JP7436367B2 - 活性ｃｄ４４分子を標的とするためのリポソームナノ担体送達系、その調製方法、及びその使用 - Google Patents

活性ｃｄ４４分子を標的とするためのリポソームナノ担体送達系、その調製方法、及びその使用 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月２２日に出願された中国特許出願第２０１８１００６０２６５．９号の利益を主張するものである。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、標的薬物送達の技術分野に属し、特に、活性化ＣＤ４４分子を標的とするための、特に不安定プラークを標的とするためのナノ担体に関し、特にそれはリポソームナノ担体送達系である。本発明は、特に不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患の診断、予防、及び治療における、ナノ担体、特にリポソーム送達系の調製方法及び使用にさらに関する。
現在、主に急性心筋梗塞及び心臓突然死を含む急性心血管イベントは、ヒトの健康に対する脅威の第１位になっている。統計によると、毎年世界中で約２０００万人が急性心血管イベントで死亡する。中国における状況も楽観的ではない。毎年７００，０００人を超える人々が急性心筋梗塞及び心臓突然死で死亡し、それは、中国人民の健康を深刻に脅かす最も顕著な疾患の１つになっている。研究により、急性心筋梗塞及び心臓突然死のほとんどが、アテローム性動脈硬化プラークにより引き起こされることが示されている。１９７０年代以来、慢性アテローム性動脈硬化プラークが急性冠症候群（ＡＣＳ，acute coronary syndrome）及び脳卒中に結び付く過程及び機序が絶えず探求されている。
１９８９年に、Muller及び同僚（Circadian Variation and Triggers of Onset of Acute Cardiovascular Disease. Circulation. 1989; 79(4): 733-43）は、「不安定プラーク」の概念を提案し、そのようなプラークが急性心血管及び脳血管イベントのほとんどの根本的原因であると推定した。不安定（vulnerable）プラーク（「不安定（unstable）プラーク」としても知られている）は、血栓を形成する傾向があるか、又は易破裂性プラーク、易びらん化(erosion-prone)プラーク、及び部分的石灰化結節性病変を含む「クリミナルプラーク（criminal plaque）」へと急速に進行する可能性が高いアテローム性動脈硬化プラークを指す。数多くの研究により、急性心筋梗塞及び脳卒中のほとんどが、軽度から中程度の狭窄を有する不安定プラークの破裂、それに続く血栓症により引き起こされることが示されている。Naghavi及び同僚ら（New Developments in the Detection of Vulnerable plaque. Curr Atheroscler Rep. 2001; 3(2): 125-35）は、不安定プラークの組織学的定義及び診断基準を提供した。主な診断基準としては、活動性炎症、薄い線維性被膜及び大きな脂質コア、表面の血小板凝集を有する内皮剥脱、プラーク亀裂又は病変、並びに重度の狭窄が挙げられる。二次的な診断基準としては、表面の石灰化プラーク、黄色で光沢のあるプラーク、プラーク内出血、及びポジティブリモデリングが挙げられる。したがって、不安定プラークには、早期介入が重要である。しかしながら、不安定プラークにより引き起こされる血管狭窄の度合いは、通常それほど高くなく、多数の患者は前駆症状を示さないため、臨床において不安定プラークを早期診断することは、非常に困難であり、不安定プラークを非常に危険なものにしている。したがって、急性心筋梗塞の予防及び治療において解決されるべき緊急の課題は、有効な介入を行なうことができるように、できるだけ早期に不安定プラークを正確に特定及び診断するための方法である。
現在、不安定プラークを診断するための一般的に用いられている技法としては、主に、冠動脈造影法、血管内超音波法（ＩＶＵＳ，intravascular ultrasound）、光干渉断層法（ＯＣＴ，optical coherence tomography）などが挙げられるが、これらの技法は全て、侵襲性検査であり、診断分解能及び正確性が低く、費用が高いため、これらの技法の臨床使用にはある程度の制限がある。したがって、現在、不安定プラークを非侵襲的に診断するための技法及び調製物には緊急の必要性がある。
加えて、不安定プラークを治療するための現行の方法は、スタチン（ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ，hydroxymethyl glutaryl coenzyme A）リダクターゼ阻害剤）、アスピリン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ，matrix metalloproteinase）阻害剤、及び／又はフィブレートなどの経口投与などの、主に全身性投与によるものである。これらの薬物は、全身性血中脂質量を調節すること、炎症と戦うこと、プロテアーゼを阻害すること、及び血小板産生などにより、プラーク中の脂質を低減させ、血管リモデリングを向上させることなどにより、プラークを安定させるように作用する。しかしながら、臨床応用では、不安定プラークを治療するための現行の薬物の治療効果は満足のいくものではないことが判明している。例えば、臨床業務で一般的に使用されるスタチンは、経口投与される場合、シンバスタチンでは５％未満、アトルバスタチンでは約１２％、及びロスバスタチンでは約２０％など、比較的低い生物学的利用能を示す。また、動物実験により、スタチンの用量を１ｍｇ／ｋｇよりも高い用量に増加させる場合にしか、線維性被膜の厚さを増加させ、プラークの容積を低減させることができず、それによりスタチンの経口投与の安定性及びプラークを縮小させるそれらの効果がボトルネックに遭遇することが確認されている。また、現在では、臨床治験により、スタチンの経口投与による不安定プラークの治療は、不安定プラークを安定させるために非常に大きな用量を必要とし、スタチンの全身性大用量による治療は、重度の副作用（肝機能異常、横紋筋融解、ＩＩ型糖尿病など）の発生率増加のリスクを示すことも確認されている。
既存の全身性投与の場合、通常は、薬物が体内に侵入した後、非常に低い割合の活性成分しか実際には病変部位に作用することができない。これは、薬物の有効性を制限し、毒性副作用を生じさせる根本的原因である。標的薬物送達系は、標的薬物送達の能力を有する薬物送達系を指す。ある経路経由で投与された後、標的薬物送達系に含まれる薬物は、標的指向性プローブを有する担体により標的部位に特異的に濃縮される。標的薬物送達系は、薬物が特定の病変部位を標的とし、活性成分を標的病変部位に放出することを可能にする。したがって、標的薬物送達系は、標的病変部位における薬物の比較的高い濃度、及び血液循環中の薬物の用量低減をもたらし、それにより毒性副作用を抑制し、正常組織及び細胞に対する損傷を低減させつつ、薬物効果を向上させることができる。
不安定プラークの診断及び治療の分野では、ナノ担体を標的指向性リガンドで修飾することによる、不安定プラークを診断するための技法も幾つか存在する。しかしながら、臨床業務における、不安定プラークを標的とするそのような標的指向性プローブの大きな問題は、これら調製物の標的部位に対する特異性が不十分であることである。例えば、そのような調製物のほとんどでは、標的部位としてマクロファージが選択される。しかしながら、マクロファージは体内全体にわたって存在するため、プローブの標的指向特異性は満足のいくものではない。したがって、不安定プラークを標的とする標的指向性調製物を開発する際の難しさは、不安定プラーク内の細胞において、有意な標的化特異性を有する標的部位を発見することにある。
ＣＤ４４は、リンパ球、単球、内皮細胞などの表面上に広く分布する一種の接着性分子である。ＣＤ４４分子の主なリガンドは、ヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）である。ＣＤ４４を発現する細胞の活性化状態に基づくと、ＣＤ４４は、比較的静的な状態（ＨＡと結合することができない）、誘導された活性化状態（活性化後にＨＡと結合することができる）、及び構造的に活性な状態（活性化無しでＨＡと結合することができる）で存在することができ、ほとんどの正常細胞の表面上のＣＤ４４は、比較的静的な状態にあり、ＨＡと結合することができない。
幾つかの以前の研究は、ＣＤ４４が、有意な標的化特異性を有する理想的な標的部位ではないことを示している。これは、ＣＤ４４が、ヒト体内に、特に細網内皮系が豊富な臓器の表面に広く分布しているからである。したがって、ＣＤ４４を標的部位として使用する標的薬物送達系を開発する際には以下の問題に遭遇することになる：標的細胞の表面上のＣＤ４４が、ＨＡに対する親和性が有意な特異性を提供するには不十分である場合、そのような標的薬物送達系は、特異的標的指向特性を示さないだろう。
したがって、不安定プラークに存在する特異的な標的部位及び不安定プラークを標的とするのに適切な標的薬物送達系を見出し、それにより不安定プラークを特異的に標的とし、薬物の安定的及び持続的放出を達成することが可能な標的薬物送達系を開発することは、医療分野で解決されるべき緊急の技術的課題になっている。
現在まで、主に不安定プラーク内に存在するマクロファージ、単球、内皮細胞、リンパ球、及び平滑筋細胞の表面上のＣＤ４４の発現状態、又はＨＡに対するそれらの親和性に関する報告は存在せず、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を診断又は治療するための、ＨＡとＣＤ４４との間の相互作用及び不安定プラークの特異的微小環境をいずれも利用することによる薬物の安定的及び持続的放出を達成する標的薬物送達系の設計に関する従来技術は一切存在しない。
Muller et al, Circadian Variation and Triggers of Onset of Acute Cardiovascular Disease. Circulation. 1989; 79(4): 733-43 Naghavi et al, New Developments in the Detection of Vulnerable plaque. Curr Atheroscler Rep. 2001; 3(2): 125-35
（１）本発明の概略
本発明者らは、正常細胞と比較して、不安定プラークの、内皮細胞、マクロファージ、及び平滑筋細胞などの細胞の表面上のＣＤ４４は、不安定プラークの特異的微小環境（炎症性因子など）により活性化され、したがってＨＡに対するそれらの結合能力が何十倍も急増することを見出した。この知見は、不安定プラークの細胞の表面上に存在する多数の活性化ＣＤ４４分子が、ＨＡを標的指向性リガンドとして用いる標的薬物送達系の理想的な標的部位を提供することを示唆する。この目的のため、本発明は、活性化ＣＤ４４分子を特異的に標的とするための、特に不安定プラークを標的とするための標的薬物送達系を提供する。
また、本発明者らは、ＣＤ４４活性化因子をロードすることにより、病変細胞の表面上のＣＤ４４のさらなる活性化を促進することができ、ＨＡに対するＣＤ４４の標的化親和性を短時間に増幅させることができ、それにより細胞表面に結合する標的指向性組成物の濃度が有意に増加し、不安定プラークのトレーサー診断及び治療のための積極的な重要性が示されることを発見した。この目的のため、本発明の標的薬物送達系には、ＣＤ４４活性化因子が同時にロードされていてもよく、それによりトレーサー又は治療剤化合物の濃度を短期間で有意に増加させて、診断感度又は治療効果を向上させることができる。
また、本発明者らは、不安定プラークでは、ＣＤ４４の高レベルの活性化及び過剰発現と共に、内在性巨大分子ＨＡが刺激により大量に生成され、それが細胞表面上のＣＤ４４に結合して、不安定プラークのマクロファージ及びリンパ球などの細胞の凝集を促進することを見出した。そのような内在性ＨＡは、細胞表面上のＣＤ４４に結合し、薬物侵入に対する障壁を形成し、薬物の生物学的利用能を低減する場合がある。この目的のため、本発明の標的薬物送達系には、不安定プラークの細胞表面上のＣＤ４４分子と特異的に結合することが可能な低分子ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体がロードされていてもよい。それにより、細胞表面上の内在性ＨＡにより形成される障壁が、細胞表面に対する内在性ＨＡの結合と競合することにより排除され、病変細胞での細胞内薬物放出に成功することが容易になり、有意な治療効果が提供される。
要約すると、本発明は、以下の態様に関する。
本発明は、活性化ＣＤ４４分子を標的とするためのリポソームナノ担体送達系を提供する。
本発明は、不安定プラークを標的とするためのリポソームナノ担体送達系を提供する。
本発明は、不安定プラークを標的とするための本発明のリポソームナノ担体送達系を調製するための方法を提供する。
本発明は、不安定プラーク及び薬学的に許容される担体を標的とするための本発明のナノ担体送達系を含む医薬をさらに提供する。
本発明は、不安定プラークを標的とするための本発明のナノ担体送達系を含む診断用調製物をさらに提供する。
本発明は、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための医薬の調製における、不安定プラークを標的とするための本発明のナノ担体送達系の使用をさらに提供する。
本発明は、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を診断するための診断用調製物の調製における、不安定プラークを標的とするための本発明のナノ担体送達系の使用をさらに提供する。
本発明は、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための方法であって、不安定プラークを標的とするための本発明のナノ担体送達系を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
本発明は、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を診断するための方法であって、不安定プラークを標的とするための本発明のナノ担体送達系を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
本発明の技術的解決策及びそれらの意味の具体的な実施形態が、下記で詳細に説明されるだろう。
（２）技術用語及びそれらの意味
本明細書で言及されている用語は、以下の意味を有する。
「不安定（vulnerable）プラーク」（「不安定（unstable）プラーク」としても知られている）は、血栓を形成する傾向があるか、又は易破裂性プラーク、易びらん化プラーク、及び部分的石灰化結節性病変を含む「クリミナルプラーク」へと急速に進行する可能性が高いアテローム性動脈硬化プラークを指す。数多くの研究により、急性心筋梗塞及び脳卒中のほとんどが、軽度から中程度の狭窄を有する不安定プラークの破裂、それに続く血栓症により引き起こされることが示されている。不安定プラークの組織学的徴候としては、活動性炎症、薄い線維性被膜及び大きな脂質コア、表面の血小板凝集を有する内皮剥脱、プラーク亀裂又は病変、及び重度の狭窄、並びに表面の石灰化プラーク、黄色で光沢のあるプラーク、プラーク内出血、及びポジティブリモデリングが挙げられる。
「不安定プラークに関連する疾患」は、主に、「不安定プラーク」に関連するか、「不安定プラーク」により特徴付けられるか、「不安定プラーク」により引き起こされるか、又は疾患の発症及び発生中に「不安定プラーク」に対して二次的である疾患を指す。「不安定プラークに関連する疾患」は、主に、アテローム性動脈硬化症、冠動脈アテローム性動脈硬化性心疾患（急性冠症候群、無症候性心筋虚血－潜在性冠動脈心疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血性心疾患、突然死、及びステント内再狭窄）、脳動脈硬化症（脳卒中を含む）、末梢血管アテローム性動脈硬化症（末梢動脈閉塞性疾患、網膜の動脈硬化症、頸動脈アテローム性動脈硬化症、腎臓アテローム性動脈硬化症、下肢アテローム性動脈硬化症、上肢アテローム性動脈硬化症、及びアテローム性動脈硬化インポテンス）、大動脈解離、血管腫、血栓塞栓症、心不全、心原性ショックなどを含む。
「標的薬物送達系」は、標的薬物送達の能力を有する薬物送達系を指す。ある経路経由で投与された後、標的薬物送達系に含まれる薬物は、特殊な担体又は標的指向性弾頭（targeting warhead）（例えば、標的指向性リガンド［targeting ligand］）の作用により標的部位に特異的に濃縮される。標的薬物送達を達成するための現行の公知手段としては、種々のマイクロ粒子送達系の受動的標的指向特性を利用すること、マイクロ粒子送達系の表面に化学的修飾を導入すること、幾つかの特殊な物理的及び化学的特性を利用すること、抗体媒介性標的薬物送達を利用すること、リガンド媒介性標的薬物送達を利用すること、プロドラッグ標的薬物送達を利用することなどが挙げられる。中でも、リガンド媒介性標的薬物送達では、薬物担体がリガンドと組み合わされており、ある臓器及び組織の特定の受容体が、その特異的リガンドと特異的に結合し、それにより薬物を特定の標的組織へと向かわせるという特徴が利用される。
「リポソーム担体」は、薬物を脂質二重層に封入して、マイクロベシクルを形成する脂質様二重層薬物担体である。また、それは、一般に長鎖リン脂質及び短鎖リン脂質又は界面活性剤の自己集合により形成されるディスク型ベシクルである脂質バイセル構造であってもよい。長鎖リン脂質は、ディスクの平面を形成し、短鎖リン脂質は、ディスクの側縁端を取り囲む。１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－コリン（ＤＭＰＣ，1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-choline）が、長鎖リン脂質成分として使用されることが多く、バイセルの表面電荷は変化させることができ、その汎用性は、同じ鎖長を有するが、異なる頭部基を有する他のリン脂質成分をドープすることにより実現することができる。また、短鎖リン脂質は、高屈曲領域を形成し、凝集体の縁端エネルギーを低減して、バイセルを安定させる。
