JP6096196B2 - 抗αβＴＣＲ抗体 - Google Patents

Description

本発明は、アルファ・ベータＴ細胞受容体（αβＴＣＲ）に特異的な抗体に関する。本発明は特に、マウスモノクローナル抗体ＢＭＡ０３１に由来するヒト化抗αβＴＣＲ抗体、および免疫抑制療法における前記ヒト化抗体の使用に関する。

自己免疫疾患および臓器移植治療における免疫抑制剤の使用は十分な確証が得られているが、その方法は最適とは程遠い。これらの薬剤で治療した患者では、毒性、日和見感染、サイトカインストーム、および癌のリスク増加がよくみられる。この分野において生物製剤を使用することにより患者の予後をある程度は改善してきたが、依然としてこれらの副作用は明白である。

免疫抑制のために、リンパ球に対するポリクローナル抗血清を使用することがよく知られている。しかしながら抗血清は、生産に多大な労力を要し、バッチ間での特性のばらつきを示し、ポリクローナル抗血清を用いて得ることができる特異性は限定的である。

ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（非特許文献１）が初めてハイブリドーマ技術によるモノクローナル抗体産生を記述した。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）はポリクローナル抗血清と比較してより特異的であり、より一定した特性を有する。ｍＡｂは、臨床的な臓器移植における免疫抑制療法に最も頻繁にうまく用いられてきた。しかしながら、自己免疫疾患および移植患者を治療するための免疫抑制剤として用いられるほとんどのｍＡｂは広い免疫抑制能力を有するため、おそらく全てが移植片拒絶反応に関与するとは限らないが幅広い免疫細胞の機能に望ましくない影響を与える。

１９７９年に初めて、ハイブリドーマ技術を用いてＴ細胞表面受容体抗原に対するマウスモノクローナル抗体が生産された（非特許文献２）。Ｋｕｎｇらによって発見された３種のモノクローナル抗体のうち１種のムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）と名付けられた抗体は、Ｔ細胞のＣＤ３受容体に対する特異性を有することが確認されており、これらは末梢の成熟Ｔ細胞の９５％より多くと反応し、未成熟の胸腺細胞に影響を与えない。ＯＫＴ３のＣＤ３複合体への結合は、ＣＤ３受容体の内在化および末梢におけるＣＤ３陽性細胞の低減を引き起こす。ＯＫＴ３治療が成功すると、それに伴いＣＤ３陽性Ｔ細胞がおよそ６０％から５％未満に迅速に減少する。

ＯＫＴ３は、腎臓移植後に急性同種移植片拒絶反応を起こした患者の治療に広範に用いられてきた（非特許文献３および非特許文献４）。さらに、同種骨髄移植における急性移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を予防するために、ドナー髄質から成熟Ｔ細胞を取り除くためにもＯＫＴ３およびウサギ補体が使用された（非特許文献５および非特許文献６）。ＯＫＴ３治療は、急性白血病のための同種骨髄移植におけるＧＶＨＤ予防では有効のようであるが、ＯＫＴ３を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｉｎ ｖｉｖｏの併用治療では、重症複合免疫不全の治療中のＧＶＨＤを予防できない（非特許文献７）。ＯＫＴ３でのＴ細胞の処理は、Ｔ細胞の活性化、免疫媒介物質の生産、およびＴ３のモジュレーションなどの免疫抑制と相反する数々の応答を惹起する。ＣＤ３−ｍＡｂ（例えばＯＫＴ３）によって認識されるＴ３−抗原複合体は、Ｔ細胞活性化中に重要な役割を果たすと言われている。アルファ／ベータＴリンパ球は、αβＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）・ＣＤ３複合体と名付けられた多量体タンパク質の集合体によってペプチド−ＭＨＣリガンドを認識する。この構造は、抗原と結合する可変性のαβＴＣＲ二量体と、ＴＣＲ・ＣＤ３表面における輸送、安定化、およびシグナル伝達に関与する３種の不変の二量体（ＣＤ３γε、δε、およびζζ）とで構成される。アルファ・ベータＴ細胞受容体（αβＴＣＲ）は大多数（約９５％）のＴ細胞で発現され、Ｔ細胞活性化においてＭＨＣ上に提示された抗原のエンゲージメントを経て重要な役割を有する。残りの５％の細胞は、ガンマ・デルタＴ細胞受容体（γδＴＣＲ）陽性である。γδＴＣＲ陽性細胞群は、細菌、ウイルス、および真菌起源の日和見感染に対する防御における先天性免疫応答において重要な役割を果たす。ガンマ・デルタＴ細胞は、移植の際の移植片拒絶反応に関与していない。それゆえに、αβＴＣＲ陽性細胞群を標的にしてγδＴＣＲ陽性群を残すことにより、日和見感染に対する基準の免疫防御を維持しつつかなりの治療効能がもたらすはずである。

マウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体ＢＭＡ０３１（非特許文献８；特許文献１）は、ＴＣＲアルファ／ベータ／ＣＤ３複合体に共通の決定基に特異的であり、ガンマ−デルタＴＣＲに結合しない。ＢＭＡ０３１は、高度に免疫抑制性であり、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）メカニズムにより活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘導することができる（非特許文献９）。ＢＭＡ０３１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで混合リンパ球反応を阻害し、多くの固形臓器移植の計画および急性移植片対宿主疾患（ａＧＶＨＤ）の治療における移植片拒絶反応の予防において予備的な臨床的効能を示している（非特許文献１０）。ヒト個体群の大多数において、ＢＭＡ０３１は、ヒトＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）にエンゲージしない（マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプに結合するＦｃγＲを有するヒトはおよそ１０％である）。従って、上記抗体はＴ細胞受容体の架橋によるＴ細胞活性化を引き起こさず、従って、Ｔ細胞活性化またはそれに関連するサイトカイン放出を誘導しない。この点に関して、ＢＭＡ０３１のプロファイルは、ＯＫＴ３のプロファイルよりも大いに好ましい。しかしながらＢＭＡ０３１はマウス抗体であるため、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が誘発されることを考慮すればヒト対象における繰り返しの投与には不適切である。

数種のＢＭＡ０３１のヒト化バージョンが記述されている（特許文献１；および非特許文献１１も参照）。特許文献１で述べられているように、単なるＣＤＲグラフティングでは、抗原結合をうまく保持することはできなかった。特許文献１で述べられているように、重要なフレームワーク改変を有する１種のクローン、ＥＵＣＩＶ３はＴ細胞にうまく結合したが、フローサイトメトリー競合アッセイでの判断によれば、αβＴＣＲへの結合は親のＢＭＡ０３１抗体ほど満足すべきものではなかった。発明者等はさらに、ＥｕＣＩＶ３のｉｎ ｖｉｔｒｏの免疫反応を阻害する能力は、ＢＭＡ０３１と比較して有意に低下することも示している（図２を参照）。加えてＥｕＣＩＶ３は元々野生型ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４主鎖で作製されたが、それでもなおＦｃγＲ結合を保持している。それゆえにこれらのヒト化抗体は、Ｔ細胞の活性化、増殖、および付随するサイトカイン放出をもたらすことから、ＢＭＡ０３１の元の特性とは顕著に異なっている。

抗体のグリコシル化の改変が当技術分野で知られている。例えば、非グリコシル化抗体は、広範に改変された官能性を有する可能性があることが知られている；非特許文献１２を参照されたい。しかしながら、ヒト化ＢＭＡ０３１の非グリコシル化型、または改変されたグリコシル化パターンを有する誘導体は、これまで記述されていない。

ＥＰ０４０３１５６

Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７（１９７５年） Ｋｕｎｇら（１９７９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０６：３４７〜３４９ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｐ．Ｓ．、Ｃｏｌｖｉｎ，Ｒ．Ｂ．、Ｃｏｓｉｍｉ，Ａ．Ｂ．（１９８４年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．３５：６３ Ｃｏｓｉｍｉ，Ａ．Ｂ．、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｒ．Ｃ．、Ｃｏｌｖｉｎ，Ｒ．Ｂ．ら（１９８１年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ３２：５３５ Ｐｒｅｎｔｉｃｅ，Ｈ．Ｇ．、Ｂｌａｃｋｌｏｃｋ，Ｈ．Ａ．、Ｊａｎｏｓｓｙ，Ｇ．ら（１９８２年）Ｌａｎｃｅｔ １：７００ Ｂｌａｃｋｌｏｃｋ，Ｈ．Ａ．、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ，Ｈ．Ｇ．、Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｍ．Ｊ．ら（１９８３年）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１１：３７ Ｈａｙｗａｒｄ，Ａ．Ｒ．ら（１９８２年）Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｏｂｓｅｒｖ．１００：６６５ Ｂｏｒｓｔら（１９９０年１１月）Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（３）：１７５〜８８ Ｗｅｓｓｅｌｂｏｒｇら（１９９３年５月）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１０）：４３３８〜４３４５ Ｋｕｒｒｌｅら（１９８９年２月）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２１（１）：１０１７〜１０１９ Ｓｈｅａｒｍａｎら（１９９１年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４３６６〜４３７３ Ｂｏｙｄら（１９９６年）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１〜１３１８

それゆえに、当技術分野において、ＥＵＣＩＶ３の結合特性を改善し、ＢＭＡ０３１の免疫抑制性および非Ｔ細胞活性化特性を有利に保持する抗αβＴＣＲヒト化抗体が求められている。

第１の態様において、ＢＭＡ０３１のＣＤＲを含み、ＢＭＡ０３１のその同種抗原への結合親和性を保持するヒト化モノクローナル抗体が提供される。第１の実施形態において、前記ヒト化抗体は、配列番号７、１２または１３に記載のＣＤＲおよび配列番号１７に記載のヒトＩＧＨ３−２３フレームワークを含む重鎖可変領域を含み、フレームワークの６位はドナー残基であり、その代わりの実施形態において、フレームワークの１８位はドナー残基である。場合により、フレームワークの４９位および／または６９位はドナー残基である。

第２の実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は、配列番号１５または１６に記載のＣＤＲおよび配列番号１８に記載のヒトＩＧＨＶ１−３^*０１フレームワークを含む重鎖可変領域を含み、フレームワークの３８位、４４位および／または４８位のうち１つまたはそれ以上はドナー残基であり、その代わりの実施形態において、フレームワークの４４位および４８位はドナー残基である。

第３の実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は、配列番号１４に記載のＣＤＲと、配列番号１９に記載のヒトＩＧＫＶ３−１１^*０１フレームワークとを含む軽鎖可変領域を含み、フレームワークの７０位および／または７１位はドナー残基である。場合により、４６位はドナー残基である。

第１の実施形態に係る抗体の例としては、配列番号７、配列番号１２、および配列番号１３に記載の配列を含む重鎖から選択される重鎖可変領域と、配列番号１４に記載の配列を含む軽鎖可変領域の配列とを含む抗体が挙げられる。

第２の実施形態に係る抗体の例としては、配列番号１５および配列番号１６に記載の配列を含む重鎖から選択される重鎖可変領域と、配列番号１４に記載の配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体が挙げられる。上述の実施形態に係るヒト化抗体は、ＢＭＡ０３１のヒト化バージョンである。それらの一次構造は、ＢＭＡ０３１と比較してαβＴＣＲへの結合が減少したヒト化抗体ＥｕＣＩＶ３の一次構造とは異なる。

