KR20200111185A - 활성 cd44 분자를 표적하기 위한 리포솜 나노캐리어 전달 시스템, 이의 제조 방법, 및 이의 용도 - Google Patents

활성 cd44 분자를 표적하기 위한 리포솜 나노캐리어 전달 시스템, 이의 제조 방법, 및 이의 용도 Download PDF

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KR20200111185A
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취안 마
지에팡 순
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베이징 이노 메디슨 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 활성 CD44 분자를 표적하기 위한 리포솜 나노캐리어 전달 시스템, 이의 제조 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다. 리포솜의 표면은 표적화 리간드에 의해서 부분적으로 개질되고, 여기에서, 표적화 리간드는 활성 CD44 분자와 특별히 조합될 수 있는 리간드이다. 리포솜 나노캐리어 전달 시스템은 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하고, 방지하고, 치료하기 위해서 사용될 수 있다.

Description

활성 CD44 분자를 표적하기 위한 리포솜 나노캐리어 전달 시스템, 이의 제조 방법, 및 이의 용도
본 출원은 2018년 1월 22일자로 출원된 중국 특허출원 CN201810060265.9호의 이익을 주장하고, 이의 전체 내용이 본원에서 참조로 통합된다.
본 발명은 표적화된 약물 전달의 기술분야에 속하고, 특히, 활성화된 CD44 분자를 표적하기 위한, 특히, 취약 플라크(vulnerable plaque)를 표적하기 위한 나노캐리어(nanocarrier) 및 특히 이의 리포솜 나노캐리어 전달 시스템(liposome nanocarrier delivery system)에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 나노캐리어, 특히, 리포솜 전달 시스템의 제조 방법, 특히, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환의 진단, 방지 및 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
현재, 주로 급성 심근경색(acute myocardial infarction) 및 급성 심장사(sudden cardiac death)를 포함하는 급성 심혈관 이벤트(acute cardiovascular event)가 인간 건강을 위협하는 첫 번째가 되었다. 통계에 따르면, 매년 세계적으로 급성 심혈관 이벤트로 약 2억명의 사람이 사망한다. 중국에서의 상황도 낙관적이지 않다. 700,000 명 초과의 사람이 매년 급성 심근경색 및 급성 심장사로 사망하며, 이는 중국 사람들의 건강을 심각하게 위협하는 가장 주목할 만한 질환 중 하나가 되고 있다. 연구에서는 급성 심근경색 및 급성 심장사의 대부분이 죽상동맥경화성 플라크에 의해서 유발되는 것으로 밝혀졌다. 1970년대 이래로, 만성 죽상동맥경화성 플라크가 급성 관상 증후군(acute coronary syndrome: ACS) 및 뇌졸중(stroke)을 유도하는 과정 및 메커니즘이 끊임없이 연구되었다.
1989년에, Muller와 그의 동료들(Circadian Variation and Triggers of Onset of Acute Cardiovascular Disease. Circulation. 1989; 79(4): 733-43 )은 "취약 플라크(vulnerable plaque)"의 개념을 제안하여, 그러한 플라크가 급성 심혈관 및 뇌혈관 이벤트의 대부분의 근본적인 원인임을 추정하였다. 취약 플라크("불안정한 플라크"로도 공지됨)는 혈전을 형성시키는 경향이 있거나, 파열되기 쉬운 플라크, 침식되기 쉬운 플라크 및 부분적으로 석회화된 결절성 병변을 포함한, "크리미널 플라크(criminal plaque)"로 신속하게 진행되지 쉬운 죽상동맥경화성 플라크(atherosclerotic plaque)를 의미한다. 매우 많은 연구에서, 심근경색 및 뇌졸중의 대부분이 가벼운 협착증 내지 중간의 협착증을 동반한 취약 플라크의 파열, 그에 이어진 혈전증에 의해서 유발됨이 밝혀졌다. Naghavi와 그의 동료들(New Developments in the Detection of Vulnerable plaque. Curr Atheroscler Rep. 2001; 3(2): 125-35)은 취약 플라크에 대한 조직학적 정의 및 기준을 제공하였다. 주된 기준은 활성 염증, 얇은 섬유 캡(thin fibrous cap) 및 큰 지질 코어, 표면에서의 혈소판 응집과 함께 내피세포 박리, 플라크 피셔 또는 병변(plaque fissure or lesion), 및 심각한 협착증을 포함한다. 이차적인 기준은 표면상의 석회화된 플라크(calcified plaque), 황색 및 광택이 나는 플라크, 플라크내 출혈(intraplaque hemorrhage), 및 양성 리모델링(positive remodeling)을 포함한다. 따라서, 취약 플라크에 대한 조기 개입이 중요하다. 그러나, 취약 플라크에 의해서 유발된 혈관 협착증의 정도가 일반적으로 높지 않아서 많은 환자들이 전구증상을 느끼지 못하므로, 임상에서의 취약 플라크의 조기 진단은 매우 어려워서 취약 플라크를 매우 위험하게 한다. 따라서, 급성 심근경색을 방지하고 치료하는데 있어서 해결해야될 시급한 문제는 취약 플라크를 가능한 한 조기에 어떻게 정확하게 확인하고 진단하여, 효과적인 개입이 수행될 수 있게 하는냐는 것이다.
현재, 취약 플라크의 진단을 위해서 일반적으로 사용되는 기술은 주로 관상동맥 조영술(coronary angiography), 혈관내 초음파(intravascular ultrasound: IVUS), 빛 간섭 단층촬영(optical coherence tomography: OCT) 등을 포함하지만, 이들 기술은 모두, 일정한 범위로 이들 기술의 임상 사용을 제한하는, 낮은 진단성 해상도 및 정확성, 그리고 높은 비용의 침습적 검사이다. 따라서, 현재, 취약 플라크에 대한 비-침습적 진단 기술 및 제제에 대한 급박한 요구가 있다.
또한, 취약 플라크를 치료하는 현재의 방법은 주로 스타틴(statin)(하이드록시메틸 글루타릴 보조효소 A (HMG-CoA) 환원효소 억제제), 아스피린, 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase: MMP) 억제제 및/또는 피브레이트(fibrate) 등의 전신 투여, 예컨대, 경구 투여를 통하고 있다. 이들 약물은 전신 혈액 지방(systemic blood fat)을 조절하고, 염증과 싸우고, 프로테아제 및 혈소판 생성을 억제하는 등등을 통해서 플라크 내의 지질을 감소시키고, 혈관 리모델링(vascular remodeling)을 개선시키는 등등에 의해서 플라크를 안정화시키는 작용을 한다. 그러나, 임상 적용에서, 취약 플라크를 치료하는 현재의 약물의 치료 효과는 만족스럽지 못한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 임상 실무에서 일반적으로 사용되는 스타틴은 경구로 투여되는 때에 비교적 낮은 생체이용성을 갖는데, 예컨대, 심바스타틴(simvastatin)의 경우 < 5%이고, 아토르바스타틴(atorvastatin)의 경우 약 12%이고, 로수바스타틴(rosuvastatin)의 경우 약 20%이다. 동물 실험에서는 또한, 스타틴의 투여량이 1 mg/kg 초과로 증가되는 때에만, 이들이 섬유 캡(fibrous cap)의 두께를 증가시킬 수 있고 플라크의 용적을 감소시킬 수 있는데, 이는 스타틴의 경구 투여의 안정성과 플라크를 역전시키는 이들의 효과가 병목현상에 직면하게 한다는 것이 확인되었다. 현재, 임상 시험에서 또한, 스타틴의 경구 투여에 의한 취약 플라크의 치료가 취약 플라크를 안정화시키기 위해서 심하게 많은 투여량을 필요로 하는 반면에, 스타틴의 전신의 많은 투여량은 또한 증가된 심각한 부작용 유발의 위험(예컨대, 비정상적인 간 기능, 횡문근 융해(rhabdomyolysis), 타입 II 당뇨병 등)이 있는 것으로 확인되었다.
기존의 전신 투여의 경우에, 일반적으로 활성 성분 중 단지 매우 작은 부분이, 약물이 신체에 들어간 후에, 병변 부위에서 실제 작용할 수 있다. 이는 약물의 효능을 제한하고 독성 부작용을 생성시키는 근본적인 원인이다. 표적화된 약물 전달 시스템은 표적화된 약물 전달의 능력을 갖는 약물 전달 시스템을 의미한다. 특정의 경로를 통해서 투여된 후에, 표적화된 약물 전달 시스템에 함유된 약물은 표적 프로브를 갖는 캐리어에 의해서 표적된 부위에서 특별히 풍부하다. 표적화된 약물 전달 시스템은 약물이 특별한 병변 부위를 표적하게 하고 표적 병변 부위에서 활성 성분을 방출하게 할 수 있다. 따라서, 표적화된 약물 전달 시스템은 표적 병변 부위에서 약물의 비교적 높은 농도를 유도할 수 있고 혈류 중에 약물 투여량을 감소시킬 수 있어서, 독성 부작용을 억제하면서 약물 효과를 개선시키고, 정상 조직 및 세포에 대한 손상을 감소시킬 수 있다.
취약 플라크의 진단 및 치료 분야에서, 나노캐리어를 표적화 리간드로 개질시킴으로써 취약 플라크를 진단하는 일부 기술이 또한 있다. 그러나, 취약 플라크를 표적하는 그러한 표적화 프로브의 주된 문제는 임상 실무에서 표적된 부위에 대한 이들 제제(preparation)의 불충분한 특이성이다. 예를 들어, 그러한 제제의 대부분의 경우에, 대식세포가 표적된 부위로서 선택되지만; 대식세포는 신체 전체에 걸쳐서 존재하기 때문에, 프로브의 표적화 특이성이 만족스럽지 못하다. 따라서, 취약 플라크를 표적하는 표적화 제제의 개발에서의 어려움은 취약 플라크 내의 세포에서의 유의한 표적화 특이성을 갖는 표적된 부위의 발견에 있다.
CD44는 림프구, 단구, 내피세포 등의 표면 상에 광범위하게 분포하는 일종의 유착 분자이다. CD44 분자의 주요 리간드는 히알루론산("HA"로 약칭됨)이다. CD44를 발현하는 세포의 활성화 상태를 기반으로 하여, CD44는 비교적 정적 상태(이는 HA에 결합할 수 없음), 유도된 활성화 상태(이는 활성화 후에 HA에 결합할 수 있음), 및 구조적으로 활성 상태(이는 활성화 없이 HA에 결합할 수 있음)로 존재할 수 있는 반면에, 대부분의 정상 세포의 표면 상의 CD44는 비교적 정적 상태에 있고, HA에 결합할 수 없다.
많은 이전의 연구에서, CD44는 유의한 표적화 특이성을 갖는 이상적인 표적된 부위가 아닌 것으로 밝혀졌다. 그 이유는 CD44가 인간 신체 내에, 특히, 세망내피계(reticuloendothelial)가 풍부한 기관의 표면 상에 광범위하게 분포되기 때문이다. 따라서, 표적된 부위로서 CD44를 사용하는 표적화된 약물 전달 시스템의 개발에서 하기 문제에 직면할 것이다: 표적된 세포의 표면 상의 CD44가 유의한 특이성을 제공하기에 HA에 불충분한 친화성을 가지면, 그러한 표적화된 약물 전달 시스템은 특이적인 표적화 특성을 갖지 못할 것이다.
따라서, 취약 플라크에 존재하는 특이적 표적된 부위 및 취약 플라크를 표적하기에 적합한 표적화된 약물 전달 시스템을 찾고, 그에 의해서, 약물의 안정하고 지속된 방출을 달성하면서 취약 플라크를 특이적으로 표적할 수 있는 표적화된 약물 전달 시스템을 개발하는 것이 의학 분야에서 해결해야 할 시급한 기술적 문제가 되었다.
현재까지, 취약 플라크 내에 주로 존재하는 대식세포, 단구, 내피세포, 림프구 및 평활근 세포의 표면 상의 CD44의 발현 상태, 및 HA에 대한 그들의 친화성에 대한 보고가 없으며, HA와 CD44 사이의 상호작용 및 취약 플라크의 특이적 미세환경을 이용함으로써 약물의 안정하고 지속된 방출을 달성하면서 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하거나 치료하기 위한 표적화된 약물 전달 시스템을 설계하는 것에 관한 어떠한 종래 기술이 없다.
(1) 발명의 개관
본 발명의 발명자들은, 정상 세포에 비해서, 취약 플라크 내의 세포, 예컨대, 내피세포, 대식세포 및 평활근 세포의 표면 상의 CD44가 취약 플라크의 특이적 미세환경(예컨대, 염증성 인자)에 의해서 활성화되고, 그에 따라서, HA에 대한 이들의 결합 능력이 갑자기 수십배 증가된다는 것을 발견하였다. 이러한 발견은 취약 플라크에서의 세포의 표면에 존재하는 매우 많은 활성화된 CD44 분자가 표적화 리간드로서 HA를 함유한 표적화된 약물 전달 시스템에 대한 이상적인 표적화된 부위를 제공한다는 것을 제시한다. 이것 때문에, 본 발명은 활성화된 CD44 분자를 특이적으로 표적화하기 위한, 특히, 취약 플라크를 표적화하기 위한 표적화된 약물 전달 시스템을 제공한다.
본 발명의 발명자들은 또한 CD44 활성화제로 부하시키는 것이 병변 세포의 표면 상의 CD44의 추가의 활성화를 촉진시킬 수 있고 단시간 내에 HA에 대한 CD44의 표적화 친화성을 증폭시킬 수 있으며, 이는 세포 표면에 결합된 표적화 조성물의 농도를 유의하게 증가시켜 취약 플라크의 추적자 진단 및 치료를 위한 능동적인 유의성을 나타냄을 발견하였다. 이것 때문에, 본 발명의 표적화된 약물 전달 시스템은 CD44 활성화제로 동시에 부하되고, 이는 단시간 내에 추적자 또는 치료제 화합물의 농도를 유의하게 증가시켜서 진단 민감성 또는 치료 효과를 개선시킬 수 있다.
본 발명의 발명자들은 또한, 취약 플라크 내에서, CD44의 높은 활성화 수준 및 과발현과 함께, 내인성 거대분자 HA가 자극에 의해서 대량으로 생성되고, 이는 세포 표면 상의 CD44에 결합하여 취약 플라크 내의 세포, 예컨대, 대식세포 및 림프구의 응집을 촉진함을 발견하였다. 세포 표면 상의 CD44에 결합하는 그러한 내인성 HA는 약물 진입에 대한 장벽을 형성할 수 있고 약물의 생체이용성을 감소시킬 수 있다. 이것 때문에, 본 발명의 표적화된 약물 전달 시스템에는 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 소분자 히알루론산 또는 히알루론산 유도체가 부하될 수 있고, 이는 세포 표면 상의 내인성 HA의 결합과 경쟁하고, 병변 세포에서의 약물의 성공적인 세포내 방출을 촉진하고, 유의한 치료 효과를 제공함으로써 세포 표면 상의 내인성 HA에 의해서 형성된 장벽을 제거한다.
요약하면, 본 발명은 다음 양태에 관한 것이다:
본 발명은 활성화된 CD44 분자를 표적하기 위한 리포솜 나노캐리어 전달 시스템을 제공한다.
본 발명은 취약 플라크를 표적하기 위한 리포솜 나노캐리어 전달 시스템을 제공한다.
본 발명은 취약 플라크를 표적하기 위한 본 발명의 리포솜 나노캐리어 전달 시스템을 제조하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 취약 플라크를 표적하기 위한 본 발명의 리포솜 나노캐리어 전달 시스템 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제(medicament)를 추가로 제공한다.
본 발명은 취약 플라크를 표적하기 위한 본 발명의 리포솜 나노캐리어 전달 시스템을 포함하는 진단 제제(diagnostic preparation)를 추가로 제공한다.
본 발명은 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 약제의 제조에서 취약 플라크를 표적하기 위한 본 발명의 리포솜 나노캐리어 전달 시스템의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하기 위한 진단 제제의 제조에서 취약 플라크를 표적하기 위한 본 발명의 리포솜 나노캐리어 전달 시스템의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 방법으로서, 취약 플라크를 표적하기 위한 본 발명의 리포솜 나노캐리어 전달 시스템을 이를 필요로 하는 대상체에 투여함을 포함하는, 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하기 위한 방법으로서, 취약 플라크를 표적하기 위한 본 발명의 리포솜 나노캐리어 전달 시스템을 이를 필요로 하는 대상체에 투여함을 포함하는, 방법을 추가로 제공한다.
본 발명의 기술적 해결책에 대한 특이적 구체예 및 이들의 의미가 이하 상세히 기재될 것이다.
(2) 기술적 용어 및 이의 의미
본원에서 언급된 용어는 하기 의미를 갖는다:
"취약 플라크"("불안정한 플라크"로도 공지됨)는 혈전을 형성시키는 경향이 있거나, 파열되기 쉬운 플라크, 침식되기 쉬운 플라크 및 부분적으로 석회화된 결절성 병변을 포함한, "크리미널 플라크(criminal plaque)"로 신속하게 진행되기 쉬운 죽상동맥경화성 플라크를 의미한다. 매우 많은 연구에서, 심근경색 및 뇌졸중의 대부분이 가벼운 협착증 내지 중간의 협착증을 동반한 취약 플라크의 파열, 그에 이어진 혈전증에 의해서 유발됨이 밝혀졌다. 취약 플라크의 조직학적 징후는 활성 염증, 얇은 섬유 캡(thin fibrous cap) 및 큰 지질 코어, 표면 혈소판 응집과 함께 내피세포 박리, 플라크 피셔 또는 병변(plaque fissure or lesion), 및 심각한 협착증 뿐만 아니라, 표면상의 석회화된 플라크(calcified plaque), 황색 및 광택이 나는 플라크, 플라크내 출혈(intraplaque hemorrhage), 및 양성 리모델링(positive remodeling)을 포함한다.
