 조정하고, 헤르페스 바이러스에 의한 감염을 억제하는데 유용하다. 또한 본 발명은 림프양 세포 질병이 있는 검체 또는 헤르페스 바이러스에 감염되었거나 감염되었을 것으로 추정되는 검체를 본 발명의 p30을 이용하여 치료하는 방법을 제공한다.

Description

헤르페스 심플렉스 바이러스 유입 매개체에 대한 리간드 및 사용 방법{LIGAND FOR HERPES SIMPLEX VIRUS ENTRY MEDIATOR AND METHODS OF USE}
헤르펙스 심플렉스 바이러스(HSV) 1형 및 2형은 가벼운 증상에서부터 심각한 증상에 이르는 경중 범위의 재발성 감염을 유발한다. HSV는 뉴런에 잠재되어 있다가 나타나서 콤피턴트 세포 면역계의 존재하에 피부 및 기타 조직을 감염시킨다. 비리온 외피내에 위치하는 경막 단백질인 HSV의 D 당단백질(gD)은 세포 수용체에 결합하여 감염을 개시한다[Spear et al. (1993), Viral Fusion Mechanisms. Ed. Bentz. CRC press, Boca Raton]. 최근, 감염을 위해 HSV가 이용하는 세포 단백질이 확인되었으며, 이를 HSV 유입 매개체(HVEM)라고 명명하였다[Montgomery et al. (1996) Cell 87:427]. HVEM은 종양 괴사 인자(TNF) 관련 시토킨에 대한 수용체와 상당한 상동성을 나타내는 시스테인이 풍부한 세포외 도메인이 있는 경막 1형 단백질이다[Smith et al. (1994) Cell 76:959; Ware et al. (1995), Pathways of Cytolysis, Eds. Griffiths and Tschopp. Springer-Verlag Basel]. 다수의 TNF 상과 구성원은 효과적인 염증 및 면역 반응을 일으키는데 필요한 각종 세포 반응을 개시한다.
TNF는 단백질 분해되어 분비된 단백질[Black et al. (1997) Nuture 385:729]을 형성하는 2형 경막 단백질[Pennica et al. (1984) Nature 312:724]이지만, LTα는 경막 도메인이 결핍되어 있고[Gray et al. (1984) Nature 312:721] 오로지 동종삼량체(이 형태는 TNFβ로 알려져 있음)로서 분비된다. 표면 단백질로서 발현되는 경우, LTα는 LTβ[Browning et al. (1993) Cell 72:847], 또는 2형 경막 당단백질이라고도 불리우며, α1β2 및 α2β1 서브유닛 비율의 이종삼량체[Androlewicz et al., 상기 문헌 참조; Browning et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:8618]로 존재하는 33 kDa 단백질[Androlewicz et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2542]과 관련되어 있다. LTα 및 TNF는 모두 2개의 수용체, 즉 55∼60 kDa TNF 수용체(TNFR60; CD120a 또는 1형)[Schall et al. (1990) Cell 61:361; Loetscher et al. (1990) Cell 61:351] 및 75∼80 kDa TNFR(TNFR80; 2형 또는 CD120b)[Smith et al. (1990) Science 248:1019]를 통해 결합하고 시그널을 보낸다. 대조적으로, 표면 LTα1β2 복합체는 LTβ 수용체(LTβR)가 특이적으로 인식하는데[Crown et al. (1994) Science 264:707], LTα 또는 TNF에는 결합하지 않지만[Crown et al. (1994) Science 264:707] TNFR은 LTα2β1 이종삼량체에는 결합한다[Crowe et al. (1994) Science 264:707; Browning et al. (1995) J. Immunol. 154:33].
마우스에서 LTα 및 LTβ 유전자를 유전자 결실시킴으로써 파이어판 및 림프절의 형성에 있어서 2개의 유전자의 역할을 밝혀냈는데[De Togni et al. (1994) Science 264:703; Banks et al. (1995) J.Immunol.155:1685], 이들 유전자들은 TNF 및 TNFR60과 함께 성인에서 면역 반응과정동안 면역글로불린 아이소타이프 전환(예, IgA 생성) 및 배중심 형성을 제어하는 중요한 시토킨이다[Matsumoto et al. (1996) Science 271:1289; Mariathasan et al. (1995) J. Inflammation 45:72]. 대부분의 연구는 이들 작용을 제어하는 중요한 시토킨 수용체계로서 LTα1β2/LTβR에 대한 것이다[Crowe et al. (1994) Science et al. (1994) Science 264:707; Koni et al. (1997) Immunity 5:491; Ettinger et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13102; Rennert et al. (1996) J. Exp. Med. 184:1999].
본 발명은 면역 반응 및 바이러스 감염을 조절하는데 유용한 화합물 및 방법에 관한 것이며, 더욱 구체적으로는 헤르페스 심플렉스 바이러스에 의한 감염을 억제하는데 유용한 폴리펩티드에 관한 것이다.
도 1a는 PAM(상부 히스토그램) 또는 PMA 및 이오노마이신(하부 히스토그램)으로 활성화시킨 후에 II-23.D7 세포에 대한 HVEM:Fc 융합 단백질의 결합을 나타내는 유동 세포계측 히스토그램쌍이다.
도 1b는 CD4+(상부 히스토그램) 및 CD8+(하부 히스토그램) T 세포에 대한 HVEM:Fc 융합 단백질의 결합을 나타내는 유동 세포계측 히스토그램쌍이다.
도 1c는 활성화된 II-23.D7 세포에 대한 HVEM:Fc 융합 단백질의 포화 결합을 나타내는 선그래프이다.
도 2a는 다이아그램쌍이다. 상부 다이아그램은 활성화된 II-23.D7 세포에 대한 HVEM:Fc 융합 단백질 결합이 LTβR:Fc 융합 단백질과 경쟁하는 것을 보여주는 유동 세포계측 히스토그램이다. 하부 다이아그램은 LTβR:Fc 융합 단백질에 의한 HVEM:Fc 융합 단백질 결합의 용량 의존 억제를 나타내는 선그래프이다.
도 2b는 다이아그램쌍이다. 상부 다이아그램은 HVEM:Fc 융합 단백질 결합이 LTα 동종삼량체와 경쟁하는 것을 보여주는 유동 세포계측 히스토그램이다. 하부 다이아그램은 LTα 동종삼량체에 의한 HVEM:Fc 융합 단백질 결합의 용량 의존 억제를 나타내는 선그래프이다.
도 3은 다이아그램쌍이다. 상부 다이아그램은 자연 발생적인 LTα의 Tyr108Phe 변종이 II-23.D7 세포에 대한 HVEM:Fc 결합과 경쟁하지 않으며, 하부 다이아그램은 LTα 및 LTα(Tyr108Phe) 경쟁 결합 분석을 나타내는 선그래프이다.
도 4A는 mLTβR:Fc 융합 단백질로 활성화된 II-23.D7 세포 추출물을 처리하여 얻은 침전물의 2차원 등전 집속/SDS-PAGE 겔로부터 얻은 자가방사선사진이다.
도 4B는 TNFR60:Fc 융합 단백질로 활성화된 II-23.D7 세포 추출물을 처리하여 얻은 침전물의 2차원 등전 집속/SDS-PAGE 겔로부터 얻은 자가방사선사진이다.
도 4C는 HVEM:Fc 융합 단백질로 활성화된 II-23.D7 세포 추출물을 처리하여 얻은 침전물의 2차원 등전 집속/SDS-PAGE 겔로부터 얻은 자가방사선사진이다.
도 5는 다이어그램 쌍이다. 상부 다이아그램은 HVEM:Fc 융합 단백질 결합이 HSV gD-1 당단백질과 경쟁한다는 것을 보여주는 유동 세포계측 히스토그램이다. 하부 다이아그램은 HSV gD-1 당 단백질에 의한 HVEM:Fc 융합 단백질 결합의 용량 의존 억제를 보여주는 선그래프이다.
도 6은 항HVEM 항체가 새로 분리된 말초 혈액 T 세포(상부 선그래프) 및 메모리 T 세포(하부 선그래프)에서 용량 의존 증식을 자극하는 것을 보여주는 선그래프쌍이다.
도 7은 다이아그램쌍이다. 상부 다이아그램은 RAJI 림프아세포양 세포상의 HVEM의 발현을 나타내는 유동 세포계측 히스토그램이다. 하부 다이아그램은 항HVEM 항체에 반응하는 RAJI 세포의 용량 의존 증식을 보여주는 선그래프이다.
발명의 상세한 설명
TNF 수용체(TNFR) 관련 폴리펩티드인 HVEM의 세포외 도메인을 함유하는 융합 단백질의 결합을 억제하는 실험 결과로부터 악성종양 및 정상 인간 T 세포는 모두 HVEM에 대한 세포 표면 리간드를 발현한다는 것을 보여준다. 경쟁적 억제 실험으로부터 HVEM 리간드가 LTαβ 이종삼량체 및 LTα와 공통적인 특성을 가지지만, LTα1β2 및 TNF와는 다른 특성을 가진다는 것을 확인하였다. 따라서, LTα2β1은 HVEM이 인식하는 추정 표면 리간드일 수 있으며, 단 LTα2β1상의 HVEM 결합 부위는 TNFR60과 동일하지 않다. 또한, HVEM은 신규 리간드를 인식할 수 있다. 생화학적 접근법을 사용하여 이들 확률을 구별할 수 있다.
면역침전 및 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 연구로부터 LTβ 및 LTα와 항원적으로 구별되는 T 세포의 표면상에서 HVEM에 대한 신규의 30 kDa 폴리펩티드 리간드(p30)의 존재를 입증하였다. 친화도 크로마토그래피 정제 및 2차원 전기 영동으로부터 분자량이 30 kDa이고 pI가 약 7∼8.5라는 점에서 p30이 LTα 및 LTβ와 물리적으로 구별된다는 것을 확인하였다(도 4C). 또한, 이들 연구로부터 p30은 TNFR이 아니라 LTβR이 인식한다는 것을 확인하였다.
결합 억제 실험으로부터 가용성 gD-1(HSV-1에서 유래한 gD) 및 돌연변이 gD-1, gD-1(Δ290∼299t)이 LTβR 또는 TNFR60에 결합하는 것이 아니라 HVEM에 결합한다는 것을 입증하였다. 이 결과는 HVEM이 TNFR60 및 LTβR이 인식하는 리간드에 결합하더라도 gD-1이 HVEM에 대한 결합에 대해 특이적으로 동시 진화되어 왔다는 것을 제시한다. 더구나, 이러한 발견은 gD-1이 림포톡신의 막 고착된 바이로킨이며, 감염된 세포로부터 HSV의 유입 및 유출 동안 HVEM 시그널링 활성화를 조정할 수 있다는 것을 제시한다.
시험관내 세포 배양 연구로부터 항HVEM 항체가 항원자극을 받은 적이 없는 T 세포 및 메모리 T 세포의 증식을 개선시킨다는 것을 확인하였다. 유사한 실험으로부터 HVEM을 통한 시그널링은 B 세포에 대한 활성화 자극을 제공하며 TNFR을 통한 평형된 음성 자극없이 양성 자극이 p30 HVEM 리간드의 독특한 특성일 수 있다는 것을 알 수 있다. 이들 결과는 HVEM 리간드의 생리학적 작용이 TNF 및 LTα1β2와 다를 가능성이 있다는 것을 제시한다. HVEM에 대한 신규한 30 kDa 리간드를 동정하여, 이 리간드가 이미 LTα또는 LTβ에 의한 생리학적 반응을 담당하고 있을 수 있을 가능성이 높아졌다. 질병 과정에서 이들 시토킨을 제어하기 위한 신규 접근법을 제안하는 본원에서의 이러한 발견으로부터 LT/TNF 시토킨계 및 헤르페스 바이러스를 한층 더 깊이 이해할 수 있다.
또한, 이들 결과는 HVEM 또는 LTβR을 포함하는 Fc 융합 단백질이 30 kDa HVEM 리간드인 p30 및 LTα의 작용을 조정할 것이라는 것을 제시한다. 유사하게, 융합 단백질 HVEM을 사용하여 모노클론 항체 또는 펩티드 또는 작은 유기 화합물과 같은 리간드 수용체 복합체의 특이적 억제제를 확인할 수 있다. HVEM과 p30 또는 LTα의 상호작용 또는 LTβR과 p30의 상호작용의 억제제를 이용하여 원하지 않는 림프구 증식이 발생하는 질병, 예컨대 T 및 B 림프종 또는 백혈병, 또는 자가 면역 질병, 예컨대 림프양 관절염, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스 또는 중증근무력증을 조정할 수 있다.
