CN114788871B - 寡聚芦丁在制备肿瘤靶向产品中的应用及寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统 - Google Patents

寡聚芦丁在制备肿瘤靶向产品中的应用及寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统 Download PDF

Info

Publication number
CN114788871B
CN114788871B CN202110098831.7A CN202110098831A CN114788871B CN 114788871 B CN114788871 B CN 114788871B CN 202110098831 A CN202110098831 A CN 202110098831A CN 114788871 B CN114788871 B CN 114788871B
Authority
CN
China
Prior art keywords
oligorutin
tumor
bortezomib
targeting
tumor targeting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110098831.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114788871A (zh
Inventor
徐莉
肖敏
洪伟英
张赫男
王洋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN202110098831.7A priority Critical patent/CN114788871B/zh
Publication of CN114788871A publication Critical patent/CN114788871A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114788871B publication Critical patent/CN114788871B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及寡聚芦丁在制备肿瘤靶向产品中的应用及寡聚芦丁‑硼替佐米肿瘤靶向递药系统。本发明首次证明了酶法合成的寡聚芦丁具有肿瘤细胞的靶向能力，荧光标记的寡聚芦丁能够选择性进入肿瘤细胞，并且能够富集于细胞内酸性细胞器中。本发明将抗肿瘤药物硼替佐米通过pH敏感的共价键连接到寡聚芦丁上，构建了水溶性、具有肿瘤靶向能力且能响应肿瘤微环境和细胞内酸性细胞器pH条件释药的靶向递药系统，寡聚芦丁负载的抗肿瘤药物硼替佐米，能够在肿瘤微环境和酸性细胞器的pH条件下释放药物，通过硼替佐米对肿瘤细胞蛋白酶体的抑制作用抑制肿瘤。

Description

寡聚芦丁在制备肿瘤靶向产品中的应用及寡聚芦丁-硼替佐 米肿瘤靶向递药系统
技术领域
本发明涉及寡聚芦丁在制备肿瘤靶向产品中的应用及寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统，属于生物工程技术领域。
背景技术
肿瘤的靶向治疗相比于传统的手术治疗、放射治疗、化疗和激素治疗等方法，具有提高药物选择性、降低毒副作用、增加利用度和控制药物释放等优势。天然生物材料作为药物的靶向递送载体具有低毒性、低抗原性及良好的生物相容性等优势。芦丁(Rutin)是一种常见的膳食多酚黄酮醇化合物，是由黄酮醇槲皮素与芸香二糖(α-L-鼠李糖基-1,6-β-D-葡萄糖)形成的糖苷化合物。芦丁具有抗炎症、抗肿瘤、免疫调控、抗氧化和抗抑郁等功能，并且已经在临床上用于高血压的辅助治疗。中国专利文献CN109223814A(申请号201811090252.2)公开了一种芦丁的新用途，从基因水平上，芦丁作为PRMT1-PXR-P-gp通路抑制剂用于制备治疗与PRMT1-PXR-P-gp通路调控有关的疾病的药物或食品，可以逆转由于长期化疗所导致的P-gp表达增加而产生的肿瘤多药耐药的现象，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，提高肿瘤药物的治疗效果。但是芦丁溶解度仅为约12.5μg/mL，水溶性较差，限制了它的用药剂量和治疗效果。
