KR20140072092A

KR20140072092A - 항-αβTCR 항체

Info

Publication number: KR20140072092A
Application number: KR1020147009515A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 스넬; 안드레아스 멘라드; 지나 라코르시아; 스리니바스 샨카라; 후아웨이 퀴; 클라크 팬; 벤자민 케블
Original assignee: 겐자임 코포레이션
Priority date: 2011-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2014-06-12
Also published as: AU2017261557B2; LT2755999T; MY173924A; US11186638B2; CL2014000574A1; PL2755999T3; CR20140127A; TWI593706B; EP2755999A2; ECSP14013307A; JP2014527802A; TW201313741A; RU2014114527A; SG11201400126PA; NI201400019A; US20220153841A1; JP2017108752A; JP6599911B2; AU2012307816B2; AU2017261557A1

Abstract

본 발명은 αβTCR.CD3 복합체에 결합하며 개선된 생물학적 성질을 갖는 BMA031 뮤린 항체의 CDR을 포함하는 인간화 단클론 항체에 관한 것이다.

Description

항-αβTCR 항체{ANTI-APLHABETATCR ANTIBODY}

본 발명은 알파 베타 T 세포 수용체(αβTCR)에 특이적인 항체에 관한 것이다. 특히 본 발명은 뮤린(murine) 단클론 항체 BMA031로부터 유도된 인간화 항-αβTCR 항체 및 상기 인간화 항체를 면역 억제 요법에 사용하는 것에 관한 것이다.

면역억제제의 자가 면역 질환 및 기관 이식 요법에서의 사용은 문서에 의해 충분히 입증되어 있다; 그러나 그 과정은 결코 최상의 것이 아니다. 독성, 기회 감염, 사이토킨 발작(cytokine storm) 및 암 위험 상승은 이들 약제로 치료한 환자에서 만연하다. 이들 영역에서 바이오 의약품의 사용은 어느 정도까지는 환자에서 성과를 개선하나 여전히 이들 부작용은 명백하다.

림프구에 대한 다클론 항혈청의 사용은 면역억제 목적으로 잘 알려져 있다. 그러나, 항혈청은 제조가 노동-집약적이고, 배치간에 달라지는 성질을 보이며 다클론 항혈청을 사용하여 얻을 수 있는 특이성이 제한된다.

하이브리도마 기술에 의한 단클론 항체 제조는 콜러 및 밀스테인(Koehler and Milstein)(Nature 256:495-497 (1975))에 의해 최초로 기술되었다. 다클론 항혈청에 비교하여, 단클론 항체(mAb)는 더 특이적이고 더욱 일관된 성질들을 갖는다. 단클론 항체는 임상적인 기관 이식에서의 면역억제 요법을 위해 가장 빈번하게 그리고 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나, 자가 면역 질환 치료를 위해 그리고 이식 환자에서 면역억제제로서 사용된 대부분의 단클론 항체는 광범위한 면역억제능을 가지며, 따라서 추정컨대 이식 거부에 모두 관련되지는 않는 넓은 스펙트럼의 면역 세포의 기능에 바람직하지 못한 영향을 미친다.

T 세포 표면 수용체 항원에 대한 마우스 단클론 항체는 1979년에 하이브리도마 기술을 이용하여 처음 제조되었다(Kung et al. (1979) Science 206:347-349). Kung 등에 의해 발견된 세 개의 단클론 항체 중 한 항체는 muromonab-CD3 (OKT3)로 명명되었으며, T 세포의 CD3 수용체에 대해 분명한 특이성을 가지며, 미성숙 흉선 세포에 영향을 주지 않으면서 말초 성숙 T 세포의 95% 이상과 반응하였다. OKT3의 CD3 복합체에 대한 결합은 CD3 수용체의 내재화 및 말초로부터의 CD3 양성 세포의 소실을 일으킨다. 성공적인 OKT3 처치는 CD3 양성 T 세포의 약 60%에서 5% 미만으로의 즉각적인 감소를 수반한다.

OKT3는 신장 이식 후 급성 동종 이식 거부를 겪는 환자 치료에 광범위하게 사용되어 왔다(Russell, P.S., Colvin, R.B., Cosimi, A.B. (1984) Annu . Rev . Med. 35:63 및 Cosimi, A.B., Burton, R.C., Colvin, R.B. et al. (1981) Transplantation 32:535). 더구나, OKT3 및 토끼 보체는 동종 뼈 골수 이식에서 급성 이식편대숙주 질환(GVHD)을 예방하기 위해 공여자 골수로부터 성숙 T 세포를 정화하는데 사용되었다(Prentice, H.G., Blacklock, H.A., Janossy, G. et al. (1982) Lancet 1:700 및 Blacklock, H.A., Prentice, H.G., Gilmore, M.J. et al. (1983) Exp . Hematol. 11:37). OKT3 처치는 급성 백혈병을 위한 동종 뼈 골수 이식에서의 GVHD 예방에는 효과적인 것으로 보이는 반면, OKT3의 인 비트로/인 비보 복합 처치로 극심한 복합 면역결핍을 치료하는 동안 GVHD를 예방하는 것은 실패하였다(Hayward, A.R. et al. (1982) Clin . Lab . Observ. 100:665). OKT3의 T 세포에의 처치는 T 세포 활성화, 면역 매개자 생성 및 T3-조절을 포함하는, 면역 억제와 일치하지 않는 수개의 반응을 촉발한다. CD3-mAb(예, OKT3)에 의해 인식되는 T3-항원 복합체는 T 세포의 활성화 과정에서 중대한 역할을 하는 것으로 상정된다. 알파/베타 T 림프구는 αβT세포 항원 수용체(TCR)·CD3 복합체로 지칭되는 다중결합 단백질 앙상블에 의해 펩티드-MHC 리간드를 인식한다. 이 구조는 항원에 결합하는 가변 αβTCR 다이머와, TCR·CD3 표면 수송, 안정화 및 시그널 변환에 관여하는 세 개의 불변 다이머 (CD3γε, δε 및 ζζ)로 구성된다. 알파 베타 T 세포 수용체(αβTCR)는 대다수(약 95%)의 T 세포 상에 발현되며 MHC 상에 표시되는 항원의 참여를 통해 T 세포 활성화에 결정적인 역할을 한다. 나머지 5%의 세포는 감마 델타 T 세포 수용체(γδTCR) 양성이다. γδTCR 양성 세포 집단은 박테리아, 바이러스 및 진균 기원의 기회 감염에 대한 방어에서 선천적 면역 반응에 중요한 역할을 한다. 감마 델타 T 세포는 이식에서 동종편 거부에서 역할을 하지 않는다. 따라서, αβTCR 양성 세포 집단을 표적화하고 γδTCR 양성 집단을 남기는 것은 상당한 치료적 효능 과 동시에 기회 감염에 대한 기저선 면역 보호의 유지를 허용한다.

마우스 IgG2b 단클론 항체 BMA031(Borst et al. (Nov. 1990) Hum . Immunol. 29(3):175-88; EP0403156)는 TCR 알파/베타/CD3 복합체 상의 공통 결정자에 대해 특이적이며, 감마-델타 TCR에 결합하지 않는다. BMA031는 고도로 면역억제성이며, 활성화-유도된 세포 치사(AICD) 기전을 통해 활성화된 T 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있다(Wesselborg et al. (May 1993) J. Immunol. 150(10): 4338-4345). 인 비트로에서 이는 혼합 림프구 반응을 억제하며 수많은 고형 기관 이식 시나리오에서의 이식편 거부의 예방 및 급성 이식편 대숙주 질환(aGVHD)의 치료에서 예비적 임상 효능을 보여주었다(Kurrle et al. (Feb 1989) Transplant Proc. 21(1): 1017-1019). BMA031는 대다수의 인간 집단에서 인간 Fc 감마 수용체(FcγR)에 관여하지 않는다(약 10%의 인간이 마우스 IgG2b 이소타입에 결합하는 FcγR를 보유한다). 이와 같이 이 항체는 T 세포 수용체의 교차-결합을 통해 T 세포 활성화를 일으키지 않으므로, T 세포 활성화 또는 관련 사이토킨 방출을 유발하지 않는다. 이러한 측면에서 BMA031의 프로파일은 OKT3의 프로파일 보다 훨씬 바람직하다. 그러나, BMA031는 뮤린 항체이며, 대상 인간에서 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응이 유발되는 것을 감안하면, 그것 자체로서는 인간에의 반복적인 투약에 적합하지 않다.

BMA031의 수개의 인간화 버젼이 기술되었다(EP 0403156; Shearman et al., (1991) J. Immunol. 147:4366-4373 참조). EP0403156에서 기술된 바와 같이, 단순한 CDR 이식은 항원 결합 보유에 있어서 성공적이지 않았다. 상당한 프레임 워크(framework)가 변경된 클론 EUCIV3는 성공적으로 T 세포에 결합하였다; 그러나, EP0403156에서 주목된 바와 같이, 유세포 경쟁 어세이(flow cytometry competition assay)로 측정된 αβTCR에 대한 결합은 모 BMA031 항체만큼 효과적이지 않다. 우리는 또한 인 비트로 면역 반응을 저해하는 EuCIV3의 능력이 BMA031에 비해 상당히 감소됨을 입증하였다(도 2 참조). 또한 EuCIV3는 FcγR 결합을 여전히 보유하는 야생형 인간 IgG1 또는 IgG4 백본상에 원래 생성되었다. 따라서 이 인간화 항체는 T 세포 활성화, 증식 및 관련 사이토킨의 방출을 허용하였으며, 이와 같이 BMA031의 원래 성질과는 상당히 상이하였다.

항체 당화(glycosylation)의 변경은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 비당화(aglycosylated) 항체는 기능적으로 광범위하게 변경될 수 있다; Boyd et al. (1996) Mol . Immunol. 32:1311-1318 참조. 그러나, 인간화 BMA031의 비당화 형태 또는 변경된 당화 패턴을 갖는 유도체는 이전에 기술된 바 없다.

따라서 EUCIV3의 결합 성질이 개선되고 BMA031의 면역억제능 및 비-T 세포-활성화 성질은 유리하게 보유하는 항-αβTCR 인간화 항체에 대한 당업계의 요구가 있다.

첫 번째 태양에서, 본 발명은 BMA031의 CDR을 포함하고 그 동족(cognate) 항원에 대해 BMA031의 결합 친화성을 보유하는 인간화 단클론 항체를 제공한다. 제1 실시형태에서, 상기 인간화 항체는 서열 번호: 7, 12 또는 13에 기재된 CDR 및 서열 번호: 17에 기재된 인간 IGH3-23 프레임 워크를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기에서 프레임 워크 위치 6은 공여자(donor) 잔기이고; 대체 실시형태에서, 프레임 워크 위치 18이 공여자 잔기이다. 임의로, 프레임 워크 위치 49 및/또는 69가 공여자 잔기이다.

제2 실시형태에서, 인간화 단클론 항체는 서열 번호: 15 또는 16에 기재된 CDR 및 서열 번호: 18에 기재된 인간 IGHV1-3*01 프레임 워크를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기에서 하나 이상의 프레임 워크 위치 38, 44 및/또는 48은 공여자 잔기이고; 대체 실시형태에서, 프레임 워크 위치 44 및 48이 공여자 잔기이다.

제3 실시형태에서, 인간화 단클론 항체는 서열 번호: 14에 기재된 CDR 및 서열 번호: 19에 기재된 인간 IGKV3-11*01 프레임 워크를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기에서 프레임 워크 위치 70 및/또는 71는 공여자 잔기이다. 임의로, 위치 46이 공여자 잔기이다.

제1 실시형태에 따른 항체들의 예는 서열 번호: 7, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 13에 기재된 서열을 포함하는 중쇄들에서 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 14에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체들을 포함한다.

제2 실시형태에 따른 항체의 예들은 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16에 기재된 서열을 포함하는 중쇄들에서 선택된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 14에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체들을 포함한다. 전술된 실시형태에 따른 인간화 항체는 BMA031의 인간화 버전이다. 이들의 일차 구조는 BMA031에 비해 αβTCR에 대해 감소된 결합을 갖는 인간화 항체 EuCIV3의 구조와 다르다.

서열 목록에서, CDR은 주석 또는 밑줄로 표시된다. 프레임 워크는 CDR 외부의 모든 서열이며, CDR은 "Kabat" 넘버링 시스템에 따라 정의되며, 적용가능한 경우 "IMGT"CDR 정의를 사용하여 확장된다. 만약 프레임 워크 잔기가 공여자 서열과 매치되게 변경되도록 지시되지 않으면, 이는 통상 수여자(acceptor) 잔기로 이해될 것이다.

인간화 항체는 불변 영역을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 불변 영역은 인간에서 기원한 것이다.

