CN115364239B - 一种具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子及其制备方法和应用,属于超声成像造影材料领域。本发明提供的纳米粒子是基于填充有全氟正戊烷、骨桥蛋白抗体标记以及偶联有二氢卟吩e6的氨基改性的中空介孔二氧化硅微球,在中空介孔二氧化硅微球的壳层分散有多个链状金纳米颗粒,具有很高的稳定性,粒径分布均匀,分散性好,介孔均匀,具有适宜的空腔尺寸,良好的负载能力、良好的靶向能力,光热性能,荧光成像能力,增强超声成像的能力及运载能力,并在细胞和分子水平上成功地对易损动脉粥样硬化斑块进行无创诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物医药材料技术领域,具体涉及一种具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实 现成像的纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
动脉粥样硬化疾病仍然严重影响着全世界的人类健康。成人心血管事件的发生率、死 亡率和发病率居高不下。动脉粥样硬化斑块的形成在心血管事件的发生和发展中起着重要 作用。动脉粥样硬化斑块的形成是一个动态的、极其复杂的过程。主要包括细胞迁移、炎 症反应、氧化应激和巨噬细胞对脂质的吞噬作用。随着斑块的不断生长,甚至破裂等,可 导致血管管腔狭窄甚至闭塞,不同病变所造成的损害严重程度不同。动脉粥样硬化斑块根 据形态学特征可分为稳定斑块和稳定斑块。前者趋于稳定,不易脱落或破裂引起心血管事 件。后者是由于存在大量细胞,例如泡沫细胞、血管平滑肌细胞(VSMC)、新的毛细血管 和较薄的纤维帽,更容易破裂,尤其是在不良因素的诱导下,大多数心血管事件都是由此 引起的。因此,早期准确诊断动脉粥样硬化易损斑块尤为重要,可以大大减少心血管事件 的发生,如心肌梗塞、急性冠脉综合征等致命性的疾病。
在临床诊疗活动中,易损动脉粥样硬化斑块的诊断方法包括无创和有创诊断。前者通 常包括超声造影(CEUS),计算机断层扫描(CT)成像,和磁共振成像(MRI),后者主 要包括:血管内超声(IVUS),数字减影血管造影(DSA)成像,和血管内光学相干断层 扫描等。但是,这些检查方法不能有效地评估易损斑块中的成分,并且难以在分子水平上 准确区分稳定斑块和易损斑块。在这些检查方法中,超声造影具有经济性好、无辐射损伤、 实时、无创、安全、操作便捷等优点,可作为首选。与此同时,具有不同成像能力的造影 剂也应运而生。如磷脂包覆全氟丙烷、人血清白蛋白包覆全氟丙烷、磷脂包覆六氟化硫等 造影剂。但是,微泡会在体内循环几分钟,然后通过呼吸道排出,而且这些微泡在制备后 直接平均约为1-2微米,并且尺寸会随着时间的推移而减小,这会不利于超声增强成像。 因为能够通过正常肺和全身毛细血管床的最大粒径通常不超过6~8μm,在这个范围内, 微泡的粒径越大,增强超声成像的效果越显着。鉴于此,心血管疾病的增强超声成像存在 很大挑战。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上,提供一种具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现 成像的纳米粒子(AuNPs@SiO2OCP),它包括内腔中填充有全氟正戊烷的氨基改性的中空介孔二氧化硅微球,该微球的表面接枝有骨桥蛋白抗体,以及在骨桥蛋白抗体和/或微球的表面偶联有二氢卟吩e6,并将多个链状金纳米颗粒呈“星空样”分布在氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的壳层内表面,相对于等质量的单个纳米金球明显增加了比表面积,增强了局域等离子共振效应,提高了纳米粒子的光热转换效率,具有良好的靶向能力,光热性能,荧光成像能力,增强超声成像的能力及运载能力,能更好的在易损动脉粥样硬化斑块中发挥作用。
本发明的另一目的是提供一种上述具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米 粒子的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒 子作为光热材料、荧光材料或超声造影材料的应用,特别是作为诊断易损动脉粥样硬化斑 块的光热材料、荧光材料或超声造影材料的应用。
本发明的技术方案如下:
一种具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子,它包括内腔中填充有全氟 正戊烷的氨基改性的中空介孔二氧化硅微球,在氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的壳层 内表面分散有多个链状金纳米颗粒,在氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的表面接枝有骨 桥蛋白抗体,在所述骨桥蛋白抗体上和/或在所述氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的表 面偶联有二氢卟吩e6。
在一种优选方案中,本发明提供的具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒 子,具有很好的生物相容性及安全性,可被大批量合成,各组分之间通过化学键互相紧密 连接,具有很高的稳定性,粒径分布均匀,分散性好,介孔均匀,具有适宜的空腔尺寸,良好的负载能力、良好的靶向能力,光热性能,荧光成像能力,增强超声成像的能力及运 载能力。其中,纳米粒子的粒径为255-300nm;氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的粒径 为220-265nm,优选为250nm;氨基改性的中空介孔二氧化硅微球中介孔的孔径为3~6 nm,优选为4nm;氨基改性的中空介孔二氧化硅微球中壳层的厚度为15~25nm,优选为 20nm。
本发明还提供上述具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子的制备方法, 它包括如下步骤:
(1)将CTAB、氢氧化钠与去离子水混合均匀后,在搅拌的过程中升温至70~90℃,向所得混合溶液中依次加入甲醛溶液、四氯金酸溶液、TEOS和乙醇进行搅拌反应,待反 应完成后,再向所得反应液中加入TEOS、APTMS和乙醇继续进行氨基改性反应,离心、 洗涤后,得到氨基改性的中空介孔二氧化硅微球AuNPs@SiO2-NH2;
(2)将步骤(1)中所得AuNPs@SiO2-NH2与SMCC混合均匀,进行活化氨基反应, 得到活化后的AuNPs@SiO2-NH2;将骨桥蛋白抗体与DTT混合均匀,进行激活反应,得 到激活后的骨桥蛋白抗体;将二氢卟吩e6、EDC和N,N-二甲苯甲酰胺混合均匀,在避 光的条件下进行活化反应,得到活化后的二氢卟吩e6;
(3)将步骤(2)中活化后的AuNPs@SiO2-NH2与激活后的骨桥蛋白抗体充分混合, 使得AuNPs@SiO2-NH2的表面接枝有骨桥蛋白抗体,得到AuNPs@SiO2O,继续向所得产 物中加入步骤(2)中活化后的二氢卟吩e6,混合均匀进行偶联反应,使得骨桥蛋白抗体 上和/或AuNPs@SiO2-NH2的表面偶联有二氢卟吩e6,离心、洗涤后,得到 AuNPs@SiO2OC;
(4)在真空和避光的条件下,将全氟正戊烷填充至步骤(3)中所得AuNPs@SiO2OC的内腔中,得到纳米粒子AuNPs@SiO2OCP。
在一种优选方案中,步骤(1)中,氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的粒径为220-265 nm,优选为250nm;氨基改性的中空介孔二氧化硅微球中介孔的孔径为3~6nm,优选为4nm;氨基改性的中空介孔二氧化硅微球中壳层的厚度为15~25nm,优选为20nm。
在一种优选方案中,步骤(1)中,在制备氨基改性的中空介孔二氧化硅微球AuNPs@SiO2-NH2的过程中,CTAB与甲醛的质量摩尔比为150~180:1(g/mol),优选为 167:1(g/mol);CTAB与四氯金酸的质量摩尔比为480~520:1(g/mol),优选为500:1(g/mol);CTAB与第一次加入的TEOS的质量体积比为230~280:1(mg/mL),优选为250:1(mg/mL);CTAB与第二次加入的TEOS的质量体积比为80~120:1(mg/mL),优选为100:1(mg/mL); CTAB与APTMS的质量体积比为180~220:1(mg/mL),优选为200:1(mg/mL)。
在一种优选方案中,步骤(2)中,步骤(1)中所得AuNPs@SiO2-NH2与SMCC的 质量比为1:0.1~0.5,优选为1:0.2。