2003年，MotoichiKurisawa等人(Biomacromolecules,2003,4,1394-1399)报道了漆酶催化芦丁生成寡聚芦丁(Oligorution，OR)。相比于芦丁，寡聚芦丁具有更高的水溶性、更强的抗氧化性和较低的细胞毒性，在化妆品、保健品、药物制剂、肥胖治疗和伤口愈合等方面具有潜在的应用价值。但对寡聚芦丁的肿瘤靶向功能的研究一直鲜有报道。关于寡聚芦丁的应用，仅中国专利文献CN111693583A(申请号202010430210.X)公开了聚芦丁-银纳米粒子-玻璃电极检测环境样本中重金属污染的方法。因此，利用酶催化这种环境友好的聚合方式合成寡聚芦丁并深入开发其生物学功能将具有重要的应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足，尤其是现有技术中对基于黄酮类化合物的肿瘤靶向递药系统研发的不足，本发明提供了寡聚芦丁在制备肿瘤靶向产品中的应用，寡聚芦丁能够靶向性进入肿瘤细胞，可以作为药物的靶向递送载体；本发明利用酶法合成的寡聚芦丁负载抗肿瘤药物硼替佐米，构建寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统，通过pH响应共价键负载和释放抗肿瘤药物硼替佐米，可以选择性抑制肿瘤细胞。
本发明所采取的技术方案如下：
寡聚芦丁在制备肿瘤靶向产品中的应用。
根据本发明优选的，所述寡聚芦丁为肿瘤靶向产品中的靶向递送载体。
根据本发明优选的，所述寡聚芦丁是以芦丁为原料，采用生物酶法合成，所述寡聚芦丁的聚合度为2-8。
进一步优选的，所述寡聚芦丁的生物酶法合成步骤为：取芦丁混悬于双蒸水中，加入漆酶，芦丁的终浓度为0.001-0.1g/mL，漆酶的终浓度为0.01-0.5U/mL，10-60℃搅拌反应8-36h，除去反应液中的漆酶，得寡聚芦丁。
根据本发明优选的，所述肿瘤靶向产品为肿瘤靶向治疗药品，或肿瘤靶向检测产品。
根据本发明优选的，所述肿瘤靶向产品以寡聚芦丁为靶向递送载体，负载肿瘤治疗药物，或肿瘤检测试剂。
一种寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统，是以寡聚芦丁为药物靶向递送载体，以硼酸酯键共价连接抗肿瘤药物硼替佐米制备得到。
根据本发明优选的，所述寡聚芦丁是以芦丁为原料，采用生物酶法合成，所述寡聚芦丁的聚合度为2-8。
进一步优选的，所述寡聚芦丁的生物酶法合成步骤为：取芦丁混悬于双蒸水中，加入漆酶，芦丁的终浓度为0.001-0.1g/mL，漆酶的终浓度为0.01-0.5U/mL，10-60℃搅拌反应8-36h，除去反应液中的漆酶，得寡聚芦丁。
上述寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)取芦丁混悬于双蒸水中，加入漆酶，芦丁的终浓度为0.001-0.1g/mL，漆酶的终浓度为0.01-0.5U/mL，10-60℃搅拌反应8-36h，除去反应液中的漆酶，得寡聚芦丁；
(2)将步骤(1)制备的寡聚芦丁加入到Tris-HCl缓冲液中，制成寡聚芦丁溶液；将硼替佐米溶于二甲基亚砜中，制成硼替佐米母液；将硼替佐米母液滴加入寡聚芦丁溶液中，寡聚芦丁与硼替佐米的质量比为(1-50):1；10-60℃搅拌反应8-36h，反应结束后，超滤收集上层液，将上层液冻干得到寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述芦丁的终浓度为0.005-0.05g/mL，漆酶的终浓度为0.1-0.3U/mL。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述搅拌反应的条件为20-35℃反应12-24h，搅拌转速为100-300rpm。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述除去反应液中的漆酶是通过沉淀法实现的，具体步骤为：向反应液中加入2-5倍于反应液体积的乙腈，6000-13000rpm离心10-60min，获得上清，通过旋转蒸发缩小体积后，用1-10kDa超滤管及去离子水超滤，除去小分子寡聚芦丁，冻干得到寡聚芦丁。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述寡聚芦丁的聚合度为2-8。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述Tris-HCl缓冲液的浓度为1-50mM，pH值为7.0-9.5；进一步优选的，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为5-25mM。