JPH0341157B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、新しい抗腫瘍抗生物質コンプレツク
スの製造、回収及び生物活性成分への分離法に関
する。 現在のスペクトルのデータ及び利用し得る物理
化学的性質を基にすると、本発明の抗腫瘍抗生物
質コンプレツクスは、エチノマイシン、デル等、
J.Am.Chem.Soc.、97、2497(1975)、キノマイシ
ン類、シヨウジ等、J.Antibiotics、14A、335
(1961)、並びにトリオスチンC、The Merck
Index、9版、9399に構造が関係あるように見え
る。然し、この抗腫瘍抗生物質コンプレツクス
は、次の点でこれらの抗生物質から区別される: 1 本発明のコンプレツクス及びその成分は、ア
クチノロイキン群の抗生物質におけるキノキサ
リンではなく発色団としてキノリン核を有す
る。 2 本コンプレツクス及びその成分は、アクチノ
ロイキン抗生物質の構造中の二硫化物又はチオ
アセタール架橋の存在とは異なり硫黄を含有し
ない。 3 本コンプレツクス及びその成分は、強力な抗
菌性抗生物質であるアクチノロイキン類に比べ
て比較的弱い抗菌活性を示す。 本発明によつてBBM−928と称される新しい
抗生物質コンプレツクスは、少なくとも6種の成
分を含有し、深部通気条件を用いる水性栄養培地
中で放線菌のBBM−928生産菌株
(ATCC31491)又はその変異株を培養することに
よつて製造される。本発明は又、培地からBBM
−928コンプレツクスの回収法及び向流分配又は
クロマトグラフの技術によつてコンプレツクスの
その生物活性成分への分離を取扱う。 本発明の生成物は、BBM−928コンプレツク
ス及びその生物活性成分A、B、C、D、E、並
びにFを包含する。 本発明は、ここで任意にBBM−928と称され
る新しい抗腫瘍抗生物質の製法に関する。このコ
ンプレツクスは、アクチノロイキン群の抗生物質
に構造が関連していると信じられ、まだ同定され
ていない放線菌の菌株の醗酵によつて生成する。
培地中BBM−928を生成することができる放線
菌の菌株はいずれも、ブリストル−バンユウコレ
クシヨン中放線菌菌株G455−101号と称される好
適な生産菌と共に使用することができる。この菌
は、フイリツピン群鳥で集められた土壤試料から
分離され、ATCC31491として米国の微生物代表
培養コレクシヨンに寄託されている。又この微生
物は、昭和55年3月25日に工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託された(微工研菌寄第5460号)。 この微生物の名称はアクチノマジユラ・ルゾネ
ンシス(Actinomadura Luzonensis)である。 ここにいう本発明の新規抗腫瘍抗生物質コンプ
レツクスは、BBM−928A、B、C、D、E及び
Fと称される少なくとも6種の成分を有する。
BBM−928コンプレツクスの成分A、B、C及
びDは、結晶性形態で単離され、成分A、B及び
Cの化学構造が同定されている。本発明のコンプ
レツクス(及び個々の成分)は、抗腫瘍抗菌性を
有している。抗菌活性に関しては、コンプレツク
ス及びその個々の成分は、動物飼料中栄養補給剤
として又哺乳類の細菌感染を処置する際治療剤と
して有用である。その外、これら抗生物質は、実
験室ガラス器具及び外科用機器を清浄にし滅菌す
るのに有用であり。石けん、洗剤及び消毒用洗液
と組合せて使用することができる。抗腫瘍効果に
ついては、コンプレツクス及びその個々の成分
は、種々の腹腔内移植マウス腫瘍に対して特に有
用である。 放線菌種G455−101号菌株 以下は、抗生物質抗腫瘍コンプレツクスBBM
−928を生産する好適な微生物の一般的記述であ
る。標準分類学的方法、例えばシヤーリング等、
Inst J.Syst.Bactariol.16、313(1966)及びルシユ
バリエ等、Biol.Actinomycetes Related
Org.11、78(1976)に従つてこの菌の培養、生理
学及び形態学的特徴を観察した。 ミクロ形態学 G455−101号菌株は、基質及び気中菌糸を共に
形成し、基質菌糸は、よく発達し、長くかつ枝分
れしている(幅0.5〜0.8μ)。この基質菌糸の明瞭
な分裂は見られない。ストレプトミセス属の通常
の種と異なり、G455−101菌株は、短かくかつ未
発達の気中菌糸のみを有するか、或いは寒天培地
によつては何も形成しない。短かいか又は長い胞
子鎖が気中菌糸中に生じ、それは鎖の中に2〜50
の卵形胞子を有する(大部分5〜20の胞子)。胞
子鎖は、形が直線か、屈曲が多いか又は輪になつ
ている。胞子は、形が円形(0.3〜0.4μ)、卵形又
は円筒形(0.3×1.5〜3.0μ)であり、滑らかな表
面を有している。胞子は、空の菌糸で分離されて
いることが多い。短かいコイル状の胞子鎖を包む
無定形の胞子のう様の包のうが気中菌糸上にとき
に観察される。 細胞壁組成及び全細胞糖成分 G455−101菌株の細胞壁は、メソ−ジアミノピ
メリン酸を含有するが、グリシンを欠いている。
全細胞水解物は、グルコース、マンノース及びマ
ズロース(3−O−メチル−D−ガラクトース)
の存在を示す。前述した細胞壁組成及び全細胞糖
成分は、G455−101菌株が細胞壁B型の放線菌
1菌株であることを示す。 培養及び生理学的特性 G455−101菌株は、豊富に生育し、紅色又は灰
紅色の気中菌糸を形成し、イースト抽出液−モル