유사하게, 헤르페스바이러스 gD-1을 사용하여 LTα, p30 및 HVEM 시그널링이 효과기 분자로서 관련되어 있는 경우 면역 반응을 억제할 수 있다. LTα 또는 30 kDa HVEM 리간드의 가용성 형태(추정 세포질 및 경막 도메인의 결실에 의해 생성)는 헤르페스 바이러스가 세포 표적에 유입할 수 있는 능력을 차단하여 헤르페스 바이러스 감염 및 재발의 억제제로서 작용할 수 있다.
TNFR과 같이, HVEM은 이중 리간드 특이성이 있다. 즉 LTα 및 특징적인 30 kDa 막 결합 리간드 p30에 결합한다. LTα Tyr108Phe 돌연변이는 TNFR60 및 TNFR80에 대한 것과 마찬가지로 HVEM 결합을 파괴한다. TNFR60이 표면 30 kDa 형태에 대한 HVEM 결합을 차단하는 능력이 없다는 것은 표면 LTα2β1이 HVEM 리간드가 아니라는 것을 제시한다.
또한, p30은 LTα와 다른데, 그 이유는 p30이 독점적으로 분비되는 LTα와는 달리 항원적으로 차이가 있고 세포 회합되어 있기 때문이다. 따라서, HVEM 결합 단백질(p30)은 TNF에 관련된 기타 단백질과 유사한 II형 경막 구조로서 배열된 경막 도메인을 형성하는 소수성 잔기의 연장부를 포함하는 것으로 추정된다. 이 때문에 p30이 세포 표면에 부착되도록 하는 기타 방법(예, 지질 변형)으로 변형된다는 가능성을 배제하지 못한다. 또한, 이 단백질은 이러한 상과를 한정하고 약 150∼160 잔기의 C-말단 세포외 도메인을 포함하는 관련 시토킨과 LTα 및 LTβ와 서열 상동성 영역을 공유해야한다.
본 발명자들은 HVEM이 LTα에 대한 특이적 수용체이며, 그 특성이 TNF 결합 수용체, 즉 TNFR60 및 TNFR80과 분명하게 구별된다는 것을 제시하였다. 이러한 특성으로 인해 HVEM 융합 단백질 또는 유사한 단백질은 TNF 또는 LTα1β2 작용을 특이적으로 억제하지 않고 LTα에 대한 길항작용을 하게 한다.
본 발명은 실질적으로 순수한 p30 폴리펩티드를 제공한다. p30 폴리펩티드는 환원성 SDS-PAGE로 측정하였을 때 추정 분자량이 30 kDa이고 pI가 약 7∼8.5 범위인 것을 특징으로 한다. p30은 10개 미만, 바람직하게는 8개 미만, 더욱 바람직하게는 6개 미만(예, 3, 4 또는 5)의 이성체 형태로 존재한다. 폴리펩티드는 세포 결합되어 있고(즉 분비되지 않음) 세포 표면 형태에서 HVEM 및 LTβR에 결합한다.
본원에서 사용한 "실질적으로 순수한"은 기타 단백질, 지질, 탄수화물 또는 자연적으로 관련된 기타 물질이 거의 없는 p30 폴리펩티드를 의미한다. 당업자들은 단백질 정제에 대한 표준 기법을 사용하여 p30을 정제할 수 있다[Protein Purification, Principles and Practice, second edition (1987) Scopes, Springer Verlag, N.Y.]. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 환원 SDS-PAGE 겔상에서 약 30 kDa의 단일 주요 밴드를 생성한다.
본 발명은 작용성 폴리펩티드 p30과 이의 작용성 단편을 포함한다. 본원에서 사용한 "작용성 폴리펩티드"는 한정된 작용성 분석를 통해 확인되고, 세포내에서 특정 생물학, 형태학 또는 표현형 변경과 관련되어 있는 생물학적 작용 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. p30 폴리펩티드의 "작용성 단편"은, 예컨대 HVEM 및 LTβR에 결합하거나 또는 HVEM에 대한 HSV의 결합을 억제함으로써 세포 반응을 조정하는 p30의 활성이 남아있는 한 p30의 단편을 포함한다. p30의 생물학적 활성을 함유하는 더 작은 펩티드도 본 발명에 포함된다. 당업자는 표준 방법, 예컨대 바이러스 플라크 감소 분석 또는 시토킨 생성 분석를 비롯한 세포 활성 분석으로 p30의 작용성 활성에 대해 분석할 수 있다.
p30 1차 아미노산 서열의 제2 변형은 본원에 개시된 자연 발생적인 p30 폴리펩티드에 비하여 실질적으로 등가의 활성을 가지는 단백질을 초래할 수 있다. 이러한 변형은 부위 지향적 돌연변이와 같이 계획적인 것이거나, 또는 자발적인 것일 수 있다. 이들 변형에 의해 생성된 모든 폴리펩티드는, 예컨대 HVEM에 대한 HSV의 결합을 억제하거나 또는 HVEM 및 LTβR에 결합함으로써 세포 반응을 조정하는 p30의 생물학적 활성이 존재하는 한 본 발명에 포함된다. 또한, 1 이상의 아미노산이 결실되면 활성을 상당히 변경하지 않고 생성 분자의 구조를 변형시킬 수 있다. 예를 들어 p30 활성에 필요하지 않을 수 있는 아미노 또는 카르복시 말단 아미노산을 제거할 수 있다.
본 발명의 p30 폴리펩티드는 폴리펩티드 서열의 보존성 변형체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "보존성 변형체"는 아미노산 잔기를 또 다른 생물학적 유사 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 보존성 변형체의 예로는 이소로이신, 발린, 로이신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기의 또 다른 소수성 잔기로의 치환, 또는 극성 잔기의 또 다른 극성 잔기로의 치환, 예컨대 아르기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환 등이 있다. 또한 "보존성 변형체"는 비치환된 모 아미노산 대신에 치환된 아미노산을 사용하는 것을 포함하는데, 단 치환된 폴리펩티드에 대해 발생된 항체는 비치환된 폴리펩티드와도 면역반응한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 p30 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 서열을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "분리된"은 기타 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물 또는 자연적으로 회합된 기타 물질이 거의 없는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 p30을 암호화하는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 포함한다. p30의 일부 또는 전부를 암호화하는 모든 폴리뉴클레오티드도 p30 활성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 한 본 발명에 속한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 자연 발생적 폴리뉴클레오티드, 합성 폴리뉴클레오티드 및 의도적으로 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, mRNA 서열의 일부는 교호적인 RNA 스플라이싱 패턴에 의해서 또는 RNA 전사에 대한 또 다른 프로모터의 사용에 의해서 변경될 수 있다. 또 다른 예로서, p30 폴리뉴클레오티드는 부위 지향적 돌연변이될 수 있다. p30에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 안티센스 서열을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유전자 코드의 결과로서 변질된 서열을 포함한다. 이는 20개 천연 아미노산이며, 이중 대부분은 하나 이상의 코돈에 의해 특이화된다. 따라서, 모든 변질 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열이 암호화하는 p30 폴리펩티드의 아미노산 서열이 작용적으로 변화하지 않는 한 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명은 p30의 생물학적 활성을 보유하고 p30 폴리펩티드와 면역반응성이 있는 항체에 대한 하나 이상의 에피토프를 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 포함한다.
본 발명의 p30 핵산은 (a) 자연 발생적 p30을 암호화하는 서열 및 (b) 고도의 엄중 조건, 예컨대 65℃에서 0.5 M NaHPO4, 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1 mM EDTA중 필터 결합된 DNA에 하이브리드화시키고 68℃에서 0.1 X SSC/0.1% SDS 중에서 세척하는 조건[Ausubel F.M. et al., eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol.I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & sons, Inc., New York]하에서 서열의 상보체에 하이브리드화하고 작용적 등가물의 유전자 생성물을 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명은 서열 (a) 및 (b)의 변질 변형체도 포함한다.
또한, 본 발명은 전 단락의 뉴클레오티드 서열 (a) 및 (b)에 하이브리드화하여 뉴클레오티드 서열 (a) 및 (b)의 보체인 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자를 포함한다. 이러한 하이브리드화 조건은 전술한 바와 같이 고도로 엄중할 수 있으며, 또는 덜 고도로 엄중한 조건, 예컨대 42℃에서 0.2 X SSC/0.1% SDS중 세척하는 것[Ausubel et al., 상기 문헌 참조]과 같은 중간 정도의 엄중 조건일 수 있다. 핵산 분자가 데옥시올리고뉴클레오티드("올리고")인 경우, 고도로 엄중한 조건은, 예컨대 37℃(14 염기 올리고의 경우), 48℃(17 염기 올리고의 경우), 55℃(20 염기 올리고) 및 60℃(23 염기 올리고)에서 6X SSC/0.05% 나트륨 피로포스페이트 중에서 세척하는 것을 말한다. 이들 핵산 분자는 예컨대 p30 조절에 유용한 p30 안티센스 분자로서 작용하거나 이를 암호화할 수 있다(p30 핵산 서열의 증폭 반응에서 안티센스 프라이머용 및/또는 안티센스 프라이머로서). 또한 이러한 분자는, 예컨대 p30 유전자의 존재를 검출함으로써 검색 방법의 성분으로서 사용할 수 있다.
전술한 뉴클레오티드 서열 외에도, 전길이 cDNA 또는 게놈 서열은 당업계에 공지된 분자 생물 기법으로 과도한 실험 없이 확인되고 쉽고 분리될 수 있다. 본 발명은 이들 핵산 분자도 포함한다.
본 발명의 DNA 서열은 몇가지 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 하이브리드화법 또는 컴퓨터를 이용한 기법을 사용하여 DNA를 분리할 수 있다. 이러한 방법의 비제한적인 예로는 (a) 프로브와 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 하이브리드화시켜 상동성 뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법; (b) 발현 라이브러리의 항체 검색으로 공유 구조 특징이 있는 클로닝된 DNA 단편을 검출하는 방법; (c) 해당 DNA에 어닐링할 수 있는 프라이머를 사용하여 게놈 DNA 또는 cDNA상에서 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)시키는 방법; (d)유사한 서열에 대한 서열 데이타베이스의 컴퓨터 조사 방법; (e) 감법 DNA 라이브러리의 차등 검색 방법; 및 (f) T 세포 cDNA 라이브러리의 발현된 서열 태그(EST)에 의한 대규모 게놈 서열 결정법 등이 있다.
본 발명의 p30 폴리뉴클레오티드는 포유류 유기체로부터 유도되는 것이 바람직하다. 핵산 하이브리드화에 따른 검색 절차로서 임의의 유기체로부터 임의의 유전자 서열을 분리할 수 있지만, 단 적절한 프로브를 이용해야 한다. 해당 단백질을 암호화하는 서열의 일부에 해당하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 화학적으로 합성할 수 있다. 이는 아미노산 서열의 짧은 올리고펩티드 연장체가 알려져 있어야만 된다. 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 유전자 코드로부터 추론할 수 있지만, 코드의 변질을 고려해야 한다. 서열이 변질된 경우 복합된 첨가 반응을 수행할 수 있다. 이는 변성된 2본쇄 DNA의 이종 혼합물을 포함한다. 이러한 검색을 위해서 1본쇄 DNA 또는 변성된 2본쇄 DNA상에서 하이브리드화시키는 것이 바람직하다. 하이브리드화는 해당 폴리펩티드와 관련이 있는 매우 소량의 mRNA 서열이 존재하는 경우 공급원으로부터 유도되는 cDNA 클론의 결실에 특히 유용하다. 다시 말하면, 비특이적 결합을 피하기 위해서 유도된 엄중 하이브리드화 조건을 사용함으로써, 예컨대 완전 보체인 혼합물내에서 단일 프로브에 표적 DNA를 하이브리드화하여 특이적 cDNA 클론을 자가방사선사진으로 가시화할 수 있다[Wallace et al. (1981) Nucl.Acid Res., 9:879]. 대안적으로, 감법 라이브러리는 비특이적 cDNA 클론의 제거에 유용하다.
소정의 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 전체 서열이 알려지지 않은 경우, DNA 서열을 직접 합성할 수 없으며, 선택할 수 있는 방법은 cDNA 서열을 합성하는 것이다. 해당 cDNA 서열을 분리하기 위한 표준 절차는 플라스미드 보유 cDNA 라이브러리 또는 파지 보유 cDNA 라이브러리를 형성하는 것인데, 이는 고 레벨의 유전자 발현을 나타내는 공여체 세포에 풍부한 mRNA의 역전사로부터 유도한다. 폴리머라제 연쇄 반응 기법과 함께 사용되는 경우, 발현 생성물이 좀처럼 클로닝될 수 없다. 폴리펩티드의 아미노산 서열의 상당 부분이 알려진 경우, 표적 cDNA에 존재하는 것으로 추정되는 서열을 복제하는 표지된 1본쇄 또는 2본쇄 DNA 또는 RNA 프로브 서열을 생성시켜 1본쇄 형태로 변성된 cDNA의 클로닝된 카피에서 수행되는 DNA/DNA 하이브리드화 절차에 사용할 수 있다[Jay et al., (1983) Nucl.Acid Res., 11:2325]. 적절한 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머는 N-말단 아미노산 서열 결정에 의해 얻은 p30 폴리펩티드의 아미노산 서열을 "역번역(back-translating)"하여 작제할 수 있다.
