TWI593706B - 抗αβＴＣＲ抗體 - Google Patents

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Description

抗αβTCR抗體
本發明係關於對αβT細胞受體(αβTCR)具有特異性之抗體。特定而言，本發明係關於源自鼠類單株抗體BMA031之人類化抗αβTCR抗體及該人類化抗體在免疫抑制療法中之用途。
有大量文件證明免疫抑制劑在自體免疫疾病及器官移植療法中之用途；然而該方法遠非最佳。毒性、伺機性感染、細胞介素風暴(cytokine storm)及癌症風險增加在用該等藥劑治療之患者中普遍存在。在此情形下使用生物製劑已一定程度地改良患者結果，但該等副效應仍明顯。
業內熟知出於免疫抑制目的使用針對淋巴球之多株抗血清。然而，抗血清之產生極為費力，其顯示在不同批料間有所變化之性質，且可使用多株抗血清獲得之特異性受到限制。
藉由雜交瘤技術產生單株抗體首先係由Köhler及Milstein(Nature 256：495-497(1975))闡述。與多株抗血清相比，單株抗體(mAb)之特異性更高，且具有更一致性質。mAb已最頻繁且順利地在臨床器官移植中用於免疫抑制療法。然而，多數用作治療自體免疫疾病之免疫抑制劑及用於移植患者之mAb具有寬免疫抑制能力，因此會不合意地影響眾多免疫細胞之功能，推測該等免疫細胞並不全部參與移植物排斥。
針對T細胞表面受體抗原之小鼠單株抗體首先係於1979年使用雜交瘤技術產生(Kung等人(1979)Science 206：347-349)。在3種由Kung等人發現之單株抗體中，一種抗體命名為莫羅單抗(muromonab)-CD3(OKT3)，其對T細胞之CD3受體具有經界定之特異性，與95%以上週邊成熟T細胞反應而不影響未成熟胸腺細胞。OKT3與CD3複合物之結合引起CD3受體之內在化及周邊損失CD3陽性細胞。順利的OKT3治療與CD3陽性T細胞自約60%迅速下降至小於5%相關。
OKT3已廣泛地用於治療在腎移植後經受急性同種異體移植物排斥之患者(Russell,P.S.、Colvin,R.B.、Cosimi,A.B.(1984)Annu.Rev.Med.35：63及Cosimi,A.B.、Burton,R.C.、Colvin,R.B.等人(1981)Transplantation 32：535)。此外，使用OKT3及兔補體自供體骨髓清除成熟T細胞以在同種異體骨髓移植中預防急性移植物抗宿主疾病(GVHD)(Prentice,H.G.,Blacklock,H.A.,Janossy,G.等人(1982)Lancet 1：700及Blacklock,H.A.、Prentice,H.G.、Gilmore,M.J.等人(1983)Exp.Hematol.11：37)。儘管OKT3治療似乎可在用於急性白血病之同種異體骨髓移植中有效地預防GVHD，但在治療嚴重組合免疫缺陷期間，用OKT3進行組合活體外/活體內治療無法預防GVHD(Hayward,A.R.等人(1982)Clin.Lab.Observ.100：665)。用OKT3處理T細胞誘發若干與免疫抑制不一致之反應，包括T細胞活化、免疫介質之產生及T3調節。假定由CD3-mAb(例如， OKT3)識別之T3抗原複合物在T細胞活化期間起關鍵作用。α/βT淋巴球藉助統稱為αβ T細胞抗原受體(TCR)．CD3複合物之多聚蛋白識別肽-MHC配體。此結構係由結合抗原之可變αβ TCR二聚物及3個不變二聚物(CD3γε、δε及ζζ)構成，該等不變二聚物參與TCR．CD3表面輸送、穩定及信號轉導。αβT細胞受體(αβTCR)係在大多數(約95%)T細胞上表現且經由接合展示於MHC上之抗原在T細胞活化中具有關鍵作用。其餘5%細胞係γδT細胞受體(γδTCR)陽性。γδTCR陽性細胞群體在針對細菌、病毒及真菌來源之伺機性感染進行防禦之先天免疫反應中起重要作用。γδT細胞在移植中之移植物排斥中不起作用。因此，靶向αβTCR陽性細胞群體及節約γδTCR陽性群體應允許顯著治療效果，同時維持針對伺機性感染之基線免疫保護。