ト抽出液寒天及びオートミル寒天のような栄養に
富む寒天培地中で赤味のある水不溶性の色素を生
じる。然し、無機塩−デンプン寒天、グリセロー
ル−アスパラギン寒天及びチロシン寒天中では、
貧弱な生育を行ない、白色又はページユ色の未発
達の気中菌糸を形成し、少量の赤味のある色素を
生じる。ペプトン−イースト−鉄寒天及びチロシ
ン寒天中で黒ずんだ色素を生じない。硝酸塩は亜
硝酸塩に還元される。28℃、37℃、並びに45℃に
おいて豊富に生育するが、10℃又は50℃において
は生育しない。五炭糖及び六炭糖は、この菌株に
よつてよく利用される。G455−101菌株の培養及
び生理学的特性を、それぞれ表1及び2に示す。
炭素源の利用を表3に示す。
スの製造、回収及び生物活性成分への分離法に関
する。 現在のスペクトルのデータ及び利用し得る物理
化学的性質を基にすると、本発明の抗腫瘍抗生物
質コンプレツクスは、エチノマイシン、デル等、
J.Am.Chem.Soc.、97、2497(1975)、キノマイシ
ン類、シヨウジ等、J.Antibiotics、14A、335
(1961)、並びにトリオスチンC、The Merck
Index、9版、9399に構造が関係あるように見え
る。然し、この抗腫瘍抗生物質コンプレツクス
は、次の点でこれらの抗生物質から区別される: 1 本発明のコンプレツクス及びその成分は、ア
クチノロイキン群の抗生物質におけるキノキサ
リンではなく発色団としてキノリン核を有す
る。 2 本コンプレツクス及びその成分は、アクチノ
ロイキン抗生物質の構造中の二硫化物又はチオ
アセタール架橋の存在とは異なり硫黄を含有し
ない。 3 本コンプレツクス及びその成分は、強力な抗
菌性抗生物質であるアクチノロイキン類に比べ
て比較的弱い抗菌活性を示す。 本発明によつてBBM−928と称される新しい
抗生物質コンプレツクスは、少なくとも6種の成
分を含有し、深部通気条件を用いる水性栄養培地
中で放線菌のBBM−928生産菌株
(ATCC31491)又はその変異株を培養することに
よつて製造される。本発明は又、培地からBBM
−928コンプレツクスの回収法及び向流分配又は
クロマトグラフの技術によつてコンプレツクスの
その生物活性成分への分離を取扱う。 本発明の生成物は、BBM−928コンプレツク
ス及びその生物活性成分A、B、C、D、E、並
びにFを包含する。 本発明は、ここで任意にBBM−928と称され
る新しい抗腫瘍抗生物質の製法に関する。このコ
ンプレツクスは、アクチノロイキン群の抗生物質
に構造が関連していると信じられ、まだ同定され
ていない放線菌の菌株の醗酵によつて生成する。
培地中BBM−928を生成することができる放線
菌の菌株はいずれも、ブリストル−バンユウコレ
クシヨン中放線菌菌株G455−101号と称される好
適な生産菌と共に使用することができる。この菌
は、フイリツピン群鳥で集められた土壤試料から
分離され、ATCC31491として米国の微生物代表
培養コレクシヨンに寄託されている。又この微生
物は、昭和55年3月25日に工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託された(微工研菌寄第5460号)。 この微生物の名称はアクチノマジユラ・ルゾネ
ンシス(Actinomadura Luzonensis)である。 ここにいう本発明の新規抗腫瘍抗生物質コンプ
レツクスは、BBM−928A、B、C、D、E及び
Fと称される少なくとも6種の成分を有する。
BBM−928コンプレツクスの成分A、B、C及
びDは、結晶性形態で単離され、成分A、B及び
Cの化学構造が同定されている。本発明のコンプ
レツクス(及び個々の成分)は、抗腫瘍抗菌性を
有している。抗菌活性に関しては、コンプレツク
ス及びその個々の成分は、動物飼料中栄養補給剤
として又哺乳類の細菌感染を処置する際治療剤と
して有用である。その外、これら抗生物質は、実
験室ガラス器具及び外科用機器を清浄にし滅菌す
るのに有用であり。石けん、洗剤及び消毒用洗液
と組合せて使用することができる。抗腫瘍効果に
ついては、コンプレツクス及びその個々の成分
は、種々の腹腔内移植マウス腫瘍に対して特に有
用である。 放線菌種G455−101号菌株 以下は、抗生物質抗腫瘍コンプレツクスBBM
−928を生産する好適な微生物の一般的記述であ
る。標準分類学的方法、例えばシヤーリング等、
Inst J.Syst.Bactariol.16、313(1966)及びルシユ
バリエ等、Biol.Actinomycetes Related
Org.11、78(1976)に従つてこの菌の培養、生理
学及び形態学的特徴を観察した。 ミクロ形態学 G455−101号菌株は、基質及び気中菌糸を共に
形成し、基質菌糸は、よく発達し、長くかつ枝分
れしている(幅0.5〜0.8μ)。この基質菌糸の明瞭
な分裂は見られない。ストレプトミセス属の通常
の種と異なり、G455−101菌株は、短かくかつ未
発達の気中菌糸のみを有するか、或いは寒天培地
によつては何も形成しない。短かいか又は長い胞
子鎖が気中菌糸中に生じ、それは鎖の中に2〜50
の卵形胞子を有する(大部分5〜20の胞子)。胞
子鎖は、形が直線か、屈曲が多いか又は輪になつ
ている。胞子は、形が円形(0.3〜0.4μ)、卵形又
は円筒形(0.3×1.5〜3.0μ)であり、滑らかな表
面を有している。胞子は、空の菌糸で分離されて
いることが多い。短かいコイル状の胞子鎖を包む
無定形の胞子のう様の包のうが気中菌糸上にとき