"취약 플라크와 연관된 질환"은 주로 질환의 발생 및 전개 동안에 "취약 플라크"와 연관되거나, "취약 플라크"를 특징으로 하거나, "취약 플라크"에 의해서 유발되거나, "취약 플라크"에 이차적인 질환을 나타낸다. "취약 플라크와 연관된 질환"은 주로 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 관상 죽상동맥경화성 심장병(급성 관상 증후군(acute coronary syndrome), 무증상 심근 허혈(asymptomatic myocardial ischemia) - 잠재성 관동맥성 심장병(latent coronary heart disease), 협심증(angina pectoris), 심근경색(myocardial infarction), 허혈성 심장병(ischemic heart disease), 급사(sudden death), 및 인-스텐트 재협착(in-stent restenosis)을 포함함), 뇌동맥경화증(cerebral arteriosclerosis)(뇌졸중을 포함함), 말초혈관 죽상동맥경화증(peripheral vascular atherosclerosis)(말초동맥 폐쇄성 질환(peripheral arterial occlusive disease), 망막의 죽상동맥경화증(arteriosclerosis of retina), 경동맥 죽상동맥경화증(carotid atherosclerosis), 신장 죽상동맥경화증(renal atherosclerosis), 다리 죽상동맥경화증(lower extremity atherosclerosis), 팔 죽상동맥경화증(upper extremity atherosclerosis) 및 죽상동맥경화성 발기부전(atherosclerotic impotence)을 포함함), 대동맥 박리(aortic dissection), 혈관종(hemangioma), 혈전색전증(thromboembolism), 심장기능상실(heart failure), 심장성 쇼크(cardiogenic shock) 등을 포함한다.
"표적화된 약물 전달 시스템"은 표적화된 약물 전달 능력을 갖는 약물 전달 시스템을 나타낸다. 특정의 경로를 통한 투여 후에, 표적화된 약물 전달 시스템에 함유된 약물은 특별한 캐리어 또는 표적화 탄두(targeting warhead)(예, 표적화 리간드)의 작용에 의해서 표적화된 부위에서 특별히 풍부하다. 표적화된 약물 전달을 달성하기 위한 현재 공지된 수단은 다양한 마이크로입자 전달 시스템의 수동적인 표적화 특성을 이용하거나, 마이크로입자 전달 시스템의 표면 상에 화학적 변화를 도입하거나, 어떠한 특별한 물리적 및 화학적 특성을 이용하거나, 항체-매개 표적화된 약물 전달을 이용하거나, 리간드-매개 표적화된 약물 전달을 이용하거나, 전구약물 표적화된 약물 전달을 이용하는 등등을 포함한다. 그 중에서도, 리간드-매개 표적화된 약물 전달은 약물 캐리어를 리간드와 조합하고, 이는 특정의 기관 및 조직 내의 특이적 수용체가 그의 특이적 리간드에 특수하게 결합하여 약물을 특이적 표적 조직에 유도하는 특성을 이용한다.
"리포솜 캐리어"는 지질-유사 이중층 약물 캐리어이고, 이는 약물을 지질 이중층에 캡슐화시켜 마이크로베지클(microvesicle)을 형성시킨다. 그것은 또한 지질 바이셀 구조(lipid bicelle structure)일 수 있고, 이는 일반적으로는 장쇄 인지질 및 단쇄 인지질 또는 계면활성제의 자가-조립에 의해서 형성된 디스크 베지클(disk vesicle)이다. 장쇄 인지질은 디스크의 평면을 형성하고, 단쇄 인지질은 디스크의 측면 가장자리를 둘러싼다. 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-콜린(DMPC)이 흔히 장쇄 인지질 성분으로서 사용되고, 바이셀의 표면 전하는 변화될 수 있고, 그의 다제다능성이 동일한 사슬 길이를 갖지만 상이한 헤드 그룹(head group)을 갖는 다른 인지질 성분을 도핑함으로써 실현될 수 있다. 그리고, 단쇄 인지질은 고도의 굴곡 영역(high curvature region)을 형성시켜 집합체의 가장자리 에너지(edge energy)를 감소시켜서 바이셀을 안정화시킨다.
"히알루론산("HA"로 약칭됨)"은 거대분자의 폴리머이고, (C14H21NO11)n의 화학식을 갖는다. 그것은 단위 D-글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민로 이루어진 고급 폴리사카라이드이다. D-글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민은 β-1,3-글리코시드 결합에 의해서 연결되고, 디사카라이드 단위는 β-1,4-글리코시드 결합에 의해서 연결된다. 독특한 분자 구조 및 물리적 및 화학적 특성 때문에, 히알루론산은 유기체에서 다양하고 중요한 생리학적 기능, 예컨대, 관절의 윤활, 혈관벽의 투과성의 조절, 단백질, 물 및 전해질의 확산 및 수송의 조절, 및 상처 치유의 촉진을 나타낸다. 히알루론산이 특수한 물 보유 효과를 가지며 자연에서 발견되는 최고의 수분 보유 특성을 갖는 물질이라는 것이 특히 중요하다.
본원에서 사용된 용어 "히알루론산의 유도체"는 취약 플라크에서의 세포의 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합하는 히알루론산의 능력을 유지할 수 있는 히알루론산의 어떠한 유도체를 의미하며, 히알루론산의 약제학적으로 허용되는 염, 체내에서 가수분해 또는 다른 수단에 의해서 히알루론산을 형성할 수 있는 저급 알킬(1 내지 6 개의 탄소 원자를 함유하는 알킬) 에스테르, 프로드러그(prodrug) 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 물질이 "히알루론산의 유도체"인지를 판단하는 것은 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합하는 물질의 능력을 측정함으로써 달성될 수 있고, 이는 본 기술분야에서의 통상의 기술자의 기술 내에 있다.
"CD44 분자"는 세포, 예컨대, 림프구, 단구(monocyte), 및 세 개의 세그먼트(segment), 즉, 세포외 세그먼트, 막관통 세그먼트(transmembrane segment), 및 세포내 세그먼트로 이루어지는 내피세포의 세포막 상에서 광범위하게 발현되는 일종의 막관통 프로테오글리칸 유착 분자(transmembrane proteoglycan adhesion molecule)이다. CD44 분자는 세포와 세포 사이 및 세포와 세포외 매질 사이의 다양한 상호작용을 매개할 수 있고, 신체 내의 다양한 신호의 전달에 참여할 수 있고, 그에 따라서, 세포의 생물학적 기능을 변화시킬 수 있다. CD44 분자에 대한 일차 리간드는 히알루론산이고, CD44 분자와 히알루론산의 수용체-리간드 결합은 세포외 매트릭스에서의 세포의 유착 및/또는 이동을 결정한다. 또한, CD44 분자는 또한 히알루론산의 대사에 관여한다.
"약"은 그 후에 주어지는 수치값의 ± 5% 범위 내의 모든 값들의 세트를 나타낸다.
(3) 발명의 상세한 설명
본 발명의 제1 양태는 활성화된 CD44 분자를 표적화하기 위한 리포솜 나노캐리어 전달 시스템(liposome nanocarrier delivery system)으로서, 나노캐리어의 표면이 표적화 리간드에 의해서 부분적으로 개질되고, 표적화 리간드가 활성화된 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 리간드인 리포솜 나노캐리어 전달 시스템을 제공한다.
본 발명의 제2 양태는 취약 플라크(vulnerable plaque)를 표적화하기 위한 리포솜 나노캐리어 전달 시스템으로서, 나노캐리어의 표면이 표적화 리간드에 의해서 부분적으로 개질되고, 표적화 리간드가 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 리간드인 리포솜 나노캐리어 전달 시스템을 제공한다. 다른 개질이 나노캐리어의 표면에 대해서 이루어져서 더 우수한 결과를 달성시킬 수 있다. 캐리어의 표면 상의 PEG의 개질은 긴 순환 효과를 달성시킬 수 있고, 약물의 반감기를 연장시킬 수 있다. 막 투과 펩타이드, 자가 펩타이드 SEP의 개질, 또는 캐리어의 표면 상의 이중 리간드의 동시 개질이 모두 약물 효과를 증폭시키는 역할을 할 수 있다.
제1 양태 또는 제2 양태의 나노캐리어 전달 시스템에 따르면, 리포솜 캐리어는 바이셀, 작은 단층 베지클, 큰 단층 베지클 및 다중층 베지클로부터 선택된다. "리포솜 캐리어"는 지질 이중층 약물 캐리어이고, 이는 약물을 지질 이중층 또는 친수성 루멘에 캡슐화시켜서 마이크로베지클 또는 디스크 구조를 형성시킨다.
바이셀의 구조는 일반적으로는 장쇄 인지질 및 단쇄 인지질 또는 계면활성제의 자가-조립에 의해서 형성된 디스크 베지클일 수 있다. 장쇄 인지질은 디스크의 평면을 형성시키고, 단쇄 인지질은 디스크의 측면 가장자리를 둘러싼다. 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-콜린(DMPC)은 흔히 장쇄 인지질 성분로서 사용되고, 바이셀의 표면 전하는 변화될 수 있고, 그의 다제다능성이 동일한 사슬 길이를 갖지만 상이한 헤드 그룹을 갖는 다른 인지질 성분을 도핑함으로써 실현될 수 있다. 그리고, 단쇄 인지질은 고도의 굴곡 영역(high curvature region)을 형성시켜 집합체의 가장자리 에너지를 감소시켜서 바이셀을 안정화시킨다.
제1 양태 또는 제2 양태의 나노캐리어 전달 시스템에 따르면, 표적화 리간드는 GAG, 콜라겐, 라미닌, 파이브로넥틴, 셀렉틴, 오스테오폰틴 (OPN), 및 단클론 항체 HI44a, HI313, A3D8, H90 및 IM7로부터 선택되거나, 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 히알루론산 또는 히알루론산 유도체로부터 선택된다.
제1 양태 또는 제2 양태의 나노캐리어 전달 시스템에 따르면, 나노캐리어가 CD44 분자 활성화의 존재와 관련된 질환을 진단하고/거나, 방지하고/거나 치료하기 위한 물질로 부하된다.
제1 양태 또는 제2 양태의 리포솜 나노캐리어 전달 시스템에 따르면, 나노캐리어는 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하고/거나, 방지하고/거나 치료하기 위한 물질로 부하된다.
일 구체예에서, 물질은 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하기 위한 물질이다.
일 구체예에서, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하기 위한 물질은 추적자이다.
일 구체예에서, 추적자는 CT 추적자, MRI 추적자 및 방사성동위원소 추적자로부터 선택된다.
일 구체예에서, CT 추적자는 요오드-기반 나노스케일 조영제, 골드-기반 나노스케일 조영제, 산화탄탈럼-기반 나노스케일 조영제, 비스무트-기반 나노스케일 조영제, 란타나이드-기반 나노스케일 조영제, 또는 유사한 구조를 갖는 다른 추적자로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는, CT 추적자는 요오드화 조영제 또는 나노골드, 또는 유사한 구조를 갖는 다른 추적자로부터 선택되고; 추가로 바람직하게는, CT 추적자는 이오헥솔(iohexol), 이오카르믹산(iocarmic acid), 이오베르솔(ioversol), 이오딕사놀, 이오프로마이드, 이오비트리돌(iobitridol), 이오메프롤(iomeprol), 이오파미돌(iopamidol), 이옥실란(ioxilan), 아세트리조익산(acetrizoic acid), 이오디파미드(iodipamide), 이오벤자믹산(iobenzamic acid), 이오글리캄산(ioglycamic acid), 디아트리조익산(diatrizoic acid), 소듐 이오탈라메이트(sodium iotalamate), 판토파크(pantopaque), 이오파노익산(iopanoic acid), 이오도알피온산(iodoalphionic acid), 소듐 아세트리조에이트(sodium acetrizoate), 소듐 이오도메타메이트(sodium iodomethamate), 프로필이오돈(propyliodone), 디오돈(diodone), 이오트롤란(iotrolan), 이오피돌(iopydol), 엔도그라핀(endografin), 이오탈람산(iotalamic acid), 메글루민 디아트리조에이트(meglumine diatrizoate), 메트리조익산(metrizoic acid), 메트리자미드(metrizamide), 요오드화 오일(iodinated oil) 또는 에티오다이즈드 오일(ethiodized oil), 또는 유사한 구조를 갖는 다른 추적자로부터 선택되고; 바람직하게는, CT 추적자는 나노골드이고/거나;
MRI 추적자는 세로방향 이완 조영제(longitudinal relaxation contrast agent) 및 횡 방향 이완 조영제(transverse relaxation contrast agent)로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는, MRI 추적자는 상자성 조영제, 강자성 조영제 및 초상자성 조영제로부터 선택되고; 추가로 바람직하게는, MRI 추적자는 Gd-DTPA 및 이의 선형, 고리형 폴리아민 폴리카르복실레이트 킬레이트 및 망간 포르피린 킬레이트, 거대분자 가돌리늄 킬레이트, 생체거대분자-개질된 가돌리늄 킬레이트, 엽산-개질된 가돌리늄 킬레이트, 덴드리머 조영제, 리포솜-개질된 조영제 및 가돌리늄-함유 풀러렌, 또는 유사한 구조를 갖는 다른 추적자로부터 선택되고; 바람직하게는, MRI 추적자는 가도펜테테이트 디메글루민(gadopentetate dimeglumine), 가도테레이트 메글루민(gadoterate meglumine), 가도베네이트 디메글루민(gadobenate dimeglumine), 가도디아민, 페릭 암모늄 시트레이트 발포 과립(ferric ammonium citrate effervescent granule), 상자성 산화철(Fe3O4 NPs), 또는 유사한 구조를 갖는 다른 추적자로부터 선택되고; 바람직하게는, MRI 추적자는 Fe3O4 NPs이고; 방사성동위원소 추적자는 탄소 14(14C), 탄소 13(13C), 인 32(32P), 황 35(35S), 요오드 131(131I), 수소 3(3H), 테크네튬 99(99Tc) 및 불소 18(18F)에 의해서 표지된 플루데옥시글루코스로부터 선택되고; 바람직하게는, 방사성동위원소 추적자는 불소 18-표지된 플루데옥시글루코스이다.
일 구체예에서, 물질은 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하고/거나, 방지하고/거나, 치료하기 위한 약물, 폴리펩타이드, 핵산 및 시토킨 중 하나 이상이다.
일 구체예에서, 물질은 CD44 활성화제이다.
일 구체예에서, CD44 활성화제 CD44 항체 mAb, IL5, IL12, IL18, TNF-α, LPS이다.
일 구체예에서, 물질은 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 소분자 히알루론산 또는 히알루론산 유도체이고;
바람직하게는, 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 소분자 히알루론산 또는 히알루론산 유도체는 1-500 KDa, 바람직하게는 1-20 KDa, 더욱 바람직하게는 2-10 KD 범위의 분자량을 갖는다.
일 구체예에서, 나노캐리어는 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하고/거나, 방지하고/거나, 치료하는 물질과 CD44 활성화제로 동시에 부하되고;
바람직하게는, 나노캐리어는 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 물질과 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 소분자 히알루론산 또는 히알루론산 유도체로 동시에 부하되고;
더욱 바람직하게는, 나노캐리어는 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하기 위한 물질, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 물질, 임의의 CD44 활성화제, 및 임의의 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 소분자 히알루론산 또는 히알루론산 유도체로 동시에 부하된다.
일 구체예에서, 물질은 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 물질이고;
바람직하게는, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 물질은 스타틴(statin), 피브레이트(fibrate), 항혈소판제(antiplatelet drug), PCSK9 억제제, 항응고제(anticoagulant drug), 안지오텐신 전환효소 억제제(angiotensin converting enzyme inhibitor: ACEI), 칼슘 이온 길항제(calcium ion antagonist), MMP 억제제, β 수용체 차단제(β receptor blocker), 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 또는 기타 소염 물질, 예컨대, IL-1 항체 카나키누맙(IL-1 antibody canakinumab), 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 및 상기 약물 또는 물질의 활성 제제, 및 내인성 소염 시토킨, 예컨대, 인터류킨 10(IL-10)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고;
더욱 바람직하게는, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 물질은 로바스타틴(lovastatin), 아토르바스타틴(atorvastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 심바스타틴(simvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 베자피브레이트(bezafibrate), 시프로피브레이트(ciprofibrate), 클로피브레이트(clofibrate), 겜피브로질(gemfibrozil), 페노피브레이트(fenofibrate), 프로부콜(probucol), 항-PCSK9 항체, 예컨대, 에볼로쿠맙(evolocumab), 알리로쿠맙(alirocumab), 보코시주맙(bococizumab), RG7652, LY3015014 및 LGT-209, 또는 아드넥틴(adnectin), 예컨대, BMS-962476, 안티센스 RNAi 올리고뉴클레오티드, 예컨대, ALN-PCSsc, 핵산, 예컨대, 마이크로RNA-33a, 마이크로RNA-27a/b, 마이크로RNA-106b, 마이크로RNA-302, 마이크로RNA-758, 마이크로RNA-10b, 마이크로RNA-19b, 마이크로RNA-26, 마이크로RNA-93, 마이크로RNA-128-2, 마이크로RNA-144, 마이크로RNA-145 안티센스 가닥 및 이들의 핵산 유사체, 예컨대, 로키드 핵산(locked nucleic acid), 아스피린, 아세메타신(acemetacin), 트록세루틴(troxerutin), 디피리다몰(dipyridamole), 실로스타졸(cilostazol), 티클로피딘 하이드로클로라이드(ticlopidine hydrochloride), 소듐 아자그렐(sodium ozagrel), 클로피도그렐(clopidogrel), 프라수그렐(prasugrel), 실로스타졸(cilostazol), 베라프로스트 소듐(beraprost sodium), 티카그렐로(ticagrelor), 칸그렐로(cangrelor), 티로피반(tirofiban), 엡티피바타이드(eptifibatide), 압식시맙(abciximab), 비분획 헤파린(unfractionated heparin), 크렉산(clexane), 프락시파린(fraxiparine), 폰다파리눅스 소듐(fondaparinux sodium), 와파린(warfarin), 다비가트란(dabigatran), 리바록사반(rivaroxaban), 아픽사반(apixaban), 에독사반(edoxaban), 비발리루딘(bivalirudin), 에녹사파린(enoxaparin), 테델파린(tedelparin), 알데파린(ardeparin), 비스하이드록시쿠마린(bishydroxycoumarin), 니트레이트 쿠마린, 소듐 시트레이트, 히루딘(hirudin), 아르가트로반(argatroban), 베나제프릴(benazepril), 캡토프릴(captopril), 에날라프릴(enalapril), 페린도프릴(perindopril), 포시노프릴(fosinopril), 리시노프릴(lisinopril), 모엑시프릴(moexipril), 실라자프릴(cilazapril), 페린도프릴(perindopril), 퀴나프릴(quinapril), 라미프릴(ramipril), 트란돌라프릴(trandolapril), 칸데사르탄(candesartan), 에프로사르탄(eprosartan), 이르베사르탄(irbesartan), 로사르탄(losartan), 텔미사르탄(telmisartan), 발사르탄(valsartan), 올메사르탄(olmesartan), 타소사르탄(tasosartan), 니페디핀(nifedipine), 니카르디핀(nicardipine), 니트렌디핀(nitrendipine), 암로디핀(amlodipine), 니모디핀(nimodipine), 니솔디핀(nisoldipine), 닐바디핀(nilvadipine), 이스라디핀(isradipine), 펠로디핀(felodipine), 라시디핀(lacidipine), 딜티아젬(diltiazem), 베라파밀(verapamil), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 미노사이클린(minocycline), MMI-166, 메토프로롤(metoprolol), 아테놀올(atenolol), 비소프로롤(bisoprolol), 프로프라놀롤(propranolol), 카베딜롤(carvedilol), 바티마스타트(batimastat), 마리마스타트(marimastat), 프리노마스타트(prinomastat), BMS-279251, BAY 12-9566, TAA211, AAJ996A, 나세트라핍(nacetrapib), 에바세트라핍(evacetrapib), 토르세트라핍(Torcetrapib), 달세트라핍(Dalcetrapib), 프레드니손(prednisone), 메틸프레드니손, 베타메타손(betamethasone), 베클로메타손 디프로피오네이트(beclomethasone dipropionate), 디프로스판(diprospan), 프레드니솔론(prednisolone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 덱사메타손 또는 그 밖의 소염 물질, 예컨대, IL-1 항체 카나키누맙, 및 이들의 유효 단편 또는 약제학적으로 허용되는 염, 및 상기 물질의 활성 구조 단편을 포함한 약제학적으로 허용되는 염 중 하나 이상, 및 내인성 소염 시토킨, 예컨대, 인터류킨 10(IL-10)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다.
