JPH0341475B2

JPH0341475B2 -

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Publication number: JPH0341475B2
Application number: JP62253588A
Authority: JP
Priority date: 1979-04-02
Filing date: 1987-10-09
Publication date: 1991-06-24
Also published as: ES8104411A1; JPS63139191A; YU41700B; SU999981A3; FI67403B; AR223372A1; DE3012565A1; JPS63139192A; ZA801856B; AU5700280A; NL8001868A; JPH0341157B2; IE800598L; HU184256B; NO155780B; AT371144B; AU533672B2; IL59746A0; DK138780A; JPS55162752A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新しい抗腫瘍抗生物質に関する。本発明の抗生物質は深部通気条件を用いる水性
栄養培地中で放線菌のBBM−928生産菌株
（ATCC31491）又はその変異株を培養することに
よつて製造されるBBM−928と称される新しい
抗生物質コンプレツクス中の１成分であり、この
コンプレツクスは、少なくとも６種の成分を含有
する。それは生理活性成分Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ及
びＦと称し、本発明はその１つであるＤ即ち
BBM−928Bを対称とする。第１図は、臭化カリウム中BBM−928Dの赤外
吸収スペクトルである。第２図は、90MHzの波数におけるNMRスペク
トロメーターによる内部標準としてTMSを使用
する重水素化クロロホルムに溶解したBBM−
928Dのプロトン磁気共鳴スペクトルを示す。 BBM−928コンプレツクスはアクチノロイキ
ン群の抗生物質に構造が関連していると信じら
れ、まだ同定されていない放線菌の菌株の醗酵に
よつて生成する。培地中BBM−928を生成する
ことができる放線菌の菌株はいずれも、ブリスト
ル−バンユウコレクシヨン中放線菌菌株G455−
101号と称される好適な生産菌と共に使用するこ
とができる。この菌は、フイリンピン群島で集め
られた土壌試料から分離され、ATCC31491とし
て米国の微生物代表培養コレクシヨンに寄託され
ている。又この微生物は、昭和55年３月25日に工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託された（微
工研菌寄第5460号）この微生物の名称はアクチノマジユラ・ルゾネ
ンシス（Actinomadura Luzonensis）である。前記したとおり新規抗腫瘍抗生物質コンプレツ
クスは、、BBM−928A，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ及びＦ
と称される少なくとも６種の成分を有する。
BBM−928コンプレツクスの生成Ａ，Ｂ，Ｃ及
びＤは、結晶性形態で単離され、成分Ａ，Ｂ及び
Ｃの化学構造が同定されている。本発明の抗生物
質Ｄは他の成分同様抗腫瘍抗菌性を有している。
これは動物飼料中栄養補給剤として又哺乳類の細
菌感染を処置する際治療剤として有用である。そ
の外、この抗生物質は、実験室ガラス器具及び外
科用機器を清浄にし滅菌するのに有用であり、石
けん、洗剤及び消毒用洗液と組合せて使用するこ
とができる。抗腫瘍効果については、コンプレツ
クス及びその個々の成分は、種々の腹腔内移植マ
ウス腫瘍に対して特に有用である。放線菌種G455−101号菌株以下は、抗生物質抗腫瘍コンプレツクスBBM
−928を生産する好適な微生物の一般的記述であ
る。標準分類学的方法、例えばシヤーリング等、
Inst J.Syst.Bactariol.16 313（1966）及びルシユ
バリエ等、Biol.Actinomycetes Related.Org.11、
78（1976）に従つてこの菌の培養、生理学及び形
態学的特徴を観察した。ミクロ形態学−G455−101号菌株は、基質及び
気中菌糸を共に形成し、基質菌糸は、よく発達
し、長くかつ枝分れしている（幅0.5〜0.8μ）。こ
の基質菌糸の明瞭な分裂は見られない。ストレプ
トミセス属の通常の種と異なり、G455−101菌株
は、短かくかつ未発達の気中菌糸のみを有する
か、或いは寒天培地によつては何も形成しない。
短かいか又は長い胞子鎖が気中菌糸中に生じ、そ
れは鎖の中に２〜50の卵形胞子を有する（大部分
５〜20の胞子）。胞子鎖は、形が直線か、屈曲が
多いか又は輪になつている。胞子は、形が円形
（0.3〜0.4μ）、卵形又は円筒形（0.3×1.5〜3.0μ）
であり、滑らかな表面を有している。胞子は、空
の菌糸で分離されていることが多い。短かいコイ
ル状の胞子鎖を包む無定形の胞子のう様の包のう
が気中菌糸上にときに観察される。細胞壁組成及び全細胞糖成分−G455−101菌株
の細胞壁は、メソ−ジアミノピメリン酸を含有す
るが、グリシンを欠いている。全細胞水解物は、
グルコース、マンノース及びマズロース（３−Ｏ
−メチル−Ｄ−ガラクトース）の存在を示す。前
述した細胞壁組成及び全細胞糖成分は、G455−
101菌株が細胞壁Ｂ型の放線菌１菌株であるこ
とを示す。培養及び生理学的特性−G455−101菌株は、豊
富に生育し、紅色又は灰紅色の気中菌糸を形成
し、イースト抽出液−モルト抽出液寒天及びオー
トミル寒天のような栄養に富む寒天培地中で赤味
のある水不溶性の色素を生じる。然し、無機塩−
デンプン寒天、グリセロール−アスパラギン寒天
及びチロシン寒天中では、貧弱な生育を行ない、
白色又はベージユ色の未発達の気中菌糸を形成
し、少量の赤味のある色素を生じる。ペプトン−
イースト−鉄寒天及びチロシン寒天中で黒ずんだ
色素を生じない。硝酸塩は亜硝酸塩に還元され
る。28℃、37℃、並びに45℃において豊富に生育
するが、10℃又は50℃においては生育しない。五
炭糖及び六炭糖は、この菌株によつてよく利用さ
れる。G455−101菌株の培養及び生理学的特性
を、それぞれ表１及び２に示す。炭素源の利用を
表３に示す。