に観察される。 細胞壁組成及び全細胞糖成分 G455−101菌株の細胞壁は、メソ−ジアミノピ
メリン酸を含有するが、グリシンを欠いている。
全細胞水解物は、グルコース、マンノース及びマ
ズロース(3−O−メチル−D−ガラクトース)
の存在を示す。前述した細胞壁組成及び全細胞糖
成分は、G455−101菌株が細胞壁B型の放線菌
1菌株であることを示す。 培養及び生理学的特性 G455−101菌株は、豊富に生育し、紅色又は灰
紅色の気中菌糸を形成し、イースト抽出液−モル
ト抽出液寒天及びオートミル寒天のような栄養に
富む寒天培地中で赤味のある水不溶性の色素を生
じる。然し、無機塩−デンプン寒天、グリセロー
ル−アスパラギン寒天及びチロシン寒天中では、
貧弱な生育を行ない、白色又はページユ色の未発
達の気中菌糸を形成し、少量の赤味のある色素を
生じる。ペプトン−イースト−鉄寒天及びチロシ
ン寒天中で黒ずんだ色素を生じない。硝酸塩は亜
硝酸塩に還元される。28℃、37℃、並びに45℃に
おいて豊富に生育するが、10℃又は50℃において
は生育しない。五炭糖及び六炭糖は、この菌株に
よつてよく利用される。G455−101菌株の培養及
び生理学的特性を、それぞれ表1及び2に示す。
炭素源の利用を表3に示す。
【表】
【表】
【表】
【表】
において生育
なし。
なし。
【表】
【表】
BBM−928コンプレツクスの生産は、上の生
育及び顕微鏡特定によつて説明された特定の放線
菌種G455−101号菌株に限定されないことが理解
される。これらの特性は、例示の目的のみで示さ
れ、本発明は、X線放射、紫外線放射、ナイトロ
ジエン・マスタード、フアージ露出等のような当
該技術に既知の常用の手段によつて前述した菌か
ら得られる菌株又は変異株の使用を意図してお
り、これらは、BBM−928コンプレツクス又は
その個々の成分を生産することができる。 抗腫瘍抗生物質BBM−928コンプレツクスの製
造 本発明の抗腫瘍抗生物質BBM−928コンプレ
ツクスの製法は、放線菌G455−101号菌株を、同
化性炭素源及び同化性窒素源を含有する水溶液中
深部通気条件下に、該溶液に実質的な抗腫瘍抗生
物質活性が付与されるまで醗酵培養することを特
徴とする。本発明の抗生物質抗腫瘍剤の生産のた
め有用である培地は、デンプン、グルコース、デ
キストラン、マルトース、ラクトース、シユクロ
ース、フラクトース、マンノース、糖密、グリセ
ロール等のような同化性炭素源を含む。この栄養
培地は又、タンパク、タンパク水解物、ポリペプ
チド、アミノ酸、コーン・ステイープ・リカー、
カゼイン、尿素等のような同化性窒素源並びにカ
リウム、ナトリウム、アンモニウム、カルシウ
ム、硫酸塩、炭酸塩、燐酸塩、塩化物、硝酸塩等
のような陰イオン及び陽イオンを生じる栄養無機
塩を含有するべきである。 BBM−928コンプレツクスを生産する際、菌
の満足すべき生育を得ることができる任意の温度
を用いてよい。20゜〜45℃の範囲の温度が実施可
能であり、菌の至適の生育に好適な温度は28゜〜
34℃の範囲であり、30゜〜32℃の範囲の温度が最
も好適である。BBM−928コンプレツクスの最
高の生産は、一般に約4〜6日で得られる。醗酵
期においては常法が用いられる。例えば、少量の
製造は、振とうフラスコ中か又は表面培養によつ
て実施するのが便利である。大量の製造は、無菌
タンク中深部通気培養条件下に実施するのが好適
である。タンク培養の場合にはまず菌からの胞子
をブイヨン培養を接種することによつて栄養ブイ
ヨン中栄養接種物を生産して若い活性のある種培
養物を得、次にこれを醗酵タンク培地に無菌的に
移す。タンク及びビン中の通気は、無菌空気を醗
酵培地又はその供給施設に強制的に送り、機械推
進体によつてタンク中更に撹拌を生じることによ
つて得ることができる。シリコン油、大豆油及び
ラード油のような消泡剤を必要に応じて添加して
よい。 醗酵ブロス又はBBM−928コンプレツクスの
抽出液中の抗生物質レベルは、試験菌としてサル
シナ・ルテア(Sarcina Iutea)を使用しそして
定量培地として栄養寒天を用いるペーパー・デイ
スク寒天−拡散定量によつて決定することができ
る。至適ブロス力価を決定するために使用される
この定量系の最も望ましい感受性のためにPHを
9.0に調節する。 BBM−928コンプレツクスは、溶媒抽出操作
のような常用の手段によつて醗酵ブロスから単離
される。精製は、下の例2及び3に更に詳細に説
明するとおり製造用向流分配及びクロマトグラフ
イー操作によつて実施してBBM−928成分A、
B、C、D、E及びFを得るのが便利である。 例3のBBM−928成分A、B、C、並びにD
の物理化学的性質 BBM−928の個々の成分は、たがいに似た溶
解性及び発色反応を示す。例えば、それらはクロ
ロホルム及び塩化メチレンに易溶性、ベンゼン、
エタノール、メタノール及びn−ブタノールにわ
ずかに可溶性そして水及びn−ヘキサンに不溶性
である。塩化第二鉄及びエールリヒ試薬により陽
性反応が得られ、トレンス、サカグチ及びニンヒ
ドリンに対しては陰性反応である。 例3のBBM−928成分の特徴のある物理化学
的性質を表4に示す。
育及び顕微鏡特定によつて説明された特定の放線
菌種G455−101号菌株に限定されないことが理解
される。これらの特性は、例示の目的のみで示さ
れ、本発明は、X線放射、紫外線放射、ナイトロ
ジエン・マスタード、フアージ露出等のような当
該技術に既知の常用の手段によつて前述した菌か
ら得られる菌株又は変異株の使用を意図してお