본 발명의 제3 양태는 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 취약 플라크를 표적하기 위한 나노-전달 시스템을 제조하기 위한 방법으로서,
(1) 적절한 양의 인지질 분자를 적합한 유기 용매에 용해시키고, 필름 수화 방법에 의해서 리포솜 나노캐리어를 제조하는 단계로서, 덜 극성인 약물 분자의 경우에는, 본 단계에서 인지질 분자와 함께 필름을 형성시키는 것이 필요한, 단계;
(2) 임의로, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하고/거나, 방지하고/거나, 치료하기 위한 수용성 물질을 임의로 함유하는 수성 매질을 단계(1)에서 얻은 나노캐리어 전달 시스템에 첨가하여 미정제 현탁액을 형성시키는 단계;
(3) 표적화 리간드를 적합한 완충 용액 용매에 용해시키고, 단계(2)에서 얻은 캐리어 분자를 반응을 위한 표적화 리간드 용액에 첨가하여 나노캐리어 전달 시스템을 얻는 단계;
(4) 임의로 단계 (3)에서 얻은 미정제 현탁액에 함유된 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하고/거나, 방지하고/거나, 치료하기 위한 비부하된 물질을 투석에 의해서 제거하여 부하된 나노 전달 시스템을 얻은 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제4 양태는 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 나노캐리어 전달 시스템 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제를 제공한다.
본 발명의 제5 양태는 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 나노캐리어 전달 시스템을 포함하는 진단 제제를 제공한다.
본 발명의 제6 양태는 CD44 분자 활성화의 존재와 관련된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 제제에서의 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 나노캐리어 전달 시스템, 제4 양태에 따른 약제, 또는 제5 양태에 따른 진단 제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 제7 양태는 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 제제에서의 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 나노캐리어 전달 시스템, 제4 양태에 따른 약제, 또는 제5 양태에 따른 진단 제제의 용도를 제공한다.
제7 양태의 용도에 따르면, 취약 플라크는 파열되기 쉬운 플라크(rupture-prone plaque), 침식되기 쉬운 플라크(erosion-prone plaque) 및 부분적으로 석회화된 결절성 병변(partially calcified nodular lesion)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고;
바람직하게는, 취약 플라크와 연관된 질환은 죽상동맥경화증, 관상 죽상동맥경화성 심장병(급성 관상 증후군, 무증상 심근 허혈 - 잠재성 관동맥성 심장병, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장병, 급사, 및 인-스텐트 재협착을 포함함), 뇌동맥경화증(뇌졸중을 포함함), 말초혈관 죽상동맥경화증(말초동맥 폐쇄성 질환, 망막의 죽상동맥경화증, 경동맥 죽상동맥경화증, 신장 죽상동맥경화증, 다리 죽상동맥경화증, 팔 죽상동맥경화증 및 죽상동맥경화성 발기부전을 포함함), 대동맥 박리, 혈관종, 혈전색전증, 심장기능상실, 심장성 쇼크로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다.
본 발명의 제8 양태는 CD44 분자 활성화의 존재와 관련된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 방법으로서, 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 나노캐리어 전달 시스템, 제4 양태에 따른 약물, 또는 제5 양태에 따른 진단 제제가 이를 필요로 하는 대상체에 투여됨을 포함하는, 방법을 제공한다.
본 발명의 제9 양태는 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 방법으로서, 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 나노캐리어 전달 시스템, 제4 양태에 따른 약물, 또는 제5 양태에 따른 진단 제제가 이를 필요로 하는 대상체에 투여됨을 포함하는, 방법을 제공하고;
바람직하게는, 취약 플라크는 파열되기 쉬운 플라크, 침식되기 쉬운 및 부분적으로 석회화된 결절성 병변으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고;
더욱 바람직하게는, 취약 플라크와 연관된 질환은 죽상동맥경화증, 관상 죽상동맥경화성 심장병(급성 관상 증후군, 무증상 심근 허혈 - 잠재성 관동맥성 심장병, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장병, 급사, 및 인-스텐트 재협착을 포함함), 뇌동맥경화증(뇌졸중을 포함함), 말초혈관 죽상동맥경화증(말초동맥 폐쇄성 질환, 망막의 죽상동맥경화증, 경동맥 죽상동맥경화증, 신장 죽상동맥경화증, 다리 죽상동맥경화증, 팔 죽상동맥경화증 및 죽상동맥경화성 발기부전을 포함함), 대동맥 박리, 혈관종, 혈전색전증, 심장기능상실, 심장성 쇼크로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다.
본 발명의 제10 양태는 CD44 분자 활성화의 존재와 관련된 질환을 진단하기 위한 방법으로서, 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 나노캐리어 전달 시스템, 제4 양태에 따른 약물, 또는 제5 양태에 따른 진단 제제가 이를 필요로 하는 대상체에 투여됨을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법을 제공한다.
종합하면, 본 발명의 나노캐리어 전달 시스템은 CD44 분자 활성화의 존재하의 질환에 대해서 하기 이점을 갖는다:
1) 본 발명의 나노캐리어 전달 시스템은 활성화된 CD44 분자에 특이적으로 결합하고, 안정하고 지속된 약물 방출을 실현할 수 있다.
2) 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44가 세포외 매트릭스 마이크로환경에 의해서 유도되고 활성화되고, 대량의 CD44가 과발현되고, CD44-HA의 친화성이 유의하게 개선되어, 취약 플라크 내의 CD44와 HA 사이의 상호작용이 극히 유의한 친화성 특이성을 갖게 한다. 따라서, 취약 플라크 내의 CD44는 취약 플라크를 표적하기 위한 나노캐리어 전달 시스템의 우수한 표적이 된다.
3) 취약 플라크를 표적하기 위한 나노캐리어 전달 시스템은 취약 플라크 내로 능동적으로 표적하고 중심 세포와 조합될 수 있다. 따라서, 전달 시스템은 중심에서의 부하된 물질의 지속된 방출을 실현하고, 중심 영역 내의 물질의 농도를 유의하게 증가시키고 지속적으로 유지시켜서, 전달 시스템의 진단 또는 치료 효과를 개선시킬 수 있다.
4) 본 발명에 따른 취약 플라크를 표적하는 나노캐리어 전달 시스템은 또한 CD44 활성화 물질, 즉, CD44 활성화제, 예컨대, IL5, IL12, IL18, TNF-α, LPS로 부하될 수 있다. CD44 활성화제를 부하시키는 것은 중심 세포의 표면상의 CD44의 추가의 활성화를 촉진할 수 있고, 단시간 내에 히알루론산에 대한 CD44의 표적된 친화성을 확대할 수 있고, 세포 표면에 결합된 표적된 나노캐리어 조성물의 농도를 유의하게 증가시킬 수 있고, 이는 취약 플라크의 추적자 진단 및 치료에 긍정적인 유의성을 갖는데, 그 이유는 그것이 단시간 내에 추적자 또는 치료제 화합물의 농도를 유의하게 증가시켜서 진단 해법 또는 치료 효과를 개선시킬 수 있기 때문이다.
본 발명의 내용을 충분히 이해시키기 위해서, 본 발명이 특이적 실시예 및 첨부된 도면을 참조로 하여 이하 상세히 추가로 기재된다.
도 1은 실시예 1에서의 LP1-(R)-HA의 전자 현미경 사진이다.
도 2는 실시예 1에서의 LP1-(R)-HA의 적외선 분광 사진이다.
도 3은 실시예 2에서의 LP1-(R)-SP의 특성화 다이어그램이다.
도 4은 실시예 3에서의 LP1-(R)-HA/Tat의 특성화 다이어그램이다.
도 5은 실시예 4에서의 LP2-(At)-HA의 특성화 다이어그램이다.
도 6은 실시예 5에서의 LP2-(At)-SEP/IM7의 특성화 다이어그램이다.
도 7은 실시예 6에서의 LP2-(At/miRNA-33a)-IM7의 특성화 다이어그램이다.
도 8은 실시예 7에서의 LP2-(AuNP/R)-OPN의 특성화 다이어그램이다.
도 9는 실시예 8에서의 LP1-(Fe3O4/DXMS)-HI44a의 특성화 다이어그램이다.
도 10은 실시예 9에서의 LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a의 특성화 다이어그램이다.
도 11은 실시예 10에서의 LP1-(Asp/Clo)-Col의 특성화 다이어그램이다.
도 12는 실시예 11에서의 LP1-(F-FDG)-OPN의 특성화 다이어그램이다.
도 13은 실험예 1에서의 입자 크기 안정성에 대한 장기간 저장의 영향이다.
도 14은 실험예 1에서의 캡슐화율에 대한 장기간 저장의 영향이다.
도 15는 실험예 1에서의 리포솜 캐리어의 시험관내 누적 약물 방출율이다.
도 16은 실험예 2에서 구성된 마우스 죽상동맥경화성 취약 플라크 모델의 핵 자기 공명 영상화의 이미지이다.
도 17은 마우스 모델에서 정상 동맥 혈관벽의 내피 세포의 표면 및 동맥 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44 함량의 측정 결과(반정량적 적분값(semi-quantitative integration)로서 표현됨)를 나타내는 그래프이다.
도 18은 마우스 모델에서 HA에 대한 정상 동맥 혈관벽의 내피 세포의 표면 및 동맥 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44의 결합력의 측정 결과(결합력 적분값으로서 표현됨)를 나타내는 그래프이다.
도 19는 마우스 모델에서 HA에 대한 동맥 취약 플라크 내부와 외부에서의 대식세포의 표면 상의 CD44의 결합력의 측정 결과(결합력 적분값로서 표현됨)를 나타내는 그래프이다.
도 20은 마우스 모델에서의 경동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 LP1-(R)-HA, LP1-(R)-SP, LP1-(R)-HA/Tat 나노 전달 시스템의 치료 효과를 나타내는 그래프이다.
도 21은 마우스 모델에서 경동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 LP2-(At)-HA，LP2-(At)-SEP/IM7，LP2-(At/miRNA-33a)-IM7 나노 전달 시스템의 치료 효과를 나타내는 그래프이다.
도 22는 마우스 모델에서 경동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 LP2-(AuNP/R)-OPN 및 다른 CT 추적자 나노 전달 시스템의 생체내 추적 효과를 나타내는 그래프이다.
도 23은 마우스 모델에서 경동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 LP2-(AuNP/R)-OPN 나노 전달 시스템의 치료 효과를 나타내는 그래프이다.
도 24는 마우스 모델에서 경동맥 취약 플라크에 대한 LP1-(Fe3O4/DXMS)- HI44a，LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a 및 다른 MRI 추적자 나노 전달 시스템의 생체내 추적 효과를 나타내는 그래프이다.
도 25는 마우스 모델에서 경동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 LP1-(Fe3O4/DXMS)-HI44a，LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a 나노 전달 시스템의 치료 효과를 나타내는 그래프이다.
도 26은 마우스 모델에서 취약 동맥 플라크의 파열에 대한 본 발명의 LP1-(Asp/Clo)-Col 나노 전달 시스템의 치료 효과를 나타내는 그래프이다.
도 27은 마우스 모델에서 경동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 방사성동위원소 추적자 LP1-(F-FDG)-OPN 나노 전달 시스템의 생체내 추적 효과를 나타내는 그래프이다.
본 발명을 추가로 이해하기 위해서, 본 발명의 특이적 구체예가 실시예를 참조로 하여 이하 상세히 설명된다. 그러나, 설명은 단지 본 발명의 특징 및 이점을 추가로 예시하고자 의도되며 어떠한 방식으로든 본 발명의 청구범위를 제한하는 것으로 의도되지 않음이 이해될 것이다.
구체예의 상세한 설명
본 발명이 특이적 실시예에 의해서 이하 추가로 기재될 것이지만, 이들 실시예는 단지 상세한 설명의 목적이며 어떠한 형태로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 함이 이해될 것이다.
본 섹션에서는 본 발명의 시험에서 사용되는 물질 및 실험 방법의 일반적인 설명이 주어진다. 비록, 본 발명의 목적을 달성하기 위한 많은 물질 및 작업 방법이 본 기술분야에서 잘 공지되어 있지만, 본 발명은 가능한 한 더욱 구체적으로 본원에서 기재된다. 통상의 기술자에게는 본 발명에서의 물질 및 작업 방법이, 달리 명시되지 않는 한, 문맥 내에의 기술분야에서 잘 공지되어 있다는 것이 자명할 것이다.
실시예 1: 로수바스타틴(R)으로 부하되고 히알루론산(HA)에 의해서 개질된 리포솜 나노 베지클(LP1-(R)-HA)의 제조
본 실시예에서, 치료제로 부하된 리포솜 나노 베지클 LP1-(R)-HA를 박막 분산 방법에 의해서 제조하였다. 상기 리포솜 전달 시스템의 나노 베지클의 표면을 표적화 리간드 히알루론산("HA"로 약칭됨)에 의해서 부분적으로 개질시키고, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 물질인 로수바스타틴(약어 "R"로 표시됨)으로 부하시켰다.
(1) LP1-(R) 리포솜 나노 베지클 현탁액의 제조:
4 mg의 스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC), 콜레스테롤, 미리스토일 포스포에탄올아민(DMPE)(몰 비율은 4:1:1임)을 칭량하고, 약물 로수바스타틴(R) (전체 약물 대 지질의 몰 비율은 1:10임)를 첨가하고, 이어서 10 mL의 클로로포름으로 용해시켰다. 유기 용매를 완만한 회전 증발 수단(65℃ 수조, 90 r/min, 30 min)에 의해서 제거하여 용기의 벽 상에 박막을 형성시켰다. 용기를 50℃의 항온 수조 케틀에 넣어 박막을 30분 동안 완전히 수화시켜서, 미정제 리포솜 나노 베지클 현탁액을 형성시켰다. 미정제 리포솜 나노 베지클 현탁액을 초음파조에서 초음파 파쇄 하였고, 이어서 현탁액을 프로브형 초음파 파쇄기(probe-type ultrasonicator)로 3 분(진폭 20, 간격 3초) 동안 추가로 초음파 파쇄하였다. 정제된 리포솜 나노 베지클 현탁액 중의 비캡슐화된 약물을 세파덱스 컬럼 G-100에 의해서 제거하였다.
(2) 히알루론산("HA")의 활성화 및 커플링:
1 g의 HA(약 100 KDa의 분자량을 가짐)를 초순수에 완전히 용해시키고, 0.1 g의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC.HCl) 및 0.12 g의 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 커플링제를 첨가하여 카르복실기를 활성화시켰다. 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반시킨 후에, 무수 에탄올을 첨가하여 활성화된 HA를 침전시켰다. 침전물을 여과하고, 에탄올로 세척하고, 진공 중에서 건조시켜 활성화된 HA를 얻었다. 이를 0.1 mg mL-1 수용액에 제형화시켰고, 활성화된 HA 중의 활성화된 카르복실기를 아미드 결합을 형성시킴을 통해서 리포솜 나노 베지클의 지질 이중층에 통합된 DSPE 분자의 아미노기에 커플링시키기 위해서, 0.2 mL의 용액을 상기 단계 (1)에서 얻은 리포솜 나노 베지클 현탁액에 전달하여 용해시켜서, 치료제로 부하된 3개의 리포솜 전달 시스템 LP1-(R)-HA를 얻었다. 도 1은 LP1-(R)-HA의 전자 현미경 사진이다. 도 2는 LP1-(R)-HA의 적외선 분광 사진이다.
실시예 2: 로수바스타틴(R)으로 부하되고, 셀렉틴(SP)에 의해서 개질된 리포솜 나노 베지클(LP1-(R)-SP)의 제조
본 실시예에서는, 치료제로 부하된 리포솜 나노 베지클 LP1-(R)-SP를 박막 분산 방법에 의해서 제조하였다. 상기 리포솜 전달 시스템의 베지클의 표면을 표적화 리간드 셀렉틴("SP"로 약칭됨)에 의해서 부분적으로 개질되고, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 물질인 로수바스타틴(약어 "R"로 표현됨)으로 부하시켰다.
(1) LP1-(R) 리포솜 나노 베지클의 제조:
실시예 1의 방법에 따른 LP1-(R) 리포솜 나노 베지클의 제조
(2) 셀렉틴(SP)의 활성화 및 커플링:
1 mg의 SP를 초순수(ultrapure water)에 완전히 용해시키고, 0.5 mg의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC.HCl) 및 0.5 mg의 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 커플링제를 첨가하여 카르복실기를 활성화시켰다. 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반시킨 후에, 활성화된 셀렉틴을 한외 여과(ultrafiltration)에 의해서 정제하였고, 활성화된 SP 중의 활성화된 카르복실기를 아미드 결합을 형성시킴을 통해서 리포솜 나노 베지클의 지질 이중층에 통합된 DMPE 분자의 아미노기에 커플링시키기 위해서, 상기 단계 (1)에서 얻은 리포솜 나노 베지클 현탁액에 용해시켜서, 치료제로 부하된 세 가지의 리포솜 전달 시스템 LP1-(R)-SP을 얻었다. 도 3은 LP1-(R)-SP의 특성화 다이어그램이다.