小鼠IgG2b單株抗體BMA031(Borst等人(1990年11月)Hum.Immunol.29(3)：175-88；EP0403156)對TCR α/β/CD3複合物上之共同決定簇具有特異性，且不結合γ-δTCR。BMA031具有高度免疫抑制性且能經由活化誘導性細胞死亡(AICD)機制誘導經活化T細胞之細胞凋亡(Wesselborg等人(1993年5月)J.Immunol.150(10)：4338-4345)。其在活體外抑制混合淋巴球反應且其已在諸多實體器官移植情形中之移植物排斥之預防中以及急性移植物抗宿主疾病之治療中顯示初步臨床效果(aGVHD)(Kurrle等人(1989年2月)Transplant Proc.21(1)：1017-1019)。BMA031不接合大多數人類群體中之人類Fcγ受體(FcγR)(約10%人類具有結合 小鼠IgG2b同種型之FcγR)。因此，該抗體不會經由T細胞受體交聯引起T細胞活化且因此，其不誘導T細胞活化或相關細胞介素釋放。就此而言，其特性相對於OKT3之特性極佳。然而，BMA031係鼠類抗體，且因此鑒於其在人類個體中所誘發之人類抗小鼠抗體(HAMA)反應而不適於重複給予人類個體。
業內已闡述BMA031之若干人類化形式(參見EP 0403156；亦參見Shearman等人，(1991)J.Immunol.147：4366-4373)。如EP0403156中所述，僅有CDR移植並不能順利地保持抗原結合。一種具有有效框架修飾之純系EUCIV3順利地結合T細胞；然而，如EP0403156中所述，與αβTCR之結合有效性不如親代BMA031抗體，如藉由流式細胞術競爭分析所測定。亦已顯示，EuCIV3抑制活體外免疫反應之能力與BMA031相比顯著降低(參見圖2)。另外，EuCIV3最初係在仍保持FeγR結合之野生型人類IgG1或IgG4骨架上產生。因此，該等人類化抗體允許T細胞活化、增殖及伴隨之細胞介素釋放且因此顯著不同於BMA031之原有性質。
抗體糖基化修飾為業內已知。例如，已知非糖基化抗體可具有經廣泛修飾之功能；參見Boyd等人(1996)Mol.Immunol.32：1311-1318。然而，先前尚未闡述人類化BMA031之非糖基化形式或具有經修飾糖基化模式之衍生物。
因此，業內需要抗αβTCR人類化抗體，其改良EUCIV3 之結合性質且有利地保持BMA031之免疫抑制性及非T細胞活化性質。
在第一態樣中，提供人類化單株抗體，其包含BMA031之CDR且保持BMA031與其同源抗原之結合親和力。在第一實施例中，該人類化抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：7、12或13中所述之CDR及SEQ ID NO：17中所述之人類IGH3-23框架，其中框架位置6係供體殘基；在替代實施例中，框架位置18係供體殘基。視情況，框架位置49及/或69係供體殘基。
在第二實施例中，人類化單株抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：15或16中所述之CDR及SEQ ID NO：18中所述之人類IGHV1-3＊01框架，其中框架位置38、44及/或48中之一或多者係供體殘基；在替代實施例中，框架位置44及48係供體殘基。
在第三實施例中，人類化單株抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：14中所述之CDR及SEQ ID NO：19中所述之人類IGKV3-11＊01框架，其中框架位置70及/或71係供體殘基。視情況，位置46係供體殘基。
第一實施例之抗體之實例包括包含抗體，該等抗體包含選自包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13中所述之序列之重鏈之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：14中所述之序列之輕鏈可變區序列。