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述寡聚芦丁溶液的浓度为0.1～50mg/mL，优选为1～10mg/mL。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述硼替佐米母液的浓度为10-100mg/mL，优选为20～50mg/mL。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述寡聚芦丁与硼替佐米的质量比为(1-25):1。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述搅拌反应的条件为20-40℃反应12-24h，搅拌转速为50-300rpm。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述超滤使用截留分子量1-10kDa超滤管及去离子水超滤，5000-12000rpm离心10-60min，超滤次数2-5次。
上述寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统在制备肿瘤靶向药物中的应用。
本发明的技术特点：
本发明以芦丁为原料，利用来自于云芝(Trametesversicolor)的漆酶(EC1.10.3.2)催化氧化还原反应，在纯水中合成了寡聚芦丁，合成收率为76.6％。通过质谱检测手段，检测了寡聚芦丁的聚合度为2-8。通过荧光标记试验，证明寡聚芦丁对肝癌细胞(HepG2)、前列腺癌细胞(PC3)和人口腔表皮样癌细胞(KB)具有选择靶向性，能够进入细胞并定位于细胞的溶酶体等酸性细胞器内。利用寡聚芦丁上的邻苯二酚结构和抗肿瘤药物硼替佐米(Bortezomib，BTZ)的硼酸基团，构建了响应肿瘤和细胞器酸性微环境的寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药体系，在弱碱性条件下合成了由pH敏感的硼酸酯键连接的寡聚芦丁-硼替佐米(Oligorutin-Bortezomib，OR-BTZ)载药体系，其负载硼替佐米的负载容量为10.4％。该体系在细胞溶酶体和酸性(pH 5.0)条件下药物释放率约是正常中性(pH 7.4)条件下的3.9倍。进一步研究了寡聚芦丁-硼替佐米载药体系对肿瘤细胞的毒性，体外细胞抑制实验结果表明，寡聚芦丁-硼替佐米浓度为400μg/mL时，对肝癌细胞HepG2细胞增殖抑制率约为63％，对肝癌细胞Hepa1-6的抑制率为约91％，对正常细胞的抑制率仅约为13％，证明该体系可以选择性的抑制肿瘤细胞，具有良好的肿瘤靶向治疗能力。
本发明的有益效果：
1、本发明首次证明了酶法合成的寡聚芦丁具有肿瘤细胞的靶向能力，荧光标记的寡聚芦丁能够选择性进入肿瘤细胞，并且能够富集于细胞内酸性细胞器中。
2、本发明制备得到的寡聚芦丁能够在弱碱性环境下，与含有硼酸的药物结合，形成硼酸酯键；硼酸酯键在弱酸性环境，比如肿瘤微环境及细胞内酸性细胞器中不稳定，能够水解并释放含有硼酸的药物，因此，本发明将抗肿瘤药物硼替佐米通过pH敏感的共价键连接到寡聚芦丁上，构建了水溶性、具有肿瘤靶向能力且能响应肿瘤微环境和细胞内酸性细胞器pH条件释药的靶向递药系统，寡聚芦丁负载的抗肿瘤药物硼替佐米，能够在肿瘤微环境和酸性细胞器的pH条件下释放药物，通过硼替佐米对肿瘤细胞蛋白酶体的抑制作用抑制肿瘤。
3、本发明制备的具有靶向和pH响应释药的可溶性递药体系，利用寡聚芦丁的靶向能力，运载硼替佐米，在肿瘤的微环境和酸性细胞器内实现pH响应释放，可以实现肿瘤细胞特异积蓄和药物释放，降低化疗药物对人体的毒副作用。目前，尚无相关的报道利用寡聚芦丁运载抗肿瘤药物硼替佐米，应用于肿瘤治疗。
4、本发明制备的寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统，生物相容性高，制备工艺简单，条件温和，环境友好，成本低廉，适用于规模生产和临床医疗使用。
附图说明：
图1为寡聚芦丁的MALDI-TOF-MS质谱图；
图2为寡聚芦丁TLC检测结果；其中1-4点样孔分别对应芦丁、寡聚芦丁、寡聚芦丁-氨基荧光素、氨基荧光素；TLC结果分别于紫外(UV，270nm)和荧光激发光(Fluorescence，470nm)下观察。
图3为寡聚芦丁-硼替佐米(OR-BTZ)和寡聚芦丁(OR)的傅里叶红外光谱图；箭头分别标出1300-1000cm-1波长代表的醌基特征峰，3600-3000cm-1波长代表的O-H特征峰和1350-1370cm-1波长代表的B-O特征峰。