실시예 3: 로수바스타틴(R)으로 부하되고 히알루론산(HA) 및 막 투과 펩타이드(Tat)에 의해서 동시에 개질된 리포솜 나노 베지클 (LP1-(R)-HA/Tat)의 제조
본 실시예에서, 치료제로 부하된 리포솜 나노 베지클 LP1-(R)-HA/Tat를 박막 분산 방법에 의해서 제조하였다. 상기 리포솜 전달 시스템의 나노 베지클의 표면을 표적화 리간드 히알루론산("HA"로 약칭됨) 및 막 투과 펩타이드(Tat)에 의해서 부분적으로 개질시키고, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 물질인 로수바스타틴(약어 "R"로 표시됨)로 부하시켰다.
3.1 LP1-(R) 리포솜 나노 베지클의 제조:
실시예 1의 방법에 따른 LP1-(R) 리포솜 나노 베지클의 제조
3.2 히알루론산("HA")의 활성화 및 커플링:
10 mg의 HA(약 10 KDa의 분자량을 가짐)를 초순수에 완전히 용해시키고, 5 mg의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC.HCl) 및 5 mg의 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 커플링제를 첨가하여 카르복실기를 활성화시켰다. 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반시킨 후에, 무수 에탄올을 첨가하여 활성화된 HA를 침전시켰다. 침전물을 여과하고, 에탄올로 세척하고, 진공 중에서 건조시켜 활성화된 HA를 얻었다. 이를 0.1 mg mL-1 수용액에 제형화시켰다.
1 mg의 Tat를 PBS 완충제에 완전히 용해시키고, 0.1 g의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC.HCl) 및 0.12 g의 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 커플링제를 첨가하여 카르복실기를 활성화시켰다. 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반시킨 후에, 미반응된 작은 유기 분자를 한외 여과에 의해서 정제하여 제거하였다. 활성화된 Tat를 0.1 mg mL-1 수용액에 제형화시켰다.
활성화된 HA 및 Tat 중의 활성화된 카르복실기를 아미드 결합을 통해서 아미드 결합을 통해서 리포솜 나노 베지클의 지질 이중층에 통합된 DMPE 분자의 아미노기에 커플링시키기 위해서, 정제된 LP1-(R) 리포솜 나노 베지클 용액에 전달하여 용해시켜서, LP1-(R) 상의 HA 및 Tat의 이중 커플링을 실현하였고, 표적 인식 나노 캐리어 LP1-(R)-HA/Tat를 얻었다. 도 4는 LP1-(R)-HA/Tat의 적외선 특성화 다이어그램이다.
실시예 4: 아토르바스타틴(At)으로 부하되고 히알루론산(HA) 및 PEG에 의해서 동시에 개질된 리포솜 나노 디스크(LP2-(At)-HA)의 제조
(1) 아토르바스타틴(At)로 부하된 리포솜 나노 디스크 LP2-(At)의 제조:
4 mg의 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1,2-디-n-헵타데카노일 포스파티딜콜린(DHPC) 및 단쇄, 미리스토일 포스포에탄올아민(DMPE)(몰 비율은 7:2:1임)을 칭량하고, 약물 아토르바스타틴(At)(전체 약물 대 지질의 몰 비율이 1:10임)을 첨가하고, 이어서, 10 mL의 클로로포름으로 용해시켰다. 유기 용매를 완만한 회전 증발 수단(65℃ 수조, 90 r/min, 30 min)에 의해서 제거하여 용기의 벽 상에 박막을 형성시켰다. 10 mL의 물(농도는 1.0mg/mL임)을 둥근 바닥 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 50℃의 항온 수조 케틀에 넣어 박막을 충분히 수화시켜, 미정제 리포솜 나노 디스크 현탁액을 형성시켰다. 미정제 리포솜 나노 디스크 현탁액을 초음파조에서 초음파 파쇄시키고, 이어서, 현탁액을 프로브형 초음파 파쇄기로 3 분(진폭 20, 간격 3초) 동안 추가로 초음파 파쇄하였다. 정제된 리포솜 나노 디스크 현탁액 중의 비캡슐화된 약물을 세파덱스 컬럼 G-100에 의해서 제거하였다.
(2) 히알루론산("HA")의 활성화 및 커플링:
1 g의 HA(약 100 KDa의 분자량을 가짐)를 초순수에 완전히 용해시키고, 0.1 g의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC.HCl) 및 0.12 g의 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 커플링제를 첨가하여 카르복실기를 활성화시켰다. 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반시킨 후에, 무수 에탄올을 첨가하여 활성화된 HA를 침전시켰다. 침전물을 여과하고, 에탄올로 세척하고, 진공 중에서 건조시켜 활성화된 HA를 얻었다. 이를 0.1 mg mL-1 수용액에 제형화시켰고, 활성화된 HA 중의 활성화된 카르복실기, PEG-NH2(분자량 1000)의 아미노기 및 리포솜 나노 디스크의 지질 이중층에 통합된 DMPE 분자의 아미노기를 아미드 결합을 통해서 커플링시키기 위해서, 0.2 mL의 용액을 상기 단계 (1)에서 얻은 리포솜 나노 디스크 현탁액에 전달하여 용해시켜서, 치료제에 의해서 부하된 세 가지의 리포솜 전달 시스템 LP2-(At)-HA를 얻었다. 도 5는 LP2-(At)-HA의 특성화 다이어그램이다. PEG가 개질되지 않아야 하면, PEG-NH2를 첨가하는 상기 단계는 생략되어 PEG 개질이 없는 LP2-(At)-HA를 얻는다.
실시예 5: 자가 펩타이드(SEP) 및 단클론 항체 IM7에 의해서 개질된 리포솜 나노 디스크 (LP2-(At)-SEP/IM7)의 제조
(1) 아토르바스타틴(At)으로 부하된 리포솜 나노 디스크의 제조:
실시예 4의 방법에 따른 리포솜 나노 디스크의 제조.
(2) SEP 또는 IM7의 활성화 및 커플링:
1 mg의 SEP를 초순수에 완전히 용해시키고, 0.5 mg의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC.HCl) 및 0.5 mg의 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 커플링제를 첨가하여 카르복실기를 활성화시켰다. 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반시킨 후에, 활성화된 SEP를 한외 여과 및 원심분리에 의해서 정제하였다. 1 mg의 IM7을 초순수에 완전히 용해시키고, 0.1 mg의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC.HCl) 및 0.1 mg의 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 커플링제를 첨가하여 카르복실기를 활성화시키고, 활성화된 IM7을 한외 여과 및 원심분리에 의해서 정제하였다.
활성화된 SEP 또는 IM7을 정제된 LP2-(At) 용액에 용해시켜, LP2-(At) 상의 SEP/IM7의 이중 커플링을 실현시키고, 표적 인식 나노 디스크 LP2-(At)-SEP/IM7을 얻었다. 도 6은 LP2-(At)-SEP/IM7의 특성화 다이어그램이다. SEP가 개질될 필요가 없으면, SEP를 활성화시키고 커플링시키는 상기 단계가 생략되어 SEP 개질 없이 LP2-(At)-IM7를 얻을 수 있다.
실시예 6: 아토르바스타틴(At) 및 마이크로 RNA(miRNA-33a)으로 부하되고 단클론 항체 IM7에 의해서 개질된 리포솜 나노 디스크(LP2-(At/miRNA-33a)-IM7)의 제조
(1) 아토르바스타틴(At) 및 마이크로 RNA(miRNA-33a)로 부하된 리포솜 나노 디스크 LP2-(At)의 제조:
4 mg의 DOTAP, 1,2-디-n-헵타데카노일 포스파티딜콜린 (DHPC) 및 단쇄, 미리스토일 포스포에탄올아민(DMPE)을 7:2:1의 몰 비율로 칭량하고, 약물 아토르바스타틴(At)(전체 약물 대 지질의 몰 비율은 1:10임)를 첨가하고, 이어서 10 mL의 클로로포름으로 용해시켰다. 유기 용매를 완만한 회전 증발 수단(65℃ 수조, 90 r/min, 30 min)에 의해서 제거하여 용기의 벽 상에 박막을 형성시켰다. 10 mL의 물(농도는 1.0mg/mL임)을 둥근 바닥 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 50℃의 항온 수조 케틀에 넣어 박막을 충분히 수화시켜서, 미정제 리포솜 나노 디스크 현탁액을 형성시켰다. 미정제 리포솜 나노 디스크 현탁액을 초음파조에서 초음파 파쇄시키고, 이어서, 현탁액을 프로브형 초음파 파쇄기로 3 분(진폭 20, 간격 3초) 동안 추가로 초음파 파쇄시켜 정제된 리포솜 나노 디스크 현탁액을 얻었다. 정제된 리포솜 나노 디스크 현탁액 중의 비캡슐화된 아토르바스타틴을 세파덱스 컬럼 G-100에 의해서 제거하였다. 여액을 농축시킨 후에, 특정량의 마이크로RNA(miRNA-33a)를 첨가하고, 2 시간 동안 인큐베이션시켜, 나노 디스크의 표면 상의 마이크로RNA의 결합을 촉진시켰다. 생성물을 나중의 사용을 위해서 4℃의 저온에서 저장하였다.
1 mg의 IM7을 초순수에 완전히 용해시키고, 0.5 mg의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC.HCl) 및 0.5 mg의 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 커플링제를 첨가하여 카르복실기를 활성화시키고, 활성화된 설포-NHS-IM7를 한외 여과 및 원심분리에 의해서 정제하였다. 활성화된 그것을 정제된 LP2-(At/miRNA-33a) 용액에 용해시켜, LP2-(At/miRNA-33a) 상의 IM7의 이중 커플링을 실현시키고, 표적 인식 나노 디스크 LP2-(At/miRNA-33a)-IM7을 얻었다. 도 7은 LP2-(At/miRNA-33a)-IM7의 적외선 특성화 다이어그램이다.
실시예 7: 로수바스타틴(R)/금 나노입자(AuNP)로 부하되고 오스테오폰틴(OPN)에 의해서 개질된 리포솜 나노 디스크(LP2-(AuNP/R)-OPN)의 제조
7.1 금 나노입자(AuNP)의 제조
100 mL의 1mM HAuCl4 용액을 제조하고, 가열하여 비등시키고, 1mL의 새롭게 제조된 0.1M 소듐 보로하이드라이드를 격렬한 교반 하에 첨가하여 AuNPs를 얻었고, 용액을 한외 여과에 의해서 정제하고, 용액을 농축시켜 1 mM AuNPs을 얻었다.
7.2 로수바스타틴(R) 및 금 나노입자(AuNP)로 부하된 리포솜 나노 디스크 LP2-(AuNP/R)의 제조
4 mg의 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1,2-디-n-헵타데카노일 포스파티딜콜린(DHPC) 및 단쇄, 미리스토일 포스포에탄올아민(DMPE)을 7:2:1의 몰 비율로 칭량하고, 약물 로수바스타틴(R)(전체 약물 대 지질의 몰 비율은 1:10임)을 첨가하고, 이어서, 10 mL의 클로로포름으로 용해시켰다. 유기 용매를 완만한 회전 증발 수단(65℃ 수조, 90 r/min, 30 분)에 의해서 제거하여 용기의 벽 상에 박막을 형성시켰다. 플라스크를 50℃의 항온 수조 케틀에 넣어 박막을 30분 동안 완전히 수화시키고, 1 mL의 정제된 AuNPs(1 mM) 용액을 첨가하였다. 미정제 리포솜 나노 디스크 현탁액을 초음파조에서 초음파 파쇄시키고, 이어서, 현탁액을 프로브형 초음파 파쇄기로 3 분(진폭 20, 간격 3초) 동안 추가로 초음파 파쇄하였다. 정제된 리포솜 나노 디스크 현탁액 중의 비캡슐화된 로수바스타틴 및 AuNPs를 세파덱스 컬럼 G-100에 의해서 제거하였다.
7.3 AuNP/R으로 부하시키고 오스테오폰틴(OPN)에 의해서 개질된 리포솜 나노 디스크(LP2-(AuNP/R)-OPN)의 제조
1 mg의 OPN을 초순수에 완전히 용해시키고, 0.5 mg의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC.HCl) 및 0.5 mg의 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 커플링제를 첨가하여 카르복실기를 활성화시켰다. 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반시킨 후에, 활성화된 OPN을 한외 여과 및 원심분리에 의해서 정제하였다. 1.0 mL의 OPN 용액을 정제된 LP2-(AuNP/R) 용액에 용해시켜, LP2-(AuNP/R) 상의 OPN의 커플링을 실현시켰다. 도 8은 실시예 7에서의 LP2-(AuNP/R)-OPN의 적외선 특성화 다이어그램이다.
원료를 대체하여, 본 발명의 발명자들은 또한 표적화된 CT 추적자 LP2-(이오프로마이드)-OPN, LP2-(이오딕사놀)-OPN 및 LP2-(요오도플루오로알코올)-OPN을 상기 유사한 제조 방법에 의해서 성공적으로 제조하였다.
실시예 8: 덱사메타손(DXMS) 및 자성 철 나노입자 (Fe 3 O 4 NPs)으로 부하되고 단클론 항체(HI44a)에 의해서 개질된 리포솜 나노 베지클(LP1-(Fe 3 O 4 /DXMS)-HI44a)의 제조
8.1 자성 철 나노입자(Fe3O4 NPs)의 제조
100 mL의 10 mM 염화제이철(FeCl3) 용액을 제조하고, 10 mL의 새롭게 제조한 0.1M 수산화암모늄을 격렬한 교반하에 첨가하여 자성 철 나노입자(Fe3O4 NPs)을 얻고, 물질을 외부 자기장에 의해서 정제하였다. 용액을 농축시키고, 그것을 순수한 물에 재분산시켜 10 mM Fe3O4 NPs를 얻었다.
8.2 덱사메타손(DXMS) 및 자성 철 나노입자(Fe3O4 NPs)로 부하된 리포솜 나노 베지클 LP1-(Fe3O4/DXMS)의 제조
4 mg의 스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC), 콜레스테롤, 미리스토일 포스포에탄올아민(DMPE)(몰 비율은 4:1:1임)을 칭량하고, 약물 덱사메타손(DXMS) (전체 약물 대 지질의 몰 비율은 1:10임)을 첨가하고, 이어서, 10 mL의 클로로포름으로 용해시켰다. 유기 용매를 완만한 회전 증발 수단(65℃ 수조, 90 r/min, 30 분)에 의해서 제거하여 용기의 벽 상에 박막을 형성시켰다. 10 mL의 정제된 1 mM Fe3O4 NPs 용액을 첨가하고, 플라스크를 50℃의 항온 수조 케틀에 넣어 박막을 충분히 수화시켜서, 미정제 리포솜 나노 베지클 현탁액을 형성시켰다. 미정제 리포솜 나노 베지클 현탁액을 초음파조에서 초음파 파쇄하였고, 이어서 현탁액을 프로브형 초음파 파쇄기로 3 분(진폭 20, 간격 3초) 동안 추가로 초음파 파쇄하여 리포솜 베지클을 완전히 분산시킴으로써 형성된 분산 시스템, 즉, 정제된 리포솜 베지클 현탁액을 얻었다. 정제된 리포솜 나노 베지클 현탁액 중의 비캡슐화된 약물 및 Fe3O4 NPs를 세파덱스 컬럼 G-100에 의해서 제거하였다.
8.3 Fe3O4/DXMS로 부하되고 HI44a에 의해서 개질된 리포솜 나노 베지클(LP1-(Fe3O4/DXMS)-HI44a)의 제조
1 mg의 HI44a를 초순수에 완전히 용해시키고, 0.5 mg의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC.HCl) 및 0.5 mg의 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 커플링제를 첨가하여 카르복실기를 활성화시켰다. 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반시킨 후에, 활성화된 HI44a를 한외 여과 및 원심분리에 의해서 정제하였다. HI44a 용액을 정제된 LP1-(Fe3O4/DXMS) 용액에 용해시켜 LP1-(Fe3O4/DXMS) 상의 HI44a의 커플링을 실현시키고, 표적 인식 나노 캐리어 LP1-(Fe3O4/DXMS)-HI44a를 얻었다. 도 9는 실시예 8에서의 LP1-(Fe3O4/DXMS)-HI44a의 특성화 다이어그램이다.
원료를 대체하여, 본 발명의 발명자들은 또한 표적화된 MRI 추적자 LP1-(가도테레이트 메글루민)-HI44a，LP1-(가도디아민)-HI44a, 및 LP1-(가도펜테틱산)-HI44a 등을 상기 유사한 제조 방법에 의해서 성공적으로 제조하였다.
실시예 9: 인터류킨 10(IL-10) 및 자성 철 나노입자(Fe 3 O 4 NPs)로 부하되고 and modified by 단클론 항체(HI44a)에 의해서 개질된 리포솜 나노 베지클(LP1-(Fe 3 O 4 /IL-10)-HI44a)의 제조
9.1 자성 철 나노입자(Fe3O4 NPs)의 제조
실시예 8의 방법에 따른 자성 철 나노입자(Fe3O4 NPs)의 제조
9.2 IL-10 및 자성 철 나노입자(Fe3O4 NPs)로 부하된 리포솜 나노 베지클 LP1-(Fe3O4/IL-10)의 제조
4 mg의 스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC), 콜레스테롤, 미리스토일 포스포에탄올아민(DMPE)(몰 비율은 4:1:1임)을 칭량하였다. 유기 용매를 완만한 회전 증발 수단(65℃ 수조, 90 r/min, 30 분)에 의해서 제거하여 용기의 벽 상에 박막을 형성시켰다. 10 mL의 정제된 1 mM Fe3O4 NPs 용액을 첨가하고, 플라스크를 50℃의 항온 수조 케틀에 넣어 박막을 충분히 수화시켜서, 미정제 리포솜 나노 베지클 현탁액을 형성시켰다. 미정제 리포솜 나노 베지클 현탁액을 초음파조에서 초음파 파쇄 하였고, 이어서, 현탁액을 프로브형 초음파 파쇄기로 3 분(진폭 20, 간격 3초) 동안 추가로 초음파 파쇄하여, 리포솜 베지클을 완전히 분산시킴으로써 형성되는 분산 시스템, 즉, 정제된 리포솜 베지클 현탁액을 얻었다. 용액을 농축시키고, 1 mg의 IL-10를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켜, LP1-(Fe3O4/IL-10)을 얻었다. 정제된 리포솜 나노 베지클 현탁액 중의 비캡슐화된 약물을 세파덱스 컬럼 G-100에 의해서 제거하였다.