り、これらは、BBM−928コンプレツクス又は
その個々の成分を生産することができる。 抗腫瘍抗生物質BBM−928コンプレツクスの製
造 本発明の抗腫瘍抗生物質BBM−928コンプレ
ツクスの製法は、放線菌G455−101号菌株を、同
化性炭素源及び同化性窒素源を含有する水溶液中
深部通気条件下に、該溶液に実質的な抗腫瘍抗生
物質活性が付与されるまで醗酵培養することを特
徴とする。本発明の抗生物質抗腫瘍剤の生産のた
め有用である培地は、デンプン、グルコース、デ
キストラン、マルトース、ラクトース、シユクロ
ース、フラクトース、マンノース、糖密、グリセ
ロール等のような同化性炭素源を含む。この栄養
培地は又、タンパク、タンパク水解物、ポリペプ
チド、アミノ酸、コーン・ステイープ・リカー、
カゼイン、尿素等のような同化性窒素源並びにカ
リウム、ナトリウム、アンモニウム、カルシウ
ム、硫酸塩、炭酸塩、燐酸塩、塩化物、硝酸塩等
のような陰イオン及び陽イオンを生じる栄養無機
塩を含有するべきである。 BBM−928コンプレツクスを生産する際、菌
の満足すべき生育を得ることができる任意の温度
を用いてよい。20゜〜45℃の範囲の温度が実施可
能であり、菌の至適の生育に好適な温度は28゜〜
34℃の範囲であり、30゜〜32℃の範囲の温度が最
も好適である。BBM−928コンプレツクスの最
高の生産は、一般に約4〜6日で得られる。醗酵
期においては常法が用いられる。例えば、少量の
製造は、振とうフラスコ中か又は表面培養によつ
て実施するのが便利である。大量の製造は、無菌
タンク中深部通気培養条件下に実施するのが好適
である。タンク培養の場合にはまず菌からの胞子
をブイヨン培養を接種することによつて栄養ブイ
ヨン中栄養接種物を生産して若い活性のある種培
養物を得、次にこれを醗酵タンク培地に無菌的に
移す。タンク及びビン中の通気は、無菌空気を醗
酵培地又はその供給施設に強制的に送り、機械推
進体によつてタンク中更に撹拌を生じることによ
つて得ることができる。シリコン油、大豆油及び
ラード油のような消泡剤を必要に応じて添加して
よい。 醗酵ブロス又はBBM−928コンプレツクスの
抽出液中の抗生物質レベルは、試験菌としてサル
シナ・ルテア(Sarcina Iutea)を使用しそして
定量培地として栄養寒天を用いるペーパー・デイ
スク寒天−拡散定量によつて決定することができ
る。至適ブロス力価を決定するために使用される
この定量系の最も望ましい感受性のためにPHを
9.0に調節する。 BBM−928コンプレツクスは、溶媒抽出操作
のような常用の手段によつて醗酵ブロスから単離
される。精製は、下の例2及び3に更に詳細に説
明するとおり製造用向流分配及びクロマトグラフ
イー操作によつて実施してBBM−928成分A、
B、C、D、E及びFを得るのが便利である。 例3のBBM−928成分A、B、C、並びにD
の物理化学的性質 BBM−928の個々の成分は、たがいに似た溶
解性及び発色反応を示す。例えば、それらはクロ
ロホルム及び塩化メチレンに易溶性、ベンゼン、
エタノール、メタノール及びn−ブタノールにわ
ずかに可溶性そして水及びn−ヘキサンに不溶性
である。塩化第二鉄及びエールリヒ試薬により陽
性反応が得られ、トレンス、サカグチ及びニンヒ
ドリンに対しては陰性反応である。 例3のBBM−928成分の特徴のある物理化学
的性質を表4に示す。
【表】
【表】
BBM−928A、BBM−928B、並びにBBM−
928CのNMRスペクトルは、たがいにきわめて似
ており、唯一の差違は、成分A(δ:2.03ppm、
2モル当量)及びB(δ:2.05ppm、1モル当量)
中アセチルの存在、然しC中不存在である。ピリ
ジン中無水酢酸によつてアセチル化すると、
BBM−928成分A、B及びCに対しそれぞれ2、
3及び4モル当量のアセチル基が導入された。か
くして得られたるアセチル化生成物は、TLC、
UV、IR及びNMRスペクトルにおいて同一の性
質を示し、BBM−928AがBBM−928Bのモノア
セチル誘導体そしてBBM−928Cのジアセチル誘
導体であることを示した。 BBM−928Aの酸加水分解は、5種のn−ブタ
ノール可溶性UV吸収性フラグメント(、、
、及び)及び5種の水溶性ニンヒドリン陽
性物質(NPS−1、2、3、4及び5)を生じ
た。後者の物質は、ダウエツクス50W×4クロマ
トグラフイーによつて分離され、次のアミノ酸と
して同定された:
928CのNMRスペクトルは、たがいにきわめて似
ており、唯一の差違は、成分A(δ:2.03ppm、
2モル当量)及びB(δ:2.05ppm、1モル当量)
中アセチルの存在、然しC中不存在である。ピリ
ジン中無水酢酸によつてアセチル化すると、
BBM−928成分A、B及びCに対しそれぞれ2、
3及び4モル当量のアセチル基が導入された。か
くして得られたるアセチル化生成物は、TLC、
UV、IR及びNMRスペクトルにおいて同一の性
質を示し、BBM−928AがBBM−928Bのモノア
セチル誘導体そしてBBM−928Cのジアセチル誘
導体であることを示した。 BBM−928Aの酸加水分解は、5種のn−ブタ
ノール可溶性UV吸収性フラグメント(、、
、及び)及び5種の水溶性ニンヒドリン陽
性物質(NPS−1、2、3、4及び5)を生じ
た。後者の物質は、ダウエツクス50W×4クロマ
トグラフイーによつて分離され、次のアミノ酸と
して同定された:
【表】
上述した5種のUV吸収性フラグメントは、次