配列表において、ＣＤＲは、注釈または下線で示される。フレームワークは、ＣＤＲの外側の全ての配列であり、この配列は「カバット（Ｋａｂａｔ）」の番号付けシステムに従って定義され、適用可能であれば「ＩＭＧＴ」のＣＤＲの定義を使用して拡張される。フレームワークの残基が、ドナーの配列に合わせるために変更されたと示されていない場合、その残基は通常アクセプターの残基であると理解される。

ヒト化抗体は、定常領域を含んでいてもよい。一実施形態において、定常領域は、ヒト由来である。

本発明のヒト化抗体は、Ｆｃ工学によってさらに改変されていてもよい。免疫グロブリンは、Ｆｃγ受容体を架橋する傾向があり、それにより抗Ｔ細胞抗体は構成的にＴ細胞を活性化することができる。Ｆｃγの架橋を回避するために、例えばＦａｂまたはＦｖ断片の作製により抗体を改変して、Ｆｃ領域を除去してもよいが、トランケートされた免疫グロブリンは、有益なエフェクター機能を失い、より短い血清中半減期を示す。それゆえに、ヒト化抗体のＦｃ領域は、Ｆｃγが架橋されないように改変してもよい。典型的な技術としては、例えばＮ２９７Ｑ突然変異でのＦｃ領域の改変による非グリコシル化免疫グロブリンの作製が挙げられる。またＦｃγと結合できない免疫グロブリンも、Ａｒｍｏｕｒら（１９９９年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３〜２６２４によって記述されている。ＩｇＧ１になされる改変は、Δａｂ改変として知られており、これは、ＩｇＧ残基が３２７位、３３０位、および３３１位で置換され、ＩｇＧ２残基が２３３位〜２３６位で置換されたΔａ変異と、２３６位の残基が欠失したΔｂ変異との組み合わせからなる。その他の実施形態において、本発明に係る抗体のグリコシル化パターンを改変してもよい。

一実施形態において、上記抗体は、突然変異Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、およびＹ３００Ｓのうち１つまたはそれ以上を含む。

実施形態において、上記抗体は、突然変異Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、およびＹ３００Ｓのうち２つまたはそれ以上を含む。例えば、複数の突然変異Ｎ２９７Ｑ／Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ、Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００ＳまたはＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓを含むヒト化抗体が提供される。

第２の態様において、ＢＭＡ０３１のＣＤＲを含み、ＢＭＡ０３１のＴ細胞抑制特性を保持するヒト化モノクローナル抗体が提供される。前記ヒト化抗体は、好ましくは、配列番号１２、１３、１５または１６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。

第３の態様において、記述した実施形態の前述の態様に係るヒト化モノクローナル抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域をコードする核酸が提供される。このような核酸は、ヒト化抗体の可変および定常領域をコードしていてもよい。重鎖および軽鎖は、別個の核酸にコードされていてもよいし、または同じ核酸分子にコードされていてもよい。

第４の態様によれば、前述の態様に係る核酸を発現する細胞が提供される。このような細胞は、例えば、培養中に抗体分子を発現するように適合させた細胞である。このような核酸は、細胞中での抗体分子の発現および／または細胞からの抗体分子の分泌に必要な、またはそれらを調節するシグナル配列および／もしくはその他の配列または改変を含んでいてもよい。

さらなる実施形態において、前述の態様で記述されているように、対象においてＴ細胞媒介応答を抑制することに使用されるヒト化抗体が提供される。

例えば、Ｔ細胞媒介応答は、固形臓器移植および複合組織移植のような組織移植、組織グラフト、多発性硬化症、ならびに１型糖尿病から選択される状態に関連する可能性がある。

さらにその他の実施形態は、異常なＴ細胞媒介応答に関連する状態に罹った対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、記述した実施形態に従って薬学的に有効な用量の抗体を投与することを含む上記方法を提供する。

従って、αβＴＣＲを選択的にモジュレートし、活性化αβＴＣＲ陽性Ｔ細胞のアポトーシスを誘導することができる、サイトカイン放出を誘導しない活性化能のないヒト化抗αβＴＣＲ抗体を作製した。これらの抗体は、Ｔ細胞媒介性疾患において免疫抑制剤として使用するために作製された。これらの抗体は、マウス抗αβＴＣＲ抗体ＢＭＡ０３１のヒト化により、さらにＦｃガンマ受容体の結合を防ぐためのヒト化抗体のＦｃ工学により作製された。記述した実施形態に係る抗体は、当技術分野において入手可能なＢＭＡ０３１のヒト化バージョンとは異なり、ＢＭＡ０３１の結合親和性を保持する。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの教育アッセイで示されるように、記述した実施形態に係る抗体の免疫抑制特性は、ＢＭＡ０３１の免疫抑制特性より優れている。その上、従来技術のヒト化ＢＭＡ０３１抗体とは異なり、記述した実施形態に係る抗体は、正常なＰＢＭＣにおいてサイトカイン放出を誘導しない。

第５の態様によれば、改変Ｆｃを含む抗体であって、前記改変Ｆｃは、ＦｃγＲ受容体結合を減少させる改変グリコシル化パターンを含み、突然変異Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、およびＹ３００Ｓのうち１つまたはそれ以上を含む上記抗体が提供される。

一実施形態において、上記抗体は、突然変異Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、およびＹ３００Ｓのうち２つまたはそれ以上を含む。

実施形態において、上記抗体は、複数の突然変異Ｎ２９７Ｑ／Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ、Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００ＳまたはＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓを含む。

例えば、上記抗体は、上述の本発明の態様で記述されているような抗体であってもよい。

第６の態様によれば、上述の本発明の態様で記述されているような第１の結合ドメインおよび腫瘍特異抗原に特異的な第２の結合ドメインの少なくとも１つの重鎖を含む、多重特異性を有する抗体が提供される。

一実施形態において、第１の結合ドメインは、本発明の第２の態様に係る重鎖を含む。

多重特異性を有する抗体は、多くの様々なコンフォメーションを含んでいてもよく、一実施形態において、多重特異性を有する抗体は、抗ＴＣＲ／ＣＤ３ ｓｃＦｖと、抗腫瘍ｓｃＦｖとを含む。

一実施形態において、多重特異性を有する抗体は、二重特異性を有する。

ＢＭＡ０３１はＥｕＣＩＶ３よりも強くαβＴＣＲと結合することを示すグラフである。ＰＥ標識ＢＭＡ０３１抗体と、ＢＭＡ０３１ ＭｏＩｇＧ２ｂ、ＢＭＡ０３１ ＨｕＩｇＧ１、およびＥｕＣＩＶ３ ＨｕＩｇＧ１抗体との結合の競合を示す。ＥｕＣＩＶ３は、ＢＭＡ０３１と比較して低い効力を有する。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの教育（ＩＶＥ）アッセイで、ＥｕＣＩＶ３はＢＭＡ０３１よりも低い効力を有することを示すグラフである。プロットは、生物学的アッセイにおいて、親のＢＭＡ０３１抗体と比較した場合のＥｕＣＩＶ３ヒト化抗体の性能の損失を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、様々な濃度（ｘ軸）の抗αβＴＣＲ抗体で処理し、ＣＭＶペプチド４９５〜５０３（ｐｐ６５）がパルス投与された自己樹状細胞と共に７日間培養した。 競合アッセイにおいてＨＥＢＥ１がＢＭＡ０３１と同等にαβＴＣＲと結合することを示すグラフである。ＰＥ標識ＢＭＡ０３１抗体と、ＢＭＡ０３１ ＨｕＩｇＧ１、ＨＥＢＥ１ ＨｕＩｇＧ１、およびＥｕＣＩＶ３ ＨｕＩｇＧ１抗体との結合の競合を示す。ＥｕＣＩＶ３は、ＢＭＡ０３１およびＨＥＢＥ１と比較して低い効力を有する。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの教育（ＩＶＥ）アッセイでＨＥＢＥ１はＥｕＣＩＶ３と類似した効力を有することを示すグラフである。ＩＶＥアッセイは図２に関して記述されているようにして行われた。 抗αβＴＣＲ可変ドメインの変異誘発の反復工程を示す略図である。影を付けたボックスのフレームワークは、所定のマウス残基が存在するＦＲ領域を示す。第１行における突然変異のうち影を付けた残基は、オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を維持するのに有用なマウスアミノ酸である。第２列における突然変異のうち影を付けた残基は、最終的な増殖工程で保持されたＣＤＲ領域周囲のマウス残基である。 最適化されたヒト化抗体はＢＭＡ０３１と比較して改善されたオフレートを有することを示すグラフである。Ｔ細胞におけるαβＴＣＲからの抗体の解離のカイネティクスをフローサイトメトリーによって測定した。ＢＭＡ０３１は、ＥｕＣＩＶ３およびＨＥＢＥ１と比較してより優れたオフレートを有していた。ＨＥＢＥ１の結合ドメインを最適化することによって、発明者等は、ＢＭＡ０３１と比較してＨＥＢＥ１．Ｈ１０のオフレートを改善することができた。 最適化されたヒト化抗体はＢＭＡ０３１と比較して改善されたオフレートを有することを示すグラフである。Ｔ細胞におけるαβＴＣＲからの抗体の解離のカイネティクスをフローサイトメトリーによって測定した。ＨＥＢＥ１の結合ドメインを最適化することによって、発明者等は、ＢＭＡ０３１と比較してＨＥＢＥ１．Ｈ６６のオフレートを改善することができた。 最適化されたヒト化抗体は、Δａｂおよび非グリコシル化フォーマットの両方において、ＢＭＡ０３１と比較して改善されたオフレートを有することを示すグラフである。Ｔ細胞におけるαβＴＣＲからの抗体の解離のカイネティクスをフローサイトメトリーによって測定した。 ＨＥＢＥ１の最適化によりＢＭＡ０３１と同等の官能性が得られることを示すグラフである。ＩＶＥアッセイは図４で記述されている通りである。ＢＭＡ０３１は、特異的な標的を用量依存的に溶解させることができないため、ＣＤ８＋Ｔ細胞の教育を阻害した。親のヒト化抗体、ＨＥＢＥ１はＢＭＡ０３１ほど効力を有しておらず、最大用量でしか教育を阻害することができなかった（第２の改善されていないヒト化Ａｂ、ＨＥＢＥ１ Ｈ１３を用いた場合も類似の結果が観察された）。ヒト化抗体、ＨＥＢＥ１ Ｈ１０にさらなる改善を施したところ、このアッセイにおいてＢＭＡ０３１と同等の効力を示した。 抗αβＴＣＲ抗体を用いたＩＶＥデータを示すグラフである。ＨＥＢＥ１およびＧＬ１ＢＭシリーズの抗体はいずれも、ＩＶＥの結果においてＢＭＡ０３１と比較して改善を示した。 抗原特異的な四量体の結合によって決定されたＩＶＥアッセイによる抗原陽性細胞を示すグラフである。抗原陽性の（すなわちＩＶＥアッセイで教育された）細胞は、ＭＨＣ−四量体分子に結合可能である。ＩＶＥアッセイをＴ細胞の抗原への教育を防ぐことができる抗体の存在下で行ったところ、アッセイの終了時にＭＨＣ−四量体に結合可能な細胞は減少した。 抗αβＴＣＲ抗体、ＯＫＴ３、および刺激ビーズの存在でのＰＢＭＣ増殖を示すグラフである。この比較において、抗αβＴＣＲ抗体ではＯＫＴ３の刺激活性は観察されなかった。 抗αβＴＣＲ抗体の存在下でのＰＢＭＣからのサイトカイン放出を示すグラフである。抗αβＴＣＲ抗体のサイトカイン放出プロファイルは、ＢＭＡ０３１によって示されたプロファイルに類似していた。 ＩＶＥアッセイにおけるＴ細胞からのＩＦＮ−ガンマの放出を示すグラフである。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、様々な濃度（図２のｘ軸を参照）の抗αβＴＣＲ抗体で処理し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの教育（ＩＶＥ）アッセイでＣＭＶペプチド４９５〜５０３（ｐｐ６５）がパルス投与された自己樹状細胞と共に７日間培養した。このアッセイでは、ＩＦＮ−ガンマ放出を測定した。 抗αβＴＣＲ抗体によって活性化誘導アポトーシスを示すグラフである。抗原によって刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞において、抗αβＴＣＲ抗体ＢＭＡ０３１およびＨＥＢＥ１ Ｈ６６の結合によりアポトーシスが誘導された。ＨＥＢＥ１ Ｈ６６のアポトーシスを誘導する能力はＢＭＡ０３１と比較して増加した。 グリコシル化突然変異体および非グリコシル化抗体の単離を示す図である。クーマシーブルー染色されたゲルは、グリコシル化突然変異体の発現および精製を示す。 Ｂｉａｃｏｒｅを用いたαβＴＣＲ抗体突然変異体のヒトＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示すグラフである。Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８およびＦ１５８）への結合を評価した。 Ｂｉａｃｏｒｅを用いたαβＴＣＲ抗体突然変異体のヒトＦｃγＲＩへの結合を示すグラフである。Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、組換えヒトおよびＦｃγＲＩへの結合を評価した。 グリコシル化突然変異体の抗αβＴＣＲ抗体の存在下でのＰＢＭＣからのサイトカイン放出（２日目）を示すグラフである。抗αβＴＣＲ抗体のＴＮＦａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮｙ、およびＩＬ１０に関するサイトカイン放出プロファイルは、ＢＭＡ０３１およびＨ６６デルタＡＢによって示されたプロファイルに類似していた。 グリコシル化突然変異体の抗αβＴＣＲ抗体の存在下でのＰＢＭＣからのサイトカイン放出（２日目）を示すグラフである。抗αβＴＣＲ抗体のＩＬ６、ＩＬ４およびＩＬ２に関するサイトカイン放出プロファイルは、ＢＭＡ０３１およびＨ６６デルタＡＢによって示されたプロファイルに類似していた。 グリコシル化突然変異体の抗αβＴＣＲ抗体の存在下でのＰＢＭＣからのサイトカイン放出（４日目）を示すグラフである。抗αβＴＣＲ抗体のＴＮＦａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮｙ、およびＩＬ１０に関するサイトカイン放出プロファイルは、ＢＭＡ０３１およびＨ６６デルタＡＢによって示されたプロファイルに類似していた。 グリコシル化突然変異体の抗αβＴＣＲ抗体の存在下でのＰＢＭＣからのサイトカイン放出（４日目）を示すグラフである。抗αβＴＣＲ抗体のＩＬ６、ＩＬ４およびＩＬ２に関するサイトカイン放出プロファイルは、ＢＭＡ０３１およびＨ６６デルタＡＢによって示されたプロファイルに類似していた。 ＴＲＡＣＥＲの結合プロファイルを示すグラフである。フローサイトメトリーによって評価された腫瘍標的細胞およびヒトＴ細胞の両方に対して二重特異性を有する抗体の結合プロファイルを示す。 様々なＴ細胞動員アームの細胞毒性活性を示すグラフである。ヒト化ＢＭＡ０３１抗体のパネルを作製し、このパネルから、腫瘍抗原を発現する細胞系に対して細胞毒性活性を示す多数の抗体を選択した。 様々なＴ細胞動員アームのサイトカイン放出プロファイルを示すグラフである。様々なＴ細胞動員アームを有するＴＲＡＣＥＲのパネルは、類似のサイトカイン放出プロファイルを示す。標的細胞の存在下では、Ｔ細胞活性化後に大量のサイトカインが検出されるが、刺激されていないヒトＰＢＭＣのみの存在下では、観察されるサイトカインレベルはそれよりも有意に低い。 Ｂｉａｃｏｒｅを用いたＣＤ５２抗体の突然変異体のヒトＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示すグラフである。Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、改変された抗ＣＤ５２の組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）への結合を評価した。ＦｃドメインにＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ突然変異を含む抗ＣＤ５２を使用して、改変された分子のエフェクター機能を評価した。Ａ：ＣＤ５２ペプチドへの結合。Ｂ：ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）への結合。Ｃ：対照としてのマウスＦｃＲｎへの結合。