9.3 Fe3O4/IL-10로 부하되고 HI44a에 의해서 개질된 리포솜 나노 베지클(LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a)의 제조
1 mg의 HI44a를 초순수에 완전히 용해시키고, 0.5 mg의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC.HCl) 및 0.5 mg의 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 커플링제를 첨가하여 카르복실기를 활성화시켰다. 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반시킨 후에, 활성화된 HI44a를 한외 여과 및 원심분리에 의해서 정제하였다. HI44a 용액을 정제된 LP1-(Fe3O4/IL-10) 용액에 용해시켜, LP1-(Fe3O4/IL-10) 상의 HI44a의 커플링을 실현시키고, 표적 인식 나노 캐리어 LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a를 얻었다. 도 10은 실시예 9에서의 LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a의 적외선 특성화 다이어그램이다.
실시예 10: 아스피린(Asp) 및 클로피도그렐(Clo)로 부하되고 콜라겐(Col)에 의해서 개질된 리포솜 나노 베지클(LP1-(Asp/Clo)-Col)의 제조
10.1 아스피린(Asp) 및 클로피도그렐(Clo)로 부하된 리포솜 나노 베지클 LP1-(Asp/Clo)의 제조
4 mg의 스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC), 콜레스테롤, 미리스토일 포스포에탄올아민(DMPE)(몰 비율은 4:1:1임)을 칭량하고, 약물 아스피린(Asp) 및 클로피도그렐(Clo)(약물들의 몰 비율은 1:1이고, 전체 약물 대 지질의 몰 비율은 1:10임)을 첨가하고, 이어서, 10 mL의 클로로포름으로 용해시켰다. 유기 용매를 완만한 회전 증발 수단(65℃ 수조, 90 r/min, 30 분)에 의해서 제거하여 용기의 벽 상에 박막을 형성시켰다. 용기를 50℃의 항온 수조 케틀에 넣어 박막을 충분히 수화시켜서, 미정제 리포솜 나노 베지클 현탁액을 형성시켰다. 미정제 리포솜 나노 베지클 현탁액을 초음파조에서 초음파 파쇄하였고, 이어서 현탁액을 프로브형 초음파 파쇄기로 3 분(진폭 20, 간격 3초) 동안 추가로 초음파 파쇄하였다. 정제된 리포솜 나노 베지클 현탁액 중의 비캡슐화된 약물을 세파덱스 컬럼 G-100에 의해서 제거하였다.
10.2 콜라겐(Col)에 의해서 개질된 부하된 리포솜 나노 베지클(LP1-(Asp/Clo)-Col)의 제조
10 mg의 Col을 초순수에 완전히 용해시키고, 3 mg의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC.HCl) 및 3 mg의 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 커플링제를 첨가하여 카르복실기를 활성화시켰다. 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반시킨 후에, 활성화된 Col을 한외 여과 및 원심분리에 의해서 정제하였다. 1.0 mL의 화설화된 Col을 정제된 LP1-(Asp/Clo) 용액에 용해시켜, LP1-(Asp/Clo) 상의 Col의 커플링을 실현시키고, 표적 인식 리포솜 베지클 LP1-(Asp/Clo)-Col을 얻었다. 도 11은 실시예 10에서의 LP1-(Asp/Clo)-Col의 적외선 특성화 다이어그램이다.
실시예 11: 불소 18(18F)-표지된 플루데옥시글루코스 (F-FDG)로 부하되고 오스테오폰틴(OPN)에 의해서 개질된 리포솜 나노 베지클(LP1-(F-FDG)-OPN)의 제조
11.1 F-FDG로 부하된 리포솜 나노 베지클 (LP1-(F-FDG))의 제조
4 mg의 스테아로일 포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤, 미리스토일 포스포에탄올아민(DMPE)(몰 비율은 4:1:1임)을 칭량하고, 이어서, 10 mL의 클로로포름으로 용해시켰다. 유기 용매를 완만한 회전 증발 수단(65℃ 수조, 90 r/min, 30 분)에 의해서 제거하여 용기의 벽 상에 박막을 형성시켰다. 10 mL의 1 mgmL-1 F-FDG 용액(전체 약물 대 지질의 몰 비율은 1:10임)을 첨가하고, 용기를 50℃의 항온 수조 케틀에 넣어 박막을 충분히 수화시켜, 미정제 리포솜 나노 베지클 현탁액을 형성시켰다. 미정제 리포솜 나노 베지클 현탁액을 초음파조에서 초음파 파쇄하였고, 이어서, 현탁액을 프로브형 초음파 파쇄기로 3 분(진폭 20, 간격 3초) 동안 추가로 초음파 파쇄시켰다. 정제된 리포솜 나노 베지클 현탁액 중의 비캡슐화된 약물을 세파덱스 컬럼 G-100에 의해서 제거하였다.
11.2 F-FDG으로 부하되고 오스테오폰틴(OPN)에 의해서 개질된 리포솜 나노 베지클(LP1-(F-FDG))의 제조
1 mg의 OPN을 초순수에 완전히 용해시키고, 0.5 mg의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC.HCl) 및 0.5 mg의 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 커플링제를 첨가하여 카르복실기를 활성화시켰다. 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반시킨 후에, 활성화된 OPN을 한외 여과 및 원심분리에 의해서 정제하였다. 활성화된 OPN을 정제된 LP1-(F-FDG) 용액에 용해시켜, LP1-(F-FDG) 상의 OPN의 커플링을 실현시키고, 표적 인식 나노 캐리어 LP1-(F-FDG)-OPN을 얻었다. 도 12는 실시예 11에서의 LP1-(F-FDG)-OPN의 적외선 특성화 다이어그램이다.
실험예 1: 본 발명의 나노캐리어 전달 시스템의 특성의 조사
본 실시예에서는, 실시예 1에서 제조된 치료제로 부하된 나노캐리어 전달 시스템을 예로서 취하여 본 발명의 캐리어 전달 시스템이 안정하고 조절 가능한 특성을 가지며, 그에 따라서, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환의 진단, 방지 및 치료에 적합함을 입증하고 있다.
1. 약물 농도의 측정을 위한 방법:
부하된 약물, 로수바스타틴, 아토르바스타틴, 덱사메타손, 아스피린, 클로피도그렐 및 불소 18(18F)-표지된 플루데옥시글루코스는 강한 자외선 흡수성을 가지며, 그에 따라서, 이의 함량은 로수바스타틴, 아토르바스타틴, 덱사메타손, 아스피린, 클로피도그렐, 불소 18(18F)-표지된 플루데옥시글루코스의 자외선 흡수성을 이용함으로써 HPLC-UV 방법(Waters 2487을 사용함, Waters Corporation, U.S.A.)에 의해서 측정될 수 있다. 표준의 정량적 방정식은 로수바스타틴, 아토르바스타틴, 덱사메타손, 아스피린, 클로피도그렐, 불소 18(18F)-표지된 플루데옥시글루코스 용액(X)의 다양한 농도 대 HPLC 크로마토그래피 피크(Y)의 피크 면적에 의해서 확립되었다.
2. 수력학적 크기의 측정:
본 발명의 캐리어 전달 시스템 LP1-(R)-HA, LP1-(R)-SP, LP1-(R)-HA/Tat, LP2-(At)-HA, LP2-(At)-SEP/IM7, LP2-(At/miRNA-33a)-IM7, LP2-(AuNP/R)-OPN, LP1-(Fe3O4/DXMS)-HI44a, LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a, LP1-(Asp/Clo)-Col, LP1-(F-FDG)-OPN의 수력학적 크기를 레이저 입자 분석기(BI-Zeta Plus/90 Plus, Brookhaven Instruments Corporation, U.S.A.)에 의해서 측정하였고, 특이적 결과를 표 1에 나타낸다.
3. 캡슐화율의 측정:
특정의 품질의 약물 현탁액을 취하고, 과량의 메탄올을 첨가하여 환류시키고 그 부하 약물을 추출하고, 추가로, 초음파 추출을 채택하여 캐리어로부터의 약물 방출을 촉진시켰다. 생성되는 액체 중의 약물 함량을 HPLC(Waters 2487, Waters Corporation, U.S.A.)에 의해서 측정하고, 캡슐화율을 식 1에 따라서 계산하였다.
Figure pct00001
4. 약물-부하율의 측정:
약물 부하율을 측정하기 위한 방법은, 계산 방법이 약간 상이한 것을 제외하고는, 캡슐화율을 측정하는 방법과 유사하다. 특정 물질의 약물 현탁액을 취하고, 과량의 메탄올을 첨가하여 환류시키고 그러한 부하 약물을 추출하고, 추가로, 초음파 추출을 채택하여 캐리어로부터의 약물 방출을 촉진시킨다. 생성되는 액체 중의 약물 함량을 HPLC(Waters 2487, Waters Corporation, U.S.A.)로 측정하였고, 캡슐화율을 하기 식에 따라서 계산하였다.
Figure pct00002
생성되는 액체 중의 약물 함량을 HPLC(Waters 2487, Waters Corporation, U.S.A.)에 의해서 측정하고, 캡슐화율을 식 2에 따라서 계산하였다.
표 1: 다양한 특성의 목록
Figure pct00003
주: 상기 데이터는 동시 5회 측정의 결과의 "평균 + 표준편차"의 형태로 표현된다.
5. 장기간 안정성의 조사
본 발명의 나노캐리어 전달 시스템 LP1-(R)-HA, LP1-(R)-SP, LP1-(R)-HA/Tat, LP2-(At)-HA, LP2-(At)-SEP/IM7, LP2-(At/miRNA-33a)-IM7, LP2-(AuNP/R)-OPN, LP1-(Fe3O4/DXMS)-HI44a, LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a, LP1-(Asp/Clo)-Col, LP1-(F-FDG)-OPN을 4℃에서 저장하고 상이한 시점에서 샘플을 채취하였다. 이들의 수력학적 크기에서의 변화를 레이저 입자 분석기 (BI-Zeta Plus/90 Plus, Brookhaven Instruments Corporation, U.S.A.)에 의해서 검출하고, 결과를 도 13에 나타낸다. 도 13은 입자 크기 안정성에 대한 장기간 저장의 영향이다.
6. 장기간 캡슐화율의 조사
본 발명의 나노캐리어 전달 시스템 LP1-(R)-HA, LP1-(R)-SP, LP1-(R)-HA/Tat, LP2-(At)-HA, LP2-(At)-SEP/IM7, LP2-(At/miRNA-33a)-IM7, LP2-(AuNP/R)-OPN, LP1-(Fe3O4/DXMS)-HI44a, LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a, LP1-(Asp/Clo)-Col, LP1-(F-FDG)-OPN을 4℃에서 저장하고 상이한 시점에서 샘플을 채취하였고, 유리 약물을 한외 여과 및 원심분리에 의해서 제거하여 이들의 캡슐화율에서의 변화를 검출하였고, 결과를 도 14에 나타낸다. 도 14는 캡슐화율에 대한 장기간 저장의 영향이다.
7. 시험관내 약물 방출 성능에 대한 연구
2 mL의 본 발명의 나노캐리어 전달 시스템 LP1-(R)-HA, LP1-(R)-SP, LP1-(R)-HA/Tat, LP2-(At)-HA, LP2-(At)-SEP/IM7, LP2-(At/miRNA-33a)-IM7, LP2-(AuNP/R)-OPN, LP1-(Fe3O4/DXMS)-HI44a, LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a, LP1-(Asp/Clo)-Col, LP1-(F-FDG)-OPN을 투석 백(dialysis bag)에 넣고 밀봉하였다. 이어서, 투석 백을 50 mL의 방출 매질(PBS 용액, pH = 7.4)에 넣고, 37℃에서 120 시간 동안 인큐베이션하였다. 2 mL의 방출 액체를 상이한 시점에서 취하고, 동일한 부피의 PBS 용액을 보충하였다. 방출 액체 중의 약물 함량을 HPLC(Waters 2487, Waters Corporation, U.S.A.)에 의해서 검출하였고, 누적 약물 방출율을 식 3에 따라서 계산하였다.
Figure pct00004
식 3에서의 각각의 파라미터의 의미는 다음과 같다:
CRP: 누적 약물 방출율
Ve: 방출 액체의 변위 용적, 여기에서 Ve는 2 mL임
V0: 방출 시스템 내의 방출 액체의 용적, 여기에서, V0는 50 mL임
Ci: μg/mL로의 i 번째 대체 및 샘플 채취에서의 방출 액체 중의 약물의 농도
M 약물: μg으로의 세라좀(cerasome) 또는 리포솜 전달 시스템 내의 약물의 전체 질량
n: 방출 액체의 대체 횟수
Cn: 방출 액체의 n 번째 대체 후에 측정된 방출 시스템 중의 약물 농도.
시험관내 방출은 나노입자 전달 시스템을 평가하기 위한 중요한 지표이다. 도 15는 본 발명의 리포솜 전달 시스템의 누적 약물 방출율에서의 변화를 나타내는 그래프이다.
실험예 2: 표적화 메커니즘에 대한 연구
본 예에서는, 취약 플라크에서의 내피세포의 표면에 대한 CD44의 밀도 및 HA에 대한 이의 친화성이 연구되어, 취약 플라크를 표적하기 위한 본 발명의 전달 시스템에 대한 표적으로서 취약 플라크 내의 CD44를 선택하기 위한 실험 기반을 제공한다.
1) 동맥 취약 플라크에서의 내피세포의 표면과 마우스의 정상 동맥 혈관벽의 내피세포의 표면 상의 CD44 함량의 비교
죽상동맥경화성 취약 플라크의 마우스 모델의 구성
SPF-등급 ApoE-/- 마우스(주령 10주, 체중 20 ± 1 g)를 실험 동물로서 취하였다. 마우스에게 4 주 동안 적응성 고지방식(adaptive high-fat)(지방 10% (w/w), 콜레스테롤 2%(w/w), 소듐 콜레이트 0.5%(w/w), 및 마우스를 위한 나머지 정상 사료)을 제공하였고, 이어서, 40 mg/kg의 투여량으로 1%의 소듐 펜토바르비탈(sodium pentobarbital)(1 mg의 소듐 펜토바르비탈을 100 mL의 생리 식염수에 첨가함으로써 제조됨)의 복강내 주입에 의해서 마취시켰다. 이어서, 마우스를 반듯이 누운 위치로 수술대에 고정시켰고, 75% (v/v) 알코올로 목 주위를 소독하였고, 목 피부를 세로로 절개하였고, 앞목샘(anterior cervical gland)을 뭉툭하게 분리하였고, 맥박이 있는 좌측 총경동맥을 기관의 좌측 상에서 관찰할 수 있다. 총경동맥을 주의해서 분기점으로 분리시켰다. 2.5 mm의 길이 및 0.3 mm의 내부 크기를 갖는 실리콘 캐뉼라(silicone cannula)를 좌측 총경동맥의 외주 상에 두었다. 캐뉼라의 근위 및 원위 세그먼트는 필라멘트에 의해서 좁아지고 고정되었다. 국소 조임은 증가된 전단력에 의한 근위 단부에서의 빠른 혈류를 유발시키고, 그에 따라서, 혈관의 내막에 손상을 준다. 경동맥을 재위치시키고, 목 피부를 간헐적으로 봉합하였다. 모든 작업은 10x 입체 현미경 하에 수행되었다. 수술로부터 깨어난 후에, 마우스를 케이지에 다시 넣었고, 그곳에서 주위 온도는 20 내지 25℃로 유지되었고, 빛은 12 시간/12 시간 낮/밤 사이클 하에 유지되었다. 수술 후 4 주째에, 리포폴리사카라이드(LPS)(0.2 ml의 포스페이트 완충된 염수 중 1 mg/kg, Sigma, U.S.A.)를 주당 2회 10주 동안 복강내 주입하여 만성 염증을 유도하였다. 수술 후 8주째에, 마우스를 전체 6주 동안 주당 5일로 하루에 6시간 동안 50 ml 주사기(충분한 통풍이 보유됨)에 넣어 제한적인 정신적 스트레스를 촉발시켰다. 죽상동맥경화성 취약 플라크의 마우스 모델을 수술 후 14주째에 완료시켰다. 도 16a 및 도 16b는 마우스 죽상동맥경화성 취약 플라크 모델의 핵 자기 공명 영상화의 이미지를 나타낸다. 화살표가 가리키고 있는 부분으로부터 좌측 경동맥 플라크가 형성되어, 성공적인 모델이 형성되었음을 알 수 있고, 우측 경동맥이 비교를 위한 정상 동맥 혈관벽으로서 사용될 수 있다.
정상 동맥 혈관의 내피세포와 모델 마우스의 동맥 취약 플라크에서의 내피세포를 면역 조직 화학적 염색 및 이미지 분석에 의한 CD44 함량 측정을 위해서 취하였고, 특이적 실험방법은 다음과 같다:
마우스 경동맥 죽상동맥경화성 취약 플라크 표본을 취하고 10 mL/L 포름알데하이드 수용액으로 고정시키고, 파라핀으로 매립시키고, 4 μm로 절단하고, 통상의 방식으로 밀납을 제거하고, 수화시켰고, CD44 함량을 스트렙타비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합 방법(streptavidin-biotin-peroxidase complex method: SABC)에 의해서 검출하였다. 표본을 30 mL/L H2O2 수용액에 침지시켜 내인성 퍼옥시다제의 활성을 차단하였고, 표본을 항원 마이크로파 복구(antigen microwave repair)를 위한 시트레이트 완충액에 넣었다. 이어서, 50 g/L 소 혈청 알부민(BSA) 차단 용액을 적가하였고, 샘플을 실온에서 20분 동안 정치시켰다. 이어서, 쥐 항-CD44 다클론성 항체(1 : 100)를 적가하고, 샘플을 4℃의 냉장고에 밤새 두었고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 표본을 세척하고, 이어서, 비오틴화된 염소 항-마우스 IgG를 적가하고 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이어서, 이를 포스페이트 완충된 염수(PBS)로 세척하고, 겨자무 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)-표지된 SABC 복합체를 적가하고, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 상기 각각의 단계를 PBS로 세척하였다. 마지막으로, 색상 전개를 DAB로 수행하고(색상 전개는 현미경 하에 조절됨), 헤마톡실린(hematoxylin)으로 다시 염색하였고, 이어서, 샘플을 탈수시키고 밀봉시켰다. 섹션들을 BI-2000 이미지 분석 시스템의 면역 조직 화학적 분석 시스템에 의해서 분석하였다. 세 개의 섹션을 각각 정상 동맥 혈관의 내피세포와 동맥 취약 플라크에서의 내피세포를 위해서 수거하고, 다섯 개의 대표적인 영역을 무작위로 선택하였다. CD44의 양성 발현은 다음과 같다: 세포막 및 세포질은 황갈색/초콜릿-갈색이고, 배경은 투명하고, 색상이 더 어두울수록 CD44의 발현이 더 강하다. CD44의 음성 발현은 다음과 같다: 황갈색 입자가 발견되지 않는다. 정상 동맥 혈관의 내피세포 및 동맥 취약 플라크에서의 내피세포 내의 양성 세포의 평균 흡광도(A) 값을 측정하고 비교하였다. 결과를 도 17에 나타낸다.