图4为寡聚芦丁对肿瘤细胞靶向以及其在细胞内酸性细胞器富集的激光共聚焦显微镜照片；其中OR-FLA为荧光标记的寡聚芦丁；LysoRed为细胞内酸性细胞器特异荧光染料；Hoechst33342为细胞核染料；Merge为以上三种荧光位置叠加，图中标尺为20μm。
图5为寡聚芦丁-硼替佐米(OR-BTZ)在不同pH条件下硼替佐米的释放率曲线。
图6为不同浓度寡聚芦丁-硼替佐米(OR-BTZ)作用下肿瘤细胞HepG2和Hepa1-6的存活率柱状图。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护的范围并不仅限于此。下述实施例中所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均为市售生物、化学实验用材料。
芦丁：北京百灵威科技有限公司有售。
漆酶：E.C.1.10.3.2.，来自于Trametesversicolor，北京百灵威科技有限公司有售。
室温：具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃。
实施例1：寡聚芦丁的酶法合成
称取芦丁混悬于39mL双蒸水中，取漆酶溶于1mL PBS缓冲液中，将漆酶溶液加入到上述芦丁混悬液中，芦丁的终浓度为0.005g/mL，漆酶的终浓度为0.2U/mL，室温下200rpm搅拌反应24h，反应结束后得反应液，为除去反应液中的漆酶，加入120mL乙腈，12000rpm离心30min，获得上清，通过旋转蒸发缩小体积后，用3kDa超滤管及去离子水7500rpm超滤离心15min，超滤3次，除去小分子寡聚芦丁，通过冻干获得寡聚芦丁。
所得的寡聚芦丁的质量占投入的芦丁质量的百分比，为寡聚芦丁的合成收率，经计算为76.6％。
取0.5mg冻干的寡聚芦丁溶于300μL乙腈、700μL水和1μL三氟乙酸的混合液中，得待测样品，按样品和基质体积比为1:100(v/v)，将样品溶于DHB基质中，点于质谱靶板上，置于通风处，至完全干燥，通过MALDI-TOF-MS，分析寡聚芦丁聚合度，结果如图1所示，寡聚芦丁产物中含有2-8不等的聚合度，并且聚合物质荷比间隔约在608左右波动，基本符合聚合物分子量分布。
取上述待测样品1μL进行TLC检测，展层体系为：正丁醇:乙醇:水:三乙胺＝6:4:3:0.01(v/v)，在紫外(270nm)下观察结果。结果如图2所示，在2号点样孔的寡聚芦丁迁移率低于1号点样孔的芦丁单体，且样品呈拖尾状，显示生成了一系列不同聚合度的寡聚产物。
取4.6mg上述制备的寡聚芦丁，溶于2.3mL磷酸钠缓冲液(10mM、pH 8.0)，再取270μL浓度为10mg/mL的氨基荧光素甲醇溶液，加入含寡聚芦丁的磷酸钠缓冲液中，50℃加热4h后，室温过夜反应。反应结束后用3kDa超滤管超滤至流穿液荧光强度无增加，收集上层液冻干，获得氨基荧光素共价标记的寡聚芦丁(寡聚芦丁-氨基荧光素)。通过TLC检测反应结果，TLC展层体系同上，在荧光激发光(470nm)下观察结果。结果如图2所示，在荧光激发光470nm条件下，点样孔3的寡聚芦丁-氨基荧光素呈现拖尾荧光条带，与点样孔4的氨基荧光素本身的迁移率不同，说明氨基荧光素对形成的系列不同聚合度的寡聚芦丁均进行了标记；且芦丁单体(点样孔1)和寡聚芦丁(点样孔2)在荧光激发光470nm条件下没有荧光。
实施例2：寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统的制备
将实施例1制备的寡聚芦丁加入到浓度为10mM的Tris-HCl缓冲液混匀，制成浓度为1mg/mL的寡聚芦丁溶液；将硼替佐米溶于DMSO中，制成浓度为30mg/mL的硼替佐米母液；将硼替佐米母液滴加入寡聚芦丁溶液中，寡聚芦丁与硼替佐米的质量比为8:1；25℃、200rpm搅拌反应16h，反应结束后，用3kDa超滤管及去离子水7500rpm超滤离心10min，超滤3次，收集上层液和流穿液，将上层液冻干得到寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统。
将上述流穿液进行HPLC检测，检测条件为：安捷伦HPLC1260，反向C18柱(4.6×150mm，5μm，Agilent TC-C18，Analytical)，流动相为乙腈:水(80:20，v/v)，流速1mL/min，UV检测波长270nm，进样体积20μL。根据HPLC检测结果，按照以下公式，计算硼替佐米的负载容量：