の構造を有することが示されている: 酸加水分解(6N HCl)の際、フラグメント
、、及びは、次の分解生成物を生じた:
の構造を有することが示されている: 酸加水分解(6N HCl)の際、フラグメント
、、及びは、次の分解生成物を生じた:
【表】
0.1N NaOHを用い25℃において3時間BBM
−928A又はBBM−928Cを塩基加水分解すると
フラグメント(略号Ser、HM−VAl、並びに
Sarは上記のとおりであり、Glyはグリシンを表
わし、記号“X”は未決定の部分を表わす)を生
じる。 0.1N HClを用い110℃において1時間フラグ
メントを処理するとフラグメントプラスHM
−Valが得られる。 0.1N NaOHを用い37℃において40時間フラグ
メントを処理するとフラグメントプラスフラ
グメントが得られる。 X→Gly→Ser→HM−Val フラグメント 0.1N NaOHを用い37℃において40時間フラグ
メントを処理するとフラグメントプラスフラ
グメントが得られる。 X→Gly→Sar フラグメント 未決定の部分(X)は、フラグメント及びそ
の他の(X)を含有するフラグメントのミクロ分
析及び下に要約するスペクトル分析を基にして
C5H6N2O2(ペプチド形態)の分子式を有する。
−928A又はBBM−928Cを塩基加水分解すると
フラグメント(略号Ser、HM−VAl、並びに
Sarは上記のとおりであり、Glyはグリシンを表
わし、記号“X”は未決定の部分を表わす)を生
じる。 0.1N HClを用い110℃において1時間フラグ
メントを処理するとフラグメントプラスHM
−Valが得られる。 0.1N NaOHを用い37℃において40時間フラグ
メントを処理するとフラグメントプラスフラ
グメントが得られる。 X→Gly→Ser→HM−Val フラグメント 0.1N NaOHを用い37℃において40時間フラグ
メントを処理するとフラグメントプラスフラ
グメントが得られる。 X→Gly→Sar フラグメント 未決定の部分(X)は、フラグメント及びそ
の他の(X)を含有するフラグメントのミクロ分
析及び下に要約するスペクトル分析を基にして
C5H6N2O2(ペプチド形態)の分子式を有する。
【表】
フラグメント及びに対するスペクトルデー
タ及び例4のBBM−928Apの360MHzプロトン
NMRによれば、未決定のアミノ酸部分(X)
は、次のテトラヒドロピリタジン構造によつて最
もよく表わされるように見える。 前述した分解実験、スペクトルデータ、ミクロ
分析及び分子量決定の結果を基にして、次の構造
がBBM−928A、B及びCを最もよく表わすと信
じられる: R1 R2 BBM−928A Ac Ac BBM−928B Ac H BBM−928C H H Ser :セリン Gly :グリシン Sar :サルコシン HM−Val:β−ヒドロキシ−N−メチルバ
リン 抗微生物活性 BBM−928成分の抗微生物活性を、ステイー
ヤのマルチ接種装置を使用しPH7において栄養寒
天中順次寒天稀釈法によつて種々の細菌及びカビ
に対して決定した。接種材料のサイズは、約104
細胞/mlを含有する試験菌の分別材料0.0025mlを
すべての細菌及びカビー抗酸菌を除、これに対し
ては106細胞/mlの懸濁液を使用した−に対して
用いるように標準化した。37℃において一夜温置
して後、最小阻止濃度(MIC)を表5に示す。
表中見られるように、BBM−928成分は、グラ
ム陽性及び抗酸菌に対し中程度ないし弱い活性が
あるが、グラム陰性菌及びカビに対して実際上活
性がない。 溶原菌(ILB)中プロフアージ誘発の活性を
BBM−928成分について決定した。100mcg/ml
の濃度までBBM−928成分A、B及びCについ
て有意なILB活性が示されなかつた。
タ及び例4のBBM−928Apの360MHzプロトン
NMRによれば、未決定のアミノ酸部分(X)
は、次のテトラヒドロピリタジン構造によつて最
もよく表わされるように見える。 前述した分解実験、スペクトルデータ、ミクロ
分析及び分子量決定の結果を基にして、次の構造
がBBM−928A、B及びCを最もよく表わすと信
じられる: R1 R2 BBM−928A Ac Ac BBM−928B Ac H BBM−928C H H Ser :セリン Gly :グリシン Sar :サルコシン HM−Val:β−ヒドロキシ−N−メチルバ
リン 抗微生物活性 BBM−928成分の抗微生物活性を、ステイー
ヤのマルチ接種装置を使用しPH7において栄養寒
天中順次寒天稀釈法によつて種々の細菌及びカビ
に対して決定した。接種材料のサイズは、約104
細胞/mlを含有する試験菌の分別材料0.0025mlを
すべての細菌及びカビー抗酸菌を除、これに対し
ては106細胞/mlの懸濁液を使用した−に対して
用いるように標準化した。37℃において一夜温置
して後、最小阻止濃度(MIC)を表5に示す。
表中見られるように、BBM−928成分は、グラ
ム陽性及び抗酸菌に対し中程度ないし弱い活性が
あるが、グラム陰性菌及びカビに対して実際上活
性がない。 溶原菌(ILB)中プロフアージ誘発の活性を
BBM−928成分について決定した。100mcg/ml
の濃度までBBM−928成分A、B及びCについ
て有意なILB活性が示されなかつた。
【表】
【表】
抗腫瘍活性
抗腫瘍活性についてマイトマイシンCとの
BBM−928成分A、B、C及びDの比較試験を、
腸腔内移植腫瘍:P388白血病、L1210白血病、
B16黒色腫、ルイス肺(LL)カルシノーマ、並