도 17은 정상 동맥 혈관벽의 내피세포 및 모델 마우스의 동맥 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44 함량(반-정량적 적분)의 측정 결과를 나타낸다. 도면에 나타낸 바와 같이, 동맥 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44 함량은 정상 동맥 혈관벽의 내피세포의 표면 상의 CD44 함량의 대략 2.3배이다.
2) 리간드 및 항체에 대한 동맥 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 및 마우스의 정상 동맥 혈관벽의 내피세포의 표면 상의 CD44의 친화성의 비교
CD44에 대한 천연 리간드는 HA, GAG, 콜라겐, 라미닌, 파이브로넥틴, 셀렉틴, 오스테오폰틴 (OPN), 및 단클론 항체 HI44a, HI313, A3D8, H90, IM7, 등을 포함한다.
정상 동맥 혈관벽에서의 내피세포 및 모델 마우스의 동맥 취약 플라크에서의 내피세포를 취하고, 10 mg/ml의 농도로 아미노 플루오르세인으로 표지된 리간드/항체를 첨가하였고, 샘플을 37℃에서 5% CO2 인큐베이터 내의 둘베릭 변형된 이글 배지(Dulberic modified Eagle's medium: DMEM)(10% 용적 분율의 송아지 혈청(calf serum), 100 U/ml 페니실린, 100 U/ml 스트렙토마이신을 함유함)에서 배양하였다. 30분 후에, 평균 형광 세기(MFI)를 유세포 분석(flow cytometry)(CytoFLEX, Beckman Coulter, U.S.A.)에 의해서 측정하였고, 두 세포 모두의 표면 상의 FL-리간드/항체의 결합력 적분값을 계산하였다(리간드/항체에 대한 정상 동맥 혈관벽의 내피세포의 CD44의 결합력을 1로 설정함). 결과를 도 18에 도시한다.
도 18에 도시된 바와 같이, HA에 대한 동맥 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 동맥 혈관벽의 내피세포의 것의 대략 24배이다. 이는 정상 동맥 혈관벽의 내피세포의 표면 상의 CD44의 대부분은 그것이 리간드 HA에 결합할 수 없는 정적 상태에 있는 반면에, 동맥 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44는 내부 환경에 있는 인자들, 예컨대, 염증성 인자들에 의해서 활성화되고, HA에 대한 친화성이 유의하게 증가됨을 나타낸다.
CD44의 다른 리간드는 HA에 대해 유사한 결과를 가지며, GAG에 대한 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 22배이고, 콜라겐에 대한 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 21배이고, 라미닌에 대한 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 16배이고, 파이브로넥틴에 대한 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 18배이고, 셀렉틴에 대한 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 19배이고, 오스테오폰틴에 대한 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 17배이다.
유사한 결과를 CD44의 단클론 항체에 대해서 관찰하였다: HI44a에 대한 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 15배이고, HI313에 대한 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 21배이고, A3D8에 대한 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 17배이고, H90에 대한 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 9배이고, IM7에 대한 취약 플라크에서의 내피세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 8배이다.
3) 리간드/항체에 대한 플라크의 외부의 대식세포의 표면 상의 CD44의 친화성과 동맥 취약 플라크의 내부의 대식세포의 것의 비교
모델 마우스의 복강내 대식세포와 동맥 취약 플라크의 내부의 대식세포를 취하고, 10 mg/ml의 농도로 아미노 플루오르세인으로 부하된 리간드/항체를 첨가하였고, 샘플을 37℃에서 5% CO2 인큐베이터 내의 DMEM(10% 용적 분율의 송아지 혈청(calf serum), 100 U/ml 페니실린, 100 U/ml 스트렙토마이신을 함유함)에서 배양하였다. 30분 후에, 평균 형광 세기(MFI)를 유세포 분석(flow cytometry)(CytoFLEX, Beckman Coulter, U.S.A.)에 의해서 측정하였고, 두 세포 모두의 표면 상의 FL-HA의 결합력 적분값을 계산하였다(리간드/항체에 대한 플라크의 외부의 대식세포의 표면 상의 CD44의 친화성을 1로 설정함). 결과를 도 19에 도시한다.
도 19에 도시된 바와 같이, 동맥 취약 플라크의 내부의 대식세포의 표면 상의 CD44-HA의 결합력은 플라크의 외부의 대식세포의 표면 상의 CD44-HA의 결합력의 대략 40배이다. 이는 동맥 취약 플라크의 내부의 대식세포의 표면 상의 CD44가 내부 환경에서의 인자들, 예컨대, 염증성 인자들에 의해서 또한 활성화되고 HA에 대한 친화성이 유의하게 증가됨을 나타낸다.
CD44의 다른 리간드가 HA에 대한 유사한 결과는 가지며, GAG에 대한 취약 플라크에서의 대식세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 33배이고, 콜라겐에 대한 취약 플라크에서의 대식세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 38배이고, 라미닌에 대한 취약 플라크에서의 대식세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 37배이고, 파이브로넥틴에 대한 취약 플라크에서의 대식세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 35배이고, 셀렉틴에 대한 취약 플라크에서의 대식세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 33배이고, 오스테오폰틴에 대한 취약 플라크에서의 대식세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 33배이다.
유사한 결과를 CD44의 단클론 항체에 대해서 관찰하였다: HI44a에 대한 취약 플라크에서의 대식세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 17배이고, HI313에 대한 취약 플라크에서의 대식세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 20배이고, A3D8에 대한 취약 플라크에서의 대식세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 16배이고, H90에 대한 취약 플라크에서의 대식세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 9배이고, IM7에 대한 취약 플라크에서의 대식세포의 표면 상의 CD44의 결합력 적분값은 정상 세포의 값의 10배이다.
상기 실험의 결과를 기반으로 하여, 다음 결론이 도출될 수 있다: 정상 세포 (예컨대, 정상 동맥 혈관벽의 내피세포, 플라크 외부의 대식세포)와 비교하여, 취약 플라크 내의 세포(동맥 취약 플라크의 발생에 중요한 내피세포, 대식세포 등을 포함함)의 표면 상의 CD44의 밀도가 유의하게 증가되고, 리간드에 대한 이의 친화성이 유의하게 향상되어, 리간드에 대한 동맥 취약 플라크 내부의 CD44의 특이적 친화성이 정상 세포의 친화성보다 훨씬 더 높아서, 그것을 취약 플라크를 표적하기 위한 본 발명의 세라좀 전달 시스템에 대한 우수한 표적으로서 매우 유리하게 한다.
실험예 3: 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 로수바스타틴 전달 시스템 LP1-(R)-HA, LP1-(R)-SP, LP1-(R)-HA/Tat의 효과에 대한 생체내 실험
히알루론산(HA) 및 셀렉틴(SP)이 취약 플라크를 표적할 수 있는 CD44를 위한 리간드이다. 로수바스타틴(R)은 플라크를 역전시킬 수 있고, 막 투과 펩타이드 (Tat)는 약물의 국소 투과 및 집적(aggregation)을 증가시킬 수 있다. 본 예에서의 목적은 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명에 기재된 LP1-(R)-HA, LP1-(R)-SP, LP1-(R)-HA/Tat 캐리어 전달 시스템의 생체내 치료 효과를 입증하는 것이다.
실험 방법:
(1) 유리 로수바스타틴의 표준 생리 식염수 용액을 제조하고, 치료제로 부하된 리포솜 나노캐리어 전달 시스템을 상기 실시예 1 내지 3에 기재된 방법에 의해서 제조하였다.
(2) 동맥 취약 플라크의 ApoE-/- 마우스 모델의 확립:
SPF-등급 ApoE-/- 마우스(42 마리의 마우스, 주령 5-6 주, 체중 20 ± 1 g)를 실험 동물로서 이용하였다. 마우스에게 4 주 동안 적응성 고지방식(adaptive high-fat)(지방 10% (w/w), 콜레스테롤 2%(w/w), 소듐 콜레이트 0.5%(w/w), 및 마우스를 위한 나머지 정상 사료)을 제공하였고, 이어서, 40 mg/kg의 투여량으로 1%의 소듐 펜토바르비탈(1 mg의 소듐 펜토바르비탈을 100 mL의 생리 식염수에 첨가함으로써 제조됨)의 복강내 주입을 통해서 마취시켰다. 이어서, 마우스를 반듯이 누운 위치로 수술대에 고정시켰고, 75% (v/v) 알코올로 목 주위를 소독하였고, 목 피부를 세로로 절개하였고, 앞목샘을 뭉툭하게 분리하였고, 맥박이 있는 좌측 총경동맥을 기관의 좌측 상에서 관찰할 수 있다. 총경동맥을 주의해서 분기점(bifurcation)으로 분리시켰다. 2.5 mm의 길이 및 0.3 mm의 내부 크기를 갖는 실리콘 캐뉼라(silicone cannula)를 좌측 총경동맥의 외주 상에 두었다. 캐뉼라의 근위 및 원위 세그먼트는 필라멘트에 의해서 좁아지고 고정되었다. 국소 조임은 증가된 전단력에 의한 근위 단부에서의 빠른 혈류를 유발시키고, 그에 따라서, 혈관의 내막에 손상을 준다. 경동맥을 재위치시키고, 목 피부를 간헐적으로 봉합하였다. 모든 작업은 10x 입체 현미경 하에 수행되었다. 수술로부터 깨어난 후에, 마우스를 케이지에 다시 넣었고, 그곳에서 주위 온도는 20 내지 25℃로 유지되었고, 빛은 12 시간/12 시간 낮/밤 사이클 하에 유지되었다. 수술 후 4 주째에, 리포폴리사카라이드(LPS)(0.2 ml의 포스페이트 완충된 염수 중 1 mg/kg, Sigma, U.S.A.)를 주당 2회 10주 동안 복강내 주입하여 만성 염증을 유도하였다. 수술 후 8주째에, 마우스를 전체 6주 동안 주당 5일로 하루에 6시간 동안 50 ml 주사기(충분한 통풍이 보유됨)에 넣어 제한적인 정신적 스트레스를 촉발시켰다. 죽상동맥경화성 취약 플라크의 마우스 모델을 수술 후 14주째에 완료시켰다.
(3) 실험 동물의 그룹 구성 및 치료:
실험 동물을 각 그룹 당 6 마리 마우스로 하기 그룹으로 무작위로 나누었다:
취약 플라크 모델의 대조 그룹: 본 동물 그룹에게는 어떠한 치료제 치료가 진행되지 않음;
로수바스타틴이 위내 투여된 그룹: 체중 kg당 10 mg의 로수바스타틴의 투여량으로 위내 투여에 의한 치료;
로수바스타틴이 정맥내 투여된 그룹: 체중 kg당 0.66 mg의 로수바스타틴의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
LP1-(R)-HA 그룹: 체중 kg당 0.66 mg의 로수바스타틴의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
LP1-(R)-SP 그룹: 체중 kg당 0.66 mg의 로수바스타틴의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
LP1-(R)-HA/Tat 그룹: 체중 kg당 0.66 mg의 로수바스타틴의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
취약 플라크 모델의 대조 그룹을 제외하고, 치료 그룹은 이틀에 한번씩 전체 5회의 치료로 치료되었다. 각각의 그룹에서의 동물에 대해서, 경동맥 MRI 스캔을 치료 전후에 수행하여 플라크 및 루멘 면적을 검출하고, 플라크 진행의 백분율을 계산하였다.
플라크 진행의 백분율 = (치료 후 플라크 면적 - 치료 전 플라크 면적)/루멘 면적.
실험 결과:
도 20은 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 캐리어 전달 시스템 LP1-(R)-HA, LP1-(R)-SP, LP1-(R)-HA/Tat의 생체내 치료 효과를 나타낸다. 도면에 도시된 바와 같이, 고지방식 공급 동안에(10일), 대조 그룹 (어떠한 치료 없음)의 죽상동맥경화증은 36.23%까지 진행되었다. 로수바스타틴의 위내 투여는 플라크의 진행을 지연시킬 수 있지만, 그것은 또한 33.9%까지 진행된다. 로수바스타틴의 정맥내 투여가 또한 플라크 진행을 지연시켰지만, 그것은 또한 32.46%까지 진행시켰다. 그러나, 표적된 나노 약물 전달 치료법은 플라크의 진행을 유의하게 억제시켰고, 심지어 역전시켰고, 플라크 용적을 줄어들게 하였다. LP1-(R)-HA 그룹은 플라크를 10.87%까지 제거하였고, LP1-(R)-SP는 플라크를 8.74%까지 제거하였고, LP1-(R)-HA/Tat 그룹은 플라크를 13.2%까지 제거하였다.
요약해서 말하면, 유리 로수바스타틴은, 위내 투여이든 정맥내 투여이든, 마우스에서의 동맥 취약 플라크에 대한 어떠한 치료 효과가 있지만, 그것은 취약 플라크가 계속 성장하는 것을 방지할 수 없다. 그러나, 로수바스타틴이 본 발명의 나노 전달 시스템에 제형화되는 때에는, 취약 플라크에 대한 치료 효과가 유의하게 개선되고, 플라크 성장을 역전시키는(플라크를 좁히는) 치료 효과가 달성되고, 기능적으로 개질된 나노 시스템은 더 우수한 효과가 있다.
실험예 4: 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 전달 시스템 LP2-(At)-HA, LP2-(At)-SEP/IM7, LP2-(At/miRNA-33a)-IM7의 효과에 대한 생체내 실험
히알루론산(HA) 및 IM7이 취약 플라크를 표적할 수 있는 CD44에 대한 리간드이다. 아토르바스타틴(At)은 플라크를 역전시킬 수 있고, 자가 펩타이드(SEP)는 약물의 국소 투과 및 집적을 증가시킬 수 있고, miRNA-33a는 콜레스테롤 유출을 증가시킬 수 있다. 본 예의 목적은 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명에 기재된 LP2-(At)-HA, LP2-(At)-SEP/IM7, LP2-(At/miRNA-33a)-IM7 캐리어 전달 시스템의 생체내 치료 효과를 입증하는 것이다.
실험 방법:
(1) 유리 아토르바스타틴의 표준 생리 식염수 용액을 제조하였고, 치료제가 부하된 리포솜 나노캐리어 전달 시스템을 상기 실시예 4 내지 6에서 기재된 방법에 의해서 제조하였다.
(2) 실험예 4에 따른 동맥 취약 플라크의 ApoE-/- 마우스 모델의 확립
(3) 실험 동물의 그룹 구성 및 치료:
실험 동물을 각 그룹 당 6 마리 마우스로 하기 그룹으로 무작위로 나누었다:
취약 플라크 모델의 대조 그룹: 본 동물 그룹에게는 어떠한 치료제 치료가 진행되지 않음;
아토르바스타틴이 위내 투여된 그룹: 체중 kg당 20 mg의 아토르바스타틴의 투여량으로 위내 투여에 의한 치료;
아토르바스타틴이 정맥내 투여된 그룹: 체중 kg당 1.2 mg의 아토르바스타틴의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
PEG-비함유 LP2-(At)-HA 그룹: 체중 kg당 1.2 mg의 아토르바스타틴의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
LP2-(At)-HA 그룹: 체중 kg당 1.2 mg의 아토르바스타틴의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
LP2-(At)-IM7 그룹: 체중 kg당 1.2 mg의 아토르바스타틴의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
LP2-(At)-SEP/IM7 그룹: 체중 kg당 1.2 mg의 아토르바스타틴의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
LP2-(At/miRNA-33a)-IM7 그룹: 체중 kg당 1.2 mg의 아토르바스타틴의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
취약 플라크 모델의 대조 그룹을 제외하고, 치료 그룹은 이틀에 한번씩 전체 5회의 치료로 치료되었다. 각각의 그룹에서의 동물에 대해서, 경동맥 MRI 스캔을 치료 전후에 수행하여 플라크 및 루멘 면적을 검출하고, 플라크 진행의 백분율을 계산하였다.
플라크 진행의 백분율 = (치료 후 플라크 면적 - 치료 전 플라크 면적)/루멘 면적.
실험 결과:
도 21은 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 캐리어 전달 시스템 LP2-(At)-HA, LP2-(At)-SEP/IM7, LP2-(At/miRNA-33a)-IM7의 생체내 치료 효과를 나타낸다. 도면에 도시된 바와 같이, 고지방식 공급 동안에(10일), 대조 그룹(어떠한 치료 없음)의 죽상동맥경화증은 34.87%까지 진행되었다. 아토르바스타틴의 위내 투여는 플라크의 진행을 지연시킬 수 있지만, 그것은 또한 33.21%까지 진행된다. 아토르바스타틴의 정맥내 투여가 또한 플라크 진행을 지연시켰지만, 그것은 또한 32.98%까지 진행시켰다. 그러나, 표적된 나노 약물 전달 치료법은 플라크의 진행을 유의하게 억제시켰고, 심지어 역전시켰고, 플라크 용적을 줄어들게 하였다. PEG-비함유 LP2-(At)-HA 그룹은 플라크를 6.9%까지 제거하였고, LP2-(At)-HA 그룹는 플라크를 12.65%까지 제거하였고, LP2-(At)-IM7은 플라크를 5.1%까지 제거하였고, LP2-(At)-SEP/IM7은 플라크를 12.43%까지 제거하였고, LP2-(At/miRNA-33a)-IM7t 그룹은 플라크를 14.22%까지 제거하였다.
요약해서 말하면, 유리 아토르바스타틴은, 위내 투여이든 정맥내 투여이든, 마우스에서의 동맥 취약 플라크에 대한 어떠한 치료 효과가 있지만, 그것은 취약 플라크가 계속 성장하는 것을 방지할 수 없다. 그러나, 아토르바스타틴이 본 발명의 나노 전달 시스템에 제형화되는 때에는, 취약 플라크에 대한 치료 효과가 유의하게 개선되고, 플라크 성장을 역전시키는(플라크를 좁히는) 치료 효과가 달성되고, PEG 또는 SEP 기능적 개질을 갖는 나노 시스템은 더 우수한 효과가 있고, 스타틴 및 핵산이 부하된 나노캐리어가 유의한 효과가 있다.