第二實施例之抗體之實例包括抗體，該等抗體包含選自 包含SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16中所述之序列之重鏈之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：14中所述之序列之輕鏈可變區。所述實施例之人類化抗體係BMA031之人類化形式。其一級結構與人類化抗體EuCIV3之一級結構不同，EuCIV3與BMA031相比與αβTCR之結合有所減少。
在序列表中，CDR係藉助注釋或加下劃線來指示。框架係在CDR以外之全部序列，其係根據「Kabat」編號系統定義且在適用時藉由使用「IMGT」CDR定義來擴展。若不指示改變框架殘基來匹配供體序列，則通常應將該殘基理解為受體殘基。
人類化抗體可包含恆定區。在一個實施例中，恆定區具有人類來源。
本發明人類化抗體可進一步藉由Fc改造來修飾。免疫球蛋白易於使Fcγ受體交聯，此可導致抗T細胞抗體之組成型T細胞活化。為避免Fcγ交聯，可藉由(例如)產生Fab或Fv片段來修飾抗體以去除Fc區；然而，經截短免疫球蛋白缺乏有效效應子功能且展現較短血清半衰期。因此，人類化抗體之Fc區可經修飾以防止Fcγ交聯。實例性技術包括藉由(例如)藉助N297Q突變修飾Fc區來產生非糖基化免疫球蛋白。無法結合Fcγ之免疫球蛋白亦係由Armour等人(1999)Eur.J.Immunol.29：2613-2624闡述。實現IgG1之修飾稱為△ab修飾，且係由△a突變(其中IgG殘基係於位置327、330及331處取代，且IgG2殘基係於位置233-236處取代)與△b突變(其中缺失殘基236)之組合組成。在另一實施 例中，本發明抗體之糖基化模式可經修飾。
在一個實施例中，抗體包含突變S298N、T299A及Y300S中之一或多者。
在實施例中，抗體包含突變N297Q、S298N、T299A及Y300S中之兩者或更多者。例如，提供包含多重突變N297Q/S298N/Y300S、S298N/T299A/Y300S或S298N/Y300S之人類化抗體。
在第二態樣中，提供包含BMA031之CDR且保持BMA031之T細胞抑制性質之人類化單株抗體。該人類化抗體較佳包含具有SEQ ID NO：12、13、15或16中所述之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：14中所述之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在第三態樣中，提供至少編碼所述實施例之前述態樣之人類化單株抗體之重鏈可變區的核酸。該核酸可編碼人類化抗體之可變區及恆定區。可在單獨核酸上或在相同核酸分子上編碼重鏈及輕鏈。
根據第四態樣，提供表現前述態樣之核酸之細胞。細胞係(例如)培養中之適於表現抗體分子之細胞。核酸可包括信號序列及/或其他序列或修飾，該等其他序列或修飾係抗體分子在細胞中之表現及/或抗體分子自細胞之分泌所必需，或對其進行調節。
在又一實施例中，如上述態樣中所述提供人類化抗體，其用於抑制個體中之T細胞介導反應。
例如，T細胞介導反應可參與選自以下之狀況：組織移 植(tissue transplantation)(包括實體器官移植及複合性組織移植)、組織移植(tissue grafting)、多發性硬化及1型糖尿病。
此外，另一實施例提供治療罹患涉及異常T細胞介導反應之病況之個體的方法，其包含向有需要之個體投與治療有效劑量之所述實施例之抗體。
因此，已產生不誘導細胞介素釋放之人類化非活化抗αβTCR抗體，其能選擇性調節αβTCR並誘導經活化αβTCR陽性T細胞之細胞凋亡。已經產生該等抗體以供在T細胞介導疾病中用作免疫抑制劑。已經由小鼠抗αβTCR抗體BMA031之人類化及藉由對人類化抗體之Fc改造以防止接合Fcγ受體來產生該等抗體。與業內可利用之BMA031之人類化形式不同，所述實施例之抗體保持BMA031之結合親和力。此外，如活體外馴化(education)分析中所示，所述實施例抗體之免疫抑制性質優於BMA031。此外，與先前技術之人類化BMA031抗體不同，所述實施例抗體不在正常PBMC中誘導細胞介素釋放。
根據第五態樣，提供包含經修飾Fc之抗體，其中該經修飾Fc包含減少FcγR受體結合之經修飾糖基化模式，該抗體包含突變S298N、T299A及Y300S中之一或多者。