びにザルコーマ180腹水(S180)を用いて実施し
た。10%ジメチルスルホキシドを含有する0.9%
食塩水中BBM−928成分及び0.9%食塩水中マイ
トマイシンCを、1回の1日処置から多回連日処
置までの範囲の投薬スケジユールに従つて1日1
回投与した。投薬量を変えることにより、処置動
物に対して対照動物より少なくとも1.25倍の中央
生存時間値を与える最小有効用量(MED)を決
定した。この活性の水準は、有意な抗腫瘍活性の
尺度であると考えられている。結果は、計算活性
比と共に表6に示され、BBM−928Aがマイトマ
イシンCより、腫瘍の株及び投薬スケジユールに
よつて10〜300の因子だけ著しく活性が大きいこ
とを例示する。ヴアン・デル・ヴエルデン、
Arch.Expt.Path.Pharmak.、195、389(1940)の
方法によつて決定したBBM−928成分A、B、
C及びD及びマイトマイシンCの腹腔内LD50値
も表6に示す。
BBM−928成分A、B、C及びDの比較試験を、
腸腔内移植腫瘍:P388白血病、L1210白血病、
B16黒色腫、ルイス肺(LL)カルシノーマ、並
びにザルコーマ180腹水(S180)を用いて実施し
た。10%ジメチルスルホキシドを含有する0.9%
食塩水中BBM−928成分及び0.9%食塩水中マイ
トマイシンCを、1回の1日処置から多回連日処
置までの範囲の投薬スケジユールに従つて1日1
回投与した。投薬量を変えることにより、処置動
物に対して対照動物より少なくとも1.25倍の中央
生存時間値を与える最小有効用量(MED)を決
定した。この活性の水準は、有意な抗腫瘍活性の
尺度であると考えられている。結果は、計算活性
比と共に表6に示され、BBM−928Aがマイトマ
イシンCより、腫瘍の株及び投薬スケジユールに
よつて10〜300の因子だけ著しく活性が大きいこ
とを例示する。ヴアン・デル・ヴエルデン、
Arch.Expt.Path.Pharmak.、195、389(1940)の
方法によつて決定したBBM−928成分A、B、
C及びD及びマイトマイシンCの腹腔内LD50値
も表6に示す。
【表】
例 1
BBM−928コンプレツクスの生産
寒天醗酵
放線菌種G455−101の1菌株のよく生育した寒
天斜面を使用して2%可溶性デンプン、1%グル
コース、0.5%フアーマメデイア、0.5%イースト
抽出液、0.5%NZ−アミン(A型)及び0.1%
CaCO3を含有する栄養培地に接種し、滅菌の前
にPHを7.2に調節する。この種培養をロータリー
振とう器(250rpm)上32℃に72時間温置し、生
育物5mlを、2%可溶性デンプン、1%フアーマ
メデイア、0.003%ZnSO4・7H2O及び0.4%
CaCO3よりなる醗酵培地100mlを含有する500ml
の三角フラスコに移す。BBM−928コンプレツ
クスの生産は、一般に5日の振とう培養の後最高
に達する。 タンク醗酵 種培養を三角フラスコ中4日間振とうし、200
リツトルの種タンク醗酵器中2.0%オートミール
(クエーカー・プロダクツ、オーストラリア)、
0.5%グルコース、0.2%乾燥イースト、0.0008%
MnCl2・4H2O、0.0007%CuSO4・7H2O、0.0002
%ZnSO4・7H2O及び0.0001%FeSO4・7H2Oより
なる発芽培地100リツトルに接種し、これを
200rpm、30℃において54時間撹拌する。次にこ
の種培養の15リツトル分を、400リツトルのタン
ク醗酵器中2.0%可溶性デンプン、1.0%フアーマ
メデイア、0.003%ZnSO4・7H2O及び0.4%
CaCO3を含有する醗酵培地170リツトルに接種
し、これを30℃、200rpm、通気速度150リツト
ル/分で操作する。醗酵の進行と共にブロスのPH
は次第に増大し、100〜120時間後8.4〜8.5に達
し、この時30mcg/mlのピーク抗生物質力価が得
られる。 例 2 溶媒抽出によるBBM−928コンプレツクスの
単離 例1から得られたブロス(170リツトル、PH
8.5)を清澄剤と共に過する。活性は、菌体ケ
ーキ及び液に共に見出される。菌体ケーキをア
セトンとメタノールとの溶媒混合物(1:1、30
リツトル×2)で2回抽出する。抽出液を合し、
減圧下蒸発させて水性濃縮物を得、これをn−ブ
タノールで抽出する。ブロス液をn−ブタノー
ルで2回抽出する(40リツトル×2)。n−ブタ
ノール抽出液を合し、減圧下に濃縮し、残留物を
凍結乾燥して粗製の固体(21.4g)を得る。薄層
クロマトグラフイー定量によれば、このものは3
種の主成分、A、B及びC、並びに3種の副成
分、D、E及びFよりなるコンプレツクスであ
り、下の表7に述べるとおりのRf値を有する。
天斜面を使用して2%可溶性デンプン、1%グル
コース、0.5%フアーマメデイア、0.5%イースト
抽出液、0.5%NZ−アミン(A型)及び0.1%
CaCO3を含有する栄養培地に接種し、滅菌の前
にPHを7.2に調節する。この種培養をロータリー
振とう器(250rpm)上32℃に72時間温置し、生
育物5mlを、2%可溶性デンプン、1%フアーマ
メデイア、0.003%ZnSO4・7H2O及び0.4%
CaCO3よりなる醗酵培地100mlを含有する500ml
の三角フラスコに移す。BBM−928コンプレツ
クスの生産は、一般に5日の振とう培養の後最高
に達する。 タンク醗酵 種培養を三角フラスコ中4日間振とうし、200
リツトルの種タンク醗酵器中2.0%オートミール
(クエーカー・プロダクツ、オーストラリア)、