본 발명의 인간화 항체는 Fc 조작(engineering)에 의해 더 변경될 수 있다. 면역글로불린은 Fcγ 수용체와 교차-결합되기 쉬우며, 이는 항-T 세포 항체에 대한 구조적 T 세포 활성화로 이끈다. Fcγ 교차-결합을 피하기 위해, 항체는 예컨대 Fab 또는 Fv 단편의 생성 등에 의해 Fc 영역이 제거되도록 변경될 수 있다; 그러나, 절단(truncated) 면역글로불린은 유익한 이펙터 기능(effector function)이 부족하고 더 낮은 혈청 반감기를 나타낸다. 따라서, 인간화 항체의 Fc 영역은 Fcγ 교차-결합을 방지하도록 변경될 수 있다. 예시적 기술은 예를 들어 N297Q 돌연변이에 의한 Fc 영역의 변경에 의한 비당화 면역글로불린의 생성을 포함한다. Fcγ와 결합하는데 실패한 면역글로불린이 또한 Armour 등에 의해 기술되었다((1999) Eur . J. Immunol. 29:2613-2624). IgG1에 시행된 변경은 Δab 변경으로 알려져 있으며, 이는 IgG 잔기가 위치 327, 330 및 331에서 치환되고, IgG2 잔기가 위치 233-236에서 치환되는 Δa 돌연변이 및 잔기 236가 결실되는 Δb 돌연변이의 조합으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체의 당화 패턴이 변경될 수 있다.

일 실시형태에서, 항체는 돌연변이 S298N, T299A 및 Y300S 중 하나 이상을 포함한다.

실시형태에서, 항체는 돌연변이 N297Q, S298N, T299A 및 Y300S 중 두 개 이상을 포함한다. 예를 들어, 다중 돌연변이 N297Q/S298N/Y300S, S298N/T299A/Y300S 또는 S298N/Y300S를 포함하는 인간화 항체가 제공된다.

제2 태양에서, 본 발명은 BMA031의 CDR을 포함하고, BMA031의 T 세포 억제 성질을 보유하는 인간화 단클론 항체를 제공한다. 상기 인간화 항체는 바람직하게 서열 번호: 12, 13, 15 또는 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역과 서열 번호: 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

제3 태양에서, 전술한 실시형태의 선행하는 태양들에 따른 인간화 단클론 항체의 적어도 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산이 제공된다. 이 핵산은 이들 인간화 항체의 가변 및 불변 영역을 코딩할 수 있다. 중쇄 및 경쇄는 별개의 핵산 또는 동일 핵산 분자상에 코딩될 수 있다.

제4 태양에 따라, 선행하는 태양에 따른 핵산을 발현하는 세포가 제공된다. 이 세포는, 예를 들면, 배양에서 항체 분자를 발현하도록 적응된 세포이다. 이 핵산은 시그널 서열 및/또는 세포에서 항체 분자의 발현 및/또는 세포로부터 항체 분자의 분비를 조절하거나 이를 위해 요구되는 기타 서열 또는 변경을 포함할 수 있다.

추가적 실시형태에서, 대상에서 T 세포 매개 반응을 억제하는데 사용하기 위한 전술한 태양에서 기술된 바와 같은 인간화 항체가 제공된다.

예를 들면, T 세포 매개 반응은 고형 기관 이식(solid organ transplant) 및 복합 조직 이식(composite tissue transplant)을 포함하는 조직 이식(tissue transplantation), 조직 그라프팅(tissue grafting), 다발성 경화증 및 1형 당뇨병에서 선택되는 상태에 관련될 수 있다.

또한 다른 실시형태로서, 전술된 실시형태에 따른 항체의 약제학적 유효량을 치료를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 이상 T 세포 매개 반응(aberrant T cell mediated response)에 관련된 상태로 고통 받는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.

따라서 사이토킨 방출을 유도하지 않는 인간화 비-활성화 항-αβTCR 항체가 생성되어, αβTCR을 선택적으로 조절할 수 있고, 활성화된 αβTCR 양성 T 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있다. 이들 항체는 T 세포 매개 질환에서 면역억제제로서 사용되기 위해 생성되었다. 이들 항체는 마우스 항-αβTCR 항체 BMA031의 인간화를 통해 그리고 Fc 감마 수용체의 개입을 방지하기 위해 인간화 항체의 Fc-조작에 의해 생성되었다. 전술한 실시형태에 따른 항체들은 당업계에서 입수가능한 BMA031의 인간화 버젼과 달리 BMA031의 결합 친화성을 보유한다. 나아가, 인 비트로 교육 어세이(education assay)에서 보인 바와 같이, 전술한 실시형태에 따른 항체의 면역억제 성질은 BMA031보다 더 우월하다. 또한, 선행기술의 인간화 BMA031 항체와 달리, 전술한 실시형태에 따른 항체는 정상 PBMC에서 사이토킨 방출을 유발하지 않는다.

제5 태양에 따라, 변경된 Fc를 포함하는 항체가 제공되며, 여기에서 상기 변경된 Fc는 FcγR 수용체 결합을 감소시키는 변경된 당화 패턴(modified glycosylation pattern)을 포함하며, 돌연변이 S298N, T299A 및 Y300S 중 하나 이상을 포함한다.

일 실시형태에서, 항체는 돌연변이 N297Q, S298N, T299A 및 Y300S 중 두 개 이상을 포함한다.

실시형태에서, 항체는 다중 돌연변이 N297Q/S298N/Y300S, S298N/T299A/Y300S 또는 S298N/Y300S을 포함한다.

예를 들면, 항체는 본 발명의 전술한 태양에서 기술된 항체일 수 있다.

제6 태양에 따라, 본 발명은 적어도 본 발명의 선행하는 태양에서 기술된 제1 결합 도메인의 중쇄 및 종양-특이적 항원에 특이적인 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체를 제공한다.

일 실시형태에서, 제1 결합 도메인은 본 발명의 제2 태양에 따른 중쇄를 포함한다.

다중 특이적 항체는 많은 상이한 구조를 가질 수 있다; 일 실시형태에서, 이는 항-TCR/CD3 scFv 및 항-종양 scFv를 포함한다.

일 실시형태에서, 다중특이적 항체는 이중특이적이다(bispecific).

도 1은 BMA031가 EuCIV3에 비해 αβTCR에 더 강하게 결합하는 것을 도시한다. BMA031 MoIgG2b, BMA031 HuIgG1 및 EuCIV3 HuIgG1 항체에 의한 PE-표지된 BMA031 항체의 결합 경쟁이 도시된다. EuCIV3는 BMA031에 비해 감소된 역가를 갖는다.
도 2는 EuCIV3가 인 비트로 교육(IVE) 어세이에서 BMA031보다 덜 강력함을 도시한다. 도표는 생물학적 어세이에서 모 BMA031 항체와 비교시 EuCIV3 인간화 항체의 성능 소실을 보여준다. CD8+ T 세포를 다양한 농도의 항-αβTCR 항체(x축)로 처리하고 7일 동안 CMV 펩티드 495-503 (pp65)로 펄스된(pulsed) 자가 수지상 세포와 함께 공배양하였다.
도 3은 HEBE1가 경쟁 어세이에서 BMA031와 동등하게 αβTCR와 결합함을 보여준다. BMA031 HuIgG1, HEBE1 HuIgG1 및 EuCIV3 HuIgG1 항체에 의한 PE-표지된 BMA031 항체의 결합 경쟁을 도시한다. EuCIV3는 BMA031 및 HEBE1에 비해 감소된 역가를 갖는다.
도 4는 HEBE1가 인 비트로 교육(IVE) 어세이에서 EuCIV3와 유사한 역가를 가짐을 도시한다. IVE 어세이는 도 2에 관해 기술된 바와 같이 수행되었다.
도 5는 항-αβTCR 가변 도메인의 돌연변이 유발의 반복적 라운드를 개략적으로 도시한다. 음영진 박스 내 프레임 워크는 특정 마우스 잔기가 놓여진 FR 영역을 묘사한 것이다. 돌연변이의 제1열의 음영진 잔기는 오프 비율(off-rate)을 유지하는데 유용한 마우스 아미노산이다. 돌연변이의 제2열의 음영진 잔기는 최종 배선 과정(germlining process) 동안 보유되는 CDR 영역을 둘러싸는 마우스 잔기이다.
도 6은 최적화된 인간화 항체가 BMA031에 비해 개선된 오프 비율을 갖는 것을 도시한다. T 세포 상에서 αβTCR 부터의 항체 해리 키네틱을 유세포 분석법으로 측정하였다. BMA031는 EuCIV3 및 HEBE1에 비해 더 양호한 오프 비율을 나타내었다. HEBE1의 결합 도메인을 최적화함으로써 HEBE1.H10의 오프 비율을 BMA031에 비해 개선할 수 있었다.
도 7은 최적화된 인간화 항체가 BMA031에 비해 개선된 오프 비율을 갖는 것을 도시한다. T 세포 상에서 αβTCR 부터의 항체 해리 키네틱을 유세포 분석법으로 측정하였다. HEBE1의 결합 도메인을 최적화함으로써 HEBE1.H66의 오프 비율을 BMA031에 비해 개선할 수 있었다.
도 8은 최적화된 인간화 항체가 Δab 및 비당화 포맷 양쪽에 있어 BMA031에 비해 개선된 오프 비율을 갖는 것을 도시한다. T 세포 상에서 αβTCR로부터의 항체 해리 키네틱을 유세포 분석법으로 측정하였다.
도 9는 HEBE1의 최적화가 BMA031와 동등한 기능성을 초래하는 것을 도시한다. IVE 어세이는 도 4에 기재된 바와 같다. BMA031는 CD8+ T 세포의 교육을 저해하였는데, 용량 의존적 방식으로 특이적 타깃을 용해할 수 없었기 때문이다. 모 인간화 항체, HEBE1는 BMA031만큼 강력하지 않았으며 단지 최고 용량에서 교육을 저해할 수 있었다(유사한 결과가 제2 비-개선된 인간화 Ab, HEBE1 H13에서 관찰되었다). 인간화 항체, HEBE1 H10에 추가적 개선이 이루어졌으며, 이 항체는 이 어세이에서 BMA031와 동등한 역가를 가졌다.
도 10은 항-αβTCR 항체의 IVE 데이터를 도시한다. HEBE1 및 GL1 BM 시리즈 항체 양쪽은 BMA031와 대비시 IVE 결과의 개선을 보여준다.
도 11은 항원-특이적 테트라머 결합에 의해 측정된 IVE 어세이에서의 항원 양성 세포를 도시한다. 항원-양성인 (즉, IVE 어세이 내에서 교육된) 세포는 MHC-테트라머 분자에 결합할 수 있다. IVE 어세이가 항원에의 T 세포 교육을 방지할 수 있는 항체의 존재 하에 이루어질 때, 어세이 종료 시 MHC-테트라머에 결합할 수 있는 세포가 더 적다.
도 12는 항-αβTCR 항체, OKT3 및 자극성 비드 존재 하에서 PBMC 증식을 도시한다. 이 비교에서 항-αβTCR 항체에서는 OKT3의 자극 활성이 나타나지 않았다.
도 13은 항-αβTCR 항체의 존재에서 PBMC로부터의 사이토킨 방출을 도시한다. 항-αβTCR 항체의 사이토킨 방출 프로파일은 BMA031에 의해 입증된 프로파일과 유사하였다.
도 14는 IVE 어세이에서 T 세포에서의 IFN-감마 방출을 도시한다. 인 비트로 교육 (IVE) 어세이에서, CD8+ T 세포는 다양한 농도의 항-αβTCR 항체로 처리되고(도 2 참조, x-축) 7일 동안 CMV 펩티드 495-503 (pp65)로 펄스된 자가 수지상 세포와 함께 공배양되었다. 이 어세이에서 IFN-감마 방출이 측정되었다.
도 15는 항-αβTCR 항체에 의해 활성화-유도된 아폽토시스를 도시한다. 항원 자극된 CD8+ T 세포는 항-αβTCR 항체 BMA031 및 HEBE1 H66의 결합에 의해 아폽토시스가 유도되었다. 아폽토시스를 유도하는 HEBE1 H66 능력은 BMA031에 비해 증가되었다.
도 16은 당화 돌연변이 및 비당화 항체의 분리를 도시한다. 코마시-블루 염색된 겔은 당화 돌연변이의 발현 및 정제를 보여준다.
도 17은 비아코어를 사용한 αβTCR 항체 돌연변이의 인간 FcγRIIIa에의 결합을 도시한다. 비아코어를 사용하여 재조합 인간 FcγRIIIa(V158 & F158)에의 결합을 평가하였다.
도 18은 비아코어를 사용한 αβTCR 항체 돌연변이의 인간 FcγRI에의 결합을 도시한다. 비아코어를 사용하여 재조합 인간 FcγRI에의 결합을 평가하였다.
도 19는 당화 돌연변이 항-αβTCR 항체의 존재 하 PBMC에서의 사이토킨 방출을 도시한다(2일). 항-αβTCR 항체의 TNFa, GM-CSF, IFNγ 및 IL10에 대한 사이토킨 방출 프로파일은 BMA031 및 H66 델타 AB가 보이는 프로파일과 유사하였다.
도 20은 당화 돌연변이 항-αβTCR 항체의 존재 하 PBMC에서의 사이토킨 방출을 도시한다(2일). 항-αβTCR 항체의 IL6, IL4 및 IL2에 대한 사이토킨 방출 프로파일은 BMA031 및 H66 델타 AB가 보이는 프로파일과 유사하였다.
도 21은 당화 돌연변이 항-αβTCR 항체의 존재 하 PBMC에서의 사이토킨 방출을 도시한다(4일). 항-αβTCR 항체의 TNFa, GM-CSF, IFNγ 및 IL10에 대한 사이토킨 방출 프로파일은 BMA031 및 H66 델타 AB가 보이는 프로파일과 유사하였다.
도 22는 당화 돌연변이 항-αβTCR 항체의 존재하 PBMC에서의 사이토킨 방출을 도시한다(4일). 항-αβTCR 항체의 IL6, IL4 및 IL2에 대한 사이토킨 방출 프로파일은 BMA031 및 H66 델타 AB가 보이는 프로파일과 유사하였다.
도 23은 TRACERS의 결합 프로파일을 도시한다. 유세포 분석에 의해 종양 타깃 세포 및 인간 T 세포 양쪽에 대한 이중-특이적 항체의 결합 프로파일이 평가되었다.
도 24는 상이한 T 세포 소집 암(recruitment arms)의 세포독성 활성을 도시한다. 인간화된 BMA031 항체 패널을 제조하고 이 패널에서 종양 항원 발현 세포주에 대해 세포독성 활성을 나타내는 많은 항체가 선택되었다.
도 25는 상이한 T 세포 소집 암의 사이토킨 방출 프로파일을 도시한다. 상이한 T 세포 소집 암을 갖는 TRACER의 패널은 유사한 사이토킨 방출 프로파일을 나타낸다. 타깃 세포의 존재하에서 T 세포 활성화에 후속하여 다량의 사이토킨이 검출된 반면, 비자극된 인간 PBMC 만의 존재 하에서는 상당히 낮은 사이토킨 수준이 관찰되었다.
도 26은 비아코어를 사용한 CD52 항체 돌연변이의 인간 FcγRIIIa에의 결합을 도시한다. 비아코어를 사용하여 재조합 인간 FcγRIIIa (V158)에 대한 변경된 항-CD52의 결합을 평가하였다. Fc 도메인에 S298N/Y300S 돌연변이를 포함하는 항-CD52을 사용하여 변경된 분자의 이펙터 기능을 평가하였다. A: CD52 펩티드에 대한 결합. B: FcγRIIIa (V158)에 대한 결합. C: 마우스 FcRn에 대한 대조 결합.

