JPH0341157B2 - - Google Patents

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JPH0341157B2
JPH0341157B2 JP62253589A JP25358987A JPH0341157B2 JP H0341157 B2 JPH0341157 B2 JP H0341157B2 JP 62253589 A JP62253589 A JP 62253589A JP 25358987 A JP25358987 A JP 25358987A JP H0341157 B2 JPH0341157 B2 JP H0341157B2
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、新しい抗腫瘍抗生物質コンプレツク
スの製造、回収及び生物活性成分への分離法に関
する。 現在のスペクトルのデータ及び利用し得る物理
化学的性質を基にすると、本発明の抗腫瘍抗生物
質コンプレツクスは、エチノマイシン、デル等、
J.Am.Chem.Soc.、97、2497（1975）、キノマイシ
ン類、シヨウジ等、J.Antibiotics、14A、335
（1961）、並びにトリオスチンＣ、The Merck
Index、９版、9399に構造が関係あるように見え
る。然し、この抗腫瘍抗生物質コンプレツクス
は、次の点でこれらの抗生物質から区別される： １ 本発明のコンプレツクス及びその成分は、ア
クチノロイキン群の抗生物質におけるキノキサ
リンではなく発色団としてキノリン核を有す
る。 ２ 本コンプレツクス及びその成分は、アクチノ
ロイキン抗生物質の構造中の二硫化物又はチオ
アセタール架橋の存在とは異なり硫黄を含有し
ない。 ３ 本コンプレツクス及びその成分は、強力な抗
菌性抗生物質であるアクチノロイキン類に比べ
て比較的弱い抗菌活性を示す。 本発明によつてBBM−928と称される新しい
抗生物質コンプレツクスは、少なくとも６種の成
分を含有し、深部通気条件を用いる水性栄養培地
中で放線菌のBBM−928生産菌株
（ATCC31491）又はその変異株を培養することに
よつて製造される。本発明は又、培地からBBM
−928コンプレツクスの回収法及び向流分配又は
クロマトグラフの技術によつてコンプレツクスの
その生物活性成分への分離を取扱う。 本発明の生成物は、BBM−928コンプレツク
ス及びその生物活性成分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、並
びにＦを包含する。 本発明は、ここで任意にBBM−928と称され
る新しい抗腫瘍抗生物質の製法に関する。このコ
ンプレツクスは、アクチノロイキン群の抗生物質
に構造が関連していると信じられ、まだ同定され
ていない放線菌の菌株の醗酵によつて生成する。
培地中BBM−928を生成することができる放線
菌の菌株はいずれも、ブリストル−バンユウコレ
クシヨン中放線菌菌株G455−101号と称される好
適な生産菌と共に使用することができる。この菌
は、フイリツピン群鳥で集められた土壤試料から
分離され、ATCC31491として米国の微生物代表
培養コレクシヨンに寄託されている。又この微生
物は、昭和55年３月25日に工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託された（微工研菌寄第5460号）。 この微生物の名称はアクチノマジユラ・ルゾネ
ンシス（Actinomadura Luzonensis）である。 ここにいう本発明の新規抗腫瘍抗生物質コンプ
レツクスは、BBM−928A、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及び
Ｆと称される少なくとも６種の成分を有する。
BBM−928コンプレツクスの成分Ａ、Ｂ、Ｃ及
びＤは、結晶性形態で単離され、成分Ａ、Ｂ及び
Ｃの化学構造が同定されている。本発明のコンプ
レツクス（及び個々の成分）は、抗腫瘍抗菌性を
有している。抗菌活性に関しては、コンプレツク
ス及びその個々の成分は、動物飼料中栄養補給剤
として又哺乳類の細菌感染を処置する際治療剤と
して有用である。その外、これら抗生物質は、実
験室ガラス器具及び外科用機器を清浄にし滅菌す
るのに有用であり。石けん、洗剤及び消毒用洗液
と組合せて使用することができる。抗腫瘍効果に