负载容量(％)＝(加入的硼替佐米质量-流穿液中未结合的硼替佐米质量)/加入的聚芦丁质量×100％
计算得出，在反应16个小时后，硼替佐米的负载容量为10.4％。
分别称取实施例1中制备的寡聚芦丁和实施例2中制备的寡聚芦丁-硼替佐米两种待测样品和红外灯烘烤10min后的溴化钾。待测样品:溴化钾＝1:100(质量比)，放入玛瑙研钵中研磨至200目以下，将粉末加入无水乙醇擦拭后的模具中，模具置于压片机上加压至20MPa，停留2min后，取出压片，放入傅里叶红外变换光谱仪中检测。结果如图3所示，寡聚芦丁在负载硼替佐米后傅里叶红外光谱变化主要有3点：1)1300-1000cm-1波长代表醌基的峰降低；2)3600-3000cm-1波长代表O-H峰降低；3)出现了1350-1370cm-1波长代表的B-O特征峰。其中1)、2)的变化是由于寡聚芦丁中的邻苯二酚基团参与形成负载硼替佐米的硼酸酯键，消耗了其酚羟基和醌基，造成特征峰降低；3)的变化是由于负载了硼替佐米，增加了B-O键的特征峰。以上结果证实成功构建了寡聚芦丁-硼替佐米。
实施例3：寡聚芦丁肿瘤细胞靶向及在细胞内酸性细胞器的富集研究
采用激光共聚焦观察荧光标记寡聚芦丁和荧光标记酸性细胞器在各种细胞内的分布情况，具体操作步骤如下：
(1)按照常规操作分别培养口腔上皮癌细胞KB、前列腺癌细胞PC3、肝癌细胞HepG2和肝正常细胞L-O2，细胞培养至70％融合度，消化，收集并计数，将细胞以1×105个/孔的数量接种于激光共聚焦培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜；
(2)更换新的完全培养基，并加入实施例1制备的50μL寡聚芦丁-氨基荧光素(4mg/mL)于激光共聚焦培养皿中，置于细胞培养箱中37℃，5％CO2避光共孵育2h；
(3)加入溶酶体红色荧光探针(LysoRed)2μL，继续孵育1.5h；
(4)加入0.5μL浓度为10μg/mL细胞核荧光染料(Hoechst33342)继续孵育0.5h；用PBS缓冲液清洗3次后，加入新鲜培养基500μL，用激光共聚焦显微镜观察，拍照。
结果如图4所示，在寡聚芦丁-氨基荧光素与细胞在共孵育的情况下，寡聚芦丁-氨基荧光素倾向于进入肿瘤细胞，包括KB细胞、PC3细胞和HepG2细胞；而正常细胞L-O2内的寡聚芦丁-氨基荧光素量则相对很低。以上结果表明寡聚芦丁具有肿瘤细胞的选择靶向能力，并能够进入肿瘤细胞内，在LysoRed对细胞内酸性细胞器标记的情况下，寡聚芦丁-氨基荧光素与LysoRed的荧光位置高度重合，表明寡聚芦丁可以定位并富集于细胞内酸性细胞器中，有利于其携带抗肿瘤药物进行pH响应的释药。
实施例4：寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统药物释放研究
称取实施例2制备的寡聚芦丁-硼替佐米冻干粉末120mg，溶解于3mL Tris-HCl缓冲液中(10mM，pH 8.5)，分装到透析袋(截留分子量3kDa)，每个透析带内装0.3mL。透析袋置于15mL离心管中，分别加入5mL透析液中进行透析。设置3组不同条件，包括：1)透析液为pH7.4的PBS缓冲液；2)透析液为pH 6.4的PBS缓冲液；3)透析液为pH 5.0的PBS缓冲液；每组3个平行实验。这3组分别在不同时间点取出0.1mL相应透析液进行HPLC分析，并加入0.1mL相应pH的PBS缓冲液补足。透析液取样时间点为0小时、6小时、16小时、26小时、36小时和48小时。HPLC分析条件同实施例2。
硼替佐米的释放率(Accumulation Release，AR)用以下方程式评估：
释放率(％)＝释放到缓冲液中的硼替佐米质量/初始加入体系中寡聚芦丁-硼替佐米体系携带的硼替佐米质量×100％
检测结果如图5所示，在人体正常体液pH(pH 7.4)的条件下，寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统载有的抗肿瘤药物硼替佐米释放率最低，48小时释放率约为13％；随着pH的降低，硼替佐米的释放量逐渐增加；pH 5.0条件下48小时硼替佐米释放率约为51％，约为中性条件(pH 7.4)下的3.9倍。该结果表明随着环境pH的降低，寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统响应性的释放药物，这一特性可用于肿瘤微环境及细胞内酸性细胞器pH响应释药。