달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당업계의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질들은 본 발명의 방법 또는 기술에 사용될 수 있다. 여기에 인용된 모든 간행물은 본 발명과 관련되어 사용된 간행물에 보고된 방법, 시약 및 도구를 기재 및 개시한 목적을 위해 그 전체로 참조로 삽입된다.

본 출원의 방법 및 기술은 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전반에서 인용되고 논의된 다양한 일반적인 참조 및 더 구체적인 참조에 기술된 대로 일반적으로 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 수행된다. 예를 들어, Gennaro, A.R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.; Hardman, J.G., Limbird, L.E., and Gilman, A.G., eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D.M. and Blackwell, C.C., eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C.R. and Graham, A., eds. (1997) PCR ( Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed., Springer-Verlag 참조.

본 명세서에 인용된 바와 같이, 인간화 단클론 항체는 인간 항체 프레임 워크로 구성된 항체이며, 여기에 비-인간 항체로부터 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)이 이식된 항체이다. 인간 수여자 프레임 워크 내에 변경이 일어날 수 있다. 인간화 항체의 디자인 및 제조 절차는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예컨대 Cabilly et al., 미국 특허 제 4,816,567호; Cabilly et al., 유럽 특허 출원 제0 125 023호; Boss et al., 미국 특허 제4,816,397호; Boss et al., 유럽 특허 출원 제 0 120 694호; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., 유럽 특허 출원 제 0 194 276호 B1; Winter, 미국 특허 제 5,225,539호; Winter, 유럽 특허 출원 제 0 239 400호; Padlan, E.A. et al., 유럽 특허 출원 제 0 519 596호에 기술되어 있다. 항체, 인간화 항체, 인간 조작(engineered) 항체 및 이들의 제조방법에 대한 추가적인 자세한 사항은 Kontermann, R. and Duebel, S. eds. (2001, 2010) Antibody Engineering, 2nd ed., Springer-Verlag, New York, NY에 기술되어 있다.

용어 "항체"는 달리 지시되지 않는 한, 전체 항체 및 이러한 항체의 항원-결합 단편을 지칭하는 것으로 사용된다. 예를 들면, 상기 용어는 4-쇄 IgG 분자 및 항체 단편을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 온전한 전장 항체의 일부를 지칭하며, 하기에 더욱 상세히 후술한다.

항체는, IgG, IgA 또는 IgM와 같은 임의의 클래스; 및 IgG1 또는 IgG4와 같은 임의의 서브클래스로 이루어진다. 상이한 클래스 및 서브클래스의 면역 글로불린은 상이한 성질을 가지며, 이는 상이한 적용에 유리할 수 있다. 예를 들어, IgG4 항체는 Fc 수용체에 대해 감소된 결합을 가진다.

본 명세서에 기술된 항체의 맥락에서, 특이성은 청구된 항체가 그 특정된 동족 항원인 αβTCR.CD3 복합체와 선택적으로 결합할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 항체는 세포에 발현된 αβTCR.CD3 복합체와 결합한다.

인간 αβTCR/CD3 복합체는 T 세포의 표면에 발현하는 T 세포 수용체 복합체이다. Kuhns et al., (2006) Immunity 24:133-139 참조. 이 복합체는 뮤린 단클론 항체 BMA031에 의해 표적화된다 (유럽 특허 출원 제EP 0 403 156호 참조; 서열 번호: 1 및 2).

자연 발생 면역글로불린은 두 개의 동일한 경쇄(약 24 kD) 및 두 개의 동일한 중쇄(약 55 또는 70 kD)가 테트라머를 형성하는 공통의 코어 구조를 가진다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 가변 (V) 영역으로 알려지며 각 쇄의 나머지의 더욱 보존된 불변(C) 영역과 구별될 수 있다. 경쇄의 가변 영역(V_L 도메인으로도 지칭됨)내에 J 영역으로 알려진 C-말단 부분이 있다. 중쇄의 가변 영역(V_H 도메인으로도 불림)내에 J 영역 이외에 D 영역이 있다. 면역글로불린에서 대부분의 아미노산 서열 변경은 초가변영역 또는 항원 결합에 직접 관여하는 상보성 결정 영역(CDR)으로 알려진 V 영역 내 세 개의 분리된 위치에 국한된다. 아미노-말단에서 시작하여, 이들 영역은 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지정된다. CDR은 더욱 보존된 프레임 워크 영역(FR)에 의해 제 위치에 보유된다. 아미노-말단에서 시작하여, 이들 영역은 각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 지정된다. CDR 및 FR 영역의 위치 및 그 넘버링 시스템은 Kabat et al. 에 의해 정의되다(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991), 및 온라인에서 발견될 수 있는 이들의 업데이트들). 또한 CDR 영역 경계선은 IMGT 명명에 의해 더 정의된다.

전술된 실시형태에 따른 항체의 가변 영역은 서열 번호: 5 내지 7 및 12 내지 16에서 발견될 수 있으며, BMA031을 인간화함으로써, 즉 BMA031의 CDR을 인간 프레임 워크로 이동함으로써 수득될 수 있다. 두 시리즈의 인간화 항체가 기술된다; 서열 번호: 5 내지 7, 12 및 13을 포함하는 HEBE1 시리즈, 및 서열 번호: 8, 15 및 16에 보인 바와 같은 중쇄 가변 영역을 포함하는 GL1BM 시리즈. 양 경우에서 사용된 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 14(GL1BM VK43)에 보인 것과 같다.

사용된 인간 프레임 워크는 HEBE1의 경우 IGH3-23이고, GL1BM의 경우 IGHV1-3*01 및 IGKV3-11*01이다.

불변 영역은 임의의 인간 항체 불변 영역에서 유래될 수 있다. 가변 영역 유전자는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 발현하기 위해 불변 영역 유전자와 함께 프레임내 발현 벡터내로 클로닝될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 항체 합성을 위해 항체 생성 숙주 세포내로 트랜스펙션될 수 있다.

인간 항체 가변 영역 및 불변 영역은 서열 데이터베이스에서 유래될 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 서열은 IMGT/LIGM 데이터베이스(Giudicelli et al., (2006) Nucleic Acids Res. 34 :(suppl. 1):D781-D784) 또는 VBase(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)에서 입수 가능하다.

비당화 항체는 광범위하게 변경된 기능성을 가질 수 있다; Boyd et al. (1996) Mol . Immunol. 32:1311-1318 참조. 본 명세서에 지칭된 바와 같은 "델타 αβ" 또는 Dab 변경은 Armour et al., (1999) Eur . J. Immunol. 29:2613-2624에 기술된 바와 같은 Fc 변경이다. 항체 Fc 영역의 당화를 변경하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 화학적, 효소적 및 돌연변이 수단, 예컨대 CH₂ 도메인에서 N297 위치 돌연변이를 포함한다. 비당화 IgG 분자를 제조하기 위한 항체 유전자 돌연변이를 위한 기술은 Tao and Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595-2601에 기술되어 있다.

본 명세서에서, "핵산" 은 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 분자를 포함한다. 숙주 세포에서 항체 유전자를 발현하기에 적합한 발현 벡터가 적합하다. 항체 유전자 발현을 위한 발현 벡터 및 숙주 세포는 당업계에 공지이다; 예컨대, Morrow, K.J. Genetic Engineering & Biotechnology News (June 15, 2008) 28(12), 및 Backliwal, G. et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36(15):e96-e96 참조.

1. 항체

본 발명은 인간화 항-αβTCR 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 항체의 단편들은 αβTCR.CD3 복합체를 결합할 수 있다. 이들은 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 F(v) 단편들, 또는 개별적 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 또는 이들의 부분을 포함한다. 단편은 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 및 scFv을 포함한다. 이들 단편들은 온전한 항체의 Fc 부분이 없으며, 순환에서 더 신속하게 소실되며, 온전한 항체보다 적은 비-특이적 조직 결합을 가질 수 있다. 이들 단편은 파파인(Fab 단편 제조를 위해) 또는 펩신(F(ab')₂ 단편 제조를 위해)과 같은 효소에 의한 단백질분해와 같은 잘 공지된 방법에 의해 온전한 항체에서 제조될 수 있다.

또한 항체 및 단편은 αβTCR.CD3 복합체에 결합하는 단일-쇄 항체 단편(scFv)을 포함한다. scFv는 항체 경쇄 가변 영역(V_L)에 작동가능하게 연결된 항체 중쇄 가변 영역(V_H)를 포함하며, 여기에서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 함께 또는 개별적으로 αβTCR와 결합하는 결합 부위를 형성한다. scFv는 아미노-말단에 V_H 영역 및 카복시-말단에 V_L 영역을 포함할 수 있다. 또는, scFv는 아미노-말단에 V_L 영역 및 카복시-말단에 V_H 영역을 포함할 수 있다. 또한 Fv 단편의 두 개의 도메인 V_H 및 V_L이 개별적인 유전자에 의해 코딩되어 있어도, 이들은 재조합 방법을 사용하여 V_H 및 V_L 영역 쌍이 일가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬(단일쇄 Fv(scFv)로 알려짐)로서 만들어지게 해주는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다. scFv는 임의로 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함할 수 있다.

본 항체 및 단편은 또한 Ward, E.S. et al. (1989) Nature 341:544-546에 기술된 바와 같은 V_H 도메인으로 구성된 도메인 항체(dAb) 단편을 포함한다.

항체 및 단편은 또한 중쇄 항체(HCAb)를 포함한다. 이들 항체는 단지 중쇄 가변 영역을 사용하여 항원-결합 영역을 형성하는 것으로 보고되며, 이들 기능적 항체는 중쇄 단독의 다이머이다("중쇄 항체" 또는 "HCAb"로 지칭). 따라서, 항체 및 단편은 αβTCR.CD3 복합체에 특이적으로 결합하는 중쇄 항체(HCAb)일 수 있다.

항체 및 단편은 또한 SMIP 또는 αβTCR.CD3 복합체에 특이적인 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질인 항체를 포함한다. 이들 구조체(construct)는 항체 이펙터 기능을 수행하는데 필요한 면역글로불린 도메인에 융합된 항원-결합 도메인을 포함하는 단쇄 폴리펩티드이다(WO 2005/017148 참조).

