CN114209854A - 一种磁流体复合显影剂及其在骨内血管显像领域的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于骨内血管显像技术领域，具体涉及一种磁流体复合显影剂及其在活体骨内血管显像领域的应用。本发明所述磁流体复合显影剂，利用改性磁性微球的方法，使用外壳为负电荷的四氧化三铁微粒吸附离子型造影剂表面包覆形成磁流体复合结构，基于磁流体在磁场作用下有强顺磁性以及能在人体内实现定向移动、局部聚集的特性，在外界磁场作用下，所述显影剂可以在体内实现浓聚，不仅实现活体骨内血管显像，且可提高活体骨内血管的显影质量和效果。

Description

一种磁流体复合显影剂及其在骨内血管显像领域的应用
技术领域
本发明属于骨内血管显像技术领域，具体涉及一种磁流体复合显影剂及其在活体骨内血管显像领域的应用。
背景技术
每一块骨都是一个器官，而探究骨内血管的分布，是探究骨生长、疾病、损伤机制的基础，对于股骨头坏死评估、骨愈合评估、骨骺损伤评估、椎骨血供观察、骨肿瘤血供及传播径路、手术入路及方法、复杂骨科手术的失血预估及术前设计等几乎涵盖所有骨科学分支的发展，均有基础作用并具有积极的意义。目前，骨内血管的解剖方法及活体骨内血管成像技术仍属骨科难题及技术空白，是骨科基础及临床发展瓶颈之一。
对于活体的骨内血管显像研究，目前国内外仍属未解难题，相关文献及研究仍停留在对滋养孔的解剖及CT观察、对局部标本血管灌注后成像或切片成像后影像叠加、灌注后MICRO CT影像重建的成像研究等，对于具体活体人体病例缺乏价值。有学者采用荧光示踪剂或放射性示踪剂注入志愿者人体活体内进行骨内血管示踪，志愿者保持静止6-8小时进行连续追踪后期处理，也只能证明骨内血管的寻在，难以描述具体形态及分布，难以重复试验，并且不能作为常规方法。近年也有学者尝试使用亚毫米分辨率的稳态(SS)磁共振血管造影(MRA)检测活体股骨头内的小动脉，但效果不佳，虽然有时可以观察到骨内血管片段，但即使三维重建后也难以观察到骨内连续血管。事实上，我们使用目前文献报道方法及磁敏感成像方法，都没有实现活体人体骨内血管的理想成像。
目前，实现活体人体骨内血管成像的常规设备及方法主要包括MR/CT/CR/超声等，但是，无论是否强化，均难以针对骨内血管(尤其管径≤1mm)连续显像，无论静脉还是动脉小血管，这对于骨科疾病的分析、诊治是一个很大瓶颈。究其原因，主要考虑在于，之前对于骨内血管观察意义认识不足，以及，硬件、软件、试剂的客观限制。而具体表现则在于：超声难以穿透骨皮质；MR技术若需根据血流成像，空间分辨率低，并存在层间干扰；分序列薄层间隔扫描难以捕捉充盈期，即使可呈现片段，三维处理后难以有效显现连续血管，有实验使用极端7T尝试，结果无明显差异；CT技术则受限于骨内小血管造影剂单位浓度限制，以及难以捕捉骨内血流信号期，对软硬组织对比敏感，难以实现骨内血管与周围组织双能对比或减影，即使血管造影强化，效果依然不理想。