「ヒアルロン酸」（「ＨＡ」と略される）は、巨大分子のポリマーであり（Ｃ１４Ｈ２１ＮＯ１１）ｎの式を有する。それは、Ｄ－グルクロン酸及びＮ－アセチルグルコサミン単位からなる高級多糖である。Ｄ－グルクロン酸及びＮ－アセチルグルコサミンは、β－１，３－グリコシド結合により連結され、二糖単位は、β－１，４－グリコシド結合により連結される。分子構造並びに物理的及び化学的性質が特有であるため、ヒアルロン酸は、生物において、関節の潤滑、血管壁透過性の調節、タンパク質、水、及び電解質の拡散及び輸送の調節、並びに創傷治癒の促進など、種々の重要な生理機能を示す。ヒアルロン酸が特別な保水効果を有し、天然に見出される最良の保湿特性を有する物質であることは特に重要である。
「ヒアルロン酸の誘導体」は、本明細書で使用される場合、不安定プラークの細胞の表面上のＣＤ４４分子と特異的に結合するヒアルロン酸の能力を維持することが可能なヒアルロン酸のあらゆる誘導体を指し、これらに限定されないが、ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩、低級アルキル（１～６つの炭素原子を含むアルキル）エステル、加水分解又は他の手段により体内でヒアルロン酸を形成することが可能なプロドラッグなどが挙げられる。物質が「ヒアルロン酸の誘導体」であるか否かの判定は、不安定プラークの細胞表面上のＣＤ４４分子と特異的に結合する物質の能力を測定することにより達成することができ、これは当業者の技術範囲内にある。
「ＣＤ４４分子」は、３つの区画、つまり細胞外区画、膜貫通区画、及び細胞内区画からなる、リンパ球、単球、及び内皮細胞などの細胞の細胞膜上に広く発現される一種の膜貫通プロテオグリカン接着分子である。ＣＤ４４分子は、細胞間及び細胞と細胞外マトリックスとの間の様々な相互作用を媒介し、体内での種々のシグナル伝達に関与し、したがって細胞の生物学的機能を変化させることができる。ＣＤ４４分子の主要なリガンドはヒアルロン酸であり、ＣＤ４４分子及びヒアルロン酸の受容体－リガンド結合は、細胞外マトリックスでの細胞の接着及び／又は遊走を決定する。加えて、ＣＤ４４分子は、ヒアルロン酸の代謝にも関与する。
「約」は、その後に示されている数値の±５％の範囲内にある一連の全ての値を表わす。
（３）発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、活性化ＣＤ４４分子を標的とするためのリポソームナノ担体送達系であって、ナノ担体の表面は、標的指向性リガンドにより部分的に修飾されており、標的指向性リガンドが、活性化ＣＤ４４分子と特異的に結合することが可能なリガンドである、リポソームナノ担体送達系を提供する。
本発明の第２の態様は、不安定プラークを標的とするためのリポソームナノ担体送達系であって、ナノ担体の表面は、標的指向性リガンドにより部分的に修飾されており、標的指向性リガンドが、不安定プラークの細胞表面上のＣＤ４４分子と特異的に結合することが可能なリガンドである、リポソームナノ担体送達系を提供する。より良好な結果を達成するために、ナノ担体の表面に他の修飾を施すことができる。担体の表面をＰＥＧで修飾すると、長期循環効果を達成し、薬物の半減期を延長することができる。担体の表面の、膜貫通ペプチド、自己ペプチドＳＥＰ、又は二重リガンドの同時修飾による修飾は全て、薬物効果の増幅に役割を果たすことができる。
第１又は第２の態様のナノ担体送達系によると、リポソーム担体は、バイセル、小型単層ベシクル、大型単層ベシクル、及び多層ベシクルから選択される。「リポソーム担体」は、薬物を脂質二重層又は親水性管腔に封入して、マイクロベシクル又はディスク型構造を形成する脂質二重層薬物担体である。
バイセルの構造は、一般に、長鎖リン脂質及び短鎖リン脂質又は界面活性剤の自己集合により形成されるディスク型ベシクルであってもよい。長鎖リン脂質は、ディスクの平面を形成し、短鎖リン脂質は、ディスクの側縁端を取り囲む。１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－コリン（ＤＭＰＣ）が、長鎖リン脂質成分として使用されることが多く、バイセルの表面電荷は変化させることができ、その汎用性は、同じ鎖長を有するが、異なる頭部基を有する他のリン脂質成分をドープすることにより実現することができる。また、短鎖リン脂質は、１，２－ジ－ｎ－ヘプタデカノイルホスファチジルコリンが選択されることが多く、高屈曲領域を形成し、凝集体の縁端エネルギーを低減して、バイセルを安定させる。
第１又は第２の態様のナノ担体送達系によると、標的指向性リガンドは、ＧＡＧ、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、セレクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ，osteopontin）、並びにモノクローナル抗体ＨＩ４４ａ、ＨＩ３１３、Ａ３Ｄ８、Ｈ９０、及びＩＭ７から選択されるか、又は不安定プラークの細胞表面上のＣＤ４４分子と特異的に結合することが可能なヒアルロン酸若しくはヒアルロン酸誘導体から選択される。
第１又は第２の態様のナノ担体送達系によると、ナノ担体には、ＣＤ４４分子活性化の存在に関連する疾患を診断、予防、及び／又は治療するための物質がロードされている。
第１又は第２の態様のリポソームナノ担体送達系によると、ナノ担体には、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を診断、予防、及び／又は治療するための物質がロードされている。
実施形態では、物質は、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を診断するための物質である。
実施形態では、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を診断するための物質は、トレーサーである。
実施形態では、トレーサーは、ＣＴトレーサー、ＭＲＩトレーサー、及び放射性同位体トレーサーから選択される。
実施形態では、ＣＴトレーサーは、ヨウ素に基づくナノスケール造影剤、金に基づくナノスケール造影剤、酸化タンタルに基づくナノスケール造影剤、ビスマスに基づくナノスケール造影剤、ランタニドに基づくナノスケール造影剤、若しくは類似の構造を有する他のトレーサーから選択され；より好ましくは、ＣＴトレーサーは、ヨウ素化造影剤、若しくはナノ金、若しくは類似の構造を有する他のトレーサーから選択され；さらに好ましくは、ＣＴトレーサーは、イオヘキソール、イオカルム酸、イオベルソール、イオジキサノール、イオプロミド、イオビトリドール、イオメプロール、イオパミドール、イオキシラン、アセトリゾ酸、イオジパミド、イオベンザム酸、イオグリカム酸、ジアトリゾ酸、イオタラム酸ナトリウム、パントパック、イオパノ酸、ヨードアルフィオン酸、アセトリゾ酸ナトリウム、ヨードメタム酸ナトリウム、プロピリオドン、ジオドン、イオトロラン、イオピドール、エンドグラフィン、イオタラム酸、ジアトリゾ酸メグルミンジ、メトリゾ酸、メトリザミド、ヨウ素化油、若しくはエチオジン化油（ethiodized oil）、若しくは類似の構造を有する他のトレーサーから選択され；好ましくは、ＣＴトレーサーはナノ金であり；並びに／又は
ＭＲＩトレーサーは、縦緩和造影剤及び横緩和造影剤から選択され；より好ましくは、ＭＲＩトレーサーは、常磁性造影剤、強磁性造影剤、及び超常磁性造影剤から選択され；さらに好ましくは、ＭＲＩトレーサーは、Ｇｄ－ＤＴＰＡ及び直鎖状、環状ポリアミンポリカルボキシレートキレート剤及びそのマンガンポルフィリンキレート剤、巨大分子ガドリニウムキレート剤、生体巨大分子修飾ガドリニウムキレート剤、葉酸修飾ガドリニウムキレート剤、デンドリマー造影剤、リポソーム修飾造影剤、並びにガドリニウム含有フラーレン、若しくは類似の構造を有する他のトレーサーから選択され；並びに好ましくは、ＭＲＩトレーサーは、ガドペンテト酸ジメグルミン、ガドテル酸メグルミン、ガドベン酸ジメグルミン、ガドジアミド、クエン酸鉄アンモニウム発泡性顆粒、常磁性酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ）、若しくは類似の構造を有する他のトレーサーから選択され；好ましくは、ＭＲＩトレーサーは、Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰであり；
放射性同位体トレーサーは、炭素１４（１４Ｃ）、炭素１３（１３Ｃ）、リン３２（３２Ｐ）、硫黄３５（３５Ｓ）、ヨウ素１３１（１３１Ｉ）、水素３（３Ｈ）、テクネチウム９９（９９Ｔｃ）、及びフッ素１８（１８Ｆ）により標識されたフルデオキシグルコースから選択され；好ましくは、放射性同位体トレーサーはフッ素１８標識フルデオキシグルコースである。
実施形態では、物質は、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を診断、予防、及び／又は治療するための薬物、ポリペプチド、核酸、及びサイトカインの１又は２以上である。
実施形態では、物質は、ＣＤ４４活性化因子である。
実施形態では、ＣＤ４４活性化因子は、ＣＤ４４抗体ｍＡｂ、ＩＬ５、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＴＮＦ－α、ＬＰＳである。
実施形態では、物質は、不安定プラークの細胞表面上のＣＤ４４分子と特異的に結合することが可能な低分子ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体であり；
好ましくは、不安定プラークの細胞表面上のＣＤ４４分子と特異的に結合することが可能な低分子ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体は、１～５００ＫＤａ、好ましくは１～２０ＫＤａ、より好ましくは２～１０ＫＤの範囲の分子量を有する。
実施形態では、ナノ担体には、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を診断、予防、及び／又は治療するための物質、並びにＣＤ４４活性化因子が同時にロードされており；
好ましくは、ナノ担体には、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための物質、並びに不安定プラークの細胞表面上のＣＤ４４分子と特異的に結合することが可能な低分子ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体が同時にロードされており；
より好ましくは、ナノ担体には、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を診断するための物質、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための物質、任意選択でＣＤ４４活性化因子、並びに任意選択で、不安定プラークの細胞表面上のＣＤ４４分子と特異的に結合することが可能な低分子ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体が同時にロードされている。
実施形態では、物質は、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための物質であり；
好ましくは、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための物質は、スタチン、フィブレート、抗血小板薬、ＰＣＳＫ９阻害剤、抗凝固薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥＩ，angiotensin converting enzyme inhibitor）、カルシウムイオンアンタゴニスト、ＭＭＰ阻害剤、β受容体遮断剤、グルココルチコイド、及びＩＬ－１抗体カナキヌマブなどの他の抗炎症物質、及び上記の薬物又は物質の活性調製物を含むその薬学的に許容される塩、及びインターロイキン１０（ＩＬ－１０，interleukin 10）などの内在性抗炎症サイトカインからなる群から選択される１又は２以上であり；
より好ましくは、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための物質は、ロバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ベザフィブレート、シプロフィブレート、クロフィブレート、ゲムフィブロジル、フェノフィブレート、プロブコール、エボロクマブ、アリロクマブ、ボコシズマブ、ＲＧ７６５２、ＬＹ３０１５０１４、及びＬＧＴ－２０９などの抗ＰＣＳＫ９抗体、及びＢＭＳ－９６２４７６などのアドネクチン、ＡＬＮ－ＰＣＳｓｃなどのアンチセンスＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ－３３ａ、マイクロＲＮＡ－２７ａ／ｂ、マイクロＲＮＡ－１０６ｂ、マイクロＲＮＡ－３０２、マイクロＲＮＡ－７５８、マイクロＲＮＡ－１０ｂ、マイクロＲＮＡ－１９ｂ、マイクロＲＮＡ－２６、マイクロＲＮＡ－９３、マイクロＲＮＡ－１２８－２、マイクロＲＮＡ－１４４、マイクロＲＮＡ－１４５アンチセンス鎖などの核酸、及びロックド核酸などのそれらの核酸類似体、アスピリン、アセメタシン、トロキセルチン、ジピリダモール、シロスタゾール、塩酸チクロピジン、オザグレルナトリウム、クロピドグレル、プラスグレル、シロスタゾール、ベラプロストナトリウム、チカグレロール、カングレロール、チロフィバン、エプチフィバチド、アブシキシマブ、未分画ヘパリン、クレキサン、フラキシパリン、フォンダパリヌクスナトリウム、ワルファリン、ダビガトラン、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ビバリルジン、エノキサパリン、ダルテパリン、アルデパリン、ビスヒドロキシクマリン、硝酸クマリン、クエン酸ナトリウム、ヒルジン、アルガトロバン、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、ペリンドプリル、ホシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、シラザプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、タソサルタン、ニフェジピン、ニカルジピン、ニトレンジピン、アムロジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニルバジピン、イスラジピン、フェロジピン、ラシジピン、ジルチアゼム、ベラパミル、クロルヘキシジン、ミノサイクリン、ＭＭＩ－１６６、メトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、プロプラノロール、カルベジロール、バチマスタット、マリマスタット、プリノマスタット、ＢＭＳ－２７９２５１、ＢＡＹ１２－９５６６、ＴＡＡ２１１、ＡＡＪ９９６Ａ、ナセトラピブ（nacetrapib）、エバセトラピブ、トルセトラピブ、ダルセトラピブ、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ベータメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ジプロスパン（diprospan）、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、及びＩＬ－１抗体カナキヌマブなどの他の抗炎症物質、及びそれらの有効な断片若しくは薬学的に許容される塩、及び上記の物質の活性構造断片を含む薬学的に許容される塩の１若しくは２以上、及びインターロイキン１０（ＩＬ－１０）などの内在性抗炎症サイトカインからなる群から選択される１又は２以上である。
本発明の第３の態様は、第１の態様又は第２の態様による不安定プラークを標的とするためのナノ送達系を調製するための方法であって、
（１）適正量のリン脂質分子を適切な有機溶媒に溶解し、薄膜水和法によりリポソームナノ担体を調製するステップであって、極性がより低い薬物分子の場合は、このステップにてリン脂質分子と共に薄膜を形成することが必要である、ステップ；
（２）不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を診断、予防、及び／又は治療するための水溶性物質を含んでいてもよい水性媒体を、ステップ（１）で得られたナノ担体送達系に添加して粗懸濁物を形成する任意のステップ；
（３）標的指向性リガンドを適切な緩衝溶液溶媒に溶解し、ステップ（２）で得られた担体分子を反応のために標的指向性リガンド溶液に添加して、ナノ担体送達系を得るステップ；
（４）ステップ（３）で得られた粗懸濁物に含まれる、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を診断、予防、及び／又は治療するための未ロード物質を透析により除去して、ロード済ナノ送達系を得る任意のステップ
を含む方法を提供する。
本発明の態様の第４（forth）の態様は、第１又は第２の態様によるナノ担体送達系及び薬学的に許容される担体を含む医薬を提供する。
本発明の第５の態様は、第１の態様又は第２の態様によるナノ担体送達系を含む診断用調製物を提供する。
本発明の第６の態様は、ＣＤ４４分子活性化の存在に関連する疾患を予防及び／又は治療するための調製物における、第１の態様若しくは第２の態様によるナノ担体送達系、第４の態様による医薬、又は第５の態様による診断用調製物の使用を提供する。
本発明の第７の態様は、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための調製物における、第１の態様若しくは第２の態様によるナノ担体送達系、第４の態様による医薬、又は第５の態様による診断用調製物の使用を提供する。
第７の態様の使用によると、不安定プラークは、易破裂性プラーク、易びらん化プラーク、及び部分的石灰化結節性病変からなる群から選択される１又は２以上であり；