항체 또는 단편은 디아체(diabodies)를 포함할 수 있다. 이들은 V_H 및 V_L 도메인이 단일 폴리펩티드쇄 상에서 발현되는 이가 항체이나, 너무 짧은 링커를 사용하여 동일 쇄 상에서는 두 개의 도메인 사이에 쌍이 허용되지 않는다. 이는 도메인으로 하여금 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 이루게 하며, 따라서 두개의 항원-결합 부위가 생성된다(예를 들면 WO 93/11161 참조). 디아체는 이중특이적이거나 단일특이적일 수 있다.

항체 또는 이들의 항체 단편은 αβTCR.CD3 복합체 이외의 임의의 타깃과 교차-반응하지 않는다.

항체 또는 이들의 단편은 그 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예컨대 PEG, 또는 반감기를 증가시키는 폴리사카라이드 폴리머를 포함하는 기타 수용성 폴리머와 같은 분자를 추가함으로써 변경될 수 있다.

항체 또는 이들의 단편은 이중특이적일 수 있다. 예를 들면, 이중 특이적 항체는 단일 항체(또는 항체 단편)과 유사하나 두개의 상이한 항원 결합 부위 (가변 영역)를 가질 수 있다. 이중 특이적 항체는 다양한 방법, 예를 들어 화학적 기술, "폴리도마" 기술 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이중특이적 항체는 적어도 두개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있으며, 에피토프 중 적어도 하나는 αβTCR.CD3 복합체이다. 다른 특이성은 임의의 유용하거나 바람직한 특이성에서 선택될 수 있으며, 예를 들면 인 비보 반감기 연장을 위한 인간 혈청 알부민에 대한 특이성을 포함한다.

종양학 적용을 위한 임상에서 이중-특이적 항체의 사용은 악성 복수(malignant ascites)에의 경우 사용에 승인된 3-기능성 카투막소맙(Catumaxomab; Removmab^®) 및 혈액암(hematological malignancies)을 위해 2상 임상 중에 있는 이중-특이적 항체 블리나투모맙(Blinatumomab)에 의해 현실화되고 있다. 이들 분자들은 T 세포에 결합하는 결합 암(binding arm) 및 종양 타깃의 T 세포 매개 용해를 초래하는 종양 타깃 세포에 결합하는 제2 암(second arm)을 공통으로 갖는다. 또한 공통으로 이들 분자는 세포 표면에 위치하는 CD3 단백질을 통해 T 세포를 소집한다. CD3을 통한 소집에 대한 대안은 역시 상기 세포의 표면에 발현되는 αβT 세포 수용체(αβ TCR)를 사용하는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 암 수반 항원에 대한 특이성과 αβT 세포 수용체(αβ TCR)에 대한 특이성을 결합함으로써 항-종양 항체를 개발하는데 사용될 수 있다.

2. 항체 제조

본 발명에 기술된 항체의 가변 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호: 5 내지 7 및 12 내지 16에 기술되어 있다. 항체 제조는 당업계에 알려진 임의의 기술로 수행될 수 있으며, 염소(Pollock et al. (1999) J. lmmunol. Methods 231:147-157 참조), 닭(Morrow, K.J.J. (2000) Genet . Eng . News 20:1-55 참조), 마우스(Pollock et al., 상기에 기재된 바와 같음) 또는 식물(Doran, P.M. (2000) Curr . Opinion Biotechnol. 11:199-204, Ma. J.K-C. (1998) Nat. Med. 4:601-606, Baez, J. et al. (2000) BioPharm. 13:50-54, Stoger, E. et al. (2000) Plant Mol . Biol. 42:583-590 참조)와 같은 형질전환 유기체에서의 기술들을 포함한다. 항체는 화학적 합성 또는 숙주 세포에서 항체를 코딩하는 유전자 발현에 의해 제조될 수도 있다.

항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 분리되어, 숙주 세포에서 추가적인 증식 또는 발현을 위해 플라스미드와 같은 복제 가능한 구조체 또는 벡터 내로 삽입된다. 전술한 실시형태에 따른 인간화 면역글로불린의 발현에 적합한 구조체 또는 벡터(예, 발현 벡터)는 당업계에서 입수 가능하다. 숙주 세포에서 단일 카피 또는 다중 카피로 유지되거나 숙주 세포의 크로모좀으로 통합되는 벡터들을 포함하여, 다양한 벡터가 입수 가능하다. 구조체 또는 벡터는 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있으며, 인간화 면역글로불린을 발현하는 세포들은 배양물에서 제조 및 유지될 수 있다. 단일 벡터 또는 다중 벡터는 인간화 면역글로불린의 발현을 위해 사용될 수 있다.

항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 용이하게 분리되어 통상의 과정(예,올리고뉴클레오타이드 프로브)사용하여 서열화된다. 사용될 수 있는 벡터는 플라스미드, 바이러스, 파지, 트랜스포존, 미니크로모좀을 포함할 수 있으며, 이중 플라스미드가 통상적인 실시형태이다. 일반적으로 이러한 벡터는 발현을 촉진하기위해 추가적으로 경쇄 및/또는 중쇄 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결되는 시그널 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있으며, 동시에 또는 순차적으로 동일한 숙주세포내로 도입될 수 있으며(예, 변형, 트랜스펙션, 전기 천공 또는 형질도입에 의해), 요망되는 경우, 이러한 도입 이전에 중쇄 및 경쇄 모두가 동일한 벡터 내로 삽입될 수 있다.

프로모터가 적합한 숙주 세포 내에 발현되기 위해 제공될 수 있다. 프로모터는 구성적(constitutive)이거나 유도될 수 있다. 예컨대, 프로모터는 인간화 면역글로불린 또는 면역글로불린 사슬을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되어, 코딩된 폴리펩티드의 발현을 지시할 수 있다. 원핵 또는 진핵 숙주를 위한 다양한 적합한 프로모터가 입수 가능하다. 원핵 프로모터는 대장균을 위한 lac, tac, T3, T7 프로모터; 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해 효소, 예를 들면, 에놀라제, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프락토키나제, 글루코스 6 포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제 및 글루코키나제를 포함한다. 진핵 프로모터는 알코올 데하이드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 메탈로티오네인 및 질소대사 또는 말토즈/갈락토즈 이용에 필요한 효소와 같은 유도성 효모 프로모터; 폴리오마(polyoma), 계두(fowlpox) 및 아데노바이러스(예, 아데노 바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 사코마 바이러스, 시토메갈로 바이러스(특히, 즉시 조기 유전자 프로모터), 레트로 바이러스, B형 간염 바이러스, 액틴, 라우스 사코마 바이러스 (RSV) 프로모터 및 조기 또는 지연 시미안 바이러스 40와 같은 바이러스 프로모터 및 EF-1 알파와 같은 비-바이러스 프로모터를 포함하는 RNA 폴리머라제 II 프로모터를 포함한다(Mizushima and Nagata (1990) Nucleic Acids Res. 18(17):5322). 본 발명의 당업자는 인간화 항체 또는 그 일부의 발현을 위한 적합한 프로모터를 선택할 수 있다.

적절한 경우, 예컨대 더 고도의 진핵 세포에서의 발현을 위해 전술한 프로모터에 위치한 것 대신 또는 함께 추가적인 인핸서 요소가 포함될 수 있다. 적합한 포유류 인핸서 서열은 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 페토프로테인, 메탈로티오닌 및 인슐린에서의 인핸서 요소를 포함한다. 또는 SV40 인핸서, 시토메갈로 바이러스 조기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 바큘로바이러스 인핸서 또는 뮤린 IgG2a 유전자좌 같은 진핵 세포 바이러스에서 유래한 인핸서 요소를 사용할 수 있다(WO 04/009823 참조). 이러한 인핸서들은 종종 프로모터에 대해 상부 위치에서 벡터 상에 위치되나, 다른 장소, 예컨대 비번역 영역내 또는 폴리아데닐화 시그널의 하류에 위치될 수 있다. 인핸서의 선택 및 위치화는 발현을 위해 사용되는 숙주세포와의 적합성에 기초할 수 있다.

또는 벡터들(예, 발현 벡터)는 벡터를 운반하는 숙주세포의 선택을 위한 선택 가능한 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 벡터의 경우에, 복제 기원을 포함할 수 있다. 항생제 또는 약물내성을 수여하는 산물을 코딩하는 유전자는 일반적인 선택 가능한 마커이며 원핵 세포(예, f3-락타마제 유전자 (앰피실린 저항성), Tet 유전자(테트라사이클린 저항성) 및 진핵 세포(예, 네오마이신(G418 또는 게네티신), gpt(마이코페놀산), 앰피실린, 또는 히그로마이신 저항 유전자)에 사용될 수 있다. 디하이드로폴레이트 리덕타제 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트를 사용한 선택을 허용한다. 숙주의 영양 요구성 마커의 유전자 산물을 코딩하는 유전자(예, LEU2, URA3, HIS3)가 자주 효모에서 선택 가능한 마커로 사용된다. 바이러스(예, 바큘로 바이러스) 또는 파지 벡터, 및 레토로바이러스 벡터와 같은 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있는 벡터의 사용도 고려될 수 있다.

진핵 시스템에서, 폴리아데닐화 및 말단 시그널은 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 시그널은 통상적으로 개방형 해독틀(open reading frame)의 3'에 위치된다. 포유동물 시스템에서, 폴리아데닐화/말단 시그널의 비제한적 예는 성장 호르몬, 신장 인자-1 알파 및 바이러스(예, SV40) 유전자 또는 레트로바이러스의 긴 말단 반복체에서 유도된 것을 포함한다. 효모 시스템에서, 폴리아데닐화/말단 시그널의 비제한적 예는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 및 알코올 데하이드로게나제 1 (ADH) 유전자에서 유도된 것들을 포함한다. 원핵 시스템에서 폴리아데닐화 시그널은 일반적으로 요구되지 않으며, 대신 더 짧고 더 특정된 종결자 서열을 채용한다. 폴리아데닐화/말단 서열의 선택은 발현을 위해 사용되는 숙주 세포와의 적합성에 기초할 수 있다. 전술한 이외에도, 수율을 상승시키기 위해 채용될 수 있는 다른 특징은 크로마틴 리모델링 요소, 인트론 및 숙주 세포 특이적 코돈 변경을 포함한다. 본 발명의 항체의 코돈 용법은 숙주세포의 코돈 바이어스(codon bias)를 수용하도록 변경되어 전사 및/또는 제조 수율을 증대시킬 수 있다(예, Hoekema, A. et al. (1987) Mol . Cell Biol. 7(8):2914-24). 코돈 선택은 발현에 사용되는 숙주 세포와의 적합성에 기초할 수 있다.

따라서 본 발명은 인간화 면역글로불린, 또는 이들의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 면역글로불린 및 그 사슬의 항원-결합 부분을 코딩하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.

항체는 예컨대 적당한 숙주 세포에서 항체를 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산의 발현에 의해 제조될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 여기에 기술된 발현 구조체(예, 하나 이상의 벡터, 예, 포유류 세포 발현 벡터)가 적합한 숙주 세포에 도입되고, 생성되는 세포가 구조체 또는 벡터의 발현에 적합한 조건하에 유지될 수 있다(예, 배양물내, 동물내, 식물내). 숙주 세포는 대장균(예, 균주 DH5a^TM) (Invitrogen, Carlsbad, CA), PerC6 (Crucell, Leiden, NL), B. 서브틸리스 및/또는 기타 적합한 박테리아와 같은 박테리아 세포를 포함하는 원핵세포; 또는 진핵세포, 예컨대, 진균 또는 효모 세포(예, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris ), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp .), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae ), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe ), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa )), 또는 기타 저급 진핵 세포, 및 곤충(예, Drosophila Schnieder S2 cells, Sf9 곤충 세포) (WO 94/126087 (O'Connor)), BTI-TN-5B1-4 (High Five^TM) 곤충 세포 (Invitrogen), 포유류(예, COS-1 (ATCC Accession No. CRL-1650) 및 COS-7 (ATCC Accession No. CRL-1651)와 같은 COS 세포, CHO (예, ATCC Accession No. CRL-9096), CHO DG44 (Urlaub, G. and Chasin, L.A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7):4216-4220), 293 (ATCC Accession No. CRL-1573), HeLa (ATCC Accession No. CCL-2), CVl (ATCC Accession No. CCL-70), WOP (Dailey, L., et al. (1985) J. Virol., 54:739-749), 3T3, 293T (Pear, W.S., et al. (1993) Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A., 90:8392-8396), NSO 세포, SP2/0 세포, HuT 78 세포 등 또는 식물(예, 담배, 렘나(duckweed) 및 조류)에서 온 고급 진핵 세포일 수 있다. 예컨대 Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc 참조. (1993). 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 다세포 유기체(예, 식물 또는 동물)의 부분이 아니며, 예컨대 분리된 숙주 세포 또는 세포 배양의 부분이다.