针对上述技术难题，申请人团队发现了一种以骨内血管为主体的新的骨科解剖学复合通道。以膝关节为例，股骨及胫骨、腓骨骨端，均存在骨端髁间孔道(内含血管)-连接关节腔的孔口-孔口滑膜的复合结构，儿童的这种复合结构还穿越了骨骺及骺板，我们将这样复合结构命名为LC复合通道(Lijianmin-Chengkun Complexes，已发表相关文章)。LC通道在人体内普遍存在，且位置相对固定，每条LC通道中均内容小血管。股骨及胫骨、腓骨的LC通道，内容小血管来自膝中动静脉分支，分别经股骨及胫骨髁间孔、腓骨近端血管孔进入骨端(如图1中a-c)；在膝关节周围侵袭性肿瘤中，股骨LC通道及胫骨LC通道均可参与肿瘤细胞的隐匿和诱导复发过程，也可作为通道介导肿瘤经“骨-LC通道-关节腔”于骨与关节腔间的双向传播，这些都已被我们证实。小儿胫骨及股骨LC通道均能打破骺板的完整连续性，且大体标本及病理图片均证实小儿骨肿瘤可经LC通道穿越骺板进行传播。这颠覆了既往对于关节软骨及骺板整体连续性及其可为肿瘤传播屏障的认识。骨端内的肿瘤，可使LC通道中的贯穿血管受累，并经LC通道累及骺板区域或进入骨骺甚至关节腔内(图1中d-e)。此外，我们认为骨骺、骺板及骨端的损伤、血液系统恶性肿瘤、炎症等均可能侵及LC通道，并由此影响骺生长板。这些前期研究验证了了骨内循环系统的客观存在及一部分临床意义。以此研究前期实验及结果为基础，我们将骨内血管研究推广至全身及各年龄段骨骼，正在进行活体骨内血管显像研究，揭示相关骨生长、疾病、损伤机制，对于骨创伤、骨病、骨关节等各临床骨科分支颇具意义。综上，骨内血管的解剖和成像是骨科基础研究的重要环节，对于临床有极为重要的意义。由于解剖与成像相辅相成，互为支持、相互促成，基于前期研究成果发现，若增强局部显影剂浓度，可以实现原来显影禁区的部位显影，比如骨内血管成像(图1中f)。但由于上述实验是在标本上进行的，加压时容易产生血管局部破裂造影剂外渗，若希望活体骨内血管成像，血管难以承受达到在标本上进行的造影剂局部显影浓度的推注压力。
为了解决上述问题，申请人利用在先解剖成果，使用各种比较先进的设备，进行了各种尝试，基本囊括了目前主流的可能性。主要包括：①活体血管造影DSA减影成像；②活体CT血管强化双能减影成像并三维重建；③MR磁敏感加权及亚毫米分辨率的稳态(SS)磁共振血管造影并三维重建；④标本MICRO CT非灌注骨内血管成像。但是，上述结果均不满意。具体而言，还是以膝关节为例，对于上述方法①，使用碘海醇造影剂，可以清晰看到腘动脉充盈，能看到膝中动脉及进入膝关节股骨远端及胫骨近端的骨外分支，但是进入骨内后血管就不再显像(图5中a)，考虑原因在于造影剂的安全浓度、压力及安全强度X射线被骨质屏蔽的限制。标本实现增加造影剂推注压力后骨内血管成像，使我们得到改变造影剂以增加活体浓度的启发。对于上述方法②，活体CT血管强化双能减影成像并三维重建，使用碘克沙醇造影剂，我们准确捕捉了下肢动脉期，三维重建后近乎完美的展现出了膝关节周围软组织内血管，刚进入骨内管径相对粗大的节段(直径1mm)亦可显像，而进入骨骼深部血管分支、细化后不再显像(图5中b)，而我们的解剖结果膝中动脉进入股骨远端及胫骨近端的主分支至少穿过整个骨骺区，近骺板区的血管肉眼仍清晰可见，试行减影去除骨质，结果是骨内血管同时被减掉，出现局部影像空缺。对于上述方法③，MR磁敏感加权及亚毫米分辨率的稳态(SS)磁共振血管造影并三维重建，我们使用Gd-DTPA血管强化剂，有文献称用这种方法显像了连续的股骨头内动脉，我们重复这个实验，结果基本同实验②，仅能显像刚进入骨内管径相对粗大的节段(直径1mm)，试行减影去除骨质，结果是骨内血管同时被减掉，出现局部影像空缺(图5中c-d)，这个结果并不能满足临床诊疗需求。