람다 gt11과 같은 cDNA 발현 라이브러리는 p30에 특이적인 항체를 사용하여 하나 이상의 에피토프를 가지는 p30 펩티드에 대해 간접적으로 검색할 수 있다. 이러한 항체는 폴리클론 또는 단일클론으로 유도하여 p30 cDNA 존재의 지표인 발현 생성물을 검출하는 데 사용할 수 있다.
p30 핵산내 변경은 유전자내 돌연변이(예, 점 돌연변이, 넌센스(종지), 미스센스, 스플라이스 부위 및 프레임 이동) 및 이형접합 결실이나 동형접합 결실을 포함한다. 이러한 변형은 서열 분석, 서던 블롯 분석, PCR계 분석(예, 멀티플렉스 PCR, 서열 태그된 부위(STS)) 및 동일계 하이브리드화를 비롯하여 당업계에 공지된 표준 방법으로 검출할 수 있다. 이러한 단백질은, 예컨대 표준 SDS-PAGE 및/또는 면역침전 분석 및/또는 웨스턴 블롯 분석으로 분석할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 임의의 p30 암호화 서열 및/또는 이의 상보체(즉, 안티센스)를 포함하는 DNA 벡터 및 전술한 임의의 p30 암호화 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 핵산으로 구성되거나 또는 이를 포함하는데, 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 또는 인헨서 프로모터 조합체에 작동가능하게 결합된다. 프로모터는 전사가 시작되는 지점의 전반부(상류)에 있는 100 뉴클레오티드 쌍내에 통상적으로 DNA 분자의 영역으로 구성된 전사 조절 성분이다. 또 다른 전사 조절 성분은 인헨서이다. 인헨서는 시간, 위치 및 발현량에 측면에서 특이성을 제공한다. 프로모터와는 달리, 인헨서는 프로모터가 존재하면 전사 부위로부터 다양한 거리에 위치한 경우 작용할 수 있다. 인헨서는 전사 개시 부위의 하류에 위치할 수 있다. 발현 벡터의 암호화 서열은 전사 말단 영역에 작동가능하게 결합된다. 암호화 서열을 프로모터의 제어하에 두기 위해서, 프로모터의 1 내지 약 50 뉴클레오티드 하류(3')에 있는 펩티드 또는 폴리펩티드의 번역 리딩 프레임의 번역 개시 부위를 정위시킬 필요가 있다. 이러한 조절 성분으로는 시토메갈로바이러스 hCMV 즉초기 유전자, SV40 아데노바이러스의 초기 또는 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, 파지 A의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세라이트 키나아제에 대한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 및 효모 α-교배 인자의 프로모터가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
발현 벡터 및 이의 작제를 위한 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 적절한 벡터로는 플라스미드, 및 바이러스 벡터, 예컨대 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 카나리아 폭스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노관련 바이러스 등이 있다.
본 발명은 전술한 p30 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터로 감염된 적절한 숙주 세포주를 포함한다. 예컨대 각종 천연 또는 유전자적으로 조작된 형태의 p30 발현을 위해서 형질감염에 사용되는 세포의 비제한적인 예로는 포유류 기원의 HEK293 세포 또는 Sf9 곤충 세포가 있다. 세포는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 각종 방법, 에컨대 전기사출법 또는 인산칼슘 침전법으로 형질감염시킨다. 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스로 형질도입한 세포내로 유전자를 도입할 수 있다. 성공적으로 형질감염된 세포주는 당업자들에게 익숙한 적절한 수단, 예컨대 GeneticinTM(G418) 또는 푸로마이신과 같은 약물이 보충된 조직 배양 배지를 사용하여, 예를 들어 내성 유전자를 포함하는 관련 발현 벡터에 대해 선별할 수 있다. 성공적으로 형질감염된 세포주는 가능한 각종 방법, 예컨대 유동 세포계측 분석으로 p30 분자의 세포 표면 발현에 대해 검색한다.
"숙주 세포"는 벡터가 증식하여 그 DNA를 발현할 수 있는 세포이다. 이 용어는 대상 숙주 세포의 임의의 후대를 포함한다. 모든 후대는 복제 과정에 발생하는 돌연변이가 될 수 있기 때문에 모세포와 동일하지 않을 수 있다. 그러나, "숙주 세포"라는 용어를 사용했을 때는 이러한 후대를 포함한다.
p30의 아미노산 서열내에 항원 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체도 본 발명에 포함된다. 이러한 항체의 비제한적인 예로는 폴리클론 항체, 모노클론 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체, 1본쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2단편 및 전술한 임의의 에피토프 결합 단편이 있다.
본 발명의 항체는, 예컨대 자가면역 질병 및 림프구 악성종양의 치료에 사용할 수 있다. 본 발명의 항체를 사용하여 세포상에서의 p30의 발현에 대해 시험할 수 있고, 따라서 검색 절차의 일부로서 이용하여 특정 검체에 대한 적절한 치료를 선택할 수 있다. 예를 들어, 림프종 또는 백혈병 환자의 종양 세포가 p30을 발현한다면, 항p30 항체 또는 항p30 항체의 면역톡신 접합체를 그 환자의 치료에 사용할 수 있다. 이러한 항체는 본 발명의 검색 분석에 사용할 수 있다.
본 발명의 항체 생성을 위해서, 숙주 동물은 p30 폴리펩티드 또는 p30 폴리펩티드를 발현하는 세포로 감염시켜 면역화시킬 수 있다. 대안적으로, 이들 폴리펩티드의 p30 특이 영역에 해당하는 펩티드를 면역원으로서 사용할 수 있다. 이러한 숙주 세포의 비제한적인 예로는 토끼, 마우스 및 래트가 있다. 숙주 종에 따라 각종 보조제를 사용하여 면역학적 반응을 증가시킬 수 있는데, 보조제의 비제한적인 예로는 프로인트(완전 및 불완전) 보조제, 미네랄 겔, 예컨대 수산화알루미늄, 리소레시틴, 플루론산 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 유화제, BCG(bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 있다. 폴리클론 항체는 면역화된 동물의 혈청에서 유래한 항체 분자의 이종군이다.
면역원성을 더욱 증가시키기 위해서, 면역원을 캐리어에 커플링시킬 수 있다. 이러한 캐리어의 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 소 혈청 알부민(BSA)이 있다. 난알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 토끼 혈청 알부민과 같은 기타 알부민을 캐리어로서 사용할 수 있다. 캐리어에 펩티드를 커플링시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 글루타르알데히드, 카르보디이미드 및 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르의 사용을 포함한다.
사용하고자 하는 항원의 양은 과도한 실험없이 당업자들이 쉽게 결정할 수 있다. 항원은 여러 경로(예, 피하, 근육내, 피내, 정맥내 및 복강내)로 투여할 수 있다. 폴리클론 항체의 생성은 투여후에 각종 시점에서 면역화된 동물의 혈액 샘플을 채취하여 모니터하였다. 소정량의 항체가 얻어지면, 동물을 방혈시키고 혈청을 저장한다.
특정 항원에 대한 항체의 상동군인 모노클론 항체는 배양액중 연속 세포주에 의해 항체 분자 생성을 제공하는 임의의 기법으로 얻을 수 있다. 이들 기법의 비제한적인 예로는 하이브리도마 기법[Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497; 미국 특허 제4,376,110호; Howell and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.], 인간 B 세포 하이브리도마 기법[Kosbor et al. (1983) Immunology Today 4:72; Cole et al. (1983) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80:2026] 및 EBV 하이브리도마 기법[Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.]이 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 비롯한 임의의 면역글로블린 클래스 및 이의 임의의 서브클래스일 수 있다.
또한, "키메라 항체"의 생성을 위해 개발된 기법을 사용할 수 있다[Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312:604; Takeda et al. (1985) Nature 314:452]. 이들은 적절한 생물학적 활성의 인간 항체를 암호화하는 유전자의 일부에 대한 적절한 항원 특이성이 있는 마우스 항체를 암호화하는 유전자의 일부를 스플라이싱하는 것을 포함한다. 키메라 항체는 상이한 부분이 다른 동물종에서 유래한 분자이며, 에컨대 쥐 모노클론 항체 및 인간 면역글로불린 불변부로부터 유래된 가변부를 가지는 것이다. 이러한 키메라 분자는, 예컨대 IgH와 k 및 λ경쇄좌를 암호화하는 인간의 유전좌를 포함하는 마우스를 면역화시켜 형성할 수 있다.
대안적으로, 1본쇄 항체의 생성에 대해 개시된 기법[미국 특허 제4,946,778호; Bird(1988) Science 242:423; Huston et al. (1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:5879; 및 Ward et al. (1989) Nature 334:544]을 적용하여 p30의 에피토프에 대한 1본쇄 항체를 생성할 수 있다. 1본쇄 항체는 아미노산교를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결시켜 형성하여 1본쇄 폴리펩티드를 얻는다. 재조합 DNA 기법으로 편리하게 이를 생성한다.
특정 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기법에 의해 생성할 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편의 비제한적인 예로는 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성할 수 있는 F(ab')2단편과 F(ab')2단편의 디설파이드교를 환원시켜 생성할 수 있는 Fab 단편이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 대안적으로, Fab 발현 라이브러리를 작제하여[Huse et al. (1989) Science 246:1275] 신속하고 용이하게 목적하는 특이성이 있는 모노클론 Fab 단편을 동정할 수 있다.
결합 특이성에 대한 항체를 검색하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이들 방법은 (a) 세포 표면 p30을 발현하는 세포에 대한 결합; (b) p30을 발현하지 않는 세포에 대한 결합 결핍 (c) p30 폴리펩티드에 대한 결합; (d) p30 이외의 다른 폴리펩티드(예, TNF, LTα, LTβ, Fas 리간드, CD40 리간드 또는 알부민)에 대한 결합 결핍; 및 (e) p30내의 해당 영역, 예컨대 HVEM 또는 LTβR에 대한 결합에 관여하는 영역에 해당하는 펩티드에 의한 p30에 대한 결합의 특이적 억제를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 HVEM 또는 LTβR 수용체 폴리펩티드를 통해 매개되는 세포 반응을 조정할 수 있는 화합물을 동정하기 위해 고안된 시험관내 시스템을 특징으로 한다. "세포" 반응은 HSV의 세포 내면화 또는 세포 활성화를 의미한다. 이들 세포 반응은 (a) p30, gD 또는 LTα가 있는 HVEM; 또는 (b) p30이 있는 LTβR의 상호작용에 의해 유발된다.
"리간드"는 작용성 반응을 유발하는 특이적 방식 및 고 친화도로 수용체 단백질에 결합하는 폴리펩티드 또는 화합물에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 리간드로는 p30, gD 또는 LTα등이 있다. "수용체"는 리간드에 결합하면 세포 반응을 유도하는 폴리펩티드이다. 본 발명의 수용체로는 HVEM 또는 LTβR 등이 있다. "결합제"는 고친화도 및 특이적 방식으로 수용체 또는 리간드에 결합하고, 작용성 반응을 유발할 수도 유발하지 않을 수도 있는 폴리펩티드 또는 화합물을 의미한다. 시험 화합물은 규정, 분리 및 정제된 대상 화합물(예, 합성 소분자), 조합 라이브러리의 구성원이거나, 또는 생물학적 유체, 조직 추출물, 서브세포 분획 또는 세포 용해물과 같은 생물학적 시료에 존재할 수 있다.
본 발명의 일양태에서, 본 발명은 HVEM 결합제가 매개하는 세포 반응에 영향을 주는 화합물을 확인하기 위한 분석을 제공한다. 이 분석은 (a) HVEM 폴리펩티드 또는 HVEM 폴리펩티드 발현 세포, 및 HVEM 결합제와 함께 화합물을, 이 성분들이 상호작용하는 조건하에 항온처리하는 단계; 및 (b) HVEM 결합제가 매개하는 세포 반응에 대한 화합물의 영향을 측정하는 단계를 포함한다. 또한, LTβR-p30이 매개하는 세포 반응에 영향을 주는 화합물을 확인하기 위한 분석도 본 발명에 속한다. 이러한 분석은 a) 화합물이 상호작용할 수 있는 조건하에서 LTβR 폴리펩티드 또는 LTβR 폴리펩티드를 발현하는 세포, 및 p30과 함께 화합물을 항온처리하는 단계; 및 (b) LTβR-p30이 매개하는 세포 반응에 대한 화합물의 영향을 측정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 분석에서 화합물은 HVEM 또는 LTβR과 리간드의 상호작용에 의해 매개된 세포 활성화를 조정하거나 또는 HSV에 의한 감수성 세포의 감염을 억제하는 능력에 대해 검색한다.