숙주 세포는 스피너 플라스크, 쉐이크 플라스크, 롤러병, 웨이브 반응기(예, wavebiotech.com의 System 1000) 또는 중공 파이버 시스템에서 배양될 수 있으나, 대량 제조를 위해 바람직하게 교반 탱크 반응기 또는 백(bag) 반응기 (예, Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA)가 특히 현탁 배양을 위해 사용된다. 교반 탱크 반응기는 예컨대 스파져, 배플 또는 저전단 임펠러를 사용하여 에어레이션을 위해 개작될 수 있다. 버블 칼럼 및 에어 리프트 반응기를 위해, 공기 또는 산소 방울을 사용하는 직접 에어레이션이 사용될 수 있다. 숙주세포가 무혈청배양배지에서 배양되는 경우, 배지는 에어레이션에 의해 초래되는 세포 손상을 방지하기 위해 플루로닉 F-68과 같은 세포 방어제로 보충될 수 있다. 숙주 세포의 특징에 따라, 마이크로캐리어(microcarriers)가 앵커리지 의존 세포주를 위해 성장 기질로서 사용될 수 있으며, 세포는 현탁 배양에 맞춰질 수 있다. 숙주 세포, 특히 척추동물 숙주 세포의 배양은 다양한 공정 모드, 예컨대 배치, 페드-배치, 반복 배치 공정(Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15:103-109 참조), 연장 배치 공정 또는 살포 배양 등을 사용할 수 있다. 재조합적으로 변형된 포유류 숙주 세포는 우태아혈청(FCS)을 포함하는 배지와 같은 혈청함유 배지에서 배양될 수 있으나, 바람직하게는 이러한 숙주세포는 Keen et al. (1995) Cytotechnology 17:153-163에서 개시된 바와 같은 무혈청배지 또는 필요한 경우 글루코스와 같은 에너지 공급원 및 재조합 인슐린과 같은 합성 성장인자로 보충된 ProCHO-CDM 또는 UltraCHO^TM(Cambrex NJ, USA)와 같은 상업적으로 입수가능한 배지에서 배양된다. 숙주세포를 무혈청으로 배양하는 것은 이들 세포들이 무혈청 조건에서 성장하는데 적응할 것이 요구된다. 한 적응 접근은 숙주세포가 무혈청 조건에서 적응하는 것을 학습할 수 있도록, 숙주세포를 혈청함유 배지에 배양하고 반복적으로 80%의 배양배지를 무혈청 배지로 교환하는 것이다(예컨대, Scharfenberg, K. et al. (1995) Animal Cell Technology: Developments Towards the 21st Century (Beuvery, E.C. et al., eds), pp.619-623, Kluwer Academic publishers 참조).

전술한 실시형태에 따른 항체는 배지 내에 분비될 수 있으며, 다양한 기술을 사용하여 이를 회수 및 정제하여 의도되는 사용에 적합한 정제 정도를 제공할 수 있다. 예를 들면, 인간 환자의 치료를 위한 치료적 항체의 사용은 이 치료적 항체를 포함하는 배양 배지에 비교시, 환원 SDS-PAGE에 의해 측정시 적어도 95%의 순도, 더욱 통상적으로 98% 또는 99% 순도가 강제된다. 제1 예로, 배양 배지에서 온 세포 부스러기는 원심분리 이후 예컨대 마이크로여과, 한외여과 및/또는 다층 여과를 사용한 상등액의 정화단계에 의해 제거될 수 있다. 또는, 항체는 전 원심분리 없이 마이크로여과, 한외여과 또는 다층 여과를 사용하여 수확될 수 있다. 다양한 기타 기술, 예컨대 투석 및 겔 전기영동 및 크로마토그라피 기술, 예컨대 하이드록시아파타이트(HA), 친화성 크로마토그라피(폴리히스티딘과 같은 친화성 태깅 시스템을 임의로 사용함) 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그라피(HIC) (US 5,429,746 참조)가 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 항체는 다양한 정화단계후 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그라피, 후속하여 추가 크로마토그라피 단계, 예컨대 이온교환 및/ HA 크로마토그라피, 음이온 또는 양이온 교환, 크기 배제 크로마토그라피 및 암모늄 설페이트 침전에 의해 포획될 수 있다. 다양한 바이러스 제거단계가 채용될 수 있다(예, DV-20 필터 등을 사용한 나노여과). 이러한 다양한 단계에 후속하여, 적어도 10 mg/ml 또는 그 이상, 예컨대 100 mg/ml 이상의 본 발명의 항체를 포함하는 정제된 제제가 제공되며, 따라서 본 발명의 다른 실시형태를 형성한다. 100 mg/ml 이상의 농도는 초원심분리로 생성될 수 있다. 이러한 제제는 실질적으로 본 발명의 항체의 응집된 형태가 없다.

박테리아 시스템은 항체 단편의 발현에 특히 적합하다. 이러한 단편은 세포 내 또는 주변세포질 내에 국재화된다. 불용성 주변세포질 단백질은 당업자에 공지된 방법에 따라 추출되어 다시 접혀 활성단백질을 형성할 수 있다(Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol. 72:13-20; Cupit, P.M. et al. (1999) Lett . Appl . Microbiol. 29:273-277 참조).

또한 본 발명은 핵산, 예를 들면 본 발명의 벡터(예, 발현 벡터)를 포함하는 세포에 관한 것이다. 예를 들면 전술한 실시형태에 따른 인간화 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산(즉, 하나 이상의 핵산) 또는 이러한 핵산을 포함하는 구조체(즉, 하나 이상의 구조체, 즉, 하나 이상의 벡터)는 선택된 숙주 세포에 적합한 방법에 의해 적합한 숙주 세포내로 도입되고(예, 변형, 트랜스펙션, 전기천공, 감염), 핵산은 하나 이상의 발현 조절 요소와 작동가능하게 연결되며(예, 숙주 세포 게놈에 통합된 벡터내, 세포에서 공정에 의해 창제된 구조체 내에서), 숙주세포는 발현에 적합한 조건하에 유지되어(예, 유도제, 적합한 염, 성장인자, 항생제, 영양적 보충물 등으로 보충된 적합한 배지), 이로써 코딩된 폴리펩티드가 제조될 수 있다. 원하는 경우, 코딩된 인간화 항체는 예를 들면 숙주세포, 배양배지 또는 우유에서 분리될 수 있다. 이러한 공정은 형질전환 동물 또는 식물(예, 담배)의 숙주 세포(예, 유선 세포)에서의 발현을 포함한다(예, WO 92/03918 참조).

3. 치료적 응용

T 세포 활성의 억제는 면역억제가 정당하고/거나 자가 면역 상태가 일어나는 많은 경우에 바람직하다. 따라서, αβTCR.CD3 복합체의 표적화는 염증, 자가 면역 및 이러한 기전을 수반하는 기타 상태와 같은 적절하지 않거나 바람직하지 않은 면역 반응과 연관된 질환의 치료에 지시된다. 일 실시형태에서, 이러한 질환 또는 질병은 자가 면역 및/또는 염증질환이다. 이러한 자가 면역 및/또는 염증질환의 예는 전신 홍반성 낭창(SLE), 류마티스성 관절염(RA) 및 염증성 장 질환(IBD)(궤양성 대장염 (UC) 및 크론병(CD) 포함), 다발성 경화증(MS), 경피증 및 1형 당뇨병(T1D), 및 기타 질병 및 질환, 예컨대 PV (심상성펨피구스), 건선, 아토피성 피부염, 소아지방변증, 만성폐쇄성폐질환, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병(갑상선), 쇼그렌증후군, 기엥바레증후군, 구드패스츄어 증후군, 에디슨병, 베게너육아종증, 원발 담즙 경화증, 경화성 담관염, 자가면역 간염, 류마티스성 다발성 근육통, 레이노현상, 측두동맥염, 거세포동맥염, 자가면역 용혈성빈혈, 악성빈혈, 결절다발동맥염, 베체트병, 원발담즙성간경화, 포도막염, 심근염, 류마티스열, 강직척추염, 사구체신염, 사코이드증, 피부근육염, 중증근육무력증, 다발근육염, 원형탈모증 및 백반증이다.

일 실시형태에서, 이러한 질환 또는 질병은 SLE, RA 또는 IBD이다. 일 실시형태에서 이러한 질환 또는 질병은 MS이다.

다른 실시형태에서, 기술된 실시형태에 따른 항체는 대상을 면역억제시킴으로써 이식을 보조하는데 사용된다. 그러한 사용은 이식편대숙주 질환을 경감시킨다. 이식편대숙주 질환을 위한 기존 치료는 예를 들어, Svennilson, Bone Marrow Transplantation (2005) 35:S65-S67, 및 거기에 인용된 참조문헌에 기술되어 있다. 유리하게 본 발명의 항체는 다른 입수가능한 치료와 함께 사용될 수 있다.

자가 면역 질환의 치료에 관해, 조합 치료는 본 발명의 항체를 의약품과 함께 투여하는 것을 포함하며, 항체와 함께 의약품은 그러한 자가 면역 질환을 예방 또는 치료하기 위한 유효량을 포함한다. 상기 자가 면역 질환이 1형 당뇨병인 경우, 조합 치료는 베타 세포 성장 또는 생존 인자 또는 면역조절항체와 같은 췌장 베타세포의 성장을 촉진시키거나 또는 베타세포 이식을 증강시키는 하나 이상의 약제를 포함한다. 상기 자가면역질환이 류마티스성 관절염인 경우, 상기 조합 치료는 메토트렉세이트, 항-TNF-β 항체, TNF-β수용체-lg 융합 단백질, 항-IL-15 또는 항-IL-21 항체, 비-스테로이드성 항염 약물 (NSAID), 또는 질환-변경 항-류마티스성 약물(DMARD) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 부가적인 약제는 생물학적 약제, 예컨대 항-TNF 약제(예, Enbrel^®, 인플릭시맙(Remicade^®) 및 아달리무맙(Humira^®) 또는 리툭시맙(Rituxan^®)일 수 있다. 상기 자가면역질환이 조혈이식거부인 경우, 조혈성장인자(예컨대, 에리트로포에틴, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-11, 트롬보포에틴 등) 또는 항마이크로바이러스제(예컨대 항생제, 항바이러스제, 항진균제)가 투여될 수 있다. 상기 자가면역질환이 건선인 경우, 부가적인 약제는 타르 및 그 유도체, 광선요법, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린 A, 비타민 D 아날로그, 메토트렉세이트, p38 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK) 저해제 및 항-TNF-제 및 Rituxan^®와 같은 생물학적 약제 중 하나 이상일 수 있다. 상기 자가면역질환이 염증성 장 질환(IBD), 예컨대 크론병 또는 염증성 대장염인 경우, 부가적 약제는 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드, 면역조절제, 항생제 또는 Remicade^® 및 Humira^®와 같은 생물학적 약제 중 하나 이상일 수 있다.

조합 치료는 당업자에 의해 필요하거나 편리하다고 여겨지는 임의의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 본 명세서의 목적을 위해, 순서, 양, 반복 또는 조합에 사용되는 화합물의 상대적인 양에 대해 어떠한 제한도 없이 고려될 수 있다. 따라서, 기술된 실시형태에 따른 항체는 치료에 사용하기 위해 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다.

4. 약제학적 조성물

바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체, 또는 본 발명의 이전 태양에서 정의된 바와 같은 어세이 방법에 의해 동정가능한 리간드(들)를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 리간드는 본 명세서에 논의된 바와 같이 면역글로불린, 펩티드, 핵산, 소분자 등일 수 있다. 이들은 하기에서 "화합물"로 지칭된다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 활성성분으로서 T 세포 활성을 조절할 수 있는 화합물 또는 화합물들을 포함하는 조성물이다. 화합물은 임의의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 예컨대 적절한 경우, 아날로그, 자유염기형태, 토토머, 에난티오머, 라세미체, 또는 이들의 조합의 형태이다. 본 발명에 따른 활성성분을 포함하는 약제학적 조성물의 활성성분은 예를 들면, 특정 경우에 의존하는 양으로 투여되었을 때, 이식편대숙주 질환의 치료에 치료적 활성을 나타내는 것으로 고려된다.

다른 실시형태에서, 하나 이상의 본 발명의 화합물은 전술한 임의의 상태를 치료하는 데 있어서 특정 적응증을 치료하기에 적합한 것으로 당업계에 인식된 화합물과 조합되어 사용될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 본 발명의 화합물은 편리한 단일 조성물이 대상에 투여될 수 있도록 전술한 적응증을 치료하는데 적합하다고 당업계에 인식된 하나 이상의 화합물과 결합될 수 있다. 용량 계획은 최적의 치료적 반응을 제공하기 위해 조절될 수 있다.