实施例5：寡聚芦丁-硼替佐米对肿瘤细胞的特异性抑制研究
采用MTT法检测细胞的活性情况，具体步骤如下：
(1)按照常规操作培养肿瘤细胞HepG2、Hepa1-6和正常细胞L-O2，细胞培养至70％融合度，消化，收集并计数，稀释细胞密度为1×105个/mL，96孔板每孔加入100μL上述细胞稀释液，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
(2)更换新的完全培养基，加入实施例2制备的寡聚芦丁-硼替佐米至终浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL和400μg/mL，并以添加PBS缓冲液的处理组为对照组，37℃，5％CO2培养箱中培养36小时；
(4)将96孔板进行染色，96孔板每孔加入10μL噻唑蓝(MTT)(5mg/mL)，37℃，5％CO2培养箱中培养4h，移去培养基，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，摇床轻轻混匀10分钟，溶解MTT，测定OD490值，计算细胞存活率。结果如图6所示，在寡聚芦丁-硼替佐米的作用下，正常细胞L-O2存活率较高，在400μg/mL的寡聚芦丁-硼替佐米的作用下仍有约87％的细胞存活，抑制率为13％；同样条件下肿瘤HepG2细胞的存活率只有约37％，抑制率为63％，肿瘤Hepa1-6细胞的存活率只有约9％，抑制率为91％。结果证明本发明的寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统具有选择性抑制肿瘤细胞的特点，且对正常细胞毒性很低，可作为肿瘤治疗的候选药物。

Claims (8)

1.寡聚芦丁在制备肿瘤靶向产品中的应用，所述寡聚芦丁为肿瘤靶向产品中的靶向递送载体，所述寡聚芦丁能够选择性进入肿瘤细胞，并且能够富集于细胞内酸性细胞器中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述寡聚芦丁是以芦丁为原料，采用生物酶法合成，所述寡聚芦丁的聚合度为2-8。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述寡聚芦丁的生物酶法合成步骤为：取芦丁混悬于双蒸水中，加入漆酶，芦丁的终浓度为0.001-0.1g/mL，漆酶的终浓度为0.01-0.5U/mL，10-60℃搅拌反应8-36h，除去反应液中的漆酶，得寡聚芦丁。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤靶向产品为肿瘤靶向治疗药品，或肿瘤靶向检测产品。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤靶向产品以寡聚芦丁为靶向递送载体，负载肿瘤治疗药物，或肿瘤检测试剂。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤靶向产品为寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统，是以寡聚芦丁为药物靶向递送载体，以硼酸酯键共价连接抗肿瘤药物硼替佐米制备得到。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)取芦丁混悬于双蒸水中，加入漆酶，芦丁的终浓度为0.001-0.1g/mL，漆酶的终浓度为0.01-0.5U/mL，10-60℃搅拌反应8-36h，除去反应液中的漆酶，得寡聚芦丁；
(2)将步骤(1)制备的寡聚芦丁加入到Tris-HCl缓冲液中，制成寡聚芦丁溶液；将硼替佐米溶于二甲基亚砜中，制成硼替佐米母液；将硼替佐米母液滴加入寡聚芦丁溶液中，寡聚芦丁与硼替佐米的质量比为(1-50):1；10-60℃搅拌反应8-36h，反应结束后，超滤收集上层液，将上层液冻干得到寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：
a.步骤(1)中所述除去反应液中的漆酶是通过沉淀法实现的，具体步骤为：向反应液中加入2-5倍于反应液体积的乙腈，6000-13000rpm离心10-60min，获得上清，通过旋转蒸发缩小体积后，用1-10kDa超滤管及去离子水超滤，除去小分子寡聚芦丁，冻干得到寡聚芦丁；
b.步骤(1)中所述寡聚芦丁的聚合度为2-8；
c.步骤(2)中所述Tris-HCl缓冲液的浓度为1-50mM，pH值为7.0-9.5；
d.步骤(2)中所述寡聚芦丁溶液的浓度为0.1～50mg/mL；