ついては、コンプレツクス及びその個々の成分
は、種々の腹腔内移植マウス腫瘍に対して特に有
用である。 放線菌種G455−101号菌株 以下は、抗生物質抗腫瘍コンプレツクスBBM
−928を生産する好適な微生物の一般的記述であ
る。標準分類学的方法、例えばシヤーリング等、
Inst J.Syst.Bactariol.16、313（1966）及びルシユ
バリエ等、Biol.Actinomycetes Related
Org.11、78（1976）に従つてこの菌の培養、生理
学及び形態学的特徴を観察した。 ミクロ形態学 G455−101号菌株は、基質及び気中菌糸を共に
形成し、基質菌糸は、よく発達し、長くかつ枝分
れしている（幅0.5〜0.8μ）。この基質菌糸の明瞭
な分裂は見られない。ストレプトミセス属の通常
の種と異なり、G455−101菌株は、短かくかつ未
発達の気中菌糸のみを有するか、或いは寒天培地
によつては何も形成しない。短かいか又は長い胞
子鎖が気中菌糸中に生じ、それは鎖の中に２〜50
の卵形胞子を有する（大部分５〜20の胞子）。胞
子鎖は、形が直線か、屈曲が多いか又は輪になつ
ている。胞子は、形が円形（0.3〜0.4μ）、卵形又
は円筒形（0.3×1.5〜3.0μ）であり、滑らかな表
面を有している。胞子は、空の菌糸で分離されて
いることが多い。短かいコイル状の胞子鎖を包む
無定形の胞子のう様の包のうが気中菌糸上にとき
に観察される。 細胞壁組成及び全細胞糖成分 G455−101菌株の細胞壁は、メソ−ジアミノピ
メリン酸を含有するが、グリシンを欠いている。
全細胞水解物は、グルコース、マンノース及びマ
ズロース（３−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース）
の存在を示す。前述した細胞壁組成及び全細胞糖
成分は、G455−101菌株が細胞壁Ｂ型の放線菌
１菌株であることを示す。 培養及び生理学的特性 G455−101菌株は、豊富に生育し、紅色又は灰
紅色の気中菌糸を形成し、イースト抽出液−モル
ト抽出液寒天及びオートミル寒天のような栄養に
富む寒天培地中で赤味のある水不溶性の色素を生
じる。然し、無機塩−デンプン寒天、グリセロー
ル−アスパラギン寒天及びチロシン寒天中では、
貧弱な生育を行ない、白色又はページユ色の未発
達の気中菌糸を形成し、少量の赤味のある色素を
生じる。ペプトン−イースト−鉄寒天及びチロシ
ン寒天中で黒ずんだ色素を生じない。硝酸塩は亜
硝酸塩に還元される。28℃、37℃、並びに45℃に
おいて豊富に生育するが、10℃又は50℃において
は生育しない。五炭糖及び六炭糖は、この菌株に
よつてよく利用される。G455−101菌株の培養及
び生理学的特性を、それぞれ表１及び２に示す。
炭素源の利用を表３に示す。
【表】
【表】
【表】
【表】 において生育
なし。
【表】
【表】 BBM−928コンプレツクスの生産は、上の生
育及び顕微鏡特定によつて説明された特定の放線
菌種G455−101号菌株に限定されないことが理解
される。これらの特性は、例示の目的のみで示さ
れ、本発明は、Ｘ線放射、紫外線放射、ナイトロ
ジエン・マスタード、フアージ露出等のような当
該技術に既知の常用の手段によつて前述した菌か
ら得られる菌株又は変異株の使用を意図してお
り、これらは、BBM−928コンプレツクス又は
その個々の成分を生産することができる。 抗腫瘍抗生物質BBM−928コンプレツクスの製
造 本発明の抗腫瘍抗生物質BBM−928コンプレ
ツクスの製法は、放線菌G455−101号菌株を、同
化性炭素源及び同化性窒素源を含有する水溶液中
深部通気条件下に、該溶液に実質的な抗腫瘍抗生
物質活性が付与されるまで醗酵培養することを特
徴とする。本発明の抗生物質抗腫瘍剤の生産のた
め有用である培地は、デンプン、グルコース、デ
キストラン、マルトース、ラクトース、シユクロ
ース、フラクトース、マンノース、糖密、グリセ
ロール等のような同化性炭素源を含む。この栄養
培地は又、タンパク、タンパク水解物、ポリペプ
チド、アミノ酸、コーン・ステイープ・リカー、
カゼイン、尿素等のような同化性窒素源並びにカ
リウム、ナトリウム、アンモニウム、カルシウ
ム、硫酸塩、炭酸塩、燐酸塩、塩化物、硝酸塩等
のような陰イオン及び陽イオンを生じる栄養無機
塩を含有するべきである。 BBM−928コンプレツクスを生産する際、菌
の満足すべき生育を得ることができる任意の温度