【表】

【表】 ℃において貧
弱な生育。10
℃及び50℃に
おいて生育な
し。

【表】

【表】 BBM−928コンプレツクスの生産は、上の生
育及び顕微鏡特定によつて説明された特定の放線
菌種G455−101号菌株に限定されないことが理解
される。これらの特性は、例示の目的のみで示さ
れ、本発明は、Ｘ線放射、紫外線放射、ナイトロ
ジエン・マスタード、フアージ露出等のような当
該技術に既知の常用の手段によつて前述した菌か
ら得られる菌株又は変異株の使用を意図してお
り、これらは、BBM−928コンプレツクス又は
その個々の成分を生産することができる。抗腫瘍抗生物質BBM−928コンプレツクスの製
造本発明の抗腫瘍抗生物質BBM−928コンプレ
ツクスの製法は、放線菌G455−101号菌株を、同
化性炭素源及び同化性窒素源を含有する水溶液中
深部通気条件下に、該溶液に実質的な抗腫瘍抗生
物質活性が付与されるまで醗酵培養することを特
徴とする。本発明の抗生物質抗腫瘍剤の生産のた
め有用である培地は、デンプン、グルコース、デ
キストラン、マルトース、ラクトース、シユクロ
ース、フラクトース、マンノース、糖蜜、グリセ
ロール等のような同化性炭素源を含む。この栄養
培地は又、タンパク、、タンパク水解物、ポリペ
プチド、アミノ酸、コーン・ステイープ・リカ
ー、カゼイン、尿素等のような同化性窒素源並び
にカリウム、ナトリウム、アンモニウム、カルシ
ウム、硫酸塩、炭酸塩、燐酸塩、塩化物、硝酸塩
等のような陰イオン及び陽イオンを生じる栄養無
機塩を含有するべきである。 BBM−928コンプレツクスを生産する際、菌
の満足すべき生育を得ることができる任意の温度
を用いてよい。20゜〜45℃の範囲の温度が実施可
能であり、菌の至適の生育に好適な温度は28゜〜
34℃の範囲であり、30〜32゜の範囲の温度が最も
好適である。BBM−928コンプレツクスの最高
の生産は、一般に約４〜６日で得られる。醗酵期
おいては常法が用いられる。例えば、少量の製法
は、振とうフラスコ中か又は表面培養によつて実
施するのが便利である。大量の製造は、無菌タン
ク中深部通気培養条件下に実施するのが好適であ
る。タンク培養の場合にはまず菌からの胞子をブ
イヨン培養に接種することによつて栄養ブイヨン
中栄養接種物を生産して若い活性のある種培養物
を得、次にこれを醗酵タンク培地に無菌的に移
す。タンク及びビン中の通気は、無菌空気を醗酵
培地又はその供給施設に強制的に送り、機械推進
体によつてタンク中更に撹拌を生じることによつ
て得ることができる。シリコン油、大豆油及びラ
ード油のような消泡剤を必要に応じて添加してよ
い。醗酵ブロス又はBBM−928コンプレツクスの
抽出液中の抗生物質レベルは、試験菌としてサル
シナ・ルテア（Sarcina lutea）を使用しそして
定量培地として栄養寒天を用いるペーパー・デイ
スク寒天−拡散定量によつて決定することができ
る。至適ブロス力価を決定するために使用される