进一步地,骨桥蛋白抗体与SMCC的质量比为1:18~22,优选为1:20。DTT与骨桥 蛋白抗体的质量比为1:35~45,优选为1:40。
进一步地,二氢卟吩e6与与SMCC的质量比为1:0.1~0.5,优选为1:0.2。在一种优选方案中,步骤(3)中,二氢卟吩e6与EDC的质量比为1:5~10,优选为1:8。
步骤(4)中,纳米粒子AuNPs@SiO2OCP的粒径为255-300nm。
为了更好的理解本发明的内容,出现了一些缩略词,其对应的中文解释如下:骨桥蛋 白抗体(OPN Ab)、氨基改性的中空介孔二氧化硅微球,在其壳层内表面分散有多个链状金纳米颗粒(AuNPs@SiO2-NH2)、二氢卟吩e6(Ce6)、氨基改性的中空介孔二氧化硅微 球的表面接枝有骨桥蛋白抗体(AuNPs@SiO2O)、氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的表 面接枝有骨桥蛋白抗体,在骨桥蛋白抗体上和/或氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的表 面偶联有二氢卟吩e6(AuNPs@SiO2OC)、全氟正戊烷(PFP)、氨基改性的中空介孔二氧 化硅微球的表面接枝有骨桥蛋白抗体,以及在骨桥蛋白抗体上和/或氨基改性的中空介孔 二氧化硅微球的表面偶联有二氢卟吩e6和在该微球的内腔中填充有全氟正戊烷 (AuNPs@SiO2OCP)。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB);正硅酸四乙酯(TEOS);3-氨 丙基三甲氧基硅烷(APTMS)。
本发明基于填充有全氟正戊烷(PFP),骨桥蛋白抗体标记(OPN Ab)以及偶联有二氢卟吩e6(Ce6)的氨基改性的中空介孔二氧化硅微球(AuNPs@SiO2-NH2),在中空介 孔二氧化硅微球的壳层内表面分散有多个链状金纳米颗粒(AuNPs),成功构建了具有多 模态成像能力的纳米粒子(AuNPs@SiO2OCP),可以作为光热材料、荧光材料或超声造 影材料,用于诊断易损动脉粥样硬化斑块。其中,纳米粒子中全氟正戊烷由于的沸点相对 较低,在体内很容易达到沸腾,因此缩短了近红外线的照射时间,避免了对病灶和周围正 常组织中有益细胞的损伤。
采用本发明的技术方案,优势如下:
本发明提供的纳米粒子是基于填充有全氟正戊烷、骨桥蛋白抗体标记以及偶联有二氢 卟吩e6的氨基改性的中空介孔二氧化硅微球,在中空介孔二氧化硅微球的壳层分散有多 个链状金纳米颗粒,具有很高的稳定性,粒径分布均匀,分散性好,介孔均匀,具有适宜 的空腔尺寸,良好的负载能力、良好的靶向能力,光热性能,荧光成像能力,增强超声成像的能力及运载能力,并在细胞和分子水平上成功地对易损动脉粥样硬化斑块进行无创诊断。
附图说明
图1是AuNPs@SiO2OCP纳米粒子的合成路线和多模态成像示意图;
图2是SEM和TEM图,其中,图2中(A)为透射电子显微镜观察AuNPs@SiO2-NH2纳米粒子;图2中(B)为扫描电子显微镜观察AuNPs@SiO2-NH2纳米粒子;图2中(C) 为AuNPs@SiO2-NH2组成元素映射;
图3是X射线光电子能谱(XPS)分析;其中,图3中(A)为AuNPs@SiO2-NH2; 图3中(B)为Au在AuNPs@SiO2氨基化后的XPS中的放大图;图3中(C)为N在AuNPs@SiO2氨基化后的XPS中的放大图;
图4是AuNPs@SiO2-NH2的N2吸附-解吸等温曲线及相应的孔径分布曲线图;其中,图4中(A)为N2吸附-解吸等温曲线图;图4中(B)为孔径分布曲线图;
图5是AuNPs@SiO2OCP的电位测试结果和紫外可见光吸收光谱;其中,图5中(A) 为不同组分的电位测试;图5中(B)为紫外可见光吸收光谱,上方的曲线代表 AuNPs@SiO2OCP,下方的曲线代表AuNPs@SiO2-NH2;
图6是水合粒径分布图;其中,图6中(A)为AuNPs@SiO2-NH2;图6中(B)为 AuNPs@SiO2OCP;
图7是AuNPs@SiO2OCP的光热性能测试;其中,图7中(A)为在1W/cm2 808nm 激光照射下5分钟后不同浓度的AuNPs@SiO2OCP溶液热成像图;图7中(B)为不同浓 度AuNPs@SiO2OCP溶液在固定激光功率密度下的光热升温曲线,对照组为生理盐水; 图7中(C)为200μg/mL AuNPs@SiO2OCP溶液在不同激光功率密度下的光热升温曲线; 图7中(D)在连续4次808nm激光照射后溶液AuNPs@SiO2OCP的温度曲线(每个循 环激光照射600秒,停止辐照900秒);
图8是AuNPs@SiO2OCP体外产气评估;其中,图8中(A)为AuNPs@SiO2OCP 纳米粒子水溶液分别在4、30、42℃时的气泡产生的量;图8中(B)为气泡量的统计分 析;图8中(C)为AuNPs@SiO2OCP纳米粒子水溶液玻片内产气的结果及统计分析;
图9是AuNPs@SiO2OCP体外超声成像;其中,图9中(A)为不同温度下的乳胶管 超声成像;图9中(B)为B-Mode管的灰度值分析;图9中(C)为CEUS管的灰度值 分析;
图10是AuNPs@SiO2OCP的细胞毒性及血液相容性评估;其中,图10中(A)为采 用CCK-8法评估不同浓度的AuNPs@SiO2OCP对巨噬细胞和内皮细胞的细胞活力的影 响;图10中(B)为显微镜下观察利用活/死试剂盒(绿色:活细胞,红色:死细胞)分 别对巨噬细胞及血管内皮细胞进行毒性评估,比例尺:50μm;图10中(C)为 AuNPs@SiO2OCP对正常C57小鼠红细胞的溶血率;图10中(D)为采用流式细胞术评 估不同浓度AuNPs@SiO2OCP对巨噬细胞和内皮细胞的存活率;
图11是泡沫细胞模型的建造;其中,左图为巨噬细胞,右图为泡沫细胞,比例尺:50μm;
图12是巨噬细胞及泡沫细胞对纳米粒子的摄取、分解;其中,图12中(A)为生物 样本观察巨噬细胞及泡沫细胞对AuNPs@SiO2OCP的摄取;图12中(B)为巨噬细胞对 AuNPs@SiO2OCP的摄取,比例尺:19.1μm;图12中(C)为泡沫细胞对AuNPs@SiO2OCP 的摄取,比例尺:38.6μm;图12中(D)为荧光强度统计学分析;
图13是泡沫细胞表达OPN Ab半定量分析;其中,图13中(A)为细胞免疫荧光, 刻度尺:38.6μm;图13中(B)为相对荧光强度统计学分析;
图14是AuNPs@SiO2OCP纳米粒子细胞荧光成像;其中,图14中(A)为 AuNPs@SiO2OCP纳米粒子对细胞的荧光成像;图14中(B)为相对荧光强度分析,F: 泡沫细胞,M:巨噬细胞;
图15是AuNPs@SiO2OCP纳米粒子细胞内产气;其中,图15中(A)为 AuNPs@SiO2OCP纳米粒子细胞内产气;图15中(B)为气泡数量统计分析;
图16是易损动脉粥样硬化斑块动物模型的鉴定;其中,图16中(A)为小鼠主动脉大体油红O染色,左为C57BL/6J小鼠,右C57BL/6J ApoE-/-小鼠,刻度尺:5mm;图16 中(B)为斑块组织HE、Masson、油红O染色,刻度尺:200μm;图16中(C)为斑 块组织免疫组化分析,刻度尺:200μm;图16中(D)为斑块组织免疫荧光,刻度尺: 200μm;
图17是小鼠活体荧光成像;其中,图17中(A)为不同处理组小鼠活体荧光成像; 图17中(B)为活体荧光成像的荧光强度随时间变化曲线(n=3);图17中(C)为不同 处理组小鼠内脏荧光成像;图17中(D)为内脏荧光成像的统计分析(n=3);
图18是小鼠活体超声成像;其中,图18中(A)为不同处理组在激光器照射前后的小鼠主动脉超声图像;图18中(B)为超声图像灰度值统计学分析(n=3);
图19是小鼠活体光热声成像;其中,图19中(A)为不同处理组光热成像图;图19 中(B)为主动脉弓处的3D光热图;图19中(C)为主动脉弓处光热温度曲线(n=3);
图20是AuNPs@SiO2OCP纳米粒子生物安全性评估;其中,图20中(A)为在注射AuNPs@SiO2OCP纳米粒子后第0天、第1天、第7天、第28天对小鼠血清AST、 ALT、LDH、CK、BUN、CREA、RBC、WBC、PLT、HGB等指标进行检测(n=3),数 据以平均值±SD表示;图20中(B)为给药28天取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织 进行病理学观察,刻度尺:200μm。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的纳米粒子(AuNPs@SiO2OCP)作进一步 的说明,但这些实施例不对本发明构成任何限制。
一、纳米粒子(AuNPs@SiO2OCP)的合成与表征
1、实验方法
1.1 AuNPs@SiO2OCP合成
1.1.1 AuNPs@SiO2-NH2的合成