を用いてよい。20゜〜45℃の範囲の温度が実施可
能であり、菌の至適の生育に好適な温度は28゜〜
34℃の範囲であり、30゜〜32℃の範囲の温度が最
も好適である。BBM−928コンプレツクスの最
高の生産は、一般に約４〜６日で得られる。醗酵
期においては常法が用いられる。例えば、少量の
製造は、振とうフラスコ中か又は表面培養によつ
て実施するのが便利である。大量の製造は、無菌
タンク中深部通気培養条件下に実施するのが好適
である。タンク培養の場合にはまず菌からの胞子
をブイヨン培養を接種することによつて栄養ブイ
ヨン中栄養接種物を生産して若い活性のある種培
養物を得、次にこれを醗酵タンク培地に無菌的に
移す。タンク及びビン中の通気は、無菌空気を醗
酵培地又はその供給施設に強制的に送り、機械推
進体によつてタンク中更に撹拌を生じることによ
つて得ることができる。シリコン油、大豆油及び
ラード油のような消泡剤を必要に応じて添加して
よい。 醗酵ブロス又はBBM−928コンプレツクスの
抽出液中の抗生物質レベルは、試験菌としてサル
シナ・ルテア（Sarcina Iutea）を使用しそして
定量培地として栄養寒天を用いるペーパー・デイ
スク寒天−拡散定量によつて決定することができ
る。至適ブロス力価を決定するために使用される
この定量系の最も望ましい感受性のためにPHを
9.0に調節する。 BBM−928コンプレツクスは、溶媒抽出操作
のような常用の手段によつて醗酵ブロスから単離
される。精製は、下の例２及び３に更に詳細に説
明するとおり製造用向流分配及びクロマトグラフ
イー操作によつて実施してBBM−928成分Ａ、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦを得るのが便利である。 例３のBBM−928成分Ａ、Ｂ、Ｃ、並びにＤ
の物理化学的性質 BBM−928の個々の成分は、たがいに似た溶
解性及び発色反応を示す。例えば、それらはクロ
ロホルム及び塩化メチレンに易溶性、ベンゼン、
エタノール、メタノール及びｎ−ブタノールにわ
ずかに可溶性そして水及びｎ−ヘキサンに不溶性
である。塩化第二鉄及びエールリヒ試薬により陽
性反応が得られ、トレンス、サカグチ及びニンヒ
ドリンに対しては陰性反応である。 例３のBBM−928成分の特徴のある物理化学
的性質を表４に示す。
【表】
【表】 BBM−928A、BBM−928B、並びにBBM−
928CのNMRスペクトルは、たがいにきわめて似
ており、唯一の差違は、成分Ａ（δ：2.03ppm、
２モル当量）及びＢ（δ：2.05ppm、１モル当量）
中アセチルの存在、然しＣ中不存在である。ピリ
ジン中無水酢酸によつてアセチル化すると、
BBM−928成分Ａ、Ｂ及びＣに対しそれぞれ２、
３及び４モル当量のアセチル基が導入された。か
くして得られたるアセチル化生成物は、TLC、
UV、IR及びNMRスペクトルにおいて同一の性
質を示し、BBM−928AがBBM−928Bのモノア
セチル誘導体そしてBBM−928Cのジアセチル誘
導体であることを示した。 BBM−928Aの酸加水分解は、５種のｎ−ブタ
ノール可溶性UV吸収性フラグメント（、、
、及び）及び５種の水溶性ニンヒドリン陽
性物質（NPS−１、２、３、４及び５）を生じ
た。後者の物質は、ダウエツクス50W×４クロマ
トグラフイーによつて分離され、次のアミノ酸と
して同定された：
【表】 上述した５種のUV吸収性フラグメントは、次
の構造を有することが示されている： 酸加水分解（6N HCl）の際、フラグメント
、、及びは、次の分解生成物を生じた：
【表】 0.1N NaOHを用い25℃において３時間BBM
−928A又はBBM−928Cを塩基加水分解すると
フラグメント（略号Ser、HM−VAl、並びに
Sarは上記のとおりであり、Glyはグリシンを表
わし、記号“Ｘ”は未決定の部分を表わす）を生
じる。 0.1N HClを用い110℃において１時間フラグ
メントを処理するとフラグメントプラスHM
−Valが得られる。 0.1N NaOHを用い37℃において40時間フラグ
メントを処理するとフラグメントプラスフラ
グメントが得られる。 Ｘ→Gly→Ser→HM−Val フラグメント 0.1N NaOHを用い37℃において40時間フラグ
メントを処理するとフラグメントプラスフラ
グメントが得られる。 Ｘ→Gly→Sar フラグメント 未決定の部分（Ｘ）は、フラグメント及びそ