この定量系の最も望ましい感受性のためにPHを
9.0に調節する。 BBM−928コンプレツクスは、溶媒抽出操作
のような常用の手段によつて醗酵ブロスから単離
される。精製は、下の例２及び３に更に詳細に設
明するとおり細胞用向流分配及びクロマトグラフ
イー操作によつて実施してBBM−928成分Ａ，
Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ及びＦを得るのが便利である。例３のBBM−928成分Ａ，Ｂ，Ｃ、並びにＤ
の物理化学的性質 BBM−928の個々の成分は、たがいに似た溶
解性及び発色反応を示す。例えば、それらはクロ
ロホルム及び塩化メチレンに易溶性、ベンゼン、
エタノール、メタノール及びｎ−ブタノールにわ
ずかに可溶性そして水及びｎ−ヘキサンに不溶性
である。塩化第二鉄及びエールリヒ試薬により陽
性反応が得られ、トレンス、サカグチ及びニンヒ
ドリンに対しては陰性反応である。例３のBBM−928成分の特徴のある物理化学
的性質を表４に示す。

【表】本発明の抗生物質Ｄの特性をまとめると次のと
おりである。 (a) クロロホルム及び塩化メチレンに可溶性、ベ
ンゼン、エタノール、メタノール及びｎ−ブタ
ノールにわずかに可溶性、そして水及びｎ−ヘ
キサンに実質的に不溶性であり； (b) 塩化第二鉄及びエールリヒ試薬反応陽性そし
てトレンス、サカグチ及びニンヒドリン試薬陰
性であり； (c) マウス腹腔内移植P388白血病に有効な抗腫
瘍剤であり、 (d) 融点224〜227℃を有し； (e) 比旋光度〔α〕²⁵ _D＝−13゜（C1，CHCl₃）を有
し； (f) 炭素50.75％、水素5.25％、窒素12.58％、並
びに酸素31.42％の概算元素組成を有し； (g) シリカゲル薄層クロマトグラフイーにおいて
Rf値0.73〔溶媒系ｎ−ブタノール−メタノール
−水（63：27：10）〕、並びにRf値0.53〔溶媒系
キシレン−メチルエチルケトン−メタノール
（５：５：１）〕を示し； (h) 実質的に第１図に示すとおりの臭化カリウム
中赤外スペクトルを有し；そして (i)重水素化クロロホルムに溶解する時実質的に第
２図に示すとおりのプロトンNMRスペクトル
を得る。抗微生物活性 BBM−928成分の抗微生物活性を、ステイー
ヤのマルチ接種装置を使用しPH７において栄養寒
天中順次寒天稀釈法によつて種々の細菌及びカビ
に対して決定した。接種材料のサイズは、約10⁴
細胞／mlを含有する試験菌の分別材料0.0025mlを
すべての細菌及びカビ−抗酸菌を除、これに対し
ては10⁶細胞／mlの懸濁液を使用した−に対して
用いるように標準化した。37℃において一夜温置
して後、最小阻止濃度（MIC）を表５に示す。
表中見られるように、BBM−928成分は、グラ
ム陽性及び抗酸菌に対し中程度ないし弱い活性が
あるが、グラム陰性菌及びカビに対して実際上活
性がない。溶原菌（ILB）中プロフアージ誘発の活性を
BBM−928成分について決定した。