e.步骤(2)中所述硼替佐米母液的浓度为10-100mg/mL；
f.步骤(2)中所述超滤使用截留分子量1-10kDa超滤管及去离子水超滤，5000-12000rpm离心10-60min，超滤次数2-5次。
CN202110098831.7A 2021-01-25 2021-01-25 寡聚芦丁在制备肿瘤靶向产品中的应用及寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统 Active CN114788871B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110098831.7A CN114788871B (zh) 2021-01-25 2021-01-25 寡聚芦丁在制备肿瘤靶向产品中的应用及寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110098831.7A CN114788871B (zh) 2021-01-25 2021-01-25 寡聚芦丁在制备肿瘤靶向产品中的应用及寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114788871A CN114788871A (zh) 2022-07-26
CN114788871B true CN114788871B (zh) 2024-02-06

Family

ID=82459986

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110098831.7A Active CN114788871B (zh) 2021-01-25 2021-01-25 寡聚芦丁在制备肿瘤靶向产品中的应用及寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114788871B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108379227A (zh) * 2018-05-28 2018-08-10 广西民族大学 一种包载芦丁的聚合物胶束及其制备方法
CN109223814A (zh) * 2018-09-18 2019-01-18 四川大学 一种芦丁的新用途
CN110536680A (zh) * 2018-01-22 2019-12-03 北京茵诺医药科技有限公司 用于靶向活化cd44分子的树枝状聚合物纳米载体递送系统、其制备方法和用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110536680A (zh) * 2018-01-22 2019-12-03 北京茵诺医药科技有限公司 用于靶向活化cd44分子的树枝状聚合物纳米载体递送系统、其制备方法和用途
CN108379227A (zh) * 2018-05-28 2018-08-10 广西民族大学 一种包载芦丁的聚合物胶束及其制备方法
CN109223814A (zh) * 2018-09-18 2019-01-18 四川大学 一种芦丁的新用途

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jing Su et al.."Catechol Polymers for pH-Responsive, Targeted Drug Delivery to Cancer Cells".《J. Am. Chem. Soc.》.2011,第第2011卷卷(第第133期期),第11850–11853页. *
Motoichi Kurisawa et al.." Enzymatic Synthesis and Antioxidant Properties of Poly(rutin)".《Biomacromolecules》.2003,第第2003卷卷(第第4期期),第1394-1399页. *
Yanyan Wang et al.."In Situ RBL Receptor Visualization and Its Mediated Anticancer Activity for Solasodine Rhamnosides".《ChemBioChem》.2011,第第2011卷卷(第第12期期),第2418- 2420页. *