の他の（Ｘ）を含有するフラグメントのミクロ分
析及び下に要約するスペクトル分析を基にして
C5H6N2O2（ペプチド形態）の分子式を有する。
【表】 フラグメント及びに対するスペクトルデー
タ及び例４のBBM−928Apの360MHzプロトン
NMRによれば、未決定のアミノ酸部分（Ｘ）
は、次のテトラヒドロピリタジン構造によつて最
もよく表わされるように見える。 前述した分解実験、スペクトルデータ、ミクロ
分析及び分子量決定の結果を基にして、次の構造
がBBM−928A、Ｂ及びＣを最もよく表わすと信
じられる： R1 R2 BBM−928A Ac Ac BBM−928B Ac Ｈ BBM−928C Ｈ Ｈ Ser ：セリン Gly ：グリシン Sar ：サルコシン HM−Val：β−ヒドロキシ−Ｎ−メチルバ
リン 抗微生物活性 BBM−928成分の抗微生物活性を、ステイー
ヤのマルチ接種装置を使用しPH７において栄養寒
天中順次寒天稀釈法によつて種々の細菌及びカビ
に対して決定した。接種材料のサイズは、約104
細胞／mlを含有する試験菌の分別材料0.0025mlを
すべての細菌及びカビー抗酸菌を除、これに対し
ては106細胞／mlの懸濁液を使用した−に対して
用いるように標準化した。37℃において一夜温置
して後、最小阻止濃度（MIC）を表５に示す。
表中見られるように、BBM−928成分は、グラ
ム陽性及び抗酸菌に対し中程度ないし弱い活性が
あるが、グラム陰性菌及びカビに対して実際上活
性がない。 溶原菌（ILB）中プロフアージ誘発の活性を
BBM−928成分について決定した。100mcg／ml
の濃度までBBM−928成分Ａ、Ｂ及びＣについ
て有意なILB活性が示されなかつた。
【表】
【表】 抗腫瘍活性 抗腫瘍活性についてマイトマイシンＣとの
BBM−928成分Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの比較試験を、
腸腔内移植腫瘍：P388白血病、L1210白血病、
B16黒色腫、ルイス肺（LL）カルシノーマ、並
びにザルコーマ180腹水（S180）を用いて実施し
た。10％ジメチルスルホキシドを含有する0.9％
食塩水中BBM−928成分及び0.9％食塩水中マイ
トマイシンＣを、１回の１日処置から多回連日処
置までの範囲の投薬スケジユールに従つて１日１
回投与した。投薬量を変えることにより、処置動
物に対して対照動物より少なくとも1.25倍の中央
生存時間値を与える最小有効用量（MED）を決
定した。この活性の水準は、有意な抗腫瘍活性の
尺度であると考えられている。結果は、計算活性
比と共に表６に示され、BBM−928Aがマイトマ
イシンＣより、腫瘍の株及び投薬スケジユールに
よつて10〜300の因子だけ著しく活性が大きいこ
とを例示する。ヴアン・デル・ヴエルデン、
Arch.Expt.Path.Pharmak.、195、389（1940）の
方法によつて決定したBBM−928成分Ａ、Ｂ、
Ｃ及びＤ及びマイトマイシンＣの腹腔内LD50値
も表６に示す。
【表】 例 １ BBM−928コンプレツクスの生産 寒天醗酵 放線菌種G455−101の１菌株のよく生育した寒
天斜面を使用して２％可溶性デンプン、１％グル
コース、0.5％フアーマメデイア、0.5％イースト
抽出液、0.5％NZ−アミン（Ａ型）及び0.1％
CaCO3を含有する栄養培地に接種し、滅菌の前
にPHを7.2に調節する。この種培養をロータリー
振とう器（250rpm）上32℃に72時間温置し、生
育物５mlを、２％可溶性デンプン、１％フアーマ
メデイア、0.003％ZnSO4・7H2O及び0.4％
CaCO3よりなる醗酵培地100mlを含有する500ml
の三角フラスコに移す。BBM−928コンプレツ
クスの生産は、一般に５日の振とう培養の後最高
に達する。 タンク醗酵 種培養を三角フラスコ中４日間振とうし、200
リツトルの種タンク醗酵器中2.0％オートミール
（クエーカー・プロダクツ、オーストラリア）、
0.5％グルコース、0.2％乾燥イースト、0.0008％
MnCl2・4H2O、0.0007％CuSO4・7H2O、0.0002
％ZnSO4・7H2O及び0.0001％FeSO4・7H2Oより
なる発芽培地100リツトルに接種し、これを
200rpm、30℃において54時間撹拌する。次にこ
の種培養の15リツトル分を、400リツトルのタン
ク醗酵器中2.0％可溶性デンプン、1.0％フアーマ