好ましくは、不安定プラークに関連する疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈硬化性心疾患（急性冠症候群、無症候性心筋虚血－潜在性冠動脈心疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血性心疾患、突然死、及びステント内再狭窄）、脳動脈硬化症（脳卒中を含む）、末梢血管アテローム性動脈硬化症（末梢動脈閉塞性疾患、網膜の動脈硬化症、頸動脈アテローム性動脈硬化症、腎臓アテローム性動脈硬化症、下肢アテローム性動脈硬化症、上肢アテローム性動脈硬化症、及びアテローム性動脈硬化インポテンス）、大動脈解離、血管腫、血栓塞栓症、心不全、及び心原性ショックからなる群から選択される１又は２以上である。
本発明の第８の態様は、ＣＤ４４分子活性化の存在に関連する疾患を予防及び／又は治療するための方法であって、第１の態様若しくは第２の態様によるナノ担体送達系、第４の態様による薬物、又は第５の態様による診断用調製物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。
本発明の第９の態様は、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための方法であって、第１の態様若しくは第２の態様によるナノ担体送達系、第４の態様による薬物、又は第５の態様による診断用調製物を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、
好ましくは、不安定プラークが、易破裂性プラーク、易びらん化、部分的石灰化結節性病変からなる群から選択される１又は２以上であり；
より好ましくは、不安定プラークに関連する疾患が、アテローム性動脈硬化症、冠動脈硬化性心疾患（急性冠症候群、無症候性心筋虚血－潜在性冠動脈心疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血性心疾患、突然死、及びステント内再狭窄）、脳動脈硬化症（脳卒中を含む）、末梢血管アテローム性動脈硬化症（末梢動脈閉塞性疾患、網膜の動脈硬化症、頸動脈アテローム性動脈硬化症、腎臓アテローム性動脈硬化症、下肢アテローム性動脈硬化症、上肢アテローム性動脈硬化症、及びアテローム性動脈硬化インポテンスを含む）、大動脈解離、血管腫、血栓塞栓症、心不全、及び心原性ショックからなる群から選択される１又は２以上である
方法を提供する。
本発明の第１０の態様は、ＣＤ４４分子活性化の存在に関連する疾患を診断するための方法であって、第１の態様若しくは第２の態様によるナノ担体送達系、第４の態様による薬物、又は第５の態様による診断用調製物を、それを必要とする対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。
まとめると、本発明のナノ担体送達系は、ＣＤ４４分子活性化の存在を有する疾患に対して、以下の利点を有する。
１）本発明のナノ担体送達系は、活性化ＣＤ４４分子と特異的に結合することができ、薬物の安定的及び持続的放出を実現することができる。
２）不安定プラークの細胞表面上のＣＤ４４が細胞外マトリックス微小環境により誘導及び活性化され、大量のＣＤ４４が過剰発現され、ＣＤ４４－ＨＡの親和性が有意に向上され、そのため不安定プラークにおけるＣＤ４４とＨＡとの相互作用は、極めて有意な親和性特異性を有する。したがって、不安定プラーク中のＣＤ４４は、不安定プラークを標的とするためのナノ担体送達系の優れた標的となる。
３）不安定プラークへと標的化するためのナノ担体（nancarrier）送達系は、不安定プラークを能動的に標的とし、病巣細胞と組み合わさることができる。したがって、送達系は、病巣でのロード物質の持続放出を実現し、病巣区域における物質の濃度を著しく増加及び継続的に維持し、それにより送達系の診断又は治療効果を向上させることができる。
４）また、本発明による不安定プラークを標的とするナノ担体送達系には、ＣＤ４４活性化物質、つまりＩＬ５、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＴＮＦ－α、ＬＰＳなどのＣＤ４４活性化剤がロードされていてもよい。ロードされているＣＤ４４活性化因子は、病巣細胞の表面上のＣＤ４４のさらなる活性化を促進することができ、ヒアルロン酸に対するＣＤ４４の標的化親和性を短時間に増大させることができ、細胞表面に結合している標的化ナノ担体組成物の濃度を有意に増加させることができ、これは、トレーサー又は治療剤化合物の濃度を短時間に有意に増加させて診断分解能又は治療効果を向上させることができるため、不安定プラークのトレーサー診断及び治療にとって肯定的な重要性を有する。
本発明の内容を十分に理解するために、本発明は、具体的な例及び添付の図面を参照することにより下記でさらに詳細に説明される。
実施例１のＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡの電子顕微鏡写真である。 実施例１のＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡの赤外線スペクトログラムである。 実施例２のＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰの特徴付けダイヤグラムである。 実施例３のＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔの特徴付けダイヤグラムである。 実施例４のＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡの特徴付けダイヤグラムである。 実施例５のＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７の特徴付けダイヤグラムである。 実施例６のＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７の特徴付けダイヤグラムである。 実施例７のＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮの特徴付けダイヤグラムである。 実施例８のＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａの特徴付けダイヤグラムである。 実施例９のＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａの特徴付けダイヤグラムである。 実施例１０のＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌの特徴付けダイヤグラムである。 実施例１１のＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ）－ＯＰＮの特徴付けダイヤグラムである。 実験例１の粒子サイズ安定性に対する長期保存の影響を示す図である。 実験例１の封入率に対する長期保存の影響を示す図である。 実験例１のリポソーム担体のインビトロでの累積薬物放出率を示す図である。 実験例２で構築されたマウスアテローム性動脈硬化不安定プラークモデルの核磁気共鳴画像法の画像である。 正常動脈血管壁の内皮細胞の表面上の、及びマウスモデルの動脈不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４含有量の決定結果（半定量積算値として表されている）を示すグラフである。 正常動脈血管壁の内皮細胞の表面上の、及びマウスモデルの動脈不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の、ＨＡに対する結合力の決定結果（結合力積算値として表されている）を示すグラフである。 マウスモデルの動脈不安定プラークの外部及び内部のマクロファージの表面上のＣＤ４４の、ＨＡに対する結合力の決定結果（結合力積算値として表されている）を示すグラフである。 マウスモデルの頚動脈不安定プラークに対する、本発明のＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔナノ送達系の治療効果を示すグラフである。 マウスモデルの頚動脈不安定プラークに対する、本発明のＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７、ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７ナノ送達系の治療効果を示すグラフである。 マウスモデルの頚動脈不安定プラークに対する、本発明のＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮ及び他のＣＴトレーサーナノ送達系のインビボでのトレース効果を示すグラフである。 マウスモデルの頚動脈不安定プラークに対する、本発明のＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮナノ送達系の治療効果を示すグラフである。 マウスモデルの頚動脈不安定プラークに対する、本発明のＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａ、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａ、及び他のＭＲＩトレーサーナノ送達系のインビボでのトレース効果を示すグラフである。 マウスモデルの頚動脈不安定プラークに対する、本発明のＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａ、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａナノ送達系の治療効果を示すグラフである。 マウスモデルの不安定動脈プラークの破裂に対する、本発明のＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌナノ送達系の治療効果を示すグラフである。 マウスモデルの頚動脈不安定プラークに対する、本発明の放射性同位体トレーサーＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ）－ＯＰＮナノ送達系のインビボでのトレース効果を示すグラフである。
本発明をさらに理解するために、本発明の具体的な実施形態が、実施例を参照して下記で詳細に説明されている。しかしながら、説明は、本発明の特徴及び利点をさらに例示することが意図されているに過ぎず、本発明の特許請求の範囲を限定することはいかなる点でも意図されていないことが理解されるべきである。
本発明は、具体的な例により下記でさらに説明されることになるが、これらの例は、より詳細な説明のためであるに過ぎず、いかなる形態でも本発明を限定するとは解釈されるべきでないことが理解されるべきである。
このセクションでは、本発明の試験に使用した物質及び実験方法の基本的説明が示される。本発明の目的を達成するための多数の物質及び作業方法は当技術分野で周知であるが、本発明は、さらに本明細書で可能な限り詳細に説明される。本発明における物質及び作業方法が、別様の指定がない限り当該状況の技術分野で周知であることは、当業者であれば明らかである。
ロスバスタチン（Ｒ）がロードされており、ヒアルロン酸（ＨＡ）により修飾されているリポソームナノベシクル（ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ）の調製
この実施例では、治療剤がロードされているリポソームナノベシクルＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡを薄膜分散法により調製する。上記のリポソーム送達系のナノベシクルの表面は、標的指向性リガンドヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）により部分的に修飾されており、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための物質であるロスバスタチン（略称「Ｒ」により表わされる）がロードされている。
（１）ＬＰ１－（Ｒ）リポソームナノベシクル懸濁物の調製：
４ｍｇのジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ，distearoyl phosphatidylcholine）、コレステロール、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ，dimyristoyl phosphoethanolamine）（モル比は４：１：１である）を計量し、薬物ロスバスタチン（Ｒ）（総薬物対脂質のモル比は１：１０である）を添加し、その後１０ｍＬのクロロホルムで溶解した。有機溶媒を、ゆっくりとした回転蒸発（６５℃水浴、９０ｒ／分、３０分間）により除去して、容器の壁面に薄膜を形成した。容器を、５０℃の恒温水浴ケトルに設置して、粗リポソームナノベシクル懸濁物が形成されるように３０分間薄膜を完全に水和させた。粗リポソームナノベシクル懸濁物を超音波槽で超音波処理し、その後懸濁物を、プローブ型超音波ソニケータ－で３分間さらに超音波処理した（振幅２０、間隔３秒間）。微細化リポソームナノベシクル懸濁物中の未封入薬物を、セファデックスカラムＧ－１００により除去した。
（２）ヒアルロン酸（「ＨＡ」）の活性化及びカップリング：
１ｇのＨＡ（約１００ＫＤａの分子量を有する）を、超純水に完全に溶解し、０．１ｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ，1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride）及び０．１２ｇのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ，N-hydroxysulfosuccinimide）カップリング剤を添加して、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、無水エタノールを添加して、活性化ＨＡを沈殿させた。沈殿物を濾過し、エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥して、活性化ＨＡを得た。それを０．１ｍｇ ｍＬ－１水溶液に調剤し、０．２ｍＬの溶液を、上記のステップ（１）で得られたリポソームナノベシクル懸濁物に移して溶解し、活性化ＨＡの活性化カルボキシル基を、アミド結合の形成により、リポソームナノベシクルの脂質二分子膜に組み込まれているＤＳＰＥ分子のアミノ基とカップリングさせて、治療剤がロードされた３つのリポソーム送達系ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡを得た。図１は、ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡの電子顕微鏡写真である。図２は、ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡの赤外線スペクトログラムである。
ロスバスタチン（Ｒ）がロードされており、セレクチン（ＳＰ）により修飾されているリポソームナノベシクル（ＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰ）の調製
この実施例では、治療剤がロードされているリポソームナノベシクルＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰを薄膜分散法により調製する。上記のリポソーム送達系のナノベシクルの表面は、標的指向性リガンドセレクチン（「ＳＰ」と略される）により部分的に修飾されており、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための物質であるロスバスタチン（略称「Ｒ」により表わされる）がロードされている。
（１）ＬＰ１－（Ｒ）リポソームナノベシクルの調製：
実施例１の方法によりＬＰ１－（Ｒ）リポソームナノベシクルを調製した。
（２）セレクチン（ＳＰ）の活性化及びカップリング：
１ｍｇのＳＰを超純水に完全に溶解し、０．５ｍｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）及び０．５ｍｇのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）カップリング剤を添加して、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、活性化セレクチンを限外濾過により精製し、上記のステップ（１）で得られたリポソームナノベシクル懸濁物に溶解し、活性化ＳＰの活性化カルボキシル基を、アミド結合の形成により、リポソームナノベシクルの脂質二分子膜に組み込まれているＤＭＰＥ分子のアミノ基とカップリングさせて、治療剤がロードされた３つのリポソーム送達系ＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰを得た。図３は、ＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰの特徴付けダイヤグラムである。
ロスバスタチン（Ｒ）がロードされており、ヒアルロン酸（ＨＡ）及び膜貫通ペプチド（Ｔａｔ）により同時に修飾されているリポソームナノベシクル（ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔ）の調製
この例では、治療剤がロードされているリポソームナノベシクルＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔを薄膜分散法により調製する。上記のリポソーム送達系のナノベシクルの表面は、標的指向性リガンドヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）及び膜貫通ペプチド（Ｔａｔ）により部分的に修飾されており、不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための物質であるロスバスタチン（略称「Ｒ」により表わされる）がロードされている。
３．１ ＬＰ１－（Ｒ）リポソームナノベシクルの調製：
実施例１の方法によりＬＰ１－（Ｒ）リポソームナノベシクルを調製した。
３．２ ヒアルロン酸（「ＨＡ」）の活性化及びカップリング：