在一個實施例中，抗體包含突變N297Q、S298N、T299A及Y300S中之兩者或更多者。
在實施例中，抗體包含多重突變N297Q/S298N/Y300S、S298N/T299A/Y300S或S298N/Y300S。
例如，抗體可為如本發明前述態樣中所述之抗體。
根據第六態樣，提供多特異性抗體，其至少包含本發明前述態樣中所述第一結合結構域之重鏈及對腫瘤特異性抗原具有特異性之第二結合結構域。
在一個實施例中，第一結合結構域包含本發明第二態樣之重鏈。
多特異性抗體可包含許多不同構形；在一個實施例中，其包含抗TCR/CD3 scFv及抗腫瘤scFv。
在一個實施例中，多特異性抗體具有雙特異性。
除非另有說明，否則本文所用所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。可在本發明方法及技術中使用任何與彼等本文所闡述方法及材料相似或等效者。本文引用之所有出版物皆係以整體引用方式併入本文中，以達成闡述及揭示可結合本發明使用之出版物中所報導方法、藥劑及工具之目的。
除非另有說明，否則本申請案之方法及技術通常係根據業內熟知且如本說明書通篇引用及論述之各種一般且較具體參考文獻中所述之習用方法實施。例如，參見Gennaro,A.R.編輯(1990)Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing公司；Hardman,J.G.、Limbird,L.E.及Gilman,A.G.編輯(2001)The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill公司；Colowick,S.等人編輯，Methods In Enzymology,Academic Press公 司；Weir,D.M.及Blackwell,C.C.編輯(1986)Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷，Blackwell Scientific Publications；Maniatis,T.等人編輯(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，第I-III卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.等人編輯(1999)Short Protocols in Molecular Biology，第4版，John Wiley & Sons；Ream等人編輯(1998)Molecular Biology Techniques：An Intensive Laboratory Course,Academic Press；Newton,C.R.及Graham,A.編輯(1997)PCR(Introduction to Biotechniques Series)，第2版，Springer-Verlag。
本文所提及之人類化單株抗體係由已移植非人類抗體之互補決定區(CDR)之人類抗體框架構成之抗體。亦可改變人類受體框架。設計及產生人類化抗體之程序為業內所熟知，且已闡述於(例如)以下專利中：Cabilly等人，美國專利第4,816,567號；Cabilly等人，歐洲專利申請案0 125 023；Boss等人，美國專利第4,816,397號；Boss等人，歐洲專利申請案0 120 694；Neuberger,M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger,M.S.等人，歐洲專利申請案0 194 276 B1；Winter，美國專利第5,225,539號；Winter，歐洲專利申請案0 239 400；Padlan,E.A.等人，歐洲專利申請案0 519 596。有關抗體、人類化抗體、人類改造抗體及其製備方法之其他細節可參見Kontermann,R.及Dübel,S.編輯(2001,2010)Antibody Engineering，第2版，Springer-Verlag,New York,NY。