본 발명은 세포 반응 분석을 제공한다. 이들 세포 반응 분석은 세포 활성화 또는 HSV에 의한 세포 감염을 측정하는 것이다.
시험 화합물은 리간드(예, p30, LTα 또는 gD)가 자극하는 수용체(예, HVEM 또는 LTβR)를 발현하는 세포의 반응을 조정하는 능력 및 세포에 대해 적절한 자극의 국부최적(suboptimal) 용량에 대해 시험할 수 있다. "반응자(responder)" 수용체를 발현하는 검체로부터 새로 얻을 수 있거나, 또는 배양된 세포주일 수 있다. 세포는 내재적으로 암호화된 수용체 또는 형질감염된 유전자가 암호화하는 수용체를 발현할 수 있다. 리간드를 분리된 폴리펩티드의 형태로 세포 반응 배양물에 첨가하거나, 또는 리간드 발현 세포의 배양물에 첨가함으로서 가할 수 있다.
리간드 발현 세포는 리간드를 암호화하는 내인성 유전자를 발현하거나 또는 리간드를 암호화하는 형질감염된 유전자를 발현할 수 있다. 또한, 리간드는 세포 표면에서 발현되거나(p30 또는 gD), 또는 분비될 수 있다(p30, gD 또는 LTα). 분비하고자 하는 p30 또는 gD를 위해서, 이를 암호화하는 유전자는 결실된 경막 도메인을 암호화하는 영역을 가지도록 해야 한다.
세포 활성화는, 예컨대 세포 증식, 세포 표면 활성화 마커의 데노보(de novo) 발현 또는 가용성 인자 생성으로 측정할 수 있다.
바람직한 양태에서, 세포는 림프구이다. T 세포의 경우, 수용체(HVEM 또는 LTβR)를 발현하는 반응자 T 세포는 시험 화합물, 리간드 및 국부최적 용량의 T 세포 활성자, 예컨대 항-CD3 항체, 식물성 적혈구 응집소(PHA)와 같은 렉틴 또는 스타필로코커스 엔테로톡신 C(SEC)와 같은 초항원의 존재하에서 배양할 수 있다. 대조군은 (a) T 세포 단독; (b) 리간드의 존재 및 시험 화합물의 부재하에 T 세포 활성자와 T 세포; (c) 리간드 및 시험 화합물의 부재하에 T 세포 활성자와 T 세포; (d) 리간드의 부재 및 시험 화합물의 존재하에 T 세포 활성자와 T 세포; (e) 리간드의 존재 및 시험 화합물의 부재하에 T 세포 활성자 없이 T 세포; (f) 리간드 및 시험 화합물의 부재하에 T 세포 활성자 없이 T 세포 및 (g) 리간드의 부재 및 시험 화합물의 존재하에 T 세포 활성자 없이 T 세포를 포함하는 배양물일 수 있다. T 세포 활성화는3H-티미딘 병입(실시예 5 참고), CD69 또는 CD25와 같은 활성화 마커 유도, 또는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4) 또는 인터페론-γ(IFN-γ)와 같은 시토킨 생성에 의해 T 세포 증식의 측면에서 측정할 수 있다.
B 림프구의 경우에 유사 반응 분석을 수행할 수 있다. B 세포 활성화는 분열유발인자, 예컨대 미국자리공 분열유발인자, 스타필로코커스 단백질 A 또는 항면역글로불린일 수 있다. 세포 활성화 세포는 세포 증식(3H-티미딘 병입으로 다시 측정) 또는 Ig 분비로 측정할 수 있다. 대안적으로 영양적으로 국부최적 배지내에서 B 세포가 생존하는 것을 측정할 수 있다(실시예 5 참고).
림프구 활성화를 억제하는 시험 화합물의 능력은 대개 T 세포와 관련된 자가면역 질병(예, 류마티스양 관절염, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 다발성 경화증) 또는 대개 T 및 B 세포와 관련된 자가면역 질병(예, 전신 홍반성 루푸스 및 중증 근무력증)의 치료에 유용하다. 시험 화합물이 림프구 활성화를 자극하는 능력은 이러한 화합물이 감염성 질병이 있는 검체, 또는 예컨대 암에 대한 화학치료 또는 방사선 치료를 받는 환자 또는 AIDS 환자에서처럼 검체가 면역억제된 경우 면역 반응을 자극하는데 사용할 수 있다는 것을 제시한다.
HSV 감염을 예방하는 시험 화합물에 대한 분석에서, 시험 화합물은 HSV 및 HSV 감수성 세포의 배양물에 첨가할 수 있다. 바이러스 감염에 대한 허용성 세포주는 인간 피부 섬유아세포, 활성화를 유발하는 제제(예, 항CD3 항체, 또는 식물성 적혈구 응집소)로 처리한 말초 혈액 림프구, 및 형질전환된 세포주(예, Hela 세포)를 포함한다. 바이러스 생성은 바이러스 플라크 분석, ELISA에 의해 측정되는 특정 바이러스 단백질의 생성, 비색계 분석에 의해 쉽게 검출 가능한 효소인 β-갈락토시다제와 같은 지표 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 사용하는 방법을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 다수의 기타 방법을 사용하여 측정할 수 있다[Montgomery et al., 상기 문헌 참조].
HSV에 의한 세포 감염을 억제하는 시험 화합물의 능력은 이 화합물이 HSV로 감염된 검체의 치료에 유용할 수 있다는 지표가 된다.
세포 반응에 영향을 주는 화합물이 관련 수용체 리간드쌍의 구성원에 결합하여 작용하는지 여부를 시험하기 위해서, 당업계에 공지된 분석, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯팅 또는 방사선면역분석으로 수용체 또는 리간드의 가용성 형태에 결합하는 능력에 대해 화합물을 시험할 수 있다. 또한, 시험 화합물이 수용체 또는 리간드에 결합하여 서로에 대한 결합을 억제하는지를 시험하기 위해서, 수용체 및 리간드의 가용성 형태의 결합을 억제하는 능력에 대해 시험 화합물을 시험할 수 있다. 이들 분석법의 예로는 ELISA, 경쟁적 웨스턴 블롯 및 경쟁적 방사선면역법이 있다.
본 발명의 검색 분석에 사용되는 펩티드 및 폴리펩티드는 각종 수단으로 얻을 수 있다. 더 작은 펩티드(길이가 50 개 아미노산 미만)는 표준 화학법에 의해 편리하게 합성할 수 있다. 일부 폴리펩티드(예, 항체)는 시판용을 구입할 수 있다. 시판용을 이용할 수 없을 경우에는, 항체는 상기 문헌을 참조하여 제조할 수 있다. 검출가능하게 표지된 항체는 시판용을 이용할 수 있으며, 또는 당업자에게 공지된 방법으로 용이하게 제조한다.
HVEM, LTβR, p30, gD 또는 LTα와 같은 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법으로 생물학적 공급원으로부터 정제할 수 있다[Protein Purification, Principles and Practice, second edition (1987) Scopes, Springer Verlag, N.Y.]. 당업계에 공지된 기법을 사용하여 재조합 DNA 기법으로 자연 발생적 단백질 형태, 절두된 단백질 형태, 융합 단백질 형태 또는 키메라 단백질 형태로 생성할 수 있다. 이들 방법으로는, 예컨대 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합법이 있다. 예컨대 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al., 상기 문헌 참조]에 개시된 기법 참조. 대안적으로, 단백질을 암호화하는 RNA는 화학적으로 합성할 수 있다. 예컨대 본원에서 그 전문을 참고로 인용한 문헌[Oligonucleotide Synthesis (1984) Gait, M.J. ed., IRL Press, Oxford]에 개시된 기법 참조.
각종 숙주 발현 벡터계를 이용하여 뉴클레오티드 서열을 발현시킬 수 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드가 가용성인 경우, (a) 배양물, 즉 펩티드 또는 폴리펩티드가 분비되는 않는 경우 숙주세포에서 유래한 배양물로부터 회수하거나 또는 (B)펩티드 또는 폴리펩티드가 세포에 의해 분비되는 경우 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 또한 발현계는 세포막에 고착된 폴리펩티드를 동일계에서 발현하는 유전자 조작된 숙주 세포를 포함한다. 적절한 세정제 및 지질 미셀과 당업계에 공지된 방법을 사용하여 이러한 발현계로부터 폴리펩티드를 정제 또는 농축시킬 수 있다. 대안적으로, 유전자 조작된 숙주 세포는 단백질의 구조 및 작용성을 보유할 뿐 아니라 생물학적 활성도 갖는 것이 중요한 상황에서 이용할 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 발현계의 비제한적인 예로는, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아(예, 이.콜리(E. coli) 및 비.서브틸리스(B. subtilis)); 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터(바큘로바이러스)로 형질전환된 곤충 세포; 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 콜리플라워 모자이크 바이러스 CaMV; 담배 모자이크 바이러스 TMV)로 감염되거나 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터로 형질감염된 식물 세포계; 또는 포유류 바이러스 또는 포유류 세포의 게놈으로부터 유래한 프로모터(예, 메탈로티오네인 프로모터)를 포함하는 재조합 발현 작제물을 보유하는 포유류 세포(예, COS, CHO, BHK, 293, 3T3)와 같은 미생물이 있다.
박테리아계에서, 다수의 발현 벡터는 발현하고자 하는 유전자 생성물에 따라 선택하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 다량의 단백질을 생성하고자 하는 경우(예, 단백질에 대한 항체를 상승시키기 위해서), 쉽게 정제되는 고 레벨의 융합 단백질 생성물의 발현을 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터의 비제한적인 예로는, lacZ 암호화 영역이 있는 프레임내에 암호화 서열을 벡터내로 개별적으로 삽입시켜 융합 단백질을 생성할 수 있는 이.콜리 발현 벡터 pUR278[Ruther et al. (1983) EMBO J.2:1791]; pIN 벡터[Inouye & Inouye (1985) Nucleic Acids Res. 13:3101; Van Heekes & Schuster (1989) J.Biol.Chem. 264:5503] 등이 있다. pGEX 벡터를 사용하여 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와 함께 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 글루타티온 아가로스 비드에 흡착시킨 후 글루타티온의 존재하에 용출시켜 용해된 세포로부터 쉽게 정제할 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하여 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 부분으로부터 방출될 수 있도록 고안된다. 검색 분석에 사용되는 폴리펩티드는 폴리펩티드의 자연 발생적 형태 또는 이 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 관련이 없는 융합 단백질의 일부는, 예컨대 면역글로불린 G의 Fc 부분, 헥사히스티딘 또는 GST일 수 있다.
포유류 숙주 세포에서, 다수의 바이러스계 발현계를 이용할 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 해당 뉴클레오티드 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예컨대 후기 프로모터 및 3부분으로 이루어진 리더 서열에 결찰시킬 수 있다. 그 다음 키메라 유전자를 아데노바이러스 게놈내로 시험관내 또는 생체내 재조합시켜 삽입할 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예, 영역 E1 또는 E3)내에 삽입시키면 감염된 숙주내에서 살아 있고 유전자 생성물을 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 형성한다[예, Logan & Shenk (1984) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81:3655]. 특이적 개시 시그널은 삽입된 뉴클레오티드 서열의 효율적인 전사에 필요할 수 있다. 이들 시그널은 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 자신의 개시 코돈 및 인접 서열을 비롯한 전체 유전자 또는 cDNA가 적절한 발현 벡터내로 삽입된 경우, 추가의 전사 제어 시그널이 필요하지 않다. 그러나, 암호화 서열의 일부만이 삽입된 경우, 외인성 전사 제어 시그널, 예컨대 아마도 ATG 개시 코돈이 제공되어야 한다. 또한, 개시 코돈이 전체 삽입체의 번역을 유지하기 위한 소정의 암호화 서열의 리딩프레임과 같이 있어야 한다. 외인성 번역 제어 시그널 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 각종 기원의 것일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인헨서 성분, 전사 종지인자 등을 함유하도록 하여 개선시킬 수 있다[Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol. 153:516].
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 또는 목적하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형 및 프로세싱하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형(예, 글리코실화) 및 프로세싱(예, 절단)은 단백질의 작용에 중요하다. 적절한 세포주 또는 숙주계는 발현된 외래 단백질의 옳바른 변형 및 프로세싱을 유지하도록 선택할 수 있다. 포유류 숙주 세포의 비제한적인 예로서 CHO, VERO, BHK, Held, COS, MDCK, 293, 3T3, 및 WI38이 있다.