对于上述方法④，标本MICRO CT非灌注骨内血管成像，我们使用新鲜人体标本膝关节进行MICRO CT扫描，并使用先进的图像处理软件Analyze 12software(骨与软组织影响分辨)后期处理，观察能否实现容纳膝中动脉分支的“股骨髁间孔”、“胫骨髁间隆突孔”骨性孔道及骨内外血管的非灌注显影，结果虽完美展现了这两组骨性孔道，仍未辨别内容血管(图5中e-f)。而对于活体MR/CT/CR/超声可能的骨内血管成像，我们认为最有可能的突破口是改进现有的CT增强造影剂，提高单位显影密度、并使造影剂可以短时间附着与血管壁使小血管显像，并通过观察骨内血管显像进行三维重建。
因此，开发一种可以在活体骨内血管内实现理想显像的显影剂体系具有积极的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种磁流体复合显影剂，所述显影剂可以在活体骨内血管中高浓度聚集进而实现理想的血管内显像；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述磁流体复合显影剂在活体骨内血管显像领域的应用。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种磁流体复合显影剂，包括离子型造影剂，以及，表面包覆的外壳为负电荷的四氧化三铁微粒。
具体的，所述造影剂包括泛影葡胺和/或泛影酸钠，泛影酸根携带正电荷。
具体的，所述四氧化三铁微粒包括外壳为氨基的四氧化三铁微粒。
优选的，所述磁流体复合显影剂的粒径为50-500nm，通常造影剂和四氧化三铁复合后的粒径在50-500nm，如果大于500nm，则强顺磁性突然变小，外界磁场带动它移动比较困难，而且粒径较大，本身在体内运输也可能出现问题。
本发明还公开了一种制备所述磁流体复合显影剂的方法，包括取所述造影剂和所述四氧化三铁微粒充分混匀的步骤。
具体的，所述造影剂和所述四氧化三铁微粒的质量比为2-4：1，优选为3：1。
具体的，所述造影剂的粒径为15-25nm，由于造影剂的粒径比较均匀，优选粒径为20nm。
具体的，所述四氧化三铁微粒的粒径为50-200nm，由于四氧化三铁不同的型号，粒径不同，在常见的产品中，用到人体上的时候，一般是100-200nm比较合适，粒径太小，容易排不出，出问题，而粒径太大，则有可能造成血管拥堵。
本发明还公开了所述磁流体复合显影剂在活体骨内血管显像领域的应用。
本发明还公开了所述磁流体复合显影剂用于制备活体骨内血管显影剂的用途。
20世纪70年代Freeman等第一个提出药物可在磁场下使用后，关于对磁性微球(磁流体)的研究，世界上已进行了30多年，大量的研究争相改造和修饰磁性纳米颗粒，使其能更好地作为载体应用。在医学上希望能使用10-500纳米级的四氧化三铁磁性微粒作为载体(外面包裹氨基羧基等外壳，结合带电荷的药物胶粒)，在外界磁场的作用下在病变部位浓聚，以此增加病变区域药物浓度，达到更好治疗效果。近几十年研究发现，纳米技术联合药物对退行性疾病，如肿瘤、糖尿病和心血管疾病等的预防以及治疗有着不容忽视的作用。超顺磁性纳米颗粒(superparam agnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)具有纳米级直径、良好的磁效应以及被各种材料修饰的性能而更适合用作药物载体。Fe3O4纳米粒子由于其优异的磁性、高比表面活性和生物相容性，在诸多领域尤其是医学领域有着广阔的应用前景，也引起人们的广泛关注。目前，针对SPIONs作为药物载体的主要研究内容为使其在外加磁场下能够与靶细胞有效反应，增加其在靶细胞的浓度，减缓其在体内的清除和其本身对体内环境的不良影响等。