실험예 5: 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 전달 시스템 LP2-(AuNP/R)-OPN의 효과에 대한 생체내 실험(CT 추적 및 치료법의 이중 기능)
오스테오폰틴(OPN)이 취약 플라크를 표적할 수 있는 CD44에 대한 리간드이다. 로수바스타틴(R)은 플라크를 역전시킬 수 있고, 나노골드(Au NP)는 CT 추적자이다. 본 예의 목적은 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명에 기재된 CT 추적자 및 로수바스타틴이 부하된 나노캐리어 전달 시스템의 생체내 추적 및 치료 효과를 입증하는 것이다.
실험 방법:
(1) 유리 로수바스타틴의 표준 생리 식염수 용액을 제조하였고, CT 추적자 및 치료제가 부하된 리포솜 나노 전달 시스템을 상기 실시예 7에서 기재된 방법에 의해서 제조하였다.
(2) 실험예 4에 따른 동맥 취약 플라크의 ApoE-/- 마우스 모델의 확립.
(3) 실험 동물에서의 취약 플라크의 추적:
실험 동물을 각 그룹 당 6 마리 마우스로 하기 그룹으로 무작위로 나누었다:
유리 나노골드 그룹: 나노골드의 투여량은 0.1 mg/체중kg이었음;
LP2-(AuNP/R)-OPN 그룹: 나노골드의 투여량은 0.1 mg/체중kg이었음;
LP2-(이오프로마이드)-OPN 그룹: 이오프로마이드의 투여량은 0.1 mg/체중kg이었음;
LP2-(이오딕사놀)-OPN 그룹: 이오딕사놀의 투여량은 0.1 mg/체중kg이었음;
LP2-(요오도플루오로알코올)-OPN 그룹: 요오도플루오로알코올의 투여량은 0.1 mg/체중kg이었음.
각각의 실험 그룹에서의 동물에게 꼬리 정맥을 통해서 상응하는 추적자를 주입하였고, CT 영상화를 투여 전 및 투여 2시간 후에 수행하여 각각의 그룹에서의 죽상동맥경화성 취약 플라크의 식별을 관찰하였다.
(4) 실험 동물의 그룹 구성 및 치료:
실험 동물을 각 그룹 당 6 마리 마우스로 하기 그룹으로 무작위로 나누었다:
취약 플라크 모델의 대조 그룹: 본 동물 그룹에게는 어떠한 치료제 치료가 진행되지 않음;
로수바스타틴이 위내 투여된 그룹: 체중 kg당 10 mg의 로수바스타틴의 투여량으로 위내 투여에 의한 치료;
로수바스타틴이 정맥 투여된 그룹: 체중 kg당 0.67 mg의 로수바스타틴의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
LP2-(AuNP/R)-OPN 그룹: 체중 kg당 0.67 mg의 로수바스타틴의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
취약 플라크 모델의 대조 그룹을 제외하고, 치료 그룹은 이틀에 한번씩 전체 5회의 치료로 치료되었다. 각각의 그룹에서의 동물에 대해서, 경동맥 MRI 스캔을 치료 전후에 수행하여 플라크 및 루멘 면적을 검출하고, 플라크 진행의 백분율을 계산하였다.
플라크 진행의 백분율 = (치료 후 플라크 면적 - 치료 전 플라크 면적)/루멘 면적.
실험 결과:
도 22는 동맥 취약 플라크에 대한 추적자가 부하된 본 발명의 리포솜 전달 시스템의 생체내 추적 효과를 나타낸다. 도면에 도시된 바와 같이, 유리 나노골드 입자는 마우스에서의 동맥 취약 플라크에 대한 특정의 추적 효과를 나타낸다. 유리 나노골드 입자와 비교하여, 나노골드, 이오프로마이드, 이오딕사놀, 요오도플루오로알코올이 표적화 리포솜 전달 시스템에 제형화되는 때에, 취약 플라크에 대한 추적 효과가 유의하게 개선되었다. 요약하면, 표면이 표적화 리간드로 개질된 본 발명의 리포솜 전달 시스템으로의 투여는 유리 나노골드 입자의 투여에 비해서 취약 플라크에 대한 나노골드의 인식 효과를 유의하게 개선시켜서, 더 우수한 추적 효과를 생성시킬 수 있다.
도 23은 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 캐리어 전달 시스템 LP2-(AuNP/R)-OPN의 생체내 치료 효과를 나타낸다. 도면에 도시된 바와 같이, 고지방식 공급 동안에(10일), 대조 그룹(어떠한 치료 없음)의 죽상동맥경화증은 31.23%까지 진행되었다. 로수바스타틴의 위내 투여는 플라크의 진행을 지연시킬 수 있지만, 그것은 또한 30.9%까지 진행된다. 로수바스타틴의 정맥내 투여가 또한 플라크 진행을 지연시켰지만, 그것은 또한 25.34%까지 진행시켰다. 그러나, 표적된 나노 약물 전달 치료법은 플라크의 진행을 유의하게 억제시켰고, 심지어 역전시켰고, 플라크 용적을 줄어들게 하였다. LP2-(AuNP/R)-OPN 그룹은 플라크를 8.32%까지 제거하였다.
요약해서 말하면, 유리 로수바스타틴은, 위내 투여이든 정맥내 투여이든, 마우스에서의 동맥 취약 플라크에 대한 어떠한 치료 효과가 있지만, 그것은 취약 플라크가 계속 성장하는 것을 방지할 수 없다. 그러나, 로수바스타틴 및 나노골드가 본 발명의 나노 전달 시스템에 제형화되는 때에는, 취약 플라크에 대한 진단 및 치료 효과가 유의하게 개선되고, 고위험 환자에 대한 조기 경보 역할을 하고, 플라크 성장을 역전시키는(플라크를 좁히는) 치료 효과가 달성된다.
실험예 6: 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 전달 시스템 LP1-(Fe 3 O 4 /DXMS)-HI44a, LP1-(Fe 3 O 4 /IL-10)-HI44a의 효과에 대한 생체내 추적 실험(MRI 추적) 및 소염 치료
단클론 항체(HI44a)가 취약 플라크를 표적할 수 있는 CD44에 대한 리간드이다. 덱사메타손(DXMS)은 소염 및 플라크 진행 억제 효과가 있으며, Fe3O4은 MRI 추적자이다. 본 예의 목적은 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명에서 기재된 MRI 추적자 및 덱사메타손이 부하된 나노캐리어 전달 시스템의 생체내 추적 및 치료 효과를 입증하는 것이다. 또한, 가도테레이트 메글루민, 가도디아민 및 가도펜테틱산이 또한 나노-제제로 제조되어 표적화된 MRI 추적 효과를 나타낼 수 있다.
(1) MRI 추적자 및 치료제가 부하된 리포솜 나노 전달 시스템을 상기 실시예 8 및 9에 기재된 방법에 의해서 제조하였다.
(2) 실험예 4에 따른 동맥 취약 플라크의 ApoE-/- 마우스 모델의 확립.
(3) 실험 동물에서의 취약 플라크의 추적:
실험 동물을 각 그룹 당 6 마리 마우스로 하기 그룹으로 무작위로 나누었다:
유리 Fe3O4 그룹: Fe3O4의 투여량은 0.1 mg/체중kg이었음;
LP1-(Fe3O4/DXMS)-HI44a 그룹: Fe3O4의 투여량은 0.1 mg/체중kg이었음;
LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a 그룹: Fe3O4의 투여량은 0.1 mg/체중kg이었음;
LP1-(가도테레이트 메글루민)-HI44a 그룹: 가도테레이트 메글루민의 투여량은 0.1 mg/체중kg이었음;
LP1-(가도디아민)-HI44a 그룹: 가도디아민의 투여량은 0.1 mg/체중kg이었음;
LP1-(가도펜테틱산)-HI44a 그룹: 가도펜테틱산의 투여량은 0.1 mg/체중kg이었음.
각각의 실험 그룹에서의 동물에게 꼬리 정맥을 통해서 상응하는 추적자를 주입하였고, MRI 영상화를 투여 전 및 투여 2시간 후에 수행하여 각각의 그룹에서의 죽상동맥경화성 취약 플라크의 식별을 관찰하였다.
(4) 실험 동물의 그룹 구성 및 치료:
실험 동물을 각 그룹 당 6 마리 마우스로 하기 그룹으로 무작위로 나누었다:
취약 플라크 모델의 대조 그룹: 본 동물 그룹에게는 어떠한 치료제 치료가 진행되지 않음;
LP1-(Fe3O4/DXMS)-HI44a 그룹: 체중 kg당 0.1 mg의 덱사메타손의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a 그룹: 체중 kg당 0.1 μmol의 IL-10의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
취약 플라크 모델의 대조 그룹을 제외하고, 치료 그룹은 이틀에 한번씩 전체 5회의 치료로 치료되었다. 각각의 그룹에서의 동물에 대해서, 경동맥 MRI 스캔을 치료 전후에 수행하여 플라크 및 루멘 면적을 검출하고, 플라크 진행의 백분율을 계산하였다.
플라크 진행의 백분율 = (치료 후 플라크 면적 - 치료 전 플라크 면적)/루멘 면적.
실험 결과:
도 24는 동맥 취약 플라크에 대한 추적자가 부하된 본 발명의 리포솜 전달 시스템의 생체내 추적 효과를 나타낸다. 도면에 도시된 바와 같이, 유리 Fe3O4 입자는 마우스에서의 동맥 취약 플라크에 대한 특정의 추적 효과를 나타낸다. 유리 Fe3O4 입자와 비교하여, Fe3O4 입자가 표적화 리포솜 전달 시스템에 제형화되는 때에, 취약 플라크에 대한 추적 효과가 매우 유의하게 개선되었다. 다른 MRI 나노 조영제를 사용하는 경우에, 취약 플라크의 추적 효과가 또한 매우 우수하다. 요약하면, 표면이 표적화 리간드로 개질된 본 발명의 리포솜 전달 시스템으로의 투여는 유리 MRI 추적자의 투여에 비해서 취약 플라크에 대한 나노골드의 인식 효과를 유의하게 개선시켜서, 더 우수한 추적 효과를 생성시킬 수 있다.
도 25는 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 캐리어 전달 시스템 LP1-(Fe3O4/DXMS)-HI44a 및 LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a의 생체내 치료 효과를 나타낸다. 도면에 도시된 바와 같이, 고지방식 공급 동안에(10일), 대조 그룹(어떠한 치료 없음)의 죽상동맥경화증은 23.65%까지 진행되었다. 그러나, 표적된 나노 약물 전달 치료법은 플라크의 진행을 유의하게 억제시켰고, 심지어 역전시켰고, 플라크 용적을 줄어들게 하였다. LP1-(Fe3O4/DXMS)-HI44a 그룹은 플라크를 9.54%까지 제거하였다. LP1-(Fe3O4/IL-10)-HI44a 그룹은 플라크를 5.43%까지 제거하였다.
요약해서 말하면, 마우스에서의 동맥 취약 플라크의 경우에, 덱사메타손 또는 IL-10이 본 발명의 나노 전달 시스템에 제형화되는 때에는, 취약 플라크에 대한 진단 및 치료 효과가 유의하게 개선되고, 고위험 환자에 대한 조기 경보 역할을 하고, 플라크 성장을 역전시키는(플라크를 좁히는) 치료 효과가 달성된다. Fe3O4의 동시 부하는 질환의 MRI 영상화 및 실시간 모니터링을 달성할 수 있다.
실험예 7: 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 전달 시스템 LP1-(Asp/Clo)-Col의 효과에 대한 생체내 실험
아스피린(Asp) 및 클로피도그렐(Clo)은 혈소판 응집 및 심혈관 이벤트(cardiovascular event)에 의한 사망율을 감소시킬 수 있는 로부터의 항혈소판제이다. 본 예의 목적은 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명에 기재된 LP1-(Asp/Clo)-Col 캐리어 전달 시스템의 생체내 치료 효과를 입증하는 것이다.
실험 방법:
(1) 유리 아스피린 및 클로피도그렐의 표준 생리 식염수 용액을 제조하였고, 치료제가 부하된 리포솜 나노캐리어 전달 시스템을 상기 실시예 10에서 기재된 방법에 의해서 제조하였다.
(2) 동맥 취약 플라크의 ApoE-/- 마우스 모델의 확립: ApoE-/- 마우스에게 30 주 동안 고지방식을 공급하여 이들의 체동맥에서 죽상동맥경화성 플라크를 형성시켰고, 뱀독(snake venom)을 투여하여 취약 플라크의 파열의 유도하여 급성 관동맥 증후군(acute coronary syndrome)을 형성시켰다.
(3) 실험 동물의 그룹 구성 및 치료:
실험 동물을 각 그룹 당 10 마리 마우스로 하기 그룹으로 무작위로 나누었다:
취약 플라크 모델의 대조 그룹: 본 동물 그룹에게는 어떠한 치료제 치료가 진행되지 않음;
아스피린 및 클로피도그렐이 위내 투여된 그룹: 체중 kg당 100 mg의 아스피린 및 체중 kg당 75 mg의 클로피도그렐의 투여량으로 위내 투여에 의한 치료;
LP1-(Asp/Clo)-Col 그룹: 체중 kg당 10 mg의 아스피린 및 체중 kg당 7.5 mg의 클로피도그렐의 투여량으로 정맥내 투여에 의한 치료;
취약 플라크 모델의 대조 그룹을 제외하고, 치료 그룹은 이틀에 한번씩 전체 5회의 치료로 치료되었다. 각각의 그룹에서의 동물에 대해서, 1개월 이내의 마우스 사망율을 관찰하였고, 마우스의 출혈 시간(BT)을 꼬리 절단에 의해해서 검출하였다.
실험 결과:
도 26은 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 캐리어 전달 시스템 LP1-(Asp/Clo)-Col의 생체내 치료 효과를 나타낸다. 도면에 도시된 바와 같이, 대조 그룹(어떠한 치료 없음)에서의 마우스의 사망율은 50%이었다. 아스피린 및 클로피도그렐의 위내 투여는 사망율을 30%로 감소시켰다. LP1-(Asp/Clo)-Col 치료법은 사망율을 10%로 감소시켰다. 출혈 시간 시점으로부터, LP1-(Asp/Clo)-Col 그룹은 유의하게 연장시키지 않은 반면에, 아스피린 및 클로피도그렐의 위내 투여는 마우스에서의 출혈 시간을 유의하게 연장시켰다.
요약해서 말하면, 취약 플라크 파열이 있는 동물의 경우에, 경구 이중 항혈소판 치료법이 사망율을 감소시킬 수 있지만, 출혈 시간을 지연시키고 출혈 위험을 증가시킬 수 있다. 그러나, 항혈소판제을 나노 전달 시스템에 부하시키면 경구 약물 보다 더 우수한 효과가 있으며, 출혈 위험을 증가시키지 않는다.
실험예 8: 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명의 전달 시스템 LP1-(F-FDG)-OPN의 효과에 대한 생체내 실험
오스테오폰틴(OPN)은 취약 플라크를 표적할 수 있는 CD44에 대한 리간드이다. 로수바스타틴(R)은 플라크를 역전시킬 수 있고, 불소 18(18F)-표지된 플루데옥시글루코스(F-FDG)는 방사성동위원소 추적자이다. 본 예의 목적은 동맥 취약 플라크에 대한 본 발명에 기재된 방사성동위원소 추적자가 부하된 리포솜 나노캐리어 전달 시스템의 생체내 추적 및 치료 효과를 입증하는 것이다.
실험 방법:
(1) 유리 로수바스타틴의 표준 생리 식염수 용액을 제조하였고, 방사성동위원소 추적자 및 치료제가 부하된 리포솜 나노 전달 시스템을 상기 실시예 11에서 기재된 방법에 의해서 제조하였다.
(2) 실험예 4에 따른 동맥 취약 플라크의 ApoE-/- 마우스 모델의 확립.
(3) 실험 동물에서의 취약 플라크의 추적:
실험 동물을 각 그룹 당 6 마리 마우스로 하기 그룹으로 무작위로 나누었다:
유리 F-FDG 그룹: F-FDG의 투여량은 2 mSv/체중kg이었음;
LP1-(F-FDG)-OPN 그룹: F-FDG의 투여량은 2 mSv/체중kg이었음;
LP1-(99mTc)-OPN 그룹: 99mTc의 투여량은 2 mSv/체중kg이었음;
LP1-(I-131)-OPN 그룹: I-131의 투여량은 2 mSv/체중kg이었음.
각각의 실험 그룹에서의 동물에게 꼬리 정맥을 통해서 상응하는 추적자를 주입하였고, 방사성동위원소 영상화를 투여 전 및 투여 2시간 후에 수행하여 각각의 그룹에서의 죽상동맥경화성 취약 플라크의 식별을 관찰하였다.
실험 결과:
도 27은 동맥 취약 플라크에 대한 방사성동위원소 추적자가 부하된 본 발명의 리포솜 전달 시스템의 생체내 추적 효과를 나타낸다. 도면에 도시된 바와 같이, 유리 F-FDG는 마우스에서의 동맥 취약 플라크에 대한 어떠한 추적 효과를 나타내지 않는다. F-FDG, 테크네튬 99(99mTc), 요오드 131(I-131)이 표적화 리포솜 전달 시스템에 제형화되는 때에는, 취약 플라크에 대한 추적 효과를 매우 유의하게 개선시켰다. 요약하면, 표면이 표적화 리간드로 개질된 본 발명의 리포솜 전달 시스템으로의 투여는 유리 F-FDG에 비해서 취약 플라크에 대한 나노골드의 인식 효과를 유의하게 개선시켜서 더 우수한 추적 효과를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 다양한 양태가 상기 기재된 구체예에 의해서 예시되었다. 상기 기재된 구체예는 단지 예들을 예시하는 것이고 구체예를 제한하는 것으로 의도되지 않음이 자명하다. 다양한 형태의 다른 변화 또는 변형이 상기 설명을 감안하여 본 기술분야에서의 통상의 기술자에 의해서 이루어질 수 있다. 구현예의 모두를 기재할 필요도 없고 그러한 방법도 없다. 그로부터 발생되는 명백한 변경 또는 변화가 여전히 본 발명의 범위 내에 있다.