１０ｍｇのＨＡ（約１０ＫＤａの分子量を有する）を超純水に完全に溶解し、５ｍｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）及び５ｍｇのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）カップリング剤を添加して、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、無水エタノールを添加して、活性化ＨＡを沈殿させた。沈殿物を濾過し、エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥して、活性化ＨＡを得た。それを０．１ｍｇ ｍＬ－１水溶液に調剤した。
１ｍｇのＴａｔをＰＢＳ緩衝液に完全に溶解し、０．１ｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）及び０．１２ｇのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）カップリング剤を添加して、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、限外濾過により精製して、未反応の小有機分子を除去した。活性化Ｔａｔを０．１ｍｇ ｍＬ－１水溶液に調剤した。
１ｍＬのＨＡ溶液及び０．５ｍＬのＴａｔ溶液を、精製ＬＰ１－（Ｒ）リポソームナノベシクル溶液に移して溶解し、活性化ＨＡ及びＴａｔの活性化カルボキシル基を、アミド結合の形成により、リポソームナノベシクルの脂質二分子膜に組み込まれているＤＭＰＥ分子のアミノ基にカップリングして、ＬＰ１－（Ｒ）に対するＨＡ及びＴａｔの二重カップリングを実現させ、標的認識ナノ担体ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔを得た。図４は、ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔの赤外線特徴付けダイヤグラムである。
アトルバスタチン（Ａｔ）がロードされており、ヒアルロン酸（ＨＡ）及びＰＥＧにより同時に修飾されているリポソームナノディスク（ＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡ）の調製
（１）アトルバスタチン（Ａｔ）がロードされたリポソームナノディスクＬＰ２－（Ａｔ）の調製：
４ｍｇの１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、短鎖を有する１，２－ジ－ｎ－ヘプタデカノイルホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）（モル比は７：２：１である）を計量し、薬物アトルバスタチン（Ａｔ）（総薬物対脂質のモル比は１：１０である）を添加し、その後１０ｍＬのクロロホルムで溶解した。有機溶媒を、ゆっくりとした回転蒸発（６５℃水浴、９０ｒ／分、３０分間）により除去して、容器の壁面に薄膜を形成した。１０ｍＬの水（濃度は１．０ｍｇ／ｍＬである）を丸底フラスコに添加し、フラスコを、５０℃の恒温水浴ケトルに設置し、粗リポソームナノディスク懸濁物が形成されるように、薄膜を完全に水和させた。粗リポソームナノディスク懸濁物を超音波槽で超音波処理し、その後懸濁物を、プローブ型超音波ソニケータ－で３分間さらに超音波処理した（振幅２０、間隔３秒間）。微細化リポソームナノディスク懸濁物中の未封入薬物を、セファデックスカラムＧ－１００により除去した。
（２）ヒアルロン酸（「ＨＡ」）の活性化及びカップリング：
１ｇのＨＡ（約１００ＫＤａの分子量を有する）を超純水に完全に溶解し、０．１ｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）及び０．１２ｇのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）カップリング剤を添加して、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、無水エタノールを添加して、活性化ＨＡを沈殿させた。沈殿物を濾過し、エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥して、活性化ＨＡを得た。それを０．１ｍｇ ｍＬ－１水溶液に調剤し、０．２ｍＬの溶液を、上記のステップ（１）で得られたリポソームナノディスク懸濁物に移して溶解し、活性化ＨＡの活性化カルボキシル基を、アミド結合の形成により、ＰＥＧ－ＮＨ２（分子量１０００）のアミノ基及びリポソームナノディスクの脂質二分子膜に組み込まれているＤＭＰＥ分子のアミノ基とカップリングさせて、治療剤がロードされた３つのリポソーム送達系ＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡを得た。図５は、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡの特徴付けダイヤグラムである。ＰＥＧを修飾する必要がない場合、ＰＥＧ－ＮＨ２を添加する上記ステップを省略して、ＰＥＧ修飾のないＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡを得ることができる。
アトルバスタチン（Ａｔ）がロードされており、自己ペプチド（ＳＥＰ）及びモノクローナル抗体ＩＭ７により修飾されているリポソームナノディスク（ＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７）の調製
（１）アトルバスタチン（Ａｔ）がロードされたリポソームナノディスクの調製：
実施例４の方法に従ってリポソームナノディスクを調製した。
（２）ＳＥＰ又はＩＭ７の活性化及びカップリング：
１ｍｇのＳＥＰを超純水に完全に溶解し、０．５ｍｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）及び０．５ｍｇのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）カップリング剤を添加して、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、限外濾過及び遠心分離により活性化ＳＥＰを精製した。１ｍｇのＩＭ７を超純水に完全に溶解し、０．１ｍｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）及び０．１ｍｇのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）カップリング剤を添加して、カルボキシル基を活性化し、限外濾過及び遠心分離により活性化ＩＭ７を精製した。
活性化ＳＥＰ又はＩＭ７を、精製ＬＰ２－（Ａｔ）溶液に溶解して、ＬＰ２－（Ａｔ）に対するＳＥＰ／ＩＭ７の二重カップリングを実現させ、標的認識ナノディスクＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７を得た。図６は、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７の特徴付けダイヤグラムである。ＳＥＰを修飾する必要がない場合、ＳＥＰを活性化及びカップリングする上記ステップを省略して、ＳＥＰ修飾のないＬＰ２－（Ａｔ）－ＩＭ７を得ることができる。
アトルバスタチン（Ａｔ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ－３３ａ）がロードされており、モノクローナル抗体ＩＭ７により修飾されているリポソームナノディスク（ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７）の調製
（１）アトルバスタチン（Ａｔ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ－３３ａ）がロードされたリポソームナノディスクＬＰ２－（Ａｔ）の調製：
４ｍｇのＤＯＴＡＰ、短鎖を有する１，２－ジ－ｎ－ヘプタデカノイルホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）を、７：２：１のモル比で計量し、薬物アトルバスタチン（Ａｔ）（総薬物対脂質のモル比は１：１０である）を添加し、その後１０ｍＬのクロロホルムで溶解した。有機溶媒を、ゆっくりとした回転蒸発（６５℃水浴、９０ｒ／分、３０分間）により除去して、容器の壁面に薄膜を形成した。１０ｍＬの水（濃度は１．０ｍｇ／ｍＬである）を丸底フラスコに添加し、フラスコを、５０℃の恒温水浴ケトルに設置し、粗リポソームナノディスク懸濁物が形成されるように、薄膜を完全に水和させた。粗リポソームナノディスク懸濁物を超音波槽で超音波処理し、その後懸濁物を、プローブ型超音波ソニケータ－で３分間さらに超音波処理して（振幅２０、間隔３秒間）、微細化リポソームナノディスク懸濁物を得た。微細化リポソームナノディスク懸濁物中の未封入アトルバスタチンを、セファデックスカラムＧ－１００により除去した。濾液を濃縮した後、ある量のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ－３３ａ）を添加し、２時間インキュベートして、ナノディスクの表面に対するマイクロＲＮＡの結合を促進した。産物を、後の使用のために４℃の低温で保存した。
１ｍｇのＩＭ７を超純水に完全に溶解し、０．５ｍｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）及び０．５ｍｇのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）カップリング剤を添加して、カルボキシル基を活性化し、限外濾過及び遠心分離により活性化ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＩＭ７を精製した。活性化されたそれを精製ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）溶液に溶解し、ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）に対するＩＭ７の二重カップリングを実現させ、標的認識ナノディスクＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７を得た。図７は、ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７の赤外線特徴付けダイヤグラムである。
ロスバスタチン（Ｒ）／金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）がロードされており、オステオポンチン（ＯＰＮ）により修飾されているリポソームナノディスク（ＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮ）の調製
７．１ 金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）の調製
１００ｍＬの１ｍＭ ＨＡｕＣｌ４溶液を調製し、加熱して沸騰させ、１ｍＬの新たに調製した０．１Ｍ水素化ホウ素ナトリウムを激しく撹拌しながら添加して、ＡｕＮＰを得、限外濾過により溶液を精製し、溶液を濃縮して１ｍＭ ＡｕＮＰを得た。
７．２ ロスバスタチン（Ｒ）及び金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）がロードされたリポソームナノディスクＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）の調製
４ｍｇの１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、短鎖を有する１，２－ジ－ｎ－ヘプタデカノイルホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）を７：２：１のモル比で計量し、薬物ロスバスタチン（Ｒ）（総薬物対脂質のモル比は１：１０である）を添加し、その後１０ｍＬのクロロホルムで溶解した。有機溶媒を、ゆっくりとした回転蒸発（６５℃水浴、９０ｒ／分、３０分間）により除去して、容器の壁面に薄膜を形成した。フラスコを、５０℃の恒温水浴ケトルに設置し、薄膜を３０分間完全に水和させ、１ｍＬの精製ＡｕＮＰ（１ｍＭ）溶液を添加した。粗リポソームナノディスク懸濁物を超音波槽で超音波処理し、その後懸濁物を、プローブ型超音波ソニケータ－で３分間さらに超音波処理した（振幅２０、間隔３秒間）。微細化リポソームナノディスク懸濁物中の未封入ロスバスタチン及び未封入ＡｕＮＰを、セファデックスカラムＧ－１００により除去した。
７．３ ＡｕＮＰ／Ｒがロードされており、オステオポンチン（ＯＰＮ）により修飾されているリポソームナノディスク（ＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮ）の調製
１ｍｇのＯＰＮを超純水に完全に溶解し、０．５ｍｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）及び０．５ｍｇのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）カップリング剤を添加して、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、限外濾過及び遠心分離により活性化ＯＰＮを精製した。１．０ｍＬのＯＰＮ溶液を精製ＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）溶液に溶解して、ＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）に対するＯＰＮのカップリングを実現した。図８は、実施例７のＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮの赤外線特徴付けダイヤグラムである。
代わりの原料を使用して、本発明者らは、標的化ＣＴトレーサーＬＰ２－（イオプロミド）－ＯＰＮ、ＬＰ２－（イオジキサノール）－ＯＰＮ、及びＬＰ２－（ヨードフルオロアルコール）－ＯＰＮを、上記の類似調製方法により調製することにも成功した。
デキサメタゾン（ＤＸＭＳ）及び磁性鉄ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ）がロードされており、モノクローナル抗体（ＨＩ４４ａ）により修飾されているリポソームナノベシクル（ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａ）の調製
８．１ 磁性鉄ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ）の調製
１００ｍＬの１０ｍＭ塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３）溶液を調製し、１０ｍＬの新たに調製した０．１Ｍ水酸化アンモニウムを激しく撹拌しながら添加して、磁性鉄ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ）を得、この材料を外部磁場により精製した。溶液を濃縮し、それを純水に再分散させて、１０ｍＭ Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰを調製した。
８．２ デキサメタゾン（ＤＸＭＳ）及び磁性鉄ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ）がロードされたリポソームナノベシクルＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）の調製
４ｍｇのジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）（モル比は４：１：１である）を計量し、薬物デキサメタゾン（ＤＸＭＳ）（総薬物対脂質のモル比は１：１０である）を添加し、その後１０ｍＬのクロロホルムで溶解した。有機溶媒を、ゆっくりとした回転蒸発（６５℃水浴、９０ｒ／分、３０分間）により除去して、容器の壁面に薄膜を形成した。１０ｍＬの精製１ｍＭ Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ溶液を添加し、フラスコを、５０℃の恒温水浴ケトルに設置して、粗リポソームナノベシクル懸濁物が形成されるように、薄膜を完全に水和させた。粗リポソームナノベシクル懸濁物を超音波槽で超音波処理し、その後懸濁物を、プローブ型超音波ソニケータ－で３分間さらに超音波処理して（振幅２０、間隔３秒間）、リポソームベシクルを完全に分散させることにより形成された分散系、つまり微細化リポソームベシクル懸濁物を得た。微細化リポソームナノベシクル懸濁物中の未封入薬物及び未封入Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰを、セファデックスカラムＧ－１００により除去した。
８．３ Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳがロードされており、ＨＩ４４ａにより修飾されているリポソームナノベシクル（ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａ）の調製
１ｍｇのＨＩ４４ａを超純水に完全に溶解し、０．５ｍｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）及び０．５ｍｇのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）カップリング剤を添加して、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、限外濾過及び遠心分離により活性化ＨＩ４４ａを精製した。ＨＩ４４ａ溶液を精製ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）溶液に溶解し、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）に対するＨＩ４４ａのカップリングを実現して、標的認識ナノ担体ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａを得た。図９は、実施例８のＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａの特徴付けダイヤグラムである。