本发明所述磁流体复合显影剂，利用改性磁性微球的方法，使用外壳为负电荷(氨基)的四氧化三铁微粒吸附离子型造影剂(泛影酸根携带正电荷)表面包覆形成磁流体复合结构，基于磁流体在磁场作用下有强顺磁性以及能在人体内实现定向移动、局部聚集的特性，在外界磁场作用下，所述显影剂可以在体内实现浓聚，不仅实现活体骨内血管显像，且可提高活体骨内血管的显影质量和效果。本发明所述磁流体复合显影剂，进一步通过调整所述四氧化三铁微粒和造影剂的复合比例，可适度中和电荷凝结成小的基团，进一步提高显影效率。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1中a为膝中动静脉及进入股骨远端及胫腓骨近端的分支；b为膝中动脉胫骨分支进入自胫骨髁间隆突孔入骨，连续穿越了髁间和骺板，颠覆了之前骺板闭合前无穿越血管的理论；c为资料图，R.SCAPINELLI采用膝关节标本灌注后矢状薄层切片、X线成像、影像叠加等后期处理方法，作出膝中动脉及进入股骨远端及胫骨近端的分支的示意图；d为胫骨干骺端骨肉瘤骺板突破；e为骨肉瘤骺板突破机制：LC通道；f为儿童膝关节标本，造影剂连接膝中动脉加压注射，清晰显示进入胫骨近端分支，并且分支穿越骺板，成像压力致血管局部破裂、造影剂在后方软组织外渗；
图2中a为资料图，四氧化三铁磁性微球及外壳修饰基团示意图；b为扫描电镜下分散液中的泛影葡胺粒子，规则球形，直径20±2nm；c为扫描电镜下分散液中的氨基四氧化三铁磁性纳米微球，规则簇球形，直径100±10nm；d为混合震荡后两种微粒有结团现象，视野中已难以发现游离的泛影葡胺粒子，考虑正负电荷中和吸附，合成新的复合结构；
图3中a为实验兔CT体位像，高亮长方形为钕磁铁；b为静脉注射磁影复合微粒后，薄层扫描重建，显示胫骨近端骨内血管影(箭头指示处)；c为HEX400，骨内血管内多见不规则褐色物质，为四氧化三铁磁性微球聚合体；d为亚铁氰化钾染色X400，骨内血管内多见不规则蓝色物质，为四氧化三铁磁性微球聚合体；
图4中a为志愿者静脉注射磁影复合微粒后，薄层扫描重建，显示腓骨近端骨内血管影(箭头指示处)，高亮长方形为钕磁铁；b为移除钕磁铁1分钟后同条件再次扫描腓骨近端血管影消失；c为解剖学基础研究，箭头指示处为腓骨近端血管孔；d为组织学研究基础，HEX200，腓骨近端血管孔道切片；
图5中a为活体血管造影DSA减影成像，骨科血管未能理想显示；b为活体CT血管强化双能减影成像并三维重建，骨内血管未能显像；c为MR磁敏感加权，骨内血管未能显像；d为MR磁敏感加权及亚毫米分辨率的稳态(SS)磁共振血管造影并三维重建，骨内血管未能理想显像，双侧股骨近端显示典型“黑骨”征；e为标本MICRO CT非灌注骨内血管成像，理想展示“股骨髁间孔”，未辨别内容血管；f为标本MICRO CT非灌注骨内血管成像，理想展示“胫骨髁间隆突孔”，未辨别内容血管。
具体实施方式
实施例1
在先研究分别用解剖、组织切片等方法，明确膝关节骨内血管的存在、分布，而在现有硬件软件及方法下，难以实现活体骨内血管显像。本实施例欲通过增强局部显影剂浓度的方式，实现原来显影禁区的部位显影，比如骨内血管成像。