除非另有說明，否則術語「抗體」用於指整個抗體以及此等抗體之抗原結合片段。例如，該術語涵蓋四鏈IgG分子以及抗體片段。
本文所用術語「抗體片段」係指完整全長抗體之部分，例如如下文所進一步闡述。
抗體可屬於任一類別，例如IgG、IgA或IgM；及任一亞類，例如IgG1或IgG4。不同類別及亞類之免疫球蛋白具有可在不同應用中有利之不同性質。例如，IgG4抗體與Fc受體之結合有所減少。
在本文所述抗體之背景下，特異性意指所主張抗體能選擇性結合其經界定同源抗原，該抗原係αβTCR.CD3複合物。本發明抗體結合在細胞上表現之αβTCR.CD3複合物。
人類αβTCR/CD3複合物係在T細胞表面上呈遞之T細胞受體複合物。參見Kuhns等人，(2006)Immunity 24：133-139。鼠類單株抗體BMA031靶向此複合物(參見歐洲專利申請案EP 0 403 156；SEQ ID NO：1及2)。
天然免疫球蛋白具有共同核心結構，其中兩條相同輕鏈(約24 kD)及兩條相同重鏈(約55或70 kD)形成四聚物。各鏈之胺基末端部分稱為可變(V)區且可與各鏈之其餘部分之較保守恆定(C)區區別。稱為J區之C末端部分係在輕鏈之可變區(亦稱為VL結構域)內。在重鏈可變區(亦稱為VH結構域)內存在D區與J區。免疫球蛋白之多數胺基酸序列變異限定於稱為超變區或互補決定區(CDR)之V區內直接參與抗原結合之3個單獨位置。自胺基末端進行，將該等 區分別命名為CDR1、CDR2及CDR3。CDR藉由較保守框架區(FR)保持在適宜位置。自胺基末端進行，將該等區分別命名為FR1、FR2、FR3及FR4。CDR及FR區之位置及編號系統已由Kabat等人界定(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,U.S.Government Printing Office(1991)及其可在線查找之更新內容)。另外，CDR區範圍已進一步藉由IMGT命名法界定。
所述實施例之抗體之可變區可參見SEQ ID NO：5-7及12-16，且可藉由人類化BMA031獲得，亦即，藉由將BMA031之CDR轉移至人類框架獲得。闡述人類化抗體之兩個系列，即HEBE1系列，包含SEQ ID NO：5-7、12及13；及GL1BM系列，包含如SEQ ID NO：8、15及16中所示之重鏈可變區。在兩種情形下，所用輕鏈可變區係如SEQ ID NO：14(GL1BM VK43)中所示。
所用人類框架係IGH3-23(在HEBE1之情況下)以及IGHV1-3＊01及IGKV3-11＊01(在GL1BM之情況下)。
恆定區可源自任何人類抗體恆定區。可將可變區基因與恆定區基因在框架內選殖至表現載體中以表現免疫球蛋白重鏈及輕鏈。可將此等表現載體轉染至抗體產生宿主細胞中用於抗體合成。
人類抗體可變區及恆定區可源自序列數據庫。例如，可在IMGT/LIGM數據庫中獲取免疫球蛋白序列(Giudicelli等人，(2006)Nucleic Acids Res.34：(增刊1)：D781-D784) 或VBase(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)。
非糖基化抗體可具有經廣泛修飾之功能；參見Boyd等人(1996)Mol.Immunol.32：1311-1318。本文所提及之「δab」或△ab修飾係如Armour等人，(1999)Eur.J.Immunol.29：2613-2624中所述之Fc修飾。用於修飾抗體Fc區之糖基化之技術為業內已知，且包括化學、酶促及突變手段，例如，使CH2結構域中之N297位置突變。用於使抗體基因突變以產生非糖基化IgG分子之技術闡述於Tao及Morrison(1989)J.Immunol.143：2595-2601中。
本文所提及之「核酸」包括編碼本發明抗體之DNA分子。較佳者係適於在宿主細胞中表現抗體基因之表現載體。用於抗體基因表現之表現載體及宿主細胞為業內已知；例如，參見Morrow,K.J.Genetic Engineering & Biotechnology News(2008年6月15日)28(12)，及Backliwal,G.等人(2008)Nucleic Acids Res.36(15)：e96-e96。