代わりの原料を使用して、本発明者らは、標的化ＭＲＩトレーサーＬＰ１－（ガドテル酸メグルミン）－ＨＩ４４ａ、ＬＰ１－（ガドジアミド）－ＨＩ４４ａ、及びＬＰ１－（ガドペンテト酸）－ＨＩ４４ａなどを、上記の類似調製方法により調製することにも成功した。
インターロイキン１０（ＩＬ－１０）及び磁性鉄ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ）がロードされており、モノクローナル抗体（ＨＩ４４ａ）により修飾されているリポソームナノベシクル（ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａ）の調製
９．１ 磁性鉄ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ）の調製
磁性鉄ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ）を実施例８の方法に従って調製した。
９．２ ＩＬ－１０及び磁性鉄ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ）がロードされたリポソームナノベシクルＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）の調製
４ｍｇのジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）（モル比は４：１：１である）を計量した。有機溶媒を、ゆっくりとした回転蒸発（６５℃水浴、９０ｒ／分、３０分間）により除去して、容器の壁面に薄膜を形成した。１０ｍＬの精製１ｍＭ Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ溶液を添加し、フラスコを、５０℃の恒温水浴ケトルに設置して、粗リポソームナノベシクル懸濁物が形成されるように、薄膜を完全に水和させた。粗リポソームナノベシクル懸濁物を超音波槽で超音波処理し、その後懸濁物を、プローブ型超音波ソニケータ－で３分間さらに超音波処理して（振幅２０、間隔３秒間）、リポソームベシクルを完全に分散させることにより形成された分散系、つまり微細化リポソームベシクル懸濁物を得た。溶液を濃縮し、１ｍｇのＩＬ－１０を添加し、室温で１０時間インキュベートして、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）を得た。微細化リポソームナノベシクル懸濁物中の未封入薬物をセファデックスカラムＧ－１００により除去した。
９．３ Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０がロードされており、ＨＩ４４ａにより修飾されているリポソームナノベシクル（ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａ）の調製
１ｍｇのＨＩ４４ａを超純水に完全に溶解し、０．５ｍｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）及び０．５ｍｇのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）カップリング剤を添加して、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、限外濾過及び遠心分離により活性化ＨＩ４４ａを精製した。ＨＩ４４ａ溶液を精製ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）溶液に溶解し、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）に対するＨＩ４４ａのカップリングを実現して、標的認識ナノ担体ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａを得た。図１０は、実施例９のＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａの赤外線特徴付けダイヤグラムである。
アスピリン（Ａｓｐ）及びクロピドグレル（Ｃｌｏ）がロードされており、コラーゲン（Ｃｏｌ）により修飾されているリポソームナノベシクル（ＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌ）の調製
１０．１ アスピリン（Ａｓｐ）及びクロピドグレル（Ｃｌｏ）がロードされたリポソームナノベシクルＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）の調製
４ｍｇのジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）（モル比は４：１：１である）を計量し、薬物アスピリン（Ａｓｐ）及びクロピドグレル（Ｃｌｏ）（薬物のモル比は１：１であり、総薬物対脂質のモル比は１：１０である）を添加し、その後１０ｍＬのクロロホルムで溶解した。有機溶媒を、ゆっくりとした回転蒸発（６５℃水浴、９０ｒ／分、３０分間）により除去して、容器の壁面に薄膜を形成した。容器を、５０℃の恒温水浴ケトルに設置して、粗リポソームナノベシクル懸濁物が形成されるように、薄膜を完全に水和させた。粗リポソームナノベシクル懸濁物を超音波浴で超音波処理し、その後懸濁物を、プローブ型超音波ソニケータ－で３分間さらに超音波処理した（振幅２０、間隔３秒間）。微細化リポソームナノベシクル懸濁物中の未封入薬物を、セファデックスカラムＧ－１００により除去した。
１０．２ コラーゲン（Ｃｏｌ）により修飾されたロード済リポソームナノベシクル（ＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌ）の調製
１０ｍｇのＣｏｌを超純水に完全に溶解し、３ｍｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）及び３ｍｇのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）カップリング剤を添加して、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、限外濾過及び遠心分離により活性化Ｃｏｌを精製した。１．０ｍＬの活性化Ｃｏｌを精製ＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）溶液に溶解し、ＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）に対するＣｏｌのカップリングを実現して、標的認識リポソームベシクルＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌを得た。図１１は、実施例１０のＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌの赤外線特徴付けダイヤグラムである。
フッ素１８（１８Ｆ）標識フルデオキシグルコース（Ｆ－ＦＤＧ）がロードされており、オステオポンチン（ＯＰＮ）により修飾されているリポソームナノベシクル（ＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ）－ＯＰＮ）の調製
１１．１ Ｆ－ＦＤＧがロードされたリポソームナノベシクル（ＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ））の調製
４ｍｇのジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）（モル比は４：１：１である）を計量し、１０ｍＬのクロロホルムで溶解した。有機溶媒を、ゆっくりとした回転蒸発（６５℃水浴、９０ｒ／分、３０分間）により除去して、容器の壁面に薄膜を形成した。１０ｍＬの１ｍｇ ｍＬ－１ Ｆ－ＦＤＧ溶液（総薬物対脂質のモル比は１：１０である）を添加し、容器を、５０℃の高温水浴ケトルに設置し、粗リポソームナノベシクル懸濁物が形成されるように、薄膜を完全に水和させた。粗リポソームナノベシクル懸濁物を超音波浴で超音波処理し、その後懸濁物を、プローブ型超音波ソニケータ－で３分間さらに超音波処理した（振幅２０、間隔３秒間）。微細化リポソームナノベシクル懸濁物中の未封入薬物を、セファデックスカラムＧ－１００により除去した。
１１．２ Ｆ－ＦＤＧがロードされており、オステオポンチン（ＯＰＮ）により修飾されているリポソームナノベシクル（ＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ））の調製
１ｍｇのＯＰＮを超純水に完全に溶解し、０．５ｍｇの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）及び０．５ｍｇのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）カップリング剤を添加して、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、限外濾過及び遠心分離により活性化ＯＰＮを精製した。活性化ＯＰＮを精製ＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ）溶液に溶解し、ＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ）に対するＯＰＮのカップリングを実現して、標的認識ナノ担体ＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ）－ＯＰＮを得た。図１２は、実施例１１のＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ）－ＯＰＮの赤外線特徴付けダイヤグラムである。
実験例１：本発明のナノ担体送達系の特性の調査
この例では、実施例１で調製されている、治療剤がロードされたナノ担体送達系を例として挙げて、本発明の担体送達系が、安定的及び制御可能な特性を有し、したがって不安定プラーク又は不安定プラークに関連する疾患の診断、予防、及び治療に適切であることを証明する。
１．薬物濃度を決定するための方法：
ロード薬物ロスバスタチン、アトルバスタチン、デキサメタゾン、アスピリン、クロピドグレル、及びフッ素１８（１８Ｆ）標識フルデオキシグルコースは、強い紫外線吸収特性を有し、したがってその含有量は、ロスバスタチン、アトルバスタチン、デキサメタゾン、アスピリン、クロピドグレル、フッ素１８（１８Ｆ）標識フルデオキシグルコースの紫外線吸収特性を共に使用することにより、ＨＰＬＣ－ＵＶ法（Waters 2487、Waters Corporation社、アメリカ合衆国を使用する）で決定することができる。標準定量化数式を、ロスバスタチン、アトルバスタチン、デキサメタゾン、アスピリン、クロピドグレル、フッ素１８（１８Ｆ）標識フルデオキシグルコース溶液の種々の濃度（Ｘ）対ＨＰＬＣクロマトグラフィーピークのピーク面積（Ｙ）を用いて確立した。
２．流体力学的サイズの決定：
本発明の担体送達系ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７、ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７、ＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮ、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａ、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａ、ＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌ、ＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ）－ＯＰＮの流体力学的サイズを、レーザー粒子アナライザー（BI-Zeta Plus/90 Plus、Brookhaven Instruments Corporation社、アメリカ合衆国）で測定した。具体的な結果は表１に示されている。
３．封入率の決定：
ある品質の薬物懸濁物を取り出し、過剰メタノールに添加して還流し、そのロード薬物を抽出し、超音波抽出をさらに適用して、担体からの薬物放出を加速させた。得られた液体中の薬物含有量を、ＨＰＬＣ（Waters 2487、Waters Corporation社、アメリカ合衆国）で測定し、封入率を数式１に従って算出した。
４．薬物ロード率の決定：
薬物ロード率を決定するため方法は、算出方法がわずかに異なる以外は、封入率を決定するための方法と同様である。ある品質の薬物懸濁物を取り出し、過剰メタノールに添加して還流し、そのロード薬物を抽出し、超音波抽出をさらに適用して、担体からの薬物放出を加速させた。得られた液体中の薬物含有量を、ＨＰＬＣ（Waters 2487、Waters Corporation社、アメリカ合衆国）で測定し、封入率を以下の数式に従って算出した。
得られた液体中の薬物含有量を、ＨＰＬＣ（Waters 2487、Waters Corporation社、アメリカ合衆国）で測定し、封入率を数式２に従って算出した。
注:上記データは、並行して行った5つの決定の結果の「平均+標準偏差」の形態で表されている。
５．長期安定性の調査
本発明のナノ担体送達系ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７、ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７、ＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮ、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａ、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａ、ＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌ、ＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ）－ＯＰＮを４℃で保存し、様々な時点でサンプリングした。それらの流体力学的サイズの変化を、レーザー粒子アナライザー（BI-Zeta Plus/90 Plus、Brookhaven Instruments Corporation社、アメリカ合衆国）で検出し、結果は図１３に示されている。図１３は、粒子サイズ安定性に対する長期保存の影響を示す図である。
６．長期封入率の調査
本発明のナノ担体送達系ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７、ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７、ＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮ、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａ、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａ、ＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌ、ＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ）－ＯＰＮを４℃で保存し、様々な時点でサンプリングし、遊離薬物を限外濾過及び遠心分離により除去して、それらの封入率の変化を検出し、結果は図１４に示されている。図１４は、封入率に対する長期保存の影響を示す図である。
７． インビトロでの薬物放出性能に関する研究
２ｍＬの本発明のナノ担体送達系ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７、ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７、ＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮ、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａ、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａ、ＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌ、ＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ）－ＯＰＮを透析バッグに入れて密封した。その後、透析バッグを、５０ｍＬの放出培地（ＰＢＳ溶液、ｐＨ＝７．４）に入れ、３７℃で１２０時間インキュベートした。２ｍＬの放出液を様々な時点で取り出し、同じ容積のＰＢＳ溶液を補充した。放出液中の薬物含有量を、ＨＰＬＣ（Waters 2487、Waters Corporation社、アメリカ合衆国）で検出し、累積薬物放出率を数式３に従って算出した。
数式３の各パラメーターの意味は以下のとおりである。
ＣＲＰ：累積薬物放出率
Ｖｅ：放出液の置換容積、本明細書ではＶｅは２ｍＬである
Ｖ０：放出系の放出液の容積、本明細書ではＶ０は５０ｍＬである
Ｃｉ：ｉ回目の置換及びサンプリング時の放出液中の薬物濃度、単位はμｇ／ｍＬ
Ｍ薬物：セラソーム（cerasome）又はリポソーム送達系中の薬物の総質量、単位はμｇ
ｎ：放出液の置換回数
Ｃｎ：放出液のｎ回目の置換後に測定された放出系中の薬物濃度
インビトロでの放出は、ナノ粒子送達系を評価するための重要な指標である。図１５は、本発明のリポソーム送達系の累積薬物放出率の変化を示すグラフである。
実験例２：標的指向性機序に関する研究
この例では、不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の密度及びＨＡに対するその親和性を研究し、それにより、不安定プラークを標的とするための本発明の送達系の標的として、不安定プラーク内のＣＤ４４を選択することに関する実験的根拠を提供する。