예를 들면, 수개의 분할된 용량이 날마다 투여되거나, 용량은 치료적 상황의 긴급상태에 의해 지시된 대로 비례적으로 감소될 수 있다.

활성 성분은 경구, 정맥(수용성인 경우), 근육내, 피하, 비강내, 진피내 또는 좌제 경로 또는 임플란팅(예, 서방출 분자를 사용하여) 등과 같이 편리한 방식으로 투여될 수 있다.

투여 경로에 의존하여, 활성 성분은 효소, 산 및 상기 성분을 불활성화할 수 있는 다른 자연적 조건으로부터 상기 성분을 보호할 수 있는 물질 내에 코팅되는 것이 요구될 수 있다.

활성성분을 비경구 투여 이외의 수단으로 투여하기 위해, 불활성화를 방지하는 물질과 함께, 또는 그러한 물질로 코팅된다. 예를 들면, 활성 성분은 애쥬번트 내에서, 효소 저해제와 공투여되거나 리포좀내에서 투여될 수 있다. 애쥬번트는 가장 넓은 의미로 사용되며 인터페론과 같은 임의의 면역 자극 화합물을 포함한다. 여기에서 고려되는 애쥬번트는 레조시놀, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르와 같은 비-이온성 계면활성제 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에테르를 포함한다. 효소 저해제는 췌장 트립신을 포함한다.

리포좀은 통상의 리포좀 및 수/유/수 CGF 에멀젼을 포함한다.

활성성분은 또한 비경구적으로 또는 복강투여될 수 있다.

분산액이 글리세롤, 액체 폴리에틸렌글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일 내에서 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건 하에서 이러한 제제는 미생물 성장을 방지하기 위해 보존제를 포함한다.

주사 가능한 사용에 적합한 약제학적 형태는 멸균수성용액(수용성인 경우) 또는 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 분산액 및 멸균분말을 포함한다. 모든 경우에 제제는 반드시 멸균이어야 하며, 쉽게 주사할 수 있는 정도로 유체여야 한다. 제조 및 보관 조건하에서 안정적이어야 하며, 박테리아나 진균과 같은 미생물의 오염작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예컨대, 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 및 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물유 등을 포함하는 분산 매질 또는 용매일 수 있다. 예컨대 레시틴과 같은 코팅을 사용하거나 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지하고 계면활성제 등을 사용함으로써, 적합한 유동성을 유지할 수 있다.

다양한 항박테리아제 및 항진균제 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등을 사용하여 미생물 작용을 방지할 수 있다. 어떤 경우에는 예컨대 설탕 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 조성물의 지연된 흡수를 위해 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수지연제를 조성물에 사용할 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은, 적당한 용매 내에 요구량의 활성성분을 필요한 경우 위에 열거된 수개의 기타 성분들과 함께 넣고 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로 분산액은 멸균된 활성 성분을 기초 분산매질 및 위에 열거된 요구되는 기타 성분들을 포함하는 멸균 매질 내에 넣음으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조법은 진공건조 및 동결건조 기술이며, 이는 전술한 멸균-여과된 용액으로부터 활성성분 및 임의의 추가적인 요망되는 성분을 포함하는 분말을 산출한다.

다양한 기타 물질이 코팅제로 또는 용량 유닛의 물리적 형태를 달리 개선하기 위해 존재할 수 있다. 물론 임의의 용량 유닛 형태를 제조하는데 사용되는 임의의 물질은 약제학적으로 순수하여야 하며 실질적으로 사용되는 양에서 비-독성이어야 한다. 또한 활성성분은 지속-방출 제제 및 제형에 포함될 수 있다.

본 발명에서 "약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산매질, 코팅제, 항박테리아제, 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 약제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 활성성분과 비적합한 경우가 아닌 한, 임의의 통상적인 매질 또는 약제는 본 치료적 조성물에 사용되는 것이 고려될 수 있다. 보충의 활성 성분도 또한 조성물에 포함될 수 있다.

투여 편의성과 용량 균일성을 위한 용량 단위 형태로 비경구용 조성물을 제형화하는 것은 특히 유리하다. 여기에 사용된 용량 유닛 형태는 치료될 포유류 대상을 위해 단위 용량으로서 맞춰진 물리적으로 구분된 유닛을 지칭하며, 각 유닛은 요망되는 치료적 효과를 생성하도록 계산된 예정된 양의 활성 물질을 요구되는 약제학적 담체와 함께 포함한다. 본 발명의 새로운 용량 단위 형태를 위한 사양은 (a) 활성 물질의 고유한 성질 및 성취하고자 하는 특정 치료학적 효과, (b) 몸 건강이 손상된 병적 상태를 갖는 살아있는 대상 내 질병의 치료를 위한 활성 물질과 같은 컴파운딩(compounding) 분야에 내재하는 제한들에 직접 의존하며 이들에 의해 좌우된다.

주된 활성 성분은 용량 단위 형태 내 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 유효량으로 편리하고 효과적으로 투여되도록 컴파운딩된다. 보충적인 활성성분을 함유하는 조성물의 경우, 복용량은 통상의 용량 및 상기 성분의 투여 방식을 참조하여 결정된다.

항체를 포함하는 펩티드 화합물의 세포에로의 송달을 촉진하기 위해, 펩티드는 세포막을 건너는 능력이 개선되도록 변경될 수 있다. 예를 들면, US 5,149,782는 융해성(fusogenic) 펩티드, 이온-채널 형성 펩티드, 막 펩티드, 장쇄 지방산 및 다른 막 혼합제를 사용하여 세포막을 건너 단백질 수송을 증가시키는 것을 개시한다. 이러한 방법 및 다른 방법들이 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 97/37016 및 US 5,108,921에 또한 개시되어 있다.

추가적 태양으로, 위에 정의된 본 발명의 활성성분을 단독으로 또는 특정 적응증을 치료하는데 적합하다고 당업계에 인식된 화합물과 함께 사용하여 질병을 치료하는 것이 제공된다. 따라서 본 발명의 활성성분을 이상 면역 반응에 관련되는 질병의 치료용 의약의 제조에 사용하는 것이 제공된다.

또한 전술한 어세이 방법을 사용하여 확인가능한 리간드의 치료학적 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이상 면역 반응에 관련되는 상태의 치료방법이 제공된다.

본 발명은 이하 실시예에 의해 더 상세히 설명되나, 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이다.

비교예 1

EuCIV3 의 결합 및 생물학적 활성은 BMA031 에 비해 감소한다.

유세포 분석법을 사용하여 우리는 EuCIV3가 T 세포 결합에서 BMA031보다 열등함을 보였다(도 1). 이 경쟁 어세이에서, T 세포는 고정된 농도의 직접 피코에리트린-표지된 MoIgG2b-BMA031(뮤린 경쟁자) 및 상승 농도의 항-αβTCR 항체의 존재 하에 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 20분의 인큐베이션 후, 세포를 세척하고 표면에 직접 결합된 피코에리트린-표지된 MoIgG2b-BMA031를 유세포 분석법으로 검출하였다. BMA031 HuIgG1 키메라 항체는 EuCIV3보다 훨씬 효과적으로 경쟁하였다.

인 비보 T 세포 활성 저해능을 평가하기 위해, CD8+ T 세포를 다양한 농도로 항-αβTCR 항체로 처리하고(도 2 참조, x-축), 7일 동안 인 비트로 교육(IVE) 어세이에서 CMV 펩티드 495-503(pp65)로 펄스된(pulsed) 자가 수지상 세포(DC)와 함께 공배양하였다.

HLA-A2+ 개체에서 온 정상 공여자 아파레시스(aphaeresis) 산물을 HemaCare Corp.(Van Nuys, CA)로부터 입수하였다. PBMC를 피콜(GE Healthcare, Piscataway, NJ) 상에서 원심분리로 분리하였다. CD8+ T 세포를 제조자 지시에 따라 자기 비드(Invitrogen, Carlsbad, California)를 사용하여 분리하였다. 자가 미성숙 수지상 세포를 생성하기 위해, PBMC를 RPMI 1640/5% 인간 AB 혈청(Sigma) 내에 재현탁하고, 트리플 플라스크(Corning)에 위치시키고, 37℃/5%CO₂에서 2시간 이상 인큐베이션하였다. 이후 부착된 단핵구들을 PBS로 세척하고, GM-CSF(Immunex, Seattle, WA) 및 IL-4(PeproTech, Rocky Hill, NJ)로 보충된 RPMI 1640/5% 인간 AB 혈청에서 6일간 배양하였다. T 세포/DC 공배양을 수립하기 전에, DC를 펩티드(10 ug/ml)로 4 시간 동안 펄스한 후 성숙시켰다. 성숙 수지상 세포는 50 ng/ml TNF-알파, 25 ng/ml IL-1β, 10 ng/ml IL-6, 500 ng/ml PGE-2(PeproTech, Rocky Hill, NJ)를 추가하여 생성시키고 이 수지상 세포를 24 시간 더 배양하였다. 펩티드-펄스된 DC는 이후 미리 분리한 CD8+ T 세포에 10:1의 T:DC 비율로 추가하였다. 배양액에 즉시 IL-2(100 IU/ml)을 추가하여 공급하였다. 배양액은 4일에 IL-2(100 IU/ml)으로 보충하였다. 7일에 벌크 배양물에 대해 펩티드 반응성을 크롬 방출 어세이로 분석하였다.

도 2의 그래프는 크롬 방출 어세이에서의 용해 데이터를 보여주며, 이 어세이에서 미처리 T 세포는 pp65 펩티드에 대해 성공적으로 교육(educated)되었으며, 특징 타깃을 50% 초과로 용해할 수 있다. BMA031는 이들 T 세포의 교육을 저해하였는데, 이들은 특이적 타깃을 용량-의존적 방식으로 용해할 수 없기 때문이다. 인간화 항체 EuCIV3는 BMA031보다 덜 강력하였으며, 오직 가장 높은 용량에서 교육을 저해할 수 있었다.

실시예 2

BMA031 키메라 항체의 Fc 조작

인 비트로 프로파일

어세이 패널에서 BMA031의 인 비트로 프로파일을 평가하였다. 표 1은 BMA031의 인 비트로 프로파일을 보여준다. 이들 어세이에서 BMA031는 OKT3와 비교되었다.

PBMC 증식 어세이에서, 인간 PBMC는 증가되는 농도들의 치료적 항체와 72시간 동안 배양되고, ³H-티미딘이 추가되며, 18 시간 후 세포들이 수확되었다.

T 세포 고갈/사이토킨 방출 어세이를 위해, 인간 PBMC는 증가되는 농도들의 치료적 항체와 배양되고, 날마다 세포수와 생육성(Vi-Cell, Beckman Coulter)을 7일까지 분석하였다. 세포 상등액도 수확하고, -20℃에서 저장하고 8-플렉스 사이토킨 패널(Bio-Rad)에서 분석하였다.

BMA031는 (i) PBMC 증식; (ii) T 세포 고갈; (iii) CD25 발현; 또는 (iv) 사이토킨 방출을 유도하지 않는다. 반면, OKT3는 전술한 모든 효과들을 유도한다. BMA031 및 OKT3은 인 비트로 교육(IVE) 어세이에서 펩티드에 대한 CD8+ 세포의 교육을 차단할 수 있으며, 또한 혼합 림프구 반응(MLR)을 차단할 수 있다. BMA031는 또한 활성화된 T 세포(활성화-유도 세포 치사; AICD)의 아폽토시스를 유도한다.

BMA031와 달리, 야생형 인간 IgG1 불변 영역을 갖는 키메라 버젼 BMA031 (HuIgG1)은 OKT3과 유사한 인 비트로 프로파일을 갖는다(표 1). 우리는 BMA031 MoIgG2b에 비교하여 HuIgG1 BMA031의 이러한 인 비트로 프로파일의 변화에 FcγR 관여가 결정적인 것으로 상정하였다. 따라서 우리는 BMA031 HuIgG1의 F(ab')₂ 단편을 만들고 이들이 BMA031 MoIgG2b의 프로파일을 회복하는 것을 발견하였다. Fc 조작에 의해, "델타 ab"로 알려진 돌연변이에서 FcγR 결합을 제거하는 변경을 삽입하고(Armour et al. (1999) Eur . J. Immunol., 29:2613-2624), HuIgG4의 비당화 형태(N297Q)를 생성하였다. HuIgG1 델타 ab 및 HuIgG4 비당화(agly) 항-αβTCR 항체는 BMA031 MoIgG2b과 동일한 인 비트로 프로파일을 나타내었다(표 1 참조).