재조합 단백질을 장기간 동안 고수율로 발현시키기 위해서, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 전술한 서열을 안정하게 발현하는 세포주를 유전자 조작할 수 있다. 바이러스 복제 기점을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것보다는 숙주 세포를 적절한 발현 제어 성분(예, 프로모터, 인헨서 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등)으로 제어되는 DNA 및 선별 마커로 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후에, 유전자 조작된 세포를 농축 배지에서 1∼2일 동안 증식시킨 다음, 선별 배지로 교체한다. 재조합 플라스미드내 선별 마커는 선별체에 내성을 부여하여 염색체내로 플라스미드가 안정하게 통합 증식되어 병소를 형성하는데, 이는 클로닝되어 세포주내로 확장될 수 있다. 이 방법은 유전자 생성물을 발현하는 세포주를 유전자 조작하는데 사용하기 유리하다. 이러한 유전자 조작된 세포주는 유전자 생성물의 내인성 활성에 영향을 주는 화합물의 검색 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
융합 단백질은 발현시킬 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 부분을 이용하여 쉽게 정제할 수 있다. 예를 들어, Janknecht 등의 문헌[(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8972]에 개시된 시스템은 인간 세포주에서 발현되는 비변성 융합 단백질을 정제할 수 있다. 이 시스템에서, 해당 유전자는 백시나아 재조합 플라스미드내로 서브클론되어 유전자 오픈 리딩 프레임이 6개의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노 말단 태그에 번역되어 융합된다. 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 세포로부터 유래한 추출물은 Ni2+니트릴로아세트산-아가로스 컬럼상에 적재하고 히스티딘 태그된 단백질을 이미다졸 함유 완충액으로 선별적으로 용출시킨다. 필요에 따라, 히스티딘 태그는 적절한 효소로 선별적으로 절단할 수 있다.
키메라 단백질은 당업자들에게 공지된 방법으로 유도할 수 있다. 이 방법은 단백질이 상이한 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 일부를 스플라이싱하는 단계를 포함한다. 키메라 폴리펩티드는 상이한 부분이 상이한 단백질로부터 유래한 분자이다. 예를 들어, 키메라 단백질은 HVEM의 도메인 및 LTβR의 또 다른 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명은 수용체 폴리펩티드 HVEM을 발현하는 세포와 HVEM 결합제를 접촉시켜 HVEM이 매개하는 세포 반응을 조정하는 방법을 제공한다. 대안적으로, HVEM이 매개하는 세포 반응은 HVEM에 대한 리간드와 리간들 결합제를 접촉시켜 조정한다. 이러한 리간드로는 p30, LTα 또는 gD가 있다. 일반적으로 p30은 세포의 표면상에서 발현되고, LTα는 분비되며, gD는 HSV 비리온 또는 HSV로 감염된 세포의 표면에서 발현된다. "세포 반응"은 세포 활성화 또는 세포에 의한 HSV의 내면화를 의미한다. 또한, 본 발명은 LTβR을 발현하는 세포 또는 LTβR 리간드인 p30을 발현하는 세포를, HVEM 또는 p30에 결합하는 결합제와 접촉시켜 LTβR 매개된 세포 반응을 조정하는 방법을 제공한다.
본원에서 "접촉"은 수용체 조정 유효량으로 결합제에 수용체나 리간드를 노출시켜 결합제가 수용체와 리간드의 상호작용에 의해 개시되는 세포 반응을 효과적으로 조정할 수 있게 하는 것을 의미한다. 조정은 세포 반응의 억제 또는 활성화를 초래할 수 있다. 특정 수용체-리간드 쌍에 대한 특별한 결합제의 또 다른 특성은 개시된 검색 분석을 사용하여 미리 검사할 수 있다.
수용체 결합제에 대하여, HVEM 결합제는 가용성 gD, 가용성 p30 또는 LTα의 펩티드 단편, 바람직하게는 자연 발생 LTα의 N 말단으로부터 108번 위치에 해당하는 위치에서 아미노산 Tyr을 포함하는 펩티드 단편이 바람직하다. LTβR 결합제는 가용성 p30이다.
리간드 결합제의 경우, p30 결합제가 가용성 HVEM, 가용성 LTβR 또는 p30에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. LTα 결합제는 가용성 HVEM이다.
예컨대 HVEM 리간드(p30, LTα또는 gD) 또는 LTβR 리간드 p30에 의해 활성화를 진행하는 HVEM 또는 LTβR를 발현하는 세포(예, 림프구)의 배양물에 결합제를 첨가하여 시험관내 접촉시킬 수 있다. 또한 결합제는, 예컨대 HSV 비리온의 표면 또는 HSV 감염된 세포의 표면상에서 gD에 노출된 HVEM 발현 세포의 배양물에 첨가할 수 있다. 결합제가 이들 세포 반응을 조정하는 능력은 전술한 검색법을 사용하여 미리 검사하였다. 결합제는 분리된 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 암호화하는 결합제 함유 발현 벡터로 형질감염된 세포로서 첨가할 수 있다. 시험관내 방법에서, 결합제의 "수용체 조정 유효량"이란 세포 활성화 또는 HSV 감염을 조정하는데 필요한 양으로서 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이다.
검체내에서 생체내 접촉시킬 수 있다. 검체는 자가면역 질병, 예컨대 류마티스양 관절염, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스 또는 중증 근무력증과 같은 자가면역 질병, 림프양(T 또는 B 세포) 악성 종양, HSV 감염, HSV 이외의 유기체로 인한 감염 또는 면역억제된 포유류, 바람직하게는 인간일 수 있다. HVEM-p30 또는 LTβR-p30 매개된 세포 반응의 억제는 T 세포 증식(류마티스양 관절염, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 중증 근무력증 및 T 세포 악성종양) 및 B 세포 증식(전신 홍반성 루푸스, 중증 근무력증 및 B 세포 악성 종양)을 억제할 수 있다는 점에서 자가면역 질병 또는 림프양 악성종양이 있는 환자에게 유리할 수 있다. HVEM-gD 매개된 세포 반응(즉, HSV 내면화)의 억제는 세포외 공간에 존재하는 gD 발현 HSV 비리온 또는 그 표면에 gD를 발현하는 HSV 감염된 세포로부터 내면화하여 매개되는 바이러스 유포를 방지한다는 점에서 HSV 감염이 있는 검체를 치료할 수 있다. HVEM-p30 또는 LTβR-p30 매개된 세포 반응을 자극하는 것은 HSV 이외의 유기체로 감염된 검체 또는 면역억제된 검체(예, 림프양 악성종양 이외의 암 치료를 위해 방사선 및/또는 화학치료를 받은 환자) 또는 T 및 B 세포 증식이 모두 자극되는 AIDS 환자를 치료하는데 유용하다. 자연적으로, 결합제는 HVEM-gD 세포 반응을 증가시켜 HSV 바이러스를 유포시킨다는 점에서 HSV 감염된 검체내 HVEM-p30 매개된 세포 반응을 자극하는 결합제의 사용을 피한다. 그러나, 관련 결합제에서 활성은 상기 문헌에 개시된 검색 분석을 사용하여 미리 검사할 수 있다. 유사하게, 이들 자극성 결합제는 종양 세포의 증식을 촉진하기 때문에, 림프양 악성 종양에 사용하지 않는다.
세포내 반응의 생체내 조정에 사용되는 결합제는 HVEM, LTβR, p30 및 LTα의 자연 발생 형태를 포함한다. 이들은 상기 문헌에 개시된 방법으로 생성한다. p30에 대한 항체도 본 발명에 포함된다. LTα 로부터 유도되고 HVEM-LTα 상호작용을 조정하는 펩티드도 사용할 수 있다. 펩티드는 205개 미만, 바람직하게는 100개 미만, 더욱 바람직하게는 50개 미만, 가장 바람직하게는 20개 미만을 포함한다. 예를 들어, 5개 아미노산, 8개 아미노산, 12개 아미노산, 15개 아미노산 또는 18개 아미노산일 수 있다. 펩티드는 자연 발생적 LTα의 N 말단으로부터 108번째의 아미노산 잔기에 해당하는 위치에서 잔기 Tyr 또는 이의 보존적 치환을 포함하는 것이 바람직하다.
전술한 펩티드의 펩티드 모방체(peptidomimetic)을 결합제로서 포함한다. 펩티드 모방체 화합물은 선택된 펩티드의 3차 구조를 기준으로 한 3차 구조(즉, "펩티드 모티프")를 가진 합성 화합물이다. 펩티드 모티프는 펩티드 모방체가 유도된 펩티드 활성과 같거나 또는 더 큰 세포 반응을 조정하는 활성이 있는 펩티드 모방체 화합물을 제공한다. 펩티드 모방체 화합물은 치료 용도, 예컨대 더 큰 친화도 및/또는 결합성 및 연장된 생물학적 반감기를 개선시키는 추가의 특성을 보유할 수 있다. 본 발명의 펩티드 모방체는 부분적으로 또는 완전히 비펩티드인 골격을 갖지만 펩티드 모방체의 근간이 되는 펩티드에서 발생하는 아미노산 잔기의 측기와 동일한 측기를 가지는 것이 통상적이다. 여러 유형의 화학 결합, 예컨대 에스테르, 티오에스테르, 티오아미드, 레트로아미드, 환원된 카르보닐, 디메틸렌 및 케토메틸렌 결합은 일반적으로 프로테아제 내성 펩티드 모방체의 작제시 펩티드 결합에 대한 유용한 치환체로서 당업계에 공지되어 있다.
펩티드 및 펩티드 결합제는 관련 폴리펩티드 또는 펩티드의 생체내 생존을 용이하게 하기 위해 아미노 말단 및 카르복시 말단 단부 중 한 단부 또는 두 단부에서 차단제를 첨가하여 변형시킬 수 있다. 이는 펩티드 말단이 프로테아제에 의해 분해("잠식(nibble)")되는 경향이 있는 상황에서 유용할 수 있다. 이러한 차단제는, 투여하고자 하는 폴리펩티드 또는 펩티드의 아미노 및/또는 카르복시 말단 잔기에 부착될 수 있는 추가의 관련 또는 비관련 펩티드 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 펩티드 또는 폴리펩티드 합성 과정에서 화학적으로 또는 재조합 DNA 기법으로 행해질 수 있다. 대안적으로, 당업계에 공지된 피로글루탐산 또는 기타 분자와 같은 차단제는 아미노 및/또는 카르복실 말단 잔기, 또는 상이한 부분으로 대치된 카르복시 말단에서의 카르복시기나 아미노 말단에서의 아미노기에 부착될 수 있다. 유사하게, 결합제는 투여 전에 약학적으로 허용가능한 "담체" 단백질에 공유적으로 또는 비공유적으로 커플링될 수 있다.
생체내 전달은 결합제 자체, 결합제 암호화 핵산, 결합제 암호화 발현 벡터 또는 벡터로 형질감염 또는 형질도입된 세포를 검체에게 투여하는 단계를 포함한다.
결합제는 인간 검체에게 전달하기 위해 후술되는 바와 실질적으로 동일한 기법을 사용하여 포유류 세포로 전달할 수 있다. 적절한 포유류의 비제한적인 예로는 인간, 비인간 영장류, 말, 소, 양, 개, 소, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 토끼 및 양 등이 있다.
결합제는 적절한 생리학적 용액, 예컨대 생리 염수에 용해된 비변형 상태로 환자의 세포로 전달할 수 있다. 이들 펩티드가 관련 조직 및 세포 유형을 선택적으로 표적화하는 것은 당연하다. 예컨대 국부 주사 또는 이식에 의해 영향을 받은 기관 또는 조직과 펩티드를 직접 접촉시켜 표적화할 수 있다. 따라서, 자가면역 질병, 예컨대 류마티스양 관절염 또는 인슐린 의존성 진성 당뇨병에서, 펩티드는 영향을 받은 관절 또는 췌장으로 각각 직접 유입되거나, 또는 바람직하게는 활성 자가면역 반응이 발생한 배수 림프양 조직내로 유입될 수 있다.
대안적으로, 결합제는 관련 세포(예, T 세포 또는 B 세포)상에 수용체에 대한 병입된 리간드 또는 이들 세포가 발현하는 세포 표면 마커에 대한 항체를 리포좀내로 전달할 수 있다. 따라서, CD4 T 세포 표면 마커에 대해 특이적인 항체는 항CD4 항체 및 CD4+ T 세포에 대한 관련 결합제를 모두 포함하는 리포좀을 유도할 수 있다. 이러한 접근법은 자가면역 질병 및 HSV 감염에 모두 사용할 수 있다. 우세한 병원성 T 세포 클론에 의해 발현되는 T 세포 수용체(TCR)에 의해 형성된 자가면역 질병에서, 관련 TCR 성분(예, Vβ)에 특이적인 항체를 사용할 수 있다. 후자의 방법은 병원성 효과기 세포가 억제를 위해 특이적으로 표적하지만 표적 기관의 세포와 전체로서의 면역계가 비타협성으로 남아있는 면역치료의 이상적인 형태로 나타난다.