本实施例原料选择泛影葡胺复方注射液(国药准字H37023984，20nm，20ml，每支含泛影酸钠32mg、泛影葡胺268mg，鲁南贝特制药有限公司)和氨基四氧化三铁磁性纳米微球分散液(100nm，10ml：50mg，天津倍思乐色谱技术开发中心)。
准备20℃泛影葡胺注射液10ml，含泛影酸钠16mg、泛影葡胺134mg；氨基四氧化三铁磁性纳米微球分散液10ml(1支)，含四氧化三铁磁性纳米微球50mg，为一例实验兔用量，将二者利用磁性微球方法充分混匀，得到所需磁流体复合显影剂。
在外界磁场作用下，所述磁流体复合显影剂可以达到体内显影剂的浓聚，利用此原理，本实施例分别进行了电镜实验、活体实验兔成像实验、实验兔组织图片证实、活体人体成像实验。
经扫描电镜实验结果显示，所述泛影葡胺的微粒直径约20纳米，氨基四氧化三铁微球的微粒直径约100纳米，且四氧化三铁微球的分布较疏散均匀。两种试剂经混合进而实现表面包覆，中和电荷凝结成小的基团，所述磁流体复合显影剂仍具备磁流体性能、强顺磁性。
经活体实验兔成像实验结果显示，捕捉到了理想的胫骨近端骨内血管成像。
经实验兔组织图片证实，有磁场一侧胫骨近端内血管明显可见四氧化三铁分布，无磁场一侧未见。
经活体人体成像实验结果显示，捕捉到了理想的腓骨近端骨内血管成像。
综上，本实施例所述磁流体复合显影剂通过磁影复合微粒(磁性微球+泛影葡胺)的复合，在外界磁场作用下，达到活体骨内显影剂浓聚，在CT扫描下可实现活体外径≥0.5㎜骨内血管成像。
实验例
研究对象
纳入标准：①SPF级新西兰兔，体重2.6±0.4k g，年龄9±0.5月；②外观健康，骨骼发育成熟正常，肾功能正常；③耳缘静脉清晰，便于静脉全麻；④基础实验研究。
排除标准：①麻醉过程死亡；②CT扫描钕磁铁产生的伪影影响观察区；③CT扫描过程中实验兔排泄小便致使显影剂弥散；④组织切片质量欠佳。
研究对象
依上述纳入及排除标准，自青岛康大生物科技有限公司购入实验兔20只。最终1例麻醉过程死亡、2例CT扫描钕磁铁产生的伪影影响观察区、1例CT扫描过程中实验兔排泄小便致使显影剂弥散、1例组织切片质量欠佳，共15例合格进入分析程序，其中公兔7例，母兔8例。
本研究中病例、实验器材、影像资料及人体标本来自与山东大学齐鲁医院及山东大学齐鲁医院青岛院区。本研究经山东大学医学院医学伦理委员会审查通过(批准编号：LL-2016-1-040)。
试剂
泛影葡胺注射液，国药准字H37023984，20ml：泛影酸钠32mg、泛影葡胺268mg，鲁南贝特制药有限公司；氨基四氧化三铁磁性纳米微球分散液，100nm，10ml：50mg，天津倍思乐色谱技术开发中心。
仪器
电子显微镜(日本电子，JEOL JEM-1200EXII扫描透射电子显微镜)；血管造影X射线机(德国西门子，Artis Zee floor)；X射线影像系统(德国西门子，ARCADIS Varic)；计算机X线断层扫描CT(德国西门子，Definition Flash)；MRI机(德国西门子，MagnetomVerio3.0T)；Micro CT(瑞士SCANCO Medical AG，vivaCT80)；生化分析仪(日本东芝，TBA-FX8)；钕磁铁(上海亘昌机电，N35表磁850Gauss，50×30×10mm及100×50×20mm)。
一、磁球-显影剂药物制备及扫描电镜实验