1.抗體
本發明涵蓋人類化抗αβTCR抗體之抗原結合片段。抗體片段能結合αβTCR.CD3複合物。其涵蓋Fab、Fab'、F(ab')2及F(v)片段、或個別輕鏈或重鏈可變區或其部分。片段包括(例如)Fab、Fab'、F(ab')2、Fv及scFv。該等片段缺乏完整抗體之Fc部分，比完整抗體更快速地自循環清除，且可具有較低的非特異性組織結合性。該等片段可使用熟知方法自完整抗體產生，例如藉由用諸如木瓜蛋白酶(產生Fab片段)或胃蛋白酶(產生F(ab')2片段)等酶進行蛋白分解裂 解。
抗體及片段亦涵蓋結合αβTCR.CD3複合物之單鏈抗體片段(scFv)。scFv包含可操作地連接至抗體輕鏈可變區(VL)之抗體重鏈可變區(VH)，其中重鏈可變區及輕鏈可變區一起或個別地形成結合αβTCR之結合位點。scFv可包含胺基末端處之VH區及羧基末端處之VL區。或者，scFv可包含胺基末端處之VL區及羧基末端處之VH區。此外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH係藉由單獨基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接體接合，該合成連接體使其能夠作為VL和VH區配對形成單價分子的蛋白單鏈(稱為單鏈FV(scFv))。scFv可視情況進一步在重鏈可變區與輕鏈可變區之間包含多肽連接體。
抗體及片段亦涵蓋如Ward,E.S.等人(1989)Nature 341：544-546中所述之結構域抗體(dAb)片段，其係由VH結構域組成。
抗體及片段亦涵蓋重鏈抗體(HCAb)。據報告，該等抗體僅使用重鏈可變區形成抗原結合區，此乃因該等功能抗體僅係重鏈二聚物(稱作「重鏈抗體」或「HCAb」)。因此，抗體及片段可為特異性地結合αβTCR.CD3複合物之重鏈抗體(HCAb)。
抗體及片段亦涵蓋為對αβTCR.CD3複合物具有特異性之SMIP或結合結構域免疫球蛋白融合蛋白之抗體。該等構築體係單鏈多肽，其包含實施抗體效應子功能所必需之融合至免疫球蛋白結構域之抗原結合結構域(參見WO 2005/017148)。
抗體及片段亦涵蓋雙鏈抗體。該等雙鏈抗體係二價抗體，其中VH及VL結構域在單多肽鏈上表現，但使用過短而不允許在相同鏈上之兩個結構域之間配對之連接體。此迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對且藉此產生兩個抗原結合位點(例如，參見WO 93/11161)。雙鏈抗體可具有雙特異性或單特異性。
抗體或其抗體片段不與除αβTCR.CD3複合物以外之任一靶標交叉反應。
抗體或其片段可經修飾以延長其血清半衰期，例如，藉由添加分子(例如PEG或其他水溶性聚合物，包括多糖聚合物)以延長半衰期。
抗體及其片段可具有雙特異性。例如，雙特異性抗體可與單抗體(或抗體片段)類似，但具有兩個不同抗原結合位點(可變區)。雙特異性抗體可藉由各種方法(例如化學技術、「多源雜交瘤(polydoma)」技術或重組DNA技術)產生。雙特異性抗體可對至少兩個不同表位具有結合特異性，該等表位中之至少一者係αβTCR.CD3複合物。另一特異性可選自任何有用或期望特異性，包括(例如)對延長活體內半衰期之人類血清白蛋白之特異性。
在腫瘤學應用之臨床學中使用雙特異性抗體現已成為現實，其中三功能卡妥索單抗(Catumaxomab)(Removmab®)已批準用於惡性腹水之情形，且雙特異性抗體蘭妥莫單抗(Blinatumomab)現已處於血液惡性病之II期試驗中。該等 分子共同具有結合T細胞之結合臂及結合腫瘤靶細胞之第二臂，從而導致T細胞介導之腫瘤靶標溶解。該等分子亦共同經由位於細胞表面上之CD3蛋白募集T細胞。經由CD3募集之替代係利用亦在細胞表面上表現之αβ T細胞受體(αβ TCR)。因此，可使用本發明抗體藉由將對腫瘤相關抗原之特異性與對αβ T細胞受體(αβ TCR)之特異性組合來產生抗腫瘤抗體。
2.抗體產生