将50mg CTAB溶于24mL去离子水中,加入1mL 0.5M氢氧化钠溶液。将所得混 合溶液置于水浴锅中加热至80℃,持续20min,同时以700rpm的速度搅拌,将0.3mL 1M甲醛溶液加入混合液中,约1min后,将1mL 0.1M四氯金酸溶液逐滴加入至反应液 中,然后将0.2mLTEOS和2mL无水乙醇混合均匀后加入反应液中,继续搅拌40min, 继续将0.5mL TEOS、0.25mL APTMS及2mL无水乙醇混合均匀后加入到反应液中,剧 烈搅拌,13h后反应结束。将反应液取出,在7000rpm离心,用无水乙醇洗涤三次。将 沉淀超声再分散至无水乙醇中,配置0.6mg/L的硝酸铵无水乙醇溶液40mL,将两者混 合在100mL圆底烧瓶中,再将烧瓶置于水浴锅中加热至60℃,300rpm的速度搅拌,持 续3h,离心,洗涤,再分散在去离子水中,放在冷冻干燥机中至完全干燥,得到干净的 表面氨基化的中空介孔二氧化硅微球(AuNPs@SiO2-NH2)。
1.1.2AuNPs@SiO2OC的合成
活化氨基:取100μl 2mg/mL SMCC(琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧 酸盐)与1mL 1mg/mL中空介孔二氧化硅微球(AuNPs@SiO2-NH2)的PBS溶液混合,在200rpm搅拌1h,离心,用PBS洗涤三次,再分散在PBS溶液中。激活OPN Ab:取1μl 0.25mg/mLDTT(二硫苏糖醇)加入到10μl 1mg/mL OPN Ab中,在200rpm搅拌1.5h,此 时OPN Ab处于活化状态(二硫键断裂变为巯基)。将上述两种溶液混合后,置于37℃摇 床,200次每分钟,反应4h,使活化后的AuNPs@SiO2-NH2与激活状态的OPN Ab充分 结合,使得AuNPs@SiO2-NH2的表面接枝有骨桥蛋白抗体,得到含AuNPs@SiO2O的反 应液。活化Ce6:将1mg Ce6,8mg EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺) 溶于5mL N,N-二甲苯甲酰胺中避光反应60min后,Ce6中的羧基得到活化。将活化状 态下的Ce6加入上述得到的AuNPs@SiO2O的反应液中,避光,置于37℃摇床,200次 每分钟,反应4h,使得骨桥蛋白抗体上和/或AuNPs@SiO2-NH2的表面偶联有二氢卟吩e6, 反应结束后,4℃离心,PBS洗涤,得到AuNPs@SiO2OC,分散于PBS溶液中,4℃避光 存放。
1.1.3 AuNPs@SiO2OCP的合成
将上述含AuNPs@SiO2OC的PBS溶液冷冻干燥后,放在50mL双颈瓶中,避光,双 颈瓶一口连三通和真空机,另一口塞上橡胶塞,抽真空,待真空度在-90以下时,保持5 min,关闭三通及机器,保持双颈瓶真空状态,快速加入100μl全氟正戊烷(PFP)超声 30秒,使PFP被充分吸入至AuNPs@SiO2OC的内腔中。加入PBS除去多余的PFP,4℃ 离心,得到纳米粒子(AuNPs@SiO2OCP),再分散在PBS中。整个反应过程中,双颈瓶 处于避光,冰水中状态。
1.1.4 AuNPs@SiO2CP的合成
活化氨基:取100μl 2mg/mL SMCC(琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧 酸盐)与1mL 1mg/mL中空介孔二氧化硅微球(AuNPs@SiO2-NH2)的PBS溶液混合,在200rpm搅拌1h,离心,用PBS洗涤三次,再分散在PBS溶液中。活化Ce6:将1mg Ce6,8mg EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)溶于5mL N,N-二甲苯甲 酰胺中避光反应60min后,Ce6中的羧基得到活化。
将活化状态下的Ce6加入上述活化后的AuNPs@SiO2-NH2的PBS溶液中,避光,置 于37℃摇床,200次每分钟,反应4h,使得AuNPs@SiO2-NH2的表面偶联有二氢卟吩 e6,反应结束后,4℃离心,PBS洗涤,得到AuNPs@SiO2C,分散于PBS溶液中,4℃避 光存放。
将上述含AuNPs@SiO2C的PBS溶液冷冻干燥后,放在50mL双颈瓶中,避光,双 颈瓶一口连三通和真空机,另一口塞上橡胶塞,抽真空,待真空度在-90以下时,保持5 min,关闭三通及机器,保持双颈瓶真空状态,快速加入100μl全氟正戊烷(PFP)超声 30秒,使PFP被充分吸入至AuNPs@SiO2C的内腔中。加入PBS除去多余的PFP,4℃ 离心,得到纳米粒子(AuNPs@SiO2CP),再分散在PBS中。整个反应过程中,双颈瓶 处于避光,冰水中状态。
1.2 AuNPs@SiO2OCP表征
1.2.1 SEM和TEM观察
将AuNPs@SiO2-NH2洗涤干净后,配置成适宜浓度的水溶液,吸取10μl的 AuNPs@SiO2-NH2水溶液小心地滴在铜网上,烘干后,进行透射电镜观察。吸取100μl AuNPs@SiO2-NH2水溶液小心地滴在玻片上,烘箱干燥后,喷金(防止纳米粒子表面异常 放电影像观察),进行扫描电镜观察。
1.2.2 XPS分析
使用X射线光电子能谱技术(XPS)对AuNPs@SiO2-NH2表面的化学元素进行分析 研究
1.2.3氮气吸附-解吸实验
使用微计量仪器对AuNPs@SiO2OCP进行氮气吸附-解吸测量。介孔孔径分布及大小使用Barrett-Joyner-Halenda(BJH)方法计算。
1.2.4 Zeta电位及水合粒径测量
使用电位-粒径仪分别对进行AuNPs@SiO2-NH2和AuNPs@SiO2OCP进行水合粒径 测量对合成AuNPs@SiO2OCP过程中的AuNPs@SiO2-NH2,OPN Ab,Ce6,AuNPs@SiO2OCP进行测量。
1.2.5紫外吸收光谱测量
使用紫外-可见分光光度计(UV-6100)对合成AuNPs@SiO2OCP过程中的 AuNPs@SiO2-NH2,AuNPs@SiO2OCP紫外吸光度进行测量。
1.2.6 AuNPs@SiO2OCP光热性能测试
(1)制备不同浓度AuNPs@SiO2OCP(0,20,50,100,200,500μg/mL)水溶液 各500μL加入2mL的EP管中。接着使用808nm激光器(1W/cm2)照射各浓度溶液, 并使用红外热成像仪实时记录图像数据,并绘制温度曲线图。
(2)制备浓度为200μg/mL的AuNPs@SiO2OCP水溶液,取500μL加入2mL的 EP管中。接着使用不同功率(0.3,0.6,0.9,1.2W/cm2)下的808nm激发光照射各浓度 溶液,并使用红外热成像仪实时记录图像数据,并得出温度曲线图。
1.2.7 AuNPs@SiO2OCP体外产气评估
将200μg/mL的AuNPs@SiO2OCP水溶液加入到透明的4℃预冷的4mL的玻璃瓶内, 打开水浴锅,将温度设定在30℃,当温度达到时,将玻璃瓶浸入水浴锅内约1min,取 出观察玻璃瓶内的气泡产生情况并拍照。将温度设置为42℃,当温度达到42℃时,再次 将玻璃瓶浸入水浴锅内约1min,取出观察玻璃瓶内的气泡产生情况并拍照。选定大小相 同的区域并作统计分析。
用移液器吸取10μl的200μg/mL的AuNPs@SiO2OCP水溶液,利用虹吸效应小心 地加在盖有盖玻片的载玻片上,将808激光器功率调整为1W/cm2对玻片连续照射6 min,观察玻片内气泡产生情况,同时进行拍照。
1.2.8 AuNPs@SiO2OCP体外超声成像
将AuNPs@SiO2OCP配制成200μg/mL的水溶液,将双蒸水加热煮沸后自然冷却, 以去除水中含有的气泡,作为对照。分别将200μg/mL的水溶液及自然冷却的双蒸水加 入到直径6mm的乳胶管中。在不同的温度同时用超声2D和Contras模式对乳胶管进行 超声成像。
1.2.9统计学分析
所有实验数据至少重复三次,采用统计软件GraphPad Prism 8.0进行统计学分析及绘 图,计量资料用均数±标准差(Mean±SD)表示;两两比较用t检验;组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA);多组的组内比较采用q检验;数据不符合正态分布或组间 方差不齐,采用秩和检验。检验水准:α=0.05,p<0.05表示有统计学意义。
2、结果与分析
2.1 TEM和SEM观察结果
如图2所示,TEM(图2A)观察AuNPs@SiO2-NH2结构形貌,可见AuNPs@SiO2-NH2纳米粒子粒径在220-265nm,优选的粒径为250nm,链状金纳米颗粒分散在中空介孔纳 米硅球的壳层内表面。SEM(图2B)显示AuNPs@SiO2-NH2纳米粒子粒径在220-265nm, 表面有粗糙感,是硅球表面的介孔造成的。AuNPs@SiO2-NH2壳层的厚度为15~25nm, 优选为20nm。图2C中可以清晰地观测到AuNPs@SiO2-NH2由Au、Si、N、O组成。
2.2 XPS测试结果