【表】抗腫瘍活性抗腫瘍活性についてマイトマイシンＣとの
BBM−928Dの比較試験を、腹腔内移植腫瘍：
P388白血病、L1210白血病、B16黒色腫、ルイス
肺（LL）カルシノーマ、並びにザルコーマ180腹
水（S180）を用いて実施した。10％ジメチルス
ルホキシドを含有する0.9％食塩水中BBM−928
成分及び0.9％食塩水中マイトマイシンＣを、１
回の１日処置から多回連日処置までの範囲の投薬
スケジユールに従つて１日１回投与した。投薬量
を変えることにより、処置動物に対して対照動物
より少なくとも1.25倍の中央生存時間値を与える
最小有効用量（MED）を決定した。この活性の
水準は、有意な抗腫瘍活性の尺度であると考られ
ている。結果は、計算活性比と共に表６に示す。
ヴアン・デル・ヴエルデン、Arch.Expt.Path.
Pharmak.，195、389（1940）の方法によつて決
定したBBM−928及びマイトマイシンＣの腹腔
内LD₅₀値も表６に示す。

【表】例１ BBM−928コンプレツクスの生産寒天醗酵−放線菌種G455−101の１菌株のよく
生育した寒天斜面を使用して２％可溶性デンプ
ン、１％グルコース、0.5％フアーマメデイア、
0.5％イースト抽出液、0.5％NZ−アミン（Ａ型）
及び0.1％CaCO₃を含有する栄養培地に接種し、
滅菌の前にPHを7.2に調節する。この種培養をロ
ータリー振とう器（250rpm）上32℃に72時間温
置し、生育物５mlを、２％可溶性デンプン、１％
フアーマメデイア、0.003％ZnSO₄・7H₂O及び0.4
％CaCO₃よりなる醗酵培地100mlを含有する500
mlの三角フラスコに移す。BBM−928コンプレ
ツクスの生産は、一般に５日の振とう培養の後最
高に達する。タンク醗酵−種培養を三角フラスコ中４日間振
とうし、200リツトルの種タンク醗酵器中2.0％オ
ートミール（クエーカー・プロダクツ、オースト
ラリア）、0.5％グルコース、0.2％乾燥イースト、
0.0008％MnCl₂・4H₂O、0.0007％CnSO₄・7H₂O、
0.0002％ZnSO₄・7H₂O及び0.0001％FeSO₄・
7H₂Oよりなる発芽培地100リツトルに接種し、
これを200rpm、30℃において54時間撹拌する。
次にこの種培養の15リツトル分を、400リツトル
のタンク醗酵器中2.0％可溶性デンプン、1.0％フ
アーマメデイア、0.003％ZnSO₄・7H₂O及び0.4％
CaCO₃を含有する醗酵培地170リツトルに接種
し、これを30℃、200rpm、通気速度150リツト
ル／分で操作する。醗酵の進行と共にブロスのPH
は次第に増大し、100〜120時間後8.4〜8.5に達
し、この時30mcg／mlのピーク抗生物質力価が得
られる。例２溶媒抽出によるBBN−928コンプレツクスの単離例１から得られたブロス（170リツトル、PH
8.5）を清澄剤と共に過する。活性は、菌体ケ
ーキ及び液に共に見出される。菌体ケーキをア
セトンとメタノールとの溶媒混合物（１：１、30
リツトル×２）で２回抽出する。抽出液を合し、
減圧下蒸発させて水性濃縮物を得、これをｎ−ブ
タノールで抽出する。ブロス液をｎ−ブタノー
ルで２回抽出する（40リツトル×２）。ｎ−ブタ
ノール抽出液を合し、減圧下に濃縮し、残留物を
凍結乾燥して粗製の固体（21.4ｇ）を得る。薄層
クロマトグラフイー定量によれば、このものは３
種の主成分、Ａ，Ｂ及びＣ、並びに３種の副成
分、Ｄ，Ｅ及びＦよりなるコンプレツクスであ
り、下の表７に述べるとおりのRf値を有する。