0.5%グルコース、0.2%乾燥イースト、0.0008%
MnCl2・4H2O、0.0007%CuSO4・7H2O、0.0002
%ZnSO4・7H2O及び0.0001%FeSO4・7H2Oより
なる発芽培地100リツトルに接種し、これを
200rpm、30℃において54時間撹拌する。次にこ
の種培養の15リツトル分を、400リツトルのタン
ク醗酵器中2.0%可溶性デンプン、1.0%フアーマ
メデイア、0.003%ZnSO4・7H2O及び0.4%
CaCO3を含有する醗酵培地170リツトルに接種
し、これを30℃、200rpm、通気速度150リツト
ル/分で操作する。醗酵の進行と共にブロスのPH
は次第に増大し、100〜120時間後8.4〜8.5に達
し、この時30mcg/mlのピーク抗生物質力価が得
られる。 例 2 溶媒抽出によるBBM−928コンプレツクスの
単離 例1から得られたブロス(170リツトル、PH
8.5)を清澄剤と共に過する。活性は、菌体ケ
ーキ及び液に共に見出される。菌体ケーキをア
セトンとメタノールとの溶媒混合物(1:1、30
リツトル×2)で2回抽出する。抽出液を合し、
減圧下蒸発させて水性濃縮物を得、これをn−ブ
タノールで抽出する。ブロス液をn−ブタノー
ルで2回抽出する(40リツトル×2)。n−ブタ
ノール抽出液を合し、減圧下に濃縮し、残留物を
凍結乾燥して粗製の固体(21.4g)を得る。薄層
クロマトグラフイー定量によれば、このものは3
種の主成分、A、B及びC、並びに3種の副成
分、D、E及びFよりなるコンプレツクスであ
り、下の表7に述べるとおりのRf値を有する。
【表】
例 3
BBM−928コンプレツクスの精製
例2の粗コンプレツクス四塩化炭素−クロロホ
ルム−メタノール−水(5:2:5:1)の溶媒
系を使用する製造用向流分配置(ミタムラ、100
ml/管)によつて精製する。50回の転溶の後、管
5号ないし20号を合し、濃縮して成分A、B、
D、E及びFを含有する淡黄色粉末(4.4g)を
得る。この混合物を少量のクロロホルムに溶解
し、予め酢酸エチルで処理したシリカゲルC−
200(500ml)のカラム上に入れる。増加量のメタ
ノール(2〜5%、V/V)を有する酢酸エチル
でカラムを展開し、345nmにおける光学密度によ
つてフラクシヨンをモニターする。副成分Dが最
初に、次いで成分Aが酢酸エチルによつて溶離さ
れる。成分E、B及びFは、次に3%のメタノー
ル濃度においてその順に溶離される。適当な成分
を含有する各フラクシヨンを減圧下蒸発させ、残
留物をクロロホルム−メタノールから結晶化させ
る。同様に、成分Cの粗製物が上述した向流分配
の管21号ないし35号から得られる。成分Cの精製
を、シリカゲルクロマトグラフイー及びクロロホ
ルム−メタノールからの結晶化によつて実施す
る。成分A、B、C、D、E及びFについて収量
は、それぞれ、988mg、420mg、848mg、130mg、
119mg、並びに114mgである。 例 4 例3の成分BBM−928Aのより以上の精製 例3のBBM−928A成分の薄層クロマトグラフ
イー定量(トルエン中10%メタノールよりなる系
を用いる)は、試料がBBM−928A成分のすぐ上
に行く外の材料を含有するという点で完全には均
質でないことを示した。精製を行なうために次の
工程を実施した。 (1) 試料を、クロロホルムないし6%メタノール
−クロロホルムの線状勾配を使用してシリカゲ
ル上クロマトグラフ処理する。2.4及び3.3%メ
タノール−クロロホルムの間に溶離するフラク
シヨン(BBM−928A成分プラス若干の汚染物
を含有する)を次の工程のために合わせる。 (2) 最初の2個中2%メタノール−トルエンそし
て第3のものの中に6%メタノール−トルエン
を含有する3個の容器を残用して凹形勾配を発
生させる。この勾配上クロマトグラフ(シリカ
ゲルカラム)処理した工程1からの複合物は、
1副成分、すぐ続いて精製されたBBM−928A
成分(ここでBBM−928Apという)を生じる。 BBM−928Apの分子量は、場脱着質量分析
(Field Desorption Mass Spectrometry)によ
つて決定して、1427であり、実験式
C64H78N14O24(分子量1427.417)に相当する。 元素分析(100℃で18時間乾燥した成分) C64H78N14O24として 計算値 :C53.85;H5.51;N13.74; O26.90 実験値b:C52.47;H5.48;N13.81; O28.24a a 差による。 b 3回の測定の平均。
ルム−メタノール−水(5:2:5:1)の溶媒
系を使用する製造用向流分配置(ミタムラ、100
ml/管)によつて精製する。50回の転溶の後、管
5号ないし20号を合し、濃縮して成分A、B、
D、E及びFを含有する淡黄色粉末(4.4g)を
得る。この混合物を少量のクロロホルムに溶解
し、予め酢酸エチルで処理したシリカゲルC−
200(500ml)のカラム上に入れる。増加量のメタ
ノール(2〜5%、V/V)を有する酢酸エチル
でカラムを展開し、345nmにおける光学密度によ
つてフラクシヨンをモニターする。副成分Dが最
初に、次いで成分Aが酢酸エチルによつて溶離さ
れる。成分E、B及びFは、次に3%のメタノー
ル濃度においてその順に溶離される。適当な成分
を含有する各フラクシヨンを減圧下蒸発させ、残
留物をクロロホルム−メタノールから結晶化させ
る。同様に、成分Cの粗製物が上述した向流分配
の管21号ないし35号から得られる。成分Cの精製