メデイア、0.003％ZnSO4・7H2O及び0.4％
CaCO3を含有する醗酵培地170リツトルに接種
し、これを30℃、200rpm、通気速度150リツト
ル／分で操作する。醗酵の進行と共にブロスのPH
は次第に増大し、100〜120時間後8.4〜8.5に達
し、この時30mcg／mlのピーク抗生物質力価が得
られる。 例 ２ 溶媒抽出によるBBM−928コンプレツクスの
単離 例１から得られたブロス（170リツトル、PH
8.5）を清澄剤と共に過する。活性は、菌体ケ
ーキ及び液に共に見出される。菌体ケーキをア
セトンとメタノールとの溶媒混合物（１：１、30
リツトル×２）で２回抽出する。抽出液を合し、
減圧下蒸発させて水性濃縮物を得、これをｎ−ブ
タノールで抽出する。ブロス液をｎ−ブタノー
ルで２回抽出する（40リツトル×２）。ｎ−ブタ
ノール抽出液を合し、減圧下に濃縮し、残留物を
凍結乾燥して粗製の固体（21.4ｇ）を得る。薄層
クロマトグラフイー定量によれば、このものは３
種の主成分、Ａ、Ｂ及びＣ、並びに３種の副成
分、Ｄ、Ｅ及びＦよりなるコンプレツクスであ
り、下の表７に述べるとおりのRf値を有する。
【表】 例 ３ BBM−928コンプレツクスの精製 例２の粗コンプレツクス四塩化炭素−クロロホ
ルム−メタノール−水（５：２：５：１）の溶媒
系を使用する製造用向流分配置（ミタムラ、100
ml／管）によつて精製する。50回の転溶の後、管
５号ないし20号を合し、濃縮して成分Ａ、Ｂ、
Ｄ、Ｅ及びＦを含有する淡黄色粉末（4.4ｇ）を
得る。この混合物を少量のクロロホルムに溶解
し、予め酢酸エチルで処理したシリカゲルＣ−
200（500ml）のカラム上に入れる。増加量のメタ
ノール（２〜５％、V/V）を有する酢酸エチル
でカラムを展開し、345nmにおける光学密度によ
つてフラクシヨンをモニターする。副成分Ｄが最
初に、次いで成分Ａが酢酸エチルによつて溶離さ
れる。成分Ｅ、Ｂ及びＦは、次に３％のメタノー
ル濃度においてその順に溶離される。適当な成分
を含有する各フラクシヨンを減圧下蒸発させ、残
留物をクロロホルム−メタノールから結晶化させ
る。同様に、成分Ｃの粗製物が上述した向流分配
の管21号ないし35号から得られる。成分Ｃの精製
を、シリカゲルクロマトグラフイー及びクロロホ
ルム−メタノールからの結晶化によつて実施す
る。成分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦについて収量
は、それぞれ、988mg、420mg、848mg、130mg、
119mg、並びに114mgである。 例 ４ 例３の成分BBM−928Aのより以上の精製 例３のBBM−928A成分の薄層クロマトグラフ
イー定量（トルエン中10％メタノールよりなる系
を用いる）は、試料がBBM−928A成分のすぐ上
に行く外の材料を含有するという点で完全には均
質でないことを示した。精製を行なうために次の
工程を実施した。 (1) 試料を、クロロホルムないし６％メタノール
−クロロホルムの線状勾配を使用してシリカゲ
ル上クロマトグラフ処理する。2.4及び3.3％メ
タノール−クロロホルムの間に溶離するフラク
シヨン（BBM−928A成分プラス若干の汚染物
を含有する）を次の工程のために合わせる。 (2) 最初の２個中２％メタノール−トルエンそし
て第３のものの中に６％メタノール−トルエン
を含有する３個の容器を残用して凹形勾配を発
生させる。この勾配上クロマトグラフ（シリカ
ゲルカラム）処理した工程１からの複合物は、
１副成分、すぐ続いて精製されたBBM−928A
成分（ここでBBM−928Apという）を生じる。 BBM−928Apの分子量は、場脱着質量分析
（Field Desorption Mass Spectrometry）によ
つて決定して、1427であり、実験式
C64H78N14O24（分子量1427.417）に相当する。 元素分析（100℃で18時間乾燥した成分） C64H78N14O24として 計算値 ：C53.85；H5.51；N13.74； O26.90 実験値b：C52.47；H5.48；N13.81； O28.24a ａ 差による。 ｂ ３回の測定の平均。
【特許請求の範囲】
１ 式 （式中、破線は単一または二重結合を示す。

Claims (1)

  1. 【表】
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