Claims (20)

  1. 활성화된 CD44 분자를 표적화하기 위한 리포솜 나노캐리어 전달 시스템(liposome nanocarrier delivery system)으로서,
    나노캐리어의 표면이 표적화 리간드에 의해서 부분적으로 개질되고, 표적화 리간드가 활성화된 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 리간드이고,
    임의로, 다른 개질이 나노캐리어의 표면에 대해서 이루어지고, 상기 다른 개질이 바람직하게는 PEG, 막 투과 펩타이드, 및 자가 펩타이드 SEP(self peptide SEP), 또는 동시에 개질된 이중 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상으로 캐리어의 표면 상에서 개질되는 것을 특징으로 하는, 리포솜 나노캐리어 전달 시스템.
  2. 취약 플라크를 표적화하기 위한 리포솜 나노캐리어 전달 시스템으로서,
    나노캐리어의 표면이 표적화 리간드에 의해서 부분적으로 개질되고, 표적화 리간드가 취약 플라크에서의 내피세포 상의 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 리간드이고,
    임의로, 다른 개질이 나노캐리어의 표면에 대해서 이루어지고, 상기 다른 개질이 바람직하게는 PEG, 막 투과 펩타이드, 및 자가 펩타이드 SEP, 또는 동시에 개질된 이중 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상으로 캐리어의 표면 상에서 개질되는 것을 특징으로 하는, 리포솜 나노캐리어 전달 시스템.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    리포솜 캐리어가 작은 단층 베지클(small unilamellar vesicle), 큰 단층 베지클 및 다중층 베지클로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 리포솜 나노캐리어 전달 시스템.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    표적화 리간드가 GAG, 콜라겐, 라미닌(laminin), 파이브로넥틴, 셀렉틴(selectin), 오스테오폰틴(osteopontin: OPN), 및 단클론 항체 HI44a, HI313, A3D8, H90 및 IM7로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 히알루론산 또는 히알루론산 유도체로부터 선택되고,
    바람직하게는, 표적화 리간드가 콜라겐, 히알루론산, 셀렉틴, 오스테오폰틴 또는 단클론 항체 HI44a, IM7로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 리포솜 나노캐리어 전달 시스템.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    나노캐리어가 CD44 분자 활성화의 존재와 관련된 질환을 진단하고/거나, 방지하고/거나, 치료하기 위한 물질로 부하되는 것을 특징으로 하는, 리포솜 나노캐리어 전달 시스템.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    나노캐리어가 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하고/거나, 방지하고/거나, 치료하기 위한 물질로 부하되고;
    바람직하게는, 물질이 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하기 위한 물질이고;
    더욱 바람직하게는, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하기 위한 물질이 추적자(tracer)이고;
    추가로 바람직하게는, 추적자가 CT 추적자, MRI 추적자 및 방사성동위원소 추적자로부터 선택되고;
    더욱더 바람직하게는, CT 추적자가 요오드-기반 나노스케일 조영제(iodine-based nanoscale contrast agent), 골드-기반 나노스케일 조영제(gold-based nanoscale contrast agent), 산화탄탈럼-기반 나노스케일 조영제, 비스무트-기반 나노스케일 조영제, 란타나이드-기반 나노스케일 조영제, 또는 유사한 구조를 갖는 다른 추적자로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는, CT 추적자가 요오드화 조영제 또는 나노골드, 또는 유사한 구조를 갖는 다른 추적자로부터 선택되고; 추가로 바람직하게는, CT 추적자가 이오헥솔(iohexol), 이오카르믹산(iocarmic acid), 이오베르솔(ioversol), 이오딕사놀(iodixanol), 이오프로마이드(iopromide), 이오비트리돌(iobitridol), 이오메프롤(iomeprol), 이오파미돌(iopamidol), 이옥실란(ioxilan), 아세트리조익산(acetrizoic acid), 이오디파미드(iodipamide), 이오벤자믹산(iobenzamic acid), 이오글리캄산(ioglycamic acid), 디아트리조익산(diatrizoic acid), 소듐 이오탈라메이트(sodium iotalamate), 판토파크(pantopaque), 이오파노익산(iopanoic acid), 이오도알피온산(iodoalphionic acid), 소듐 아세트리조에이트(sodium acetrizoate), 소듐 이오도메타메이트(sodium iodomethamate), 프로필이오돈(propyliodone), 디오돈(diodone), 이오트롤란(iotrolan), 이오피돌(iopydol), 엔도그라핀(endografin), 이오탈람산(iotalamic acid), 메글루민 디아트리조에이트(meglumine diatrizoate), 메트리조익산(metrizoic acid), 메트리자미드(metrizamide), 요오드화 오일(iodinated oil) 또는 에티오다이즈드 오일(ethiodized oil), 또는 유사한 구조를 갖는 다른 추적자로부터 선택되고; 바람직하게는, CT 추적자가 나노골드이고/거나;
    MRI 추적자가 세로방향 이완 조영제(longitudinal relaxation contrast agent) 및 횡 방향 이완 조영제(transverse relaxation contrast agent)로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는, MRI 추적자가 상자성 조영제, 강자성 조영제 및 초상자성 조영제로부터 선택되고; 추가로 바람직하게는, MRI 추적자가 Gd-DTPA 및 이의 선형, 고리형 폴리아민 폴리카르복실레이트 킬레이트 및 망간 포르피린 킬레이트, 거대분자 가돌리늄 킬레이트, 생체거대분자-개질된 가돌리늄 킬레이트, 엽산-개질된 가돌리늄 킬레이트, 덴드리머 조영제, 리포솜-개질된 조영제 및 가돌리늄-함유 풀러렌, 또는 유사한 구조를 갖는 다른 추적자로부터 선택되고; 바람직하게는, MRI 추적자가 가도펜테테이트 디메글루민(gadopentetate dimeglumine), 가도테레이트 메글루민(gadoterate meglumine), 가도베네이트 디메글루민(gadobenate dimeglumine), 가도디아민, 페릭 암모늄 시트레이트 발포 과립(ferric ammonium citrate effervescent granule), 상자성 산화철(Fe3O4 NPs), 또는 유사한 구조를 갖는 다른 추적자로부터 선택되고; 바람직하게는, MRI 추적자가 Fe3O4 NPs이고/거나;
    방사성동위원소 추적자가 탄소 14(14C), 탄소 13(13C), 인 32(32P), 황 35(35S), 요오드 131(131I), 수소 3(3H), 테크네튬 99(99Tc) 및 불소 18(18F)에 의해서 표지된 플루데옥시글루코스(fludeoxyglucose)로부터 선택되고; 바람직하게는, 방사성동위원소 추적자가 불소 18-표지된 플루데옥시글루코스인 것을 특징으로 하는, 리포솜 나노캐리어 전달 시스템.
  7. 청구항 6에 있어서,
    물질이 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하고/거나, 방지하고/거나, 치료하기 위한 약물, 폴리펩타이드, 핵산 및 시토킨 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 리포솜 나노캐리어 전달 시스템.
  8. 청구항 5 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    물질이 CD44 활성화제이고;
    바람직하게는, CD44 활성화제가 CD44 항체 mAb, IL5, IL12, IL18, TNF-α, 또는 LPS인 것을 특징으로 하는, 리포솜 나노캐리어 전달 시스템.
  9. 청구항 5 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    물질이 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 소분자 히알루론산 또는 히알루론산 유도체이고;
    바람직하게는, 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 소분자 히알루론산 또는 히알루론산 유도체가 1-500 KDa, 바람직하게는 1-20 KDa, 더욱 바람직하게는 2-10 KDa 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 리포솜 나노캐리어 전달 시스템.
  10. 청구항 6 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    나노캐리어가 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하고/거나, 방지하고/거나, 치료하는 물질과 CD44 활성화제로 동시에 부하되고;
    바람직하게는, 나노캐리어가 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 물질과 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 소분자 히알루론산 또는 히알루론산 유도체로 동시에 부하되고;
    더욱 바람직하게는, 나노캐리어가 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하기 위한 물질, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 물질, 임의로, CD44 활성화제, 및 임의로, 취약 플라크에서의 세포 표면 상의 CD44 분자에 특별히 결합할 수 있는 소분자 히알루론산 또는 히알루론산 유도체로 동시에 부하되는 것을 특징으로 하는, 리포솜 나노캐리어 전달 시스템.
  11. 청구항 6에 있어서,
    물질이 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 물질이고;
    바람직하게는, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 물질이 스타틴(statin), 피브레이트(fibrate), 항혈소판제(antiplatelet drug), PCSK9 억제제, 항응고제(anticoagulant drug), 안지오텐신 전환효소 억제제(angiotensin converting enzyme inhibitor: ACEI), 칼슘 이온 길항제(calcium ion antagonist), MMP 억제제, β 수용체 차단제(β receptor blocker), 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 또는 기타 소염 물질, 예컨대, IL-1 항체 카나키누맙(IL-1 antibody canakinumab), 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 및 상기 약물 또는 물질의 활성 제제(active preparation), 및 내인성 소염 시토킨, 예컨대, 인터류킨 10(IL-10)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고;
    더욱 바람직하게는, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 물질이 로바스타틴(lovastatin), 아토르바스타틴(atorvastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 심바스타틴(simvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 베자피브레이트(bezafibrate), 시프로피브레이트(ciprofibrate), 클로피브레이트(clofibrate), 겜피브로질(gemfibrozil), 페노피브레이트(fenofibrate), 프로부콜(probucol), 항-PCSK9 항체, 예컨대, 에볼로쿠맙(evolocumab), 알리로쿠맙(alirocumab), 보코시주맙(bococizumab), RG7652, LY3015014 및 LGT-209, 또는 아드넥틴(adnectin), 예컨대, BMS-962476, 안티센스 RNAi 올리고뉴클레오티드, 예컨대, ALN-PCSsc, 핵산, 예컨대, 마이크로RNA-33a, 마이크로RNA-27a/b, 마이크로RNA-106b, 마이크로RNA-302, 마이크로RNA-758, 마이크로RNA-10b, 마이크로RNA-19b, 마이크로RNA-26, 마이크로RNA-93, 마이크로RNA-128-2, 마이크로RNA-144, 마이크로RNA-145 안티센스 가닥 및 이들의 핵산 유사체, 예컨대, 로키드 핵산(locked nucleic acid), 아스피린, 아세메타신(acemetacin), 트록세루틴(troxerutin), 디피리다몰(dipyridamole), 실로스타졸(cilostazol), 티클로피딘 하이드로클로라이드(ticlopidine hydrochloride), 소듐 아자그렐(sodium ozagrel), 클로피도그렐(clopidogrel), 프라수그렐(prasugrel), 실로스타졸(cilostazol), 베라프로스트 소듐(beraprost sodium), 티카그렐로(ticagrelor), 칸그렐로(cangrelor), 티로피반(tirofiban), 엡티피바타이드(eptifibatide), 압식시맙(abciximab), 비분획 헤파린(unfractionated heparin), 크렉산(clexane), 프락시파린(fraxiparine), 폰다파리눅스 소듐(fondaparinux sodium), 와파린(warfarin), 다비가트란(dabigatran), 리바록사반(rivaroxaban), 아픽사반(apixaban), 에독사반(edoxaban), 비발리루딘(bivalirudin), 에녹사파린(enoxaparin), 테델파린(tedelparin), 알데파린(ardeparin), 비스하이드록시쿠마린(bishydroxycoumarin), 니트레이트 쿠마린, 소듐 시트레이트, 히루딘(hirudin), 아르가트로반(argatroban), 베나제프릴(benazepril), 캡토프릴(captopril), 에날라프릴(enalapril), 페린도프릴(perindopril), 포시노프릴(fosinopril), 리시노프릴(lisinopril), 모엑시프릴(moexipril), 실라자프릴(cilazapril), 페린도프릴(perindopril), 퀴나프릴(quinapril), 라미프릴(ramipril), 트란돌라프릴(trandolapril), 칸데사르탄(candesartan), 에프로사르탄(eprosartan), 이르베사르탄(irbesartan), 로사르탄(losartan), 텔미사르탄(telmisartan), 발사르탄(valsartan), 올메사르탄(olmesartan), 타소사르탄(tasosartan), 니페디핀(nifedipine), 니카르디핀(nicardipine), 니트렌디핀(nitrendipine), 암로디핀(amlodipine), 니모디핀(nimodipine), 니솔디핀(nisoldipine), 닐바디핀(nilvadipine), 이스라디핀(isradipine), 펠로디핀(felodipine), 라시디핀(lacidipine), 딜티아젬(diltiazem), 베라파밀(verapamil), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 미노사이클린(minocycline), MMI-166, 메토프로롤(metoprolol), 아테놀올(atenolol), 비소프로롤(bisoprolol), 프로프라놀롤(propranolol), 카베딜롤(carvedilol), 바티마스타트(batimastat), 마리마스타트(marimastat), 프리노마스타트(prinomastat), BMS-279251, BAY 12-9566, TAA211, AAJ996A, 나세트라핍(nacetrapib), 에바세트라핍(evacetrapib), 토르세트라핍(Torcetrapib), 달세트라핍(Dalcetrapib), 프레드니손(prednisone), 메틸프레드니손, 베타메타손(betamethasone), 베클로메타손 디프로피오네이트(beclomethasone dipropionate), 디프로스판(diprospan), 프레드니솔론(prednisolone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 덱사메타손 또는 그 밖의 소염 물질, 예컨대, IL-1 항체 카나키누맙, 및 이들의 유효 단편 또는 약제학적으로 허용되는 염, 및 상기 물질의 활성 구조 단편을 포함한 약제학적으로 허용되는 염 중 하나 이상, 및 내인성 소염 시토킨, 예컨대, 인터류킨 10(IL-10)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 리포솜 나노캐리어 전달 시스템.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 따른 취약 플라크를 표적하기 위한 나노-전달 시스템을 제조하기 위한 방법으로서,
    (1) 적절한 양의 인지질 분자를 적합한 유기 용매에 용해시키고, 필름 수화 방법에 의해서 리포솜 나노캐리어를 제조하는 단계로서, 덜 극성인 약물 분자의 경우에는, 본 단계에서 인지질 분자와 함께 필름을 형성시키는 것이 필요한, 단계;
    (2) 임의로, 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하고/거나, 방지하고/거나, 치료하기 위한 수용성 물질을 임의로 함유하는 수성 매질을 단계(1)에서 얻은 나노캐리어 전달 시스템에 첨가하여 미정제 현탁액을 형성시키는 단계;
    (3) 표적화 리간드를 적합한 완충 용액 용매에 용해시키고, 단계(2)에서 얻은 캐리어 분자를 반응을 위한 표적화 리간드 용액에 첨가하여 나노캐리어 전달 시스템을 얻는 단계;
    (4) 임의로 단계 (3)에서 얻은 미정제 현탁액에 함유된 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 진단하고/거나, 방지하고/거나, 치료하기 위한 비부하된 물질을 투석에 의해서 제거하여 부하된 나노 전달 시스템을 얻은 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 나노캐리어 전달 시스템 및 약제학적으로 허용되는 캐리어를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제.
  14. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 나노캐리어 전달 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 제제(diagnostic preparation).
  15. CD44 분자 활성화의 존재와 관련된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 제제에서의 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 나노캐리어 전달 시스템, 청구항 13에 따른 약제, 또는 청구항 14에 따른 진단 제제의 용도.
  16. 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 제제에서의 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 나노캐리어 전달 시스템, 청구항 13에 따른 약제, 또는 청구항 14에 따른 진단 제제의 용도.
  17. 청구항 16에 있어서,
    취약 플라크가 파열되기 쉬운 플라크(rupture-prone plaque), 침식되기 쉬운 플라크(erosion-prone plaque) 및 부분적으로 석회화된 결절성 병변(partially calcified nodular lesion)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고;
    바람직하게는, 취약 플라크와 연관된 질환이 죽상동맥경화증, 관상 죽상동맥경화성 심장병(급성 관상 증후군, 무증상 심근 허혈 - 잠재성 관동맥성 심장병, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장병, 급사, 및 인-스텐트 재협착을 포함함), 뇌동맥경화증(뇌졸중을 포함함), 말초혈관 죽상동맥경화증(말초동맥 폐쇄성 질환, 망막의 죽상동맥경화증, 경동맥 죽상동맥경화증, 신장 죽상동맥경화증, 다리 죽상동맥경화증, 팔 죽상동맥경화증 및 죽상동맥경화성 발기부전을 포함함), 대동맥 박리, 혈관종, 혈전색전증, 심장기능상실, 심장성 쇼크로 이루어진 군으로부터의 하나 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 용도.
  18. CD44 분자 활성화의 존재와 관련된 질환을 방지하고/거나 치료하기 위한 방법으로서, 방법이 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 나노캐리어 전달 시스템, 청구항 13에 따른 약제, 또는 청구항 14에 따른 진단 제제를 이를 필요로 하는 대상체에 투여함을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 취약 플라크 또는 취약 플라크와 연관된 질환을 방지하고/거나, 진단하고/거나, 치료하기 위한 방법으로서, 방법이 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 나노캐리어 전달 시스템, 청구항 13에 따른 약제, 또는 청구항 14에 따른 진단 제제를 이를 필요로 하는 대상체에 투여함을 포함하고;
    바람직하게는, 취약 플라크가 파열되기 쉬운 플라크(rupture-prone plaque), 침식되기 쉬운 플라크(erosion-prone plaque) 및 부분적으로 석회화된 결절성 병변(partially calcified nodular lesion)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고;
    더욱 바람직하게는, 취약 플라크와 연관된 질환이 죽상동맥경화증, 관상 죽상동맥경화성 심장병(급성 관상 증후군, 무증상 심근 허혈 - 잠재성 관동맥성 심장병, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장병, 급사, 및 인-스텐트 재협착을 포함함), 뇌동맥경화증(뇌졸중을 포함함), 말초혈관 죽상동맥경화증(말초동맥 폐쇄성 질환, 망막의 죽상동맥경화증, 경동맥 죽상동맥경화증, 신장 죽상동맥경화증, 다리 죽상동맥경화증, 팔 죽상동맥경화증 및 죽상동맥경화성 발기부전을 포함함), 대동맥 박리, 혈관종, 혈전색전증, 심장기능상실, 심장성 쇼크로 이루어진 군으로부터의 하나 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. CD44 분자 활성화의 존재와 관련된 질환을 진단하기 위한 방법으로서, 방법이 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 나노캐리어 전달 시스템, 청구항 13에 따른 약제, 또는 청구항 14에 따른 진단 제제를 이를 필요로 하는 대상체에 투여함을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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