使用X射线光电子能谱(XPS)分析确认AuNPs@SiO2-NH2的元素组成成分。图3A 显示,AuNPs@SiO2氨基化(AuNPs@SiO2-NH2)后包括(Au、N、O)三个元素,符合 Au4f(两个峰),O1s和N1s特征峰。结合能峰分别位于83.48、87.18、399.78、400.08eV。 图3B是Au在AuNPs@SiO2氨基化后的XPS中的放大图。图3C是N在AuNPs@SiO2氨基化后的XPS中的放大图。
2.3 N2吸附-解吸实验结果
图4A表示N2吸附-解吸等温曲线,图4B表示BJH方法测得的AuNPs@SiO2-NH2表 面介孔的直径分布,孔径分布集中在3~6nm左右,优选为4nm;表明AuNPs@SiO2-NH2纳米粒子具有载入-释放药物的能力。
2.4 Zeta电位测试结果及紫外可见光吸收光谱
图5A显示了AuNPs@SiO2OCP纳米粒子的不同组分的电位特性,及其中间产物的 电位范围约在-10.18至-17.66mV。图5B显示了AuNPs@SiO2-NH2及AuNPs@SiO2OCP 复合纳米粒子的紫外可见光吸收光谱,可以看出,在AuNPs@SiO2-NH2在504-506nm处 有吸收峰,转变成AuNPs@SiO2OCP的过程中,紫外光吸收峰发生了红移, AuNPs@SiO2OCP在522-532nm处有宽的吸收峰。
2.5 AuNPs@SiO2OCP水合粒径测量结果
图6A和6B分别为AuNPs@SiO2-NH2及AuNPs@SiO2OCP水合粒径结果。图6A显 示AuNPs@SiO2-NH2的水合粒径集中在220-265nm范围。图6B显示AuNPs@SiO2OCP 水合粒径集中在255-300nm范围
2.6 AuNPs@SiO2OCP的光热性能测试
AuNPs@SiO2OCP具有良好的光热性能,图7A为光热图,将808nm激光器的功率 调整为1.0W/cm2连续辐照5min后观察不同浓度AuNPs@SiO2OCP溶液随时间变化情况。 如图7B所示,sline,20、50、100、200、500μg/mL组,在辐照5min后温度分别增加了 2.3、7.8、12.5、20.7、28.9、32.5℃。图7C所示,将激光器的功率密度分别调整为0.3、0.6、0.9、1.2w/cm2对浓度为200μg/mL AuNPs@SiO2OCP溶液连续照射5min。溶液的 温度分别升高了2.6、18.7、27.4、32℃。为了研究AuNPs@SiO2OCP的光热稳定性,将 AuNPs@SiO2-OCP溶液连续固定功率密度辐照10min,至溶液升至最高温度,停止辐照 15min,使溶液完全降至周围温度,重复连续加热,冷却,4个循环。结果如图7D所示, AuNPs@SiO2OCP经过多次辐照后仍然具有良好的稳定性和重现性。
2.7 AuNPs@SiO2OCP体外产气评估
AuNPs@SiO2OCP具有良好的发生气泡的能力。图8A示AuNPs@SiO2OCP纳米粒 子水溶液分别在4、30、42℃时的气泡产生的量。以水作为0气泡对照。图8B为相应的 统计分析结果。可以看出纳米溶液在42℃时气泡产生的量明显增加。图8C为将808激 光器功率调整为1W/cm2对加有纳米溶液的玻片连续照射6min,玻片内气泡产生的结果 及统计分析,可以看出在照射3min时气泡产生明显增加。
2.8 AuNPs@SiO2OCP体外超声成像
如图9A所示AuNPs@SiO2OCP纳米粒子水溶液分别在30、42℃时的乳胶管超声成像,从2D图像上可以看出,水中的气泡为0,当纳米粒子溶液加热到30℃时,乳胶管 中明显产生气体,当温度升至42℃时乳胶管内明显增多的气泡生成,相应的增强模式显 示气泡的量明显增加。图9B分别对超声成像的灰度值进行统计分析,结果显示42℃时乳 胶管超声成像的灰度值明显增高。
二、纳米粒子(AuNPs@SiO2OCP)的细胞实验及体外成像
1、方法
1.1细胞培养
本实验采用RAW264.7细胞系,是一种常用的经典的巨噬细胞。采用含有10%胎牛血清(FBS,Gibco)的不完全DMEM高糖培养基,再放入37℃,5%CO2恒温培养箱中 培养,细胞可贴壁生长,25cm2培养瓶可以加入5mL培养液,6孔细胞培养板每孔可加 入1.5-2mL完全培养液,每天观察细胞生长情况。
1.1.1细胞复苏
将水浴锅打开预热至37℃,将含有10%FBS不完全DMEM高糖培养基预热,用含75%的酒精棉球擦拭超净台,将移液枪、灭菌后的枪头、细胞培养瓶及2mL EP管在超 净台紫外线灯下照射至少15分钟。将装有细胞株的冻存管从液氮罐中取出,快速放入 37℃的水浴锅内,持续摇晃40s后迅速转移到超净台中。将细胞悬液转移至15mL的 无菌离心管中,加入预热后的培养液至离心管的2/3处,离心,1000r/min,4min。弃 掉上清液,将1mL含有10%FBS不完全DMEM高糖培养基加入离心管使细胞重悬,细 胞计数:用微量移液器吸取10μl细胞悬液,利用虹吸作用进入计数板和载玻片之间,显 微镜观察并记录计数板上4个大网格内16个小网格上细胞的数量(计数方法:当细胞在 同一方格的四条边上时,取上边弃下边,取左边弃右边),计算4个区域的平均细胞数, 推算出原来EP管中细胞的浓度。取细胞培养瓶,加入4mL完全培养基,吸出细胞悬液 加入到培养瓶内,采用十字法轻柔地摇晃细胞培养瓶,将培养瓶转移到37℃,5% CO2的细胞培养箱中继续培养,待细胞贴壁后观察细胞形态。
1.1.2细胞传代
RAW264.7细胞生长较快,容易发生接触抑制。当细胞密度达到80%左右时即可传代。弃掉原来的培养液,用PBS缓冲液晃洗细胞2-3次,小心地用无菌吸管吸出PBS,并 弃掉。加入2mL培养基,用无菌滴管连续轻柔吹打,在显微镜下观察,当大部分细胞被 吹打下来后,将细胞悬液计数后转移至不同培养瓶中,同时培养液补充至5mL,观察细 胞生长情况,大概2天左右即可传代。
1.1.3细胞冻存
选取在对数期生长的细胞,弃掉旧的培养基,用PBS晃洗3次,无菌吸管轻连续柔吹打,使用15mL无菌离心管收集细胞悬液,离心,1000rpm,5min。弃掉上清液,将 1mL即用型细胞冻存液加入离心管中并轻柔吹打重悬细胞。拧紧冻存管瓶盖,封口膜密 封,注明冻存的日期和细胞名称。放入室温状态的冻存盒中,转入-80℃冰箱,24h后可 放置于液氮罐长期储存。
1.2细胞毒性实验
1.2.1纳米粒子对RAW264.7细胞的细胞毒性检测
选取在对数期生长的RAW264.7细胞以每孔1×104个的数量铺在96孔板中,用完全培养基100μL培养,待细胞过夜贴壁后,弃掉旧的培养基,处理组加入将 AuNPs@SiO2OCP用不含FBS不完全高糖培养基配置不同浓度梯度(0,10,20,50, 100,200,500μg/mL)的溶液。对照组用不含FBS不完全高糖培养基,相同浓度设6个 副孔,96孔板周围一圈添加少许PBS缓冲液,用以减少培养基挥发对实验结果产生的影 响。培养箱孵育6h。弃掉旧的培养液,每孔加入含10μL CCK-8的不完全高糖培养基 100μL,避光,继续细胞培养箱孵育2h。最后,使用酶标仪检测450nm处的吸光度 (OD)值,进行统计学分析。
选取在选取对数期生长的RAW264.7细胞以每孔8×105个的数量铺在6孔板中,每孔 加入2mL完全培养液培养,待细胞过夜贴壁后,弃掉旧的培养液,用PBS清洗2次,弃 掉PBS,处理组加入将AuNPs@SiO2OCP用不含FBS不完全高糖培养基配置不同浓度梯 度(0,10,20,50,100,200,500μg/mL)的溶液。对照组用不含FBS不完全高糖培 养基,相同浓度设3个副孔。培养箱孵育6h。弃掉旧的培养液,加入事先准备好的 AM/PI工作液,每孔2mL,避光室温放置30-45min,吸出工作液,用PBS充分晃洗2 次,倒置荧光显微镜观察。
选取对数期生长的RAW264.7细胞以每孔8×105个的数量铺在6孔板中,每孔加入2mL完全培养液培养,待细胞过夜贴壁后,弃掉旧的培养基,用PBS清洗2次,弃掉 PBS,处理组加入将AuNPs@SiO2OCP用不含FBS不完全高糖培养基配置不同浓度梯度 (0,10,20,50,100,200,500μg/mL)的溶液。对照组用不含FBS不完全高糖培养 基,相同浓度设3个副孔。培养箱孵育6h。弃掉旧的培养液,用PBS充分晃洗2次,用 不含EDTA的胰酶消化5min,300g、4℃、5min离心收集细胞,为了防止消化过度, 用含有10%的FBS培养基终止消化,用4℃预冷的PBS清洗2次,每次300g、4℃、 5min离心收集细胞,并用100μl 1×buffer重悬细胞,每管中加入4-5μl的Fitc-AnnexinV 和5μl的PI工作液。准备2个额外的流式管,每管只加入一种单染染料(Fitc-AnnexinV 或PI),用于流式单染补偿调节。室温状态下,避光孵育13min,将400μl的1×buffer 加入到每管中,尽快使用流式细胞仪进行检测。
1.2.2纳米粒子对人脑血管内皮细胞的细胞毒性检测