【表】例３ BBM−928コンプレツクスの精製例２の粗コンプレツクス四塩化炭素−クロロホ
ルム−メタノール−水（５：２：５：１）の溶媒
系を使用する製造用向流分配装置（ミタムラ、
100ml／管）によつて精製する。50回の転溶の後、
管５号ないし20号を合し、濃縮して成分Ａ，Ｂ，
Ｄ，Ｅ及びＦを含有する淡黄色粉末（4.4ｇ）を
得る。この混合物を少量のクロロホルムに溶解
し、予め酢酸エチルで処理したシリカゲルＣ−
200（500ml）のカラム上に入れる。増加量のメタ
ノール（２〜５％、Ｖ／Ｖ）を有する酢酸エチル
でカラムを展開し、345nmにおける光学密度によ
つてフラクシヨンをモニターする。副成分Ｄが最
初に、次いで成分Ａが酢酸エチルによつて溶解さ
れる。成分Ｅ、Ｂ及びＦは、次に３％のメタノー
ル濃度においてその順に溶離される。適当な成分
を含有する各フラクシヨンを減圧下蒸発させ、残
留物をクロロホルム−メタノールから結晶化させ
る。同様に、成分Ｃの粗製物が上述した向流成分
配の管21号ないし35号から得られる。成分Ｃの精
製を、シリカゲルクロマトグラフイー及びクロロ
ホルム−メタノールからの結晶化によつて実施す
る。成分Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ及びＦについて収量
は、それぞれ、988mg、420mg、848mg、130mg、
119mg、並びに114mgである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、臭化カリウム中BBM−928Dの赤外
吸収スペクトルである。第１図において、縦軸は
透過パーセントであり、横軸上部は波長（ミクロ
ン）、横軸下部は波数（cm¹）である。第２図は、
同じ条件下のBBM−928Dのプロトン磁気共鳴ス
ペクトルを示す。第２図において、横軸はPPM
である。

Claims

【特許請求の範囲】１次の特性を有する抗腫瘍抗生物質BBM−
928D： (a) クロロホルム及び塩化メチレンに可溶性、ベ
ンゼン、エタノール、メタノール及びｎ−ブタ
ノールにわずかに可溶性、そして水及びｎ−ヘ
キサンに実質的に不溶性であり； (b) 塩化第二鉄及びエールリヒ試薬反応陽性そし
てトレンス、サカグチ及びニンヒドリン試薬陰
性であり； (c) マウス腹腔内移植P388白血病に有効な抗腫
瘍剤であり、 (d) 融点224〜227℃を有し； (e) 比旋光度〔α〕²⁵ _D＝−13゜（C1，CHCl₃）を有
し； (f) 炭素50.75％、水素5.25％、窒素12.58％、並
びに酸素31.42％の概算元素組成を有し； (g) シリカゲル薄層クロマトグラフイーにおいて
Rf値0.73〔溶媒系ｎ−ブタノール−メタノール
−水（63：27：10）〕、並びにRf値0.53〔溶媒系
キシレン−メチルエチルケトン−メタノール
（５：５：１）〕を示し； (h) 実質的に第１図に示すとおりの臭化カリウム
中赤外スペクトルを有し；そして (i)重水素化クロロホルムに溶解する時実質的に第
２図に示すとおりのプロトンNMRスペクトル
を得る。