림프종 또는 백혈병 환자에서, 증식억제 결합제는 암세포 지향적인 것이 바람직하다. 예를 들어, 펩티드는 종양을 제거하기 위한 수술 후에 림프종 종양 부위 주변 조직내로 직접 주입하여 남은 종양 세포의 증식을 억제할 수 있다. 수술 대신에, 결합제를 종양내로 동일계 주입하여 종양을 처리할 수 있다. 전술되어 있는 리포좀 방법을 이용할 수 있다. 이 경우, 종양 특이 항원(TSA) 또는 종양 관련 항원(TAA)에 특이적인 항체를 이용할 수 있다.
여러 인자 뿐 아니라 투여하고자 하는 특정 화합물, 투여 시간 및 경로와 기타 동시에 투여되는 약물에 따라 각 환자에 대한 용량이 달라진다는 것은 의학 분야의 업자들에게는 자명하다. 본 발명의 결합제의 용량은 다양하지만, 정맥 투여되는 경우 혈액 부피 1 ㎖당 약 0.01 ㎎∼10 ㎎일 수 있다. 투여 경로 및 용량은 약리학자 및 의사에게 공지되어 있다. 전술한 것 외에, 경로는 복강내, 근육내, 폐내, 경점막, 피하 및 정맥내일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
생체내 유전자 치료법은 환자내로 직접 유전자 작제물을 전달해야 한다. 바람직하게는 해당 세포 또는 조직에 유전자 작제물을 표적화하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 1차 종양을 제거하는 수술을 행한 후에, 증식억제 결합제를 암호화하는 레트로바이러스 벡터를 함유하는 조성물로 종양 부근을 처리하여 잔여 세포를 표적화할 수 있다. 대안적으로, 수술 대신 1차 종양을 종양내로 직접 벡터를 동일계 주입하여 처리할 수 있다. 벡터를 정맥내 전달하여 1차 종양 부위에서 멀리 있는 악성 세포에 도달하게 할 수 있다. 유사하게, 벡터를 직접 주입하여 자가면역 공격하에 조직을 표적화할 수 있다. 예컨대 주로 증식 세포를 안정하게 형질감염시키는 레트로바이러스를 사용하여 종양 세포 또는 활성화된 림프구를 표적화할 수 있다.
정전기력 또는 공유력에 의해 폴리-L-리신에 부착된 플라스미드 또는 기타 벡터로 구성된 분자 접합체를 사용하여 조직 특이적 표적화시킬 수 있다. 폴리-L-리신은 종양 세포상의 수용체에 결합할 수 있는 리간드에 결합한다[Cristiano et al. (1995) J. Mol. Med. 73: 479]. 유사하게, 종양 및 전술한 유형의 세포 특이적 항체를 벡터에 결합시켜 림프양 종양 또는 T 림프구와 같은 세포에 표적화시킬 수 있다. 후자는 자가면역 질병 및 HSV 감염에 유용하다. 비교적 종양 특이적인 발현을 유도하는 프로모터를 사용하여 추가 레벨의 표적화를 얻을 수 있다. 자가면역 환자 또는 이식 환자에게 사용하기 위한 조직 특이적 프로모터로는, 예컨대 유도성 IL-2[Thompson et al.(1992) Mol.Cell.Biol. 12:1043], IL-4[Todd et al. (1993) J.Exp.Med. 177:1663] 및 감마 인터페론[Penix et al. (1993) J.Exp.Med. 178:483] T 세포 표적화 프로모터가 있다. 이러한 유도성 프로모터는 발현이 활성화된 T 세포에서 선택적으로 발생한다는 점에서 매우 귀중한 장점을 가진다. 이상적인 면역 치료 양상이 자가면역 환자에서 선택적으로 억제한다는 점에서 효과기 세포는 활성화된 T 세포군에 포함된다.
전술한 바와 같이 단독으로 또는 세포 특이적 항체와 함께 동시 병입된 벡터는 기타 전달 부형제 또는 리포좀내로 병입되어 전달될 수 있다.
관련 결합제가 세포막에 정상적으로 결합된 경우(HVEM, LTβR, p30 또는 gD), 결합제의 경막 도메인을 암호화하는 핵산 영역에는 발현 벡터내에 포함된 핵산이 결실되어 있다.
DNA 또는 형질감염된 세포는 약학적 허용 담체내로 투여될 수 있다. 약학적 허용 담체는 인간에게 투여하기 적절한 생체 적합성 부형체, 예컨대 생리 염수이다. 치료학적 유효량은 처리된 동물에서 의학적으로 바람직한 결과를 생성할 수 있는 본 발명의 DNA의 양이다. 의학 분야에 공지된 바와 같이, 환자를 위한 용량은 환자의 크기, 체표면, 연령, 투여하고자 하는 특정 화합물, 성별, 투여 시간과 경로, 일반적인 건강 및 동시 투여되는 기타 약물을 비롯하여 여러 인자에 좌우된다. 용량은 다양하지만, DNA의 정맥 투여를 위한 바람직한 용량은 DNA 분자 약 106내지 1012카피이다. 이는 필요에 따라 반복투여할 수 있다.
다음 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이나, 이를 제한하려는 것은 아니다.
발명의 개요
본 발명은 이전에 HSV gD에만 결합하는 것으로 알려져있는 HVEM에 대한 리간드로서 작용하는 내인성 폴리펩티드의 동정에 관한 것이다. 본 발명은 p30으로서 불리우는 이 리간드 뿐 아니라 p30을 암호화하는 핵산 서열과 p30에 결합하는 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 HSV 감염을 조정하는 화합물을 동정하기 위한 방법 및 림프양 세포 반응을 조정하는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은, 예컨대 자가면역 질병, 림프양 악성종양 및 HSV 감염이 있는 검체의 치료에 유용하다.
일양태에서, 본 발명은 HVEM 결합제가 매개하는 세포 반응에 영향을 주는 화합물을 동정하기 위한 분석을 제공한다. 또한, LTβR-p30이 매개하는 세포 반응에 영향을 주는 화합물을 동정하기 위한 분석도 본 발명에 포함된다.
기타의 언급이 없으면, 본원에 사용된 모든 기법 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 개시된 것과 유사하거나 또는 동일한 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 적절한 방법 및 재료는 하기에 개시되어 있다. 본원에 개시된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참조 문헌은 전문을 참조로 인용하였다. 정의를 비롯하여 상충되는 경우에는 본 출원을 따른다. 또한, 본 발명에 개시된 재료, 방법 및 실시예는 예시를 위한 것이지 제한하려는 것은 아니다.
본 발명의 기타 특징 및 장점, 예컨대 각종 인간 질병을 위한 치료법은 다음 상세한 설명, 도면 및 청구항으로부터 명백할 것이다.
재료
인간의 IgG1의 Fc 영역 및 Fas:Fc[Brunner et al. (1995) Nature 373:441], TNFR60[Crowe et al. (1994) J.Immunol.Methods 168:79] 및 인간 LTβR:Fc[Crowe et al. (1994) Science 264:707]의 리간드 결합 도메인으로 형성된 이가 키메라 단백질의 작제, 발현 및 정제에 대해 전술하였다. HVEM의 세포외 영역은 전방향 프라이머 5'-CGGAGATCTGAGTTCATCCTGCTAGCTGG-3' (서열 번호 1) 및 역방향 프라이머 5'-ATAGGATCCCTTGGTCTGGTGCTGACATTCC-3' (서열 번호 2)를 사용하여 1-K184를 암호화하는 pBEC10 DNA로부터 Taq DNA 폴리머라제 증폭된 서열을 이용하여 PCR로 생성하였다. 증폭된 HVEM 생성물은 인간 Fc IgG1을 포함하는 바큘로바이러스 벡터 pVL1392(파밍엔)내로 프레임내 결찰시켰다. 토끼 IgG1에서 유래한 Fc 영역으로 HVEM:Fc를 유사하게 작제하여 CHO 세포내에 생성하고, 정제한 후 면역원으로서 사용하여 토끼 항-HVEM 항체를 생성하였다. LTβR:Fc는 정방향 프라이머 5'-GACGTCAGATCTTCCCACCTTTCCTCCTA-3' (서열 번호 3) 및 역방향 프라이머 5'-GAACAGAGATCTCATTGCTCCTGGCTCTG-3' (서열 번호 4)와 함께 Taq DNA 폴리머라제를 이용하여 PCR로 세포외 도메인[Force et al. (1996) J. Immunol. 1995.1 155:5280]의 아미노산 잔기 1-Met221을 암호화하는 마우스 LTβR(mLTβR) DNA 단편으로부터 작제하였다. LTα 및 LTαTyr108Phe는 전술한 바와 같이 재조합 바큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포에서 생성하였다[Crowe et al. (1994) J.Immunol. Methods 168:79]. 재조합 가용성 LTα1β2[Browning et al. (1996), 상기 문헌 참조], TNF[Browning and Ribolini (1989) J.Immunol.143:1859], 및 LTα에 대한 모노클론 항체(BF7), 및 LTβ에 대한 모노클론 항체(C37, B9 및 B27)[Browning et al. (1995) 상기 문헌 참조]는 Jeffrey Browining (바이오겐 인코포레이티드)로부터 입수한 기증품이다. 면역침전시킨 항LTα 항체(클론 9B9)은 뵈링거 만하임에서 입수하였다. 항CD3(OKT3)을 복수증이 있는 BALB/c 마우스에서 생성하고 단백질 1 ㎖당 1 ㎍ 사용하였다. 정제된 재조합 HSV gD-1 단백질 및 돌연변이체는 앞서 상세히 설명한 바와 같이 바큘로바이러스에서 생성하였다[Nicola et al. (1996) J.Virol. 6:3815]. FITC-항-CD4 및 CD8 항체는 벡톤 딕켄슨으로부터 입수하였다.
실시예 1. T 세포상에서 HVEM 리간드의 발현
방법
II.23.D7 세포에 대한 HVEM의 결합
II-23.D7 세포주는 인간 CD4+ T 세포 하이브리도마[Ware et al (1986) Lymphokine Res. 5:313]이며, 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 항생제가 있는 RPMI1640 배지내에 유지한다. II-23.D7 세포는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)(100 ng/㎖), 또는 PMA(100 ng/㎖) 및 이오노마이신(1 ㎍/㎖)과 함께 37℃에서 4 시간 동안 활성화시켰다. 세포를 세척하고 HVEM:Fc, LTβR:Fc 또는 인간 IgG 5 ㎍/㎖를 함유하는 행크스 밸런스 염 용액(HBSS)(10% 소의 송아지 혈청 및 0.1% NaN3)에서 4℃하에 30분 동안 항온처리한 다음, 피코에리트린(항-huIg-PE)과 접합된 염소 항인간 IgG로 염색하였다. 염색된 세포를 유동 세포계측법으로 분석하였다(FACSCaliber, 벡톤-딕켄슨). 각 히스토그램은 104결과를 나타내었다.
정상 인간 T 세포에 대한 HVEM의 결합
Ficoll-Hypaque에 의한 정상 공여체로부터 얻은 말초 혈액 단핵 세포는 5일 동안 IL-2가 있는 배지에서 항CD3 항체로 활성화시켰다. 세포를 PMA 또는 PMA 및 이오노마이신으로 4시간 동안 재자극한 다음, 전술한 바와 같이 항-huIgG-PE로 검출된 FITC-CD4 또는 FITC-CD8 및 HVEM:Fc로 이중 염색하였다. 보강된 FITC 형광을 사용하여 CD4 및 CD8 T 세포 아군에 접근시켰다.
수용체 결합
수용체 결합은 전술한 바와 같이 활성화된 II-23.D7 세포와 HVEM:Fc 또는 대조군 IgG의 등급별 농도에서 항온처리하여 측정하였다. 양성 결과가 정상 IgG에 대한 값이 >98%인 형광값을 가지는 경우, 형광 강도=(평균 형광 채널)(% 양성 형광 결과)를 계산하여 수용체 결합을 측정하였다. 특이적 형광 강도는 대조군 IgG에 대한 값을 감한 후에 형광 강도를 나타낸다.
결과
HVEM에 대한 추정 리간드를 시험하기 위해서, HVEM의 세포외 도메인 및 인간 IgG(HVEM:Fc)의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 작제하였다. PMA 단독에 의해서가 아니라 칼슘 이오노포어, 이오노마이신 및 PMA로 활성화시킨 후 인간 CD4+ T 세포 하이브리도마 II.23.D7[Ware et al. (1986), 상기 문헌 참조]에 결합된 HVEM:Fc의 특이적 결합을 유동 세포 계측법으로 검출하였다(도 1a). 특이적 HVEM:Fc 결합은 인간 말초 혈액에서 유래한 T 림프구에서 검출하였다(도 1b). 이들 결합은 악성 종양 및 정상 인간 T 세포가 모두 HVEM에 대한 세포 표면 리간드를 발현시킨다는 것을 보여준다. II.23.D7 세포에 대한 HVEM:Fc의 최대 결합의 1/2이 ∼20 nM에서 활성화되었다(도 1c). II.23.D7 세포주는 PMA에 의해 유도되어 LTα및 β와 TNF를 발현한다[Ware et al. (1992) J. Immunol. 149:3881].