将生长良好的人脑血管内皮细胞以每孔0.8×104个铺板在96孔板中,用完全培养基 100μl培养,待细胞过夜贴壁后,弃掉旧的培养基,处理组加入将AuNPs@SiO2OCP用不 含FBS不完全高糖培养基配置不同浓度梯度(0,10,20,50,100,200,500μg/mL) 的溶液。对照组用不含FBS不完全高糖培养基,相同浓度设6个副孔,96孔板周围一圈 添加少许PBS缓冲液,用以减少培养基挥发对实验结果产生的影响。培养箱孵育6h。弃 掉旧的培养液,每孔加入含10μL CCK-8的不完全高糖培养基100μL,避光孵育2h。最 后,使用酶标仪检测450nm处的吸光度(OD)值,进行统计学分析。
选取生长良好的人脑血管内皮细胞以每孔10×105个铺板在6孔板中,每孔加入2mL 完全培养液培养,待细胞过夜贴壁后,弃掉旧的培养基,用PBS清洗2次,弃掉PBS, 处理组加入将AuNPs@SiO2OCP用不含FBS不完全高糖培养基配置不同浓度梯度(0, 10,20,50,100,200,500μg/mL)的溶液。对照组用不含FBS不完全高糖培养基,相 同浓度设3个副孔。培养箱孵育6h。弃掉旧的培养液,加入事先准备好的AM/PI工作 液,每孔2mL,避光室温放置30-45min,吸出工作液,用PBS充分晃洗2次,倒置荧 光显微镜观察。
选取生长良好的人脑血管内皮细胞以每孔10×105个铺板在6孔板中,每孔加入2mL 完全培养液培养,待细胞过夜贴壁后,弃掉旧的培养基,用PBS晃洗2次,弃掉PBS, 处理组加入将AuNPs@SiO2OCP用不含FBS不完全高糖培养基配置不同浓度梯度(0, 10,20,50,100,200,500μg/mL)的溶液。对照组用不含FBS不完全高糖培养基,相 同浓度设3个副孔。培养箱孵育6h。弃掉旧的培养液,用PBS充分晃洗2次,用不含 EDTA的胰酶消化5min,300g、4℃、5min离心收集细胞,用含有10%的FBS培养基 终止消化,防止消化过度,用4℃预冷的PBS清洗2次,每次300g、4℃、5min离心 收集细胞,并用100μl 1×buffer重悬细胞,每管中加入4-5μL的Fitc-AnnexinV和5μL 的PI工作液。准备2管额外的流式管,每管只需加入一种单染染料(Fitc-AnnexinV或 PI),用于流式单染补偿调节。室温避光孵育10-15min,每管加入400μL的PBS或 1×buffer,尽快使用流式细胞仪进行检测。
1.3泡沫细胞模型的建造
1.3.1 RAW264.7细胞转换成泡沫细胞
选取对数期生长的RAW264.7细胞,铺在10cm细胞培养皿,1×106个每皿,加入10mL含有10%FBS不完全DMEM高糖培养基,移入细胞培养箱,过夜,细胞贴壁后,弃 掉培养基,用PBS清洗2次,加入10mL含有50μg/mL oxLDL及3%FBS的培养基, 再次移入细胞培养箱中,孵育24h。
1.3.2血管平滑肌细胞转换成泡沫细胞
选取对数期生长的血管平滑肌细胞,铺在10cm细胞培养皿,0.8×106个每皿,加入10mL含有10%FBS不完全DMEM高糖培养基,移入细胞培养箱,过夜,细胞贴壁 后,弃掉培养基,用PBS清洗2次,加入约10mL含有50μg/mL oxLDL及3%FBS的培 养基,再次移入细胞培养箱中,孵育24h。
1.3.3泡沫细胞的鉴定
油红O细胞染色:弃掉旧的细胞培养液,用PBS晃洗3次,加ORO Fixative(试剂 A)固定液,固定28min。吸除固定液,用双蒸水晃洗3次,使用60%异丙醇,充分晃洗5 min。吸除60%异丙醇,滴加新配制的ORO Stain。浸染15min。弃去,双蒸水充分晃洗 4次。用移液器吸干多余水分,加入适量Mayer苏木素染液,染细胞核2min,弃去,双 蒸水充分晃洗4次。滴加ORO Buffer,2min,弃去。加入蒸馏水覆盖细胞并在显微镜下 观察。注意:ORO Stain最好现配现用。配制好后若有沉淀,要用滤过膜过滤掉。
1.4泡沫细胞模型中OPN表达的检测
将生长良好的RAW264.7细胞铺皿,每个共聚焦细胞培养皿中细胞约3×104个,完全 培养液培养,置于细胞培养箱中,待细胞贴壁4-5h后,加入含有1mL 50μg/mL oxLDL 及3%FBS的培养基,继续孵育24h。取出细胞培养皿,除去原培养液,PBS缓冲液充 分晃洗2-3次,弃掉PBS;4%多聚甲醛,1mL,固定15min,PBS缓冲液充分晃洗3 次,吸除PBS;各样品中加入含有0.3%Triton X-100的PBS溶液1mL,室温孵育15 min,裂解细胞膜,充分暴露细胞内蛋白。随后使用PBS充分晃洗2-3次,6min/次,弃 掉PBS;配制含有1%BSA的PBS溶液,将1mL1%BSA溶液加入每皿样品中,孵育30 min左右;用1%BSA溶液分别将OPN抗体和IgG抗体按照1:100比例稀释,每组样品 中加入相应的抗体稀释液400μl,4℃过夜孵育;约15h后弃掉OPN抗体和IgG抗体稀 释液,PBS充分晃洗3次,6-8min/次,弃掉残留的PBS缓冲液;将1%BSA溶液以 1:100比例稀释FITC标记的山羊抗兔二抗,每组样品中加入相应的抗体稀释液400μl, 室温状态下孵育60min,弃掉二抗稀释液,PBS充分晃洗3次,15min/次,弃掉PBS, 每皿加入即用型DAPI染液400μL染细胞核7-10min,随后PBS充分漂洗3次,全程避 光操作;所制得样品避光保存。尽快使用激光共聚焦显微镜观察。
1.5纳米粒子的细胞胞吞实验
1.5.1 RAW264.7细胞对纳米粒子的摄取及生物降解实验
选择对数期生长的RAW264.7细胞铺皿,每个共聚焦细胞培养皿中细胞约3×104个, 完全培养液培养,置于细胞培养箱中,待细胞贴壁4-5h后,弃掉培养基,将3mL含20 μg/mLAuNPs@SiO2OCP的DMEM溶液加入到每个皿中,继续在细胞培养箱中分别培养 1、2和3h后。使用PBS洗3次。随后使用4℃预冷的4%多聚甲醛固定液固定巨噬细 胞10分钟以上,再用DAPI染色7-10分钟。操作全程避光。尽快通过共聚焦显微镜对样 品进行上机的观察。
选取对数期生长的RAW264.7细胞,以1×106个/皿的数量传代至10cm细胞培养皿中,加入10mL不完全高糖培养基DMEM+10%FBS培养液,培养至细胞长满皿底,弃 掉培养液,加入10mL含有20μg/mL AuNPs@SiO2OCP不完全高糖培养基,分别细胞培 养箱37℃培养2h、3h、4h。取出培养皿,弃掉培养液,用PBS清洗3遍,用无菌吸 管轻柔吹打,至大部分细胞脱落,用移液器将细胞悬液转移到15mL无菌离心管中,离 心,1200rpm,5min,弃上清,用移液器加入1mL PBS重悬细胞。将细胞悬液移至1.5 mL EP管中。3000rpm,10min,弃上清,向EP管中加入透射电镜专用固定液至满,盖 紧盖子,固定24h。对固定好的细胞进行树脂包埋。修块:将样本从模块中取出,选择 合适的样本块,将其1/3暴露在样本固定器外,用拇指和食指固定刀片,借助手腕发 力,削树脂块最上层,用2-3个手指捏住固定器,左手支撑,右手放在底座上,不能将 手指悬在空中,用中指抵在样本固定器的壁上,小幅度修块,先平着修,再将样本周围 多余的树脂切掉,细胞块横断面大致呈方形。注意:本操作需多加练习,防止手指受 伤。超薄切片机切片。染色:铀染,将染色板用双蒸水清洗干净,60℃烘箱干燥,将铜网按顺序放在染色板上,注意正反面。取一个10cm培养皿。用镊子将钠石灰逐粒放入 皿中,终于位置空出,放置染色板,取常温状态下的铀液约0.2mL注入1.5mL尖底EP 管中,离心,10000rpm,2min,取出,轻轻打开盖子,用1mL注射器吸出,滴加在铜 网正面,锡纸避光,小太阳加热30min。漂洗:用镊子轻轻地夹住染色板边缘,分别在 3个装有双蒸水的烧杯中漂洗3次,每个烧杯内水量接近满杯,在每个烧杯中晃洗若干 次,大约持续2-3秒。取一张干净滤纸,撕成几片,用滤纸的毛边将铜网边缘的水吸 掉,在空气中静置1min。待铜网干燥,用镊子夹住染色板,培养皿半开盖放入染色板, 盖上盖子,2min。使二氧化碳和水分被充分吸收。铅染,将培养皿半开盖,用注射器将 柠檬酸铅液体小心地加到铜网正面,避光,加热10min,准备三个大烧杯,加入双蒸水 近满,用镊子夹住染色板,漂洗2-3秒,用滤纸毛边将水分吸干,将铜网用镊子取出, 按顺序放回培养皿中,准备透射电镜观察。
1.5.2泡沫细胞对纳米粒子的摄取及生物降解实验
选用经造模处理后的泡沫细胞,弃掉旧的培养基,PBS晃洗3次,弃掉PBS;将细 胞分为3组,即实验处理组、抗体抑制组和对照组。实验处理组加入1mL 200μg/mL AuNPs@SiO2OCP,抗体抑制组加10μl OPN抗体原液和1mL 200μg/mL AuNPs@SiO2OCP,对照组加入1mL200μg/mL AuNPs@SiO2-IgG Ab-Ce6-PFP,锡纸避光, 37℃,5%CO2孵育8h;吸除原培养液,使用PBS 2mL/次晃动漂洗3次,吸除残留的PBS 缓冲液;1mL 4%多聚甲醛溶液加入各样本,固定,10min,PBS晃洗3次,吸除残留的 PBS缓冲液;每皿加入即用型DAPI染液400μL染细胞核7-10min,随后PBS充分漂洗 3次,全程避光操作;所制得样品避光保存。尽快使用激光共聚焦显微镜观察。