１）動脈不安定プラークの内皮細胞の表面上の、及びマウスの正常動脈血管壁の内皮細胞の表面上のＣＤ４４含有量の比較
アテローム性動脈硬化不安定プラークのマウスモデルを構築する。
ＳＰＦグレードＡｐｏＥ－／－マウス（１０週齢、体重２０±１ｇ）を、実験動物として得る。マウスには、４週間にわたって、適応型高脂肪食（adaptive high-fat diet）（脂肪１０％（ｗ／ｗ）、コレステロール２％（ｗ／ｗ）、コール酸ナトリウム０．５％（ｗ／ｗ）、残りは通常のマウス飼料）を与え、その後１％ペントバルビタールナトリウム（１ｍｇのペントバルビタールナトリウムを１００ｍｌの生理食塩水に添加することにより調製された）を４０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射することにより麻酔をかけた。その後、マウスを背臥位で外科用プレートに固定し、７５％（ｖ／ｖ）アルコールで頸部の周りを消毒し、頸部皮膚を縦に切り、前頸部腺をざっくりと分離した。拍動左総頸動脈を気管の左側に観察することができる。総頚動脈を、分岐点まで注意深く分離した。長さ２．５ｍｍ及び内径０．３ｍｍのシリコーンカニューレを、左総頚動脈の外側周囲に留置した。カニューレの近位及び遠位セグメントを狭窄させ、細糸で固定した。局所的に締め付けると、近位端での急速な血流が引き起こされて剪断力が増加し、したがって血管内膜が損傷する。頸動脈を再配置し、頸部皮膚を断続的に縫合した。手術は全て１０×実体顕微鏡下で実施した。手術から覚醒したら、マウスをケージに戻し、周囲温度を２０～２５℃に維持し、光を１２時間／１２時間の明／暗サイクルで維持した。手術後４週目に、リポ多糖（ＬＰＳ）（０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水で１ｍｇ／ｋｇ、Sigma社、アメリカ合衆国）を、１０週間にわたって週２回腹腔内注射して、慢性炎症を誘導した。手術後８週目に、マウスを、６時間／日、１週当たり５日、合計６週間にわたって５０ｍｌシリンジに入れ（十分な換気が確保されている）、拘束による精神的ストレスを誘発させた。アテローム性動脈硬化不安定プラークのマウスモデルは、手術後１４週目に完成した。図１６（ａ）及び（ｂ）は、マウスアテローム性動脈硬化不安定プラークモデルの核磁気共鳴画像法の画像を示す。矢印が指している部分から、左頸動脈プラークが形成されていることを見ることができ、モデリングが成功していることが示唆される。右頸動脈を、比較のための正常動脈血管壁として使用することができる。
モデルマウスの正常動脈血管の内皮細胞及び動脈不安定プラークの内皮細胞を、免疫組織化学的染色及び画像分析によるＣＤ４４含有量決定のために採取する。具体的な実験方法は以下のとおりである。
マウス頸動脈アテローム動脈硬化プラーク標本を採取し、１０ｍＬ／Ｌホルムアルデヒド水溶液で固定し、パラフィンで包埋し、４μｍに切片化し、従来の様式で脱脂し、水和させ、ＣＤ４４含有量をストレプトアビジン－ビオチン－ペルオキシダーゼ複合体法（ＳＡＢＣ，streptavidin-biotin-peroxidase complex method）で検出した。検体を３０ｍＬ／Ｌ Ｈ２Ｏ２水溶液に浸漬して内在性ペルオキシダーゼの活性を阻止し、抗原マイクロ波修復（antigen microwave repair）のために検体をクエン酸緩衝液に入れた。その後、５０ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，bovine serum albumin）ブロッキング溶液を滴加し、試料を、室温で２０分間静置した。その後、マウス抗ＣＤ４４ポリクローナル抗体（１：１００）を滴加し、試料を４℃の冷蔵庫に一晩入れ、３７℃で１時間インキュベートした。検体を洗浄し、その後ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧを滴加し、３７℃で３０分間反応させた。その後、それをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，phosphate buffered saline）で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ＳＡＢＣ複合体を滴加し、３７℃で２０分間インキュベートした。上記の各ステップをＰＢＳで洗浄した。最後に、ＤＡＢで顕色を実施し（顕色は顕微鏡下で制御される）、ヘマトキシリンで再染色し、その後試料を脱水して密封した。切片を、ＢＩ－２０００画像分析システムの免疫組織化学分析システムにより分析した。正常動脈血管の内皮細胞及び動脈不安定プラークの内皮細胞についてそれぞれ３つの切片を収集し、５つの代表的な視野を無作為に選択した。ＣＤ４４の陽性発現は以下のとおりである：細胞膜及び細胞質は黄褐色／チョコレートブラウンであり、背景は透明であり、色が濃いほどＣＤ４４の発現が強い。ＣＤ４４の陰性発現は以下のとおりである：黄褐色の粒子が見られない。正常動脈血管の内皮細胞及び動脈不安定プラークの内皮細胞中の陽性細胞の平均吸光度（Ａ）値を測定及び比較した。結果は図１７に示されている。
図１７は、マウスモデルの正常動脈血管壁の内皮細胞及び動脈不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４含有量の決定結果（半定量積算値）を示す。図示されているように、動脈不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４含有量は、正常動脈血管の内皮細胞の表面上のＣＤ４４含有量のおよそ２．３倍である。
２）リガンド及び抗体に対する、マウスの動脈不安定プラークの内皮細胞及び正常動脈血管壁の内皮細胞の表面上のＣＤ４４の親和性の比較
ＣＤ４４の天然リガンドとしては、以下のものが挙げられる：ＨＡ、ＧＡＧ、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、セレクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、及びモノクローナル抗体ＨＩ４４ａ、ＨＩ３１３、Ａ３Ｄ８、Ｈ９０、ＩＭ７など。
モデルマウスの正常動脈血管壁の内皮細胞及び動脈不安定プラークの内皮細胞を採取し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度の、アミノフルオレセインで標識されたリガンド／抗体を添加し、試料を、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃にてダルベリック（Dulberic）変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Dulberic modified Eagle's medium）（体積分率が１０％の仔ウシ血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを含む）で培養した。３０分後、平均蛍光強度（ＭＦＩ，mean fluorescence intensity）を、フローサイトメトリー（CytoFLEX、Beckman Coulter社、アメリカ合衆国）で決定し、両細胞の表面に対するＦＬ－リガンド／抗体の結合力積算値を算出した（リガンド／抗体に対する、正常動脈血管壁の内皮細胞のＣＤ４４の結合力を１とする）。結果は図１８に示されている。
図１８に示されているように、ＨＡに対する、動脈不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常動脈血管壁の内皮細胞のもののおよそ２４倍である。これは、正常動脈血管壁の内皮細胞の表面上のＣＤ４４はほとんどが、リガンドＨＡに結合することができない静止状態にあるが、動脈不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４は、内部環境の炎症性因子などの因子により活性化されており、ＨＡに対する親和性が有意に増加されていることを示す。
ＣＤ４４の他のリガンドは、ＨＡと同様の結果を示す。ＧＡＧに対する、不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの２２倍である。コラーゲンに対する、不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの２１倍である。ラミニンに対する、不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの１６倍である。フィブロネクチンに対する、不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの１８倍である。セレクチンに対する、不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの１９倍である。オステオポンチンに対する、不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの１７倍である。
同様の結果が、ＣＤ４４のモノクローナル抗体で観察された。ＨＩ４４ａに対する、不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの１５倍である。ＨＩ３１３に対する、不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの２１倍である。Ａ３Ｄ８に対する、不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの１７倍である。Ｈ９０に対する、不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの９倍である。ＩＭ７に対する、不安定プラークの内皮細胞の表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの８倍である。
３）リガンド／抗体に対する、プラーク外部のマクロファージの表面上のＣＤ４４の親和性と、動脈不安定プラーク内部のマクロファージのものとの比較
モデルマウスの腹腔内マクロファージ及び動脈不安定プラーク内部のマクロファージを採取し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度の、アミノフルオレセインで標識されたリガンド／抗体を添加し、試料を、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて、ＤＭＥＭ（体積分率が１０％の仔ウシ血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを含む）で培養した。３０分後、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、フローサイトメトリー（CytoFLEX、Beckman Coulter社、アメリカ合衆国）で決定し、両細胞の表面に対するＦＬ－ＨＡの結合力積算値を算出した（リガンド／抗体に対する、プラーク外部のマクロファージの表面上のＣＤ４４の親和性を１とする）。結果は図１９に示されている。
図１９に示されているように、動脈不安定プラーク内部のマクロファージの表面上のＣＤ４４－ＨＡの結合力は、プラーク外部のマクロファージの表面上のＣＤ４４－ＨＡの結合力のおよそ４０倍である。これは、内部環境の炎症性因子などの因子により、動脈不安定プラーク内部のマクロファージの表面上のＣＤ４４も活性化され、ＨＡに対する親和性が著しく増加されていることを示す。
ＣＤ４４の他のリガンドは、ＨＡと同様の結果を示す。ＧＡＧに対する、不安定プラークのマクロファージの表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの３３倍である。コラーゲンに対する、不安定プラークのマクロファージの表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの３８倍である。ラミニンに対する、不安定プラークのマクロファージの表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの３７倍である。フィブロネクチンに対する、不安定プラークのマクロファージの表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のもの３５倍である。セレクチンに対する、不安定プラークのマクロファージの表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの３３倍である。オステオポンチンに対する、不安定プラークのマクロファージの表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの３３倍である。
同様の結果が、ＣＤ４４のモノクローナル抗体で観察された。ＨＩ４４ａに対する、不安定プラークのマクロファージの表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの１７倍である。ＨＩ３１３に対する、不安定プラークのマクロファージの表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの２０倍である。Ａ３Ｄ８に対する、不安定プラークのマクロファージの表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの１６倍である。Ｈ９０に対する、不安定プラークのマクロファージの表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの９倍である。ＩＭ７に対する、不安定プラークのマクロファージの表面上のＣＤ４４の結合力積算値は、正常細胞のものの１０倍である。
上記の実験の結果に基づくと、以下の結論を導き出すことができる：正常細胞（正常動脈血管壁の内皮細胞、プラーク外部のマクロファージなど）と比較して、不安定プラークの細胞（動脈不安定プラークの発生にとって重要である内皮細胞、マクロファージなどを含む）の表面上のＣＤ４４の密度が著しく増加され、リガンドに対するその親和性が著しく増強され、したがってリガンドに対する、動脈不安定プラーク内部のＣＤ４４の特異的親和性は、正常細胞のものよりも非常に高く、そのため、不安定プラークを標的とするための本発明のセラソーム送達系の優れた標的として非常に有利である。
実験例３：動脈不安定プラークに対する、本発明のロスバスタチン送達系ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔの効果に関するインビボでの実験
ヒアルロン酸（ＨＡ）及びセレクチン（ＳＰ）は、ＣＤ４４のリガンドであり、不安定プラークを標的とすることができる。ロスバスタチン（Ｒ）は、プラークを縮小させることができ、膜貫通ペプチド（Ｔａｔ）は、薬物の局所的な浸透及び凝集を増加させることができる。この例の目的は、動脈不安定プラークに対する、本発明に記載のＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔ担体送達系のインビボでの治療効果を検証することである。
実験方法：
（１）遊離ロスバスタチンの生理食塩溶液を調製し、治療剤がロードされたリポソームナノ担体送達系を、上記の実施例１～３に記載の方法により調製した。
（２）動脈不安定プラークのＡｐｏＥ－／－マウスモデルの確立：
ＳＰＦグレードＡｐｏＥ－／－マウス（４２匹のマウス、５～６週齢、体重２０±１ｇ）を、実験動物として得た。マウスには、４週間にわたって、適応型高脂肪食（脂肪１０％（ｗ／ｗ）、コレステロール２％（ｗ／ｗ）、コール酸ナトリウム０．５％（ｗ／ｗ）、残りは通常のマウス飼料）を与え、その後１％ペントバルビタールナトリウム（１ｍｇのペントバルビタールナトリウムを１００ｍｌの生理食塩水に添加することにより調製）を４０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射することにより麻酔をかけた。その後、マウスを背臥位で外科用プレートに固定し、７５％（ｖ／ｖ）アルコールで頸部の周りを消毒し、頸部皮膚を縦に切り、前頸部腺をざっくりと分離した。拍動左総頸動脈を気管の左側に観察することができる。総頚動脈を、分岐点まで注意深く分離した。長さ２．５ｍｍ及び内径０．３ｍｍのシリコーンカニューレを、左総頚動脈の外側周囲に留置した。カニューレの近位及び遠位セグメントを狭窄させ、細糸で固定した。局所的に締め付けると、近位端での急速な血流が引き起こされて剪断力が増加し、したがって血管の内膜が損傷する。頸動脈を再配置し、頸部皮膚を断続的に縫合した。手術は全て１０×実体顕微鏡下で実施した。手術から覚醒したら、マウスをケージに戻し、周囲温度を２０～２５℃に維持し、光を１２時間／１２時間の明／暗サイクルで維持した。手術後４週目に、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）（０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水で１ｍｇ／ｋｇ、Sigma社、アメリカ合衆国）を、１０週間にわたって週２回腹腔内注射して、慢性炎症を誘導した。手術後８週目に、マウスを、６時間／日、１週当たり５日、合計６週間にわたって５０ｍｌシリンジに入れ（十分な換気が確保されている）、拘束による精神的ストレスを誘発させた。アテローム性動脈硬化不安定プラークのマウスモデルは、手術後１４週目に完成した。
（３）実験動物のグループ化及び治療：
実験動物を、各群６匹マウスで以下の群に無作為に分けた。
不安定プラークモデルの対照群：この群の動物はいかなる治療処置も受けない。
ロスバスタチンの胃内投与群：体重１ｋｇ当たり１０ｍｇロスバスタチン用量の胃内投与による治療。
ロスバスタチンの静脈内投与群：体重１ｋｇ当たり０．６６ｍｇロスバスタチン用量の静脈内投与による治療。
ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ群：体重１ｋｇ当たり０．６６ｍｇロスバスタチン用量の静脈内投与による治療。
ＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰ群：体重１ｋｇ当たり０．６６ｍｇのロスバスタチン用量の静脈内投与による治療。
ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔ群：体重１ｋｇ当たり０．６６ｍｇロスバスタチン用量の静脈内投与による治療。
不安定プラークモデルの対照群を除いて、治療群は、１日おきに合計５回の処置で治療した。治療前及び治療後に各群の動物の頚動脈ＭＲＩスキャンを実施して、プラーク面積及び管腔面積を検出し、プラーク進行のパーセンテージを算出した。
プラーク進行のパーセンテージ＝（治療後プラーク面積－治療前のプラーク面積）／管腔面積。
実験結果：
図２０は、動脈不安定プラークに対する、本発明の担体送達系ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔのインビボでの治療効果を示す。図示されているように、高脂肪食給餌中（１０日間）、対照群（いかなる治療もしない）のアテローム性動脈硬化症は３６．２３％進行した。ロスバスタチンの胃内投与は、プラークの進行を遅延させることができるが、それでも３３．９％進行する。ロスバスタチンの静脈内投与も、プラークの進行を遅延させることができるが、それでも３２．４６％進行する。しかしながら、標的ナノ薬物送達療法は、プラークの進行を著しく阻害し、さらに縮小させ、プラーク容積を低下させた。ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ群はプラークを１０．８７％消失させ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＳＰはプラークを８．７４％消失させ、ＬＰ１－（Ｒ）－ＨＡ／Ｔａｔ群はプラークを１３．２％消失させた。
まとめると、遊離ロスバスタチンは、胃内投与で与えられるか又は静脈内投与で与えられるかに関わらず、マウスの動脈不安定プラークにある程度の治療効果を示すが、不安定プラークの成長継続を防止することができない。しかしながら、ロスバスタチンを本発明のナノ送達系に製剤化すると、不安定プラークに対する治療効果が著しく向上し、プラーク成長（狭窄プラーク）を縮小させる治療効果が達成される。機能的修飾を有するナノ系は、より良好な効果を示す。
実験例４：動脈不安定プラークに対する、本発明の送達系ＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７、ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７の効果に関するインビボでの実験
ヒアルロン酸（ＨＡ）及びＩＭ７は、ＣＤ４４のリガンドであり、不安定プラークを標的とすることができる。アトルバスタチン（Ａｔ）はプラークを縮小させることができ、自己ペプチド（ＳＥＰ）は、薬物の局所的な浸透及び凝集を増加させることができ、ｍｉＲＮＡ－３３ａは、コレステロール流出を増加させることができる。この例の目的は、動脈不安定プラークに対する、本発明に記載のＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７、ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７担体送達系のインビボでの治療効果を検証することである。
実験方法：
（１）遊離アトルバスタチンの生理食塩溶液を調製し、治療剤がロードされたリポソームナノ担体送達系を、上記の実施例４～６に記載の方法により調製した。
（２）動脈不安定プラークのＡｐｏＥ－／－マウスモデルを、実験例４にしたがって確立した。
（３）実験動物のグループ化及び治療：
実験動物を、各群６匹マウスで以下の群に無作為に分けた。
不安定プラークモデルの対照群：この群の動物はいかなる治療処置も受けない。
アトルバスタチンの胃内投与群：体重１ｋｇ当たり２０ｍｇアトルバスタチン用量の胃内投与による治療。
アトルバスタチンの静脈内投与群：体重１ｋｇ当たり１．２ｍｇアトルバスタチン用量の静脈内投与による治療。
ＰＥＧを含まないＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡ群：体重１ｋｇ当たり１．２ｍｇアトルバスタチン用量の静脈内投与による治療。
ＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡ群：体重１ｋｇ当たり１．２ｍｇアトルバスタチン用量の静脈内投与による治療。
ＬＰ２－（Ａｔ）－ＩＭ７群：体重１ｋｇ当たり１．２ｍｇアトルバスタチン用量の静脈内投与による治療。
ＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７群：体重１ｋｇ当たり１．２ｍｇアトルバスタチン用量の静脈内投与による治療。
ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７群：体重１ｋｇ当たり１．２ｍｇアトルバスタチン用量の静脈内投与による治療。
不安定プラークモデルの対照群を除いて、治療群は、１日おきに合計５回の処置で治療した。治療前及び治療後に各群の動物の頚動脈ＭＲＩスキャンを実施して、プラーク面積及び管腔面積を検出し、プラーク進行のパーセンテージを算出した。
プラーク進行のパーセンテージ＝（治療後プラーク面積－治療前のプラーク面積）／管腔面積。
実験結果：
図２１は、動脈不安定プラークに対する、本発明の担体送達系ＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７、ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７のインビボでの治療効果を示す。図示されているように、高脂肪食給餌中（１０日間）、対照群（いかなる治療もしない）のアテローム性動脈硬化症は３４．８７％進行した。アトルバスタチンの胃内投与は、プラークの進行を遅延させることができるが、それでも３３．２１％進行する。アトルバスタチンの静脈内投与も、プラークの進行を遅延させることができるが、それでも３２．９８％進行した。しかしながら、標的ナノ薬物送達療法は、プラークの進行を著しく阻害し、さらに縮小させ、プラーク容積を低下させた。ＰＥＧを含まないＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡ群は、プラークを６．９％消失させ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＨＡ群は、プラークを１２．６５％消失させ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＩＭ７群はプラークを５．１％消失させ、ＬＰ２－（Ａｔ）－ＳＥＰ／ＩＭ７は、プラークを１２．４３％消失させ、ＬＰ２－（Ａｔ／ｍｉＲＮＡ－３３ａ）－ＩＭ７ｔ群は、プラークを１４．２２％消失させた。
まとめると、遊離アトルバスタチンは、胃内投与で与えられるか又は静脈内投与で与えられるかに関わらず、マウスの動脈不安定プラークにある程度の治療効果を示すが、不安定プラークの成長継続を防止することができない。しかしながら、アトルバスタチンを本発明のリポソームナノ担体送達系に製剤化すると、不安定プラークに対する治療効果が著しく向上し、プラーク成長（狭窄プラーク）を縮小させる治療効果が達成される。ＰＥＧ又はＳＥＰ機能的修飾を有するナノ系は、より良好な効果を示し、スタチン及び核酸がロードされたナノ担体は、有意な効果を示す。
実験例５：動脈不安定プラークに対する、本発明の送達系ＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮの効果（ＣＴトレース及び治療の二重機能）に関するインビボでの実験
オステオポンチン（ＯＰＮ）は、ＣＤ４４のリガンドであり、不安定プラークを標的とすることができる。ロスバスタチン（Ｒ）はプラークを縮小させることができ、ナノ金（Ａｕ ＮＰ）はＣＴトレーサーである。この例の目的は、動脈不安定プラークに対する、本発明に記載されているＣＴトレーサー及びロスバスタチンがロードされたナノ担体送達系のインビボでのトレース効果及び治療効果を検証することである。
実験方法：
（１）遊離ロスバスタチンの生理食塩溶液を調製し、ＣＴトレーサー及び治療剤がロードされたリポソームナノ担体送達系を、上記の実施例７に記載の方法により調製した。
（２）動脈不安定プラークのＡｐｏＥ－／－マウスモデルを、実験例４に従って確立した。
（３）実験動物での不安定プラークのトレース：
実験動物を、各群６匹マウスで以下の群に無作為に分けた。
遊離ナノ金群：ナノ金の用量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重だった。
ＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮ群：ナノ金の用量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重だった。
ＬＰ２－（イオプロミド）－ＯＰＮ群：イオプロミドの用量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重だった。
ＬＰ２－（イオジキサノール）－ＯＰＮ群：イオジキサノールの用量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重だった。
ＬＰ２－（ヨードフルオロアルコール）－ＯＰＮ群：ヨードフルオロアルコールの用量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重だった。
対応するトレーサーを各実験群中の動物の尾静脈に注射した。投与前及び投与２時間後にＣＴ画像法を実施して、各群のアテローム性動脈硬化不安定プラークを観察により特定した。
（４）実験動物のグループ化及び治療：
実験動物を、各群６匹マウスで以下の群に無作為に分けた。
不安定プラークモデルの対照群：この群の動物はいかなる治療処置も受けない。
ロスバスタチンの胃内投与群：体重１ｋｇ当たり１０ｍｇロスバスタチン用量の胃内投与による治療。
ロスバスタチンの静脈内投与群：体重１ｋｇ当たり０．６７ｍｇロスバスタチン用量の静脈内投与による治療。
ＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮ群：体重１ｋｇ当たり０．６７ｍｇロスバスタチン用量の静脈内投与による治療。
不安定プラークモデルの対照群を除いて、治療群は、１日おきに合計５回の処置で治療した。治療前及び治療後に各群の動物の頚動脈ＭＲＩスキャンを実施して、プラーク面積及び管腔面積を検出し、プラーク進行のパーセンテージを算出した。
プラーク進行のパーセンテージ＝（治療後プラーク面積－治療前のプラーク面積）／管腔面積。
実験結果：
図２２は、動脈不安定プラークに対する、トレーサーがロードされた本発明のリポソーム送達系のインビボでのトレース効果を示す。図示されているように、遊離ナノ金粒子は、マウスの動脈不安定プラークに対してある程度のトレース効果を示す。遊離ナノ金粒子と比較して、ナノ金、イオプロミド、イオジキサノール、ヨードフルオロアルコールを、標的指向性リポソーム送達系に製剤化すると、不安定プラークに対するトレース効果が有意に向上される。要約すると、その表面が標的指向性リガンドで修飾されている本発明のリポソーム送達系での投与は、遊離ナノ金粒子の投与と比較して、不安定プラークに対するナノ金の認識効果を向上させ、より良好なトレース効果をもたらすことができる。
図２３は、動脈不安定プラークに対する、本発明の担体送達系ＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮのインビボでの治療効果を示す。図示されているように、高脂肪食給餌中（１０日間）、対照群（いかなる治療もしない）のアテローム性動脈硬化は３１．２３％進行した。ロスバスタチンの胃内投与は、プラークの進行を遅延させることができるが、それでも３０．９％進行する。ロスバスタチンの静脈内投与も、プラークの進行を遅延させることができるが、それでも２５．３４％進行した。しかしながら、標的ナノ薬物送達療法は、プラークの進行を有意に阻害し、さらに縮小させ、プラーク容積を低下させた。ＬＰ２－（ＡｕＮＰ／Ｒ）－ＯＰＮ群はプラークを８．３２％消失させた。
まとめると、遊離ロスバスタチンは、胃内投与で与えられるか又は静脈内投与で与えられるかに関わらず、マウスの動脈不安定プラークにある程度の治療効果を示すが、不安定プラークの成長継続を防止することができない。しかしながら、ロスバスタチン及びナノ金を本発明のナノ送達系に製剤化すると、不安定プラークに対する診断効果及び治療効果が有意に向上し、高リスク患者への早期警告の役割を果たし、プラーク成長（狭窄プラーク）を縮小させる治療効果が達成される。
実験例６：動脈不安定プラーク（ＭＲＩトレース）及び抗炎症治療に対する、本発明の送達系ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａ、ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａの効果に関するインビボでのトレース実験
モノクローナル抗体（ＨＩ４４ａ）は、ＣＤ４４のリガンドであり、不安定プラークを標的とすることができる。デキサメタゾン（ＤＸＭＳ）は抗炎症効果及びプラーク進行阻害効果を有し、Ｆｅ３Ｏ４はＭＲＩトレーサーである。この例の目的は、動脈不安定プラークに対する、本発明に記載されているＭＲＩトレーサー及びデキサメタゾンがロードされたナノ担体送達系のインビボでのトレース効果及び治療効果を検証することである。加えて、ガドテル酸メグルミン、ガドジアミド、及びガドペンテト酸も、標的ＭＲＩトレース効果を示すナノ調製物へと調製することができる。
（１）ＭＲＩトレーサー及び治療剤がロードされたリポソームナノ担体送達系を、上記の実施例８～９に記載の方法により調製した。
（２）動脈不安定プラークのＡｐｏＥ－／－マウスモデルを、実験例４に従って確立した。
（３）実験動物での不安定プラークのトレース：
実験動物を、各群６匹マウスで以下の群に無作為に分けた。
遊離Ｆｅ３Ｏ４群：Ｆｅ３Ｏ４の用量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重だった。
ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａ群：Ｆｅ３Ｏ４の用量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重だった。
ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａ群：Ｆｅ３Ｏ４の用量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重だった。
ＬＰ１－（ガドテル酸メグルミン）－ＨＩ４４ａ群：ガドテル酸メグルミンの用量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重だった。
ＬＰ１－（ガドジアミド）－ＨＩ４４ａ群：ガドジアミドの用量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重だった。
ＬＰ１－（ガドペンテト酸）－ＨＩ４４ａ群：ガドペンテト酸の用量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重だった。
各実験群の動物の尾静脈に、対応するトレーサーを注射し、投与前及び投与２時間後にＭＲＩ画像法を実施して、各群のアテローム性動脈硬化不安定プラークを観察により特定した。
（４）実験動物のグループ化及び治療：
実験動物を、各群６匹マウスで以下の群に無作為に分けた。
不安定プラークモデルの対照群：この群の動物はいかなる治療処置も受けない。
ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａ群：体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇデキサメタゾン用量の静脈内投与による治療。
ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａ群：体重１ｋｇ当たり０．１μｍｏｌ ＩＬ－１０用量の静脈内投与による治療。
不安定プラークモデルの対照群を除いて、治療群は、１日おきに合計５回の処置で治療した。治療前及び治療後に各群の動物の頚動脈ＭＲＩスキャンを実施して、プラーク面積及び管腔面積を検出し、プラーク進行のパーセンテージを算出した。
プラーク進行のパーセンテージ＝（治療後プラーク面積－治療前のプラーク面積）／管腔面積。
実験結果：
図２４は、動脈不安定プラークに対する、トレーサーがロードされた本発明のリポソーム送達系のインビボでのトレース効果を示す。図示されているように、遊離Ｆｅ３Ｏ４粒子は、マウスの動脈不安定プラークに対してある程度のトレース効果を示す。遊離Ｆｅ３Ｏ４粒子と比較して、Ｆｅ３Ｏ４を、標的指向性リポソーム送達系に製剤化すると、不安定プラークに対するトレース効果が非常に有意に向上する。また、他のＭＲＩナノ造影剤を使用すると、不安定プラークのトレース効果は非常に良好である。要約すると、その表面が標的指向性リガンドで修飾されている本発明のリポソーム送達系での投与は、遊離ＭＲＩトレーサーの投与と比較して、不安定プラークに対するナノ金の認識効果を有意に向上させ、より良好なトレース効果をもたらすことができる。
図２５は、動脈不安定プラークに対する、本発明の担体送達系ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａ及びＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａのインビボでの治療効果を示す。図示されているように、高脂肪食給餌中（１０日間）、対照群（いかなる治療もしない）のアテローム性動脈硬化は２３．６５％進行した。しかしながら、標的ナノ薬物送達療法は、プラークの進行を有意に阻害し、さらに縮小させ、プラーク容積を低下させた。ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＤＸＭＳ）－ＨＩ４４ａ群は、プラークを９．５４％消失させた。ＬＰ１－（Ｆｅ３Ｏ４／ＩＬ－１０）－ＨＩ４４ａ群は、プラークを５．４３％消失させた。