特に他の指定がない限り、本明細書において用いられる全ての専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の方法または技術において、本明細書において記述されるものと類似する、または同等ないかなる方法および材料も使用することができる。本明細書で引用された全ての出版物は、本発明に関して使用される可能性がある出版物で報告された方法論、試薬、およびツールを記述し開示する目的で、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本願の方法および技術は、一般的に、特に他の指定がない限り、当技術分野で周知の従来の方法に従って、本明細書全体で引用され考察された様々な一般的でより詳細な参考文献に記載されているようにして行われる。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．編（１９９０年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．；Ｈａｒｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｌｉｍｂｉｒｄ，Ｌ．Ｅ．、およびＧｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．編（２００１年）Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｃｏ．；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，Ｓ．ら編、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｃ．Ｃ．編（１９８６年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら編（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編（１９９９年）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｒｅａｍら編（１９９８年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗｔｏｎ，Ｃ．Ｒ．およびＧｒａｈａｍ，Ａ．編（１９９７年）ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照されたい。

本明細書で言及される、ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト以外の抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフトしたヒト抗体のフレームワークで構成される抗体である。またヒトアクセプターのフレームワークの変更がなされていてもよい。ヒト化抗体の設計および生産の手法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第０１２５０２３号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許出願第０１２０６９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ．Ｓ．ら、ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許出願第０１９４２７６号Ｂ１；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許出願第０２３９４００号；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら、欧州特許出願第０５１９５９６号で記述されている。抗体、ヒト化抗体、ヒト型に改造された抗体、およびそれらの調製方法に関するさらなる詳細は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．およびＤｕｅｂｅｌ，Ｓ．編（２００１、２０１０）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹに見出すことができる。

用語「抗体」は、特に他の指定がない限り、抗体全体およびこのような抗体の抗原結合断片を指すのに用いられる。この用語は、例えば、４本鎖のＩｇＧ分子および抗体断片を包含する。

用語「抗体断片」は、本明細書で用いられる場合、例えば以下でさらに記述されるような無傷の全長の抗体の部分を意味する。

抗体は、例えばＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭなどのいかなるクラスに属するものでもよく、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのいかなるサブクラスに属するものでもよい。免疫グロブリンの異なるクラスおよびサブクラスはそれぞれ異なる特性を有しており、それぞれ異なる用途で有利な可能性がある。例えばＩｇＧ４抗体のＦｃ受容体への結合は少ない。

特異性とは、本明細書において記述される抗体に関して、特許請求された抗体が、その所定の同種抗原、すなわちαβＴＣＲ．ＣＤ３複合体と選択的に結合できることを意味する。本発明の抗体は、細胞で発現されるαβＴＣＲ．ＣＤ３複合体と結合する。

ヒトαβＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞表面に提示されるＴ細胞受容体複合体である。Ｋｕｈｎｓら（２００６年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２４：１３３〜１３９を参照されたい。この複合体は、マウスモノクローナル抗体ＢＭＡ０３１によって標的化される（欧州特許出願ＥＰ０４０３１５６；配列番号１および２を参照）。

天然に存在する免疫グロブリンは、共通のコア構造を有しており、このようなコア構造において、２本の同一な軽鎖（約２４ｋＤ）と２本の同一な重鎖（約５５または７０ｋＤ）とが四量体を形成する。各鎖のアミノ末端部分は可変（Ｖ）領域として知られており、各鎖の残りのより高度に保存された定常（Ｃ）領域と区別することができる。軽鎖の可変領域（またはＶ_Lドメインともいう）内には、Ｊ領域として知られているＣ末端部分がある。重鎖の可変領域（またはＶ_Hドメインともいう）内には、Ｊ領域に加えてＤ領域もある。免疫グロブリンにおけるアミノ酸配列変化の大部分は、抗原結合に直接的に関与する高度可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られているＶ領域中の３つの別々の位置に限定される。これらの領域は、アミノ末端側から順に、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と名付けられている。これらのＣＤＲは、より高度に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）によって所定位置に保持される。これらの領域は、アミノ末端側から順に、それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と名付けられている。ＣＤＲおよびＦＲ領域の位置および番号付けシステムは、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健社会福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、米国政府印刷局（Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ）（１９９１年）、この最新版はオンラインでみることができる）で定義されている。加えて、ＣＤＲ領域の境界は、ＩＭＧＴの命名法によってさらに定義されている。

記述した実施形態に係る抗体の可変領域は、配列番号５〜７および１２〜１６に見出すことができ、このような可変領域は、ＢＭＡ０３１をヒト化すること、すなわちＢＭＡ０３１のＣＤＲをヒトフレームワークに移すことにより得ることもできる。２種の一連のヒト化抗体、すなわち配列番号５〜７、１２、および１３を含むＨＥＢＥ１シリーズと、配列番号８、１５、および１６で示されるような重鎖可変領域を含むＧＬ１ＢＭシリーズとが記述されている。いずれの場合でも、用いられる軽鎖可変領域は、配列番号１４で示されるようなものである（ＧＬ１ＢＭ ＶＫ４３）。

用いられるヒトフレームワークは、ＨＥＢＥ１の場合はＩＧＨ３−２３であり、ＧＬ１ＢＭの場合はＩＧＨＶ１−３^*０１およびＩＧＫＶ３−１１^*０１である。

定常領域は、いかなるヒト抗体の定常領域由来のものでもよい。可変領域の遺伝子を発現ベクターの定常領域の遺伝子と共にインフレームにクローニングして、免疫グロブリン重鎖と軽鎖とが発現されるようにしてもよい。このような発現ベクターは、抗体合成のために抗体産生宿主細胞にトランスフェクトすることができる。

ヒト抗体の可変および定常領域は、配列データベース由来のものでもよい。例えば、免疫グロブリン配列は、ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭデータベース（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：（増補版１）：Ｄ７８１〜Ｄ７８４）またはＶＢａｓｅ（ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）で入手可能である。

非グリコシル化抗体は、広範に改変された官能性を有する可能性がある；Ｂｏｙｄら（１９９６年）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１〜１３１８を参照されたい。本明細書に記載されている「デルタａｂ」またはΔａｂ改変は、Ａｒｍｏｕｒら（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３〜２６２４で記載されているようなＦｃ改変である。抗体のＦｃ領域のグリコシル化を改変するための技術は当技術分野で知られており、化学的、酵素的、および突然変異による手段、例えばＣＨ₂ドメイン中のＮ２９７位の突然変異が挙げられる。非グリコシル化ＩｇＧ分子を生産するために抗体の遺伝子を突然変異させる技術は、ＴａｏおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９８９年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２５９５〜２６０１で記述される。

本明細書で言及される、「核酸」は、本発明の抗体をコードするＤＮＡ分子を含む。好ましくは、宿主細胞中で抗体の遺伝子を発現するのに適した発現ベクターである。抗体遺伝子発現のための発現ベクターおよび宿主細胞は当技術分野でよく知られている；例えば、Ｍｏｒｒｏｗ，Ｋ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎｅｗｓ（２００８年６月１５日）２８（１２）、およびＢａｃｋｌｉｗａｌ，Ｇ．ら（２００８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６（１５）：ｅ９６〜ｅ９６を参照されたい。