选取对数期生长的RAW264.7细胞,以1×106个/皿传代至10cm细胞培养皿中,加入10mL不完全高糖培养基DMEM+10%FBS培养液,培养至细胞长满皿底,弃掉培养 液,PBS清洗2次,加入约10mL含有50μg/mL oxLDL及3%FBS的培养基,继续培养 24h,弃掉培养液,加入10mL含有200μg/mL AuNPs@SiO2OCP不完全高糖培养基,分 别细胞培养箱37℃培养2h、3h、4h。取出培养皿,弃掉培养液,用PBS清洗3遍,用 无菌吸管轻柔吹打,至大部分细胞脱落,将细胞悬液用移液器转移到15mL无菌离心管 中,1200rpm,5min,弃上清,用移液器加入1mLPBS重悬细胞。将细胞悬液移至1.5 mL EP管中。3000rpm,10min,弃上清,向EP管中加入透射电镜专用固定液至满,盖 紧盖子,固定24h。对固定好的细胞进行树脂包埋。修块:将样本从模块中取出,选择 合适的样本块,将其1/3暴露在样本固定器外,用拇指和食指固定刀片,借助手腕发 力,削树脂块最上层,用2-3个手指捏住固定器,左手支撑,右手放在底座上,不能将 手指悬在空中,用中指抵在样本固定器的壁上,小幅度修块,先平着修,再将样本周围多余的树脂切掉,细胞块横断面大致呈方形。注意:本操作需多加练习,防止手指受 伤。超薄切片机切片。染色:铀染,将染色板用双蒸水清洗干净,60℃烘箱干燥,将 铜网按顺序放在染色板上,注意正反面。取一个10cm培养皿。用镊子将钠石灰逐粒放 入皿中,终于位置空出,放置染色板,取常温状态下的铀液约0.2mL注入1.5mL尖底 EP管中,离心,10000rpm,2min,取出,轻轻打开盖子,用1mL注射器吸出,滴加在 铜网正面,锡纸避光,小太阳加热30min。漂洗:用镊子轻轻地夹住染色板边缘,分别 在3个装有双蒸水的烧杯中漂洗3次,每个烧杯内水量接近满杯,在每个烧杯中晃洗若干 次,大约持续2-3秒。取一张干净滤纸,撕成几片,用滤纸的毛边将铜网边缘的水吸 掉,在空气中静置1min。待铜网干燥,用镊子夹住染色板,培养皿半开盖放入染色板, 盖上盖子,2min。使二氧化碳和水分被充分吸收。铅染,将培养皿半开盖,用注射器将 柠檬酸铅液体小心地加到铜网正面,避光,加热10min,准备三个大烧杯,加入双蒸水 近满,用镊子夹住染色板,漂洗2-3秒,用滤纸毛边将水分吸干,将铜网用镊子取出, 按顺序放回培养皿中,准备透射电镜观察。
1.6细胞荧光成像
选用对数期生长的RAW264.7细胞悬液以2×104个/皿接种于共聚焦培养皿中,待细 胞贴壁4-6h后,弃掉培养液,PBS清洗2遍,弃掉PBS,加入1mL 4%多聚甲醛固定1h, 1%BSA封闭1h,分别用1mL,50μg/mL AuNPs@SiO2OCP、AuNPs@SiO2CP的DMEM 溶液过夜孵育,弃掉培养液,PBS清洗2遍,弃掉PBS,DAPI染色10min,PBS充分清 洗2遍,少许PBS铺底,尽快使用激光共聚焦显微镜上机观察。本操作全程避光。
选用对数期生长的RAW264.7细胞悬液以2×104个/皿接种于共聚焦培养皿中,待细 胞贴壁4-6h后,弃掉培养液,PBS清洗2遍,弃掉PBS,加入含有1mL 50μg/mL oxLDL 及3%FBS的培养基,继续培养24h,弃掉培养基,PBS清洗2遍,弃掉PBS,加入1mL, 4%多聚甲醛固定1h,1%BSA封闭1h,分别用1mL,50μg/mL AuNPs@SiO2OCP、 AuNPs@SiO2CP的DMEM溶液过夜孵育,弃掉培养液,PBS清洗2遍,弃掉PBS,DAPI 染色10min,PBS充分清洗2遍,少许PBS铺底,尽快使用激光共聚焦显微镜上机观察。 本操作全程避光。
1.7细胞内产气实验
取6cm无菌细胞培养皿,分别铺入生长良好的RAW264.7细胞,5×105个/皿,待细胞过夜贴壁后。置于25℃,10%CO2细胞培养箱中约1h,将旧的培养基弃掉,PBS清 洗2遍,弃掉PBS,加入5mL 20μg/mL AuNPs@SiO2OCP DMEM溶液,继续培养2-3h, 取出培养皿,弃掉旧的培养基,用4℃预冷的PBS充分晃洗3遍,弃掉PBS,少许PBS 铺底,将培养皿放在倒置显微镜下,同时用808激光器1W/cm2连续照射5min,并拍照, 记录细胞内产生的气泡量。
2、结果与分析
2.1 AuNPs@SiO2OCP纳米粒子的细胞毒性及血液相容性评估
如图10A所示,使用CCK-8评估不同浓度的纳米粒子分别对巨噬细胞(RAW264.7)及血管内皮细胞细胞活力的影响,两种细胞的细胞活力均在85%以上。图10B显示利用 活/死试剂盒分别对巨噬细胞及血管内皮细胞进行毒性实验,图中Calcein-AM通道显示 存活细胞,PI通道显示死亡细胞,图中可用看出当纳米粒子浓度为500μg/mL时巨噬细 胞及血管内皮细胞死亡细胞都很少。图10C显示不同浓度的纳米粒子的对小鼠的血液相 容性,分别以去离子水(阳性)和PBS(阴性)作为对照组。随着纳米粒子浓度的升高, 溶血率无明显增加,且均在5%范围内。图10D所示,流式细胞术显示,当纳米粒子浓度 达到500μg/mL时,存活细胞率(Q4)仍在90%以上。以上结果从不同角度表明, AuNPs@SiO2OCP复合纳米粒子的细胞毒性低,血液相容性良好。
2.2泡沫细胞模型的建造
如图11所示,左图为巨噬细胞,右图为经过oxLDL刺激后的泡沫细胞。
2.3巨噬细胞及泡沫细胞对纳米粒子的摄取、分解
如图12A所示巨噬细胞及泡沫细胞2h、3h、4h对纳米粒子的摄取,从图中可用看 出在2h时大量的纳米粒子被摄入,3h时纳米粒子已经被分解,严重变形,4h时纳米粒 子大部分被分解。
图12B显示通过激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞连续3h对纳米粒子的吞噬,荧光强 度及面积逐渐增大,表明纳米粒子被吞噬逐渐增多。图12C示泡沫细胞对含有OPN Ab 的纳米粒子摄取明显增多,抑制组在纳米粒子孵育前已经加入了OPN Ab,结果纳米粒子 的摄取明显减少。泡沫细胞对含有IgG抗体的纳米粒子的摄取也明显减少。图12D是泡 沫细胞摄取的荧光强度分析。
2.4泡沫细胞表达OPN Ab半定量分析
图13显示通过免疫荧光实验半定量地分析OPN在泡沫细胞中的表达,图13A显示使用一抗为OPN Ab的泡沫细胞荧光强度明显较其他组增加,对于非特异性抗体IgG Ab 的表达,泡沫细胞及巨噬细胞没有明显的差异。
2.5 AuNPs@SiO2OCP纳米粒子细胞荧光成像
图14显示纳米粒子对泡沫细胞及巨噬细胞的荧光成像,图14A显示AuNPs@SiO2OCP纳米粒子对泡沫细胞的荧光成像能力强,也从另一方面说明了纳米粒子具有明显的特异性靶向作用。
2.6 AuNPs@SiO2OCP纳米粒子细胞内产气
图15A显示在激光器照射前后的巨噬细胞气泡产生对比。照射5min后细胞内的气泡明显增多(红色箭头所示)。图15B示细胞内的气泡数量统计分析。
三、易损动脉粥样硬化斑块动物模型的建造及AuNPs@SiO2OCP的在体外成像 1、方法
1.1易损动脉粥样硬化小鼠模型的建立
8周龄ApoE-/-小鼠,4只/笼,均在学校动物中心饲养,第一周适应性喂养普通辐照饲 料,随后只用高脂饲料喂养20周,对照组继续普通辐照饲料喂养。
1.2小鼠动脉粥样硬化模型的鉴定
1.2.1小鼠的解剖
取经高脂饲料喂养20周左右的ApoE-/-小鼠,过量水合氯醛安乐死,将小鼠固定于解剖板上,仰卧位,剪开小鼠腹部正中皮肤,同时向上、下位置扩大解剖区域,钝性分离 下层筋膜至颈部。在显微镜下小心钝性分离并暴露颈部血管,暴露主动脉弓及各分支,清 除血管周围组织。摘除脏器,避免遮挡手术视野,游离并摘取主动脉及颈动脉组织(做冰 冻切片的组织需直接放入-80℃冷冻储藏)于生理盐水中轻柔漂洗3遍后,使用4%多聚 甲醛,固定血管24h。将血管组织送至学校病理学教研室进行石蜡包埋并切片。
1.2.2易损动脉粥样硬化斑块组织的油红染色
从-80℃冰箱中取出冰冻切片,室温静置约30min,干燥血管,固定约15min,自来水轻柔冲洗2遍,自然干燥。将切片放入油红工作液约9min。随后,将切片取出,停留 2s,将切片放入60%异丙醇中分化4s,取出,纯水清洗10s,随后75%乙醇分化3s,取 出,去离子水清洗60s,将切片放入苏木素染液中约4min,染细胞核,纯水冲洗20s, 使用分化液分化6s,纯水冲洗5s,氨水返蓝3s,纯水冲洗8s,使用滤纸毛边将水吸干, 甘油明胶融化后封片,显微镜下观察并拍照。
1.2.3易损动脉粥样硬化斑块组织的HE染色