실시예 2. HVEM 리간드의 결합 특성
방법
LTβR:Fc에 의한 결합 경쟁
활성화된 II-23.D7 세포(실시예 1에 개시된 바와 같은 PMA 및 이오노마이신)를 4℃에서 30분 동안 LTβR:Fc 또는 TNFR60:Fc(100 ㎍/㎖)와 함께 30분 동안 예비항온처리하였다. 이어서, HVEM:Fc-토끼(2 ㎍/㎖)를 첨가하고, 30분 동안 항온처리하고, 염소 항토끼 IgG-PE로 세포를 염색하여 HVEM:Fc-토끼를 검출하였다. 토끼 IgG를 사용하여 기준 염색을 측정하였다. 활성화된 II-23.D7 세포에 대한 HVEM:Fc의 결합을 전술한 바와 같이 각 등급별 농도의 LTβR:Fc, TNFR60, Fas:Fc 또는 IgG와 경쟁시켰다.
LTα 동종삼량체에 의한 결합 경쟁
II-23.D7 세포를 활성화시키고 4℃에서 30분 동안 HVEM:Fc를 재조합 LTα 또는 LTα1β2와 함께 예비배양하였다. 혼합물을 활성화된 II-23.D7 세포에 첨가한 다음 항-huIgG-PE로 염색하였다. HVEM:Fc + LTα를 이용한 형광 염색은 정상 IgG를 이용한 배경과 동일하였다.
결과
HVEM이 TNF 또는 LTαβ복합체에 결합되는지를 측정하기 위해서, LTβR:Fc 및 TNFR:Fc를 토끼 IgG Fc가 있는 HVEM:Fc 작제물을 이용하여 PMA 및 이오노마이신 및 PMA로 활성화된 II-23.D7 세포에 대한 HVEM:Fc 결합의 경쟁 억제제로서 사용하였다[Motgomery et al., 상기 문헌 참조]. TNFR60:Fc가 아니라 LTβR:Fc 및 HVEM:Fc(인간 IgG1의 Fc)가 HVEM:Fc(토끼)의 결합에 대해 경쟁하였다(도 2a). 또한, 관련 수용체 융합 단백질 Fas:Fc 및 TNFR80:Fc는 HVEM:Fc의 결합에 대해 경쟁하지 않았다. 그러나, 놀랍게도 TNF 또는 LTα1β2가 아니라 LTα 동종삼량체가 HVEM:Fc 결합에 대해 경쟁하였다(도 2b). 위치 108번에 티로신(Tyr)이 페닐알라닌(Phe)으로 치환된(Tyr108Phe) LTα의 TNFR60 결합 돌연변이체[Goh et al. (1991) Protein Eng. 4:785]는 경쟁하지 않았다(도 3). 이들 결과로부터 추정 HVEM 리간드가 LTαβ 이종 삼량체 및 LTα와는 공통적인 특징이 있으나 LTα1β2 및 TNF와는 구별되는 특징을 가진다는 것을 알 수 있다. 따라서, LTα2β1은 HVEM:Fc가 인식하는 추정 표면 리간드일 수 있으며, 단 LTα2β1상의 HVEM 결합 부위는 TNFR60과 동일하지 않다. 대안적으로, HVEM:Fc는 신규 리간드를 인식할 수 있다. 생화학적 접근법을 사용하여 이들 가능성을 구별할 수 있다.
실시예 3. HVEM 리간드의 생물학적 특성
방법
SDS-PAGE 분석
II-23.D7 세포를 2.5 시간 동안 PMA 또는 PMA 및 이오노마이신을 사용하여 활성화시키고(실시예 1에서와 같이), 인산염 완충 염수(PBS)로 2회 세척하고, 시스테인 메티오닌 결핍 RPMI로 1회 세척한 다음 10% 투석된 FBS,35S-메티오닌 및35S-시스테인 각각 250 μCi, 및 활성화제를 함유하는 배지에서 1.5 시간 동안 재현탁시켰다. 배양 상청액을 수거하고, 2% NP40, HEPES pH7.0, 20 mM EDTA, 150 mM NaCl을 함유하는 완충액내에서 류펩틴 및 아프로티닌(10 ㎍/㎖), PMSF(1 mM) 및 아이오도아세트아미드(20 mM)로 세포를 용해시켰다. 추출물을 인간 IgG(10 ㎍), 지정된 경우 항 LT 항체 및 단백질 G 비드로 전처리하였다. 이어서, 수용체:Fc 융합 단백질(10 ㎍/㎖)을 시료에 첨가하고 단백질 G 비드로 침전시켰다. 표지된 단백질을 환원시킨 SDS-PAGE 및 광영상으로 분석하였다(화소 범위 6∼200).
전단락에 개시된 바와 같이 제조한 세포 추출물을 LTα 또는 LTβ에 대한 모노클론 항체 또는 마우스 IgG 10 ㎍으로 먼저 전처리한 다음 HVEM:Fc를 첨가하여 리간드를 침전시켰다. HVEM:Fc에 결합된 단백질을 환원성 SDS-PAGE로 분석하고 광영상으로 검출하였다.
HVEM 리간드인 p30의 정제
II-23.D7 세포를 PMA(100 ng/㎖) 또는 PMA 및 이오노마이신(1 ㎍/㎖)으로 2.5 시간 동안 활성화시킨 다음, 상기 2 단락에서와 같이35S-메티오닌 및35S-시스테인으로 표지하였다. 세포 추출물을 인간 IgG(5 ㎍) 및 단백질 G 비이드로 예비처리하여 비특이적으로 결합 단백질을 제거하였다. 그 다음 TNFR60:Fc 및 단백질 G 비드로 추출물을 처리하여 추출물에서 LTα를 제거하였다. HVEM:Fc 및 단백질 G 비드를 추출물에 첨가하고 항온처리하였다. 각 경우, 비드를 3회 세척하여 비결합 분획 중 오염 단백질을 제거하였다. 비드는 8M 우레아를 함유하는 완충액에서 용출시키고, 1차는 등전 접속(pI가 5∼7(50%), 3∼10(40%), 2∼11(10%)인 암폴린 혼합물로 형성된 구배)에 의해 분석하고, 2차는 환원 SDS-PAGE(15% 겔)로 분석하였다.
HVEM:Fc에 의한 p30 정제는 LTβR:Fc 또는 TNFR60:Fc에 의해 정제된 샘플에 비교하여 모니터할 수 있다. PMA로 자극한 II-23.D7 세포로부터 분리한 LTβR:Fc 정제된 단백질인 LTα1β2를 도 4A에 도시하고, 추출물로부터 LTα를 제거하는데 사용되는 TNFR60:Fc에 결합된 단백질은 도 4B에 도시되어 있다. 전술한 바와 같이 HVEM:Fc에 의해 정제된 p30은 도 4C에 도시되어 있다.
14C-표지된 분자량 마커는 각각의 겔의 제1 레인에 도시되어 있고, 제2 레인에서는 수용체:Fc 결합 단백질 조작이 2차원으로만 도시되어 있다.
결과
LTα는 PMA로 활성화시킨 후에 II23.D7 세포가 분비한다[Ware et al. (1992), 상기 문헌 참조; Crowe et al. (1994) Science 264:707]. HVEM:Fc 및 TNFR:Fc는 SDS-PAGE로 알수 있는 바와 같이 PMA 및 이오노마이신으로 자극된 II23.D7 세포로부터 분비된 LTα를 침전시켰다. LTα는 글리코실화시 이질성으로 인한 분자량 범위로서 이동한다[Browning et al. (1991), 상기 문헌 참조]. HVEM:Fc가 아니라 TNFR60:Fc가 또한 TNF(17 kDa)를 침전시키며, 이는 전술한 바와 같이 경쟁 연구 결과로서 확인할 수 있다. LTβR:Fc는 예상한 바와 같이, 임의의 분비된 단백질을 결합시키지 않지만, PMA 활성화된 II-23.D7의 세정제 추출물로부터 LTβ(33 kDa) 및 LTα(23∼25 kDa) 복합체를 침전시켰다. 그러나, 자극이 이오노마이신 및 PMA를 포함하는 경우, LTβR:Fc는 30 kDa에서 주요 밴드를 침전시키고, 33 kDa에서 소량의 LTβ 및 23∼25 kDa에서 소량의 LTα를 침전시켰다. TNFR60:Fc는 LTα 전구체와 크기가 동일한 23 kDa 단백질을 침전시켰다. 대조적으로, HVEM:Fc는 30 kDa 및 23 kDa 단백질을 침전시켰다. LTβ에 대한 3개의 상이한 수용체 차단 모노클론 항체는 HVEM:Fc를 첨가하기 전에 추출물로부터 30 kDa 밴드를 제거하는데 실패하였는데, 이는 p30 단백질이 항원적으로 LTβ와 연관성이 없다는 것을 제시하는 것이다. 그러나, 항LTα 항체는 추출물로부터 23 kDa 밴드를 제거하였는데, 이는 LTα와의 연관성을 의미하는 것이다. LTα항체가 30 kDa 및 23 kDa 밴드를 미리 제거할 수 없다는 것은 이들 단백질이 이종삼량체를 형성하는 LTα 및 LTβ와는 달리 서로 관련되어 있지 않다는 것을 입증하는 것이다[Androlewicz et al., 상기 문헌 참조].
p30은 친화 크로마토그래피로 II-23.D7 세포로부터 정제하였다. 연속적인 TNFR60:Fc 및 HVEM:Fc 단계를 사용하여 LTα를 TNFR60에 의해 추출물로부터 제거하고, 따라서 HVEM:Fc에 대한 p30 결합을 저해하지 않는다. HVEM:Fc, TNFR60:Fc 또는 쥐 LTβR:Fc를 결합시키는 단백질의 2차원(2D) 전기 영동으로부터 p30이 LTα및 LTβ와 비교하여 전하 대 질량이 특징적이라는 것을 밝혀냈다. LTβR:Fc에 의해 침전된 LTα1β2 복합체내 LTβ는 산성이며, 4개의 특징적인 하전 이성체는 산성 형태의 질량에 있어 검출가능한 증가가 있는 5∼6.5의 pI 범위에 있다(도 4A). TNFR60에 결합된 LTβ 또는 LTα 단독삼량체와의 복합체로서 LTα는 pI가 7∼8.5인 범위에서 7개의 특징적인 이성체를 보유한다. 23 kDa LTα전구체는 가장 염기성 pI(> 또는 =9)를 가진다. 시그널 서열이 없는 LTα의 pI는 8.9이다. 이들 결과는 글리코실화 부가 반응 생성물의 특성을 나타내며, LTα 및 LTβ에 대한 이전에 공개된 연구 결과와도 완전히 일치한다[Browing et al. (1991), 상기 문헌 참조]. 대조적으로, p30은 3개의 밴드로 분할되는 낮은 강도하에서 광범위한 밴드(pI 7∼8.5)로서 이동한다(도 4C). p30의 질량에서 식별할 수 없는 변화가 있는 하전 이질성은 인산염 또는 인지질 첨가와 같은 번역후 변형의 결과일 것 같다. 이들 결과는 HVEM이 항원적으로 및 물리적으로 LTβ와 차이가 있는 pI 7∼8.5의 이성체가 있는 신규 세포 표면 단백질(p30 또는 HVEM 리간드)을 결합시킨다는 것을 명백하게 입증한다. 또한, HVEM 리간드는 TNFR이 아니라 LTβR:Fc가 인식한다.
실시예 4. HSV gD 외피 당단백질은 내인성 HVEM 리간드와 경쟁한다
HVEM:Fc에 결합하기 위한 (p30)
방법
HVEM:Fc(2 ㎍/㎖)를 gD-1(250 ㎍/㎖) 또는 gD-1(Δ290-299)(100 ㎍/㎖)와 함께 4℃에서 30분동안 예비항온처리한 다음 PMA 및 이오노마이신 활성화된 II-23.D7 세포에 첨가하였다(실시예 1에서와 같이). huIgG를 이용하여 배경 염색을 측정하였으며, 이는 HVEM:Fc + gD-1(Δ290-299)과 동일하다. 활성화된 II-23.D7에 대한 HVEM:Fc 결합은 실시예 1에서와 같이 등급별 농도의 gD-1 또는 gD-1(Δ290-299)와 경쟁하였다.