１．抗体
本発明は、ヒト化抗αβＴＣＲ抗体の抗原結合断片を包含する。上記抗体の断片は、αβＴＣＲ．ＣＤ３複合体と結合することができる。このような断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦ（ｖ）断片、または個々の軽鎖または重鎖可変領域もしくはそれらの部分を包含する。断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、ＦｖおよびｓｃＦｖが挙げられる。これらの断片は、無傷抗体のＦｃ部分がなく、無傷抗体よりも迅速に循環系から排出され、無傷抗体よりも非特異的な組織結合を少なくすることができる。これらの断片は、周知の方法を用いて無傷抗体から生産することができ、例えばパパイン（Ｆａｂ断片を生産する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）₂断片を生産する）などの酵素でのタンパク質分解的切断によって生産することができる。

上記抗体および断片はまた、αβＴＣＲ．ＣＤ３複合体に結合する単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）も包含する。ｓｃＦｖは、抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_L）に機能するように連結した抗体の重鎖可変領域（Ｖ_H）を含み、これらの重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、一緒にまたは個々に、αβＴＣＲと結合する結合部位を形成する。ｓｃＦｖは、アミノ末端の端部にＶ_H領域、およびカルボキシ末端の端部にＶ_L領域を含んでいてもよい。あるいはｓｃＦｖは、アミノ末端の端部にＶ_L領域、およびカルボキシ末端の端部にＶ_H領域を含んでいてもよい。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、Ｖ_LおよびＶ_Hは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え法を用いて、これらをＶ_L領域とＶ_H領域とが対になった単一のタンパク質鎖にすることができる合成リンカーによって連結して、１価の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）を形成することができる。ｓｃＦｖは、場合により、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にポリペプチドリンカーをさらに含んでいてもよい。

上記抗体および断片はまた、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６で記載されているようなＶ_Hドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）断片も包含する。

上記抗体および断片はまた、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）も包含する。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを用いて抗原結合領域を形成することが報告されており、この点において、これらの機能的な抗体は、重鎖のみの二量体である（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」と称される）。従って、抗体および断片は、αβＴＣＲ．ＣＤ３複合体に特異的に結合する重鎖抗体（ＨＣＡｂ）であってもよい。

上記抗体および断片はまた、αβＴＣＲ．ＣＤ３複合体に特異的なＳＭＩＰまたは結合ドメインと免疫グロブリンとの融合タンパク質である抗体も包含する。これらのコンストラクトは、抗体のエフェクター機能を実行するのに必要な免疫グロブリンドメインに融合した抗原結合ドメインを含む単鎖ポリペプチドである（ＷＯ２００５／０１７１４８を参照）。

上記抗体および断片はまた、二重特異性抗体も包含する。このような抗体および断片は、Ｖ_HおよびＶ_Lドメインが、単一のポリペプチド鎖で、ただし同じ鎖に２つのドメイン間で対を形成させるには短すぎるリンカーを用いて発現される２価抗体である。それによりこれらのドメインはその他の鎖の相補的ドメインと対を形成させられ、２つの抗原結合部位が形成される（例えば、ＷＯ９３／１１１６１を参照）。二重特異性抗体は、二重特異性であってもよいし、または単一特異性であってもよい。

上記抗体またはその抗体断片は、αβＴＣＲ．ＣＤ３複合体以外のいかなる標的とも交差反応しない。

上記抗体またはその断片は、その血清中半減期を長くするように改変してもよく、例えばＰＥＧまたはその他の水溶性ポリマー、例えば多糖ポリマーなどの分子を付加することによって改変し、半減期を長くすることができる。

上記抗体およびその断片は、二重特異性であってもよい。例えば、二重特異性抗体は、単一抗体（または抗体断片）と類似しているが、２種の異なる抗原結合部位（可変領域）を有していてもよい。二重特異性抗体は、例えば化学的技術、「ポリドーマ（ｐｏｌｙｄｏｍａ）」技術または組換えＤＮＡ技術などの様々な方法によって生産することができる。二重特異性抗体は、少なくとも２種の異なるエピトープへの結合特異性を有していてもよく、そのうち少なくとも一方は、αβＴＣＲ．ＣＤ３複合体である。他方の特異性は、例えばｉｎ ｖｉｖｏでの半減期延長のためにヒト血清アルブミンへの特異性など、いかなる有用な特異性または所望の特異性から選択することができる。

目下、診察機関における腫瘍学的用途のための二重特異性抗体の使用は、悪性腹水のケースで使用するために承認された三官能性カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）（Ｒｅｍｏｖｍａｂ（登録商標））と、現在、血液学的な悪性疾患において第ＩＩ相試験段階にある二重特異性抗体のブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）とが現実のものになりつつある。これらの分子は、共通して、Ｔ細胞に結合する結合アームと、腫瘍標的細胞に結合してＴ細胞媒介の腫瘍標的の溶解を引き起こす第２のアームとを有する。さらに共通して、これらの分子は、細胞表面上にあるＣＤ３タンパク質を介してＴ細胞を動員する。ＣＤ３を介した動員の代わりに、細胞表面上に発現されるαβＴ細胞受容体（αβＴＣＲ）も利用される。従って、本発明に係る抗体を使用して、腫瘍関連抗原への特異性とαβＴ細胞受容体（αβＴＣＲ）への特異性とを組み合わせることによって抗腫瘍抗体を開発することができる。

２．抗体産生
本明細書に記載の抗体の可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５〜７および１２〜１６に記載される。抗体産生は、当技術分野で周知のいかなる技術によっても行うことができ、例えば、ヤギ（Ｐｏｌｌｏｃｋら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１４７〜１５７を参照）、ニワトリ（Ｍｏｒｒｏｗ，Ｋ．Ｊ．Ｊ．（２０００）Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ ２０：１〜５５を参照）、マウス（上記のＰｏｌｌｏｃｋらを参照）、または植物（Ｄｏｒａｎ，Ｐ．Ｍ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１９９〜２０４、Ｍａ．Ｊ．Ｋ−Ｃ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：６０１〜６０６、Ｂａｅｚ，Ｊ．ら（２０００）ＢｉｏＰｈａｒｍ．１３：５０〜５４、Ｓｔｏｇｅｒ，Ｅ．ら（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：５８３〜５９０を参照）などのトランスジェニック生物において行うことができる。また抗体は、化学合成によって、または宿主細胞での抗体をコードする遺伝子の発現によっても生産することができる。

上記抗体をコードするポリヌクレオチドは、単離されて、複製可能なコンストラクトまたはベクター、例えば宿主細胞でのさらなる増殖または発現のためのプラスミドに挿入される。記述した実施形態に係るヒト化免疫グロブリンの発現に適したコンストラクトまたはベクター（例えば発現ベクター）が当技術分野において利用可能である。様々なベクターが利用可能であり、例えば、宿主細胞において単一コピーまたは複数コピーで維持されるベクター、または宿主細胞の染色体（複数可）に組み込まれるようになるベクターが挙げられる。コンストラクトまたはベクターは、適切な宿主細胞に導入することができ、ヒト化免疫グロブリンを発現する細胞は、培養で生産し維持することができる。ヒト化免疫グロブリンの発現のために、１種のベクターまたは複数種のベクターを用いることができる。

上記抗体をコードするポリヌクレオチドは、従来の手法（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）を用いて容易に単離され配列決定される。使用できるベクターとしては、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、微小染色体が挙げられ、なかでも典型的な実施形態はプラスミドである。一般的に、このようなベクターはさらに、発現を容易にするように軽鎖および／または重鎖ポリヌクレオチドに機能するように連結したシグナル配列、複製起点、１種またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列を含む。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドを別々のベクターに挿入して、（例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは形質導入によって）同時または連続的に同じ宿主細胞に導入してもよいし、あるいは必要に応じて、このような導入の前に、重鎖および軽鎖の両方を同じベクターに挿入してもよい。

適切な宿主細胞での発現のために、プロモーターを使用することができる。プロモーターは、構成的であってもよいし、または誘導性であってもよい。例えば、プロモーターをヒト化免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖をコードする核酸に機能するように連結して、プロモーターによってコードされたポリペプチドの発現が指示されるようにしてもよい。原核性および真核性の宿主にとって適切な様々なプロモーターが利用可能である。原核性プロモーターとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合、ｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター；３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたはその他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびグルコキナーゼが挙げられる。真核性プロモーターとしては、誘導性の酵母プロモーター、例えばアルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネイン、および窒素代謝またはマルトース／ガラクトースの利用に関与する酵素；ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターとしては、ウイルスプロモーター、例えばポリオーマ、鷄痘およびアデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（具体的には、前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、および初期または後期シミアンウイルス４０、ならびに非ウイルスプロモーター、例えばＥＦ−１アルファ（ＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（１７）：５３２２）が挙げられる。当業者であれば、ヒト化抗体またはその部分を発現させるのに適したプロモーターを選択することができる。

必要に応じて、例えば高等真核生物細胞で発現させる場合、上述のプロモーター中の既存のエンハンサー要素の代わりに、またはそれに加えて、追加のエンハンサー要素が含まれていてもよい。適切な哺乳動物のエンハンサー配列としては、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、メタロチオネイン、およびインスリン由来のエンハンサー要素が挙げられる。あるいは、真核細胞のウイルス由来のエンハンサー要素、例えばＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサー、またはマウスＩｇＧ２ａ遺伝子座を使用することもできる（ＷＯ０４／００９８２３を参照）。このようなエンハンサーは、ベクター中のプロモーター上流の部位に配置されることが多いが、これらはその他の場所に配置されていてもよく、例えば、非翻訳領域内、またはポリアデニル化シグナル下流に配置されていてもよい。エンハンサーの選択および位置決定は、発現に用いられる宿主細胞との適合性に基づいていてもよい。

加えて、ベクター（例えば発現ベクター）は、ベクターを有する宿主細胞の選択のための選択マーカーを含んでいてもよく、複製可能なベクターの場合、複製起点を含んでいてもよい。一般的な選択マーカーは、抗生物質耐性または薬物耐性を付与する生成物をコードする遺伝子であり、これらは、原核細胞（例えばｆ３−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、Ｔｅｔ遺伝子（テトラサイクリン耐性）、および真核細胞（例えばネオマイシン（Ｇ４１８またはゲネチシン）、ｇｐｔ（マイコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子）で用いることができる。ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカー遺伝子は、様々な宿主でメトトレキセートでの選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えばＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、酵母での選択マーカーとして用いられることが多い。ウイルス（例えばバキュロウイルス）またはファージベクター、および宿主細胞のゲノムに組み込むことができるベクター、例えばレトロウイルスベクターの使用も企図される。

真核細胞系において、ポリアデニル化および終結シグナルが、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに機能するように連結される。このようなシグナルは、典型的にはオープンリーディングフレームの３’に配置される。哺乳動物系において、ポリアデニル化／終結シグナルの非限定的な例としては、成長ホルモン、延長因子−１アルファ、およびウイルス（例えばＳＶ４０）遺伝子またはレトロウイルスのロングターミナルリピートに由来するシグナルが挙げられる。酵母系において、ポリアデニル化／終結シグナルの非限定的な例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびアルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ）遺伝子に由来するシグナルが挙げられる。原核細胞系において、ポリアデニル化シグナルは、典型的には必要ではなく、代わりにそれより短くより明確なターミネーター配列を用いることが一般的である。ポリアデニル化／終結配列の選択は、発現に用いられる宿主細胞との適合性に基づいていてもよい。上記に加えて、収量を高めるのに使用できるその他の特徴としては、クロマチン再構築因子、イントロン、および宿主細胞特異的なコドン改変が挙げられる。本発明の抗体のコドン使用を改変して、転写物および／または生成物の収量を増大させるように宿主細胞のコドンバイアスを適応させることもできる（例えばＨｏｅｋｅｍａ，Ａ．ら（１９８７年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７（８）：２９１４〜２４）。コドンの選択は、発現に用いられる宿主細胞との適合性に基づいていてもよい。