将制备好的石蜡切片在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中分别脱蜡5min、10min;取出切片先后放入无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中,分别持续约2、2、 3、3、3min,取出切片,自然干燥后,纯水冲洗30s,利用滤纸毛边吸收切片中的残留 水分,使用苏木素染液,染核4min,纯水冲洗40s,氨水返蓝4s,纯水冲洗6s,自然 干燥,将切片先后浸入70%乙醇和90%乙醇中脱水,各持续10min;将切片取出放入伊 红工作液中染细胞质,约6min,纯水冲洗30s;自然干燥,将切片先后放入70%乙醇、 80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇Ⅰ中、无水乙醇Ⅱ中分别持续约30、30、120、120、120s 进行脱水,最后将切片分别放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各3-5min进行透明化处理;中性 树胶封片,显微镜下观察并拍照。
1.2.4易损动脉粥样硬化斑块组织的马松染色
将制备好的主动脉石蜡切片脱蜡,苏木素染液染细胞核约4min,纯水冲洗20s,分化液分化5s,氨水返蓝4s,室温状态下加入4滴马松品红溶液,保持4min,酸性溶液 清洗3遍,自然干燥,将切片浸入1%磷钼酸溶液中4min,取出切片,使用滤纸毛边将 残留溶液吸干,将切片浸入苯胺蓝染液染色4min,取出切片,酸性溶液冲洗3s;将切片 先后浸入95%乙醇中Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中, 各持续4min进行脱水及透明化处理,自然干燥,封片,显微镜下观察并拍照存图。
1.2.5易损动脉粥样硬化斑块组织的免疫组织化学染色
将81mL 0.1mol/L柠檬酸溶液加入到19mL 0.1mol/L柠檬酸三钠溶液中,混合均匀, pH调至6.0;此为抗原修复液,取适量抗原修复液,将切片脱蜡后浸入其中,煮沸25min,PBS冲洗5s;取1mL 0.3%Triton X-100溶液滴加在切片上,约15min,破坏细胞膜性结 构,PBS冲洗10s;取出切片,滤纸吸干多余水分,在切片上滴加500μl 10%正常山羊封 闭血清,室温状态下,孵育25min;弃掉封闭血清,使用滤纸吸干残留液体,将CD68、 α-SMA、OPN抗体稀释液分别滴加在对应的组织上,各400μl,将切片均放在湿盒中,4℃ 孵育约15h;弃掉抗体稀释液,PBS冲洗30s,各样本均滴加400μl HRP标记的山羊抗 兔稀释液,室温状态下孵育45min,PBS冲洗30s;向各样本中滴加适量DAB显色剂, 显微镜下监测,当切片上出现黄褐色沉淀后冲洗切片;苏木素染液染细胞核4min,使用 分化液分化5s,PBS冲洗30s;将切片分别浸入70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水 乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ中分别约30、30、120、120、120s中,进行脱水;将切片先后浸入 二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中,各4min进行透明化处理,自然干燥后,封片,尽快显微镜下观 察并拍照存图。
1.3活体荧光成像实验
选取体重相近的连续高脂饲料喂养20周的小鼠,颈胸腹部使用动物专用剃毛器,剪 去毛发,再使用棉签蘸取少量脱毛膏脱毛,温水擦拭去除脱毛膏。使用异氟烷气体将小鼠 麻醉后,仰卧于小动物活体荧光成像仪器内,进行荧光拍照,作为组内对照组;随后用酒精棉球消毒小鼠尾部,用胰岛素针予实验组注射浓度为200μg/mL AuNPs@SiO2OCP生理 盐水溶液100μL,对照组注射AuNPs@SiO2CP生理盐水溶液100μL,选取注射后1h,2 h,3h进行小鼠荧光成像,观察纳米粒子的荧光成像能力,同时选取荧光最强的组解剖, 对离体的主动脉及内脏组织进行荧光成像。
1.4活体光热成像实验
选取体重相近的连续高脂饲料喂养20周的小鼠,颈胸腹部使用动物专用剃毛器,剪 去毛发,再使用棉签蘸取少量脱毛膏脱毛,温水擦拭去除脱毛膏。利用红外热成像相机进 行红外热成像监测拍照。选取体重相近的模型鼠,并将小鼠分为二组:(1)实验组:尾静脉注射200μg/mL AuNPs@SiO2OCP生理盐水溶液100μL;(2)对照组:尾静脉注射200 μg/mLAuNPs@SiO2CP生理盐水溶液100μL;随后,使用808nm激光照射小鼠主动脉弓 部位,红外热成像相机监测并记录1~5分钟内小鼠主动脉弓部位的热成像图像。
1.5活体超声成像实验
选取体重相近的连续高脂饲料喂养20周的小鼠,颈胸腹部使用动物专用剃毛器,剪 去毛发,再使用棉签蘸取少量脱毛膏脱毛,温水擦拭去除脱毛膏。使用小动物超声仪进行 小鼠主动脉超声成像。选取体重相近的模型鼠,并将小鼠分为三组:(1)尾静脉注射200μg/mL AuNPs@SiO2OCP生理盐水溶液100μL(2)尾静脉注射200μg/mL AuNPs@SiO2CP 生理盐水溶液100μL(3)尾静脉注射200μg/mL AuNPs@SiO2OC生理盐水溶液100μL; 先对小鼠主动脉进行超声成像,注射纳米粒子生理盐水溶液后,使用功率为1.0W/cm2的 808nm激光照射小鼠主动脉弓部位5min,再次超声探查主动脉。
1.6在体生物安全性评估
为了更好地监测纳米平台的长期毒性,按照20mg/kg的剂量对C57小鼠尾静脉注射AuNPs@SiO2OCP悬液。分别于注射后第1天、第7天、第28天处死小鼠,每只小鼠 眼球取血约1mL装于EDTA钠抗凝管中,进行血常规及生化指标检测。测定肾功能 (BUN、CREA),肝功能(ALT、AST)心肌酶(LDH-L、CK)和其他血常规指标如WBC、 RBC、HGB、PLT水平以评估体内毒性。摘取小鼠主要脏器(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、 肾脏),用4%福尔马林溶液固定24h后进行组织学分析。分析前将固定好的切块标本彻 底清洗去除固定液,按酒精浓度由低至高的顺序脱水,随后二甲苯透明两次,石蜡进行包 埋。使用二甲苯脱去切片中的石蜡,依次浸入高浓度至低浓度的酒精,最后双蒸水浸洗, 随后进行染色,在显微镜下观察各内脏标本的组织学形态并存图。
2、结果与分析
2.1易损动脉粥样硬化斑块动物模型的鉴定
经过20周的高脂饲料喂养,如图16所示,动脉粥样硬化的模型成功建造。如图16A所示,C57BL/6J和C57BL/6J ApoE-/-小鼠的主动脉大体油红O染色,斑块组织被油红染 成红色,很明显的看出,ApoE-/-小鼠主动脉有很多斑块形成。图16B显示了C57BL/6J 和C57BL/6JApoE-/-小鼠的主动脉切片的HE、Masson、油红O染色,通过切片可以看 出,斑块内呈现出脂质多、细胞成分多、坏死组织多、胶原纤维少等易损动脉粥样硬化 斑块的特点,图16C分别对斑块组织做了不同成分的免疫组化,进一步证实了易损动脉 粥样硬化斑块的形成。可见斑块内富含巨噬细胞、血管平滑肌细胞、新生毛细血管及高 表达骨桥蛋白。图16D为斑块组织的免疫荧光成像,红色荧光代表巨噬细胞,绿色荧光 代表血管平滑肌细胞。以上实验充分的证明易损动脉粥样硬化斑块造模成功。
2.2小鼠活体荧光成像
将如图17A所示,将模型鼠分为两组,一组注射AuNPs@SiO2OCP生理盐水溶液, 另一组注射AuNPs@SiO2CP生理盐水溶液,分别对注射后0、1、2、3h进行活体成像, 可以发现,在2h时AuNPs@SiO2OCP组荧光强度最大。AuNPs@SiO2CP组荧光强度整体 都不高。图17B为对应的统计分析。图17C所示,选取注射纳米溶液2h的小鼠主动脉 及内脏进行荧光成像,可见AuNPs@SiO2OCP组血管荧光强度明显高于AuNPs@SiO2CP 组。图17D对应的统计分析。
2.3小鼠活体超声成像
图18A为不同处理组激光器照射前后的超声图像,AuNPs@SiO2OCP组相对于其他两组超声灰度值增加明显,灰度值越高在超声图像上显示越亮,超声成像效果越好。图 18B相应组超声灰度值进行统计,具体灰度值的结果如下表1所示。
表1不同灰度值统计结果
由图18和表1可知,对照组AuNPs@SiO2OC中未填充有PFP,对照组AuNPs@SiO2CP 中未接枝OPN Ab,这两个对照组在照射前后的灰度值变化不大,灰度值不高于55,在超 声图像上亮度偏低,超声成像效果不佳。而本发明提供的AuNPs@SiO2OCP在照射前灰 度值不佳,但是在照射后,灰度值均大于130,在超声图像上亮度高,超声成像效果越好, 取得了出人意料的超声效果。
2.4小鼠活体光热成像
图19A所示用激光器对不同处理组小鼠主动脉弓连续照射5min,并用热相仪器记录 温度变化。AuNPs@SiO2OCP组在5min时可以达50℃,AuNPs@SiO2CP组温度只有 35℃。图19B所示照射5min后主动脉弓处的3D光热图。图19C为连续照射5min温度 变化曲线。具体光热效果如表2所示。
表2光热效果数据