결과
HSV gD가 HVEM 세포 리간드의 길항물질로서 작용하는 가능성은 HVEM에 대한 HSV gD-1 단백질의 결합에 의해 제안되었다. HVEM에 대한 결합이 증가된 가용성 gD-1 및 돌연변이 gD, gD-1(Δ290-299t)은 활성화된 II-23.D7 세포의 표면에 HVEM이 결합하는 것을 차단하는데 효과적이다(도 5A). gD-1 단백질의 효과적인 억제 농도는 HVEM에 대한 친화도와 상호관련이 있다(도 5B). LTβR:Fc 또는 TNFR60:Fc의 PMA 또는 PMA/이오노마이신 활성화된 II-23.D7 세포에 대한 결합은 gD-1(Δ290-299 t)에 의해 억제되지 않았는데, 이는 HVEM:gD-1 상호작용이 고도로 특이적이라는 것을 제시하는 것이다. 이 결과로부터 HVEM은 TNFR60 및 LTβR이 인식하는 리간드에 결합하지만 gD-1가 HVEM에 결합하기 위해서 특이적으로 동시진화되어 왔다. 이들 결과는 gD-1은 림포톡신의 막 고착된 바이로킨이고 감염된 세포로부터 HSV 유입 또는 유출 과정에서 HVEM 시그널링 활성을 조정할 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 5. HVEM의 결찰은 림프구 활성화를 초래한다
방법
T 세포 활성화
새로 분리된 말초 혈액 림프구를 유사분열 촉진 이하의 용량(1 ㎍/㎖)의 PMA 및 등급별 토끼 항HVEM 또는 예비면역 혈청의 희석물[Montgomery et al. 상기 문헌 참조]을 함유하는 배지에서 항온처리하였다. 증식은 β-신틸레이션 계수로 평가시 DNA내로3H-티미딘을 병입시켜 3일 후에 측정하였다.
새로 분리한 말초 혈액 림프구를 식물성 적혈구 응집소(PHA) 5 ㎍/㎖로 활성화시키고 IL-2와 함께 배지에서 배양하였다. 17일 후에, 세포를 등급별 항HVEM 항혈청의 희석물 및 유사분열 촉진 이하의 농도(1.5 ㎍/㎖)의 항CD3(OKT3) 항체로 재자극하였다. 증식은 전술한 바와 같이 3일 후에 측정하였다.
B 세포 유동 세포 계측 분석
인간 림프아세포종 RAJI 세포를 항HVEM 항혈청(1:100 희석) 또는 대조군 토끼 IgG를 4℃에서 항온처리하여 유동 세포계측 분석을 수행하고, 염소 항토끼 IgG로 염색된 것을 피코에리트린과 접합시켰다. 104세포를 각 히스토그램에 대해 분석하였다.
B 세포 활성화
RAJI를 24 시간 동안 2% FBS를 함유하는 배지내로 옮긴 다음 토끼 항-HVEM 항체의 지정 희석액 또는 배지 단독의 존재하에 3일 동안 항온처리하였다. 세포 증식을 전술한 바와 같이 평가하였다.
결과
HVEM은 휴지기 CD4+ T 세포에서 발현되는데, 이는 면역 반응의 개시기 동안에 세포 증식에 대한 동시자극성 분자로서 기능한다는 것을 제안하는 것이다. PMA의 국부 최적 농도에서, 항HVEM 항체는 배양물에서 3일 후에 측정된3H-티미딘의 흡수시 증가로 알 수 있는 말초 혈액 백혈구의 증식 증가를 촉진하였다(도 6A). PHA로 활성화시킨 후 10∼17일 동안 계속 배양시켜 형성한 메모리 림프구를 항CD3 항체의 국부최적 농도에서 항HVEM 항체로 재활성화시켰다(도 6B). 이 결과로부터 HVEM이 면역반응의 효과기 상태에서 작용한다는 것을 알 수 있다. 항체는 TNF 관련된 리간드의 작용을 모방하기 때문에[Engelmann et al. (1990) J.Biol.Chem. 265:14497], 이들 결과로부터 세포 회합된 30 kDa HVEM 리간드가 T 세포에 대한 증식 유도 시그널로서 작용할 수 있다는 것을 알 수 있다.
이미 LTα는 엡스테인 바르 바이러스 형질전환된 세포주를 비롯하여 B 림프구에 대한 활성을 증가시키는 성장을 자극하는 것으로 확인되었다[Abken et al. (1992) J.Immunol. 149:2785; Estrov et al. (1993) J. Exp.Med. 177:76; Kehrl et al. (1987) Science 238:1144; Gibbons et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:1879]. HVEM은 B 림프아세포종 주에서 발현된다(도 7A). 항HVEM 항체가 2% 혈청이 있는 배지내 RAJI B 세포주의 배양물에 첨가되는 경우, 이 항체는 용량 의존 방식으로3H-티미딘의 흡수를 자극하였는데, 이는 HVEM이 저혈청에서 B 세포 생존력의 유지를 시그널링하는 것을 의미한다(도 7B). LTα는 이 분석에서 2∼3 배 자극 효과를 나타내었다. 음성 성장 인자로서 TNFR60 및 TNFR80의 존재는 LTα에 대한 저 반응을 일으킬 수 있다. 항 HVEM 항체의 양성 효과는 p30 HVEM 리간드에 대한 독특한 특성일 수 있다.
본 발명은 바람직한 양태를 참고로 하여 기술하였지만, 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 각종 변형이 가능하다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 하기의 청구항에 의해서만 제한된다.

Claims (66)

  1. a) 환원성 SDS-PAGE로 측정할 때 분자량이 30 kDa이고,
    b) pI가 약 7∼8.5이며,
    c) 헤르페스 바이러스 유입 매개체(HVEM) 폴리펩티드에 결합하며,
    d) 림프톡신 β 수용체(LTβR) 폴리펩티드에 결합하는 것이 특징인 실질적으로 정제된 폴리펩티드.
  2. 제1항에 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 서열.
  3. 제2항에 기재된 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  4. 제3항에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  5. 제1항에 기재된 폴리펩티드에 결합하는 항체.
  6. 제5항에 있어서, 모노클론 항체인 것이 특징인 항체.
  7. a) HVEM 폴리펩티드 또는 HVEM 폴리펩티드를 발현하는 세포, 및 HVEM 결합제와 함께 화합물을, 이 성분들이 상호작용하는 조건하에서 항온처리하는 단계; 및
    b) HVEM 결합제가 매개하는 세포 반응에 대한 상기 화합물의 영향을 측정하는 단계를 포함하여, HVEM 결합제가 매개하는 세포 반응에 영향을 주는 화합물을 동정하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 효과가 HVEM 매개된 세포 반응을 억제하는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 효과가 HVEM 매개된 세포 반응을 자극하는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, HVEM 결합제가 p30인 것이 특징인 방법.
  11. 제7항에 있어서, HVEM 결합제가 gD인 것이 특징인 방법.
  12. 제7항에 있어서, HVEM 결합제가 림포톡신 α(LTα)인 것이 특징인 방법.
  13. 제7항에 있어서, 세포 반응이 세포 활성화인 것이 특징인 방법.
  14. 제7항에 있어서, 세포 반응이 HSV 내면화(internalization)인 것이 특징인 방법.
  15. 제7항에 있어서, 세포가 림프구인 것이 특징인 방법.
  16. a) LTβR 폴리펩티드 또는 LTβR 폴리펩티드를 발현하는 세포, 및 p30과 함께 화합물을, 이 성분들이 상호작용하는 조건하에서 항온처리하는 단계; 및
    b) LTβR-p30이 매개하는 세포 반응에 대한 상기 화합물의 영향을 측정하는 단계를 포함하여, LTβR-p30이 매개하는 세포 반응에 영향을 주는 화합물을 동정하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 효과가 LTβR-p30 매개된 세포 반응을 억제하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 효과가 LTβR-p30 매개된 세포 반응을 자극하는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 반응이 세포 활성화인 것이 특징인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 세포가 림프구인 것이 특징인 방법.
  21. HVEM을 발현하는 세포를 HVEM 조정 유효량의 HVEM 결합제 또는 p30 결합제와 접촉시키는 단계를 포함하여 HVEM이 매개하는 세포 반응을 조정하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 결합제가 HVEM 매개된 세포 반응을 억제하는 것이 특징인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 결합제가 HVEM 매개된 세포 반응을 자극하는 것이 특징인 방법.
  24. 제21항에 있어서, HVEM 결합제가 gD인 것이 특징인 방법.
  25. 제21항에 있어서, HVEM 결합제가 p30인 것이 특징인 방법.
  26. 제21항에 있어서, HVEM 결합제가 LTα의 HVEM 결합 펩티드 단편 또는 그 펩티드 단편의 펩티드 모방체(peptidomimetic)인 것이 특징인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 펩티드가 자연 발생적 LTα의 N-말단으로부터 108번째에 해당하는 위치에 아미노산 Tyr을 포함하는 것이 특징인 방법.
  28. 제21항에 있어서, p30 결합제가 LTβR인 것이 특징인 방법.
  29. 제21항에 있어서, p30 결합제가 p30에 결합하는 항체인 것이 특징인 방법.
  30. 제21항에 있어서, 접촉이 시험관내에서 이루어지는 것이 특징인 방법.
  31. 제21항에 있어서, 접촉이 검체의 생체내에서 이루어지는 것이 특징인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 검체가 포유류인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 검체가 HVEM 관련 질병인 것이 특징인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 검체가 자가면역 질병, 백혈병 및 림프종으로 구성된 군에서 선택된 HVEM 관련 질병이 있는 것이 특징인 방법.
  35. HVEM을 발현하는 세포를 HVEM 조정 유효량의 HVEM 결합제 또는 LTα 결합제와 접촉시키는 단계를 포함하여 HVEM이 매개하는 세포 반응을 조정하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 결합제가 HVEM 매개된 세포 반응을 억제하는 것이 특징인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 결합제가 HVEM 매개된 세포 반응을 자극하는 것이 특징인 방법.
  38. 제35항에 있어서, HVEM 결합제가 gD인 것이 특징인 방법.
  39. 제35항에 있어서, HVEM 결합제가 LTα의 HVEM 결합 펩티드 단편 또는 이 펩티드 단편의 펩티드 모방체인 것이 특징인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 펩티드가 자연 발생적 LTα의 N 말단으로부터 108번째에 해당하는 위치에 아미노산 Tyr을 포함하는 것이 특징인 방법.
  41. 제35항에 있어서, LTα 결합제가 HVEM인 것이 특징인 방법.
  42. 제35항에 있어서, 접촉이 시험관내에서 이루어지는 것이 특징인 방법.
  43. 제35항에 있어서, 접촉이 검체의 생체내에서 이루어지는 것이 특징인 방법.
  44. 제35항에 있어서, 검체가 포유류인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 검체가 HVEM 관련 질병이 있는 것이 특징인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 검체가 자가면역 질병, 백혈병 및 림프종으로 구성된 군에서 선택된 HVEM 매개된 질병이 있는 것이 특징인 방법.
  47. LTβR을 발현하는 세포를 LTβR 조정 유효량의 LTβR 결합제 또는 p30 결합제와 접촉시키는 단계를 포함하여, LTβR이 매개하는 세포 반응을 조정하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 결합제가 LTβR 매개된 세포 반응을 억제하는 것인 방법.
  49. 제47항에 있어서, 결합제가 LTβR 매개된 세포 반응을 자극하는 것인 방법.
  50. 제47항에 있어서, LTβR 결합제가 p30 인 것이 특징인 방법.
  51. 제47항에 있어서, p30 결합제가 LTβR인 것이 특징인 방법.
  52. 제47항에 있어서, p30 결합제가 p30에 결합하는 항체인 것이 특징인 방법.
  53. 제47항에 있어서, 접촉이 시험관내에서 이루어지는 것이 특징인 방법.
  54. 제47항에 있어서, 접촉이 검체의 생체내에서 이루어지는 것이 특징인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 검체가 포유류인 방법.
  56. 제54항에 있어서, 검체가 LTβR 관련 질병이 있는 것이 특징인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 검체가 자가면역 질병, 백혈병 및 림프종으로 구성된 군에서 선택된 LTβR 관련 질병이 있는 것이 특징인 방법.
  58. 억제 유효량의 HVEM 결합제와 HSV 감염에 감수성인 세포를 접촉시켜 HSV 감염을 억제하는 단계를 포함하여 세포의 헤르페스 심플렉스 바이러스 감염(HSV)을 억제하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, HVEM 결합제가 gD인 것이 특징인 방법.
  60. 제58항에 있어서, HVEM 결합제가 p30인 것이 특징인 방법.
  61. 제58항에 있어서, HVEM 결합제가 LTα의 HVEM 결합 펩티드 단편 또는 이 펩티드 단편의 펩티드 모방체인 것이 특징인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 펩티드 단편이 자연 발생적 LTα의 N 말단으로부터 108번째에 해당하는 위치에 아미노산 Tyr을 포함하는 것이 특징인 방법.
  63. 제58항에 있어서, 접촉이 시험관내에서 이루어지는 것이 특징인 방법.
  64. 제58항에 있어서, 접촉이 검체의 생체내에서 이루어지는 것이 특징인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 검체가 포유류인 방법.
  66. 제64항에 있어서, 검체가 HSV 감염 위험이 있거나 또는 HSV에 감염된 것이 특징인 방법.
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