を、シリカゲルクロマトグラフイー及びクロロホ
ルム−メタノールからの結晶化によつて実施す
る。成分A、B、C、D、E及びFについて収量
は、それぞれ、988mg、420mg、848mg、130mg、
119mg、並びに114mgである。 例 4 例3の成分BBM−928Aのより以上の精製 例3のBBM−928A成分の薄層クロマトグラフ
イー定量(トルエン中10%メタノールよりなる系
を用いる)は、試料がBBM−928A成分のすぐ上
に行く外の材料を含有するという点で完全には均
質でないことを示した。精製を行なうために次の
工程を実施した。 (1) 試料を、クロロホルムないし6%メタノール
−クロロホルムの線状勾配を使用してシリカゲ
ル上クロマトグラフ処理する。2.4及び3.3%メ
タノール−クロロホルムの間に溶離するフラク
シヨン(BBM−928A成分プラス若干の汚染物
を含有する)を次の工程のために合わせる。 (2) 最初の2個中2%メタノール−トルエンそし
て第3のものの中に6%メタノール−トルエン
を含有する3個の容器を残用して凹形勾配を発
生させる。この勾配上クロマトグラフ(シリカ
ゲルカラム)処理した工程1からの複合物は、
1副成分、すぐ続いて精製されたBBM−928A
成分(ここでBBM−928Apという)を生じる。 BBM−928Apの分子量は、場脱着質量分析
(Field Desorption Mass Spectrometry)によ
つて決定して、1427であり、実験式
C64H78N14O24(分子量1427.417)に相当する。 元素分析(100℃で18時間乾燥した成分) C64H78N14O24として 計算値 :C53.85;H5.51;N13.74; O26.90 実験値b:C52.47;H5.48;N13.81; O28.24a a 差による。 b 3回の測定の平均。
1 式
(式中、破線は単一または二重結合を示す。
Claims (1)
- 【表】
Applications Claiming Priority (2)
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US2648879A | 1979-04-02 | 1979-04-02 | |
US26488 | 1979-04-02 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4205180A Division JPS55162752A (en) | 1979-04-02 | 1980-04-02 | Antitumor and antimicrobial agent |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63139192A JPS63139192A (ja) | 1988-06-10 |
JPH0341157B2 true JPH0341157B2 (ja) | 1991-06-21 |
Family
ID=21832125
Family Applications (3)
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---|---|---|---|
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JP62253589A Granted JPS63139192A (ja) | 1979-04-02 | 1987-10-09 | 抗腫瘍性抗生物質の製造法 |
JP62253588A Granted JPS63139191A (ja) | 1979-04-02 | 1987-10-09 | 抗腫瘍抗菌剤 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4205180A Granted JPS55162752A (en) | 1979-04-02 | 1980-04-02 | Antitumor and antimicrobial agent |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62253588A Granted JPS63139191A (ja) | 1979-04-02 | 1987-10-09 | 抗腫瘍抗菌剤 |
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AU566569B2 (en) * | 1983-01-31 | 1987-10-22 | Bristol-Myers Company | Luzopeptin e2 |
DE3375076D1 (en) * | 1983-09-14 | 1988-02-11 | Bristol Myers Co | Injectable compositions of bbm-928a |
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- 1980-04-02 AT AT0180380A patent/AT371144B/de not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-10-09 JP JP62253589A patent/JPS63139192A/ja active Granted
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