まとめると、マウスの動脈不安定プラークの場合、デキサメタゾン又はＩＬ－１０を本発明のナノ送達系に製剤化すると、不安定プラークに対する診断効果及び治療効果が著しく向上し、高リスク患者への早期警告の役割を果たし、プラーク成長（狭窄プラーク）を縮小させる治療効果が達成される。Ｆｅ３Ｏ４の同時ロードは、疾患のＭＲＩ画像法及びリアルタイムモニタリングを達成することができる。
実験例７：動脈不安定プラークに対する、本発明の送達系ＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌの効果に関するインビボでの実験
アスピリン（Ａｓｐ）及びクロピドグレル（Ｃｌｏ）は抗血小板薬であり、心血管イベントに由来する血小板凝集及び死亡率を低減することができる。この例の目的は、動脈不安定プラークに対する、本発明に記載のＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌ担体送達系のインビボでの治療効果を検証することである。
実験方法：
（１）遊離アスピリン及びクロピドグレルの生理食塩溶液を調製し、治療剤がロードされたリポソームナノ担体送達系を、上記の実施例１０に記載の方法により調製した。
（２）動脈不安定プラークのＡｐｏＥ－／－マウスモデルの確立：ＡｐｏＥ－／－マウスに高脂肪食を３０週間給餌して、マウスの全身動脈にアテローム性動脈硬化プラークを形成させ、蛇毒を与えて不安定プラークの破裂を誘導し、急性冠症候群を形成した。
（３）実験動物のグループ化及び治療：
実験動物を、各群１０匹マウスで以下の群に無作為に分割した。
不安定プラークモデルの対照群：この群の動物はいかなる治療処置も受けない。
アスピリン及びクロピドグレルの胃内投与群：体重１ｋｇ当たり１００ｍｇアスピリン及び体重１ｋｇ当たり７５ｍｇクロピドグレルの用量の胃内投与による治療。
ＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌ群：体重１ｋｇ当たり１０ｍｇアスピリン及び体重１ｋｇ当たり７．５ｍｇクロピドグレルの用量の静脈内投与による治療。
不安定プラークモデルの対照群を除いて、治療群は、１日おきに合計５回の処置で治療した。各群の動物について、１か月のマウス死亡率を観察した。マウスの出血時間（ＢＴ，bleeding time）を尾部切断により検出した。
実験結果：
図２６は、動脈不安定プラークに対する、本発明の担体送達系ＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌのインビボでの治療効果を示す。図示されているように、対照群（いかなる治療もしない）のマウス死亡率は、５０％だった。アスピリン及びクロピドグレルの胃内投与は、死亡率を３０％に低減させることができる。ＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌ療法は死亡率を１０％に低減させることができる。出血時間の点では、ＬＰ１－（Ａｓｐ／Ｃｌｏ）－Ｃｏｌ群は、有意に延長を示さなかったが、アスピリン及びクロピドグレルの胃内投与は、マウスの出血時間を有意に長期化させた。
まとめると、経口二重抗血小板療法は、不安定プラークが破裂した動物の死亡率を低減することができるが、出血時間を長期化させ、出血リスクを増加させる場合がある。しかしながら、ナノ送達系への抗血小板薬のロードは、経口薬物よりも良好な効果を示し、出血リスクを増加させない。
実験例８：動脈不安定プラークに対する、本発明の送達系ＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ）－ＯＰＮの効果に関するインビボでの実験
オステオポンチン（ＯＰＮ）は、ＣＤ４４のリガンドであり、不安定プラークを標的とすることができる。ロスバスタチン（Ｒ）は、プラークを縮小させることができ、フッ素１８（１８Ｆ）標識フルデオキシグルコース（Ｆ－ＦＤＧ）は、放射性同位体トレーサーである。この例の目的は、動脈不安定プラークに対する、本発明に記載されている放射性同位体トレーサーがロードされたリポソームナノ担体送達系のインビボでのトレース効果及び治療効果を検証することである。
実験方法：
（１）遊離ロスバスタチンの生理食塩溶液を調製し、放射性同位体トレーサー及び治療剤がロードされたリポソームナノ担体送達系を、上記の実施例１１に記載の方法により調製した。
（２）動脈不安定プラークのＡｐｏＥ－／－マウスモデルを、実験例４に従って確立した。
（３）実験動物での不安定プラークのトレース：
実験動物を、各群６匹マウスで以下の群に無作為に分割した。
遊離Ｆ－ＦＤＧ群：Ｆ－ＦＤＧの用量は２ｍＳｖ／ｋｇ体重だった。
ＬＰ１－（Ｆ－ＦＤＧ）－ＯＰＮ群：Ｆ－ＦＤＧの用量は２ｍＳｖ／ｋｇ体重だった。
ＬＰ１－（９９ｍＴｃ）－ＯＰＮ群：９９ｍＴｃの用量は２ｍＳｖ／ｋｇ体重だった。
ＬＰ１－（Ｉ－１３１）－ＯＰＮ群：Ｉ－１３１の用量は２ｍＳｖ／ｋｇ体重だった。
各実験群の動物の尾静脈に、対応するトレーサーを注射し、投与前及び投与２時間後に放射性同位体画像法を実施して、各群のアテローム性動脈硬化不安定プラークを観察により特定した。
実験結果：
図２７は、動脈不安定プラークに対する、放射性同位体トレーサーがロードされた本発明のリポソーム送達系のインビボでのトレース効果を示す。図示されているように、遊離Ｆ－ＦＤＧは、マウスの動脈不安定プラークに対していかなるトレース効果も示さない。遊離Ｆ－ＦＤＧと比較して、テクネチウム９９（９９ｍＴｃ）、ヨウ素１３１（Ｉ－１３１）を、標的指向性リポソーム送達系に製剤化すると、不安定プラークに対するトレース効果が非常に有意に向上する。要約すると、その表面が標的指向性リガンドで修飾されている本発明のリポソーム送達系での投与は、遊離Ｆ－ＦＤＧと比較して、不安定プラークに対するナノ金の認識効果を有意に向上させ、より良好なトレース効果をもたらすことができる。
本発明の種々の態様が、上記に記載の実施形態により例証されている。上記に記載の実施形態は例を示すものに過ぎず、実施形態を制限することは意図されていないことは明らかである。当業者であれば、上記の説明に照らして種々の形態の他のバリエーション又は改変を実現することができる。実施を全て網羅する必要性もないし、その方法も存在しない。そこから生じる明白な変更又はバリエーションは、依然として本発明の範囲内にある。

Claims (17)

  1. 不安定プラーク又は前記不安定プラークに関連する疾患の診断、予防、及び／又は治療に使用するためのリポソームナノ担体送達系であって、前記ナノ担体の表面は、標的指向性リガンドにより部分的に修飾されており、前記標的指向性リガンドが、前記不安定プラークの細胞表面上のＣＤ４４分子と特異的に結合することが可能なリガンドであり、
    前記標的指向性リガンドが、不安定プラークの細胞表面上のＣＤ４４分子と特異的に結合することが可能なヒアルロン酸及びヒアルロン酸誘導体から選択され、
    前記ヒアルロン酸が、１～２０ＫＤａの範囲の分子量を有し、
    ナノ担体に、不安定プラーク又は前記不安定プラークに関連する疾患を診断、予防、及び／又は治療するための物質がロードされている、
    前記リポソームナノ担体送達系。
  2. 前記ナノ担体の表面には他の修飾がさらに施されており、前記他の修飾が、ＰＥＧ、膜貫通ペプチド、及び自己ペプチドからなる群から選択される１又は２以上による修飾であることを特徴とする、請求項１に記載のナノ担体送達系。
  3. リポソーム担体が、小型単層ベシクル、大型単層ベシクル、及び多層ベシクルからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のナノ担体送達系。
  4. 不安定プラーク又は前記不安定プラークに関連する疾患を診断するための前記物質が、トレーサーであり、並びに、
    前記トレーサーが、ＣＴトレーサー、ＭＲＩトレーサー、及び放射性同位体トレーサーから選択されることを特徴とする、
    請求項１～３のいずれか一項に記載のナノ担体送達系。
  5. 前記ＣＴトレーサーが、ヨウ素に基づくナノスケール造影剤、金に基づくナノスケール造影剤、酸化タンタルに基づくナノスケール造影剤、ビスマスに基づくナノスケール造影剤、ランタニドに基づくナノスケール造影剤、若しくは類似の構造を有する他のトレーサーから選択され；並びに/又は、
    前記ＭＲＩトレーサーが、縦緩和造影剤及び横緩和造影剤から選択され；並びに、
    前記ＭＲＩトレーサーが、常磁性造影剤、強磁性造影剤、及び超常磁性体造影剤から選択され；並びに／又は、
    前記放射性同位体トレーサーが、炭素１４（１４Ｃ）、炭素１３（１３Ｃ）、リン３２（３２Ｐ）、硫黄３５（３５Ｓ）、ヨウ素１３１（１３１Ｉ）、水素３（３Ｈ）、テクネチウム９９（９９Ｔｃ）、及びフッ素１８（１８Ｆ）により標識されたフルデオキシグルコースから選択される；
    ことを特徴とする、請求項４に記載のナノ担体送達系。
  6. 前記ＣＴトレーサーが、イオヘキソール、イオカルム酸、イオベルソール、イオジキサノール、イオプロミド、イオビトリドール、イオメプロール、イオパミドール、イオキシラン、アセトリゾ酸、イオジパミド、イオベンザム酸、イオグリカム酸、ジアトリゾ酸、イオタラム酸ナトリウム、パントパック、イオパノ酸、ヨードアルフィオン酸、アセトリゾ酸ナトリウム、ヨードメタム酸ナトリウム、プロピリオドン、ジオドン、イオトロラン、イオピドール、エンドグラフィン、イオタラム酸、ジアトリゾ酸メグルミン、メトリゾ酸、メトリザミド、ヨウ素化油、若しくはエチオジン化油、又は類似の構造を有する他のトレーサーから選択され；並びに/又は、
    前記ＭＲＩトレーサーが、Ｇｄ－ＤＴＰＡ及び直鎖状、環状ポリアミンポリカルボキシレートキレート剤及びそのマンガンポルフィリンキレート剤、巨大分子ガドリニウムキレート剤、生体巨大分子修飾ガドリニウムキレート剤、葉酸修飾ガドリニウムキレート剤、デンドリマー造影剤、リポソーム修飾造影剤、並びにガドリニウム含有フラーレン、若しくは類似の構造を有する他のトレーサーから選択され；並びに、前記ＭＲＩトレーサーが、ガドペンテト酸ジメグルミン、ガドテル酸メグルミン、ガドベン酸ジメグルミン、ガドジアミド、クエン酸鉄アンモニウム発泡性顆粒、常磁性酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰ）、若しくは類似の構造を有する他のトレーサーから選択され；並びに/又は、
    前記放射性同位体トレーサーが、フッ素１８標識フルデオキシグルコースである、
    請求項４又は５に記載のナノ担体送達系。
  7. 不安定プラーク又は前記不安定プラークに関連する疾患を診断、予防、及び／又は治療するための物質が、薬物、ポリペプチド、核酸、及びサイトカインからなる群から選択される１又は２以上であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載のナノ担体送達系。
  8. ナノ担体送達系に、ＣＤ４４活性化因子がロードされることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載のナノ担体送達系。
  9. 前記ＣＤ４４活性化因子が、ＣＤ４４抗体ｍＡｂ、ＩＬ５、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＴＮＦ－α、又はＬＰＳである、請求項８に記載のナノ担体送達系。
  10. 前記ナノ担体に、不安定プラーク又は前記不安定プラークに関連する疾患を診断するための物質、不安定プラーク又は前記不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための物質、任意でＣＤ４４活性化因子、並びに、任意で、不安定プラークの細胞表面上のＣＤ４４分子と特異的に結合することが可能な低分子ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体が同時にロードされていることを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載のナノ担体送達系。
  11. 物質が、不安定プラーク又は前記不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための物質であり；
    不安定プラーク又は前記不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための前記物質が、スタチン、フィブレート、抗血小板薬、ＰＣＳＫ９阻害剤、抗凝固薬、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）、カルシウムイオンアンタゴニスト、ＭＭＰ阻害剤、β受容体遮断剤、グルココルチコイド、及び他の抗炎症性物質、及び上記の薬物又は上記の物質の活性調製物を含む、それらの薬学的に許容される塩、並びに内在性抗炎症サイトカインからなる群から選択される１又は２以上である；
    ことを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載のナノ担体送達系。
  12. 不安定プラーク又は前記不安定プラークに関連する疾患を予防及び／又は治療するための前記物質が、ロバスタチン；アトルバスタチン；ロスバスタチン；フルバスタチン；ピタバスタチン；プラバスタチン；ベザフィブレート；シプロフィブレート；クロフィブレート；ゲムフィブロジル；フェノフィブレート；プロブコール；抗ＰＣＳＫ９抗体；アリロクマブ；ボコシズマブ；ＲＧ７６５２；ＬＹ３０１５０１４；及びＬＧＴ－２０９；又は、アドネクチン；アンチセンスＲＮＡｉオリゴヌクレオチド；マイクロＲＮＡ－３３ａ、マイクロＲＮＡ－２７ａ／ｂ、マイクロＲＮＡ－１０６ｂ、マイクロＲＮＡ－３０２、マイクロＲＮＡ－７５８、マイクロＲＮＡ－１０ｂ、マイクロＲＮＡ－１９ｂ、マイクロＲＮＡ－２６、マイクロＲＮＡ－９３、マイクロＲＮＡ－１２８－２、マイクロＲＮＡ－１４４、マイクロＲＮＡ－１４５アンチセンス鎖；及びそれらの核酸類似体；アスピリン；アセメタシン；トロキセルチン；ジピリダモール；シロスタゾール；塩酸チクロピジン；オザグレルナトリウム；クロピドグレル；プラスグレル；シロスタゾール；ベラプロストナトリウム；チカグレロール；カングレロール；チロフィバン；エプチフィバチド；アブシキシマブ；未分画ヘパリン；クレキサン；フラキシパリン；フォンダパリヌクスナトリウム；ワルファリン；ダビガトラン；リバーロキサバン；アピキサバン；エドキサバン；ビバリルジン；エノキサパリン；ダルテパリン；アルデパリン；ビスヒドロキシクマリン；硝酸クマリン；クエン酸ナトリウム；ヒルジン；アルガトロバン；ベナゼプリル；カプトプリル；エナラプリル；ペリンドプリル；ホシノプリル；リシノプリル；モエキシプリル；シラザプリル；ペリンドプリル；キナプリル；ラミプリル；トランドラプリル；カンデサルタン；エプロサルタン；イルベサルタン；ロサルタン；テルミサルタン；バルサルタン；オルメサルタン；タソサルタン；ニフェジピン；ニカルジピン；ニトレンジピン；アムロジピン；ニモジピン；ニソルジピン；ニルバジピン；イスラジピン；フェロジピン；ラシジピン；ジルチアゼム；ベラパミル；クロルヘキシジン；ミノサイクリン；ＭＭＩ－１６６；メトプロロール；アテノロール；ビソプロロール；プロプラノロール；カルベジロール；バチマスタット；マリマスタット；プリノマスタット；ＢＭＳ－２７９２５１；ＢＡＹ １２－９５６６；ＴＡＡ２１１；ＡＡＪ９９６Ａ；ナセトラピブ；エバセトラピブ；トルセトラピブ；ダルセトラピブ；プレドニゾン；メチルプレドニゾロン；ベータメタゾン；ジプロピオン酸ベクロメタゾン；ジプロスパン；プレドニゾロン；ヒドロコルチゾン；デキサメタゾン；及びそれらの有効な断片又は薬学的に許容される塩類からなる群から選択される１又は２以上である、請求項１１に記載のナノ担体送達系。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の不安定プラークを標的とするためのナノ担体送達系を調製するための方法であって、
    （１）適正量のリン脂質分子を適切な有機溶媒に溶解し、薄膜水和法によりリポソームナノ担体を調製するステップ；
    （２）不安定プラーク又は前記不安定プラークに関連する疾患を診断、予防、及び／又は治療するための水溶性物質を含んでいてもよい水性媒体を、ステップ（１）で得られたナノ担体送達系に添加して粗懸濁物を形成するステップ；
    （３）標的指向性リガンドを適切な緩衝溶液溶媒に溶解し、ステップ（２）で得られた担体分子を、反応のために前記標的指向性リガンド溶液に添加して、ナノ担体送達系を得るステップ；
    （４）ステップ（３）で得られた前記粗懸濁物に含まれる、前記不安定プラーク又は前記不安定プラークに関連する疾患を診断、予防、及び／又は治療するための未ロード物質を透析により除去して、ロード済ナノ担体送達系を得る任意のステップ
    を含むことを特徴とする、前記方法。
  14. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のナノ担体送達系及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬。
  15. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のナノ担体送達系を含むことを特徴とする診断用調製物。
  16. 不安定プラークが、易破裂性プラーク、易びらん化プラーク、及び部分的石灰化結節性病変からなる群から選択される１又は２以上である；
    ことを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載のナノ担体送達系。
  17. 前記不安定プラークに関連する疾患が、アテローム性動脈硬化症、冠動脈硬化性心疾患（急性冠症候群、無症候性心筋虚血－潜在性冠動脈心疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血性心疾患、突然死、及びステント内再狭窄を含む）、脳動脈硬化症（脳卒中を含む）、末梢血管アテローム性動脈硬化症（末梢動脈閉塞性疾患、網膜の動脈硬化症、頸動脈アテローム性動脈硬化症、腎臓アテローム性動脈硬化症、下肢アテローム性動脈硬化症、上肢アテローム性動脈硬化症、及びアテローム性動脈硬化インポテンスを含む）、大動脈解離、血管腫、血栓塞栓症、心不全、及び心原性ショックからなる群から選択される１又は２以上である、
    請求項１６に記載のナノ担体送達系。
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