[표 1]

실시예 3

개선된 결합을 갖는 인간화 항체의 구축

HEBE1 시리즈(IGH3-23) 및 GL1BM 시리즈(IGHV1-3*01와 IGKV3-11*01; 참조, VBase, vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)로 지칭되는 두 시리즈의 BMA031 인간화 버젼을 생성하였다. BMA031 중쇄 CDR 영역의 IGH3-23 프레임 워크 영역(서열 번호: 5 및 6 참조) 상에의 초기 이식은 경쟁 어세이에 나타난 바와 같이 αβTCR에 대한 항체의 결합을 개선하였다(도 3); 실시예 2 참조. 그러나 이러한 개선은 IVE 어세이에 나타난 바와 같이 항체의 기능적 개선으로 번역되지는 않았다(도 4).

실시예 4

인간화 항체의 최적화

인간화 항체의 최적화 전략은 돌연변이 생성 및 기능적 스크리닝에 기초하였다. 최적화는 가변 도메인의 4개의 각 프레임 워크 영역 중 하나에서 아미노산 잔기의 마우스로부터 인간으로의 블록 변경으로 시작하였다. 각 GL1BM HC, GL1BM LC 및 HEBE1 HC 시리즈에서 핵심 프레임 워크 영역이 동정되었다. 동정에 후속하여, 이들 프레임 워크 영역내 개별적 잔기들은 원래의 마우스 서열에서 인간 생식 계열 잔기로 돌연변이되었다. 마우스 서열로의 동정에 의해 항체의 결합능을 보유하는데 중요한 것으로 발견된 프레임 워크 잔기는 마우스 잔기로 유지되었다. 그렇지 않으면 프레임 워크 잔기는 인간 생식계열 아미노산 서열을 매치하도록 변경되었다. 이는 항체의 원래 결합 성질을 보유하기 위한 마우스 잔기의 최소 숫자가 확인될 때까지 서열 전반에 걸쳐 계속되었다. 도 5 참조. 이들 시리즈로부터 수 개의 항체가 BMA031에 비해 개선된 결합을 나타내는 것을 T 세포로부터의 항체 오프-비율로 측정하여 입증하였다(도 6, 7 및 8 참조).

오프-비율 어세이를 위해, 10⁵ 인간 T 세포를 30 내지 60분 동안 실온에서 HuIgG1-Δab로서 발현되는 항체 2 ug/mL을 함유하는 100 uL의 전 성장 배지 내에서 인큐베이션하였다. 이후 세포들을 세척하고, 50 uL 전 성장 배지에 재현탁하고, 20 ug/mL의 HEBE1 F(ab')₂ 를 첨가하여 해리 후보 항체의 재결합을 방지하였다. 이 시간 과정 어세이의 종말에, 세포를 고정하고, 세포 표면에 결합한 잔여 HuIgG1-Δab 항체 수준을 PE 표지 염소 항-HuIgG 이차 항체를 통해 유세포 분석법에 의해 측정하였다.

우리는 이들 항체들이 IVE(도 9, 10 및 11) 및 MLR 어세이에서 면역 반응을 방지하는데 활성임을 입증하였다. IVE 어세이에서, 테트라머 결합이 IVE에 대한 정량적 측정으로서 사용되었다. 항원 특이적 세포 퍼센트는 교육 펩티드에 특이적인 직접 표지된 테트라머로 T 세포를 염색하여 특정하였다. 간략하게, 7일에 IVE에서 온 CD8+ T 세포를 표준 유세포 분석 염색 프로토콜에 의해 테트라머로 염색하고 BD FACSCalibur 상에서 분석하였다. 또한, 인간화 항체는 BMA031와 비교할 때 유사한 수준의 PBMC 상 증식 포텐셜 및 사이토킨 방출을 나타내었다(도 12 및 13).

항체는 또한 IVE 어세이에서 T 세포로부터의 IFNγ 방출 저해능을 나타내었다(도 14). 또한, 이들 항체들의 많은 수가 BMA031에 비해 활성화된 αβTCR-양성 T 세포의 활성화-유도 세포 치사(AICD)를 유발하는데 개선된 능력을 나타냄이 확인되었다(도 15). AICD 어세이에서, 항원-특이적 CD8+ T 세포는 치료적 항체와 함께 배양되었다. 24, 48 및 72시간에 세포들은 아폽토시스 마커 Annexin-V 및 7-AAD를 위해 염색되었다. 또한 세포들은 항원-특이적 T 세포에 대해 효과를 나타내는 아폽토시스를 트랙하기 위해 테트라머로 염색되었다.

결론적으로, 우리들은 BMA031를 인간화하기 위한 이전 시도를 넘어서는 중요한 개선을 이루었다. BMA031에 비교하여 개선된 오프-비율을 갖는 항체의 발견은 본 과정을 통한 예상하지 못한 발견이다. 이러한 결합에서의 개선은 IVE 어세이에서 입증된 바와 같이 면역 반응을 억제하는 역가의 개선과 관련된다(도 10 및 11). αβTCR에 대한 항체 특이성, 인간화에 의한 감소된 면역원성, 활성화 T 세포의 특이적 아폽토시스 및 항체 결합시 T 세포 활성화의 결여는 이들 항체로 하여금 치료적 목적을 위한 우수한 후보가 되게 한다.

실시예 5

감소된 이펙터 기능을 위한 Fc 돌연변이 생성

자연발생적인 Asn297 위치 옆의 아미노산 Ser 298 위치에 당화 위치가 도입된 조작된 Fc 변종들을 디자인하고 생성하였다. Asn297에서의 당화는 유지되거나 돌연변이에 의해 녹아웃되었다. 돌연변이 및 당화 결과를 표 2에 나타내었다.

#	돌연변이	예측된 결과	예상된 이점
1	N297Q	당화 없음	비당화 대조
2	T299A	당화 없음	비당화 대조, 알려지지않은 이펙터 기능
3	N297Q/S298N/Y300S (NSY)	297에는 당화 없으나 298 위치에서는 조작된 당화 부위	감소된 이펙터 기능
4	S298N/T299A/Y300S (STY)	297에는 당화 없으나 298 위치에서는 조작된 당화 부위	감소된 이펙터 기능
5	S298N/Y300S (SY)	297 및 298 위치에서 두 개의 잠재적인 당화 부위; 이중 당화? 혼합 당화?	감소된 이펙터 기능에 대한 양성 대조

pENTR_LIC_IgG1 주형을 사용하여 Quikchange에 의해 αβ T-세포 수용체 항체 클론 #66의 중쇄에 돌연변이를 만들었다. HEBE1 Δab IgG1 #66의 VH 도메인은 LIC 프라이머로 증폭되고, LIC에 의해 돌연변이 또는 야생형 pENTR_LIC_IgG1내로 클로닝되어 전장 Ab 돌연변이 또는 야생형을 생성하였다. 서브클로닝은 DraIII/XhoI 이중 소화로 성공적인 클론 내 약 1250 bp 인서트를 제조하여 검증하였다. 이들 전장 돌연변이는 이후 발현 벡터 pCEP4(-E+I)Dest 내로 게이트웨이 클로닝에 의해 클로닝되었다. 돌연변이는 이후 DNA 서열화로 확인되었다.

두 개의 구조체, pCEP4 내 HEBE1 Agly IgG4 및 HEBE1 Δab IgG1가 HEK293 트랜스펙션에서 대조로 사용되었다.

돌연변이, 야생형 및 대조들(비당화 및 Δab)는 발현을 위해 트리플-플라스크에서 HEK293-EBNA 세포 내로 트랜스펙션되었다. 단백질은 다채널 연동 펌프상에서 1 ml HiTrap 단백질 A 칼럼(GE)으로 160 ml의 조건화된 배지(CM)에서 정제되었다. 각 상등액 5 마이크로그램을 4~20% 트리스-글리신 환원 및 비환원 SDS-PAGE 상에서 분석하였다(도 16 참조). 비당화 돌연변이(N297Q, T299A, 및 비당화 대조의 중쇄는 이들 항체의 글리칸 소실과 일치하게 낮았다(흑색 화살표). 그러나 조작된 당화 항체(NSY, STY, SY, Δab, 및 야생형 대조, 적색 화살표)의 중쇄는 야생형 대조와 동일한 방식으로 이동하였다. 이 결과는 298 위치에 조작된 당화 부위의 예측된 결과와 일치한다. SEC-HPLC 분석은 모든 돌연변이가 모노머로 발현됨을 가리킨다.

LC - MS 에 의한 당화 분석.

조작된 H66 IgG1 Fc 변종들은 20 mM DTT로 37℃에서 30 분간 부분 환원되었다. 샘플들은 모세관 LC/MS에 의해 QSTAR qq TOF 하이브리드 시스템과 커플링한 Agilent 1100 capillary HPLC 시스템(Applied Biosystem)상에서 분석되었다. 데이타 분석을 위해 기저선을 정정한 베이지안 단백질 재구조체와 Analyst QS 1.1(Applied Bisoystem)에서의 컴퓨터 모델링을 사용하였다. 돌연변이 S298N/T299A/Y300S H66 항체 리드(lead)에 대해, 하나의 당화 위치가 아미노산 298에서 주요 종으로서 검출된 이-촉각(bi-antennary) 및 삼-촉각(tri- antennary) 복합체-타입 글리칸과, G0F, G1F 및 G2F와 함께 관찰되었다.

비아코어를 이용한 인간 Fc γ RIIIa 및 Fc γ RI 에 대한 αβ TCR 항체 돌연변이의 결합

비아코어를 사용하여 재조합 인간 FcγRIIIa(V158 & F158) 및 FcγRI에 대한 결합을 평가하였다. CM5 칩의 4개의 플로우셀(flowcell)은 모두 비아코어에 의해 제공된 표준 아민 커플링 과정을 통해 항-HPC4 항체로 고정되었다. 항-HPC4 항체는 커플링 반응을 위해 10 mM 소듐 아세테이트 pH 5.0 내에 50 ㎍/mL로 희석되었고, 25 분간 5 ㎕/분으로 주입되었다. 약 12,000 RU의 항체가 칩 표면에 고정되었다. 재조합 인간 FcγRIIIa-V158 및 FcγRIIIa-F158는 결합 버퍼인 1 mM CaCl₂ 함유 HBS-P 내에 0.6 ㎍/mL로 희석되고, 항-HPC4 칩에 300~400 RU 수용체를 포획하기 위해 각각 플로우셀 2 및 4에 3분간 5 ㎕/분으로 주입되었다. 낮은 바인더 사이를 구별하기 위해, 이 어세이에서 통상 사용되는 것보다 세배 더 많은 rhFcγRIIIa가 항-HPC4 표면에 포획되었다. 플로우셀 1 및 3은 참조 대조로 사용되었다. 각 항체는 결합 버퍼내에서 200 nM로 희석되었으며, 모든 4개의 플로우셀 상에 4분간 주입되고, 이어 버퍼 내에서 5 분간 해리되었다. 표면은 HBS-EP 버퍼 내 10 mM EDTA로 3분간 20 ㎕/분으로 재생되었다.

그 결과를 도 17에 나타내었다.

비아코어는 또한 FcγRI 결합을 비교하기 위해 사용되었다. 항-테트라 His 항체는 Zeba Desalting 칼럼을 사용하여 10 mM 소듐 아세테이트(pH 4.0)로 버퍼 교환되고 아민 커플링을 위하여 아세테이트 버퍼에서 25 ㎍/mL로 희석되었다. CM5 칩의 두 플로우셀은 5 ㎕/분으로 20분 주입 후 항-테트라-His 항체 약 9000 RU 으로 고정되었다. 이전 실험과 유사하게 약한 결합제를 비교하기 위해, 10배 더 많은 FcγRI가 항-테트라-His 표면에 포획되었다. 재조합 인간 FcγRI를 HBS-EP 결합 버퍼에서 10 ㎍/mL로 희석하고 플로우셀 2에 1분간 5 ㎕/분으로 주입하여 약 1000 RU 수용체를 항-테트라-His 칩에 포획하였다. 단일 농도의 항체, 100 nM을 3분간 30 ㎕/분으로 포획된 수용체 및 대조 표면에 주입하였다. 해리는 3분간 모니터되었다. 표면은 10 mM 글리신(pH 2.5)를 20 ㎕/분으로 두 번 30초 주입하여 재생하였다.

그 결과를 도 18에 나타내었다.

결과는 글리코조작된 돌연변이들이 FcγRIIIa 또는 FcγRI에 거의 결합하지 않음을 제안한다. 특히 H66 S298N/T299A/Y300S는 두 수용체에 대한 결합이 거의 완전히 폐지되었다. 이 돌연변이는 더 상세한 특성화를 위해 리드로서 선택되었다.