因电镜观察样品为液态，所以采用既有的液体封装的技术：将液体单独封装在一个密封空间内，使得液体与样品室进行物理的隔绝，以避免液体对样品室的污染。其原理都是利用超薄的氮化硅材质作封装的窗口，因为氮化硅相对于电子束是透明的，可以透过其观察封装在内的液体样品，并采取侧面封装的结构，待观测液体由侧面注入，并进行封装的模式。
如图2中a所示的四氧化三铁磁性微球及外壳修饰基团示意图，所述磁流体复合显影剂的制备步骤包括：①准备20℃泛影葡胺注射液，10ml：泛影酸钠16mg、泛影葡胺134mg；氨基四氧化三铁磁性纳米微球分散液，100nm，10ml：50mg×1支，为一例实验兔用量；②扫描电镜观察泛影葡胺注射液泛影葡胺粒子形态及大小；③扫描电镜观察氨基四氧化三铁磁性纳米微球分散液纳米微球形态及大小；④将泛影葡胺注射液10ml与氨基四氧化三铁磁性纳米微球分散液10ml混合，使用振荡器振荡频率200次/min持续5分钟，取少量扫描电镜观察形态结构，剩余药物备用。
本实验例使用扫描电镜观察到泛影葡胺粒子为规则球形，直径20±2nm，均匀分散与溶液中(图2中b)；使用扫描电镜观察到氨基四氧化三铁磁性纳米微球为规则簇球形，直径100±10nm，较疏散分散与溶液中(图2中c)；混合震荡后两种微粒有结团现象，视野中已难以发现游离的泛影葡胺粒子，考虑正负电荷中和吸附，合成新的复合结构，此文中且叫做磁影复合微粒(图2中d)。为了验证磁影复合微粒是否仍然具有超顺磁性，我们又使用小水泵等仪器构建了循环模型，得到肯定结论。
二、活体兔注射磁球-显影剂药物CT扫描
本实验例中，经在先解剖学研究发现了一种以骨内血管为主体的新的骨科解剖学复合通道。以膝关节为例：股骨及胫骨、腓骨骨端，均存在骨端髁间孔道(内含血管)-连接关节腔的孔口-孔口滑膜的复合结构，儿童的这种复合结构还穿越了骨骺及骺板，我们将这样复合结构命名为LC复合通道(Lijianmin-Chengkun Complexes，已发表相关文章)。LC通道在人体内普遍存在，位置固定，每条LC通道中均内容小血管，股骨及胫骨、腓骨的LC通道，内容小血管来自膝中动静脉分支，分别经股骨及胫骨髁间孔、胫骨近端滋养孔进入骨端。实验兔解剖得到相同结果。
实验步骤包括：①经兔耳缘静脉置留置针，注入3％戊巴比妥30mg全身麻醉，确保呼吸心跳正常；②捆绑带固定于硬纸板，拉伸外展单侧下肢，50×30×10mm大小钕磁铁放置于膝关节外侧约3cm(避免磁铁伪影)，远磁铁侧下肢自然外展；③行CT1mm薄层扫描，三维重建，骨窗观察膝关节；④经耳缘静脉置留置针注入步骤三③制备的磁球-显影剂药物(泛影葡胺+磁流体)，行CT薄层全身扫描；⑤其他实验兔重复上述步骤。所有影像资料由两名经验丰富的高年资医师采用盲法共同审阅，对影像累及部位及征象审阅不一致处，经两位医师协商达成一致，本实验涉及骨内显像血管与骨小梁的鉴别等。
经活体兔注射磁影复合微粒CT扫描结果，观察到膝中血管胫骨近端分支。注入磁影复合微粒前，15只合格纳入实验兔CT薄层扫描及三维重建均未见膝关节骨内血管显影。经耳缘静脉注射磁影复合微粒后，即刻在肝脏及泌尿系(肾脏、输尿管、膀胱)浓聚显影；15只实验兔CT薄层扫描及三维重建后均在冠状或矢状位显示清晰血管影，其中胫骨近端15例都观察到，股骨远端也观察到的6例(图3中a-b)。注射磁影复合微粒后血管显影率显著高于注射磁影复合微粒前(卡方检验，胫骨近端P＜0.001，股骨远端P＜0.01)。
三、实验兔膝关节骨组织切片