样品 | 0min | 1min | 2min | 3min | 4min | 5min |
AuNPs@SiO2OCP | 28 | 38 | 44 | 47.5 | 49 | 50℃ |
AuNPs@SiO2CP | 28 | 31 | 33 | 34 | 34.7 | 35℃ |
由图19和表2可知,AuNPs@SiO2CP中未接枝OPN Ab,在5min内温度由28℃增 加至35℃,而本发明提供的AuNPs@SiO2OCP在5min内温度由28℃增加至50℃,小鼠 主动脉温度升高的速度快,达到最高温度高,相对于AuNPs@SiO2CP在光热成像方面, 取得了出人意料的光热效果。
2.5 AuNPs@SiO2OCP纳米粒子生物安全性评估
图20A所示将纳米粒子注射健康C57BL/6J小鼠后,我们分别于第0天、第1天、 第7天、第28天分别采集实验鼠血液,每组各取3只,分析血常规、生化等指标。注射 AuNPs@SiO2OCP纳米颗粒后,这些指标在正常范围内略有上下波动,但仍旧在正常值 范围。采用用乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)来评估心肌有无损伤;谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶(AST)指标评估肝功能;用血尿素氮(BUN)、血肌酐(CREA) 指标来评估肾功能;以及其他指标红细胞(RBC)和白细胞(WBC)等评估生物安全性。 各项指标均在正常范围内,表明AuNPs@SiO2OCP具有良好的生物安全性。同时取小鼠 内脏进行HE染色,观察给药28天后内脏组织有无损伤,如图20B所示,组织病理结果 未见异常。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本 发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可能对前述各实施例所 记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换, 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (12)
1.一种具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子,其特征于,包括内腔中填充有全氟正戊烷的氨基改性的中空介孔二氧化硅微球,在所述氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的壳层内表面分散有多个链状金纳米颗粒,在所述氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的表面接枝有骨桥蛋白抗体,在所述骨桥蛋白抗体上和/或在所述氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的表面偶联有二氢卟吩e6;其中,该纳米粒子的粒径为255-300 nm;所述氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的粒径为220-265 nm;所述氨基改性的中空介孔二氧化硅微球中介孔的孔径为3~6 nm;所述氨基改性的中空介孔二氧化硅微球中壳层的厚度为15~25 nm。
2.根据权利要求1所述的具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子,其特征于,所述氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的粒径为250 nm;所述氨基改性的中空介孔二氧化硅微球中介孔的孔径为4 nm;所述氨基改性的中空介孔二氧化硅微球中壳层的厚度为20 nm。
3.权利要求1所述的具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子的制备方法,其特征于,它包括如下步骤:
(1)将CTAB、氢氧化钠与去离子水混合均匀后,在搅拌的过程中升温至70~90℃,向所得混合溶液中依次加入甲醛溶液、四氯金酸溶液、TEOS和乙醇进行搅拌反应,待反应完成后,再向所得反应液中加入TEOS、APTMS和乙醇继续进行氨基改性反应,离心、洗涤后,得到氨基改性的中空介孔二氧化硅微球AuNPs@SiO2-NH2;
(2)将步骤(1)中所得AuNPs@SiO2-NH2与SMCC混合均匀,进行活化氨基反应,得到活化后的AuNPs@SiO2-NH2;将骨桥蛋白抗体与DTT混合均匀,进行激活反应,得到激活后的骨桥蛋白抗体;将二氢卟吩e6、EDC和N,N-二甲苯甲酰胺混合均匀,在避光的条件下进行活化反应,得到活化后的二氢卟吩e6;
(3)将步骤(2)中活化后的AuNPs@SiO2-NH2与激活后的骨桥蛋白抗体充分混合,使得AuNPs@SiO2-NH2的表面接枝有骨桥蛋白抗体,得到AuNPs@SiO2O,继续向所得产物中加入步骤(2)中活化后的二氢卟吩e6,混合均匀进行偶联反应,使得骨桥蛋白抗体上和/或AuNPs@SiO2-NH2的表面偶联有二氢卟吩e6,离心、洗涤后,得到AuNPs@SiO2OC;
(4)在真空和避光的条件下,将全氟正戊烷填充至步骤(3)中所得AuNPs@SiO2OC的内腔中,得到纳米粒子AuNPs@SiO2OCP。
4.根据权利要求3所述的具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子的制备方法,其特征于,在步骤(1)中,所述氨基改性的中空介孔二氧化硅微球的粒径为250 nm;所述氨基改性的中空介孔二氧化硅微球中介孔的孔径为4 nm;所述氨基改性的中空介孔二氧化硅微球中壳层的厚度为20 nm。
5.根据权利要求3所述的具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子的制备方法,其特征于,在步骤(1)中,所述CTAB与甲醛的质量摩尔比为150~180:1 g/mol;所述CTAB与四氯金酸的质量摩尔比为480~520:1 g/mol;所述CTAB与第一次加入的TEOS的质量体积比为230~280:1 mg/mL;所述CTAB与第二次加入的TEOS的质量体积比为80~120:1 mg/mL;所述CTAB与APTMS的质量体积比为180~220:1 mg/mL。
6.根据权利要求5所述的具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子的制备方法,其特征于,在步骤(1)中,所述CTAB与甲醛的质量摩尔比为167:1 g/mol;所述CTAB与四氯金酸的质量摩尔比为500:1 g/mol;所述CTAB与第一次加入的TEOS的质量体积比为250:1 mg/mL;所述CTAB与第二次加入的TEOS的质量体积比为100:1 mg/mL;所述CTAB与APTMS的质量体积比为200:1 mg/mL。
7.根据权利要求3所述的具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子的制备方法,其特征于,在步骤(2)中,步骤(1)中所得AuNPs@SiO2-NH2与SMCC的质量比为1:0.1~0.5。
8.根据权利要求7所述的具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子的制备方法,其特征于,在步骤(2)中,步骤(1)中所得AuNPs@SiO2-NH2与SMCC的质量比为1:0.2。
9.根据权利要求3所述的具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子的制备方法,其特征于,在步骤(2)中,所述骨桥蛋白抗体与与SMCC的质量比为1:18~22;所述DTT与骨桥蛋白抗体的质量比为1:35~45;所述二氢卟吩e6与与SMCC的质量比为1:0.1~0.5;所述二氢卟吩e6与EDC的质量比为1:5~10。
10.根据权利要求9所述的具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子的制备方法,其特征于,在步骤(2)中,所述骨桥蛋白抗体与与SMCC的质量比为1:20;所述DTT与骨桥蛋白抗体的质量比为1:40;所述二氢卟吩e6与与SMCC的质量比为1:0.2;所述二氢卟吩e6与EDC的质量比为1:8。
11.权利要求1所述的具有靶向易损动脉粥样硬化斑块实现成像的纳米粒子在制备光热材料、荧光材料或超声造影材料中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用,其特征在于,所述纳米粒子在制备与诊断易损动脉粥样硬化斑块有关的光热材料、荧光材料或超声造影材料中的应用。
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