従って本発明は、ヒト化免疫グロブリン、またはそれらの重鎖または軽鎖をコードする単離された核酸分子に関する。本発明はまた、免疫グロブリンおよびそれらの鎖の抗原結合部位をコードする単離された核酸分子にも関する。

上記抗体は、例えば適切な宿主細胞で上記抗体をコードする組換え核酸の１種またはそれ以上を発現させることによって生産することができる。宿主細胞は、いかなる適切な方法を用いて生産することができる。例えば、本明細書に記載の発現コンストラクト（例えば１種またはそれ以上のベクター、例えば哺乳動物細胞の発現ベクター）を適切な宿主細胞に導入して、得られた細胞を、コンストラクト（複数可）またはベクター（複数可）の発現に適した条件下で（例えば培養物中で、動物中で、植物中で）維持することができる。宿主細胞は、原核細胞としては、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えばＤＨ５ａ（商標）株）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＰｅｒＣ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、ＮＬ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、および／またはその他の適切な細菌；真核細胞、例えば真菌または酵母細胞（例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、アスペルギルス種、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ））、またはその他の下等真核細胞、ならびに高等真核生物細胞、例えば昆虫由来の細胞（例えばドロソフィラ・シュナイダー（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ）Ｓ２細胞、Ｓｆ９昆虫細胞）（ＷＯ９４／１２６０８７（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ））、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標））昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、哺乳類（例えばＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１６５１）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−９０９６）、ＣＨＯＤＧ４４（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．およびＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．（１９８０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７（７）：４２１６〜４２２０）、２９３（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−２）、ＣＶＩ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−７０）、ＷＯＰ（Ｄａｉｌｅｙ，Ｌ．ら（１９８５年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５４：７３９〜７４９）、３Ｔ３、２９３Ｔ（Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０：８３９２〜８３９６）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨｕＴ７８細胞など、または植物（例えばタバコ、ウキクサ科植物（ウキクサ）、および藻類）であってもよい。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９９３年）を参照されたい。いくつかの実施形態において、宿主細胞は多細胞生物（例えば植物または動物）の一部ではなく、例えば単離された宿主細胞であるか、または細胞培養物の一部である。

宿主細胞は、スピナーフラスコ、振盪フラスコ、ローラーボトル、ウェーブリアクター（例えばｗａｖｅｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍのシステム１０００（Ｓｙｓｔｅｍ １０００））または中空糸システムで培養することもできるが、ラージスケールでの生産の場合、具体的には撹拌槽反応器またはバッグリアクター（ｂａｇ ｒｅａｃｔｏｒ）（例えばＷａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ＵＳＡ）を特に懸濁培養に使用することが好ましい。撹拌槽反応器は、例えばスパージャー、バッフルまたは低剪断インペラーを用いて通気されるように改造してもよい。バブルカラムおよびエアリフト反応器の場合、空気または酸素の気泡での直接的な通気が使用される場合もある。無血清培養培地で宿主細胞が培養される場合、通気過程に起因する細胞の損傷を防ぐために、細胞保護剤、例えばプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８を培地に補足してもよい。宿主細胞の特徴に応じて、マイクロキャリアーを足場依存性細胞系の増殖基質として用いてもよいし、あるいはこれらの細胞を懸濁培養に適合させてもよい。宿主細胞、特に脊椎動物の宿主細胞の培養は、例えばバッチ式、流加バッチ式、反復バッチ式処理（Ｄｒａｐｅａｕら（１９９４年）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１０３〜１０９を参照）、長期バッチ式過程または潅流培養などの様々な操作様式を利用してもよい。組換えによって形質転換した哺乳動物の宿主細胞は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む培地などの血清含有培地中で培養することができるが、このような宿主細胞は、必要に応じてグルコースなどのエネルギー源および組換えインスリンなどの合成増殖因子が補足された、例えばＫｅｅｎら（１９９５）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１５３〜１６３で開示された無血清培地、または例えばＰｒｏＣＨＯ−ＣＤＭもしくはＵｌｔｒａＣＨＯ（商標）（Ｃａｍｂｒｅｘ ＮＪ、ＵＳＡ）などの市販の培地中で培養されることが好ましい。宿主細胞の無血清培養は、宿主細胞を無血清条件での成長に順応させることが必要な場合がある。順応アプローチの一つは、このような宿主細胞を血清含有培地で培養し、培養培地の８０％を無血清培地で繰り返し交換して、宿主細胞が無血清条件に順応できるようにすることである（例えば、Ｓｃｈａｒｆｅｎｂｅｒｇ，Ｋ．ら（１９９５年）Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ Ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ（Ｂｅｕｖｅｒｙ，Ｅ．Ｃ．ら編）、６１９〜６２３ページ、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照）。

記述した実施形態に係る抗体を培地に分泌させ、それから様々な技術を用いて回収し精製して、目的とする使用に適した程度の精製を達成することができる。例えば、患者（ヒト）を治療するための治療用抗体の使用では、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した場合に、治療用抗体を含む培養培地と比較して典型的には少なくとも９５％の純度、より典型的には９８％または９９％の純度が求められる。まず遠心分離を用いて培養培地から死細胞片を除去して、続いて例えば精密ろ過、限外ろ過、および／または深層ろ過を用いて上清の透明化工程を行ってもよい。あるいは、前もって遠心分離を行わずに、精密ろ過、限外ろ過または深層ろ過によって抗体を回収してもよい。様々なその他の技術、例えば透析およびゲル電気泳動およびクロマトグラフ技術、例えばヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティークロマトグラフィー（場合により例えばポリヒスチジンなどの親和性タグを付けるシステムを含む）、および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（ＵＳ５，４２９，７４６を参照）が利用可能である。一実施形態において、様々な透明化工程後、抗体は、プロテインＡまたはＧアフィニティークロマトグラフィー、それに続いてさらなるクロマトグラフィー工程、例えばイオン交換および／またはＨＡクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに硫酸アンモニウム沈殿を用いて捕捉される。さらに様々なウイルス除去工程（例えばナノろ過、例えばＤＶ−２０フィルターを用いたナノろ過）を用いてもよい。これらの様々な工程の後、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ以上、例えば１００ｍｇ／ｍｌ以上の本発明の抗体を含む精製調製物が得られ、それゆえに、これは本発明のその他の実施形態を形成する。超遠心分離法によって１００ｍｇ／ｍｌ以上の濃度を達成することができる。このような調製物は、本発明の抗体の凝集した形態を実質的に含まない。

細菌系は、抗体断片の発現に特に適している。このような断片は、細胞内またはペリプラズム内に局在する。不溶性ペリプラズムタンパク質を抽出し、再フォールディングさせて、当業者に知られた方法に従って活性タンパク質を形成することができる（Ｓａｎｃｈｅｚら（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：１３〜２０；Ｃｕｐｉｔ，Ｐ．Ｍ．ら（１９９９年）Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２７３〜２７７を参照）。

また本発明は、本発明の核酸、例えばベクター（例えば発現ベクター）を含む細胞にも関する。例えば、記述した実施形態に係るヒト化免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする核酸（すなわち１種またはそれ以上の核酸）、またはこのような核酸（複数可）を含むコンストラクト（すなわち１種またはそれ以上のコンストラクト、例えば１種またはそれ以上のベクター）は、選択された宿主細胞に適した方法（例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）によって適切な宿主細胞に導入することができ、これらの核酸（複数可）は、（例えばベクター中で、細胞中の過程により作製されたコンストラクト中で、宿主細胞ゲノムに組み込まれた）１つまたはそれ以上の発現調節因子に機能するように連結しているか、あるいは連結するようになる。宿主細胞は、発現に適した条件下で（例えば、誘導物質、適切な塩が補足された適切な培地、増殖因子、抗生物質、栄養補給剤などの存在下で）維持することができ、それによってコードされたポリペプチド（複数可）が生産される。所望に応じて、コードされたヒト化抗体は、例えば宿主細胞、培養培地、または乳汁から単離することができる。この過程は、トランスジェニック動物または植物（例えばタバコ）の宿主細胞（例えば乳腺細胞）における発現を包含する（例えばＷＯ９２／０３９１８を参照）。

３．治療用途
Ｔ細胞活性の抑制は、免疫抑制が認められる、および／または自己免疫性状態が発生する多数の状況において望ましい。従って、不適切な、または望ましくない免疫反応、例えば炎症、自己免疫、およびこのようなメカニズムが関与するその他の状態が関与する疾患の治療において、αβＴＣＲ．ＣＤ３複合体の標的化が必要である。一実施形態において、このような疾患または障害は、自己免疫および／または炎症性疾患である。このような自己免疫および／または炎症性疾患の例は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ様関節炎（ＲＡ）および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）など）、多発性硬化症（ＭＳ）、強皮症および１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、ならびにその他の疾患および障害、例えばＰＶ（尋常性天疱瘡）、乾癬、アトピー性皮膚炎、セリアック病、慢性閉塞性肺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病（甲状腺）、シェーグレン症候群、ギヤン−バレー症候群、グッドパスチャー症候群、アディソン病、ヴェグナー肉芽腫症、原発性胆管硬化症、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発性筋痛、レイノー現象、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、ベーチェット病、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、心筋炎、リウマチ熱、強直性脊椎炎、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、円形脱毛症、および白斑である。

一実施形態において、このような疾患または障害は、ＳＬＥ、ＲＡまたはＩＢＤである。一実施形態において、このような疾患または障害は、ＭＳである。

その他の実施形態において、記述した実施形態に係る抗体は、対象の免疫を抑制することにより移植を補助するのに用いられる。このような使用は、移植片対宿主疾患を緩和する。現行の移植片対宿主疾患治療の記述については、例えば、Ｓｖｅｎｎｉｌｓｏｎ、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００５）３５：Ｓ６５〜Ｓ６７、およびそこで引用された文献を参照されたい。有利には、本発明の抗体は、その他の利用可能な療法と併用することができる。

自己免疫疾患の治療に関して、併用療法は、本発明の抗体と医薬との投与を含んでいてもよく、このような医薬は、上記抗体と共に、このような自己免疫疾患を予防または治療するのに有効な量で含まれる。前記自己免疫疾患が１型糖尿病である場合、併用療法は、膵臓ベータ細胞の増殖を促進したり、またはベータ細胞の移植を強化したりする１種またはそれ以上の薬剤、例えばベータ細胞増殖因子もしくは生存因子または免疫調節性の抗体を包含していてもよい。前記自己免疫疾患がリウマチ様関節炎である場合、前記併用療法は、１種またはそれ以上のメトトレキセート、抗ＴＮＦ−β抗体、ＴＮＦ−β受容体−Ｉｇ融合タンパク質、抗ＩＬ−１５もしくは抗ＩＬ−２１抗体、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、または疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を包含していてもよい。例えば、追加の薬剤は、生物学的薬剤、例えば抗ＴＮＦ剤（例えばＥｎｂｒｅｌ（登録商標）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、およびアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））またはリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））であってもよい。前記自己免疫疾患が造血細胞移植による拒絶反応である場合、造血細胞成長因子（複数可）（例えばエリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−１１、トロンボポエチンなど）または抗菌剤（複数可）（例えば抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬）を投与することができる。前記自己免疫疾患が乾癬である場合、追加の薬剤は、１種またはそれ以上のタールおよびそれらの誘導体、光線療法、コルチコステロイド、サイクロスポリンＡ、ビタミンＤ類似体、メトトレキセート、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害剤、加えて生物学的薬剤、例えば抗ＴＮＦ剤およびＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）であってもよい。前記自己免疫疾患が、例えばクローン病または潰瘍性大腸炎のなどの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である場合、追加の薬剤は、１種またはそれ以上のアミノサリチレート、コルチコステロイド、免疫調節薬、抗生物質、もしくは生物学的薬剤、例えばＲｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）であってもよい。

併用療法は、当業者によって、さらに本明細書の目的のために必要または好都合とみなされたいかなる方法で行うことができ、順番、量、反復、または組み合わせて用いられる化合物の相対量に関して制限は企図されていない。従って、記述した実施形態に係る抗体は、治療に使用するための医薬組成物に配合してもよい。

４．医薬組成物
好ましい実施形態において、本発明に係る抗体、または本発明の前述の態様で定義されたようなアッセイ方法によって同定可能なリガンドもしくは複数のリガンドを含む医薬組成物が提供される。リガンドは、本明細書で考察されたような、免疫グロブリン、ペプチド、核酸または低分子物質であってもよい。以下の考察において、これらは「化合物」と称される。

本発明に係る医薬組成物は、活性成分としてＴ細胞活性を調節することができる化合物または複数の化合物を含む、物質の組成物である。化合物は、いかなる薬学的に許容される塩の形態、または例えば必要に応じて類似体、遊離塩基の形態、互変異性体、エナンチオマーのラセミ化合物、もしくはそれらの組み合わせであってもよい。本発明に係る活性成分を含む医薬組成物の活性成分は、特定のケースごとに決定された量で投与される場合、治療活性を示すように、例えば移植片対宿主疾患の治療における治療活性を示すように企図されている。

その他の実施形態において、本発明の１種またはそれ以上の化合物を、上述の状態のいずれかの治療において特定の徴候を治療するのに適していることが公知のいずれかの技術分野で承認されている化合物と組み合わせて用いてもよい。従って、対象への投与が好都合な一回分の組成物で行うことができるように、本発明の１種またはそれ以上の化合物は、前述の徴候を治療するのに適していることが公知の１種またはそれ以上の技術分野で承認されている化合物と組み合わせてもよい。投与計画を調節して、最適な治療効果を得ることもできる。

例えば、数回分の分割用量を毎日投与してもよいし、あるいはこのような用量は、治療状況の要求により指定された通りに比例的に減少させてもよい。

活性成分は、好都合な方式で、例えば経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内または坐剤経路によって、または埋め込み式で（例えば遅延放出分子を用いて）投与することができる。

投与経路によっては、活性成分を、前記成分を不活性化する可能性がある酵素、酸、およびその他の自然状態の作用から前記成分を保護するための材料でコーティングすることが必要な場合もある。

活性成分を非経口投与以外の手段で投与するために、活性成分は、その不活性化を防ぐ材料でコーティングされるか、またはそのような材料と共に投与されることになる。例えば、活性成分は、アジュバント中で投与したり、酵素阻害剤と共に投与したり、またはリポソーム中で投与したりすることができる。アジュバントは、その最も広い意味で用いられ、例えばインターフェロンなどのいかなる免疫刺激性化合物が挙げられる。本明細書において企図されるアジュバントとしては、レゾルシノール、非イオン界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテル、およびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルが挙げられる。酵素阻害剤としては、膵臓トリプシンが挙げられる。

リポソームとしては、水中油中水型ＣＧＦエマルジョンおよび従来のリポソームが挙げられる。

活性成分はまた、非経口投与または腹腔内投与してもよい。

また分散液は、グリセリン、液状のポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で製造してもよいし、油中で製造してもよい。これらの調製物は、通常の貯蔵および使用条件下で、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。

注射用途に適した医薬の形態としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射用液剤または分散液の即時調製物のための滅菌粉末が挙げられる。いずれの場合においても、これらの形態は滅菌されていなければならず、さらに注射器の操作が容易になる程度の流動性を有していなければならない。これらの形態は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、さらに細菌および菌類などの微生物の汚染の影響から保護されていなければならない。キャリアーは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリン、プロピレングリコール、および液状のポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合では必要な粒度の維持によって、およびスーパーファクタント（ｓｕｐｅｒｆａｃｔａｎｔ）の使用によって維持することができる。

微生物の影響は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって予防することができる。所定の場合において、等張剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい場合がある。注射用組成物の持続性吸収は、吸収を遅くする薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物を使用することにより達成することができる。

滅菌注射用液剤は、適切な溶媒中に、必要に応じて上記で列挙された数種のその他の成分と共に必要量の活性成分を混合し、続いてろ過滅菌することによって製造される。一般的に、分散液は、ベースの分散媒と上記で列挙されたもののうち必要なその他の成分とを含む滅菌媒体に、滅菌した活性成分を混合することによって製造される。滅菌注射用液剤を製造するための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、このような技術によって、予めろ過滅菌した活性成分と追加のいかなる所望の成分との溶液からそれら成分の粉末が得られる。

様々なその他の材料がコーティングとして存在していてもよいし、あるいは別の様式で投与単位の物理的形状を改変するために存在していてもよい。当然ながら、いかなる投与単位形態を製造するのに用いられる材料はいずれも、薬学的に純粋であり、用いられる量で実質的に非毒性であるはずである。加えて活性成分は、持続放出製剤および調合物に包含されてもよい。

本明細書で用いられるように「薬学的に許容されるキャリアーおよび／または希釈剤」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、ならびに抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。このような薬学的に活性な物質のための培地および薬剤の使用は当技術分野で周知である。活性成分と配合禁忌でない限り、いかなる従来の培地または薬剤の治療用組成物における使用が企図される。補助的な活性成分も組成物に包含させることができる。

投与量の投与しやすさと均一性のために、非経口組成物を投与単位形態で配合することが特に有利である。投与単位形態とは、本明細書で用いられる場合、治療しようとする哺乳動物の対象にとって一単位の投薬として適切な物理的に別々の単位を指し；それぞれの単位は、必要な医薬キャリアーと共に、所望の治療効果をもたらすように計算された予め決められた量の活性物質を含む。本発明の新規の投与単位形態の仕様は、（ａ）活性物質独自の特徴および達成しようとする具体的な治療効果と、（ｂ）体の健康状態が正常ではない病的状態を有する生きた対象の疾患を治療するために活性物質等を調剤する分野に固有の制限とによって決定され、それらによって直接左右される。

主要な活性成分は、好都合で有効な投与が有効量でなされるように、適切な薬学的に許容されるキャリアーと共に、投与単位形態で配合される。補助的な活性成分を含む組成物の場合、投与量は、前記成分の通常の用量および投与方式を参考にして決定される。

抗体などのペプチド化合物の細胞への送達を容易にするために、ペプチドを改変して、ペプチドの細胞膜を通過する能力を改善してもよい。例えばＵＳ５，１４９，７８２は、膜融合性ペプチド、イオンチャンネルを形成するペプチド、膜ペプチド、長鎖脂肪酸、および細胞膜を通過するタンパク質輸送を増強するためのその他の膜ブレンド剤（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｌｅｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の使用を開示している。これらの方法およびその他の方法は、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ９７／３７０１６およびＵＳ５，１０８，９２１にも記載されている。

さらなる態様において、単独で、または、特定の徴候を治療するのに適していることが公知の技術分野で承認されている化合物と組み合わせて疾患の治療に使用するための上記で定義したような本発明の活性成分が提供される。その結果として、異常な免疫反応に関連する疾患を治療する医薬を製造するための、本発明の活性成分の使用が提供される。

さらに、対象に、上述のようなアッセイ方法を用いて同定可能な治療上有効な量のリガンドを投与することを含む、異常な免疫反応に関連する状態を治療する方法が提供される。

以下の実施例で本発明をさらに記述するが、これらは単に例示のためである。

比較例１
ＥｕＣＩＶ３の結合および生物活性はＢＭＡ０３１と比較して低い
フローサイトメトリーを用いて、発明者等は、ＥｕＣＩＶ３は、Ｔ細胞の結合に関してＢＭＡ０３１より劣っていることを示した（図１）。この競合アッセイでは、固定濃度の直接フィコエリトリンで標識したＭｏＩｇＧ２ｂ−ＢＭＡ０３１（マウスの競合剤）および濃度を増加させた抗αβＴＣＲ抗体の存在下で、Ｔ細胞を氷上でインキュベートした。２０分インキュベートした後、細胞を洗浄し、表面に直接結合したフィコエリトリン標識ＭｏＩｇＧ２ｂ−ＢＭＡ０３１をフローサイトメトリーによって検出した。ＢＭＡ０３１ ＨｕＩｇＧ１キメラ抗体は、ＥｕＣＩＶ３よりもかなり効果的に競合した。

ｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞活性を阻害するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を評価するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、様々な濃度（図２、ｘ軸を参照）の抗αβＴＣＲ抗体で処理し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの教育（ＩＶＥ）アッセイでＣＭＶペプチド４９５〜５０３（ｐｐ６５）がパルス投与された自己樹状細胞（ＤＣ）と共に７日間培養した。

正常なドナーとＨＬＡ−Ａ２⁺の個体とのアフェレーシス産物をＨｅｍａＣａｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｖａｎ Ｎｕｙｓ、ＣＡから得た。フィコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上で遠心分離することによってＰＢＭＣを単離した。磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造元の説明書に従って用いてＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。自己由来の未成熟の樹状細胞を得るために、ＰＢＭＣをＲＰＭＩ１６４０／５％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁し、三連フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で平板培養し、３７℃／５％ＣＯ₂で２時間より長くインキュベートした。続いて付着単球をＰＢＳですすぎ、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）およびＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ、ＮＪ）が補足されたＲＰＭＩ１６４０／５％ヒトＡＢ血清中で６日間培養した。Ｔ細胞／ＤＣの共培養を安定化させる前、ＤＣに４時間にわたりペプチド（１０μｇ／ｍｌ）をパルス投与し、次いで成熟させた。５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、５００ｎｇ／ｍｌのＰＧＥ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を添加し、樹状細胞をさらに２４時間培養することにより成熟樹状細胞を作製した。続いてペプチドがパルス投与されたＤＣを前もって単離したＣＤ８＋Ｔ細胞に１０：１のＴ：ＤＣ比で添加した。ＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）を培養物に即座に添加することによって培養物に与えた。４日目にＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）を培養物に補足した。７日目に、クロム放出アッセイでバルクの培養物をペプチド反応性に関してアッセイした。

図２に記載のグラフは、クロム放出アッセイからの溶解のデータを示し、それによれば、未処理のＴ細胞はｐｐ６５ペプチドに対してうまく教育され、特異的な標的を５０％よりも多く溶解させることができた。ＢＭＡ０３１は、特異的な標的を用量依存的に溶解させることができないため、ＢＭＡ０３１はこれらのＴ細胞の教育を阻害した。ヒト化抗体ＥｕＣＩＶ３はＢＭＡ０３１よりも低い効力しか有さず、最大用量でしか教育を阻害することができなかった。

実施例２
ＢＭＡ０３１キメラ抗体のＦｃ工学
ｉｎ ｖｉｔｒｏのプロファイル
発明者等は、アッセイパネルでＢＭＡ０３１のｉｎ ｖｉｔｒｏのプロファイルを評価した。表１は、ＢＭＡ０３１のｉｎ ｖｉｔｒｏのプロファイルを示す。これらのアッセイにおいて、ＢＭＡ０３１をＯＫＴ３と比較した。

ＰＢＭＣ増殖アッセイにおいて、ヒトＰＢＭＣを治療用抗体の濃度を増加させて７２時間培養し、³Ｈ−チミジンを添加し、１８時間後に細胞を回収した。

Ｔ細胞の枯渇／サイトカイン放出アッセイのために、ヒトＰＢＭＣを治療用抗体の濃度を増加させて培養し、細胞数および生存率について７日間毎日解析した（Ｖｉ−Ｃｅｌｌ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。細胞上清も回収して、−２０℃で保存し、８つのサイトカインパネル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で解析した。

ＢＭＡ０３１は：（ｉ）ＰＢＭＣ増殖；（ｉｉ）Ｔ細胞の枯渇；（ｉｉｉ）ＣＤ２５発現；または（ｉｖ）サイトカイン放出を誘導しなかった。それに対してＯＫＴ３は上記の作用を全て誘導した。ＢＭＡ０３１およびＯＫＴ３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの教育（ＩＶＥ）アッセイでＣＤ８＋細胞のペプチドに対する教育をブロックすることができ、さらに混合リンパ球反応（ＭＬＲ）もブロックすることができる。またＢＭＡ０３１は、活性化されたＴ細胞のアポトーシス（活性化誘導細胞死；ＡＩＣＤ）も誘導する。

ＢＭＡ０３１とは異なり、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域を有するＢＭＡ０３１のキメラバージョン（ＨｕＩｇＧ１）は、ＯＫＴ３に匹敵するｉｎ ｖｉｔｒｏのプロファイルを示した（表１）。発明者等は、ＢＭＡ０３１ ＭｏＩｇＧ２ｂと比較してＨｕＩｇＧ１ ＢＭＡ０３１のｉｎ ｖｉｔｒｏのプロファイルがこのように変化していることに関して、ＦｃγＲの関与が重要であると仮定した。従って発明者等は、ＢＭＡ０３１ ＨｕＩｇＧ１のＦ（ａｂ’）₂断片を作製したところ、これらがＢＭＡ０３１ ＭｏＩｇＧ２ｂのプロファイルを取り戻したことを見出した。Ｆｃ工学により、発明者等は、ＨｕＩｇＧ４の非グリコシル化型（Ｎ２９７Ｑ）を形成することにより、「デルタａｂ」（Ａｒｍｏｕｒら（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２９：２６１３〜２６２４）として公知の突然変異でＦｃγＲ結合を除去した改変を取り入れた。ＨｕＩｇＧ１デルタａｂおよびＨｕＩｇＧ４非グリコシル化抗αβＴＣＲ抗体は、ＢＭＡ０３１ ＭｏＩｇＧ２ｂと同じｉｎ ｖｉｔｒｏのプロファイルを示した（表１）。

実施例３
結合が改善されたヒト化抗体の構築
発明者等は、ＨＥＢＥ１シリーズ（ＩＧＨ３−２３）およびＧＬ１ＢＭシリーズ（ＩＧＨＶ１−３^*０１およびＩＧＫＶ３−１１^*０１；ＶＢａｓｅ、ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋを参照）と称される２つのシリーズのＢＭＡ０３１のヒト化バージョンを作製した。最初にＢＭＡ０３１重鎖のＣＤＲ領域をＩＧＨ３−２３フレームワーク領域（配列番号５および６を参照）にグラフトすることにより、競合アッセイで示した通り（図３）抗体のαβＴＣＲへの結合が改善された；実施例２を参照されたい。しかしながら、この改善は、ＩＶＥアッセイで示した通り（図４）抗体の機能的な改善には反映されなかった。

実施例４
ヒト化抗体の最適化
ヒト化抗体を最適化する方策は、変異誘発および機能的なスクリーニングに基づく。可変ドメインのそれぞれ４つのフレームワーク領域のうち１つにおいて、マウスからヒトへのアミノ酸残基のブロック変化を行うことで最適化を開始した。ＧＬ１ＢＭ ＨＣ、ＧＬ１ＢＭ ＬＣ、およびＨＥＢＥ１ ＨＣシリーズそれぞれにおいて主要なフレームワーク領域を同定した。この同定後、そのフレームワーク領域内の個々の残基を、元のマウス配列からヒト生殖細胞系の残基に突然変異させた。マウス配列と同一であることが抗体の結合特性を保持するのに重要であることが見出されたフレームワークの残基が、マウス残基として保持されていた。別の方法でフレームワーク残基を変更して、ヒト生殖細胞系のアミノ酸配列と一致させた。抗体の元の結合特性を保持するための最低限のマウス残基が同定されるまで、これを配列全体に対して続けた。図５を参照されたい。発明者等は、Ｔ細胞からの抗体オフレートによって決定したところ、これらのシリーズのうちいくつかの抗体が、ＢＭＡ０３１と比較して改善された結合を示すことを実証した（図６、７、および８）。

オフレートアッセイにおいて、１０⁵種のヒトＴ細胞を、ＨｕＩｇＧ１−Δａｂとして発現された２μｇ／ｍＬの抗体を含む１００μＬの完全増殖培地中で、室温で３０〜６０分インキュベートした。続いて細胞を洗浄し、５０μＬの完全増殖培地に再懸濁し、解離した候補抗体の再結合を防ぐために２０μｇ／ｍＬのＨＥＢＥ１Ｆ（ａｂ’）₂を添加した。この時間経過アッセイの最後に、細胞を固定し、細胞表面に結合した残りのＨｕＩｇＧ１−Δａｂ抗体のレベルをフローサイトメトリーでＰＥ標識ヤギ抗ＨｕＩｇＧ二次抗体によって測定した。

発明者等はまた、上記抗体は、ＩＶＥ（図９、１０、および１１）およびＭＬＲアッセイで免疫反応の予防において活性であることも実証した。ＩＶＥアッセイにおいて、ＩＶＥのための定量的な測定として四量体の結合を使用した。抗原特異的な細胞のパーセンテージを、教育するペプチドに特異的な直接標識された四量体でＴ細胞を染色することによって決定した。簡単に言えば、標準的なフローサイトメトリー染色プロトコールにより、ＩＶＥからの７日目のＣＤ８＋Ｔ細胞を四量体で染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで解析した。加えて、ヒト化抗体は、ＢＭＡ０３１と比較して匹敵するレベルの、ＰＢＭＣにおける増殖能およびサイトカイン放出を示した（図１２および１３）。

上記抗体はまた、ＩＶＥアッセイで（図１４）、Ｔ細胞からのＩＦＮγの放出を阻害する能力も示した。加えて発明者等は、多数のこれらの抗体は、ＢＭＡ０３１と比較して、活性化されたαβＴＣＲ陽性Ｔ細胞の活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を惹起する改善された能力を有することを示した（図１５）。ＡＩＣＤアッセイにおいて、抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を治療用抗体と共に培養した。２４時間、４８時間、および７２時間で、細胞をアポトーシスマーカーのアネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤについて染色した。さらに細胞を四量体でも染色し、抗原特異的なＴ細胞における作用によりアポトーシスを追跡した。

すなわち発明者等は、ＢＭＡ０３１をヒト化しようとするこれまでの試みを大きく改善した。この方法でＢＭＡ０３１と比較して改善されたオフレートを有する抗体を発見したことは、予想外の発見であった。この結合における改善は、ＩＶＥアッセイで実証されたように（図１０および１１）、免疫反応を抑制する可能性の改善と互いに相関する。これらの抗体は、抗体のαβＴＣＲへの特異性、ヒト化による免疫原性の減少、活性化されたＴ細胞の特異的なアポトーシス、および抗体結合の際のＴ細胞活性化の欠如のために、治療目的の優れた候補である。

実施例５
エフェクター機能を減少させるためのＦｃ突然変異体の作製
天然に存在するＡｓｎ２９７部位の隣のアミノ酸Ｓｅｒ２９８位にグリコシル化部位が導入されるように改変されたＦｃ変異体を設計して作製した。Ａｓｎ２９７でのグリコシル化は、維持するか、または突然変異でノックアウトするかのいずれかとした。表２に突然変異およびグリコシル化の結果を示す。

αβＴ細胞受容体の抗体クローン＃６６の重鎖に、クイックチェンジ（Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ）によりｐＥＮＴＲ＿ＬＩＣ＿ＩｇＧ１テンプレートを用いて突然変異を形成した。ＨＥＢＥ１ Δａｂ ＩｇＧ１＃６６のＶＨドメインをＬＩＣプライマーで増幅し、ＬＩＣによって突然変異型または野生型ｐＥＮＴＲ＿ＬＩＣ＿ＩｇＧ１にクローニングし、全長のＡｂ突然変異体または野生型を作製した。成功したクローンでＤｒａＩＩＩ／ＸｈｏＩによって二重消化を行い約１２５０ｂｐのインサートを生産することによりサブクローニングを検証した。続いてこれらの全長突然変異体を、ゲートウェイ・クローニング（Ｇａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ）によって発現ベクター、ｐＣＥＰ４（−Ｅ＋Ｉ）Ｄｅｓｔにクローニングした。続いてＤＮＡ配列決定により突然変異を確認した。

２つのコンストラクト、ｐＣＥＰ４中のＨＥＢＥ１非グリコシル化ＩｇＧ４およびＨＥＢＥ１ Δａｂ ＩｇＧ１をＨＥＫ２９３トランスフェクションで対照として使用した。

三連フラスコ中で突然変異体、野生型、および対照（非グリコシル化およびΔａｂ）を発現のためにＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした。マルチチャンネルの蠕動ポンプに取り付けられた１ｍｌのＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム（ＧＥ）を用いて１６０ｍｌの調整培地（ＣＭ）からタンパク質を精製した。５マイクログラムの各上清を４〜２０％のトリス−グリシン還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した（図１６を参照）。非グリコシル化突然変異体（Ｎ２９７Ｑ、Ｔ２９９Ａ、および非グリコシル化対照）の重鎖は下方にあり（黒い矢印）、これは、これらの抗体においてグリカンが欠失していることと一致する。しかしながら、改変されたグリコシル化抗体（ＮＳＹ、ＳＴＹ、ＳＹ、Δａｂ、および野生型対照、赤い矢印）の重鎖は、野生型対照と同じように移動している。この結果は、２９８位における改変されたグリコシル化部位の期待される結果と一致する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析から、全ての突然変異体は単量体として発現されることが示された。

ＬＣ−ＭＳによるグリコシル化解析
改変されたＨ６６ ＩｇＧ１ Ｆｃ変異体を、２０ｍＭのＤＴＴで３７℃で３０分、部分的に還元した。ＱＳＴＡＲ ｑｑ ＴＯＦハイブリッドシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を備えたアジレント１１００（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００）キャピラリーＨＰＬＣシステムでのキャピラリーＬＣ／ＭＳによってサンプルを解析した。アナリストＱＳ１．１（Ａｎａｌｙｓｔ ＱＳ１．１）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｓｏｙｓｔｅｍ）での基準の補正およびコンピューターモデリングによるベイズのタンパク質再構築をデータ解析に使用した。突然変異体Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓ Ｈ６６リード抗体に関して、アミノ酸２９８位に１つのグリコシル化部位が観察され、主要な種として二分岐および三分岐の複合型グリカン、加えてＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、およびＧ２Ｆが検出された。

Ｂｉａｃｏｒｅを用いたαβＴＣＲ抗体突然変異体のヒトＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩへの結合
Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８およびＦ１５８）およびＦｃγＲＩへの結合を評価した。ＣＭ５チップの４つ全てのフローセルを、Ｂｉａｃｏｒｅによって提供された標準的なアミンカップリング法で抗ＨＰＣ４抗体で固定した。抗ＨＰＣ４抗体をカップリング反応のためにｐＨ５．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウムで５０μｇ／ｍＬに希釈し、５μＬ／分で２５分注入した。チップ表面におよそ１２，０００ＲＵの抗体を固定した。組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８およびＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８を、結合緩衝液の１ｍＭのＣａＣｌ₂を含むＨＢＳ−Ｐで０．６μｇ／ｍＬに希釈し、フローセル２および４それぞれに５μＬ／分で３分注入し、抗ＨＰＣ４チップに３００〜４００ＲＵの受容体を捕捉した。弱い結合物質を識別するために、このアッセイで通常用いられる量より３倍多くのｒｈＦｃγＲＩＩＩａを抗ＨＰＣ４表面に捕捉させた。参照対照としてフローセル１および３を使用した。各抗体を結合緩衝液で２００ｎＭに希釈し、４つ全てのフローセルに４分注入し、続いて緩衝液中で５分解離させた。表面をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中の１０ｍＭのＥＤＴＡで２０μＬ／分で３分再生した。

図１７に結果を示す。

Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、ＦｃγＲＩ結合も比較した。抗テトラＨｉｓ抗体の緩衝液をＺｅｂａ脱塩カラムを用いてｐＨ４．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウムで交換し、アミンカップリングのために酢酸緩衝液で２５μｇ／ｍＬに希釈した。ＣＭ５チップの２つのフローセルを、約９０００ＲＵの抗テトラ−Ｈｉｓ抗体を５μＬ／分で２０分注入した後に固定した。以前の実験と同様に、弱い結合物質と比較するために、抗テトラ−Ｈｉｓ表面に１０倍多くのＦｃγＲＩを捕捉させた。組換えヒトＦｃγＲＩをＨＢＳ−ＥＰ結合緩衝液で１０μｇ／ｍＬに希釈し、フローセル２に５μＬ／分で１分注入し、抗テトラ−Ｈｉｓチップに約１０００ＲＵの受容体を捕捉した。１００ｎＭの単一濃度の抗体を、捕捉した受容体および対照表面に３０μＬ／分で３分注入した。解離を３分モニターした。表面を、ｐＨ２．５の１０ｍＭのグリシンを２０μＬ／分で３０秒で２回注入することによって再生した。

図１８に結果を示す。

結果から、グリコシル化操作された突然変異体のＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃγＲＩへの結合は極めてわずかだったことが示唆される。特にＨ６６ Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓは、両方の受容体への結合がほぼ完全になくなっていた。詳細な特徴付けのためのリードとしてこの突然変異体を選択した。

円二色性（ＣＤ）を用いた安定性の特徴付け
Ｆａｒ−ＵＶ ＣＤ熱融解実験によるＳ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓ抗体の突然変異体の安定性のモニターは、２１６ｎｍおよび２２２ｎｍにおけるＣＤシグナルを、最終的に抗体のアンフォールディングを引き起こすまで温度を上昇させながらモニターすることによりなされた。ジャスコ８１５（Ｊａｓｃｏ ８１５）分光光度計で、ＰＢＳ緩衝液中およそ０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、パス長１０ｍｍの石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ，Ｉｎｃ）でＣＤスペクトルを回収した。熱電気でのペルチエ効果（ジャスコのモデルＡＷＣ１００）によって温度を制御し、１℃／分の速度で２５℃から８９℃に温度を徐々に高めた。ＣＤシグナルおよびＨＴ電圧の両方のデータを取った。２１０〜２６０ｎｍの範囲で、０．５ｎｍのデータインターバル、１℃の温度インターバルでデータを得た。スキャン速度は５０ｎｍ／分であり、データピッチは０．５ｎｍであった。培地の感度設定で２．５ｎｍの帯域幅を使用した。サンプルごとにスキャンを４回重複して行った。結果から、デルタＡＢ Ｈ６６およびＳ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓ Ｈ６６突然変異体はいずれも、類似の熱挙動を示し、約６３℃の同じ分解開始温度を有することが示唆される。言い換えれば、この突然変異体は、デルタＡＢ様式と同等に安定である。

図１８を参照されたい。

実施例６
Ｆｃで改変された突然変異体の機能的な解析
実施例２に記載されたようにしてＰＢＭＣ増殖およびサイトカイン放出アッセイを行った。正常なドナーのＰＢＭＣを融解し、以下の条件下で処理した（全て補体を含む培地中で）：
・未処理
・ＢＭＡ０３１、ｍｏＩｇＧ２ｂ １０μｇ／ｍｌ
・ＯＫＴ３、ｍｏＩｇＧ２ａ １０μｇ／ｍｌ
・Ｈ６６、ｈｕＩｇＧ１デルタＡＢ １０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、および０．１μｇ／ｍｌ
・Ｈ６６、ｈｕＩｇＧ１ Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓ １０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、および０．１μｇ／ｍｌ。

バイオプレックス（Ｂｉｏｐｌｅｘ）解析のために２日目（Ｄ２）および４日目（Ｄ４）にサイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ）を回収した。Ｄ４にＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびａｂＴＣＲ発現に関して細胞を染色した。

図１９〜２２に示される結果から、Ｈ６６ Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓは、全ての細胞ベースのアッセイでＨ６６デルタＡＢと同様の挙動を示したことが実証され、これは、ＣＤ２５発現による最小のＴ細胞活性化；ａｂＴＣＲへの結合（ただしデルタＡＢに対するカイネティクスがわずかに異なる）；Ｄ２およびＤ４のタイムポイントの両方における最小のサイトカイン放出を示し；すなわちＤ４で、この突然変異体は、数種のサイトカインと比べて実際にデルタＡＢより優れていた。

従ってＳ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓ突然変異体は、デルタＡＢ突然変異と同等に効果的にエフェクター機能を喪失した。

実施例７
二重特異性抗体
一方のアームが腫瘍標的と結合でき、他方がαβＴＣＲを介してＴ細胞と結合できるように短いアミノ酸リンカーを介して一緒に連結された２つの単鎖抗体（ｓｃＦｖ）で構成される二重特異性分子を構築した。二重特異性分子は、本明細書では、ＴＲＡＣＥＲ（Ｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ＥｎａｂｌｅＲ）と称される。

以下のヒト化抗αβＴＣＲ ｓｃＦｖコンストラクトを作製した：
ＧＬ１ＢＭΔＳ×ＶＫ１
ＧＬ１ＢＭΔＳ×ＶＫ２７
ＧＬ１ＢＭΔＳＶＨ１１×ＶＫ１
ＧＬ１ＢＭΔＳＶＨ１５×ＶＫ１
ＧＬ１ＢＭΔＳＶＨ２８×ＶＫ４３
ＧＬ１ＢＭΔＳＶＨ３１×ＶＫ４３。

配列番号１４〜１６および２０〜２４に重鎖および軽鎖の配列を記載した。

これらの分子の特徴付けは、腫瘍標的およびＴ細胞への結合の評価、ｉｎ ｖｉｔｒｏの腫瘍標的細胞存在および非存在下での細胞毒性活性およびサイトカイン放出プロファイルで構成されていた。

フローサイトメトリーによって評価された結合プロファイルから、抗αβＴＣＲ二重特異性抗体は、腫瘍標的細胞系およびＴ細胞の両方と結合できることが示された。図２３を参照されたい。

フローサイトメトリーによって測定されたｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性活性から、抗αβＴＣＲ二重特異性抗体によって動員されたＴ細胞は、Ｔ細胞媒介の溶解を誘導できることが示された。図２４を参照されたい。

サイトカイン放出プロファイルの解析から、二重特異性抗体の両方のアームが結合すると、標的細胞の非存在下ではみられないＴ細胞からの高いレベルのＴＨ１／ＴＨ２サイトカイン放出が起こることが示された。総合すると、この作用機序は、文献で記述されているＣＤ３ベースの二重特異性分子のプロファイルと類似したプロファイルを示す。

実施例８：抗ＣＤ５２抗体を改変したＦｃ変異体の製造および特徴付け
本明細書において記述されるＦｃ突然変異の適応性に関する概説を試験するために、抗ＣＤ５２抗体でグリコシル化突然変異体Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓも製造して（クローン２Ｃ３）、ＦｃγＲＩＩＩ結合がないエフェクター機能のモジュレーションが異なる抗体主鎖にも当てはまるかどうかを調べた。クイックチェンジ変異誘発によってＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ ２Ｃ３変異体のＤＮＡを製造した。ＨＥＫ２９３の一過性トランスフェクション後、タンパク質を調整培地から精製した。対照として抗ＣＤ５２ ２Ｃ３野生型抗体を平行して生産した。Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、精製した抗体の抗原結合、ＦｃγＲＩＩＩ、および結合特性を特徴付けた（図２６を参照）。

Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ ２Ｃ３変異体は、ＣＤ５２ペプチドにしっかりと結合し、結合のセンサーグラムが野生型対照と区別できないことから、このＦｃドメインにおける突然変異は、その抗原結合に影響を与えないことが示唆される（図２６Ａ）。
Ｆｃのエフェクター機能をアッセイするために、結合研究にＦｃγＲＩＩＩ受容体（Ｖａｌ１５８）を使用した。突然変異体および野生型対照抗体を２００ｎＭに希釈し、ＨＰＣ４−タグで捕捉したＦｃγＲＩＩＩａに注入した。ＦｃγＲＩＩＩ結合は、Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ突然変異体ではほとんど検出できなかったが、これは、この変異体はエフェクター機能を喪失したことを示す（図２６Ｂ）。またこの突然変異体は、野生型抗体対照と同じ親和性でＦｃＲｎ受容体にも結合したことから、発明者等は、その循環半減期またはその他の薬物動態学的特性は変化しないと予想する。（図２６Ｃを参照）。発明者等は、例えばヒトＦｃγ受容体のエンゲージメントにより望ましくないＦｃのエフェクター機能を減少させたりまたは除去したりするために、Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ突然変異は一般的に抗体に適用が可能であると結論付けた。

Claims (11)

1. 配列番号７、１２、１３、１５および１６に記載の配列からなる群より選択されるアミ
   ノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトαβＴＣＲ／ＣＤ３複合体に特異的なヒト化モノクローナル抗体。
2. 重鎖可変領域が、配列番号７、配列番号１２、および配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる群より選択される、請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体。
3. 重鎖可変領域が、配列番号１５および配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなる群より選択される、請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体。
4. ヒト由来の定常領域をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
5. Ｆｃγ受容体結合を減少させるＦｃ改変をさらに含む、請求項４に記載のヒト化抗体。
6. 改変されたグリコシル化パターンを含む、請求項５に記載のヒト化抗体。
7. 非グリコシル型Ｆｃ領域またはデルタａｂ改変を含む、請求項５に記載のヒト化抗体。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体の、少なくとも１つの重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸。
9. 請求項８に記載の核酸を発現する細胞。
10. 対象におけるＴ細胞媒介応答を抑制するのに使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
11. Ｔ細胞媒介応答が、固形臓器移植および複合組織移植を含めた組織移植、組織グラフト、多発性硬化症、ならびに１型糖尿病からなる群より選択される状態に関連する、請求項１０に記載の使用のためのヒト化抗体。

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