원편광 이색성(CD)을 사용한 안정성 특성화

S298N/T299A/Y300S 항체 돌연변이의 안정성은 원거리 자외선 CD 써모 용융 실험에 의해 모니터되었으며, 여기에서 종국적으로 항체 펼침을 초래하는 온도 상승에 따라 216nm 및 222nm에서의 CD 시그널이 모니터되었다. Jasco 815 분광기상에서 10 mm의 경로 길이로 석영 큐벳(Hellma, Inc) 내 PBS 버퍼 내 약 0.5 mg/mL 단백질 농도에서 CD 스펙트럼이 수집되었다. 온도는 열전기 펠티에(Jasco model AWC100)로 조절되었고, 25~89℃에서 1℃/분의 속도로 상승되었다. CD 시그널 및 HT 전압 모두 수집되었다. 데이타는 210~260 nm에서 0.5 nm의 데이타 간격 및 1℃의 온도 간격으로 수집되었다. 스캔 속도는 50 nm/분이고 데이타 피치는 0.5 nm이었다. 밴드너비는 2.5 nm로 사용되었으며 감도는 중간으로 세팅되었다. 각 샘플마다 4개의 복제 스캔이 수행되었다. 결과로부터 델타 AB H66 및 S298N/T299A/Y300S H66 돌연변이 모두 유사한 열적 행동을 나타내며, 63C 주변에서 분해를 위한 동일한 온셋 온도를 갖는 것이 제안되었다. 환언하면, 돌연변이는 델타 AB 포맷만큼 안정적이다.

도 18 참조.

실시예 6

Fc -조작된 돌연변이의 기능적 분석

PBMC 증식 및 사이토킨 방출 어세이가 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행되었다. 정상 공여자 PBMC를 해동하여 하기 조건하에 처리하였다(모두 보체를 포함하는 매질 내에서 처리됨):

- 미처리

- BMA031, moIgG2b 10ug/ml

- OKT3, moIgG2a 10ug/ml

- H66, huIgG1 델타AB 10ug/ml, 1ug/ml 및 0.1ug/ml

- H66, huIgG1 S298N/T299A/Y300S 10ug/ml, 1ug/ml 및 0.1ug/ml

사이토킨은 Bioplex 분석(IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, GM-CSF, IFNg, TNFa)을 위해 2일(D2) 및 4일(D4)에 수확하였다. 세포는 CD4, CD8, CD25 및 αβTCR 발현을 위해 D4에 염색되었다.

도 19 내지 22에 보인 바와 같이, 결과는 H66 S298N/T299A/Y300S가 모든 세포 기초 어세이에서 H66 델타AB와 유사하게 행동함을 보여주며, CD25 발현에 의한 최소의 T-세포 활성화; 델타AB와 약간 상이한 키네틱을 갖지만 αβTCR에 대한 결합; D2 및 D4 양 시점에서 최소의 사이토킨 방출을 보이며; 이 돌연변이는 실제로 수개의 사이토킨에 대해 D4에서 델타AB보다 우월하였다.

따라서 S298N/T299A/Y300S 돌연변이는 델타AB 돌연변이만큼 효과적으로 이펙터 기능을 제거하였다.

실시예 7

이중특이적 항체

두개의 단일쇄 항체(scFv)가 짧은 아미노산 링커에 의해 함께 연결되어 구성되며, 한 암(arm)은 종양 타깃에 결합할 수 있고 다른 암은 αβ TCR에 의해 T 세포에 결합할 수 있는 이중-특이적 분자들을 구축하였다. 이 이중특이적 분자는 여기에서 TRACER(T 세포 수용체 활성화된 세포독성 가능자; T cell Receptor Activated Cytotoxic EnableR)로 지칭된다.

하기 인간화 항-αβTCR scFv 구조체들이 제조되었다:

GL1BMΔSxVK1

GL1BMΔSxVK27

GL1BMΔSVH11xVK1

GL1BMΔSVH15xVK1

GL1BMΔSVH28xVK43

GL1BMΔSVH31xVK43

중쇄 및 경쇄 서열이 서열 번호 14 내지 16 및 20 내지 24에 제시되어 있다.

이들 분자들의 특성화는 종양 타깃 및 T 세포에의 결합, 인 비트로 세포독성 활성 및 종양 타깃 세포의 존재 및 비존재 하에서의 사이토킨 방출 프로파일의 평가로 구성되었다.

유세포 분석에 의해 평가된 결합 프로파일은 항-αβ TCR 이중-특이적 항체가 종양 타깃 세포주 및 T 세포 양쪽에 결합할 수 있음을 보여준다. 도 23 참조

유세포 분석에 의해 측정된 인 비트로 세포독성 활성은 항-αβ TCR 이중-특이적 항체로 소집된 T 세포가 T 세포 매개 용해를 유도할 수 있음을 보여준다. 도 24 참조.

사이토킨 방출 프로파일의 분석은 이중-특이적 항체의 두 암이 결합될 때, 타깃 세포 부재 시에 보이지 않던 고 수준의 TH1/TH2 사이토킨 방출이 T 세포로부터 일어남을 보여준다. 이를 함께 고려하면 이 작용 기전이 문헌에 기재된 CD3 기초 이중특이적 항체와 유사한 프로파일을 보여준다.

실시예 8: 항- CD52 항체에서 조작된 Fc 변종의 제조 및 특성화

여기에 기재된 Fc 돌연변이 이용 가능성의 일반성을 테스트하기 위해, 당화 돌연변이 S298N/Y300S를 항-CD52 항체(클론 2C3)에 제조하여 FcγRIII 결합의 소실로 이펙터 기능을 조절하는 것이 상이한 항체 백본에도 적용될 수 있는 지 여부를 보았다. S298N/Y300S 2C3 변종 DNA는 신속 변경 돌연변이 생성(quick change mutagenesis)에 의해 제조되었다. 단백질은 HEK293 일시적 트랜스펙션 후 조건화된 매질로부터 정제되었다. 항-CD52 2C3 야생형 항체가 대조로서 병렬적으로 제조되었다. 비아코어를 사용하여 정제된 항체의 항원-결합, FcγRIII 및 결합성질을 특성화하였다(도 26 참조).

S298N/Y300S 2C3 변종은 CD52 펩티드에 강하게 결합하고 결합 센서그램(sensorgram)은 야생형 대조와 구별되지 않았으며, 이는 Fc 도메인상의 돌연변이가 항원 결합에 영향을 미치지 않음을 제안한다(도 26의 A 참조).

Fc 이펙터 기능을 분석하기 위해, FcγRIII 수용체(Val158)를 결합연구에 사용하였다. 돌연변이 및 야생형 대조 항체들을 200nM로 희석하고 HPC4-tag 포획된 FcγRIIIa에 주입하였다. FcγRIII 결합은 S298N/Y300S 돌연변이에 대해 거의 검출이 불가능하였으며, 이는 이 변경으로 이펙터 기능이 소실된 것을 가리킨다(도 26의 B). 돌연변이는 또한 야생형 항체 대조와 동일한 친화성으로 FcRn 수용체에 결합하므로, 순환 반감기 또는 기타 약물동력학적 성질의 변화는 없는 것으로 예측되었다(도 26의 C 참조). 결론적으로 S298N/Y300S 돌연변이는, 예컨대 인간 Fcγ 수용체 결합을 통한 원하지 않는 Fc 이펙터 기능의 감소나 제거를 위해 항체에 일반적으로 적용가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> Genzyme Corporation SNELL, Daniel MENRAD, Andreas LaCORCIA, Gina SHANKARA, Srinivas QIU, Huawei PAN, Clark <120> Anti-Alpha Beta TCR Antibodies <130> AM/JS/300232.20772WO <150> US 61/533,510 <151> 2011-09-12 <160> 24 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: EuCIV3 Heavy chain variable domain <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: EuCIV3 Light chain variable domain <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ile Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: HEBE1 Heavy chain variable domain <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: HEBE1 Light chain variable domain <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ile Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: HEBE1 H10 Heavy chain variable domain <400> 7 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GL1BM Heavy chain variable domain <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GL1BM Light chain variable domain <400> 9 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 11 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: HuIgG4 agly Fc <400> 11 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 12 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: HEBE1 H66 Heavy chain variable domain <400> 12 Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: HEBE1 H71 Heavy chain variable domain <400> 13 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GL1BM VK43 Light chain variable domain <400> 14 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GL1BM VH28 Heavy chain variable domain <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GL1BM VH31 Heavy chain variable domain <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys <210> 18 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 19 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro 85 90 95 <210> 20 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GL1BM VHdeltaS <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GL1BM VK1 <400> 21 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GL1BM VK27 <400> 22 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GL1BM VHdeltaS VH11 <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GL1BM VHdeltaS VH15 <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims

서열 번호: 7, 12 또는 13에 기재된 CDR 및 서열 번호: 17에 기재된 인간 IGH3-23 프레임 워크를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 프레임 워크 위치 6이 공여자 잔기인, 인간 αβTCR/CD3 복합체에 특이적인 인간화 단클론 항체.
서열 번호: 7, 12 또는 13에 기재된 CDR 및 서열 번호: 17에 기재된 인간 IGH3-23 프레임 워크를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 프레임 워크 위치 18이 공여자 잔기인, 인간 αβTCR/CD3 복합체에 특이적인 인간화 단클론 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 프레임 워크 위치 49 및/또는 69가 공여자 잔기인 인간 αβTCR/CD3 복합체에 특이적인 인간화 단클론 항체.
서열 번호: 15 또는 16에 기재된 CDR 및 서열 번호: 18에 기재된 인간 IGHV1-3*01 프레임 워크를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 프레임 워크 위치 38, 44 및/또는 48의 하나 이상이 공여자 잔기인, 인간 αβTCR/CD3 복합체에 특이적인 인간화 단클론 항체.
서열 번호: 15 또는 16에 기재된 CDR 및 서열 번호: 18에 기재된 인간 IGHV1-3*01 프레임 워크를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 프레임 워크 위치 44 및 48이 공여자 잔기인, 인간 αβTCR/CD3 복합체에 특이적인 인간화 단클론 항체.
서열 번호: 14에 기재된 CDR 및 서열 번호: 19에 기재된 인간 IGKV3-11*01 프레임 워크를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 프레임 워크 위치 70 및/또는 71이 공여자 잔기인, 인간 αβTCR/CD3 복합체에 특이적인 인간화 단클론 항체.
제6항에 있어서, 프레임 워크 위치 46이 공여자 잔기인 인간 αβTCR/CD3 복합체에 특이적인 인간화 단클론 항체.
서열 번호: 7, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄들에서 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 인간 αβTCR/CD3 복합체에 특이적인 인간화 단클론 항체.
서열 번호: 15 및 서열 번호: 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄들에서 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 αβTCR/CD3 복합체에 특이적인 인간화 단클론 항체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 기원의 불변 영역을 더 포함하는 인간화 항체.
제10항에 있어서, Fcγ 수용체 결합을 감소시키는 Fc 변경을 더 포함하는 인간화 항체.
제11항에 있어서, 비당화된 Fc 영역 또는 델타 ab 변경을 포함하는 인간화 항체.
제11항에 있어서, 변경된 당화 패턴을 포함하는 인간화 항체.
제13항에 있어서, 돌연변이 S298N, T299A 및 Y300S 중 하나 이상을 포함하는 인간화 항체.
제14항에 있어서, 돌연변이 N297Q, S298N, T299A 및 Y300S 중 두 개 이상을 포함하는 인간화 항체.
제14항에 있어서, 다중 돌연변이 N297Q/S298N/Y300S, S298N/T299A/Y300S 또는 S298N/Y300S을 포함하는 인간화 항체.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 인간화 단클론 항체의 적어도 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산.
제17항에 따른 핵산을 발현하는 세포.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에서 T 세포 매개 반응을 억제하는데 사용하기 위한 것인 인간화 항체.
제19항에 있어서, T 세포 매개 반응이 고형 기관 이식 및 복합 조직이식을 포함하는 조직 이식(tissue transplantation), 조직 그라프팅(tissue grafting), 다발성 경화증 및 1형 당뇨병에서 선택되는 상태에 관련된 인간화 항체.
돌연변이 S298N, T299A 및 Y300S 중 하나 이상을 포함하는, Fcγ 수용체 결합을 감소시키는 변경된 당화 패턴을 포함하는 변경된 Fc를 포함하는 항체.
제21항에 있어서, 돌연변이 N297Q, S298N, T299A 및 Y300S 중 두 개 이상을 포함하는 항체.
제14항에 있어서, 다중 돌연변이 N297Q/S298N/Y300S, S298N/T299A/Y300S 또는 S298N/Y300S을 포함하는 항체.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체인 항체.
적어도 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 제1 결합 도메인의 중쇄 및 종양-특이적 항원에 특이적인 제2 결합 도메인을 갖는 다중특이적 항체.
제25항에 있어서, 적어도 제4항, 제5항 또는 제9항 중 어느 한 항에 따른 결합 도메인의 중쇄를 포함하는 다중특이적 항체.
제25항 또는 제26항에 있어서, 항-αβTCR/CD3 scFv 및 항-종양 scFv을 포함하는 다중특이적 항체.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적인 다중특이적 항체.