上述实验例完成后，实验兔下肢远近端捆扎止血带阻止血液流动，迅速处死(15只合格纳入实验兔，处死10只)、深低温冰箱冷冻(50℃)，24小时取出，冰冻状态切取膝关节(带腘动静脉)，10％福尔马林浸泡7天后，再使用EDTA脱钙液浸泡14天脱钙，隔日更换脱钙液。制作双侧(区分近磁场侧及远磁场侧)胫骨近端切片，行HE染色及亚铁氰化钾染色，400倍光镜观察骨内血管。组织切片诊断由两位资深病理医师进行，结果一致。
膝关节骨内血管切片证实磁影复合微粒存在。因处死实验兔时难以准确捕捉骨内血管的动静脉期等原因，本实验虽然采取了处死前止血带捆扎实验兔下肢远近端阻止血液流动、迅速深低温冰箱冷冻等措施，膝关节骨内血管充盈情况仍不十分理想。在处死的10只实验兔中，有8只在近磁场侧膝关节骨内血管切片中明确发现了磁影复合微粒，有2只未发现；在远磁场侧膝关节骨内血管切片中10只实验兔均未磁影复合微粒(图3中c-d)。近磁场侧磁影膝关节骨内血管切片中复合微粒检出率显著高于远磁场侧(卡方检验，P＜0.001)。
四、尿液粪便磁性微球排出测定
剩余5只合格纳入实验兔，麻醉苏醒后分笼饲养，正常喂食，收集48小时尿液、粪便，观察尿量、尿液颜色、有无沉淀等。粪便捣碎，与粪便混合。使用钕磁铁置入混合液收集磁性微球，塑料片刮取、蒸馏水冲洗、煮沸、沉淀、收集，将粉末溶于PBS缓冲溶液，取3ml置入生化分析仪定量分析，评价磁性微球排出情况。
数据包括15只实验兔注射磁影复合微粒前后血管显影率，10只实验兔膝关节骨内血管切片中胫骨近端在有磁场实验侧和无磁场对照侧磁影复合微粒(四氧化三铁物质)的检出率，以及实验前后实验兔的48小时尿量，应用SPSS21.0对数据进行统计分析。应用卡方检验比较实验兔注射磁影复合微粒前后血管显影率和磁影复合微粒(四氧化三铁物质)的检出率，应用t检验比较试验前后实验兔的48小时尿量，P＜0.05认为差异有统计学意义。
尿液磁性微球排出测定证实磁性微球大部分通过尿液排出。5只合格纳入存活实验兔麻醉苏醒后48小时尿量263±31ml，与实验前15只实验兔48小时尿量247±28ml无统计学差异(t检验，P＞0.05)。尿液为正常的淡黄色，静置后出现黑褐色粉末样及絮状沉淀。收集尿液及粪便，提取提纯再溶解，配制为100ml PBS缓冲溶液，3ml经生化分析仪测量换算铁元素含量，换算为四氧化三铁含量0.22±0.03mg，可能损耗等误差影响较大，只能得出结论磁性微球大部分由尿液粪便排出。
五、志愿者注射磁球-显影剂药物CT扫描观察尝试
在完成上述实验兔尿液磁性微球排出测定以及确保试剂无菌的前提下，发明人本人作为志愿者接受了磁球-显影剂药物注射并CT扫描观察。操作步骤基本同前(即活体兔注射磁球-显影剂药物CT扫描观察)，自手背部静脉注入，换用更大型号的N35表磁850Gauss100×50×20mm钕磁铁紧密贴附与膝关节外侧提供磁场。自药物完全注入开始计时，间隔30秒、1分钟、2分钟、5分钟重复膝关节薄层扫描；移除钕磁铁1分钟后同条件再次扫描。观察膝关节我们团队已标本解剖证实存在的骨内血管成像情况。
志愿者注射磁影复合微粒CT扫描观察到腓骨近端膝中血管分支。在发明人作为志愿者的实验中，清晰显像了腓骨近端膝中血管分支，自药物完全注入开始计时，间隔30秒、1分钟、2分钟、5分钟重复膝关节薄层扫描，得到的血管显像图像基本一致(图4中a)，说明此方法可以提供磁影复合微粒在血管内的持续附着，并不受血管动静脉期的影响。移除钕磁铁1分钟后同条件再次扫描血管影消失(图4中b)，这说明了在活体骨内血管中磁场对磁影复合微粒的聚集作用可逆。我们前面的解剖学研究已证实膝中动脉一支分支在腓骨上端胫腓关节面旁进入骨质，并且即使入口处成人此血管直径＜1mm(图4)此实验未观察到膝中血管进入股骨远端及胫骨近端骨内分支显影，考虑原因为恒定磁场的磁场强度与距离磁铁的距离关系极大，恒定磁场理论认为某一点的磁场强度与距离的立方成反比，在这个实验中就表现为股骨及胫骨内的血管距磁铁的距离已达不到得以留存磁影复合微粒并显影的磁场强度要求。
需要强调的是，在实验中发现一个有趣的现象：恒定磁场作用下磁影复合微粒在血管内持续显影，说明持续附着，并不受血管动静脉期的影响；而周围软组织内的血管显影与否仍与动静脉期基本同步。分析原因，结合骨内血管解剖基础，我们考虑到两个可能性：血流动力学与骨内血管构造特点。随着骨内血管的分支细化，我们发现两个特点：骨内血管比较牢固的贴附在骨内骨性通道壁上，不管是否充盈，内外径恒定，基本无收缩扩张变化；骨内细小血管往往只存在内皮细胞和上皮细胞，缺少平滑肌细胞。我们据此推测骨内血流动力来自骨外循环系统。这个发现可以很好地解释为什么患者休克时常规静脉因塌陷建立静脉通路失败时可行骨髓腔内注射。由此我们进一步推断，本实验中磁影复合微粒能在恒定磁场作用下在血管内持续附着的原因是骨内血管的解剖学特点导致的血流动力相对恒稳，这也对进一步研究磁性微球携带药物治疗骨肿瘤产生了新的启发。
综上所述，本申请从实验层面，证实了本申请方案的可行性：即通过改进磁性微球的方法，制成新的粒子-磁影复合微粒，通过动物实验或标本实验验证，在外界磁场作用下，达到体内显影剂浓聚，实现活体骨内血管显像，相信此技术能给骨科基础研究和临床带来广泛应用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种磁流体复合显影剂，其特征在于，包括离子型造影剂，以及，表面包覆的外壳为负电荷的四氧化三铁微粒。
2.根据权利要求1所述磁流体复合显影剂，其特征在于，所述造影剂包括泛影葡胺和/或泛影酸钠。
3.根据权利要求1或2所述磁流体复合显影剂，其特征在于，所述四氧化三铁微粒包括外壳为氨基的四氧化三铁微粒。
4.根据权利要求1-3任一项所述磁流体复合显影剂，其特征在于，所述磁流体复合显影剂的粒径为50-500nm。
5.一种制备权利要求1-4任一项所述磁流体复合显影剂的方法，其特征在于，包括取所述造影剂和所述四氧化三铁微粒充分混匀的步骤。
6.根据权利要求5所述磁流体复合显影剂的制备方法，其特征在于，所述造影剂和所述四氧化三铁微粒的质量比为2-4：1。
7.根据权利要求5或6所述磁流体复合显影剂的制备方法，其特征在于，所述造影剂的粒径为15-25nm。
8.根据权利要求5-7任一项所述磁流体复合显影剂的制备方法，其特征在于，所述四氧化三铁微粒的粒径为50-200nm。
9.权利要求1-4任一项所述磁流体复合显影剂在活体骨内血管显像领域的应用。
10.权利要求1-4任一项所述磁流体复合显影剂用于制备活体骨内血管显影剂的用途。
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薛思涵: "碘剂/四氧化三铁纳米CT/MRI双模态造影剂的制备及表征", 《硕士电子期刊》 *

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