负载抗肿瘤药物的天然高分子纳米粒研究进展;史涛;陈建清;;世界临床药物(第12期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114788871A (zh) 2022-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ren et al. Enzyme and pH dual-responsive hyaluronic acid nanoparticles mediated combination of photodynamic therapy and chemotherapy
CN107158410B (zh) 一种具有肿瘤靶向性的叶酸-壳聚糖-Cy7聚合物及其制备方法
CN114853810B (zh) 一种姜黄素衍生物及其制备方法和应用
CN113304151B (zh) 一种硝基呋喃类小分子化合物在制备诱导铁死亡和/或减缓胃癌化疗耐药药物中的应用
CN115252560A (zh) 一种基于天然产物的自组装纳米粒及其制备方法和应用
CN115260083A (zh) 一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针的制备方法及应用
CN108126212A (zh) 一种还原敏感型四价铂纳米复合物的制备及应用
CN111407743A (zh) 一种多巴胺组装体药物递送系统及其制备方法
CN113845551B (zh) 一种具有光动力抗三阴乳腺癌活性的Pt(Ⅱ)配合物及其制备方法和应用
Li et al. Folate chitosan conjugated doxorubicin and pyropheophorbide acid nanoparticles (FCDP–NPs) for enhance photodynamic therapy
CN114788871B (zh) 寡聚芦丁在制备肿瘤靶向产品中的应用及寡聚芦丁-硼替佐米肿瘤靶向递药系统
Liu et al. Curcumin copolymerized drugs mediated by enteric-coated polymers: Their design, synthesis and biocompatibility cell imaging studies
CN108159432B (zh) 一种抑制乳腺癌的靶向纳米粒子及其制备和应用
CN108003354B (zh) 一种响应细胞内酸性与氧化还原环境的聚合物及其制备与应用
Chen et al. Novel mitochondria-targeted and fluorescent DNA alkylation agents with highly selective activity against cancer cells
CN113842462A (zh) 一种透明质酸-小分子自组装纳米药物的制备方法与应用
CN110818739B (zh) 一种对肿瘤微环境pH/乏氧协同响应的金属铱配合物及其应用
Lian et al. Multi salt strategy based on curcumin pyrimidine derivatives prodrugs: Synthesis, biological activity, in vitro and in vivo imaging, and drug distribution research
CN112480176A (zh) 一种新型靶向溶酶体钌光催化剂及其制备方法和应用
CN109289048A (zh) 一种肿瘤血管阻断协同光治疗试剂及其合成方法与应用
CN112023059B (zh) 一种pH响应型阿霉素无载体纳米药物及其制备方法和应用
CN116425732B (zh) 一种具有线粒体靶向功能的光可控释放no并开启光动力效果的光敏剂及其制备方法和应用
Liu et al. Strategy of eudragit coated curcumin nanoparticles delivery system: Release and cell imaging studies in simulated gastrointestinal microenvironments
CN107469080B (zh) 一种含有ApoG2和AlpcS4的双纳米载药系统及其制备方法和应用
CN108283720A (zh) 同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant