JP6681396B2 - Ｃｄ３ｘｃｄ２０二特異性抗体を用いて腫瘍を治療する方法 - Google Patents

Ｃｄ３ｘｃｄ２０二特異性抗体を用いて腫瘍を治療する方法 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
本願は、２０１４年１１月１７日出願の米国特許仮出願第６２／０８０，７１６号、及び２０１５年５月１３日出願の同第６２／１６０，７８８号の優先権を主張し、これらの内容を参照により本明細書に援用する。
配列表
本願は、１０１６２ＷＯ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ（８３，３９２バイト）というファイル名で２０１４年６月３日に作成された、コンピューター読取可能形式で提出する配列表を、参照により援用する。
本発明は、ＣＤ２０及びＣＤ３抗原を標的とする二特異性抗体、及び殺腫瘍方法に関する。本発明はまた、腫瘍治療の抗体療法に関連するＦｃ結合により生じ得るエフェクター機能を減じ及び／または制御する方法にも関する。
ＣＤ２０結合アーム及びＣＤ３結合アームを有する二特異性抗体は、抗腫瘍活性を増強させるのに必要なクロストークを提供し得る。そのような二特異性抗体の第３のモダリティーが、Ｆｃドメインである。Ｆｃ結合特性の修飾は、治療用抗体の抗腫瘍能力を強化することがわかっている。
免疫グロブリンのＦｃドメインがその受容体に結合すると、結合された抗原の部位にエフェクター細胞が集まり、様々なシグナル伝達及び免疫応答が生じることになる。これらの様々な「ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ（エフェクター機能）」、たとえばＣＤＣやＡＤＣＣなどは、Ｇクラスの免疫グロブリン（ＩｇＧ）が、該ＩｇＧのＦａｂドメインと標的抗原とで複合体を形成する結果であるが、該ＩｇＧのＦｃドメインは、エフェクター細胞のＦｃ受容体に結合する。ＩｇＧのエフェクター機能の一部は抗原結合から独立しており、循環血清中レベルなどの諸機能やバリアを越えてＩｇを輸送する能力を体現している。その他のエフェクター機能は、癌治療などの免疫グロブリン療法に利用される非常に重要なものとされている。特にＡＤＣＣ機構は治療用抗体の主要な抗腫瘍機構のひとつに数えられ、ラスツズマブ（ｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（転移性乳癌）やリツキシマブ（非ホジキンリンパ腫）などが既に販売されている。
今日の治療ストラテジーは一般に、抗原の生物活性を中和または阻害することを目的とする抗体（たとえば抗体ブロッカーまたはアンタゴニスト）、あるいは下流での細胞性シグナル伝達を活性化または開始することを目的とする抗体（たとえば抗体アゴニスト）にとって、抗体のＦｃドメインの修飾によりエフェクター機能を低減（またはＦｃガンマ受容体結合性を低減）することが有用であり得る、と提唱している。
しかし、エフェクター機能が低下した腫瘍標的抗体の設計は、腫瘍治療では反直感的なものである。というのは、標的細胞の細胞傷害性（すなわちＡＤＣＣ及びＣＤＣ）の低下は疾患治療、つまり腫瘍細胞の破壊または腫瘍増殖の阻害に有効ではないと考えられているからである。
本明細書で説明する一ストラテジーでは、二特異性抗原結合と組み合わせたＦｃ受容体の差別的な結合により、腫瘍マーカーを特異的に標的とし、かつＴ細胞による腫瘍特異的な殺滅を誘発する。抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体との結合を注意深く制御して、Ｆｃ受容体を有するＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージといった細胞の望ましくない殺滅を排するかまたは減じるように、設計される。ＦｃγＲＩＩ受容体との結合相互作用はあるがＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩＩとの相互作用のない、Ｆｃ受容体相互作用に関するユニークな結合パターンは、ＣＤ３とＣＤ２０の両方と結合する二特異性抗体という文脈で、腫瘍標的Ｉｇ療法において驚くほど有用である。しかし、サイトカインの過剰放出や患者に対する毒性をもたらすことなく、免疫系を刺激して腫瘍を消失させるのに有効な、より優れた治療剤を見出す必要性は尚も存在している。
現在、ＢｉＴＥ（登録商標）（二特異性Ｔ細胞エンゲージャー）抗体などの二特異性治療は、微小量だが頻回に投与されている。ＣＤ２０＋ Ｂ細胞悪性腫瘍の患者、特に初回治療後に再発または進行している患者にとって耐容可能な投与計画を有するさらなる治療オプションが医学的に必要とされている。
第１の態様では、本発明は、ヒトＣＤ３及びＣＤ２０に結合する改変されたＦｃ結合ドメインを有し、天然の免疫系のレパートリーには見られない特定のエフェクター機能を有するようにさらに操作された、二特異性抗体を提供する。本発明のこの態様による抗体は、ＣＤ３が媒介するＴ細胞の活性化を抗ＣＤ２０腫瘍細胞などの特定の細胞種に向ける二特異性抗体の一部として、たとえばＴ細胞が媒介する殺滅が有用または望ましい状況で、ＣＤ３を発現しているＴ細胞を標的とすること及びＴ細胞の活性を刺激することについて特に有用である。本発明の抗体は、用量漸増プロトコルで投与して、免疫系の刺激、すなわちＴ細胞を活性化する有効性を高める一方で、たとえばサイトカイン急増などの毒性作用を最小限化する。
別の態様では、本発明は、対象におけるＢ細胞癌の治療または寛解のための二特異性抗体の使用、または治療方法を提供し、第１の用量の抗体を第１の期間投与すること、及び引き続いて第２の用量の該抗体を第２の期間投与することを含み、該第２の用量は該第１の用量を上回り、該二特異性抗体にはヒトＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、ヒトＣＤ２０に結合する第２の抗原結合ドメイン、及び第１と第２の抗原結合ドメインそれぞれに連結されたキメラＦｃドメインが含まれ、癌治療または寛解には、（ａ）対象における腫瘍増殖の抑制、（ｂ）対象におけるＢ細胞溶解の媒介、（ｃ）対象におけるＢ細胞癌の治療、（ｄ）対象におけるＣＤ２０発現が陽性である癌の治療、または（ｅ）対象におけるＣＤ２０を発現している黒色腫癌の治療が含まれる。
別の態様では、本発明は、対象における腫瘍負荷または癌の治療または寛解のための二特異性抗体の使用、または治療方法を提供し、第１の用量の抗体を第１の期間投与すること、及び引き続いて第２の用量の該抗体を第２の期間投与することを含み、該第２の用量は該第１の用量を上回り、該二特異性抗体にはヒトＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、ヒト腫瘍標的抗原または腫瘍特異的抗原に結合する第２の抗原結合ドメイン、及び第１と第２の抗原結合ドメインそれぞれに連結されたキメラＦｃドメインが含まれ、腫瘍負荷または癌の治療または寛解には、（ａ）対象における腫瘍増殖の抑制、（ｂ）対象における腫瘍細胞溶解の媒介、（ｃ）対象における腫瘍標的抗原または腫瘍特異的抗原の発現が陽性である癌の治療、または（ｄ）対象における腫瘍標的抗原を発現している癌または腫瘍特異的抗原を発現している腫瘍の治療が含まれる。
本発明の例示的な抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体を本明細書の表１〜表８に挙げる。表１は、例示的二特異性抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、ならびに重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、及び軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を示す。表２は、例示的二特異性抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３をコードする核酸分子の配列識別子を示す。表３は、ＨＣＶＲと重鎖定常領域（ＣＨ）とＬＣＶＲの組合せを含む、例示的二特異性抗体のアミノ酸配列識別子の組合せを示す。表４は、例示的二特異性抗体のＨＣＶＲと重鎖定常領域（ＣＨ）とＬＣＶＲの組合せをコードする核酸分子の組合せの核酸配列識別子を示す。
表５は、本発明の重鎖の例のアミノ酸配列識別子を説明しており、二特異性抗体は、本発明のＣＨと対をなす、表５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲを含んでいる。表６は、本発明の軽鎖例のアミノ酸配列識別子を別途説明するものであり、二特異性抗体は、表６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲを含んでいる。
本発明は、表１に挙げたＨＣＶＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むＨＣＶＲを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明は、表１に挙げたＬＣＶＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むＬＣＶＲを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明は、表２に挙げる例示的抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体中に含まれるアミノ酸配列対を含むＨＣＶＲとＬＣＶＲのアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２／１０からなる群より選択される（たとえば抗体１と抗体２）。
本発明は、表１に挙げたＨＣＤＲ１アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明は、表１に挙げたＨＣＤＲ２アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明は、表１に挙げたＨＣＤＲ３アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明は、表１に挙げたＬＣＤＲ１アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明は、表１に挙げたＬＣＤＲ２アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明は、表１に挙げたＬＣＤＲ３アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明は、配列番号８／１６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対などの、表１に挙げたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと対をなす表１に挙げたＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３のアミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する（たとえば抗体１または抗体２）。
本発明は、表１に含まれる６つのＣＤＲのセット（すなわちＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある実施形態では、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号４−６−８−２０−２２−２４であるか、または１２−１４−１６−２０−２２−２４である（たとえば抗体１または抗体２）。
ある関連実施形態では、本発明は、表１に挙げる例示的抗体として定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対中に含まれる６つのＣＤＲのセット（すなわちＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。たとえば、本発明には、配列番号２／１８からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対中に含まれるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む抗体またはその抗原結合フラグメントが含まれる（たとえば抗体１または抗体２）。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列中のＣＤＲを特定する方法及び技法は当技術分野では周知であり、本明細書で説明する特定のＨＣＶＲ及び／またはＬＣＶＲアミノ酸配列中のＣＤＲを特定するのに用いることができる。ＣＤＲの境界を特定するのに用いることができる例示的規約（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）としては、たとえばＫａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、及びＡｂＭの定義が挙げられる。一般に、Ｋａｂａｔの定義は、配列多様性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の場所に基づき、ＡｂＭの定義はＫａｂａｔ法とＣｈｏｔｈｉａ法の折衷である。たとえばＫａｂａｔ， "Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，" Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１）； Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７３：９２７−９４８ （１９９７）；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：９２６８−９２７２ （１９８９）を参照されたい。公開されているデータベースを利用して抗体中のＣＤＲ配列を特定することもできる。
本発明は、抗体またはその一部をコードする核酸分子も提供し、たとえば、本発明は、表１に挙げたＨＣＶＲまたはＬＣＶＲアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。ある実施形態では、核酸分子は、表２に挙げたＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
本発明は、表１に挙げたＨＣＤＲ１またはＨＣＤＲ２またはＨＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸分子も提供する。ある実施形態では、核酸分子は、表２に挙げたＨＣＤＲ１またはＨＣＤＲ２またはＨＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されたポリヌクレオチド配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
本発明は、表１に挙げたＬＣＤＲ１またはＬＣＤＲ２またはＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。ある実施形態では、核酸分子は、表２に挙げたＬＣＤＲ１またはＬＣＤＲ２またはＬＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
本発明は、ＨＣＶＲをコードする核酸分子も提供し、ここでＨＣＶＲは３つのＣＤＲのセット（すなわちＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）を含み、該ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に挙げた例示的抗ＣＤ３抗体の定義のとおりである。
本発明は、ＬＣＶＲをコードする核酸分子も提供し、ここでＬＣＶＲは３つのＣＤＲのセット（すなわちＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含み、該ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に挙げた例示的抗ＣＤ３抗体の定義のとおりである。
本発明は、ＨＣＶＲとＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子も提供し、ここでＨＣＶＲは、表１に挙げたＨＣＶＲアミノ酸配列のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、表１に挙げたＬＣＶＲアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、核酸分子は、表２に挙げたいずれかのＨＣＶＲ核酸配列より選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、及び表２に挙げたＬＣＶＲ核酸配列より選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、本発明のこの態様によると、核酸分子はＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードし、ここでＨＣＶＲとＬＣＶＲはどちらも表１に挙げた同じ抗ＣＤ３抗体に由来する。
本発明は、表２に挙げたＣＨアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む重鎖定常領域（ＣＨ）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明は、表２に挙げたＣＨ核酸配列より選択される核酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる重鎖定常領域（ＣＨ）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
本発明は、抗ＣＤ３抗体の重鎖または軽鎖可変領域及び抗ＣＤ２０抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターも提供する。たとえば、本発明は、上述の任意の核酸分子、すなわち表１と表２に示すＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ及び／またはＣＤＲ配列及び／またはＣＨ配列のいずれかをコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターを含む。また、本発明の範囲には、そのようなベクターが導入されている宿主細胞、ならびに、抗体または抗体フラグメントの生産が可能な条件下で宿主細胞を培養し、そうして生産された抗体または抗体フラグメントを回収することによる、抗体またはその一部を生産する方法も含まれる。
別の態様では、本発明は、治療有効量のＣＤ３及びＣＤ２０に特異的に結合する組換えヒト抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体は、キメラＦｃドメイン及び医薬的に許容される担体を含む。関連の態様では、本発明は、抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体と第２の治療剤の併用剤である組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体との併用が有益である任意の剤である。抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体との併用が有益であり得る例示的剤としては、限定ではないが、ＣＤ３に結合する及び／またはＣＤ３シグナル伝達を活性化する別剤（別の抗体またはその抗原結合フラグメントなども含む）、及び／または、直接ＣＤ３に結合するわけではないが、免疫細胞を活性化または刺激する、あるいは殺腫瘍を強化する別剤が挙げられる。本発明の抗ＣＤ３抗体に関するさらなる併用剤及び合剤については本明細書の別の箇所で開示する。
別の態様では、本発明は、ＣＤ３及び標的抗原に結合する二特異性抗原結合分子を提供し、該分子は、エフェクター機能が低下したキメラＦｃドメインを含む。ある実施形態では、該分子は、本明細書で説明するキメラＦｃドメインを含む。ある例示的実施形態によると、二特異性抗原結合分子は、ＣＤ３及びＣＤ２０に結合し、そのような二特異性抗原結合分子は、本明細書では「ａｎｔｉ−ＣＤ３／ａｎｔｉ−ＣＤ２０ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子）」とも呼ばれる。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子の抗ＣＤ２０部分は、ＣＤ２０を発現している腫瘍細胞（たとえばＢ細胞腫瘍）を標的とするのに有用であり、該二特異性分子の抗ＣＤ３部分は、Ｔ細胞の活性化に有用である。腫瘍細胞のＣＤ２０とＴ細胞のＣＤ３への同時結合は、キメラＦｃドメインに結合するエフェクター細胞により促進される、活性化Ｔ細胞による標的腫瘍細胞に特化した殺細胞（細胞溶解）を媒介する。本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子はしたがって、ＣＤ２０を発現している腫瘍（たとえばリンパ腫及び黒色腫腫瘍）に関するかまたはそれを原因とする疾患及び障害を治療するのにとりわけ有用である。
本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子は、さらに、ＣＤ２０陽性腫瘍を退縮させる方法を提供する。したがって、本発明は、対象におけるＢ細胞癌を治療する方法を提供し、該方法は、治療量の本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子を投与することを含み、該量は対象の腫瘍負荷を減じ、腫瘍を退縮させ、または腫瘍形成を減じるのに十分である。
本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子は、さらに、ＣＤ２０陽性黒色腫を抑制または退縮させる方法を提供する。したがって、本発明は、対象における黒色腫を治療する方法を提供し、該方法は、治療量の本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子を投与することを含み、該量は、対象の腫瘍増殖を阻害し、腫瘍負荷を減じ、または腫瘍形成を減じるのに十分である。
本発明のこの態様による二特異性抗原結合分子は、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、ＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン、及びキメラＦｃドメインを含んでいる。本発明は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子（たとえば二特異性抗体）を含み、各抗原結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と対をなす重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。本発明のある例示的実施形態では、抗ＣＤ３抗原結合ドメインと抗ＣＤ２０抗原結合ドメインは、共通のＬＣＶＲと対をなす別々の異なるＨＣＶＲを、それぞれ含む。たとえば、本明細書の実施例２で説明するように、二特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン（第１の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ３抗体由来のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む）、及びＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン（第２の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ３抗体由来のＬＣＶＲと対をなす抗ＣＤ２０抗体由来のＨＣＶＲ、たとえば抗ＣＤ３抗原結合ドメインに含まれるのと同じＬＣＶＲを含む）を含んで構成された。換言すると、本明細書で開示する例示的分子において、抗ＣＤ２０抗体のＨＣＶＲと抗ＣＤ３抗体のＬＣＶＲの対合により、ＣＤ２０に特異的に結合する（がＣＤ３には結合しない）抗原結合ドメインができる。そのような実施形態では、第１と第２の抗原結合ドメインは異なる抗ＣＤ３ ＨＣＶＲと抗ＣＤ２０ ＨＣＶＲを含むが、同じ抗ＣＤ３ ＬＣＶＲを共有している。
本発明は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子を提供し、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、表１または表２に示すＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含んでいる。ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインはまた、表１または表２に示すＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含み得る。ある実施形態によると、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、表１または表２に示すＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対のいずれかを含んでいる。本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、表１または表２に示す重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、及び／または表１または表２に示す軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子も提供する。
ある実施形態によると、本発明は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子を提供し、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１０を含むアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有する。
本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号１８を含むアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子も提供する。
本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号１０／１８からなる群より選択されるＨＣＶＲとＬＣＶＲのアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子も提供する。
本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号１６を含むアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；及び配列番号２４を含むアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを有する、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子も提供する。
ある実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１６／２４を含むＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含んでいる。
本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２を含むアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン；配列番号１４を含むアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号２０を含むアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン；及び配列番号２２を含むアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメインを含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子も提供する。
本発明のある非限定的な例示的抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子は、配列番号１２−１４−１６−２０−２２−２４からなる群より選択されるアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインを含んでいる。
本発明は、ＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号２を含むアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子も提供する。
本発明は、ＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号１８を含むアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子も提供する。本発明は、ＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号７５を含むアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子も提供する。
本発明は、ＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号２／１８、または配列番号２／７５を含むＨＣＶＲとＬＣＶＲのアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子も提供する。
本発明は、ＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；及び配列番号２４を含むアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性分子も提供する。
ある実施形態では、ＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号８／２４を含むＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
本発明は、ＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン；配列番号６のアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号２０のアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン；及び配列番号２２のアミノ酸配列、またはそれとほぼ同様の、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメインを含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子も提供する。
本発明のある非限定的な例示的抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子は、配列番号４−６−８−２０−２２−２４からなる群より選択されるアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、ＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含んでいる（たとえば抗体１または抗体２）。
ある関連実施形態では、本発明は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子を含み、ＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２／１８の重鎖及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列中に含まれる重鎖及び軽鎖ＣＤＲドメインを含んでいる。
別の態様では、本発明は、本明細書で開示する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、該核酸分子としては、本明細書の表２、７及び８に示すポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、ならびに本明細書の表２、７及び８に示すポリヌクレオチド配列を任意の機能的組合せまたは配置で２つ含む核酸分子が挙げられる。本発明の核酸を担持する組換え発現ベクター、及びそのようなベクターが導入されている宿主細胞、ならびに抗体の生産が可能な条件下で宿主細胞を培養し、生産された抗体を回収することによる、抗体を生産する方法も、本発明に含まれる。
本発明は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子を含み、ここでＣＤ３に特異的に結合する上述の抗原結合ドメインのいずれかが、ＣＤ２０に特異的に結合する上述の抗原結合ドメインのいずれかと組み合わされ、接続され、または別途連結されて、ＣＤ３及びＣＤ２０に結合する二特異性抗原結合分子を形成している。
別の態様では、本発明は、ヒトＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、ヒトＣＤ２０に結合する第２の抗原結合ドメイン、及び第１と第２の抗原結合ドメインそれぞれに連結されたキメラＦｃドメインを含む二特異性抗体を提供する。関連の態様では、二特異性抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ及びヒトＦｃγＲＩＩＢに特異的に結合できる。本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ及びヒトＦｃγＲＩＩＢに選択的に結合するが、ヒトＦｃγＲＩまたはヒトＦｃγＲＩＩＩに対する親和力はほとんどまたはまったく示さない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子を提供する。本発明の二特異性抗体は、インビトロアッセイで測定すると、ヒトＦｃγＲＩまたはヒトＦｃγＲＩＩＩに結合する抗体と比べて高い親和力で、ヒトＦｃγＲＩＩＡ及びヒトＦｃγＲＩＩＢに特異的に結合できる。いくつかの実施形態では、抗体は、インビトロアッセイで測定すると、ヒトＦｃγＲＩＩＡとヒトＦｃγＲＩＩＢの両方に特異的に結合し、ヒトＦｃγＲＩとヒトＦｃγＲＩＩＩそれぞれに対し１μＭ未満のＫD結合親和力を示す。
他の態様では、本発明は、キメラＦｃドメインをそれぞれ含む第１及び第２の重鎖ポリペプチドを含む二特異性抗体を提供し、ここで第１の重鎖ポリペプチドは、ヒトＣＤ３に結合する抗原結合ドメインを含み、第２の重鎖ポリペプチドは、ヒトＣＤ２０に結合する第２の抗原結合ドメインを含んでいる。
他の実施形態では、抗体は、インビトロアッセイで測定すると、ヒトＦｃγＲＩＩＡに対して、ヒトＦｃγＲＩＩＢとの結合よりも高い結合親和力を示す。さらに他の実施形態では、抗体は、インビトロアッセイで測定すると、ヒトＦｃγＲＩＩＡに結合し、ヒトＦｃγＲＩＩＢとの結合よりも低いＫD値を示す。いくつかの実施形態では、抗体は、インビトロアッセイで測定すると、２５℃でヒトＦｃγＲＩＩＡに結合し、１０〜３０μＭのＫD値を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、インビトロアッセイで測定すると、２５℃でヒトＦｃγＲＩＩＢに結合し、１００〜２５０μＭのＫD値を有する。
別の実施形態では、抗体は、インビトロアッセイで測定すると、ヒトＦｃγＲＩに対してほとんどまたはまったく検出できない結合親和力を示す。いくつかの実施形態では、抗体は、インビトロアッセイで測定すると、ヒトＦｃγＲＩＩＩに対してほとんどまたはまったく検出できない結合親和力を示す。
いくつかの実施形態では、インビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴アッセイである。
いくつかの実施形態では、抗体は、インビトロ細胞傷害アッセイで測定すると、野生型Ｆｃドメインを含む抗体と比べて低い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。
いくつかの実施形態では、抗体は、無視できるまたは検出不能な抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。
いくつかの実施形態では、抗体は、インビトロ細胞傷害アッセイで測定すると、野生型Ｆｃドメインを含む抗体と比べて低い補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す。
いくつかの実施形態では、抗体は、全細胞集団の５０％未満の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す。
いくつかの実施形態では、抗体は、無視できるまたは検出不能な補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型Ｆｃドメインを含む抗体と比べて、ＮＫ細胞やマクロファージなどのＦｃ受容体を有する細胞の殺滅の低下を示す。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型Ｆｃドメインを含む抗体と比べて、Ｆｃ受容体を有するＴ細胞の、ＮＫ細胞やマクロファージによる殺滅の低下を示す。
いくつかの実施形態では、抗体は、インビトロアッセイで測定すると、ヒトＦｃγＲＩＩＡとのＫD結合親和力はヒトＦｃγＲＩＩＢとのＫD結合親和力よりも高く、ヒトＦｃγＲＩＩＢとのＫD結合親和力はヒトＦｃγＲＩとのＫD結合親和力よりも高く、ヒトＦｃγＲＩとのＫD結合親和力はヒトＦｃγＲＩＩＩとのＫD結合親和力よりも高いかまたはそれと等しいことを示す。他の実施形態では、インビトロアッセイで測定すると、抗体のＫD結合親和力は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ＞ヒトＦｃγＲＩＩＢ＞ヒトＦｃγＲＩ＞ヒトＦｃγＲＩＩＩであることが示される。
いくつかの実施形態では、抗体は、インビトロアッセイで測定すると、ヒトＦｃγＲＩＩＡとのＫD結合親和力はヒトＦｃγＲＩＩＢとのＫD結合親和力よりも高く、ヒトＦｃγＲＩＩＢとのＫD結合親和力はヒトＦｃγＲＩＩＩとのＫD結合親和力よりも高く、ヒトＦｃγＲＩＩＩとのＫD結合親和力はヒトＦｃγＲＩとのＫD結合親和力よりも高いかまたはそれと等しいことを示す。他の実施形態では、インビトロアッセイで測定すると、抗体のＫD結合親和力は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ＞ヒトＦｃγＲＩＩＢ＞ヒトＦｃγＲＩＩＩ＞ヒトＦｃγＲＩであることが示される。
いくつかの実施形態では、ヒトＦｃγＲＩＩＩはヒトＦｃγＲＩＩＩＡまたはヒトＦｃγＲＩＩＩＢである。
いくつかの実施形態では、キメラＦｃドメインはキメラヒンジを含む。
別の態様では、本発明は、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、及びキメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む二特異性抗体を提供し、ここで（ａ）第１の抗原結合ドメインはＣＤ３に結合し、（ｂ）第２の抗原結合ドメインはＣＤ２０に結合する。本発明のある態様では、キメラＣＨ領域は、インビトロアッセイで測定すると、野生型ＣＨ領域を含む抗体と比べて高い親和力でヒトＦｃγＲＩＩＡ及びヒトＦｃγＲＩＩＢに結合する。さらに別の態様では、キメラＣＨは、インビトロアッセイで測定すると、野生型ＣＨ領域を含む抗体と比べて低い親和力〜親和力なしでヒトＦｃγＲＩ及びヒトＦｃγＲＩＩＩに結合する。
本発明は、キメラヒンジ領域を含む二特異性抗体を提供する。いくつかの態様では、キメラヒンジ領域は、位置２１６〜２３６（ＥＵナンバリング）のアミノ酸配列残基を含む。本発明の二特異性抗体は、キメラヒンジに位置２２８〜２３６（ＥＵナンバリング）のヒトＩｇＧ２ヒンジ下部アミノ酸配列ＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号５２）を含んで構成される。ある実施形態では、本発明の二特異性抗体は、キメラヒンジを含み、キメラヒンジのヒンジ上部は、ＩｇＧ１ヒンジ上部の位置２１６〜２２７（ＥＵナンバリング）のアミノ酸残基を含む。他の実施形態では、本発明の二特異性抗体はキメラヒンジを含み、キメラヒンジのヒンジ上部は、ＩｇＧ４ヒンジ上部の位置２１６〜２２７（ＥＵナンバリング）のアミノ酸残基を含む。
一実施形態では、二特異性抗体は、キメラヒンジのアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号５３）を含む。別の実施形態では、二特異性抗体は、キメラヒンジのアミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号５４）を含む。ある実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインの位置２３７〜３４０（ＥＵナンバリング）のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインまたはヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインに由来するＣＨ３ドメインを含む。さらに他の実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン及びヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む。さらなる実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメイン及びヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインを含む。
本発明の一態様は、キメラ定常重鎖領域を含む二特異性抗体を作る方法を提供し、該方法は、（ａ）宿主細胞を、ＣＤ３抗原に結合できる第１の軽鎖をコードする核酸分子で形質移入することであって、該核酸分子は第１のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列、及びＩｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含んでおり、選択された抗原特異的抗体のＶＬ領域をコードする該ヌクレオチド配列とＩｇのＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列は機能的に連結されており、（ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を、ＣＤ３抗原に結合できる抗体の第１の重鎖をコードする核酸分子で形質移入することであって、該核酸分子は、ＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列及びヒトＩｇのキメラ定常ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ＶＨ領域をコードする該ヌクレオチド配列と該ＩｇのＣＨ領域をコードする該ヌクレオチド配列は機能的に連結されており、該ＣＨ領域は、第２のＣＨ３ドメインのプロテインＡへの結合を減じるかまたは排するようにＣＨ３ドメインの１つ以上のアミノ酸修飾をコードしており、（ｃ）ステップ（ａ）の宿主細胞を、ＣＤ２０抗原に結合できる抗体の第２の重鎖をコードする核酸分子で形質移入することであって、該核酸分子は、ＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列及びヒトＩｇのキメラＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ＶＨ領域をコードする該ヌクレオチド配列と該ＩｇのＣＨ領域をコードする該ヌクレオチド配列は機能的に連結されており、及び（ｃ）該宿主細胞内で（ａ）と（ｂ）の核酸分子を同時発現させることにより該抗体を作ること、を含んでいる。
いくつかの態様では、二特異性抗体を作る方法は、任意選択で、ステップ（ａ）の宿主細胞を、ＣＤ２０抗原に結合できる第２の軽鎖をコードする核酸分子で形質移入することを含み、該核酸分子は、第２の軽鎖のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列及びＩｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、第２の軽鎖のＶＬ領域をコードする該ヌクレオチド配列とＩｇのＣＬ領域をコードする該ヌクレオチド配列は機能的に連結されている。
いくつかの実施形態では、第１の重鎖は、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングではＨ４３５Ｒ）を含むＣＨ３領域を含む。別の実施形態では、第１の重鎖は、さらに、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴ；ＥＵナンバリングではＹ４３６Ｆ）を含むＣＨ３領域を含む。さらなる実施形態では、方法は、プロテインＡを用いて抗体を単離することを含んでいる。
本発明の別の態様は、（ａ）第１の標的抗原を認識して結合できる抗原結合ドメインを含む第１の重鎖、（ｂ）第２の標的抗原を認識して結合できる抗原結合ドメインを含む第２の重鎖、及び（ｃ）第１のまたは第２の標的抗原を認識して結合できる共通の軽鎖抗原結合ドメインを含む二特異性抗体を提供し、ここで（ａ）または（ｂ）の、あるいは（ａ）と（ｂ）両方の重鎖は、配列番号５３または配列番号５４のアミノ酸配列を含むキメラヒンジ領域を含む重鎖定常領域（ＣＨ）を含んでいる。
ある実施形態では、重鎖定常領域（ＣＨ）は、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラＣＨをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、または配列番号３３を含む。他の実施形態では、キメラＣＨヌクレオチド配列は、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２のアミノ酸配列をコードする。さらに他の実施形態では、ＣＨ領域のヌクレオチド配列は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１または配列番号３３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
ある態様では、二特異性抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする核酸分子を含む。他の態様では、二特異性抗体は、配列番号３４のヌクレオチド配列を含む、軽鎖をコードする核酸分子を含む。
ある態様では、二特異性抗体は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖をコードする核酸分子を含む。他の態様では、二特異性抗体は、配列番号３６のヌクレオチド配列を含む、重鎖をコードする核酸分子を含む。
ある態様では、二特異性抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖をコードする核酸分子を含む。他の態様では、二特異性抗体は、配列番号３８または配列番号３９のヌクレオチド配列を含む、重鎖をコードする核酸分子を含む。
ある態様では、二特異性抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖をコードする核酸分子を含む。他の態様では、二特異性抗体は、配列番号４１のヌクレオチド配列を含む、重鎖をコードする核酸分子を含む。
ある態様では、二特異性抗体は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖をコードする核酸分子を含む。他の態様では、二特異性抗体は、配列番号４３のヌクレオチド配列を含む、重鎖をコードする核酸分子を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書で開示する、治療有効量の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子を提供する。関連の態様では、本発明は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子と第２の治療剤の併用剤である組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子との併用が有益である任意の剤である。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子との併用が有益であり得る例示的剤は、本明細書の別の箇所で詳しく論じる。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子を用いて、ＣＤ２０を発現している腫瘍細胞を標的化／殺滅する治療法を提供し、該治療法は、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子を含む治療有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでいる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子または抗体を用いて、ＣＤ２０を発現している腫瘍細胞を標的化／殺滅する治療法は、第１の用量の抗原結合分子または抗体を第１の期間投与すること、及び引き続いて第２の用量の該抗体を第２の期間投与することを含み、該第２の用量は該第１の用量を上回る。
いくつかの実施形態では、二特異性抗原結合分子の使用には、第１の用量の抗体を第１の期間投与すること、及び引き続いて第２の用量の該抗体を第２の期間投与することが含まれ、該第２の用量は該第１の用量を上回る。ある態様では、第１の用量の抗体及び第２の用量の抗体は、好適な製剤中に存在する。
本発明は、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子を、ＣＤ２０発現に関連するかまたはそれを原因とする疾患または障害を治療するための医薬の製造に使用することを含む。
本発明は、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、及びキメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む二特異性抗体も含み、ここで第１の抗原結合ドメインはＣＤ３に結合し、第２の抗原結合ドメインはＣＤ２０に結合し、キメラＣＨ領域は、野生型ＣＨ領域を含む抗体と比べて高親和力でヒトＦｃγＲＩＩＡ及びヒトＦｃγＲＩＩＢに結合し、そのような二特異性抗体は医薬の製造に使用される。本発明は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、ＣＤ２０に結合する第２の抗原結合ドメイン、及びヒトＦｃγＲＩＩＢに結合するよりも高い親和力でヒトＦｃγＲＩＩＡに結合するキメラＣＨ領域を含む、医薬の製造に使用される二特異性抗体を提供する。
以下の詳細な説明を読むことで、他の実施形態も明らかになろう。
キメラヒンジ領域の構成に用いられるヒンジアミノ酸と、対応するアミノ酸ナンバリング規約を示す。 ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７の、ＩＧＨＧ１として説明される、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号４５）を示す。 ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５９の、ＩＧＨＧ２として説明される、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号４６）を示す。 ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１８６１の、ＩＧＨＧ４として説明される、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号４７）を示す。 図５Ａと図５Ｂは、野生型またはキメラヒンジＣH領域を有する抗体の存在下でのＤａｕｄｉ細胞（図５Ａ）とラージ細胞（図５Ｂ）に対するＣＤＣ活性の低下を示す用量反応曲線である（「コントロール」抗体４＝ｗｔ ＩｇＧ１ ＣHを有する二特異性Ａｂ；抗体１；抗体２；ＩｇＧ１アイソタイプコントロール＝ｗｔ ＩｇＧ１ ＣHを有する非特異的Ａｂ）。 図６Ａと図６Ｂは、野生型またはキメラヒンジＣH領域を有する抗体の存在下でのＤａｕｄｉ細胞（図６Ａ）とラージ細胞（図６Ｂ）に対するＡＤＣＣ活性の低下を示す用量反応曲線である（「コントロール」抗体４＝ｗｔ ＩｇＧ１ ＣHを有する二特異性Ａｂ；抗体１；抗体２；ＩｇＧ１アイソタイプコントロール＝ｗｔ ＩｇＧ１ ＣHを有する非特異的Ａｂ）。 図７Ａ〜図７Ｆは、ラージ腫瘍細胞とＰＢＭＣを混合して（またはＰＢＭＣコントロールなしで（図７Ｄ））皮下移植したＮＳＧマウスにおける経時腫瘍体積（ｍｍ3）を示すが、腫瘍移植後、腫瘍移植と同日（０日目）から本発明のＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体（Ａｂ１）またはビヒクルもしくはコントロール抗体を投与して処置し、２５日間測定した。図７Ａ：ビヒクルで処置したマウスは腫瘍増殖阻害を示さなかった；図７Ｂ：０．４ｍｇ／ｋｇのコントロールＡｂ５（抗ＦｅｌＤ１ Ａｂ）で処置したマウスは５匹中１匹（１／５）が腫瘍増殖阻害を示した；図７Ｃ：０．４ｍｇ／ｋｇの抗体１（Ａｂ１）で処置したマウスは５／５が腫瘍増殖阻害を示した；図７Ｄ：ＰＢＭＣは移植せず、０．４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１で処置したマウスは０／５が腫瘍増殖阻害を示した；図７Ｅ：０．０４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１で処置したマウスは５／５が腫瘍増殖阻害を示した；図７Ｆ：０．００４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１で処置したマウスは５／５が腫瘍増殖阻害を示した。 図７−１の続き。 図８Ａと図８Ｂは、ラージ腫瘍細胞とＰＢＭＣを混合して皮下移植したＮＳＧマウスにおける経時腫瘍体積（ｍｍ3）を示し、図８Ａは、ＩｇＧを添加した、または添加しない、Ａｂ１（ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ）とビヒクルでの処置を比較した図であり、図８Ｂは、ＩｇＧを添加した、または添加しない、Ａｂ４（ＣＤ３ｘＣＤ２０−ｗｔＦｃ）とビヒクルでの処置を比較した図である。このモデルでは、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体はどちらも、ＩｇＧを添加した場合に著しい腫瘍増殖阻害を示している。図８Ａからわかるように、この実験では、ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ二特異性抗体（Ａｂ１）は、ＩｇＧを添加してもしなくても、試験期間全体で完全な腫瘍増殖阻害を示している。 ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体で処置したＮＳＧマウスにおいて１４日目には定着腫瘍（約２００〜４００ｍｍ3）が退縮したことを示す。処置の１５日前にＮＳＧマウスにラージ腫瘍細胞とＰＢＭＣを混合して（ＨＬＡ適合細胞）皮下移植し、腫瘍を定着させ測定した。マウスを０．４ｍｇ／ｋｇの抗体１（ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ抗体）、または０．４ｍｇ／ｋｇのコントロールＡｂ５（抗ＦｅｌＤ１ Ａｂ）、またはビヒクルコントロールで週１回（７日目、１４日目、２１日目）処置した。 ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体で処置したＮＳＧマウスにおいて２１日目には定着腫瘍（約５００〜９００ｍｍ3）が退縮したことを示す。処置の１５日前にＮＳＧマウスにラージ腫瘍細胞とＰＢＭＣを混合して（ＨＬＡ適合細胞）皮下移植し、腫瘍を定着させ測定した。マウスを０．４ｍｇ／ｋｇの抗体１（ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ抗体）、または０．４ｍｇ／ｋｇのコントロールＡｂ５（抗ＦｅｌＤ１ Ａｂ）、またはビヒクルコントロールで週１回（７日目、１４日目、２１日目）処置した。 図１１Ａと図１１Ｂは、抗体１及び抗体４のＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体投与と単一特異性抗体（リツキシマブ）投与のインビボの力価を、７日間の研究で、カニクイザルの末梢血液中のＣＤ２０＋Ｂ細胞レベルまたはＣＤ３＋Ｔ細胞レベルの変化を測定することで比較した図である。抗体またはプラセボは０日目に投与した。図１１Ａ：末梢血液中のＢ細胞レベルは、２日目にはプラセボを除く全試料で著しく減少した；図１１Ｂ：二特異性抗体で処置した動物の末梢血液中、Ｔ細胞の一時的低減が２日目には観察され、４日目にはベースラインレベルに回復した。プラセボまたはリツキシマブ（リツキサン）群ではＴ細胞の（ベースラインを下回る）低減は観察されなかった。 図１２Ａと図１２Ｂは、抗体１及び抗体４のＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体投与のインビボの力価を、長期（３か月）研究で、カニクイザルの末梢血液中のＣＤ２０＋Ｂ細胞レベルまたはＣＤ３＋Ｔ細胞レベルの変化を測定することで示す図である。プラセボ（ビヒクル）または二特異性抗体は、１．０ｍｇ／ｋｇを０日目に投与した。図１２Ａ：末梢血液中のＢ細胞レベルは、２日目にはプラセボを除く全試料で著しく減少し、研究期間全体にわたり減少したままであった；図１２Ｂ：二特異性抗体で処置した動物については、Ｔ細胞の一時的な低減が２日目には観察され、その後Ｔ細胞は４日目にはベースラインレベルまで回復し、研究期間の間もベースライン付近に留まった（＞８０日）。プラセボで処置した動物ではＴ細胞の一時的な低減は観察されなかった。 図１３Ａと図１３Ｂは、抗体１及び抗体４のＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体の低用量投与のインビボの力価を、長期（２か月）研究で、カニクイザルの末梢血液中のＣＤ２０＋Ｂ細胞レベルまたはＣＤ３＋Ｔ細胞レベルの変化を測定することで示す図である。二特異性抗体は、０．０１ｍｇ／ｋｇまたは０．００１ｍｇ／ｋｇ（１μｇ／ｋｇ）のいずれかを０日目に投与した。図１３Ａ：より高い用量のＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体で処置した動物で観察されたのと同様に（図１１Ａまたは図１２Ａも参照のこと）、末梢血液中のＢ細胞レベルは２日目には著しく減少し、研究期間全体にわたり減少したままであった；図１３Ｂ：非常に低い用量（１μｇ／ｋｇ）の二特異性抗体で処置した動物は、より高い用量のＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体で処置した動物に見られたのと同様に、Ｔ細胞の一時的低減があった（図１１Ｂまたは図１２Ｂも参照のこと）。 ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ抗体１で処置した動物の末梢血液中のＢ細胞の低減と抗体の低減の相関関係を示す。動物の血液循環中の抗体曝露（白抜き記号）が時間の経過とともに減少すると、Ｂ細胞集団（塗りつぶし記号）は回復し始める（たとえば第Ｉ０６８８１号の動物（塗りつぶし丸）で８１日目に観察された）。 ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ抗体２で処置した動物の末梢血液中のＢ細胞の低減と抗体の低減の相関関係を示す。動物の血液循環中の抗体曝露（白抜き記号）が時間の経過とともに減少すると、Ｂ細胞集団（塗りつぶし記号）は回復し始める（たとえば第Ｉ０６８７６号の動物（塗りつぶし三角）で６６日目に、第Ｉ０６８７７号の動物（塗りつぶし四角）で６８日目に観察された）。 ＣＤ３ｘＣＤ２０−ｗｔＦｃ（Ａｂ４）二特異性抗体で処置した動物の末梢血液中のＢ細胞の低減と抗体の低減の相関関係を示す。動物の血液循環中の抗体曝露（白抜き記号）が時間の経過とともに減少すると、Ｂ細胞集団（塗りつぶし記号）は回復し始める（たとえば第Ｉ０６８７０号の動物（塗りつぶし三角）で９１日目に、第Ｉ０６８７２号の動物（塗りつぶし丸）で６４日目に観察された）。 図１７Ａと図１７Ｂは、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体を抗ＣＤ２０単一特異性抗体よりもかなり低い用量（０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量）で二特異性コホートに投与した結果、抗ＣＤ２０単一特異性抗体と比べて、カニクイザルの脾臓（図１７Ａ）または腸間膜リンパ節（図１７Ｂ）で組織Ｂ細胞が減少したこと示す図である。この減少は、プラセボコントロール動物コホートでは、どちらの組織でも見られなかった。ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体（Ａｂ１及びＡｂ４）は両方とも、リンパ器官において用量依存性のＢ細胞減少をもたらし、二特異性抗体は０．１ｍｇ／ｋｇ以上の用量でリツキシマブよりも有効にＢ細胞を減少させた。 図１８Ａと図１８Ｂは、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体が、インビトロバイオアッセイで、ヒトＰＢＭＣ（図１８Ａ）またはカニクイザルＰＢＭＣ（図１８Ｂ）の増殖を誘導することを示すが、コントロール抗体５（−▲−；ＣＤ３ｘＣＤ２０に特異的ではない）は活性を示さなかった。 図１９Ａと図１９Ｂは、細胞傷害性アッセイにおけるＣＤ３ｘＣＤ２０が媒介するラージを標的とする殺細胞を例示する。抗体１は、ヒトＴ細胞（図１９Ａ）は２５．０ρＭ、カニクイザルＴ細胞（図１９Ｂ）は９．１０ρＭの各代表ＥＣ50値で、標的細胞の殺滅を媒介した。抗体４は、ヒトＴ細胞（図１９Ａ）は１５．７ρＭ、カニクイザルＴ細胞（図１９Ｂ）は１．７３ρＭの各代表ＥＣ50値で、標的細胞の殺滅を媒介した。コントロール（−▲−）の活性は観察されなかった。 図２０Ａと図２０８Ｂは、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体が、ナイーブＴ細胞による殺細胞を媒介することを例示する。図２０Ａは、抗体４の試験最高濃度の代表的ＦＡＣＳ散布図を示す。Ｂ１６Ｆ１０．９野生型細胞をＣＦＤＡ−ＳＥで標識し、Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０細胞をＶｉｏｌｅｔ細胞トラッカーで標識している。エフェクター細胞は標識していない。図２０Ａの第２のパネルは、抗ＣＤ３ｘＣＤ２０での処置により、ＣＤ２０を発現している細胞が排除されたことを示す（右下のクアドラント）。図２０Ｂは、ＣＤ２０ｘＣＤ３抗体、すなわち抗体４（ｗｔＦｃ）、抗体１（キメラＦｃ）またはコントロールＡｂ５、及びＰＢＭＣの存在下、４８時間後の生存Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０細胞の割合を示す。生存率は、生細胞集団中のＢ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０細胞とＣＤ２０陰性Ｂ１６Ｆ１０．９細胞のパーセンテージを比較して求めた。Ａｂ４とＡｂ１は、ヒトＴ細胞を、混合細胞集団において標的であるＣＤ２０を発現している細胞のみを特異的に殺滅するように仕向けた（図２０Ｂ）。標的細胞の殺滅は二特異性抗体の存在下でのみ観察され、Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０細胞は抗体４（ＥＣ50 １２．８ρＭ）及び抗体１（ＥＣ50 １９．５ρＭ）により用量依存的に減少していた（図２０Ｂ）。ＣＤ２０を発現している細胞のうち、試験最高用量（１０μｇ／ｍＬ）で生存していたのは５％未満であった。 Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０細胞を標的とする４８時間の細胞傷害性アッセイで、全ＣＤ２＋エフェクター細胞中の活性化（ＣＤ６９＋）細胞のパーセントを示す。そのような活性化は、ＣＤ２０ｘＣＤ３抗体のどちらか、すなわち抗体４（ｗｔＦｃ）または抗体１（キメラＦｃ）により誘導された。 図２２Ａと図２２Ｂは、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体が、二特異性結合アームにより、Ｔ細胞と標的細胞（ＣＤ２０＋細胞）のクラスター化を誘導したことを例示する。エフェクター細胞をＣＦＳＥで染色し、ＣＤ２０＋細胞をＶｉｏｌｅｔ細胞トラッカーで染色し、別々のクアドラントにゲートした。的外れなコントロール抗体（コントロール抗体５）と一緒にインキュベートしても、細胞混合体ではクラスター化（二重染色）は現れない（図２２Ａ）。ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体（Ａｂ４）と一緒にインキュベートすると、ＣＦＳＥとＶｉｏｌｅｔの両方で染色されているので細胞クラスターが現れる（図２２Ｂの太枠で強調した散布図左上のクアドラントを参照のこと）。 ラージ腫瘍細胞とＰＢＭＣを混合して皮下移植したＮＳＧマウスの腫瘍体積（ｍｍ3）の研究を示す図であり、本発明のＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体（Ａｂ１）の０．４ｍｇ／ｋｇ、２Ｘ／週（腹腔内投与）、的外れな抗体コントロールＡｂ６の０．４ｍｇ／ｋｇ、２Ｘ／週（腹腔内投与）、またはビヒクルと、抗ＣＤ２０抗体のリツキシマブの８ｍｇ／ｋｇ、５Ｘ／週（腹腔内投与）、及びＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥの０．５ｍｇ／ｋｇ、５Ｘ／週（静脈内投与）とを比較した。（ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥについては、Ｎａｇｏｒｓｅｎ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ｄｅｃ；１３６（３）：３３４−４２， ２０１２を参照されたい。）それぞれ腫瘍移植後に投与した。データは平均値（ＳＥＭ）として示し、ＡＮＯＶＡ分析に供した。このインビボモデルでは、週２回腹腔内投与したＡｂ１の力価は、５ｘ／週で静脈内投与したＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥに匹敵した。 ラージ／ＰＢＭＣを混合して皮下移植したＮＳＧマウスの腫瘍体積（ｍｍ3）研究を示す図であり、図２３と似ているが、ＡＮＯＶＡ分析をＡＢ１、コントロールＡｂ６、リツキシマブ及びビヒクルコントロールで実施している。週２回投与したＡｂ１は、リツキシマブ療法（８ｍｇ／ｋｇを５ｘ／週で腹腔内投与）よりも定着ラージ腫瘍を有効に抑制した。 図２５Ａと図２５Ｂは、ヒト化マウスにｈＣＤ２０／Ｂ１６Ｆ１０．９腫瘍を移植し、移植と同時にまたは移植後にＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体での処置を開始すると、腫瘍増殖が遅延したことを例示する。図２５Ａ：ｈＣＤ３マウスにｈＣＤ２０形質導入Ｂ１６Ｆ１０．９黒色腫細胞を皮下移植し、同時に０．００４ｍｇ／ｋｇまたは０．４ｍｇ／ｋｇの抗体１（ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ抗体）、または４ｍｇ／ｋｇのコントロールＡｂ５（抗ＦｅｌＤ１ Ａｂ）、またはビヒクルコントロール（週２回腹腔内投与）で処置した。図２５Ｂ：ｈＣＤ３マウスにｈＣＤ２０／Ｂ１６Ｆ１０．９黒色腫細胞を皮下移植し、定着させた腫瘍を１０日目から抗体１（ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ抗体）またはコントロールで処置した。マウスは、０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１、または０．４ｍｇ／ｋｇのコントロールＡｂ５（抗ＦｅｌＤ１ Ａｂ）、またはビヒクルコントロールを週２回腹腔内投与して処置した。
本発明を説明する前に理解されたいのは、ここで説明する具体的な方法や実験条件は変更可能なので、本発明はそれらに限定されないということである。また、本明細書で用いる術語は、具体的な実施形態を説明するという目的しかなく、限定的なものと理解すべきではないことも、理解されたい。本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定されるためである。
特に定めのない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する業界で使用されるのと同じ意味を有する。本明細書では、具体的に記載される数値に関して「ａｂｏｕｔ（約）」という言葉を用いる場合、その値は記載値の前後１％以内で変更可能であることを意味する。たとえば、本明細書では、「約１００」という表現は、９９と１０１を含めてその間の全ての値（たとえば９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含んでいる。
本明細書で説明するのと類似または同等のあらゆる方法や材料を本発明の実施や試験に使用できるが、好ましい方法及び材料を以下に説明する。
定義
本明細書では、「ＣＤ３」という表現は、多分子性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部としてＴ細胞に発現し、４種の受容体鎖であるＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ゼータ及びＣＤ３ガンマのホモダイマー、またはそのうちの２種の結合により形成されるヘテロダイマーからなる抗原を指す。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド及びタンパク質フラグメントへの言及はすべて、非ヒト種であるとの断りが特になければ、それぞれヒトバージョンのタンパク質、ポリペプチド及びタンパク質フラグメントを指すことを意図している。したがって、「ＣＤ３」という表現は、たとえば「マウスＣＤ３」「サルＣＤ３」などのように非ヒト種由来と特定されていなければ、ヒトＣＤ３を意味する。
本明細書では、「ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ＣＤ３（ＣＤ３に結合する抗体）」または「ａｎｔｉ−ＣＤ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗ＣＤ３抗体）」には、１つのＣＤ３サブユニット（たとえばイプシロン、デルタ、ガンマまたはゼータ）を特異的に認識する抗体及びその抗原結合フラグメント、ならびに２つのＣＤ３サブユニットのダイマー複合体（たとえばガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン及びゼータ／ゼータのＣＤダイマー）を特異的に認識する抗体及びその抗原結合フラグメントが含まれる。本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、可溶性ＣＤ３及び／または細胞表面に発現したＣＤ３に結合し得る。可溶性ＣＤ３としては、膜貫通ドメインがないかまたはそうではなく細胞膜と関連のない、天然のＣＤ３タンパク質ならびにたとえばモノマー及びダイマーのＣＤ３コンストラクトなど組換えＣＤ３タンパク質バリアントが挙げられる。
本明細書では、「ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＣＤ３（細胞表面に発現したＣＤ３）」という表現は、インビトロまたはインビボで細胞表面に発現して、ＣＤ３タンパク質の少なくとも一部が細胞膜の細胞外側に曝露されて抗体の抗原結合部分にアクセス可能になっている、１つ以上のＣＤ３タンパク質（複数可）を意味する。「細胞表面に発現したＣＤ３」としては、細胞膜の機能的Ｔ細胞受容体の文脈に含まれるＣＤ３タンパク質が挙げられる。「細胞表面に発現したＣＤ３」という表現には、細胞表面のホモダイマーまたはヘテロダイマー（たとえばガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、及びゼータ／ゼータのＣＤ３ダイマー）の一部として発現したＣＤ３タンパク質が含まれる。「細胞表面に発現したＣＤ３」という表現には、他のＣＤ３タイプなしで単独で細胞表面に発現しているＣＤ３鎖（たとえばＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタまたはＣＤ３ガンマ）も含まれる。「細胞表面に発現したＣＤ３」は、通常ＣＤ３タンパク質を発現する細胞表面に発現したＣＤ３タンパク質を含むかまたはそれからなることができる。あるいは、「細胞表面に発現したＣＤ３」は、通常はその表面にヒトＣＤ３を発現しないが、人工的に操作されて表面にＣＤ３を発現するようになった細胞の表面に発現したＣＤ３タンパク質を含むかまたはそれからなることができる。
本明細書では、「ａｎｔｉ−ＣＤ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗ＣＤ３抗体）」という表現には、単一の特異性を有する一価の抗体、ならびにＣＤ３に結合する第１のアーム及び第２の（標的）抗原に結合する第２のアームを含む二特異性抗体が含まれ、抗ＣＤ３アームは、本明細書の表１または表２に示すＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のいずれかを含む。抗ＣＤ３二特異性抗体の実施例を本明細書の別の箇所で説明する。「ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（抗原結合分子）」という用語には、抗体及び抗体の抗原結合フラグメントが含まれ、たとえば二特異性抗体が含まれる。例示的抗ＣＤ３抗体は、ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１及び２０１３年９月１９日出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／６０５１１でも説明されており、その内容を参照により本明細書に援用する。
「ＣＤ２０」という用語は、本明細書では、非ヒト種由来であると特定されない限り（たとえば「マウスＣＤ２０」、「サルＣＤ２０」など）、ヒトＣＤ２０タンパク質を指す。ヒトＣＤ２０タンパク質はＮＣＢＩ基準配列ＮＰ＿６９０６０５．１のアミノ酸配列を有する。
本明細書では、「ａｎｔｉ−ＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗ＣＤ２０抗体）」という表現には、米国特許第７，８７９，９８４号で説明されているようなリツキサン（リツキシマブ）などの単一の特異性を有する一価抗体が含まれる。例示的抗ＣＤ２０抗体は、米国特許第７，８７９，９８４号及び２０１３年９月１９日出願のＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／６０５１１でも説明されており、これらをそれぞれ参照により本明細書に援用する。
「ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎ（腫瘍標的抗原）」は、腫瘍細胞により発現される標的抗原を指すが、腫瘍に変わる前の同族細胞（または健常細胞）に発現される場合もある。「ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（腫瘍特異的抗原）」は、腫瘍細胞内で発現または存在するが、通常は健常細胞や起源の異なる細胞には存在しない抗原を指す。
「ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗体）」という用語は、本明細書では、特定の抗原（たとえばＣＤ３）に特異的に結合するかまたは相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語には、ジスルフィド結合により相互接続された２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそのマルチマー（たとえばＩｇＭ）が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶHと省略）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣH１、ＣH２及びＣH３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶLと省略）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣL１）を含む。ＶH領域とＶL領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域にさらに分けることができ、変化の少ないフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域がそれらの間に挿入されている。各ＶH及びＶLは、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成されており、これらがアミノ末端からカルボキシ末端へとＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並んでいる。本発明の別の実施形態では、抗ＣＤ３抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列の配列と同一であってもよいし、あるいは天然または人工の修飾があってもよい。アミノ酸のコンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並びを分析して決定され得る。
「抗体」という用語には、本明細書では、完全抗体分子の抗原結合フラグメントも含まれる。抗体の「ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ（抗原結合部分）」、抗体の「ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ（抗原結合フラグメント）」などの用語には、本明細書では、あらゆる天然の、酵素学的に得られる、合成の、または遺伝子改変による、特異的に抗原に結合して複合体を形成するポリペプチドまたはグリコタンパク質が含まれる。抗体の抗原結合フラグメントは、たとえば、タンパク質消化または抗体の可変ドメイン及び任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡを操作し発現させることを含む組換え遺伝子改変手法などの任意の好適な標準的手法を用いて、完全抗体分子から誘導することができる。そのようなＤＮＡは既知であり、及び／またはたとえば市販の、ＤＮＡライブラリー（たとえばファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であり、あるいは合成することもできる。ＤＮＡは、配列決定し、化学的にまたは分子生物学的手法により操作することができ、たとえば、１つ以上の可変及び／または定常ドメインを好適な配置にするか、またはコドンを導入し、システイン残基を形成し、アミノ酸を修飾し、付加し、または削除する、などができる。
抗原結合フラグメントの非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最少認識ユニット（たとえばＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、または制限されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドが挙げられる。その他の操作された分子、たとえばドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（たとえば一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなども、本明細書では「抗原結合フラグメント」という表現に含まれる。
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは任意のサイズまたはアミノ酸組成であり得、一般には、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているかまたはインフレームの少なくとも１つのＣＤＲを含むことになる。ＶLドメインと結合したＶHドメインを有する抗原結合フラグメントでは、ＶHドメインとＶLドメインは互いに対して任意の好適な配置で所在し得る。たとえば、可変領域はダイマーであり得、ＶH−ＶH、ＶH−ＶLまたはＶL−ＶLダイマーを含み得る。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、モノマーのＶHまたはＶLドメインを含み得る。
ある実施形態では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常フラグメント（Ｆｃ）ドメインに共有結合しているか、そうではなくＦｃドメインと連結している少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント中に見られ得る可変及び定常ドメインの非限定的な例示的配置としては、（ｉ）ＶH−ＣH１−ヒンジ−ＣH２−ＣH３；（ｉｉ）ＶH−ヒンジ−ＣH２−ＣH３；（ｉｉｉ）ＶH−ＣL；（ｉｖ）ＶL−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｖ）ＶL−ＣH２−ＣH３；及び（ｖｉ）ＶL−ＣLが挙げられる。上述したあらゆる例示的配置を含め、可変及び定常ドメインのあらゆる配置において、可変及び定常ドメインは互いに直接連結していてもよいし、本発明の完全または部分キメラヒンジにより、あるいは完全または部分ＣH１とキメラヒンジにより、連結（ｌｉｎｋｅｄ、ｔｅｔｈｅｒｅｄ）していてもよい。ヒンジ領域は、少なくともヒンジ上部及び下部のアミノ酸からなり得、１つのポリペプチド分子において隣接する可変及び／ま
たは定常ドメイン間の柔軟または半柔軟な連結部となる。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、上述した可変及び定常ドメインの配置のいずれかが、互い同士及び／または１つ以上のモノマーのＶHまたはＶLドメインと非共有結合的（たとえばジスルフィド結合（複数可））に結合したホモダイマーまたはヘテロダイマー（またはその他のマルチマー）を含み得る。
本明細書で開示する例示的二特異性抗体フォーマットも含めて本発明の多特異性抗体フォーマットは、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含んでおり、各可変ドメインは別々の抗原に特異的に結合できる。多特異フォーマットは、当技術分野で利用されるルーチンの手法を用いて、本発明の抗体の抗原結合フラグメントの文脈で使用されるようにされ得る。
本発明の抗体は、インビトロで測定すると補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が低下しているかまたは皆無であるように、修飾される。「ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（補体依存性細胞傷害）」（ＣＤＣ）は、補体の存在下で、本発明の抗体により、抗原を発現している細胞を溶解することを指す。「ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（抗体依存性細胞性細胞傷害）」（ＡＤＣＣ）は、細胞が媒介する反応を指し、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（たとえばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が、標的細胞に結合した抗体を認識し、それによって標的細胞の溶解をもたらすものである。ＣＤＣ及びＡＤＣＣは、当技術分野では周知の利用可能なアッセイを用いて測定できる（たとえば米国特許第５，５００，３６２号及び同第５，８２１，３３７号、ならびにＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９５：６５２−６５６を参照のこと）。抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）は、抗体が補体と結合し細胞依存性の細胞傷害を媒介する能力において、重要である。したがって、抗体のＣＨは、その抗体が細胞傷害性を媒介するのに望ましいかどうかによって選択され得る。
本発明のある実施形態では、本発明の二特異性抗体は、ヒト抗体である。「ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ヒト抗体）」という用語は、本明細書では、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を、たとえばＣＤＲに、具体的にはＣＤＲ３に含み得る（たとえばインビトロのランダムもしくは部位特異的変異誘発による、またはインビボの体細胞変異による変異導入）。しかし、「ヒト抗体」という用語には、本明細書では、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体は含まれないものとする。
本発明の抗体は、いくつかの実施形態では、組換えヒト抗体であり得る。「ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（組換えヒト抗体）」という用語は、本明細書では、宿主細胞に形質移入された組換え発現ベクターにより発現させた抗体（以下でさらに説明する）、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（以下でさらに説明する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック動物（たとえばマウス）から単離された抗体（たとえばＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：６２８７−６２９５を参照のこと）などの組換え手段で調製され、発現させられ、作製され、または単離されたすべてのヒト抗体、あるいはヒト免疫グロブリンの遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段により調製され、発現させられ、作製され、または単離された抗体を含むものとする。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する。しかしある実施形態では、そのような組換えヒト抗体はインビトロ変異誘発を受け（または、ヒトＩｇ配列のトランスジェニック動物を用いる場合はインビボの体細胞変異誘発）、その結果として組換え抗体のＶH及びＶL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶH及びＶL配列由来でありそれに関連してはいるが、インビボのヒト抗体生殖系列レパートリー中に天然に存在しない配列であり得る。
ヒト抗体は、ヒンジの異種性に関係のある二形態で存在し得る。１つの形態では、免疫グロブリン分子は、安定した、およそ１５０〜１６０ｋＤａの４本の鎖のコンストラクトを含み、ここで各ダイマーは鎖間重鎖ジスルフィド結合により繋がっている。第２の形態では、各ダイマーは鎖間ジスルフィド結合を介して連結しておらず、共有結合した軽鎖と重鎖で構成される約７５〜８０ｋＤａの分子（半抗体）が形成されている。これらの形態は、親和性精製後でも分離するのが極めて難しい。
様々な無傷のＩｇＧアイソタイプに第２の形態が出現する頻度は、限定ではないが、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関する構造的差異による。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における１つのアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジで一般に観察されるレベルにまで、第２の形態の出現率を大幅に減じ得る（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）。本発明は、生産時にたとえば所望の抗体形態の収率を高め得るような、１つ以上の変異をヒンジ領域に有する抗体を含む。
本発明の抗体は、単離された抗体であり得る。「ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ（単離された抗体）」は、本明細書では、その天然環境の少なくとも１つのコンポーネントから特定され分離され、及び／または回収された抗体を意味する。たとえば、ある生物の少なくとも１つのコンポーネントから、あるいはその抗体が自然に存在するかまたは自然に産生される組織または細胞から、分離または回収された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体も含まれる。単離された抗体は、少なくとも１回は精製または単離ステップに供されている抗体である。ある実施形態によると、単離された抗体は、他の細胞物質及び／または化学物質を実質的には含まない場合もある。
本明細書で開示する抗ＣＤ３または抗ＣＤ２０可変領域は、その抗体が由来する対応する生殖系列の配列と比べて、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書で開示のアミノ酸配列を、たとえば公開されている抗体配列のデータベースから入手可能な生殖系列の配列と比べることにより、容易に確認できる。本発明は、本明細書で開示するアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体及びその抗原結合フラグメントを含み、ここで１つ以上のフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域中の１つ以上のアミノ酸が、その抗体が由来する生殖系列の配列の対応する残基（複数可）に、または別のヒト生殖系列の配列の対応する残基（複数可）に、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に変異させられている（そのような配列の変化を本明細書ではまとめて「ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ（生殖系列変異）」と呼ぶ）。当業者であれば、本明細書で開示する重鎖及び軽鎖可変領域の配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組合せを含む多くの抗体及び抗原結合フラグメントを容易に生産できる。ある実施形態では、ＶH及び／またはＶLドメイン中のすべてのフレームワーク及び／またはＣＤＲ残基が、その抗体が由来するもとの生殖系列の配列に見られる残基に逆変異させられている。他の実施形態では、特定の残基だけが、もとの生殖系列の配列に逆変異させられ、たとえば変異残基はＦＲ１の最初の８アミノ酸中またはＦＲ４の最後の８アミノ酸中にのみ見られ、あるいは変異残基はＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３中にのみ見られる。他の実施形態では、１つ以上のフレームワーク及び／またはＣＤＲ残基（複数可）が、異なる生殖系列の配列（すなわち抗体がもともと由来する生殖系列の配列とは異なる生殖系列の配列）の対応する残基（複数可）へと変異させられる。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／またはＣＤＲ領域中に２つ以上の生殖系列変異の任意の組合せを含み得、たとえば特定の個々の残基は特定の生殖系列の配列の対応する残基に変異させられるが、もとの生殖系列の配列とは異なる特定の他の残基は維持されるかまたは異なる生殖系列の配列の対応する残基に変異させられる。１つ以上の生殖系列変異を含む抗体及び抗原結合フラグメントが得られると、結合特異性の向上、結合親和力の増加、アンタゴニストまたはアゴニスト的生体特性の向上または増強（場合による）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験できる。こうした一般的な方法で得られた抗体及び抗原結合フラグメントは、本発明に含まれる。
本発明は、１つ以上の保存的置換を有する、本明細書で開示するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む抗ＣＤ３または抗ＣＤ２０可変領域も含む。たとえば、本発明は、本明細書の表１に示すＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比べて、たとえば１０以下、８以下、６以下、４以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＣＤ３抗体を含む。
「ｅｐｉｔｏｐｅ（エピトープ）」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域の特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。１つの抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は抗原の異なるエリアに結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは立体構造的かまたは直線的であり得る。立体構造的エピトープは、直線的ポリペプチド鎖の異なるセグメントの空間的に互い違いのアミノ酸により作られる。直線的エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基により作られるものである。ある状況では、エピトープは、抗原上でサッカライド、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
「ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（実質的な同一性）」または「ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ（ほぼ同一）」という用語は、核酸またはそのフラグメントに言及する場合は、適切なヌクレオチド挿入または欠失を有して別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列させた場合に、以下に論じるＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなどの任意の周知の配列同一性アルゴリズムにより測定すると、少なくとも約９５％の、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド塩基にヌクレオチド配列同一性があることを示している。基準核酸分子に対し実質的な同一性を有する核酸分子は、ある例では、その基準核酸分子によりコードされるポリペプチドと同一またはほぼ同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
ポリペプチドに用いられる「ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（実質的な類似性）」または「ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ（ほぼ同様）」という用語は、２つのペプチド配列が、たとえばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムによりデフォルトのギャップウェイトを用いて最適に整列させた場合に、少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％または９９％配列同一性を有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なっている。「ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ（保存的アミノ酸置換）」とは、あるアミノ酸残基が、同様の化学特性（たとえば電荷や疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を大幅に変えることはない。保存的置換により２つ以上のアミノ酸配列が互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似度を上方調節して、置換の保存的性質を較正することができる。この調節の手段は当業者には周知である。たとえばＰｅａｒｓｏｎ （１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４： ３０７−３３１を参照されたい。類似の化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン、（３）アミドを含む側鎖：アスパラギン及びグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン及びヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、ならびに（７）硫黄を含有する側鎖のシステイン及びメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６： １４４３−１４４５で開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで正の値を有する任意の変化である。「ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ（やや保存的）」な置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで負ではない値を有する任意の変化である。
ポリペプチドの配列類似性は、配列同一性ともいうが、一般に、配列分析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換などの様々な置換、欠失、及びその他の各種修飾に割り当てられた類似性測定値を用いて、類似する配列同士を一致させる。たとえばＧＣＧソフトウェアにはＧａｐやＢｅｓｔｆｉｔといったプログラムが含まれ、これをデフォルトのパラメーターで用いて、近縁ポリペプチド間の、たとえば異なる生物種に由来する相同ポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質との配列相同性（ホモロジー）または配列同一性を決定する。たとえばＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１のプログラム、ＦＡＳＴＡをデフォルトまたは推奨パラメーターで用いて比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（たとえばＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列とサーチ配列の重複率が最も高い領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）前掲）。本発明の配列を異種生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合のもうひとつの好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮというコンピュータープログラムであり、デフォルトのパラメーターを用いる。たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−４０２を参照されたい。
二特異性抗原結合分子
本発明の抗体は、二特異性または多特異性であり得る。多特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対し特異的であり得、または２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含み得る。たとえばＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０−６９； Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２：２３８−２４４を参照されたい。本発明の抗ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体は、別の機能分子、たとえば別のペプチドまたはタンパク質と連結し得、または同時発現し得る。たとえば、抗体またはそのフラグメントを別の抗体または抗体フラグメントなどの１つ以上の他の分子実体に機能的に連結（たとえば化学結合、遺伝子融合、非共有結合またはその他による）して、追加の結合特異性を有する二特異性または多特異性抗体を生産することができる。
したがって、本発明は、免疫グロブリンの一方のアームがヒトＣＤ３に結合し、該免疫グロブリンの他方のアームが標的抗原に対し特異的である、二特異性抗体を含む。ＣＤ３二特異性抗体の他方のアームが結合する標的抗原は、細胞、組織、器官、微生物またはウイルスの表面または付近に発現した任意の抗原であり得、該抗原に対する標的免疫応答が望ましい。ＣＤ３結合アームは、本明細書の表１に示すＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列をどれでも含むことができる。
抗体の一方のアームがＣＤ３に結合し、他方のアームが標的抗原に結合する本発明の二特異性抗体の文脈では、標的抗原は腫瘍関連の抗原であり得る。具体的な腫瘍関連抗原の非限定的な例としては、たとえばＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（サバイビン）、ＢＩＲＣ７、β−カテニン、ｂｒｃ−ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、炭酸脱水酵素ＩＸ、カスパーゼ−８、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ４、サイクリン−Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ−１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質（たとえばＧＡＧＥ−１、−２）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン−３、ＧＭ３、ｇｐ１００、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ／Ｂ−ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ−ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ−Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥタンパク質（たとえばＭＡＧＥ−１、−２、−３、−４、−６、及び−１２）、ＭＡＲＴ−１、メソセリン、ＭＬ−ＩＡＰ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６（ＣＡ−１２５）、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ−ＢＲ１、ＮＹ−ＢＲ６２、ＮＹ−ＢＲ８５、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＯＸ４０、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ−１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、Ｓｔｅａｐ−１、Ｓｔｅａｐ−２、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原（Ｔｎ）、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、及びウロプラキン−３が挙げられる。
抗体の一方のアームがＣＤ３に結合し、他方のアームが標的抗原に結合する本発明の二特異性抗体の文脈では、標的抗原は、感染性疾患関連抗原であり得る。感染性疾患関連抗原の非限定的な例としては、たとえば、ウイルス粒子の表面に発現した、または好ましくはウイルスに感染した細胞に発現した抗原が挙げられ、ウイルスは、ＨＩＶ、肝炎（Ａ型、Ｂ型またはＣ型）、ヘルペスウイルス（たとえばＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＨＡＶ−６、ＶＺＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶ、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、及びアルボ脳炎ウイルスからなる群より選択される。あるいは、標的抗原は、細菌の表面に発現した、または好ましくは細菌に感染した細胞に発現した抗原であり得、細菌は、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｉ、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ、ｇｏｎｏｃｏｃｃｉ、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、破傷風、ボツリヌス、炭疽、ペスト、レプトスピラ、及びライム病細菌からなる群より選択される。ある実施形態では、標的抗原は、真菌の表面に発現した、または好ましくは真菌に感染した細胞に発現した抗原であり、真菌は、カンジダ（ａｌｂｉｃａｎｓ、ｋｒｕｓｅｉ、ｇｌａｂｒａｔａ、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓなど）、Ｃｒｙｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、ｎｉｇｅｒなど）、Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ（ｍｕｃｏｒ、ａｂｓｉｄｉａ、ｒｈｉｚｏｐｕｓなど）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、及びＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍからなる群より選択される。ある実施形態では、標的抗原は、寄生体の表面に発現した、または好ましくは寄生体に感染した細胞に発現した抗原であり、寄生体は、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｔａｅｎｉａ ｃｒａｓｓｉｃｅｐｓ、及びＢｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉからなる群より選択される。具体的な病原体関連抗原の非限定的な例としては、たとえばＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＣＤ４、Ｂ型肝炎グルコタンパク質Ｌ、Ｂ型肝炎グルコタンパク質Ｍ、Ｂ型肝炎グルコタンパク質Ｓ、Ｃ型肝炎Ｅ１、Ｃ型肝炎Ｅ２、幹細胞特異タンパク質、単純ヘルペスウイルスｇＢ、サイトメガロウイルスｇＢ、及びＨＴＬＶエンベロープタンパク質が挙げられる。
ある例示的実施形態によると、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ２０に特異的に結合する二特異性抗原結合分子を含む。そのような分子は、本明細書では、たとえば「抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０」または「抗ＣＤ３／ＣＤ２０」または「抗ＣＤ３ｘＣＤ２０」または「ＣＤ３ｘＣＤ２０」二特異性分子、あるいは他の同様の術語で呼ばれることもある。
本明細書では、「ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（抗原結合分子）」という表現は、単独で、または１つ以上のさらなるＣＤＲ及び／またはフレームワーク領域（ＦＲ）との組合せで、特定の抗原に特異的に結合する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むかそれからなる、タンパク質、ポリペプチドまたは分子複合体を意味する。ある実施形態では、抗原結合分子は、抗体または抗体のフラグメントであり、これらの用語は本明細書の別の箇所で定義されている。
本明細書では、「ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（二特異性抗原結合分子）」という表現は、少なくとも第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインを含むタンパク質、ポリペプチドまたは分子複合体を意味する。二特異性抗原結合分子中の各抗原結合ドメインは、単独でまたは１つ以上のさらなるＣＤＲ及び／またはＦＲとの組合せで特定の抗原に特異的に結合する少なくとも１つのＣＤＲを含んでいる。本発明の文脈では、第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原（たとえばＣＤ３）に特異的に結合し、第２の抗原結合ドメインは、第２の、別の抗原（たとえばＣＤ２０）に特異的に結合する。
本発明のある例示的な実施形態では、二特異性抗原結合分子は、二特異性抗体である。二特異性抗体の各抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）を含む。第１及び第２の抗原結合ドメインを含む二特異性抗原結合分子（たとえば二特異性抗体）の文脈では、第１の抗原結合ドメインの各ＣＤＲは、接頭辞「Ａ１」により示され、第２の抗原結合ドメインの各ＣＤＲは、接頭辞「Ａ２」により示され得る。したがって、第１の抗原結合ドメインの各ＣＤＲは、本明細書では、Ａ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２、及びＡ１−ＨＣＤＲ３として言及され得、第２の抗原結合ドメインの各ＣＤＲは、Ａ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２、及びＡ２−ＨＣＤＲ３として言及され得る。
第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインは、直接または間接的に互いに接続して、本発明の二特異性抗原結合分子（すなわち二特異性ＳｃＦｖ）を形成でき、さらに１つのＦｃドメインに結合されている。あるいは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインはそれぞれ別のＦｃドメインに接続される場合もある。本発明の二特異性抗原結合分子は、典型的には、それぞれが別々の抗体重鎖の一部である２つのＦｃドメインを含むことになる。第１及び第２のＦｃドメインは、ヘテロダイマー（すなわち二特異性）分子の精製を促進しまたは容易にするための変異をＣH３ドメインに有することを除いては、同一の配列であり得る。
本発明は、第１のＣH３ドメイン及び第２のＩｇ ＣH３ドメインを含む二特異性抗原結合分子を含み、ここで第１と第２のＩｇ ＣH３ドメインは少なくとも１つのアミノ酸の違いがあり、該二特異性抗体はこの少なくとも１つのアミノ酸の違いにより、アミノ酸の違いがない二特異性抗体と比べて、プロテインＡへの結合性が低い。一実施形態では、第１のＩｇ ＣH３ドメインはプロテインＡに結合するが、第２のＩｇ ＣH３ドメインはプロテインＡへの結合を減じるかまたは排するＨ４３５Ｒ修飾（ＥＵナンバリングによる；ＩＭＧＴエクソンナンバリングではＨ９５Ｒ）などの変異を含んでいる。第２のＣH３は、さらに、Ｙ４３６Ｆ修飾（ＥＵナンバリングによる；ＩＭＧＴではＹ９６Ｆ）を含み得る。第２のＣH３中に見られ得るさらなる修飾としては、ＩｇＧ１ ＣH３ドメインの場合、ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ（ＩＭＧＴでは、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ）；ＩｇＧ４ ＣH３ドメインの場合、ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ（ＩＭＧＴではＱ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ）が挙げられる。
他の二特異性抗体フォーマットまたは技術を用いて本発明の二特異性抗原結合分子を作ることもできる。たとえば、第１の抗原結合特異性を有する抗体またはそのフラグメントを、第２の抗原結合特異性を有する別の抗体または抗体フラグメントなどの１つ以上の他の分子実体に機能的に連結（たとえば化学結合、遺伝子融合、非共有結合またはその他による）して、二特異性抗原結合分子を生産することができる。本発明の文脈で使用できる具体的な例示的二特異性フォーマットとしては、限定ではないが、たとえばｓｃＦｖベースまたはジアボディ二特異性フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合、二重（ｄｕａｌ）可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドローマ、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ、共通の軽鎖（たとえばｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓを有する共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重活性Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、及びＭａｂ2二特異性フォーマットが挙げられる（以上のフォーマットの説明については、たとえばＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ． ２０１２， ｍＡｂｓ ４：６， １−１１及びその引用参照文献を参照のこと）。
本発明の二特異性抗原結合分子の文脈では、Ｆｃドメインは、所望の機能性を変更することなく、Ｆｃドメインの特定のキメラバージョンと比べて、１つ以上のアミノ酸の変化（たとえば挿入、欠失または置換）を含み得る。たとえば、本発明は、ＦｃとＦｃＲｎ間の修飾された結合相互作用（たとえば増強または低下）を有する修飾Ｆｃドメインとなる１つ以上の修飾をＦｃドメインに含んでいる、二特異性抗原結合分子を含む。一実施形態では、二特異性抗原結合分子は、ＣH２またはＣH３領域に修飾を含み、修飾により酸性環境（たとえばｐＨ約５．５〜約６．０のエンドソーム）でのＦｃドメインのＦｃＲｎへの親和力が増加している。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例としては、たとえば、位置２５０（たとえばＥまたはＱ）；２５０及び４２８（たとえばＬまたはＦ）；２５２（たとえばＬ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４（たとえばＳまたはＴ）、及び２５６（たとえばＳ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）の修飾；あるいは位置４２８及び／または４３３（たとえばＬ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）及び／または４３４（たとえばＨ／ＦまたはＹ）の修飾；あるいは位置２５０及び／または４２８の修飾；あるいは位置３０７または３０８（たとえば３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４の修飾が挙げられる。一実施形態では、修飾には、４２８Ｌ（たとえばＭ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（たとえばＮ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（たとえばＶ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（たとえばＶ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（たとえばＨ４３３Ｋ）及び４３４（たとえば４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、及び２５６（たとえば２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の修飾；２５０Ｑ及び４２８Ｌの修飾（たとえばＴ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；及び３０７及び／または３０８の修飾（たとえば３０８Ｆまたは３０８Ｐ）が挙げられる。
配列バリアント
本発明の抗体及び二特異性抗原結合分子は、個々の抗原結合ドメインが由来する対応する生殖系列の配列と比べて、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書で開示のアミノ酸配列を、たとえば公開されている抗体配列のデータベースから入手可能な生殖系列の配列と比べることにより、容易に確認できる。本発明の抗原結合分子は、本明細書で開示する例示的アミノ酸配列のいずれかに由来する抗原結合ドメインを含み得、ここで１つ以上のフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域中の１つ以上のアミノ酸が、その抗体が由来する生殖系列の配列の対応する残基（複数可）に、または別のヒト生殖系列の配列の対応する残基（複数可）に、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に変異させられている（そのような配列の変化を本明細書ではまとめて「生殖系列変異」と呼ぶ）。当業者であれば、本明細書で開示する重鎖及び軽鎖可変領域の配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組合せを含む多くの抗体及び抗原結合フラグメントを容易に生産できる。ある実施形態では、ＶH及び／またはＶLドメイン中のすべてのフレームワーク及び／またはＣＤＲ残基が、その抗原結合ドメインが由来するもとの生殖系列の配列に見られる残基に逆変異させられる。他の実施形態では、特定の残基だけが、もとの生殖系列の配列に逆変異させられ、たとえば変異残基はＦＲ１の最初の８アミノ酸中またはＦＲ４の最後の８アミノ酸中にのみ見られ、あるいは変異残基はＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３中にのみ見られる。他の実施形態では、１つ以上のフレームワーク及び／またはＣＤＲ残基（複数可）が、異なる生殖系列の配列（すなわち抗原結合ドメインがもともと由来する生殖系列の配列とは異なる生殖系列の配列）の対応する残基（複数可）へと変異させられる。さらに、抗原結合ドメインは、フレームワーク及び／またはＣＤＲ領域中に２つ以上の生殖系列変異の任意の組合せを含み得、たとえば特定の個々の残基は特定の生殖系列の配列の対応する残基に変異させられるが、もとの生殖系列の配列とは異なる特定の他の残基は維持されるかまたは異なる生殖系列の配列の対応する残基に変異させられる。１つ以上の生殖系列変異を含む抗原結合ドメインが得られると、結合特異性の向上、結合親和力の増加、アンタゴニストまたはアゴニスト的生体特性の向上または増強（場合による）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験できる。こうした一般的な方法で得られた１つ以上の抗原結合ドメインを含む二特異性抗原結合分子は、本発明に含まれる。
本発明は、片方または両方の抗原結合ドメインが、１つ以上の保存的置換を有する、本明細書で開示するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む、抗原結合分子も含む。たとえば、本発明は、本明細書で開示するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比べて、たとえば１０以下、８以下、６以下、４以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む、抗原結合分子を含む。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、類似の化学特性（たとえば電荷や疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を大幅に変えることはない。類似の化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン、（３）アミドを含む側鎖：アスパラギン及びグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン及びヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、ならびに（７）硫黄を含有する側鎖のシステイン及びメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６： １４４３−１４４５で開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで正の値を有する任意の変化である。「やや保存的」な置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで負ではない値を有する任意の変化である。
ポリペプチドの配列類似性は、配列同一性ともいうが、配列分析ソフトウェアを用いて測定できる。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換などの様々な置換、欠失、及びその他の各種修飾に割り当てられた類似性測定値を用いて、類似する配列同士を一致させる。たとえばＧＣＧソフトウェアにはＧａｐやＢｅｓｔｆｉｔといったプログラムが含まれ、これをデフォルトのパラメーターで用いて、近縁ポリペプチド間の、たとえば異なる生物種に由来する相同ポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質との配列相同性または配列同一性を決定する。たとえばＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１のプログラム、ＦＡＳＴＡをデフォルトまたは推奨パラメーターで用いて比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（たとえばＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列とサーチ配列の重複率が最も高い領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）前掲）。本発明の配列を異種生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合のもうひとつの好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮというコンピュータープログラムであり、デフォルトのパラメーターを用いる。たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−４０２を参照されたい。
ｐＨ依存性結合
本発明は、ｐＨ依存性結合特徴を有する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗体を含む。たとえば、本発明の抗ＣＤ３抗体は、酸性ｐＨでは中性ｐＨよりも低いＣＤ３結合性を示し得る。あるいは、本発明の抗ＣＤ３抗体は、酸性ｐＨでは中性ｐＨよりも高いＣＤ３結合性を示し得る。「ａｃｉｄｉｃ ｐＨ（酸性ｐＨ）」という表現は、約６．２未満のｐＨ値、たとえば約６．０、５．９５、５、９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０またはそれ以下のｐＨ値を含む。本明細書では、「ｎｅｕｔｒａｌ ｐＨ（中性ｐＨ）」とは、約７．０〜約７．４のｐＨを意味する。「中性ｐＨ」という表現は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、及び７．４のｐＨ値を含む。
ある例では、「酸性ｐＨでは中性ｐＨよりも結合性が低い」ということを、中性ｐＨで抗原に結合する抗体のＫD値に対する酸性ｐＨで抗原に結合する抗体のＫD値の比で表現する（または逆もあり）。たとえば、ある抗体またはその抗原結合フラグメントが約３．０以上の酸性／中性ＫD比を示す場合に、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の目的のために「酸性ｐＨでは中性ｐＨよりも低いＣＤ３結合性」を示す、とみなすことができる。ある例示的実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントの酸性／中性ＫD比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０．２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０またはそれ以上であり得る。
ｐＨ依存性結合特徴のある抗体は、たとえば、特定の抗原に対する結合性が中性ｐＨよりも酸性ｐＨで低い（または高い）抗体集団をスクリーニングすることにより、得ることができる。それに加えて、抗原結合ドメインのアミノ酸レベルの修飾によって、ｐＨ依存性結合特徴のある抗体を得ることもできる。たとえば、抗原結合ドメイン（たとえばＣＤＲ中）の１つ以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置換することにより、抗原結合性が中性ｐＨよりも酸性ｐＨで低い抗体を得ることができる。
Ｆｃ受容体結合
本発明で提供する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子及び抗体は、種々のＩｇＧアイソタイプに由来しＦｃ受容体の結合及び活性化に関して固有の特徴を有するＩｇ重鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３定常ドメインなどの、キメラＦｃドメインを含んでいる。本発明の特定のＦｃドメインは、キメラヒンジを含むように操作されている。
「ｃｈｉｍｅｒｉｃ（キメラ（の））」という用語は、本明細書では、異起源の部分でできていることを意味する。「ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（キメラタンパク質）」という語句には、通常自然に連結されることがない第２のアミノ酸タンパク質に連結された第１のアミノ酸タンパク質が含まれる。そのようなアミノ酸配列は通常は別々のタンパク質として存在するか、または同一タンパク質の異なる配置に存在し得、新たな配置の融合ポリペプチドとして一緒にされる。キメラタンパク質は、当技術分野で知られる様々な方法により、たとえば化学合成によって、または所望の配置のキメラタンパク質のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを作製することによって、作製できる。例示的キメラタンパク質としては、ＩｇＧ重鎖ドメインを接続するキメラヒンジ配列、及び本発明のヒト抗体及び抗原結合タンパク質を作るように操作された融合タンパク質が挙げられる。
本明細書で開示するキメラタンパク質は、たとえば野生型ＩｇＧのＦｃ領域またはドメインと比べて、連結部における免疫原性エピトープ形成を最小限化するように設計した。したがって、本発明の操作されたタンパク質は、免疫原性が低下しており、Ｆｃ受容体への結合性の低減ならびにエフェクター機能の低減〜エフェクター機能なしを示す。
「ｈｉｎｇｅ（ヒンジ）」という用語は、本明細書では、免疫グロブリンのＣH１のＣ末端をＣH２ドメインのＮ末端に接続する連続するアミノ酸残基の領域を含むものとする。ＣH２エクソンによりコードされるＣH２ドメインのＮ末端のいくつかのアミノ酸も「ｌｏｗｅｒ ｈｉｎｇｅ（ヒンジ下部）」の一部とみなされる。特定の理論に縛られるわけではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のヒンジ領域のアミノ酸は、独特のヒンジエクソンによりコードされている連続する１２〜１５のアミノ酸、及びＣH２ドメインのいくつかのＮ末端アミノ酸（ＣH２エクソンによりコードされる）を含むと特徴づけられている（Ｂｒｅｋｋｅ， Ｏ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １６（２）：８５−９０ （１９９５））。これに対し、ＩｇＧ３は、ＩｇＧ１のヒンジ領域と似た上部セグメント１つと、ＩｇＧ３に固有の同一のアミノ酸反復である３セグメントの合計４つのセグメントからなるヒンジ領域を含んでいる。
「ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈｉｎｇｅ（キメラヒンジ）」という用語は、本明細書では、１つのＩｇ分子ヒンジ領域に由来する第１のアミノ酸配列、及び異なるクラスまたはサブクラスのＩｇ分子ヒンジ領域に由来する第２のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を含むものとする。本発明の例示的キメラヒンジには、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する第１のアミノ酸配列または「ヒンジ上部」配列、及びヒトＩｇＧ２ヒンジ領域に由来する第２のアミノ酸配列または「ヒンジ下部」配列が含まれる。ある実施形態では、第１の、または「ヒンジ上部」配列は、ＥＵナンバリングによる位置２１６〜２２７のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、第２の、または「ヒンジ下部」配列は、ＥＵナンバリングによる位置２２８〜２３６のアミノ酸残基を含む。
本開示の目的では、「ヒンジ上部」領域は、ＥＵナンバリングによる位置２１６〜２２７のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔナンバリングによる位置２２６〜２４０のアミノ酸残基）（図１を参照のこと）を含むものとする。「ヒンジ下部」領域は、ＥＵナンバリングによる位置２２８〜２３６のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔナンバリングによる位置２４１〜２４９のアミノ酸残基）（図１を参照のこと）を含むものとする。
本開示では、本発明を実施する際の便宜のため、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のヒンジ領域のアミノ酸を、「ＥＵナンバリング」または「ＥＵインデックス」としても知られているＫａｂａｔのＥＵナンバリングシステムで特定しており（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ５th ｅｄ． ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１−３２４２ （１９９１））、これはＩＭＧＴ（登録商標）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｈａｒｔ、ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ（作成日：２００１年５月１７日、最新更新日：２０１３年１月１０日）にしたがい更新されている。
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のヒンジアミノ酸のＥＵナンバリングと、ＩＭＧＴユニークドメインナンバリング規約、ＩＭＧＴエクソンナンバリング規約、及びＫａｂａｔナンバリング規約との対応（前掲のＫａｂａｔ， Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９１も参照のこと）を以下の表Ａ〜表Ｆに記載する。
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「ｂｉｎｄｉｎｇ（結合）」という用語は、抗体、Ｉｇ、抗体結合フラグメント、またはＦｃ含有タンパク質の、たとえば所定の抗原またはＦｃγＲいずれかとの結合の文脈では、一般には、最低２つの実体つまり分子構造の相互作用または結合、たとえば抗体−抗原の相互作用、またはＦｃ含有タンパク質のＦｃγＲへの結合を指す。
たとえば、結合親和力は典型的には、たとえば抗原またはＦｃＲをリガンドとし、抗体、Ｉｇ、抗体結合フラグメント、またはＦｃ含有タンパク質をアナライト（または抗リガンド）としてＢＩＡｃｏｒｅ ３０００機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定すると、約１０-7Ｍ以下、たとえば約１０-8Ｍ以下、たとえば約１０-9Ｍ以下のＫD値に相当する。したがって、抗体または他の結合タンパク質は、非特異的抗原（たとえばＢＳＡ、カゼイン）への結合親和力よりも少なくとも１０倍低い（少なくとも１００倍低いなど）、たとえば少なくとも１０００倍低い（少なくとも１万倍低いなど）、たとえば少なくとも１０万倍低いＫD値に相当する親和力で所定の抗原または受容体に結合する。
「ＫD」（Ｍ）という用語は、本明細書では、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数、または抗体、Ｉｇ、抗体結合フラグメント、もしくはＦｃ含有タンパク質のＦｃγＲに対する解離平衡定数を指す。ＫDと結合親和力には反比例関係があるので、ＫD値が小さいほど親和力は高い（すなわち強い）。したがって、「ｈｉｇｈｅｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ（より高い親和力）」または「ｓｔｒｏｎｇｅｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ（より強い親和力）」という用語は、相互作用を形成する能力がより高いということに関連し、したがってより小さいＫD値となり、その反対に「ｌｏｗｅｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ（より低い親和力）」または「ｗｅａｋｅｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ（より弱い親和力）」という用語は、相互作用を形成する能力がより低いということに関連し、したがってより大きいＫD値となる。いくつかの状況では、特定の分子（たとえば抗体）の相互作用相手方分子（たとえば受容体Ｘ）に対する結合親和力（またはＫD）が、該分子（たとえば抗体）の別の相互作用相手方分子（たとえば受容体Ｙ）に対する結合親和力よりも高いということを、大きいほうのＫD値（より低いかまたは弱い親和力）を小さいほうのＫD（より高いかまたは強い親和力）で割ることで決定される結合比として表すことができ、たとえば、場合によっては５倍または１０倍大きい結合親和力として表される。
「ｋd」（秒−１または１／ｓ）という用語は、本明細書では、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数、または抗体、Ｉｇ、抗体結合フラグメント、またはＦｃ含有タンパク質のＦｃγＲに対する解離速度定数を指す。該値は、ｋoff値とも呼ばれる。
「ｋa」（Ｍ−１ｘ秒−１または１／Ｍ）という用語は、本明細書では、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度定数、または抗体、Ｉｇ、抗体結合フラグメント、またはＦｃ含有タンパク質のＦｃγＲに対する結合速度定数を指す。
「ＫA」（Ｍ−１または１／Ｍ）という用語は、本明細書では、特定の抗体−抗原相互作用の結合平衡定数、または抗体、Ｉｇ、抗体結合フラグメント、またはＦｃ含有タンパク質のＦｃγＲに対する結合平衡定数を指す。結合平衡定数は、ｋaをｋdで割ることで得られる。
「ＥＣ５０」または「ＥＣ50」という用語は、本明細書では、最大半数の有効濃度を指し、特定の曝露時間の経過後にベースラインと最大の中間の応答を誘導する抗体濃度を含む。基本的には、ＥＣ50は、最大効果の５０％が観察される抗体濃度を表す。したがって、結合性の低下は、高いＥＣ50つまり最大半数有効濃度値とともに観察される。
一実施形態では、結合性の低下は、最大半数の標的細胞への結合を可能にするＥＣ50抗体濃度の上昇と定義できる。
いくつかの実施形態では、ＡＤＣＣまたはＣＤＣなどの細胞傷害活性の低下は、標的細胞の最大半数の溶解を可能にするＥＣ50抗体濃度の上昇と定義できる。細胞傷害性は、細胞傷害性パーセントとして、またはカルセイン放出アッセイまたは同等のアッセイで細胞集団全体のうち溶解が観察される画分である溶解パーセントとしても測定される。細胞傷害性パーセントは実施例６で説明するようにして測定できる。
他の実施形態では、増殖低下は、標的細胞の最大半数の増殖を可能にするＥＣ50抗体濃度の上昇と定義できる。
「ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ（エフェクター機能）」という語句は、本明細書では、ＦｃγＲへの結合後にＦｃ含有タンパク質により付与される機能的能力を含むものとする。特定の理論に縛られるわけではないが、Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成により、結合された抗原の部位に様々なエフェクター細胞が集まり、典型的には細胞内の種々のシグナル伝達事象及び後続の重要な免疫応答がもたらされる。
本発明のキメラＦｃ含有抗原結合タンパク質及び抗体は、対応する野生型Ｆｃ含有抗原結合タンパク質または抗体と比べて、改変されたまたは低下したエフェクター機能を示す。たとえば２０１４年８月７日公開のＰＣＴ公報ＷＯ２０１４／１２１０８７（参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、低下したまたは改変されたエフェクター機能は、細胞傷害性エフェクター機能、たとえば細胞傷害性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）である。一実施形態では、低下したまたは改変されたエフェクター機能は、補体依存性細胞傷害性である。別の実施形態では、低下したまたは改変されたエフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害性である。他の実施形態では、低下したまたは改変されたエフェクター機能は、標的細胞の細胞増殖である。
いくつかの抗体エフェクター機能は、少なくとも部分的にはＦｃ受容体（ＦｃＲ）に媒介される。Ｆｃ受容体は抗体Ｆｃ領域、典型的な免疫グロブリンの定常ドメイン（具体的にはＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）に結合する。免疫グロブリンの異なるクラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＤに特異的なＦｃ受容体がいくつかある。ヒトＩｇＧのＦｃ受容体ファミリーは、高親和力でＩｇＧに結合できるＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、親和力が低い受容体ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の３つのグループに分けられる。各ＦｃγＲサブクラスは、２つまたは３つの遺伝子によりコードされ、選択的ＲＮＡスプライシングにより複数の転写がもたらされるので、多種多様なＦｃγＲアイソマーが存在することになる（たとえばＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４；ＦＣＧＲ１Ａ）、ＦｃγＲＩＢ（ＣＤ６４；ＦＣＲＧ１Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ；ＦＣＧＲ２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ；ＦＣＧＲ２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２Ｃ；ＦＣＧＲ２Ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ；ＦＣＧＲ３Ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ；ＦＣＧＲ３Ｂ））。それに加えて、ＦｃＲｎつまり胎児性Ｆｃ受容体（Ｆｃ受容体トランスポーター、アルファ、またはＦＣＧＲＴとしても知られている）は、母親から胎盤を通して胎児にＩｇＧ抗体を伝えることができる。さらに、Ｆｃ受容体は、たとえばＢ細胞、単球、樹状細胞、好中球、及びある種のリンパ球など、様々な細胞で発現する。たとえば、ヒト単球細胞株であるＵ９３７細胞は、ＦｃγＲＩとＦｃγＲＩＩＡを両方発現する（たとえば Ｊｏｎｅｓ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３５（５）：３３４８−５３ （１９８５）；及びＢｒｏｏｋｓ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７０：１３６９−８５ （１９８９年１０月）を参照のこと）。本明細書で言及する各受容体は、転写バリアント、アイソフォーム及び多形といった、その受容体の任意の既知の機能的形態を含む。
ＩｇのＦｃが受容体に結合すると、これらのエフェクター細胞が結合された抗原の部位に集まり、最終的には様々なシグナル伝達、及びＢ細胞活性化、炎症反応、細胞傷害反応、貪食反応などの免疫応答がもたらされる。したがって、ＩｇのＦｃの受容体への結合性が低下するかまたは改変されると、エフェクター機能が低下し得る。
「ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ（抗体依存性細胞貪食）」または「ＡＤＣＰ」という語句は、細胞傷害の誘導ではなく貪食によって標的細胞を排除（つまり殺滅）するエフェクター機能に関する。ＡＤＣＰは、殺腫瘍細胞の重要なインビボの機構であり得る。たとえばＡＤＣＰは、二色蛍光フローサイトメトリー法、たとえば異なる細胞表面タンパク質に対しＰＫＨ２（緑色の蛍光色素）及びフィコエリトリン結合（赤色）モノクローナル抗体を用いて試験細胞を識別し、それによって貪食の活性と速度を決定する方法により、測定できる。ＡＤＣＰ測定は当技術分野では周知である。ＦｃγＲＩＩｂよりもＦｃγＲＩＩａを選択的に活性化する治療ストラテジーは、マクロファージの貪食活性を増強し得る（Ｒｉｃｈａｒｄｓ， ＪＯ， ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ７（８）：２５１７−２７）。本発明のキメラＦｃ含有抗原結合タンパク質及び抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＡに結合しこれを活性化する。ある状況では、本発明の抗原結合タンパク質及び抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＡに対し、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和力よりも高い結合親和力で結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＡに対し、ヒトＦｃγＲＩＩＢに対するＫD結合親和力よりも、約５倍よりも高いＫD結合親和力を示す。他の実施形態では、抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＡに対し、ヒトＦｃγＲＩＩＢに対するＫD結合親和力よりも、約６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍よりも高いＫD結合親和力を示す。
抗体及び二特異性抗原結合分子の生物学的特徴
本発明は、ヒトＣＤ３及びＣＤ２０に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。たとえば、本発明は、たとえば本明細書の実施例３で定義するアッセイフォーマットを用いるインビトロ結合アッセイ（たとえばジャーカット細胞またはラージ細胞のＣＤ３ｘＣＤ２０抗体への結合を評価する）、またはほぼ同様のアッセイで測定すると、約６０ｎＭ未満のＥＣ50値でジャーカット細胞（ＣＤ３＋）及びラージ細胞（ＣＤ２０＋）に結合する、抗ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体を含む。ある実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、たとえば本明細書の実施例４で定義するアッセイフォーマットを用いるインビトロ結合アッセイまたはほぼ同様のアッセイで測定すると、細胞（たとえばジャーカット細胞及び／またはラージ細胞）表面のＣＤ３またはＣＤ２０に、約７５ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６５ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、または約２５ｎＭ未満のＥＣ50値で結合する。
本発明は、ヒトＣＤ３とヒトＣＤ２０に同時に結合できる二特異性抗原結合分子（たとえば二特異性抗体）を含む。ある実施形態によると、本発明の二特異性抗原結合分子は、ＣＤ３及び／またはＣＤ２０を発現する細胞と特異的に相互作用する。二特異性抗原結合分子がＣＤ３及び／またはＣＤ２０を発現する細胞に結合する程度は、本明細書の実施例４で説明するように、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）で評価できる。たとえば、本発明は、ＣＤ３を発現するヒトＴ細胞株（たとえばジャーカット）、ＣＤ２０を発現するヒトＢ細胞株（たとえばラージ）、及び霊長類Ｔ細胞（たとえばカニクイザル末梢血単核球［ＰＢＭＣ］）に特異的に結合する二特異性抗原結合分子を含む。本発明の上述の任意の細胞及び細胞株に、実施例４で示すようなＦＡＣＳアッセイまたはほぼ同様のアッセイで決定される約８．７４ｘ１０-6〜約５．９９ｘ１０-8またはそれ以下のＥＣ50値で結合する二特異性抗原結合分子を含む。
本発明は、ヒトＣＤ３に高親和力で結合する二特異性抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、所望の治療コンテクスト及び具体的な目標特性によっては、中程度のまたは低い親和力でヒトＣＤ３に結合する二特異性抗体及びその抗原結合フラグメントも含む。たとえば、１本のアームはＣＤ３に結合し、もう１本のアームは標的抗原（たとえばＣＤ２０）に結合する二特異性抗原結合分子の文脈では、標的抗原結合アームは高親和力で標的抗原に結合するが、抗ＣＤ３アームは単に中程度のまたは低い親和力でヒトＣＤ３に結合するのが望ましいこともあり得る。こうすれば、抗原結合分子は、標的抗原を発現している細胞を優先的に標的化するが、一般の／非標的化ＣＤ３結合及びそれに伴う有害な副作用を回避することができる。
本発明は、ヒトＣＤ３に結合し、Ｔ細胞が媒介する殺腫瘍細胞を誘導する抗体及びその抗原結合フラグメントも含む。たとえば、本発明は、たとえば本明細書の実施例５で定義するアッセイフォーマットを用いるインビトロのＴ細胞媒介性の殺腫瘍細胞アッセイ（たとえば抗ＣＤ３抗体の存在下でラージ腫瘍細胞がヒトＰＢＭＣにより死滅する程度を評価する）、またはほぼ同様のアッセイで測定すると約６０ｐＭ未満のＥＣ50でＴ細胞が媒介する殺腫瘍細胞を誘導する、抗ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体を含む。ある実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、たとえば本明細書の実施例５で定義するアッセイフォーマットを用いるインビトロＴ細胞媒介性の殺腫瘍細胞アッセイ、またはほぼ同様のアッセイで測定すると約５６ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４５ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３５ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２５ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、または約１ｐＭ未満のＥＣ50値で、Ｔ細胞媒介性の殺腫瘍細胞（たとえばＰＢＭＣが媒介する殺ラージ細胞）を誘導する。
本発明はまた、ヒトＣＤ３／ＣＤ２０に結合し補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導するが、ただしその程度は野生型ＩｇＧのＦｃドメインを有する抗体ほどではない、抗体及びその抗原結合フラグメントも含む。たとえば、本発明は、たとえば本明細書の実施例６で定義するアッセイフォーマットを用いるインビトロＴ細胞媒介性の殺腫瘍細胞アッセイ（たとえば補体及び抗ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体の存在下での殺標的細胞（ラージまたはＤａｕｄｉ）の程度を評価する）、またはほぼ同様のアッセイで測定すると約５０％未満の細胞傷害性パーセント（細胞傷害性％）で、ラージまたはＤａｕｄｉ（ＣＤ２０発現）細胞のＣＤＣによる殺滅を誘導する、抗ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体を含む。ある実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、たとえば本明細書の実施例６で定義するアッセイフォーマットを用いるインビトロ補体媒介性の殺細胞アッセイ、またはほぼ同様のアッセイで測定すると、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満の細胞傷害性％、バックグラウンド細胞傷害性未満、または検出不能な細胞傷害性で、ＣＤＣによる殺細胞（たとえば補体媒介性のラージまたはＤａｕｄｉ細胞殺滅）を誘導する。
本発明はまた、ヒトＣＤ３／ＣＤ２０に結合するが、野生型ＩｇＧのＦｃドメインを有する抗体と比べて著しく抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するわけではない、抗体及びその抗原結合フラグメントも含む。たとえば、本発明は、たとえば本明細書の実施例７で定義するアッセイフォーマットを用いるインビトロＮＫ細胞媒介性の殺細胞アッセイ（たとえばＮＫ細胞及び抗ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体の存在下での標的細胞（ラージまたはＤａｕｄｉ）殺滅の程度を評価する）、またはほぼ同様のアッセイで測定すると、約２０％未満（またはバックグラウンド細胞傷害性未満）の細胞傷害性パーセント（細胞傷害性％）にたいしてラージまたはＤａｕｄｉ（ＣＤ２０発現）細胞を死滅させない抗ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体を含む。ほぼ同様のアッセイには、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、またはその他のＦｃγＲＩＩＩ発現細胞、たとえばバリアントＦｃγＲＩＩＩ発現細胞の存在が含まれ得る。ある実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、たとえば本明細書の実施例７で定義するアッセイフォーマットを用いるインビトロＦｃγＲＩＩＩ媒介性の殺細胞アッセイ、またはほぼ同様のアッセイで測定すると、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満の細胞傷害性％、バックグラウンド細胞傷害性未満、または検出不能な細胞傷害活性など、検出できるＡＤＣＣ活性（たとえばＮＫ細胞またはＦｃγＲＩＩＩ媒介性のラージまたはＤａｕｄｉ細胞殺滅）を示さない。
ある実施形態によると、本発明は、たとえば本明細書の実施例８で定義するアッセイフォーマットを用いて表面プラズモン共鳴で測定すると、約２３．５μＭ未満のＫDで（たとえば２５℃で）ヒトＦｃγＲＩＩＡに結合する抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、たとえば本明細書の実施例８で定義するアッセイフォーマット（たとえばｍＡｂ捕捉または抗原捕捉フォーマット）を用いる表面プラズモン共鳴、またはほぼ同様のアッセイにより測定すると、約２０．５μＭ未満、約２０μＭ未満、約１９．３μＭ未満、約１８μＭ未満、約１７μＭ未満、約１６μＭ未満、約１５μＭ未満、約１０μＭ未満、約９μＭ未満、約８μＭ未満、約７μＭ未満、約６μＭ未満、約５μＭ未満、約４μＭ未満、約３μＭ未満、約２μＭ未満、約１μＭ未満、約９００ｎＭ未満、約８００ｎＭ未満、または約７００ｎＭ未満のＫDでＦｃγＲＩＩＡに結合する。
ある実施形態によると、本発明は、たとえば本明細書の実施例８で定義するアッセイフォーマットを用いる表面プラズモン共鳴で測定すると、約２３３μＭ未満のＫDで（たとえば２５℃で）ヒトＦｃγＲＩＩＢに結合する抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、たとえば本明細書の実施例８で定義するアッセイフォーマット（たとえばｍＡｂ捕捉または抗原捕捉フォーマット）を用いる表面プラズモン共鳴、またはほぼ同様のアッセイで測定すると、約２００μＭ未満、約１９０μＭ未満、約１８０μＭ未満、約１７０μＭ未満、約１６０μＭ未満、約１５０μＭ未満、約１４０μＭ未満、約１３０μＭ未満、約１２５μＭ未満、約１２３μＭ未満、約１２０μＭ未満、約１１０μＭ未満、約１００μＭ未満、約９０μＭ未満、約８０μＭ未満、約７０μＭ未満、約６０μＭ未満、約５０μＭ未満、または約４０μＭ未満のＫDでＦｃγＲＩＩＢに結合する。
本発明はまた、たとえば本明細書の実施例９で定義するアッセイフォーマットを用いる、２５℃または３７℃の表面プラズモン共鳴、またはほぼ同様のアッセイで測定すると、約８日よりも長い解離半減期（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ（ｔ１／２））でＣＤ３ｘＣＤ２０に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントも含む。ある実施形態では、抗体は、たとえば本明細書の実施例９で定義するアッセイフォーマット（たとえばｍＡｂ捕捉または抗原捕捉フォーマット）を用いる、２５℃または３７℃の表面プラズモン共鳴、またはほぼ同様のアッセイで測定すると、約５日よりも長い、６日よりも長い、約７日よりも長い、約８日よりも長い、約９日よりも長い、約１０日よりも長い、約１１日よりも長い、約１２日よりも長い、約１３日よりも長い、約１４日よりも長い、約１５日よりも長い、または約２０日よりも長いｔ１／２を示す。
本発明はまた、（ａ）インビトロでＰＢＭＣ増殖を誘導するアッセイ、（ｂ）ＣＤＣ細胞傷害アッセイ（たとえば本明細書の実施例６を参照のこと）、（ｄ）ＡＤＣＣアッセイ（たとえば本明細書の実施例７を参照のこと）からなる群より選択される１つ以上のアッセイで実質的な活性を示さない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子も含む。
本発明はまた、（ａ）カニクイザルのＢ細胞減少アッセイ（たとえばＣＤ４５＋／ＣＤ２０＋Ｂ細胞）（たとえば本明細書の実施例１０及び１１を参照のこと）、（ｂ）免疫不全マウスモデルにおけるＢ細胞の腫瘍体積（たとえばラージ腫瘍体積）縮小アッセイ（たとえば実施例１２Ａを参照のこと）、及び（ｃ）定着腫瘍を有するマウスモデルにおける腫瘍退縮アッセイ（たとえば実施例１２Ｂを参照のこと）からなる群より選択される１つ以上のアッセイで、かなりの活性を示す抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子も含む。
本発明は、対象におけるＢ細胞を減少させることができる抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子を含む（たとえば実施例１０を参照のこと）。たとえば、ある実施形態によると、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子が提供され、ここで該二特異性抗原結合分子の対象への単回投与（たとえば約１ｍｇ／ｋｇの、約０．９ｍｇ／ｋｇの、約０．８ｍｇ／ｋｇの、約０．７ｍｇ／ｋｇの、約０．６ｍｇ／ｋｇの、約０．５ｍｇ／ｋｇの、約０．４ｍｇ／ｋｇの、約０．３ｍｇ／ｋｇの、約０．２ｍｇ／ｋｇの、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、またはそれ未満の用量）によって、対象における（たとえば対象から採取した血液試料中の）Ｂ細胞数が、検出可能レベル未満にまで減少する。ある実施形態では、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子の約０．１ｍｇ／ｋｇ用量の単回投与により、該二特異性抗原結合分子を対象に投与してから約７日目には、約６日目には、約５日目には、約４日目には、約３日目には、約２日目には、または約１日目には、対象におけるＢ細胞数が検出可能レベル未満にまで減少する。ある実施形態によると、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子の約０．０１ｍｇ／ｋｇ用量の単回投与により、投与後少なくとも約７日まで、８日まで、９日まで、１０日まで、１１日まで、１２日まで、１３日まで、１４日まで、１５日まで、１６日まで、１７日まで、またはそれよりも長く、Ｂ細胞数が検出可能レベル未満に維持される。本明細書では、「ｂｅｌｏｗ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｌｅｖｅｌｓ（検出可能レベル未満）」という表現は、標準的なＢ細胞検出アッセイ、たとえば本明細書の実施例１０で示すようなＢ細胞マーカーのＦＡＣＳアッセイにより、対象から採取した血液試料中に直接的にも間接的にもＢ細胞が検出されないことを意味する。
あるいは、単回の第１の用量を低用量で、たとえば１０μｇ、または３０μｇ、または１００μｇで投与し、しばらく時間が経過した後に第２の用量を第１の用量よりも高い用量で、たとえば２倍または３倍高い用量で投与して、患者におけるサイトカイン急増を予防、軽減または寛解する。患者における「ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｏｒｍ（サイトカイン急増）」を軽減するということは、サイトカインカスケードまたは高サイトカイン血症の作用を軽減することを指し、そのようなネガティブな免疫反応は、限定ではないが、サイトカインと白血球間のポジティブ・フィードバックループにより、及び／または様々なサイトカインのレベルが非常に高くなることにより生じ得る。
本明細書の実施例２０によると、第１の（初期）用量の本発明の二特異性抗原結合分子（たとえばＡｂ１）が投与され、一定の時間が経ってから、次の第２の用量が投与されるが、ここで第２の用量は第１の用量を上回る（第１の用量よりも多い）。いくつかの実施形態では、第２の用量は、第１の用量よりも約２倍多く、または約３倍多い。別の実施形態では、二特異性抗原結合分子は、第１の用量で、連続して４週間など、連続して何週間か毎週投与される。別の実施形態では、第１の用量は毎週投与され、次いで追加期間は月用量で（または月用量を指定回数で）投与される。いくつかの実施形態では、第１の用量の指定用法に続いて第２の用量が毎週投与され、次いで追加期間は月用量で投与される。いくつかの実施形態では、第１の（初期）用量は１０μｇであり、第２の用量は３０μｇである。いくつかの実施形態では、第１の（初期）用量は３０μｇであり、第２の用量は１００μｇである。他の実施形態では、第１の（初期）用量は１００μｇであり、第２の用量は３００μｇである。他の実施形態では、第１の（初期）用量は３００μｇであり、第２の用量は１００μｇである。他の実施形態では、第１の（初期）用量は１０００μｇであり、第２の用量は２０００μｇである。他の実施形態では、第１の（初期）用量は２０００μｇであり、第２の用量は３０００μｇである。他の実施形態では、第１の（初期）用量は３０００μｇであり、第２の用量は４０００μｇである。他の実施形態では、第１の（初期）用量は４０００μｇであり、第２の用量は５０００μｇである。他の実施形態では、第１の（初期）用量は５０００μｇであり、第２の用量は６０００μｇである。他の実施形態では、第１の（初期）用量は６０００μｇであり、第２の用量は７０００μｇである。他の実施形態では、第１の（初期）用量は７０００μｇであり、第２の用量は８０００μｇである。
本発明は、対象に投与されるとＴ細胞の一過性のみの減少を生じさせる抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子も提供する。たとえば、提供する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与されると、投与後１日目にＴ細胞数を減少させるが、マイクロリットル当たりのＴ細胞数は、その後（たとえば投与後約２日目、４日目、７日目、１４日目、２８日目には、またはそれよりも後には）回復する。たとえば本発明は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子を提供し、ここで約０．０１ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇの用量の抗原結合分子を対象に投与してから約４日目〜約７日目に該対象から採取した血液のマイクロリットル当たりのＴ細胞数は、標準的なＴ細胞検出アッセイ、たとえば本明細書の実施例１０で示すようなＴ細胞マーカーのＦＡＣＳアッセイで検出すると、該二特異性抗原結合分子の投与前に該対象から採取した血液のマイクロリットル当たりのＴ細胞数と等しいかまたはそれよりも増えている。
エピトープマッピング及び関連技術
本発明の抗原結合分子が結合するＣＤ３またはＣＤ２０のエピトープは、ＣＤ３タンパク質の１つの連なった配列の３アミノ酸以上（たとえば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）からなり得る。あるいは、エピトープは、ＣＤ３またはＣＤ２０の連なっていない複数のアミノ酸（またはアミノ酸配列）からなり得る。本発明の抗体は、１本のＣＤ３鎖（たとえばＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタまたはＣＤ３ガンマ）中に含まれるアミノ酸と相互作用でき、または２本以上の異なるＣＤ３鎖のアミノ酸と相互作用できる。「エピトープ」という用語は、本明細書では、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域の特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。１つの抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は抗原の異なるエリアに結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは立体構造的かまたは直線的であり得る。立体構造的エピトープは、直線的ポリペプチド鎖の異なるセグメントの空間的に互い違いのアミノ酸により作られる。直線的エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基により作られるものである。ある状況では、エピトープは、抗原上でサッカライド、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
当業者に既知の様々な技法を用いて、抗体の抗原結合ドメインが、ポリペプチドまたはタンパク質中の「１つ以上のアミノ酸と相互作用」するかどうかを決定することができる。例示的な技法としては、たとえば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．， ＮＹ）で説明されているようなルーチンのクロスブロッキングアッセイ、アラニンスキャニング変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ， ２００４， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３−４６３）、及びペプチド切断分析が挙げられる。それに加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出及び抗原化学修飾などの方法も用いられ得る（Ｔｏｍｅｒ， ２０００， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７−４９６）。抗体の抗原結合ドメインが相互作用するポリペプチド中のアミノ酸を特定するのに用いられ得る別の方法は、質量分析で検出される水素／重水素交換である。一般には、水素／重水素交換法は、対象のタンパク質を重水素標識し、続いて重水素標識したタンパク質に抗体を結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水中に移して、抗体保護された残基（重水素標識されたままである）を除く全残基で水素−重水素交換を生じさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及び質量分析に供し、そうすることで、抗体が特異的に相互作用するアミノ酸に相当する重水素標識された残基が明らかになる。たとえばＥｈｒｉｎｇ （１９９９） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２−２５９； Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （２００１） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７３：２５６Ａ−２６５Ａを参照されたい。抗原／抗体複合体のＸ線結晶解析も、エピトープマッピングのために用いることができる。
本発明はさらに、本明細書で説明する具体的な例示的抗体（たとえば本明細書の表１に示すアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＣＤ３抗体を含む。同様に、本発明はまた、本明細書で説明する具体的な例示的抗体（たとえば本明細書の表１に示すアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかとＣＤ３への結合を競う抗ＣＤ３抗体も含む。
本発明はまた、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン及びヒトＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二特異性抗原結合分子も含み、ここで第１の抗原結合ドメインは、本明細書で説明する具体的な例示的ＣＤ３特異的抗原結合ドメインと同じＣＤ３のエピトープに結合し、及び／または、第２の抗原結合ドメインは、本明細書で説明する具体的な例示的ＣＤ２０特異的抗原結合ドメインと同じＣＤ２０のエピトープに結合する。
同様に、本発明はまた、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン及びヒトＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二特異性抗原結合分子も含み、ここで第１の抗原結合ドメインは、本明細書で説明する具体的な例示的ＣＤ３特異的抗原結合ドメインのいずれかとＣＤ３への結合を競い、及び／または、第２の抗原結合ドメインは、本明細書で説明する具体的な例示的ＣＤ２０特異的抗原結合ドメインのいずれかとＣＤ２０への結合を競う。
特定の抗原結合分子（たとえば抗体）またはその抗原結合ドメインが、本発明の基準抗原結合分子と同じエピトープに結合するのか、結合を競うのかは、当技術分野のルーチンの方法により、容易に決定できる。たとえば、試験抗体が、本発明の基準二特異性抗原結合分子と同じＣＤ３（またはＣＤ２０）のエピトープに結合するかどうかを決定する場合、基準二特異性分子をまずはＣＤ３タンパク質（またはＣＤ２０タンパク質）に結合させる。次に、試験抗体がＣＤ３（またはＣＤ２０）分子に結合する能力を評価する。試験抗体が、基準二特異性抗原結合分子の飽和結合に続いてＣＤ３（またはＣＤ２０）に結合できる場合、試験抗体は基準二特異性抗原結合分子とは異なるＣＤ３（またはＣＤ２０）のエピトープに結合すると判断できる。一方、試験抗体が、基準二特異性抗原結合分子の飽和結合に続いてＣＤ３（またはＣＤ２０）分子に結合できない場合、試験抗体は、本発明の基準二特異性抗原結合分子が結合したエピトープと同じＣＤ３（またはＣＤ２０）のエピトープに結合し得る。次に、さらなるルーチンの実験（たとえばペプチド変異及び結合分析）を実施して、試験抗体の結合が観察されなかったのは、現に基準二特異性抗原結合分子と同じエピトープに結合するからか、または立体的阻害（あるいは別の現象）のせいで結合が観察できなかったのかを確認できる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリーまたは当技術分野で利用可能な任意の他の定量もしくは定性抗体結合アッセイにより実施できる。本発明のある実施形態によると、結合競合アッセイで測定すると、２種の抗原結合タンパク質のうち一方が他方をたとえば１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍上回る場合に、他方の抗原結合タンパク質のエピトープ結合を少なくとも５０％阻害していれば、しかし好ましくは７５％、９０％または９９％阻害していれば、これらの抗原結合タンパク質は同じ（または重複する）エピトープに結合する（たとえばＪｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９０：５０：１４９５−１５０２を参照のこと）。あるいは、２種の抗原結合タンパク質は、一方の抗原結合タンパク質の結合を減じるか排する抗原のアミノ酸変異の事実上全てが、他方の抗原結合タンパク質の結合も減じるか排する場合に、同じエピトープに結合すると考えられる。２種の抗原結合タンパク質は、一方の抗原結合タンパク質の結合を減じるか排するアミノ酸変異のサブセットだけが、他方の抗原結合タンパク質の結合も減じるか排する場合に、「ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅｓ（重複するエピトープ）」を有すると考えられる。
抗体またはその抗原結合ドメインが基準抗原結合分子と結合を競うかどうかを決定するには、上述の結合手順を二方向で実施する。第１の方向では、基準抗原結合分子をＣＤ３タンパク質（またはＣＤ２０タンパク質）に飽和条件下で結合させ、次いで試験抗体のＣＤ３（またはＣＤ２０）分子への結合を評価する。第２の方向では、試験抗体をＣＤ３（またはＣＤ２０）分子に飽和条件下で結合させ、次いで基準抗原結合分子のＣＤ３（またはＣＤ２０）分子への結合を評価する。両方の方向で第１の（飽和）抗原結合分子だけがＣＤ３（またはＣＤ２０）分子に結合できる場合、試験抗体と基準抗原結合分子はＣＤ３（またはＣＤ２０）への結合を競うと判定される。当業者なら理解しようが、基準抗原結合分子と結合を競う抗体は、必ずしも基準抗体と同じエピトープに結合しなくてもよく、重複するかまたは隣接するエピトープに結合することにより、基準抗体の結合を立体的に阻害し得る。
抗原結合ドメインの調製及び二特異性分子の構成
特定の抗原に対し特異的な抗原結合ドメインは、当技術分野のあらゆる抗体生成技術により調製できる。異なる２種の抗原（たとえばＣＤ３とＣＤ２０）に特異的な２種の抗原結合ドメインが得られたら、ルーチンの方法によりこれらを互いに対して適切に配置して、本発明の二特異性抗原結合分子を生産できる。（本発明の二特異性抗原結合分子の構成に使用できる例示的二特異性抗体フォーマットについて、本明細書の別の箇所で説明する。）ある実施形態では、本発明の多特異性抗原結合分子の１つ以上の個々のコンポーネント（たとえば重鎖や軽鎖）は、キメラヒト化または完全ヒト抗体に由来する。そのような抗体の作製方法は当技術分野では周知である。たとえば、本発明の二特異性抗原結合分子の１つ以上の重鎖及び／または軽鎖は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を用いて調製できる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（または他の任意のヒト抗体生成技術）を用いて、最初に、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、特定の抗原（たとえばＣＤ３またはＣＤ２０）に対し高親和性のキメラ抗体を単離する。抗体の特徴を決定し、親和性、選択性、エピトープその他などの所望の特徴について選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域で置換して、本発明の二特異性抗原結合分子に組み込むことができる完全ヒト重鎖及び／または軽鎖を生成する。
遺伝子改変動物を用いてヒト二特異性抗原結合分子を作成できる。たとえば、内在性マウス免疫グロブリン軽鎖可変配列の再配置及び発現ができない遺伝子修飾マウスを用いることができ、ここで該マウスは、内在性マウスカッパ遺伝子座のマウスカッパ定常遺伝子に機能的に連結されたヒト免疫グロブリン配列によりコードされる１つまたは２つのヒト軽鎖可変ドメインのみを発現する。そのような遺伝子修飾マウスを使って、異なる２種のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントのうちの１つに由来する可変ドメインを含む同一の軽鎖に結合する異なる２種の重鎖を含む完全ヒト二特異性抗原結合分子を生産できる。（そのような遺伝子改変マウス及びそれを用いての二特異性抗原結合分子の生産に関する詳細は、たとえばＵＳ２０１１／０１９５４５４を参照されたい。）
生物学的均等物
本発明は、本明細書で開示する例示的分子とは異なるアミノ酸配列を有するが、ＣＤ３及び／またはＣＤ２０に結合する能力は保持している抗原結合分子を含む。そのようなバリアント分子は、親配列と比べて１つ以上のアミノ酸付加、欠失、または置換を含み得るが、上述した二特異性抗原結合分子と実質上均等な生物活性を示し得る。
本発明は、本明細書で示すいずれかの例示的抗原結合分子と生物学的に均等な抗原結合分子を含む。２種の抗原結合タンパク質または抗体は、たとえばそれらが、単回用量でも反復用量でも、同様の実験条件で同じモル量で投与された場合に、吸収率や吸収度に大差がない製薬上の均等物または製薬上の代替物であれば、生物学的均等物とみなされる。一部の抗原結合タンパク質は、吸収度は均等であるが吸収率は異なる場合でも均等物または製薬上の代替物とみなされ得るが、それは、そのような吸収率の差は意図的なものであり標識化に反映されており、たとえば長期使用での有効な体内薬物濃度の達成に関して重要ではなく、試験対象である特定の製薬にとって医療上重要ではないとみなされるからである。
一実施形態では、２種の抗原結合タンパク質は、安全性、純度及び力価において臨床的な有意差がなければ、生物学的に均等である。
一実施形態では、２種の抗原結合タンパク質は、基準産物と生体産物とを１回以上入れ替えても、そのような入替なしに継続治療した場合と比べて免疫原性の臨床的に大きな変化または有効性の低下といった予測される有害事象リスクの上昇が患者に生じなければ、生物学的に均等である。
一実施形態では、２種の抗原結合タンパク質は、両方が、使用条件（単数または複数）に関し、知られている限り共通の作用機構（単数または複数）により作用する場合、生物学的に均等である。
生物学的均等性は、インビボ及びインビトロの方法で実証できる。生物学的均等性の測定法としては、たとえば（ａ）ヒトまたは他の哺乳動物の血液、血漿、血清、または他の体液中、抗体濃度またはその代謝物を時間関数として測定する、インビボの試験、（ｂ）ヒトのインビボの生体利用能データと相関付けられており該データを妥当に予測するインビトロの試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な短時間の薬理効果を時間関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳動物のインビボの試験、及び（ｄ）抗原結合タンパク質の安全性、有効性または生体利用能、あるいは生物学的均等性を決定する、十分に制御された臨床試験、が挙げられる。
本明細書で示す例示的二特異性抗原結合分子の生物学的に均等なバリアントは、たとえば、残基または配列の様々な置換をすることにより、あるいは生物活性に不要な末端または内部残基または配列の欠失により構成できる。たとえば、生物活性に必須ではないシステイン残基を削除するかまたは他のアミノ酸と置換して、復元時に不要または不適当な分子内ジスルフィド架橋が形成しないようにできる。他の文脈では、生物学的に均等な抗原結合タンパク質は、分子のグリコシル化特徴を修飾するアミノ酸の変化、たとえばグリコシル化を排除または除去する変異を含む、本明細書で示す例示的二特異性抗原結合分子のバリアントを含み得る。
種選択性及び種交差反応性
本発明のある実施形態によると、ヒトＣＤ３には結合するが、他の種のＣＤ３には結合しない抗原結合分子が提供される。また、ヒトＣＤ２０には結合するが、他の種のＣＤ２０には結合しない抗原結合分子も提供される。本発明はまた、ヒトＣＤ３及び１種以上の非ヒト種のＣＤ３に結合する抗原結合分子、及び／またはヒトＣＤ２０及び１種以上の非ヒト種のＣＤ２０に結合する抗原結合分子も含む。
本発明のある例示的実施形態によると、提供される抗原結合分子は、ヒトＣＤ３及び／またはヒトＣＤ２０には結合するが、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのうち１種以上のＣＤ３及び／またはＣＤ２０には結合する場合もあるし、しない場合もある。たとえば、本発明のある特定の例示的な実施形態では、ヒトＣＤ３及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びヒトＣＤ２０に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二特異性抗原結合分子が提供される。
免疫複合体
本発明は、細胞毒、化学治療剤、免疫抑制剤、または放射性同位体などの治療部分に結合させた抗原結合分子（「ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ（免疫複合体）」）を含む。細胞毒性剤としては、細胞に有害なあらゆる剤が挙げられる。免疫複合体を形成するための好適な細胞毒性剤及び化学治療剤の諸例が当技術分野で知られている（たとえばＷＯ０５／１０３０８１を参照のこと）。
治療剤及び投与
本明細書では、「ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ（有効量）」及び「ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ（治療有効量）」という用語は、毒性、刺激、またはアレルギー反応などの過度の有害な副作用なく所望の治療効果を得るのに十分な活性治療剤の量を指す。具体的な「有効量」は、当然ながら、治療対象の具体的な状態、患者の体調、治療対象の動物の種類、治療期間、（あれば）同時治療の性質、ならびに使用される具体的な製剤及び化合物またはその誘導体の構造といった要因により変わってくる。ここでは、量は、限定ではないが、（ａ）腫瘍（たとえばＢ細胞癌）増殖の阻害、及び（ｂ）Ｂ細胞癌の回復（ｒｅｖｅｒｓａｌ）または安定化のうちの１つ以上が得られた場合に治療的に有効であるとされる。
患者に投与される抗原結合分子の用量は、患者の年齢とサイズ、標的とする疾患、状態、投与経路などにより変わり得る。好ましい用量は、一般に、体重または体表面積により計算される。本発明の二特異性抗原結合分子を成体患者の治療に用いる場合、本発明の二特異性抗原結合分子を、通常、単回用量で、０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重で静脈内投与すると有益であり得る。状態の重度によっては、治療の頻度と期間を調節できる。二特異性抗原結合分子を投与する有効量とスケジュールは、経験的に決定することができ、たとえば、患者の進捗を定期診断でチェックし、それに応じて用量を調節することができる。さらに、当技術分野で周知の方法により種間の用量スケーリングをすることもできる（たとえばＭｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｒｅｓ． ８：１３５１）。
たとえばリポソーム封入、マイクロ粒子、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現できる組換細胞、受容体媒介性飲食作用など、さまざまな送達システムが知られており、本発明の医薬組成物を投与するのに使用できる（たとえばＷｕ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）。導入法としては、限定ではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、及び経口経路が挙げられる。組成物は、任意の便利な経路で、たとえば点滴またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜ライニング（たとえば口腔粘膜、直腸及び小腸粘膜他）からの吸収により投与され得、また、他の生物活性剤と一緒に投与され得る。投与は、全身または局所投与であり得る。
本発明の医薬組成物は、標準的な針とシリンジで皮下または静脈内投与できる。それに加えて、皮下送達に関し、ペン型送達デバイスは本発明の医薬組成物を容易に送達する用途がある。そのようなペン型送達デバイスは、再利用式でも使い捨て式でもよい。再利用可能ペン型送達デバイスは、一般に、医薬組成物を収容する交換式カートリッジを用いる。カートリッジ内の医薬組成物がすべて投与されてカートリッジが空になると、空のカートリッジを簡単に廃棄して、医薬組成物を収容する新しいカートリッジと交換できる。こうしてペン型送達デバイスを再利用できる。使い捨てのペン型送達デバイスの場合、交換式カートリッジは存在しない。しかし使い捨てペン型送達デバイスは、その貯蔵部に医薬組成物が予め充填されている。貯蔵部の医薬組成物がなくなると、デバイス全体が廃棄される。
多くの再利用可能ペン型及び自動注射型の送達デバイスが、本発明の医薬組成物の皮下送達で用途を有する。限定ではないが、例としては、ほんの一部だが、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（英国ウッドストックのＯｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ社）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（スイス国ＢｅｒｇｄｏｒｆのＤｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（インディアナ州インディアナポリスのＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．社）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（デンマーク国コペンハーゲンのＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（デンマーク国コペンハーゲンのＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社）、ＢＤ（商標）ペン（ニュージャージー州フランクリンレイクスのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ドイツ国フランクフルトのｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ社）が挙げられる。本発明の医薬組成物の皮下送達で用途を有する使い捨てペン型送達デバイスの非限定的な例としては、ほんの一部だが、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ社）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（カリフォルニア州サウザンドオークスのＡｍｇｅｎ社）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（ドイツ国シュタットガルトのＨａｓｅｌｍｅｉｅｒ社）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、ならびにＨＵＭＩＲＡ（商標）Ｐｅｎ（イリノイ州アボットパークのＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ社）が挙げられる。
ある状況では、医薬組成物は、放出制御システムで送達され得る。一実施形態では、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，前掲； Ｓｅｆｔｏｎ， １９８７， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１を参照のこと）。別の実施形態では、ポリマー材料が使用され得る。Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ （ｅｄｓ．）， １９７４， ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態では、放出制御システムは組成物の標的の近傍に置かれ得るので、全身用量のほんの僅かしか要しない（たとえばＧｏｏｄｓｏｎ， １９８４， ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ｓｕｐｒａ， ｖｏｌ． ２， ｐｐ． １１５−１３８を参照のこと）。他の放出制御システムはＬａｎｇｅｒ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３の研究で論じられている。
注射用調製物は、静脈内、皮下、皮内及び筋内注射、点滴などの剤形を含み得る。これらの注射用調製物は、一般に知られている方法で調製できる。たとえば、注射用調製物は、上述の抗体またはその塩を、たとえば、一般的に注射用に使用される滅菌水系溶媒または油系溶媒に溶解させ、懸濁させ、または乳濁させることにより調製され得る。注射用の水系溶媒としては、たとえば、グルコースや他の補助剤を含む等張液である生理食塩水などがあり、これらを適切な可溶化剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［たとえばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素添加ひまし油付加のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ））］などと併せて用いることができる。油系溶媒としては、たとえば、ゴマ油、大豆油などが使用され、これらは安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と併せて用いることができる。こうして調製された注射剤は、好ましくは、適切なアンプルに充填される。
有利には、上述の経口または非経口使用される医薬組成物は、活性成分の用量に合わせた単位用量の剤形に調製される。そのような単位用量の剤形としては、たとえば、錠剤、丸薬、カプセル剤、注射剤（たとえばアンプル、バイアル）、座薬などが挙げられる。
抗原結合分子の治療用途
本発明は、抗ＣＤ３抗体またはＣＤ３及び標的抗原（たとえばＣＤ２０）に特異的に結合する二特異性抗原結合分子を含む治療組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を含む。治療組成物は、本明細書で開示するいずれかの抗体または二特異性抗原結合分子、及び製薬上許容される担体または希釈剤を含み得る。本明細書では、「ａ ｓｕｂｊｅｃｔ ｉｎ ｎｅｅｄ ｔｈｅｒｅｏｆ（〜を必要とする対象）」という表現は、癌の症状または徴候を１つ以上示している（たとえば対象は腫瘍を発現しているか、以下に記載する癌のいずれかに罹患している）ヒトまたは非ヒト動物、あるいはそうではなく、ＣＤ２０活性の阻害もしくは低減またはＣＤ２０＋ Ｂ細胞の減少またはＣＤ２０＋ Ｂ細胞腫瘍の退縮により恩恵を受けるであろうヒトまたは非ヒト動物を意味する。
本発明の抗体及び二特異性抗原結合分子（及びそれを含む治療組成物）は、免疫応答の刺激、活性化及び／または標的化が有益となるようなあらゆる疾患または障害の治療にとりわけ有用である。具体的には、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子は、ＣＤ２０発現または活性またはＣＤ２０＋ Ｂ細胞の増殖と関連があるかまたはそれが媒介するあらゆる疾患または障害の治療、予防及び／または寛解に使用され得る。本発明の治療法が得られる作用機構には、エフェクター細胞の存在下で、たとえばアポトーシス、貪食により、またはこれらの機構もしくは同様の細胞傷害機構の２つ以上の組合せにより、ＣＤ２０を発現している細胞を殺滅することが含まれる。本発明の二特異性抗原結合分子を用いて阻害または殺滅され得る、ＣＤ２０を発現している細胞としては、たとえば、腫瘍原性Ｂ細胞が挙げられる。
腫瘍負荷の低減または腫瘍退縮には、対象における腫瘍（単数または複数）の部分的または完全な消滅が含まれる。腫瘍退縮は、腫瘍負荷の低下または疾患状態の軽症化の傾向を表すと理解される。したがって、退縮は、腫瘍サイズの低下及び／または腫瘍数の低下を含む、体内の測定可能な悪性腫瘍の進歩的な低下、排除である。腫瘍発生の低減には、追加または新規の腫瘍増殖の部分的または完全な阻害または抑制が含まれる。
本発明の抗原結合分子は、たとえば、脳や髄膜、中咽頭、肺や気管支樹、胃腸管、雌雄生殖器、筋肉、骨、皮膚や付属器、結合組織、脾臓、免疫系、細胞や骨髄を形成する血液、肝臓や泌尿器、及び眼などの特殊な感覚器などにできる原発及び／または転移腫瘍の治療に用いることができる。ある実施形態では、本発明の二特異性抗原結合分子は、次の癌の１つ以上の治療に用いられる：腎細胞癌、膵臓癌、乳癌、頭頚部癌、前立腺癌、悪性グリオーマ、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（たとえばＭＥＴ増幅性胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、小細胞肺癌、非小細胞胚癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、または黒色腫。ある例示的実施形態によると、本発明の二特異性抗原結合分子は、Ｂ細胞癌（たとえばホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫［ＮＨＬ］、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリーセル白血病、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、及び未分化大細胞リンパ腫）の治療に用いられる。
本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子は、対象における腫瘍負荷を低下させ、腫瘍を退縮させ、腫瘍増殖を阻害し、または腫瘍発生を低減させるのに十分な量で投与される。本発明のいくつかの例示的実施形態では、投与量は約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態では、投与量は約０．４ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態では、投与量は約０．０４ｍｇ／ｋｇである。さらに他の実施形態では、投与量は約０．００４ｍｇ／ｋｇである。
本発明のある実施形態によると、抗原結合分子は、抗ＣＤ２０単独治療に耐性があるかまたは効果が不十分な（たとえばリツキシマブ治療に耐性がある）Ｂ細胞リンパ腫（たとえばＮＨＬ）患者の治療に有用である。本発明の他の関連実施形態によると、抗ＣＤ２０治療抵抗性のＢ細胞リンパ腫（たとえばＮＨＬ）患者（たとえばリツキシマブ抵抗性腫瘍患者あるいは再発または抵抗性Ｂ細胞リンパ腫患者）に、本明細書で開示する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子を投与することを含む方法が提供される。当技術分野で知られている分析／診断法、たとえば腫瘍スキャニングなどにより、抗ＣＤ２０単独治療に耐性がある、効果が不十分な、または抵抗性がある腫瘍を患者が有しているかどうかを確認できる。
本発明はまた、対象における残存癌を治療する方法も含む。本明細書では、「ｒｅｓｉｄｕａｌ ｃａｎｃｅｒ（残存癌）」という用語は、抗癌剤治療後も対象に存在または残存している１つ以上の癌性細胞を意味する。
ある態様では、本発明は、ＣＤ２０の発現に関する疾患または障害（たとえばＢ細胞リンパ腫）を治療する方法を提供し、該方法は、既に抗ＣＤ２０単独治療を受けている対象に（たとえばリツキシマブなどの抗ＣＤ２０抗体を含む医薬組成物の投与後）、本明細書の別の箇所で説明する１種以上の二特異性抗原結合分子を投与することを含んでいる。たとえば、本発明は、対象が抗ＣＤ２０単独治療（たとえばリツキシマブ治療またはそれと等価の治療）を受けてから１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間または４週間、２か月、４か月、６か月、８か月、１年またはそれ以上後に、該患者に抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子を投与することを含む、Ｂ細胞リンパ腫を治療する方法を含む。
併用療法及び製剤
本発明は、本明細書で説明するいずれかの例示的抗体及び二特異性抗原結合分子と１種以上のさらなる治療剤とを併せて含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。本発明の抗原結合分子と併用されるかまたは併用投与され得る例示的なさらなる治療剤としては、たとえばＥＧＦＲアンタゴニスト（たとえば抗ＥＧＦＲ抗体［たとえばセツキシマブまたはパニツムマブ］またはＥＧＦＲの小分子阻害剤［たとえばゲフィチニブまたはエルロチニブ］）、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４などの他のＥＧＦＲファミリーメンバーのアンタゴニスト（たとえば抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３もしくは抗ＥｒｂＢ４抗体、またはＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、ＥＧＦＲｖＩＩＩアンタゴニスト（たとえばＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体）、ｃＭＥＴアンタゴニスト（たとえば抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（たとえば抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ−ｒａｆ阻害剤（たとえばベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０）、ＰＤＧＦＲ−α阻害剤（たとえば抗ＰＤＧＦＲ−α抗体）、ＰＤＧＦＲ−β阻害剤（たとえば抗ＰＤＧＦＲ−β抗体）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（たとえばＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、たとえば米国特許第７，０８７，４１１号を参照のこと（本明細書では、「ＶＥＧＦ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質）」とも呼ぶ）、抗ＶＥＧＦ抗体（たとえばベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（たとえばスニチニブ、ソラフェニブまたはパゾパニブ））、ＤＬＬ４アンタゴニスト（たとえばＵＳ２００９／０１４２３５４で開示されている抗ＤＬＬ４抗体）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（たとえばＵＳ２０１１／００２７２８６で開示されているＨ１Ｈ６８５Ｐなどの抗Ａｎｇ２抗体）、ＦＯＬＨ１アンタゴニスト（たとえば抗ＦＯＬＨ１抗体）、ＰＲＬＲアンタゴニスト（たとえば抗ＰＲＬＲ抗体）、ＳＴＥＡＰ１またはＳＴＥＡＰ２アンタゴニスト（たとえば抗ＳＴＥＡＰ１抗体または抗ＳＴＥＡＰ２抗体）、ＴＭＰＲＳＳ２アンタゴニスト（たとえば抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体）、ＭＳＬＮアンタゴニスト（たとえば抗ＭＳＬＮ抗体）、ＣＡ９アンタゴニスト（たとえば抗ＣＡ９抗体）、ウロプラキンアンタゴニスト（たとえば抗ウロプラキン抗体）、一価ＣＤ２０アンタゴニスト（たとえばリツキシマブなどの一価抗ＣＤ２０抗体）などが挙げられる。本発明の抗原結合分子と併用で有益に投与され得る他の剤としては、サイトカイン阻害剤、たとえばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８などのサイトカインまたはそれぞれの受容体に結合する小分子サイトカイン阻害剤及び抗体が挙げられる。本発明の医薬組成物（たとえば本明細書で開示する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二特異性抗原結合分子を含む医薬組成物）は、「ＩＣＥ」：イホスファミド（たとえばＩｆｅｘ（登録商標））、カルボプラチン（たとえばパラプラチン（登録商標））、エトポシド（たとえばＥｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ＶＰ−１６）；「ＤＨＡＰ」：デキサメタゾン（たとえばデカドロン（登録商標））、シタラビン（たとえばＣｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標）、シトシンアラビノシド、ａｒａ−Ｃ）、シスプラチン（たとえばＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）−ＡＱ）；及び「ＥＳＨＡＰ」：エトポシド（たとえばＥｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ＶＰ−１６）、メチルプレドニゾロン（たとえばＭｅｄｒｏｌ（登録商標））、高用量シタラビン、シスプラチン（たとえばＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）−ＡＱ）より選択される１種以上の併用治療を含む治療計画の一部としても投与され得る。
本発明は、本明細書で記載する任意の抗原結合分子と、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ−ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＦＯＬＨ１、ＰＲＬＲ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＳＬＮ、ＣＡ９、ウロプラキン、または上述の任意のサイトカインのうちの１種以上の阻害剤とを含む治療剤の組合せも含み、ここで阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディまたは抗体フラグメント（たとえばＦａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ'）2フラグメント；Ｆｄフラグメント；Ｆｖフラグメント；ｓｃＦｖ；ｄＡｂフラグメント；または他の改変分子、たとえばジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、及び最少認識ユニット）である。本発明の抗原結合分子はまた、抗ウイルス剤、抗菌剤、鎮痛剤、コルチコステロイド剤、及び／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて投与され及び／または合剤とされ得る。本発明の抗原結合分子はまた、放射線治療及び／または一般的な化学療法も含む治療計画の一部としても投与され得る。
本発明の抗原結合分子投与の直前、同時に、またはすぐ後に、追加の治療用活性コンポーネント（複数可）を投与する場合もある(本開示の目的では、そのような投与計画は、抗原結合分子を追加の治療用活性コンポーネントと「組み合わせる」投与とみなされる)。
本発明は、本発明の抗原結合分子が、本明細書の別の箇所で説明する１種以上の追加の治療用活性コンポーネント（複数可）と合剤されている、医薬組成物を含む。
投与計画
本発明のある実施形態によると、反復用量の抗原結合分子（たとえば抗ＣＤ３抗体またはＣＤ２０及びＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗原結合分子）が所定の期間を通して対象に投与され得る。本発明のこの態様による方法は、対象に反復用量の本発明の抗原結合分子を逐次投与することを含む。本明細書では、「ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ（逐次投与すること）」とは、各用量の抗原結合分子を異なる時点で対象に投与すること、所定の間隔（たとえば時間、日、週または月）を開けて、たとえば別の日に投与することを意味する。本発明は、患者に単回用量の抗原結合分子を、次に１回以上の第２の用量の抗原結合分子を、次に任意選択で１回以上の第３の用量の抗原結合分子を逐次投与することを含む、方法を含む。
「ｉｎｉｔｉａｌ ｄｏｓｅ（初期用量）」、「ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｄｏｓｅｓ（第２の用量）」、「ｔｅｒｔｉａｒｙ ｄｏｓｅｓ（第３の用量）」という用語は、本発明の抗原結合分子を投与する時間的順を指す。したがって、「初期用量」または「ｆｉｒｓｔ ｄｏｓｅ（第１の用量）」は、治療計画の最初に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）であり、「第２の用量」は初期用量の後に投与される用量であり、「第３の用量」は第２の用量の後に投与される用量である。初期の、第２の、及び第３の用量はすべて同量の抗原結合分子を含み得るが、一般に投与頻度の点で互いに異なり得る。しかし、ある実施形態では、治療期間中、初期の、第２の及び／または第３の用量に含まれる抗原結合分子の量が、互いに異なり得る（たとえば必要に応じて上下調節され得る）。ある実施形態では、２回以上の（たとえば２回、３回、４回、または５回の）用量が治療計画の初期に「ｌｏａｄｉｎｇ ｄｏｓｅｓ（初期量）」として投与され、続いてそれよりも低頻度で次の用量が（たとえば「ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｄｏｓｅｓ（維持量）」として）投与される。
第１の用量を最低限の濃度で投与し、次いで後続または第２の用量を第１の用量の２倍か３倍の濃度で投与すると、患者にとって有益であることが発見されている。
いくつかの実施形態では、第１の用量の抗原結合分子を連続して第１の期間にわたって患者に投与し、引き続いて次の第２の用量の該抗原結合分子を第２の期間にわたって患者に投与し、ここで該第２の用量は該第１の用量を上回る。他の実施形態では、第１の用量は、週に１回か２回、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、またはそれ以上にわたり投与される。別の実施形態では、第２の用量は、週１回、週２回、月１回、または月２回を、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週もしくはそれ以上、または２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月もしくはそれ以上にわたり投与される。
本発明の一例示的実施形態では、各第２の及び／または各第３の用量は、直前の用量から１〜２６週（たとえば１週、１ １／２週、２週、２ １／２週、３週、３ １／２週、４週、４ １／２週、５週、５ １／２週、６週、６ １／２週、７週、７ １／２週、８週、８ １／２週、９週、９ １／２週、１０週、１０ １／２週、１１週、１１ １／２週、１２週、１２ １／２週、１３週、１３ １／２週、１４週、１４ １／２週、１５週、１５ １／２週、１６週、１６ １／２週、１７週、１７ １／２週、１８週、１８ １／２週、１９週、１９ １／２週、２０週、２０ １／２週、２１週、２１ １／２週、２２週、２２ １／２週、２３週、２３ １／２週、２４週、２４ １／２週、２５週、２５ １／２週、２６週、２６ １／２週、またはそれ以上）後に投与される。「ｔｈｅ ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ ｄｏｓｅ（直前の用量）」という語句は、本明細書では、反復投与の連続回のうち、これから患者に投与しようとする用量の前の、間に他の用量が介在していない抗原結合分子用量を意味する。
本発明のこの態様による方法は、患者に任意の回数の第２の及び／または第３の用量の抗原結合分子（たとえばＣＤ２０及びＣＤ３に特異的に結合する二特異性抗原結合分子）を投与することを含み得る。たとえば、ある実施形態では、第２の用量は１回のみ患者に投与される。他の実施形態では、第２の用量は、２回以上（たとえば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、またはそれ以上）患者に投与される。同様に、ある実施形態では、第３の用量は１回のみ患者に投与される。他の実施形態では、第３の用量は、２回以上（たとえば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、またはそれ以上）患者に投与される。
複数の第２の用量を含む実施形態では、各第２の用量は、他の第２の用量と同じ頻度で投与され得る。たとえば、各第２の用量は、直前の用量から１〜２週間後に患者に投与され得る。同様に、複数の第３の用量を含む実施形態では、各第３の用量は、他の第３の用量と同じ頻度で投与され得る。たとえば、各第３の用量は、直前の用量から２〜４週間後に患者に投与され得る。あるいは、第２の及び／または第３の用量が患者に投与される頻度は、治療計画の期間中に変更できる。投与頻度はまた、治療期間中に、個々の患者の臨床検査後、必要に応じて、医師により調節され得る。
抗体の診断用途
本発明の抗ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体は、たとえば診断用途で、試料中のＣＤ３またはＣＤ３を発現している細胞を検出及び／または測定するのにも使用され得る。たとえば、抗ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体またはそのフラグメントを、ＣＤ３の異常発現（たとえば過剰発現、過小発現、不発現など）を特徴とする状態または疾患の診断に用いることができる。例示的ＣＤ３診断アッセイは、たとえば、患者から採取した試料と本発明の抗ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体を接触させることを含み得、ここで抗体は検出可能標識またはレポーター分子で標識されている。あるいは、未標識の抗ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体を、自体検出可能に標識された第２の抗体と組み合わせて、診断用途に用いることもできる。検出可能標識またはレポーター分子は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、または125Ｉなどの放射性同位体；フルオレセインイソチオシアナート、またはローダミンなどの蛍光または化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、またはルシファラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＣＤ３を検出または測定するのに用いられ得る具体的な例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
本発明の抗ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体はまた、同様に、試料中のＣＤ２０またはＣＤ２０を発現している細胞を検出及び／または測定するのに、またはＣＤ２０の異常発現（たとえば過剰発現、過小発現、不発現など）を特徴とする状態または疾患を診断するのにも使用され得る。
本発明においてＣＤ３またはＣＤ２０診断アッセイで使用できる試料としては、健常または病理条件下で、検出可能量のＣＤ３及び／またはＣＤ２０タンパク質、あるいはそのフラグメントを含んでいる、患者から採取できるあらゆる組織または液体試料が挙げられる。一般に、健康な患者（たとえば、ＣＤ３またはＣＤ２０の異常なレベルまたは活性と関連する疾患または状態ではない患者）から採取した特定の試料中のＣＤ３またはＣＤ２０レベルを最初に測定して、ベースラインすなわち標準のＣＤ３またはＣＤ２０レベルを設定する。次に、このＣＤ３またはＣＤ２０のベースラインレベルを、それぞれＣＤ３またはＣＤ２０関連の疾患または状態を有すると思われる個体から採取した試料中のＣＤ３レベルと比較する。
以下の諸例は、本発明の方法及び組成物をいかに作製し使用するかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために示すものであり、発明者らが意図する発明の範囲を制限するものではない。用いる数値（たとえば量、温度など）については正確さを期したが、多少の実験誤差や偏差については考慮されるべきである。特に断らないかぎり、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧かほぼ大気圧である。
実施例１．抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２０抗体の生成
抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ２０抗体を単離する方法がいくつか知られている。以下の例で用いる完全ヒト抗ＣＤ３抗体は、ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１で説明されているように、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離し、骨髄腫細胞との融合はない。
抗ＣＤ３抗体のさらなる例が本方法で使用され得、そのような抗体及びそのような抗ＣＤ３抗体の生物学的特性については２０１３年９月１９日出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／６０５１１で説明されており、その内容を参照により本明細書に援用する。例示的抗ＣＤ２０抗体及びそのような抗ＣＤ２０抗体の生物学的特性については、米国特許第７，８７９，９８４号及び２０１３年９月１９日出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／６０５１１で説明されており、それぞれ参照により本明細書に援用する。
抗ＣＤ２０抗体及びこの実施例の二特異性抗体を構成するための抗体作製方法は、米国特許第７，８７９，９８４号で説明されているとおりである。
二特異性抗体の発明の抗ＣＤ３抗原結合アーム及び抗ＣＤ２０結合アームを構成するのに用いられる重鎖及び軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を表１に示す。対応する核酸配列識別子を表２に示す。
Figure 0006681396
実施例２．ＣＤ３及びＣＤ２０に結合する二特異性抗体の生成
上述の配列を有する抗ＣＤ３特異性結合ドメイン及び抗ＣＤ２０特異性結合ドメインを含む二特異性抗体を標準的手順により構成し、抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖を、抗ＣＤ２０抗体の重鎖と組み合わせた。
したがって、この実施例にしたがい作製された二特異性抗体は、２つの別々の抗原結合ドメイン（すなわち結合アーム）を含んでいる。第１の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ３抗体由来の軽鎖可変領域（「ＣＤ３−ＶＬ」）と対をなす抗ＣＤ２０抗体由来の重鎖可変領域（「ＣＤ２０−ＶＨ」）を含む。このＣＤ２０−ＶＨ／ＣＤ３−ＶＬ対により、特異的にＣＤ２０を認識する抗原結合ドメインが生じる。第２の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ３抗体由来の軽鎖可変領域（「ＣＤ３−ＶＬ」）と対を成す抗ＣＤ３抗体由来の重鎖可変領域（「ＣＤ３−ＶＨ」）を含む。このＣＤ３−ＶＨ／ＣＤ３−ＶＬ対により、特異的にＣＤ３を認識する抗原結合ドメインが生じる。この実施例では、すべての二特異性抗体を作成するのに同じＣＤ２０−ＶＨを用いた。これを「ＣＤ２０−ＶＨ−Ａ」とする。
各重鎖の野生型重鎖定常ドメイン（ＣＨ）を組換え技法によりキメラＣＨで置き換えた。一方の結合アーム（たとえば抗ＣＤ３結合アーム）のＣＨは、そのＣＨ３領域に二特異性抗体の単離を容易にするような変異を含んでいる。
この実施例にしたがい作製される様々な二特異性抗体のコンポーネント部分の要約を表３と表４に示す。
Figure 0006681396
表５及び表６は、この実施例の二特異性抗体の様々な重鎖可変領域（表５）及び軽鎖可変領域（表６）ならびにそれらに対応するＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。
Figure 0006681396
それに加えて、表７及び表８は、この実施例の二特異性抗体の様々な重鎖可変領域（表７）、重鎖定常領域、及び軽鎖可変領域（表８）ならびにそれらに対応するＣＤＲをコードするヌクレオチド配列の配列識別子を示す。
Figure 0006681396
以下の実施例で示す実験のいくつかには、上述の二特異性抗体に加えて、以下のコントロール抗体も用いた。
コントロール抗体１：米国特許第４，３６１，５４９号で示されており、ハイブリドーマＣＲＬ−８００１（バージニア州マナサスのアメリカ培養細胞系統保存機関）から入手可能な、ヒトＴ細胞表面の抗原に対するモノクローナル抗体「ＯＫＴ−３」。
コントロール抗体２：ＢＤ Ｐｈａｒｍａｇｅｎ社Ｃａｔ＃５５０５２で入手可能な、ヒトＴリンパ球細胞のＴ３複合体のイプシロン鎖に反応する抗体「ＳＰ３４」。
コントロール抗体３：米国特許第５，７３６，１３７号で開示されている、リツキサン（リツキシマブ）の重鎖及び軽鎖配列を有する抗ＣＤ２０治療用抗体。
（コントロール）抗体４：ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体−野生型Ｆｃ（ｗｔＦｃ）としても知られるこの抗体は、上述の方法と同様に作製され、配列番号２／１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ 配列番号４−６−８−２０−２２−２４のアミノ酸配列）及び野生型ＩｇＧ１ ＣＨ領域（配列番号４５）を含む抗ＣＤ２０アーム；及び配列番号１０／１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ 配列番号１２−１４−１６−２０−２２−２４のアミノ酸配列）及び単離を容易にするためにＣＨ３ドメインに２アミノ酸修飾（配列番号４８）を有する野生型ＩｇＧ１ ＣＨ領域を含む抗ＣＤ３アームを有している。ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体−ｗｔＦｃ（抗体４）は、異なるＦｃドメイン配列または構造を有する抗体と抗体エフェクター機能またはその他の特性を比較する目的で、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有する適合（ｍａｔｃｈｅｄ）コントロール抗体（すなわち本発明のＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ抗体の抗原結合ドメインに適合している）として言及され得る。
コントロール抗体５：抗ＦｅｌＤ１モノクローナル抗体はネコ抗原に結合するが、ヒトＣＤ２０またはＣＤ３に対する反応交差性はない。このＩｇＧ１非特異的抗体コントロールは、２０１３年１１月７日発行のＰＣＴ公報ＷＯ２０１３／１６６２３６で説明されている方法で得た。
コントロール抗体６：ＰＣＴ公報ＷＯ２０１３／１６６２３６で説明されている抗ＦｅｌＤ１抗原結合ドメインを、Ａｂ１と同様にキメラＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含むように、本明細書で説明するように操作した。コントロールＡｂ６はヒトＣＤ２０またはＣＤ３に対する反応交差性はないが、Ａｂ１と同様のエフェクター機能を有する。
実施例３．キメラ重鎖の構成
キメラ重鎖、たとえばキメラＣＨ ＩｇＧ４（配列番号２６）やキメラＣＨ ＩｇＧ１（配列番号３０）の生成は、標準的なクローン化技法を用いて行った。まず、２ステップのＰＣＲ増幅法により、キメラＩｇＧ４ ＣＨを生成した。２種のＰＣＲフラグメント、フラグメント１及び２を、ＣＨ領域に隣接するプライマー対、Ｐ１−Ｐ２とＰ３−Ｐ４をそれぞれ用い、野生型ｈＩｇＧ４ ＣＨのＤＮＡを含む出発ベクターコンストラクトｐＲ００１を用いて増幅した。以下の表９を参照されたい。）プライマーは、所望のＩｇＧ２ヒンジ下部配列（配列番号５２をコードする）と隣接する制限部位の両方をフラグメントに導入した。次に、これら２種のフラグメントを、ＰＣＲプライマーＰ２とＰ４を用いて連結した。得られた配列を、Ｘｈｏ１−Ｎｏｔ１制限部位を介してｐＲ００１に挿入して、ＩｇＧ２ヒンジ下部配列を有するキメラＩｇＧ４ ＣＨを含むベクターコンストラクトｐＲ００２を生成した。この配列は、プライマーＰ１０及びＰ１１を用いて確認した。
それに加えて、複数ステップのＰＣＲ増幅により、キメラＩｇＧ１ ＣＨを生成した。フラグメント１ａは、プライマーＰ２及びＰ５（以下の表９を参照のこと）を使って、（野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨのＤＮＡを含む）テンプレートｐＲ８５５０３から生成した。フラグメント２ａは、（キメラＩｇＧ４ ＣＨのＤＮＡを含む）ｐＲ００２をテンプレートとして用い、プライマーＰ６及びＰ８で増幅した。フラグメント３は、プライマーＰ７及びＰ９を使って、テンプレートｐＲ００３（野生型ｈＩｇＧ１ ＣＨのＤＮＡ；配列番号４５）から生成した。フラグメント１ａと２ａをプライマーＰ２及びＰ８を用いて連結して、フラグメント４を生成した。フラグメント２ａと３をプライマーＰ６及びＰ９を用いて連結して、フラグメント５を作製した。次にフラグメント４と５を、プライマーＰ２及びＰ９を用いて融合した。得られた配列を、Ｘｈｏ１−Ｎｏｔ１制限部位を介してｐＲ００１に挿入して、ＩｇＧ２ヒンジ下部及びＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインを有するＩｇＧ１定常領域を有するコンストラクトｐＲ００４を生成した。この配列は、プライマーＰ１０及びＰ１１を用いて確認した。
Figure 0006681396
実施例４．単一特異性抗体と比べて特異的にジャーカット、ラージ及びサルＴ細胞に結合するＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性抗体
ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体−ｗｔＦｃ（コントロール抗体４）のジャーカット（ＣＤ３＋、ＣＤ２０− ヒトＴ細胞株）、ラージ（ＣＤ３−、ＣＤ２０＋ ヒトＢ細胞株）、またはカニクイザルＰＢＭＣ（「ｍｋＴ細胞」）への結合能を、ＦＡＣＳ結合法により、実施例２で示した単一特異性コントロール抗体と比較した。
ＦＡＣＳデータは次のプロトコルを用いて獲得した。ウェルあたり２ｘ１０5個の細胞を系列希釈した抗体と一緒に氷上で３０分インキュベートした。インキュベート後、細胞を洗って、（ジャーカット、ラージ細胞は）適切な第２の抗体を加え、または（カニクイザルＰＢＭＣは）第２の抗体カクテルを加えて、さらに３０分インキュベートした。インキュベート後、細胞を洗い、１％ＢＳＡを含む冷ＰＢＳ中に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩでフローサイトメトリー分析した。ジャーカット及びラージ細胞を側方及び前方散乱でゲートし、カニクイザルＴ細胞はＣＤ２＋ＣＤ４＋集団でもゲートした。細胞結合滴定のＥＣ50は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使って４パラメーターの非線形回帰分析で値を計算し決定した。結果を表１０に示す。
Figure 0006681396
表１０に示すように、試験抗体のパネルは、その特異性に応じて様々な細胞株に対し多様な結合親和力を示している。二特異性コントロール抗体４は、ヒトとカニクイザル両方の標的細胞株に結合する能力を示した。コントロール抗体４は、本発明の抗体１及び抗体２と同じ抗ＣＤ３ｘＣＤ２０可変領域を含むが、野生型ＩｇＧ１ ＣＨ領域を有している。抗ＣＤ３コントロール１（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ３コントロール２（ＳＰ３４）、及び抗ＣＤ２０コントロール３は、それぞれジャーカット、カニクイザルＴ細胞、及びラージに結合した。
実施例５．活性化Ｔ細胞の存在下でラージ細胞に対する細胞傷害性を誘導する、野生型ＣＨを有するＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性抗体
ＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性抗体が、Ｔ細胞が媒介する殺細胞を、ＣＤ２０を発現しているラージ細胞へと向け直す能力について、インビトロ細胞傷害アッセイで試験した。それに加えて、二特異性抗体と親抗ＣＤ３抗体の両方について、Ｆｃ／ＦｃＲ相互作用によりＵ９３７細胞を殺滅する能力を調査した。
次のプロトコルを用いてカルセイン殺滅アッセイを実施した。ヒト及びカニクイザルのＰＢＭＣをそれぞれフィコール−プラークで、またはリンパ球哺乳動物細胞分離培地により単離した。単離したＰＢＭＣを組換えヒトＩＬ−２（３０Ｕ／ｍｌ）及びＴ細胞活性化ビーズ（ヒトＰＢＭＣは抗ＣＤ３／ＣＤ２８、カニクイザルＰＢＭＣは抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８）を含む培地で数日間にわたって活性化した。
標的細胞（ラージはＣＤ２０媒介性の殺滅、Ｕ９３７はＦｃＲ媒介性の殺滅）をカルセイン標識し、活性化Ｔ細胞と一緒に、３倍系列希釈の抗体を用いて、エフェクター：標的が１０：１の比率で３時間、３７℃でインキュベートした。インキュベート後、プレートを遠心分離し、上澄みを透明底部の黒色透光性プレートに移して蛍光分析を行った。５０％細胞傷害性を誘導する二特異性抗体のモル濃度としてのＥＣ50を、Ｐｒｉｓｍを用いて決定した。４パラメーターの非線形回帰分析により値を計算した。結果を表１０にまとめる。
Figure 0006681396
表１１に示すように、ヒト特異的及びカニクイザル交差反応性抗ＣＤ３アーム、及び野生型ＩｇＧ１ ＣＨ領域を含む二特異性ＣＤ２０ｘＣＤ３抗体は、ヒト活性化Ｔ細胞の存在下で、細胞傷害性を特異的にラージ細胞に向け直すことができた。カニクイザル活性化Ｔ細胞の存在下では、ラージは、サルＴ細胞を活性化する抗ＣＤ３アームを有するコントロールＡｂ４二特異性抗体と一緒にインキュベートすると、死滅した。二特異性抗体もコントロールＡｂ１（抗ＣＤ３ ｍＡｂ）も、Ｕ９３７ Ｆｃ／ＦｃＲ依存性殺滅アッセイで活性を示した。この活性は、阻害性の非特異性ヒトＩｇＧを反応物に加えることにより阻害できた（データ不掲載）。
実施例６−ＣＤＣアッセイでエフェクター機能の低下を示す、キメラＣＨ領域を含むＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性抗体
実施例２で上述した、キメラＣＨ領域を有するＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性抗体（抗体１及び抗体２）を、エフェクター機能を改変または低減するように、操作した。ＩｇＧ１アイソタイプの野生型（ｗｔ）重鎖定常領域を含む抗体（コントロールＡｂ４）と比べて、ＣＨ領域のアミノ酸置換は、Ｉｇ Ｆｃが受容体（複数可）に結合する能力を阻害し得る。したがって、Ｂ細胞活性化または食作用などのシグナル伝達及び免疫応答が改変され得る。ＣＨ領域のアミノ酸修飾が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）（この実施例）及び抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能（実施例７を参照のこと）に及ぼす効果を調査した。
抗体１及び抗体２がＣＤＣエフェクター機能に及ぼす効果を調査するために、ＣＤ２０を発現しているラージ（標的）細胞（５０００個／ウェル）またはＤａｕｄｉ細胞を、５％ヒト血清補体の存在下でプレート培養した。１００ｎＭから系列希釈を開始した抗体１、抗体２及びコントロール抗体を、３７℃で４時間にわたって細胞に加えた。標的細胞の溶解をＣｙｔｏＴｏｘ Ｇｌｏ（商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて決定し、細胞傷害性パーセントを計算した。
細胞傷害性パーセントを、式
細胞傷害性％＝（（ＬS−ＬSR）／（ＬMR−ＬSR））*１００％
により計算した。式中、ＬSRはベースラインの標的細胞発光であり、ＬMRはジギトニンにより溶解された細胞からの最大カルセイン放出である。細胞傷害性のＥＣ50は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて決定した。４パラメーターの非線形回帰分析により値を計算し、表１２ならびに図５Ａ及び図５Ｂに示す。
Ｄａｕｄｉ及びラージ細胞に対する抗体１及び抗体２のＣＤＣ活性は、ｗｔ重鎖定常領域を有する対応する抗体と比べて著しく低下する。表１２及び図５Ａ／図５Ｂを参照されたい。抗体１で多少のＣＤＣ活性がラージ細胞に対して観察されたが、全体的な結果としては、キメラ抗体が設けるエフェクター応答は、ｗｔ ＩｇＧ１ Ｆｃコントロール抗体よりも弱いことが示された。
Figure 0006681396
実施例７−ＡＤＣＣアッセイでエフェクター機能の低下を示す、キメラＣＨ領域を含むＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体
抗体１及び抗体２対野生型ＣＨ領域（及び同一の可変領域）を有する二特異性抗体の、ＡＤＣＣエフェクター機能に及ぼす効果を調査するため、新たに単離した未刺激のＣＤ５６陽性ＮＫ細胞またはＮＫ９２細胞をＦｃγＲＩＩＩａの高親和性Ｖアレルを発現するように操作したものを、カルセイン標識したＣＤ２０陽性ラージまたはＤａｕｄｉ細胞と一緒に、キメラＣＨ抗体（抗体１及び抗体２）及びｗｔ−ＣＨコントロール抗体（コントロール抗体４）の存在下でプレート培養した。標的細胞からのカルセイン放出を観測し、細胞傷害性パーセントを決定した。細胞傷害性パーセント及びＥＣ50は、上述のＣＤＣアッセイで説明したようにして計算した。結果を表１３ならびに図６Ａ及び図６Ｂに示す。
キメラＣＨ抗体、抗体１及び抗体２は、ラージまたはＤａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性を媒介しない（表１３）。
Figure 0006681396
実施例８−表面プラズモン共鳴によるキメラ抗体の結合親和力及び動態定数
キメラ定常重鎖領域を有する抗ＣＤ３ｘ抗ＣＤ２０二特異性抗体の抗体１及び抗体４を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｂｉａｃｏｒｅ社）技術を用いて分析して、ヒト及びカニクイザルＦｃγ受容体に対する動態結合パラメーターを決定した。アイソタイプコントロール、すなわちｗｔ−ＩｇＧ１アイソタイプコントロールとｗｔ−ＩｇＧ４ ＣＰＰＣアイソタイプコントロールを、同様の方法で試験した。
簡単に説明すると、ＳＰＲ実験は、機器Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で、カルボキシメチル＝デキストランでコートした（ＣＭ−５）チップを用いて２５℃で実施した。マウスモノクローナル抗ペンタ−ヒスチジン抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を、標準的なアミンカップリング反応によりＣＭ−５センサーチップ上に固定化した。ＨｉｓタグしたヒトまたはサルＦｃγＲタンパク質の１４０ＲＵ−３７６ＲＵをアミンカップリングさせた抗ペンタ−ヒスチジンＣＭ−５チップ上で捕捉し、捕捉したタンパク質に抗体原液を２０μｌ／分で２．５分間注いだ。ｍＡｂ結合応答を観測し、低親和性受容体について、定常状態結合平衡を計算した。動態的な結合速度定数（ｋa）と解離速度定数（ｋd）を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０曲線フィッティングソフトウェアを用いてデータ処理し１：１の結合モデルに適合させて求めた。動態速度定数から、結合解離平衡定数（ＫD）と解離半減期（ｔ1/2）を、次式で計算した。
ＫD（Ｍ）＝ｋd／ｋa及び
ｔ1/2（分）＝（ｌｎ２／（６０*ｋd）
Figure 0006681396
表１４の結果が示すように、ＳＰＲアッセイでは、抗体１及び抗体２の二特異性抗体は、野生型（ｗｔ）ｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ４−ＣＰＰＣ ＣＨ領域を有する抗体と比べて、ヒトＦｃγＲＩへの結合を示さない。本発明のキメラ重鎖二特異性抗体はまた、ｗｔ ｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ４−ＣＰＰＣ Ｆｃ配列を有する抗体と比べて、いくつかの低親和性ヒトＦｃＲγ受容体に対し弱い結合〜不結合を示す（たとえばヒトＦｃＲγＩＩＡ、ＦｃＲγＩＩＢでは弱い結合、ヒトＦｃＲγＩ、ＦｃＲγＩＩＩＡ、またはＦｃＲγＩＩＩＢでは結合は不検出）（以下の表１５）。
Figure 0006681396
実施例９−キメラ抗体の薬物動態プロファイル
単回のＩＶ注入を３０分受けさせた後、観察期間を１２週間おいた雄のカニクイザル（３匹／処置群）の血液試料を得ることによって、抗体１と抗体２の毒物動態プロファイルを評価した。血清中の総薬物濃度についての毒物動態分析の血液試料は、投与前と、投与後５分、５時間、２４時間、４８時間、７２時間、１６８時間、１４日目、２１日目、３５日目、４９日目、６６日目、及び８４日目に採取した。得られた血清試料を直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で分析して、Ａｂ１またはＡｂ２の総薬物濃度を決定した。試験物の毒物動態をノンコンパートメント解析（Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ）で評価して、薬物動態パラメーターを決定した。結果を表１６に示す（ＡＵＣ＝濃度−時間曲線下面積；Ｃmax＝観察された血清中最高濃度）。
Figure 0006681396
カニクイザルに単回静脈内用量１．０ｍｇ／ｋｇのＡｂ１とＡｂ２を与えた後、平均ピーク濃度（Ｃmax）はそれぞれ３３．４μｇ／ｍＬと２６．０μｇ／ｍＬ、平均ＡＵＣ0-168h値はそれぞれ１００日*ｕｇ／ｍＬと６１．１日*ｕｇ／ｍＬが観察された。これら２種の分子の見かけの終末相半減期は、８．１４〜１４．０日と推定された。データは、全動物についてＡｂ１とＡｂ２への継続的曝露が１２週の観察期間の大部分にわたり維持されたこと、また、曝露は処置群すべてで類似していたことを示している。試験物では見かけの免疫原性は観察されなかった。Ａｂ１とＡｂ２の全体的な薬物動態プロファイルは、カニクイザルに投与されたモノクローナル抗体の典型である。
実施例１０．カニクイザルにおいて単一特異性抗体よりも低用量でＣＤ２０＋ Ｂ細胞を減少させることができるＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体
抗体１及びコントロール抗体４のＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体投与のインビボの力価を決定するために、抗ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体投与後の、単一特異性抗ＣＤ２０抗体（コントロールＡｂ３）と比較しての、カニクイザルの末梢血液中のＣＤ２０＋ Ｂ細胞レベルの変化をＦＡＣＳで調べた。この研究では、雄カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を３匹ずつ８つの投与群に分けた。内訳は、第１群はプラセボ群（ビヒクルコントロールを投与）；第２群は単一特異性抗体（コントロールＡｂ３；リツキサン）を３０ｍｇ／ｋｇ与えた（サルの３０ｍｇ／ｋｇは、ヒト用量では最大臨床用量とされる３７５ｍｇ／ｍ2に等しい）；第３群は二特異性ＣＤ３ｘＣＤ２０コントロール抗体４を０．０１ｍｇ／ｋｇ；第４群は抗体４を０．１ｍｇ／ｋｇ；第５群は抗体４を１ｍｇ／ｋｇ；第６群は抗体１を０．０１ｍｇ／ｋｇ；第７群は抗体１を０．１ｍｇ／ｋｇ；第８群は抗体１を１ｍｇ／ｋｇであった。動物に投与する７日前と４日前に血液を採取した。抗体薬またはビヒクル（プラセボ）の用量は、静脈内注入で投与し、投与後２日目、４日目、及び７日目に血液を採取した。血液試料をＢ細胞（ＣＤ２０；表１７）及びＴ細胞（ＣＤ３、以下を参照のこと）マーカーについてＦＡＣＳ分析し、これらの細胞種の絶対数を決定した。
簡単に説明すると、１００μｌの血液を１．５ｍｌのＲＢＣ溶解バッファーと一緒にＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに入れ、３分インキュベートした。細胞を０．４ｘｇで５分遠心分離し、ＦＡＣＳ洗浄液（ＰＢＳ＋３％ＦＢＳ）で２回洗い、Ｆｃブロック試薬で室温で１０分ブロックした。次に細胞をｈＣＤ４５及びＣＤ２０蛍光試薬に直接結合させた抗体と一緒に３０分、４℃でインキュベートした。まずはＢ細胞サブセット（ＣＤ２０）またはＴ細胞サブセット（ＣＤ３）の定量決定を、ＣＤ４５蛍光染色及び側方散乱特徴（ＳＳＣ）分界（ＣＤ４５ｂｒｉｇｈｔＳＳＣｄｉｍ）からなるヘテロ・ゲート・ストラテジーを用いて実施して、白血球（ＷＢＣ）集団を記述した。次に、関連の蛍光標識抗体（ＣＤ２０ ＡＰＣ−Ｃｙ７）を利用してＢ細胞集団を特定した。染色後、細胞を２回洗ってから、ＦＡＣＳＣａｎｔｏサイトメーターによりＦＡＣＳ捕捉し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。結果を表１７ならびに図１１Ａ及び図１１Ｂに示す。
Figure 0006681396
表１７及び図１１Ａに示すように、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体及び抗ＣＤ２０単一特異性抗体を投与すると、測定の第１の時点（２日目）には、循環Ｂ細胞がベースラインレベルにまで減少した。この減少はプラセボコントロール動物のコホートでは見られなかった。二特異性コホートにおけるＢ細胞の減少は、二特異性抗体１ｍｇ／ｋｇを投与してから１週間維持され、Ｂ細胞減少は０．０１ｍｇ／ｋｇと０．１０ｍｇ／ｋｇ用量の二特異性コホートでも維持された。
この実験では、蛍光標識した抗ＣＤ３抗体により、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）レベルも観測した。二特異性抗体コホート（Ａｂ４及びＡｂ１；全用量）で、投与後２日目に、循環Ｔ細胞の一時的低減が観察された。Ｔ細胞の（ベースラインを下回る）低減は、ビヒクル（プラセボ）コントロールまたはコントロールＡｂ３（リツキサン）群では、各測定時に観察されなかった。Ｔ細胞レベルは、二特異性抗体コホートで、４日目の時点にはベースラインレベルに戻り、実験終了時までベースラインレベルに維持された（図１１Ｂを参照のこと）。
抗体１と抗体４のＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体のインビボの力価を、長期（３か月）研究で、カニクイザルの末梢血液中のＣＤ２０＋ Ｂ細胞レベルまたはＣＤ３＋ Ｔ細胞レベルの変化を上記に説明した研究と同様に測定して、測った。プラセボ（ビヒクル）または二特異性抗体は、１．０ｍｇ／ｋｇを０日目に投与した。末梢血液中のＢ細胞レベルは、両方の二特異性抗体コホートで２日目には著しく減少し、プラセボを除く全試料で研究期間全体にわたり減少したままであった（図１２Ａを参照のこと）。二特異性抗体で処置した動物については、Ｔ細胞の一時的な低減が二特異性コホートで２日目には観察され、その後Ｔ細胞は４日目にはベースラインレベルまで回復し、研究期間を通してベースライン付近に留まった（＞８０日）（図１２Ｂ）。プラセボで処置した動物ではＴ細胞の一時的な低減は観察されなかった。
抗体１と抗体４のＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体の低用量投与でのインビボの力価をさらに測定するために、長期（２か月）研究で、カニクイザルの末梢血液中のＣＤ２０＋ Ｂ細胞レベルまたはＣＤ３＋ Ｔ細胞レベルの変化を、上記の実験と同様に測定した。二特異性抗体は、０．０１ｍｇ／ｋｇまたは０．００１ｍｇ／ｋｇ（１μｇ／ｋｇ）のいずれかを０日目に投与した。末梢血液中のＢ細胞レベルは、より高い用量のＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体で処置した動物で観察されたのと同様（表１７ならびに図１１Ａ及び図１２Ａからわかるように）、両方のＣＤ３ｘＣＤ２０コホートで２日目には著しく減少し、研究期間全体にわたり減少したままであった（図１３Ａ）。非常に低い用量（１μｇ／ｋｇ）の二特異性抗体で処置した動物は、より高い用量のＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体で処置した動物に見られたのと同じＴ細胞の一時的低減及び回復があった（図１３Ｂを図１１Ｂまたは図１２Ｂと比べて参照のこと）。
これまで説明した研究で観察されたＢ細胞の低減は、ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ抗体１で処置した動物の末梢血液中の循環抗体の低減と相関関係にあった（図１４を参照のこと）。動物の血液循環中の抗体曝露が時間の経過とともに減少すると、Ｂ細胞集団は回復し始める（たとえば第Ｉ０６８８１号の動物で８１日目に観察された）。
Ｂ細胞の低減と末梢血液中の循環抗体の低減の相関関係は、ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ抗体２で処置した動物にも見られたが（図１５を参照のこと）、動物の血液循環中の抗体曝露は時間の経過とともに減少し、その後Ｂ細胞集団は、たとえば６６日目に第Ｉ０６８７６号の動物で、また６８日目に第Ｉ０６８７７号の動物で観察されたように、回復し始める。同様の相関関係はＣＤ３ｘＣＤ２０−ｗｔＦｃ（Ａｂ４）二特異性抗体で処置した動物でも見られた（図１６を参照のこと）。動物の血液循環中の抗体曝露が時間の経過とともに減少すると、Ｂ細胞集団は回復し始める（図１６を参照されたい。たとえば９１日目に第Ｉ０６８７０号の動物で、また６４日目に第Ｉ０６８７２号の動物で観察されている）。
実施例１１．カニクイザルのリンパ組織において単一特異性抗体よりも低用量でＣＤ２０＋ Ｂ細胞を減少させることができるＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体
抗ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体（抗体１または抗体４）の投与後の、単一特異性抗ＣＤ２０抗体（コントロールＡｂ３−リツキサン）と比較しての、カニクイザルのリンパ組織におけるＣＤ２０＋ Ｂ細胞レベルの変化をＦＡＣＳで調査した。この研究では、雄カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を３匹ずつ８つの投与群に分けた。内訳は、上述の実施例１０で概説した第１群〜第８群と同様にした。抗体薬またはビヒクルの用量は、静脈内注入で投与し、投与後７日目に動物を犠牲にして組織を採取した。組織試料を白血球（ＣＤ４５＋）マーカーについて、具体的にはＢ細胞（ＣＤ２０＋）マーカーについてＦＡＣＳ分析してから、Ｂ細胞の体積％を決定した。
上述の実施例１０で説明した方法と同様にして、関連の蛍光標識抗体（ＣＤ２０ ＡＰＣ−Ｃｙ７）及びＦＡＣＳ捕捉により、Ｂ細胞集団を特定した。結果を表１８ならびに図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。
Figure 0006681396
表１８及び図１７Ａに示すように、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体の投与の結果、抗ＣＤ２０単一特異性抗体と比べて、かなり低い用量（０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ用量）の二特異性コホートで脾臓の組織Ｂ細胞が減少した。この減少は、プラセボコントロール動物コホートでは見られなかった。
表１８及び図１７Ｂに示すように、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体の投与の結果、抗ＣＤ２０単一特異性抗体と比べて、かなり低い用量（０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ用量）の二特異性コホートで腸間膜リンパ節の組織Ｂ細胞が減少し、二特異性抗体の０．１ｍｇ／ｋｇ用量と１ｍｇ／ｋｇ用量では、単一特異性コホートよりも高効率のＢ細胞減少となった。この減少は、プラセボコントロール動物コホートでは見られなかった。
実施例１２．ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体での腫瘍処置
Ａ．ＮＳＧマウスにおけるラージ腫瘍増殖を抑制する、ＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性抗体での処置
選択した抗ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体がラージ腫瘍増殖を抑制する有効性を評価するために、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国メーン州バーハーバー）から購入したＮＳＧマウス（ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγnullマウス）に２ｘ１０6個のラージ腫瘍細胞と５ｘ１０5個のヒトＰＢＭＣを同時に皮下移植した（０日目）。同じ日に、マウス１匹あたり（各処置群にマウス５匹）腹腔内用量で０．４ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇまたは０．００４ｍｇ／ｋｇの抗体１またはコントロール抗体５（的外れ（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）な標的に対するＩｇＧ１抗体）、あるいはビヒクルコントロールでマウスを処置した。０日目から開始して、研究期間が終わるまで週２回、マウスを腹腔内用量の薬物またはビヒクルで処置した。腫瘍サイズは週２回カリパスで測定し、腫瘍体積を、体積＝（長さｘ幅2）／２で計算した。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアＰｒｉｓｍ５．０（ＭａｃＩｎｔｏｓｈバージョン）で統計分析を行った。
統計学的有意差を２ウェイＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較事後検定により決定した。各測定値のデータを処置群間で比較した。閾値としては、ｐ＜０．０５を統計学的に有意差ありとした。結果を図７Ａ〜図７Ｆに示す。これらの結果は、抗体１（ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ）が、ヒト免疫細胞を同時移植したマウスのラージ腫瘍を標的とすることを示し、試験用量で腫瘍増殖の完全抑制がもたらされた（図７Ｃ：０．４ｍｇ／ｋｇ Ａｂ１；図７Ｅ：０．０４ｍｇ／ｋｇ Ａｂ１；図７Ｆ：０．００４ｍｇ／ｋｇ Ａｂ１）。この実施例は、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体１での処置は、腫瘍移植時から開始して、腫瘍増殖を阻害する効果があることを示している。ラージ腫瘍増殖は、用量０．４ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇまたは０．００４ｍｇ／ｋｇの抗体１を与えたマウスでは、コントロールと比較して、移植２３日目まで完全に抑制されていた。また、抗体１もコントロール抗体も研究期間中マウスの体重に重大な影響を及ぼさないことも観察された（データ不掲載）。
ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体の抗腫瘍効果を、さらに、（上記と）同様のＮＳＧマウスモデルで試験したが、各ＮＳＧマウスには、１ｍｇのマウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ２ａ Ｆｃ）を−１日目に投与し、その後は週１回投与した。結果を図８Ａ〜図８Ｂに示す。
この実験は、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体１（ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ）の処置でも、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体４（ＣＤ３ｘＣＤ２０−ｗｔＦｃ）の処置でも、腫瘍移植時から開始して、循環ＩｇＧの存在下で、試験した二特異性Ａｂの用量で、腫瘍増殖の阻害に効果があったことを示している（図８Ａ〜図８Ｂ）。図８Ａからわかるように、抗体１（ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ二特異性抗体）は、この実験ではＩｇＧの添加の有無にかかわらず研究期間を通して腫瘍増殖の完全阻害を示している。
Ｂ．ＮＳＧマウスにおける定着腫瘍を退縮させる、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体での処置
選択した抗ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体がＮＳＧマウスにおける定着腫瘍を抑制する有効性を評価した。ＮＳＧマウス（ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγnullマウス）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国メーン州バーハーバー）から購入し、ＨＬＡ適合ラージ腫瘍細胞（２ｘ１０6個）とヒトＰＢＭＣ（５ｘ１０5個）を同時に皮下移植した（−１５日目）。処置の１５日前から宿主に腫瘍を定着させた。薬物を投与する１日前（−１日目）、各マウスに５ｍｇのｍＩｇＧ２ａ Ｆｃのサプリメントを投与した。その後、実験期間を通して週１回、マウスにｍＩｇＧ２ａ Ｆｃを１匹あたり５ｍｇ投与した（７日目、１４日目など）。薬物を投与する前に、マウスを腫瘍サイズにより、約２００〜４００ｍｍ3の第１群または約５００〜９００ｍｍ3の第２群の２つの実験群に分けた。
薬物処置に続いて、各マウスの腫瘍サイズを０日目、３日目、６日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目及び２８日目に観測し記録した。腫瘍サイズは週２回カリパスで測定し、腫瘍体積を、体積＝（長さｘ幅2）／２で計算した。腫瘍の存在は、触診によっても決定した。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアＰｒｉｓｍ５．０（ＭａｃＩｎｔｏｓｈバージョン）で統計分析を行った。各測定値データを処置群間で比較した。結果を図９及び図１０に示す。
ａ．第１群：腫瘍は約２００〜４００ｍｍ3。０日目から開始して、それぞれマウス４〜５匹のいくつかのコホートを、以下のように、表示の用量の薬物またはビヒクルで週１回（すなわち７日目、１４日目など）処置した。
ｉ．コントロール：ビヒクルのみ
ｉｉ．コントロール抗体５、０．４ｍｇ／ｋｇ
ｉｉｉ．抗体１（ＣＤ２０ｘＣＤ３−キメラＦｃ）、０．４ｍｇ／ｋｇ
ｂ．第２群：腫瘍は約５００〜９００ｍｍ3。０日目から開始して、それぞれマウス４〜５匹のいくつかのコホートを、以下のように、表示の用量の薬物またはビヒクルで週１回（すなわち７日目、１４日目など）処置した。
ｉ．コントロール抗体５、０．４ｍｇ／ｋｇ
ｉｉ．抗体１（ＣＤ２０ｘＣＤ３−キメラＦｃ）、０．４ｍｇ／ｋｇ
０．４ｍｇ／ｋｇの抗体１（ＣＤ２０ｘＣＤ３−キメラＦｃ）を投与したコホートでは、１４日目には腫瘍が完全に退縮した。図９を参照されたい。
定着腫瘍がより大きいモデル（すなわち第２群、約５００〜９００ｍｍ3）では、抗体１（ＣＤ２０ｘＣＤ３−キメラＦｃ）での処置（０．４ｍｇ／ｋｇ）により、マウスで観察される腫瘍は２１日目には完全に消失した。図１０を参照されたい。
実施例１３．インビトロでＰＢＭＣ増殖を誘導するＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体
選択したＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体とコントロールコンストラクトが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を刺激して増殖を誘導する能力を、ＡＴＰ触媒定量法（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ
Ｇｌｏ（登録商標））を用いて評価した。ＰＢＭＣが活性化すると、細胞増殖を促すサイトカインが放出される。
増殖データは、以下のプロトコルを用いて取得した。ヒトまたはカニクイザル由来のＰＢＭＣ（５ｘ１０5個／ウェル）を、系列希釈したＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体またはコントロール抗体及び市販の抗ＣＤ２８抗体（ヒト：２００ｎｇ／ｍＬ、カニクイザル：５００ｎｇ／ｍＬ）と一緒に７２時間、３７℃でインキュベートした。細胞は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）を用いて定量化し、細胞生存率の表示である発光をＶＩＣＴＯＲ Ｘ５マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定して、生存細胞を検出した。細胞生存率（未刺激細胞に対する刺激細胞の誘導倍率）を、刺激細胞の発光を未刺激細胞のベースライン発光で割ることで決定し、Ｐｒｉｓｍソフトウェアでグラフ化した。結果を表１９ならびに図１８Ａ及び図１８Ｂにまとめる。
Figure 0006681396
表１９ならびに図１８Ａ〜図１８Ｂに示すように、本発明のＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性抗体は両方ともヒトまたはカニクイザルのＰＢＭＣ増殖を誘導した。抗体１は、ほぼ同等の力価でヒトとカニクイザル両方のＰＢＭＣ増殖を誘導した。コントロールＡｂ５は活性を示さなかった。
実施例１４．インビトロで活性化Ｔ細胞による殺細胞を媒介するＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性抗体
ヒトまたはカニクイザルのＰＢＭＣをそれぞれフィコール−パーク（Ｐａｑｕｅ）で、またはリンパ球哺乳動物細胞分離培地により単離した。単離したＰＢＭＣ（１ｘ１０6細胞／ｍＬのヒトＰＢＭＣまたは５ｘ１０6細胞／ｍＬのカニクイザルＰＢＭＣ）を、それぞれ７日間と２１日間、組換えヒトＩＬ−２（ヒトＰＢＭＣは３０Ｕ／ｍＬ、カニクイザルＰＢＭＣは１００Ｕ／ｍＬ）及びＴ細胞活性化ビーズ（ヒトＰＢＭＣは抗ＣＤ３／ＣＤ２８、カニクイザルＰＢＭＣは抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８）を含む完全培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２９２μｇ／ｍＬのＬ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ）で活性化した。ＣＤ２０を発現しているラージ細胞（２ｘ１０6細胞／ｍＬ）を８μＭのカルセイン−ＡＭで３０分かけて３７℃で標識し、培地で３回洗った。カルセイン標識した標的細胞（１万〜２万細胞／ウェル）を、完全培地中、活性化Ｔ細胞（エフェクター／標的細胞の比率は１０：１）及び系列希釈した抗体１、Ａｂ４またはコントロールＡｂ５（ヒト濃度範囲は２ｎＭ〜０．００００３ｎＭ；カニクイザル濃度範囲は６．６ｎＭ〜０．００２ｐＭ）と一緒に２００μＬで、２時間、３７℃でプレート培養した。インキュベート後、プレートを遠心分離し、上澄みを透明底部の黒色透光性プレートに移して蛍光分析を行った。細胞傷害性パーセントを、次式により計算した。
細胞傷害性％＝（（ＦＳ−ＦＳＲ）／（ＦＭＲ−ＦＳＲ））*１００％
式中、ＦＳは試験ウェルからのカルセイン放出であり、ＦＳＲは自発的カルセイン放出であり、ＦＭＲはトリトンＸにより溶解された細胞からの最大カルセイン放出である。
細胞生存率のＥＣ50（ＡＴＰ触媒定量法）をＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて決定した。細胞溶解（細胞傷害性）は、最大放出の画分としてのカルセイン放出により測定した。細胞傷害性パーセントは、観察された放出を最大放出と比較して計算し、ＥＣ50値を決定した。結果を表２０ならびに図１９Ａ（ヒトＴ細胞）及び図１９Ｂ（サルＴ細胞）に示す。
Figure 0006681396
表２０に示すように、抗体１は、ヒトＴ細胞（図１９Ａ）は２５．０ρＭ、カニクイザルＴ細胞（図１９Ｂ）は９．１０ρＭの各代表ＥＣ50値で、標的細胞の殺滅を媒介した。抗体４は、ヒトＴ細胞（図１９Ａ）は１５．７ρＭ、カニクイザルＴ細胞（図１９Ｂ）は１．７３ρＭの各代表ＥＣ50値で、標的細胞の殺滅を媒介した。コントロールの活性は観察されなかった。
ＣＤ２０を有する標的細胞の特異的な殺滅をフローサイトメトリーで観測するために、Ｂ１６Ｆ１０．９親マウス骨髄腫細胞（ＣＤ２０を発現していない）と、安定してヒトＣＤ２０を発現するように操作されたＢ１６Ｆ１０．９細胞（Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０）を、１μＭの蛍光追跡色素のカルボキシフルオレセイン＝ジアセタート＝スクシンイミジル＝エステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）とＶｉｏｌｅｔ細胞トラッカーでそれぞれ標識した。標識後、細胞を１：１の比率で混合し、３７℃で一晩プレート培養した。それとは別に、ヒトＰＢＭＣを、添加物を加えた培地で１ｘ１０6細胞／ｍＬでプレート培養し、３７℃で一晩インキュベートして、付着マクロファージ、樹状細胞、及び一部単球を減少させることでリンパ球を富化した。翌日、標的細胞を、付着細胞を減少させたナイーブＰＢＭＣ（エフェクター／標的細胞の比率は４：１）及び系列希釈した試験ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体またはＩｇＧ１コントロール抗体５（濃度範囲は６６．７ｎＭ〜０．２５ρＭ）と一緒に４８時間３７℃でインキュベートした。酵素を含まない細胞解離バッファーを用いて細胞を細胞培養プレートから回収し、ＦＡＣＳ分析した。ＦＡＣＳ分析のために細胞を生／死長波長赤色細胞トラッカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色した。殺細胞の特異性評価のために、細胞は、生Ｖｉｏｌｅｔ及びＣＦＤＡ−ＳＥ標識集団をゲートした。各集団のパーセントを報告して調整生存率（ａｄｊｕｓｔｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ）を次式で計算した。
調整生存率＝（Ｒ１／Ｒ２）*１００
式中、Ｒ１は抗体の非存在下での［（Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０）／バイスタンダー細胞（Ｂ１６Ｆ１０．９）］*１００であり、Ｒ２は試験抗体の存在下での同比率である。
Figure 0006681396
ＣＤ３ｘＣＤ２０−キメラＦｃ（抗体１）とＣＤ３ｘＣＤ２０−ｗｔＦｃ（抗体４）の両方が、ヒトＴ細胞を、混合細胞集団においてＣＤ２０を発現している標的細胞のみを特異的に殺滅するように仕向けた（図２０Ａ〜図２０Ｂ）。標的細胞の殺滅は、二特異性抗体の存在下でのみ観察され、Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０細胞は抗体１（ＥＣ50 １９．５ρＭ）及び抗体４（ＥＣ50 １２．８ρＭ）により用量依存的に減少していた（図２０Ｂ）。ＣＤ２０を発現している細胞のうち、試験最高用量（１０μｇ／ｍＬ）で生存していたのは５％未満であった（図２０Ｂ）。ＩｇＧ１コントロール抗体であるコントロールＡｂ５では、親Ｂ１６Ｆ１０．９細胞集団またはＢ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０集団で細胞死の証拠は観察されなかった。
実施例１５．２０時間のＦＡＣＳインビトロアッセイにおいてＴ細胞上の初期活性化マーカーＣＤ６９を増加させるＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体
ＣＤ６９＋は、Ｔ細胞が活性化していることを示す、最も初期の誘導性細胞表面マーカーのひとつである。Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ６９などの特定の細胞表面マーカーの増加を調べることで決定できる。
ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体が、ヒトまたはカニクイザルの全血中でＴ細胞上の初期活性化マーカーＣＤ６９を増加させる能力を、２０時間インビトロＦＡＣＳアッセイで決定した。簡単に説明すると、Ｔ細胞活性化は、平底の９６ウェルプレートで、新たに単離したヒトまたはカニクイザルの全血（１００μＬ）を、５倍（ヒト）または１０倍（カニクイザル）に系列希釈した抗体１、抗体４またはコントロールＡｂ５（濃度範囲は５０ｎＭ〜０．０００６ｎＭ）と一緒に、ＲＰＭＩ＋Ｌ−グルタミン酸中最終体積２００μＬで、３７℃で２０時間インキュベートして評価した。インキュベート後、プレートを１０００ｒｐｍで５分スピンダウンして血漿を回収した。Ｔ細胞上のＣＤ６９増加を測定するため、ＣＤ２及びＣＤ６９ならびにＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ１９（ヒト）またはＣＤ１６（カニクイザル）に直接結合させた抗体を含む表現型決定カクテルを３０分間４℃で直接血液に加えた。赤血球を、取扱説明書にしたがって１．５ｍＬのＰｈａｒｍＬｙｓｅバッファーで１５分かけて溶解した。細胞を２回洗い、２００μＬの冷ＰＢＳ＋１％ＦＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏサイトメーターを用いてフローサイトメトリー分析した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、生存小ＣＤ４５＋リンパ球の第１のゲーティングと、その次のＣＤ１９−／ＣＤ２＋／ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ヒト）またはＣＤ１６−／ＣＤ２＋／ＣＤ４＋ Ｔ細胞（カニクイザル）のゲーティングで特定した。
全ＣＤ２＋エフェクター細胞中、活性化（ＣＤ６９＋）Ｔ細胞パーセントを報告する。表２２、及び図２１も参照されたい。結果は、初期活性化マーカーＣＤ６９により検出すると、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体はＴ細胞を著しく活性化したことを示している。
Figure 0006681396
実施例１６．Ｔ細胞と標的細胞のクラスター化を誘導するＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体
細胞クラスター化フォーマットにより、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体が、二特異性結合アームによりＴ細胞と標的細胞（ＣＤ２０＋細胞）間を架橋したことが、決定された。エフェクター細胞はＣＦＳＥで染色し、ＣＤ２０＋細胞はＶｉｏｌｅｔ細胞トラッカーで２４時間の染色をし、的外れなコントロール抗体（的外れなＩｇＧ１アイソタイプ抗体であるコントロール抗体５）と一緒にインキュベートしてから別々のクアドラントにゲートした。的外れな抗体で処置した細胞混合体でのクラスター化（二重染色）を示していない図２２Ａを参照されたい。ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体と一緒にインキュベートすると、ＣＦＳＥとＶｉｏｌｅｔ両方の染色により細胞クラスターが現れる（図２２Ｂの太枠で強調した散布図左上のクアドラントを参照のこと）。
実施例１７．ＣＤ３＋細胞上の阻害性Ｔｉｍ−３及びＰＤ−１マーカーの発現
Ｔ細胞の機能障害つまり疲弊は腫瘍を有する宿主で生じる。Ｔｉｍ−３及びＰＤ−１受容体は、慢性疾患状態における疲弊Ｔ細胞のマーカーとして特定されている。研究者のＳａｋｕｉｓｈｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．によると（Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２０７（１０）：２１８７−２１９４， ２０１０）、Ｔｉｍ−３及びＰＤ−１が陽性の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（Ｔｉｍ−３＋ＰＤ−１＋ＴＩＬ）は、もっとも重度の疲弊表現型を示し、ＩＬ−２、ＴＮＦ、及びＩＦＮ−γの増殖や生産ができないと定義されている。
ＨＬＡ適合ラージ腫瘍細胞とヒトＰＢＭＣを同時に皮下移植したＮＳＧマウス（上記の実施例１２Ｂを参照のこと）の血液及び腫瘍からＣＤ３陽性細胞を抽出した。簡単に説明すると、処置の１５日前から宿主内で腫瘍を定着させ、次にマウスを腫瘍サイズにより２つの処置群に分けた（実施例１２Ｂを参照のこと）。９日目に、各実験群すなわち第１群（約２００〜４００ｍｍ3）または第２群（約５００〜９００ｍｍ3）の処置マウス（二特異性Ａｂ）と非処置マウスから血液を採った。研究の最後に、１５００ｍｍ3に達する腫瘍を有する非処置マウス（ビヒクルまたはコントロールＡｂ）を犠牲にし、それらの腫瘍をＰＤ１及びＴｉｍ−３の発現について試験した。
循環Ｔ細胞の実験では、Ｔｉｍ−３またはＰＤ−１のいずれかに対する直接標識した抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入可能）を用いてのマーカー識別に、生ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ Ｔ細胞の画分を選択した。Ｔｉｍ−３＋ＰＤ−１＋細胞は、非処置動物の血液中の循環Ｔ細胞の主要画分であった。しかし、ＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性抗体（Ａｂ１）で処置した動物の血液中のＴ細胞は、より低いＴｉｍ−３＋ＰＤ−１＋細胞の画分を示した。
非処置宿主の腫瘍細胞を分離し、生存率について染色した。生単細胞についてＦＡＣＳ分析を行って、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞画分を分取し、次にこの画分をＴｉｍ−３またはＰＤ−１発現について試験した。
発明者らは、実施例１２Ｂで説明した実験中、非処置マウスのＮＳＧ Ｂ細胞リンパ腫のＣＤ３＋ ＴＩＬに阻害性受容体Ｔｉｍ−３及びＰＤ−１が発現したこと、及びＴｉｍ−３＋ＰＤ−１＋細胞はＴ細胞浸潤腫瘍の主要な画分であったことを見出した。
実施例１８．定着ラージ腫瘍を有するＮＳＧマウスにおいて、抗ＣＤ２０＋抗体よりも有効な、ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体での処置
選択した抗ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体がＮＳＧマウスの定着腫瘍を縮小させる有効性を評価した。ＮＳＧマウス（ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウス；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に、（−１４日目に）ラージ腫瘍細胞（２ｘ１０6個）とヒトＰＢＭＣ（５ｘ１０5個）を同時に皮下移植した（実施例１２Ｂと同様）。
定着ラージ腫瘍の抑制において、ＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性Ａｂ１（０．４ｍｇ／ｋｇを２ｘ／週、腹腔内投与）は、ＣＤ１９ｘＣＤ３ＢｉＴＥ（０．５ｍｇ／ｋｇを５ｘ／週、静脈内投与）と同等であり（図２３）、リツキシマブ処置（８ｍｇ／ｋｇを５ｘ／週、腹腔内投与）よりも優れていた（図２４）。
実施例１９．ＣＤ３ｘＣＤ２０二特異性抗体での黒色腫治療
研究者らは、患者の黒色腫癌の特定の亜集団、たとえばＣＤ２０＋黒色腫の腫瘍細胞は、腫瘍始原特徴及び再発の高リスクを呈し得るとしている（Ｐｉｎｃ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０（５）：１０５６−１０６２， ２０１２ ２０１２年２月２１日電子出版）。ＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性抗体Ａｂ１は、免疫コンピテントマウスにおけるｈＣＤ２０を形質導入したＢ１６Ｆ１０．９（Ｂ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０）の腫瘍増殖を大幅に遅らせて、ＣＤ２０を発現している他の腫瘍細胞に対する強力な活性を示した。
実施例２０．ＣＤ２０を対象とする抗体治療で以前治療を受けたことのあるＣＤ２０＋
Ｂ細胞悪性腫瘍患者における抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性モノクローナル抗体の安全性及び耐容性を調査する第１相臨床試験
研究目的及び概要
本研究の主目的は、静脈内投与される抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性モノクローナル抗体の安全性、耐容性及び用量制限毒性（ＤＬＴ）を評価することである。本研究で用いる抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二特異性モノクローナル抗体は、本明細書の別の箇所で「Ａｂ１」と言及される抗体である。
本研究の副次的目的は、（ａ）Ａｂ１の薬物動態（ＰＫ）プロファイルの特徴づけ、（ｂ）Ａｂ１の免疫原性の評価、（ｃ）抗ＣＤ２０抗体治療を以前受けたことのあるＣＤ２０＋ Ｂ細胞悪性腫瘍（非ホジキンリンパ腫［ＮＨＬ］及び慢性リンパ性白血病［ＣＬＬ］）を有する患者に投与されるＡｂ１の予備（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ）抗腫瘍活性の調査である。
本研究の特定の診査上の目的は、作用機構、観察される毒性、及び潜在的な抗腫瘍活性と相関のあるバイオマーカーを評価し、限定ではないが、サイトカインのプロファイリング、末梢血液Ｂ細胞及びＴ細胞のサブセット及び免疫表現型の決定、及び末梢血液中の遺伝子発現の変化が挙げられる。
試験デザイン
抗ＣＤ２０ｘＣＤ３モノクローナル抗体「Ａｂ１」をＩＶ注入で投与して、非盲検多施設用量漸増試験を開始した。患者を初期の開始用量からなる用量レベル（ＤＬ）コホートに割り当て、第２の後続の用量はより高用量を投与した。患者は、（ＮＨＬまたはＣＬＬの）適応（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）に基づき登録している。各ＤＬに２コホート（各適応に１コホート）があり、１コホートには３〜６名の患者がいる。
当初は臨床的有用性を示すがその後再発または進行を示す患者は、再発または進行時に耐容可能と思われる最高ＤＬのＡｂ１で再治療され得る。
登録済の患者は、Ａｂ１の初回投与前２８日以内に、適性を決めるスクリーニング手順を受けている。患者は、各コホートがプロトコル基準にしたがい定員になるまで、スポンサーによる適性確認順に、（ＮＨＬまたはＣＬＬの）適応に基づき順次登録した。
各ＤＬでＮＨＬ及びＣＬＬに別々の独立した用量漸増コホートが存在している。各ＤＬは、初期用量と第２の後続用量とからなり、初期用量が耐容されれば第２の用量は開始用量よりも高くなる。
用量漸増は、一般的な３＋３用量漸増デザインをとる。観察された毒性に基づき、各コホートに３〜６名の患者が計画されている。
用量漸増相が終了し、さらなる試験用の推奨用量が決定されると、低悪性ＮＨＬ、高悪性ＮＨＬ、及びＣＬＬの３つの拡大コホートを計画し、各拡大コホートの患者数は１０名とする。
第１のＤＬでは、同じ適応の最初の３名の患者に対する最初の治験薬投与は、投与と投与の間に４８時間の待機期間を要する。第１のＤＬの後続の患者らは、適応にかかわらず同日に治療されることはない。後続のコホートでは、その前のコホートや同コホート内で予期せぬ毒性が観察されなかったとして、最初の３名の患者への最初の輸液は、少なくとも２４時間は開けて投与すべきである。
各患者コホートの登録、治療、及びＤＬＴ観察期間が終了すると、スポンサーと担当医（複数可）の両方が安全性データを確認してから、後続のＤＬコホートの登録開始（または現非盲検ＤＬコホートの拡大）をするかどうか決定する。ＤＬＴ観察期間は、この試験では誘導期に相当する、治療の最初の２８日間と定める。誘導期中、患者に週１回４週間Ａｂ１を投与して治療することになる。
ある患者のＤＬＴ評価をするには、その患者は少なくとも最初の２回のＡｂ１投与を受けていなくてはならない（第１週の１日目と第２週の１日目）。それに加えて、該患者は、１回目投与の後少なくとも２８日間、及び２回目投与の後少なくとも２１日間はモニタリングされなくてはならない。
試験期間
治療期間は６か月である。患者はまず、最大９用量のＡｂ１、つまり４週間の誘導期に週１回４週間で４用量、その後の５か月の維持期は月１回投与される追加の５用量で治療される。フォローアップ期は６か月である。
患者集団
用量漸増相では両適応（ＮＨＬ及びＣＬＬ）の用量漸増コホートに、（ＤＬ１からＤＬ７までそれぞれ６名の患者を登録するとして）最大８４名の患者が必要であり得、ＤＬ８からＤＬ１０を追加する場合はさらに３６名の患者が登録され得、さらに最大３０名の患者（２０名のＮＨＬ［低悪性と高悪性のＮＨＬに１０名ずつ］と１０名のＣＬＬ）が拡大コホートに必要であり得、全部で１５０名の患者となる。
患者は、ＣＤ２０＋ Ｂ細胞悪性腫瘍ありと診断されていて過去の治療が奏功しない活動性疾患を有していなくてはならず、ＣＤ２０を対象とする抗体治療を受けたことがあり、標準的な治療オプションは存在せず、抗ＣＤ２０抗体での治療が適切であり得る患者である。
試験の選択基準は、（１）ＣＤ２０＋ Ｂ細胞悪性腫瘍ありと診断されていて過去の治療が奏功しない活動性疾患を有し、標準的な治療オプションは存在せず、抗ＣＤ２０抗体での治療が適切であり得ること、（２）抗ＣＤ２０抗体療法で治療を受けたことがあること、（３）全患者（Ｂ細胞ＮＨＬ及びＣＬＬ）はＣＴスキャンで診断される二次元的に測定可能な病変≧１．５ｃｍ）を少なくとも１つ有していなくてはならない、（４）ＣＬＬ患者の白血球（ＷＢＣ）≦２００ｘ１０９であること、（５）１８歳以上であること、（６）Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）の活動指標≦１であること、（７）余命が少なくとも６か月あること、（８）次の（ａ）〜（ｃ）で診断される適切な骨髄機能：（ａ）血小板数≧７５ｘ１０９／Ｌ、（ｂ）血色素量≧９ｇ／ｄＬ、（ｃ）ＡＮＣ≧１ｘ１０９／Ｌ、（９）適切な内臓機能、（１０）患者に重大なリスクを負わさずに生検できるアクセス可能な病変を該患者が有すると担当医が判断した場合、治療前に強制的な腫瘍生検の事前処置を受ける意思、（１１）外来及び試験関連手順に従う意思があり、それが可能であること、及び（１２）サイン済みのインフォームド・コンセントを提出すること、である。
試験の除外基準は、以下のとおりである。（１）原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫または非原発性ＣＮＳ ＮＨＬによるＣＮＳ関与がわかっているか疑わしい場合、（２）次の（ａ）または（ｂ）などのＣＮＳ病態の病歴または現在の病状：（ａ）てんかん、発作、不全麻痺、失語症、卒中、重度の脳障害、小脳疾患、器質性脳症候群、精神病、または（ｂ）炎症性病変及び／または血管炎の存在を示す脳ＭＲＩエビデンス、（３）治験薬の第１回投与前２８日以内の標準的な抗リンパ腫の（非生物学的）化学治療または放射線治療、（４）ブリナツモマブでの治療歴、（５）同種間幹細胞移植、（６）治験薬の第１回投与前１２週間以内のリツキシマブ、アレムツズマブまたは他の被験製剤もしくは市販の生物学的製剤の治療［注：直ちに治療を要する高悪性リンパ腫の患者の場合は休薬期間を２８日まで短縮可能］、（７）治験薬の第１回投与前２８日以内の免疫抑制療法（非生物学的）、（８）治験薬の第１回投与前２８日以内の被験非生物学的製剤治療、（９）治験薬と同様の化学的または生物学的組成の化合物によるアレルギー反応歴、（１０）テトラサイクリン系抗生物質群のいずれかの化合物に対する過敏性歴、（１１）治験参加前の５年以内のＢ細胞悪性腫瘍以外の悪性腫瘍歴（ただし、皮膚の基底もしくは扁平上皮細胞癌、または子宮頸部上皮内癌の摘出／切除は除く）、（１２）第１回投与前の４週間以内に、既知の活動性細菌、ウイルス、真菌、マイクロバクテリア、その他の感染、または入院もしくはＩＶ抗感染治療を要する何らかの主要なエピソード、（１３）試験の実施を阻害し得る、または患者に重大な危険を及ぼし得る同時発生の疾患または医学的状態のエビデンス、（１４）継続中の全身性コルチコステロイド治療（ただし、最高５ｍｇ／日のプレドニゾンまたはその均等物の他の（非腫瘍かつ非免疫抑制）適応へのコルチコステロイドの使用は除く）、（１５）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染、またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）もしくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の慢性感染、（１６）アロプリノール及びラスブリカーゼの両方に対する既知の過敏性、（１７）妊娠中または授乳中の女性、（１８）試験期間中然るべき避妊を望まない、性的パートナーがいる妊娠の可能性がある男女。
治療
Ａｂ１は、滅菌単回使用バイアルに入った液体として供給した。各バイアルは、引抜き可能な体積で濃度２ｍｇ／ｍＬの１ｍＬのＡｂ１を収容する。調製及び投与の詳細な取扱説明は、調剤マニュアルに掲載する。
用量レベル（ＤＬ）１の初期Ａｂ１用量は、３０ｍｃｇであった。用量はＤＬ１０に達すると最大の８０００ｍｃｇまで増加され得る。Ａｂ１の各用量は、外来の登録患者に少なくとも６０分かけてＩＶ注入により投与した。用量レベルを表２３に例示する。
Figure 0006681396
患者はＡｂ１を４週間の誘導期の間は週１回ずつ、その後は月に１回ずつさらに５用量を、それぞれ割り当てられたコホートの用量で受けた。
エンドポイント
主エンドポイントは、Ａｂ１の推奨される第２相用量（ＲＰ２Ｄ）として最大耐容用量（ＭＴＤ）及び／または最適生物学的用量（ＯＢＤ）を決定するための、安全性（具体的には有害事象［ＡＥ］及びＤＬＴ）である。
副次的評価項目は、（ａ）薬物動態：Ａｂ１の濃度、（ｂ）免疫原性：抗Ａｂ１抗体、（ｃ）ＣＬＬ患者では、奏効率（ＯＲＲ）、無増悪生存（ＰＦＳ）及び全生存（ＯＳ）、ならびに微小残存病変（ＭＲＤ）などの抗腫瘍活性。ＯＲＲに関しては、腫瘍の奏功性評価は、ＮＣＩ国際ワーキンググループ（ＮＣＩ−ＷＧ）の改訂版悪性リンパ腫治療効果判定基準（Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｌｙｍｐｈｏｍａ）にしたがい、ＣＬＬの診断と治療については慢性リンパ性白血病ガイドラインの国際ワークショップ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）にしたがって実施される。
この試験の探索的評価項目としては、（ａ）Ｂ細胞及びＴ細胞のサブセット及び表現型、（ｂ）循環サイトカイン量、及び（ｃ）Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）などの薬力学的（ＰＤ）測定が挙げられる。
手順及び評価
ベースライン手順としては、脳ＭＲＩ、心電図（ＥＣＧ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の検査、及び凝固が挙げられる。
安全性手順としては、病歴、健康診断、Ｂ症状の評価、活動指標の評価、臨床検査、バイタルサイン、ＡＥ、及び併用薬が挙げられる。
有効性手順としては、ＣＴスキャン、１８Ｆ−フルオロデオキシグルコースポジトロン陽電子放出断層撮影（ＦＤＧ−ＰＥＴ）スキャン、骨髄穿刺及び生検、リンパ節及び／または腫瘍生検、及び末梢血液試料（ＣＬＬ患者のみ）などの腫瘍評価が挙げられる。
ＰＫ及び抗薬物抗体（ＡＤＡ）の評価用血液試料を登録患者から採取した。
登録患者のバイオマーカーの試料を回収して、サイトカイン産生、炎症促進性サイトカインの血清レベルの変化、ならびにリンパ球サブセット及び活性状態の変化を観測した。それに加えて、これらの試料は、根底の疾患の臨床経過に影響を及ぼすかまたは治療の副作用を変えるようなバリエーションに関する腫瘍または体細胞の遺伝子解析も可能にする。
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態により限定されない。実際、上記の説明及び添付の図面から、本明細書で記載したものに加えて、本発明の様々な変更形態が当業者には明白になろう。そのような変更形態も、添付の請求項の範囲内とする。

Claims (12)

  1. 対象におけるＣＤ２０陽性Ｂ細胞癌の治療または寛解のための二特異性抗体を含む医薬組成物であって、前記組成物は、サイトカインカスケードの作用を軽減する用量漸増プロトコルで投与され、前記用量漸増プロトコルは、第１の用量の前記二特異性抗体を投与すること、及び引き続いて第２の用量の前記二特異性抗体を投与することを含み、前記第２の用量は前記第１の用量を上回り、
    前記二特異性抗体は、ヒトＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、ヒトＣＤ２０に結合する第２の抗原結合ドメイン、及び前記第１と前記第２の抗原結合ドメインそれぞれに連結された重鎖定常領域を含み、前記重鎖定常領域は、
    （ａ）位置２２８から２３６まで（ＥＵナンバリング）ＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号５２）を含むヒトＩｇＧ２ヒンジ下部アミノ酸配列、
    （ｂ）位置２１６から２２７まで（ＥＵナンバリング）のヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４ヒンジ上部アミノ酸配列、
    （ｃ）位置２３７から３４０まで（ＥＵナンバリング）のヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列、および
    （ｄ）ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン及びヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、またはヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメイン及びヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン
    を含み、
    前記二特異性抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイで測定される場合に、ヒトＦｃγＲＩＩＡに対して、ヒトＦｃγＲＩＩＢに対するよりも高い結合親和力を示し、かつヒトＦｃγＲＩおよびヒトＦｃγＲＩＩＩに対する結合親和力をほとんどまたはまったく示さない、
    前記組成物。
  2. 前記Ｂ細胞は、前駆Ｂリンパ球、成熟Ｂリンパ球、またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記対象は、残存癌を有することに基づき選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 前記癌はリンパ腫または白血病である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 前記癌は、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ヘアリーセル白血病及びバーキットリンパ腫からなる群より選択される、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. 前記第１の用量は最大１０００μｇである、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 前記対象は、（ａ）抗ＣＤ２０単一特異性単独療法、または（ｂ）リツキシマブ単独療法に耐性があるかまたは効果が不十分である腫瘍を有している、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. 前記対象は、前記二特異性抗体の投与の少なくとも１日〜１年前に、抗ＣＤ２０単一特異性抗体療法を受けている、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 前記重鎖定常領域は、
    （ａ）キメラヒンジのアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号５３）、または
    （ｂ）キメラヒンジのアミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号５４）を含む、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. （ａ）前記第１の抗原結合ドメインは、配列番号１０を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列を含み、
    （ｂ）前記第１の抗原結合ドメインは、配列番号１８を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を含み、
    （ｃ）前記第２の抗原結合ドメインは、配列番号２を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列を含み、
    （ｄ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインは、配列番号１０を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列、及び配列番号１８を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を含み、
    （ｅ）ヒトＣＤ２０に特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインは、配列番号２を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列、及び配列番号１８を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を含み、
    （ｆ）前記第１の抗原結合ドメイン（Ａ１）は、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含み、
    （ｉ）Ａ１−ＨＣＤＲ１は配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｉ）Ａ１−ＨＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｉｉ）Ａ１−ＨＣＤＲ３は配列番号１６のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｖ）Ａ１−ＬＣＤＲ１は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、
    （ｖ）Ａ１−ＬＣＤＲ２は配列番号２２のアミノ酸配列を含み、
    （ｖｉ）Ａ１−ＬＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
    （ｇ）ヒトＣＤ２０に特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメイン（Ａ２）は、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含み、
    （ｉ）Ａ２−ＨＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｉ）Ａ２−ＨＣＤＲ２は配列番号６のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｉｉ）Ａ２−ＨＣＤＲ３は配列番号８のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｖ）Ａ２−ＬＣＤＲ１は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、
    （ｖ）Ａ２−ＬＣＤＲ２は配列番号２２のアミノ酸配列を含み、
    （ｖｉ）Ａ２−ＬＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を含む、
    請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. ヒトＣＤ３に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメイン（Ａ１）は、３つの重鎖相補性決定領域（Ａ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２、Ａ１−ＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（Ａ１−ＬＣＤＲ１、Ａ１−ＬＣＤＲ２、Ａ１−ＬＣＤＲ３）を含み、ヒトＣＤ２０に特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメイン（Ａ２）は３つの重鎖相補性決定領域（Ａ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２及びＡ２−ＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（Ａ２−ＬＣＤＲ１、Ａ２−ＬＣＤＲ２及びＡ２−ＬＣＤＲ３）を含み、
    （ｉ）Ａ１−ＨＣＤＲ１は配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｉ）Ａ１−ＨＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｉｉ）Ａ１−ＨＣＤＲ３は配列番号１６のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｖ）Ａ１−ＬＣＤＲ１は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、
    （ｖ）Ａ１−ＬＣＤＲ２は配列番号２２のアミノ酸配列を含み、
    （ｖｉ）Ａ１−ＬＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
    （ｖｉｉ）Ａ２−ＨＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を含み、
    （ｖｉｉｉ）Ａ２−ＨＣＤＲ２は配列番号６のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｘ）Ａ２−ＨＣＤＲ３は配列番号８のアミノ酸配列を含み、
    （ｘ）Ａ２−ＬＣＤＲ１は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、
    （ｘｉ）Ａ２−ＬＣＤＲ２は配列番号２２のアミノ酸配列を含み、
    （ｘｉｉ）Ａ２−ＬＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を含む、
    請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  12. ヒトＣＤ３に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、ヒトＣＤ２０に特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインは、（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
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Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20210648A1 (es) 2013-12-17 2021-03-26 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd3 y metodos de uso
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
EP3693391A1 (en) 2014-09-12 2020-08-12 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and immunoconjugates
RS60739B1 (sr) 2014-11-17 2020-09-30 Regeneron Pharma Postupci za lečenje tumora upotrebom cd3xcd20 bispecifičnog antitela
CA2973159A1 (en) 2015-01-08 2016-07-14 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
EP3310811B1 (en) 2015-06-16 2021-06-16 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
SI3310814T1 (sl) 2015-06-16 2023-11-30 F. Hoffmann - La Roche Ag HUMANIZIRANA IN AFINITETNO DOZORELA PROTITELESA PROTI FcRH5 IN METODE ZA NJIHOVO UPORABO
CN107847568B (zh) 2015-06-16 2022-12-20 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cll-1抗体和使用方法
AU2017273147A1 (en) * 2016-06-02 2019-01-03 Immunocore Limited Dosing regimen for GP100-specific TCR - anti-CD3 SCFV fusion protein
US11466094B2 (en) * 2016-11-15 2022-10-11 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-CD20/anti-CD3 bispecific antibodies
MX2020006125A (es) 2017-12-14 2020-08-24 Hoffmann La Roche Uso de un anticuerpo biespecifico de cea cd3 y un antagonista de la union al eje de pd-1 en un regimen de dosificacion para tratar el cancer.
MX2020008289A (es) 2018-02-08 2020-09-25 Genentech Inc Moleculas biespecificas de union al antigeno y metodos de uso.
CN112771077A (zh) * 2018-08-31 2021-05-07 瑞泽恩制药公司 针对cd3/c20双特异性抗体的减轻细胞因子释放综合征的给药策略
MX2021009533A (es) 2019-02-12 2021-11-12 Regeneron Pharma Composiciones y metodos para usar anticuerpos bispecificos para unirse al complemento y a un antigeno objetivo.
TW202135860A (zh) * 2019-12-10 2021-10-01 美商再生元醫藥公司 含有抗ｃｄ２０ｘ抗ｃｄ３雙特異性抗體之穩定調配物
MX2022007158A (es) 2019-12-13 2022-07-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-ly6g6d y metodos de uso.
CN111394387A (zh) * 2020-03-13 2020-07-10 苏州智享众创孵化管理有限公司 一种双特异性抗体细胞株的构建和筛选方法
EP4126954A1 (en) * 2020-03-23 2023-02-08 Cytoarm Co. Ltd. Bi-specific antibodies for use in producing armed immune cells
CN111411079A (zh) * 2020-03-27 2020-07-14 北京时合生物科技有限公司 细胞培养方法、改造抗体、细胞培养基、细胞产品及其应用
KR20230066040A (ko) 2020-09-10 2023-05-12 젠맵 에이/에스 만성 림프구성 백혈병을 치료하기 위한 cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체
US20240034812A1 (en) 2020-09-10 2024-02-01 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
JP2023542289A (ja) 2020-09-10 2023-10-06 ジェンマブ エー／エス 濾胞性リンパ腫を治療するための併用療法におけるｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体
AU2021339006A1 (en) 2020-09-10 2023-04-13 Genmab A/S Bispecific antibody against CD3 and CD20 in combination therapy for treating diffuse large B-cell lymphoma
US20230357440A1 (en) 2020-09-10 2023-11-09 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
KR20230157315A (ko) 2021-01-28 2023-11-16 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 사이토카인 방출 증후군을 치료하기 위한 조성물 및 방법
WO2022199555A1 (en) * 2021-03-23 2022-09-29 Guangzhou Lintonpharm Co., Ltd. A multispecific antigen binding protein binding to cd3 and the use thereof
WO2022256618A1 (en) * 2021-06-04 2022-12-08 Xencor, Inc. Dosing of a bispecific antibody that binds cd20 and cd3
CN114702593B (zh) * 2022-03-11 2023-12-08 苏州思萃免疫技术研究所有限公司 一种抗folr1/vegf的全人双特异性抗体及其筛选方法和应用
WO2023201226A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing
WO2023201291A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of mosunetuzumab and methods of use
WO2024061352A1 (zh) * 2022-09-23 2024-03-28 广州凌腾生物医药有限公司 分离的抗原结合蛋白及其应用

Family Cites Families (133)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4361549A (en) 1979-04-26 1982-11-30 Ortho Pharmaceutical Corporation Complement-fixing monoclonal antibody to human T cells, and methods of preparing same
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
WO1989007142A1 (en) 1988-02-05 1989-08-10 Morrison Sherie L Domain-modified constant region antibodies
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
JP3095175B2 (ja) 1992-11-13 2000-10-03 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトｂリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
ATE218143T1 (de) 1996-09-03 2002-06-15 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verwendung bi-und trispezifischer antikörper zur induktion einer tumorimmunität
CZ20003099A3 (cs) 1998-02-25 2002-04-17 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Zvýąení doby poloviční ľivotnosti cirkulujících fúzních proteinů odvozených od protilátek
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ID27512A (id) 1998-04-21 2001-04-12 Microment Ges Fur Biomedizinis Polipeptid tetapan cd19xcd3 dan kegunaan-kegunaannya
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
NZ573838A (en) 1998-08-11 2011-01-28 Biogen Idec Inc Combination therapies for b-cell lymphomas comprising administration of anti-cd20 antibody
US6224866B1 (en) 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1141024B1 (en) 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
DK2270150T4 (da) 1999-04-09 2019-08-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle.
MXPA01011279A (es) 1999-05-07 2002-07-02 Genentech Inc Tratamiento de enfermedades autoinmunes con antagonistas que se unene a los marcadores de superficie, de celulas b.
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
ITMI991299A1 (it) 1999-06-11 2000-12-11 Consiglio Nazionale Ricerche Uso di anticorpi contro antigeni di superficie per il trattamento della malattia trapianto contro ospite
US7396917B2 (en) 2000-12-05 2008-07-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Rationally designed antibodies
JP4524074B2 (ja) 2001-03-09 2010-08-11 アーナソン， バリー ジー． 低親和性Ｆｃγレセプターを標的化する重合体の免疫グロブリン融合タンパク質
CA2461631A1 (en) 2001-09-28 2003-04-03 Elusys Therapeutics, Inc. Methods and compositions for prevention, diagnosis, and treatment of cancer using bispecific molecules
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
KR101033196B1 (ko) 2002-02-14 2011-05-09 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 항-ｃｄ20 항체 및 그 융합 단백질 및 이들의 이용방법
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US8673589B2 (en) 2002-05-29 2014-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Inducible eukaryotic expression system
EP1400534B1 (en) 2002-09-10 2015-10-28 Affimed GmbH Human CD3-specific antibody with immunosuppressive properties
US7820166B2 (en) 2002-10-11 2010-10-26 Micromet Ag Potent T cell modulating molecules
PL216630B1 (pl) 2002-10-17 2014-04-30 Genmab As Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie
US7608260B2 (en) 2003-01-06 2009-10-27 Medimmune, Llc Stabilized immunoglobulins
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
JP2006524039A (ja) 2003-01-09 2006-10-26 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型Ｆｃ領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
KR101351122B1 (ko) 2003-05-09 2014-01-14 듀크 유니버시티 Ｃｄ２０-특이적 항체 및 이를 이용한 방법
AR044388A1 (es) 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
US20070041972A1 (en) 2003-05-30 2007-02-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibodies and fusion proteins that include engineered constant regions
WO2004106380A2 (en) 2003-05-31 2004-12-09 Micromet Ag Human-anti-human cd3 binding molecules
AU2004242847B2 (en) 2003-05-31 2011-06-09 Amgen Research (Munich) Gmbh Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody for EpCAM
US20050163782A1 (en) 2003-06-27 2005-07-28 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
EP1660129A2 (en) 2003-08-29 2006-05-31 Genentech, Inc. Anti-cd20 therapy of ocular disorders
US8399618B2 (en) 2004-10-21 2013-03-19 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions, and substitutions
EP2292664B1 (en) 2003-10-16 2016-11-23 Amgen Research (Munich) GmbH Multispecific deimmunized CD3-binders
CA2549237A1 (en) 2003-12-19 2005-07-07 Genentech, Inc. Detection of cd20 in transplant rejection
US7276585B2 (en) 2004-03-24 2007-10-02 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
SG172616A1 (en) 2004-04-13 2011-07-28 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin antibodies
EP1740946B1 (en) 2004-04-20 2013-11-06 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
ZA200608982B (en) 2004-05-05 2008-06-25 Genentech Inc Preventing autoimmune disease by using an anti-CD20 antibody
WO2005118635A2 (en) 2004-06-03 2005-12-15 Novimmune S.A. Anti-cd3 antibodies and methods of use thereof
SV2006002131A (es) 2004-06-04 2006-01-26 Genentech Inc Uso de un anticuerpo para el tratamiento de lupus
CA2580271A1 (en) 2004-10-05 2006-04-20 Genentech, Inc. Method for treating vasculitis
AR051836A1 (es) 2004-11-30 2007-02-14 Centocor Inc Antagonistas de receptor 3 simil toll metodos y usos
US20120189643A1 (en) 2004-11-30 2012-07-26 Carton Jill M Toll Like Receptor 3 Antagonists, Methods and Uses
WO2006074399A2 (en) 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Multispecific binding molecules comprising connecting peptides
US7700099B2 (en) 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
TW200714289A (en) 2005-02-28 2007-04-16 Genentech Inc Treatment of bone disorders
AR053579A1 (es) 2005-04-15 2007-05-09 Genentech Inc Tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (eii)
RU2007143302A (ru) 2005-04-22 2009-05-27 Дженентек, Инк. (Us) Способ лечения деменции или болезни альцгеймера антителами к cd20
EP1891113A2 (en) 2005-06-02 2008-02-27 AstraZeneca AB Antibodies directed to cd20 and uses thereof
KR20140053410A (ko) 2005-08-19 2014-05-07 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
EP2500357A3 (en) 2005-08-19 2012-10-24 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1940881B1 (en) 2005-10-11 2016-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
WO2007047578A2 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Medimmune, Inc. Cell display of antibody libraries
NZ599035A (en) 2006-01-12 2013-12-20 Alexion Pharma Inc Antibodies to ox-2/cd200 and uses thereof
EP1820513A1 (en) 2006-02-15 2007-08-22 Trion Pharma Gmbh Destruction of tumor cells expressing low to medium levels of tumor associated target antigens by trifunctional bispecific antibodies
PT2359834T (pt) 2006-03-15 2016-12-23 Alexion Pharma Inc Tratamento de doentes com hemoglobimúria paroxística noturna por meio de um inibidor de complemento
US8048421B2 (en) 2006-03-23 2011-11-01 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Agonist antibody to human thrombopoietin receptor
CA2652976C (en) 2006-06-02 2015-08-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity antibodies to human il-6 receptor
RU2448979C2 (ru) 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
AU2008234248C1 (en) 2007-03-29 2015-01-22 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
WO2008119566A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
CN101687915B8 (zh) 2007-04-03 2018-08-03 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
MX2009012343A (es) 2007-05-14 2010-02-10 Biogen Idec Inc Regiones fc (sc fc) de cadena sencilla, polipeptidos de enlace que comprenden las mismas, y metodos relacionados con ello.
KR101380729B1 (ko) 2007-05-30 2014-04-10 포항공과대학교 산학협력단 면역글로불린 융합 단백질
CA2689895A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Non-glycosylated recombinant monovalent antibodies
US20100267934A1 (en) 2007-05-31 2010-10-21 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
US20110077383A1 (en) 2007-07-03 2011-03-31 Medimmune, Llc Hinge domain engineering
US7879984B2 (en) 2007-07-31 2011-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to human CD20 and method of using thereof
ES2517872T3 (es) 2007-08-10 2014-11-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos humanos de alta afinidad para el factor de crecimiento nervioso humano
PL3059246T3 (pl) 2007-09-26 2018-11-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Zmodyfikowany region stały przeciwciała
AR068564A1 (es) 2007-09-26 2009-11-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti- receptor de il-6 (interleuquina 6)
KR20100117120A (ko) 2008-02-20 2010-11-02 지투 인플레메이션 피티와이 엘티디 인간화된 항-Ｃ5ａＲ 항체
JP2012508022A (ja) 2008-11-06 2012-04-05 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 減少した免疫原性を有する操作された抗体および作製方法
HUE046222T2 (hu) 2008-11-07 2020-02-28 Amgen Res Munich Gmbh Gyermekkori akut limfoblasztos leukémia kezelése bispecifikus, CD3XCD19 elleni ellenanyagokkal
AR074438A1 (es) 2008-12-02 2011-01-19 Pf Medicament Proceso para la modulacion de la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal
SG10201610247QA (en) 2008-12-03 2017-02-27 Genmab As Antibody variants having modifications in the constant region
US20120100140A1 (en) 2009-01-23 2012-04-26 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized fc polypeptides with reduced effector function and methods of use
TWI646193B (zh) 2009-03-19 2019-01-01 中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
MY164121A (en) 2009-06-26 2017-11-30 Regeneron Pharma Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
JO3182B1 (ar) 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
WO2011037158A1 (ja) 2009-09-24 2011-03-31 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
CA2782218C (en) 2009-11-30 2018-07-31 Janssen Biotech, Inc. Antibody fc mutants with ablated effector functions
US20130129723A1 (en) 2009-12-29 2013-05-23 Emergent Product Development Seattle, Llc Heterodimer Binding Proteins and Uses Thereof
CN103124743A (zh) 2009-12-29 2013-05-29 新兴产品开发西雅图有限公司 Ron结合构建物及其使用方法
LT3095871T (lt) 2010-02-08 2019-05-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bendros lengvosios grandinės pelė
JP5889181B2 (ja) 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
CA2794708C (en) 2010-03-29 2021-11-16 Zymeworks Inc. Antibodies with enhanced or suppressed effector function
KR101930964B1 (ko) * 2010-04-20 2018-12-19 젠맵 에이/에스 이종이량체 항체 ｆｃ-함유 단백질 및 그의 생산 방법
WO2011137362A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 Rother Russell P Antibodies having reduced immunogenicity in a human
GB201014033D0 (en) 2010-08-20 2010-10-06 Ucb Pharma Sa Biological products
PL2616489T3 (pl) 2010-09-16 2017-07-31 Baliopharm Ag Przeciwciało anty-huTNFR1
EP4303237A3 (en) 2010-11-30 2024-03-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
JP6012624B2 (ja) 2010-12-23 2016-10-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 活性プロテアーゼ耐性抗体Ｆｃ突然変異体
RS58190B2 (sr) 2011-02-08 2021-08-31 Medimmune Llc Antitela koja specifično vezuju staphylococcus aureus alfa toksin i postupci njihove primene
AU2012234335B2 (en) 2011-03-29 2016-09-01 Roche Glycart Ag Antibody Fc variants
WO2013012733A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Biogen Idec Ma Inc. Heterodimeric fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
BR112014004168A2 (pt) 2011-08-23 2017-12-12 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, uso do anticorpo biespecífico, célula hospedeira procariótica ou eucariótica, método de produção de anticorpo e invenção
CA2899433A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Gliknik Inc. Fusion proteins comprising igg2 hinge domains
JO3820B1 (ar) 2012-05-03 2021-01-31 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها
KR20150023535A (ko) 2012-06-05 2015-03-05 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 공통 경쇄를 사용하여 완전한 인간 이중 특이적 항체를 만드는 방법
KR20150036606A (ko) 2012-07-13 2015-04-07 자임워크스 인코포레이티드 항-cd3 구조체를 포함하는 이중특이적 비대칭 이형이합체
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
US10358492B2 (en) 2012-09-27 2019-07-23 Merus N.V. Bispecific IgG antibodies as T cell engagers
WO2014054804A1 (ja) 2012-10-05 2014-04-10 協和発酵キリン株式会社 ヘテロダイマータンパク質組成物
KR20150064068A (ko) 2012-10-08 2015-06-10 로슈 글리카트 아게 2개의 Fab 단편을 포함하는 FC-부재 항체 및 이용 방법
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
UA119646C2 (uk) 2013-07-05 2019-07-25 Ґенмаб А/С Гуманізоване антитіло, що зв`язується з сd3 людини
BR112016000666A2 (pt) 2013-07-12 2017-10-03 Zymeworks Inc Constructos de ligação de antígeno cd3 e cd19 biespecíficos
PE20210648A1 (es) * 2013-12-17 2021-03-26 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd3 y metodos de uso
CN105829347B (zh) 2013-12-20 2020-09-08 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性her2抗体及使用方法
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
RS60739B1 (sr) 2014-11-17 2020-09-30 Regeneron Pharma Postupci za lečenje tumora upotrebom cd3xcd20 bispecifičnog antitela
US10556952B2 (en) 2015-03-30 2020-02-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to Fc gamma receptors
GB201506407D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
JP7023231B2 (ja) 2015-09-23 2022-02-21 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 最適化抗ｃｄ３二重特異性抗体及びその使用
AU2016378573A1 (en) 2015-12-22 2018-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-CD20/anti-CD3 antibodies to treat acute lymphoblastic leukemia

Also Published As

Publication number Publication date
US20180194841A1 (en) 2018-07-12
AU2015350075B2 (en) 2021-06-03
MX2017006312A (es) 2017-08-21
CA2967820A1 (en) 2016-05-26
KR20170089881A (ko) 2017-08-04
DK3221359T3 (da) 2020-06-22
HUE050831T2 (hu) 2021-01-28
EP3221359A1 (en) 2017-09-27
IL252232B (en) 2021-03-25
ES2809455T3 (es) 2021-03-04
SI3221359T1 (sl) 2020-08-31
LT3221359T (lt) 2020-07-27
KR102614189B1 (ko) 2023-12-18
EP3699198A1 (en) 2020-08-26
HK1244293A1 (zh) 2018-08-03
AU2015350075A1 (en) 2017-06-29
IL252232A0 (en) 2017-07-31
JP2018505129A (ja) 2018-02-22
WO2016081490A1 (en) 2016-05-26
PT3221359T (pt) 2020-06-23
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