本文所述抗體之可變結構域之胺基酸序列係如SEQ ID NO：5-7及12-16中所述。抗體產生可藉由任何業內已知技術實施，包括在諸如以下等轉基因有機體中：山羊(參見Pollock等人(1999)J.Immunol.Methods 231：147-157)、雞(參見Morrow,K.J.J.(2000)Genet.Eng.News 20：1-55)、小鼠(參見Pollock等人，見上文)或植物(參見Doran,P.M.(2000)Curr.Opinion Biotechnol.11：199-204,Ma.J.K-C.(1998)Nat.Med.4：601-606,Baez,J.等人(2000)BioPharm.13：50-54,Stoger,E.等人(2000)Plant Mol.Biol.42：583-590)。抗體亦可藉由化學合成或藉由在宿主細胞表現編碼抗體之基因來產生。
分離編碼抗體之多核苷酸並將其插入可複製構築體或載體(例如質粒)中以供在宿主細胞中進一步繁殖或表現。業內可利用適於表現所述實施例之人類化免疫球蛋白之構築體或載體(例如，表現載體)。可利用多種載體，包括以單拷貝或多拷貝維持於宿主細胞中或變得整合至宿主細胞之 染色體中之載體。可將構築體或載體引入適宜宿主細胞中，且可產生表現人類化免疫球蛋白之細胞並維持於培養中。可使用單一載體或多個載體來表現人類化免疫球蛋白。
使.用習用程序(例如，寡核苷酸探針)容易分離並定序編碼抗體之多核苷酸。可使用之載體包括質粒、病毒、噬菌體、轉座子、袖珍染色體，其中質粒係典型實施例。通常，此等載體進一步包括信號序列、複製起點、一或多個標記物基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列，其可操作地連接至輕鏈及/或重鏈多核苷酸以促進表現。可將編碼輕鏈及重鏈之多核苷酸插入單獨載體中且同時或依序引入(例如，藉由轉化、轉染、電穿孔或轉導)相同宿主細胞中，或者若需要，可在此引入之前將重鏈及輕鏈二者插入相同載體中。
可提供用於在適宜宿主細胞中表現之啟動子。啟動子可為組成型或誘導型。例如，啟動子可經可操作地連接至編碼人類化免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈之核酸，以使其引導編碼多肽表現。可利用多種適宜的原核及真核宿主啟動子。原核啟動子包括用於大腸桿菌(E.coli)之lac、tac、T3、T7啟動子；3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖分解酶(例如，烯醇酶、甘油醛3-磷酸去氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸酯變位酶及葡糖激酶)之啟動子。真核啟動子包括誘導型酵母啟動子，例如醇去氫酶2啟動子、異細胞色素C啟動 子、酸性磷酸酶啟動子、金屬硫蛋白啟動子及負責氮代謝或麥芽糖/半乳糖利用之酶啟動子；RNA聚合酶II啟動子，包括病毒啟動子，例如多瘤病毒啟動子、禽痘病毒及腺病毒(例如，腺病毒2)啟動子、牛乳頭瘤病毒啟動子、鳥類肉瘤病毒啟動子、細胞巨大病毒啟動子(特定而言，即早期基因啟動子)、反轉錄病毒啟動子、肝炎B病毒啟動子、肌動蛋白啟動子、勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus)(RSV)啟動子及早期或晚期猿猴病毒40；及非病毒啟動子，例如EF-1α啟動子(Mizushima及Nagata(1990)Nucleic Acids Res.18(17)：5322)。彼等熟習此項技術者將能選擇表現人類化抗體或其部分之適當啟動子。
若適當，例如，對於在高等真核生物細胞中之表現而言，可包括其他增強子元件以代替彼等發現位於上述啟動子中者或包括其他增強子元件以及彼等發現位於上述啟動子中者。適宜哺乳動物增強子序列包括來自球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、金屬硫蛋白及胰島素之增強子元件。或者，可使用來自真核細胞病毒之增強子元件，例如SV40增強子、細胞巨大病毒早期啟動子增強子、多瘤增強子、桿狀病毒增強子或鼠類1gG2a基因座(參見WO 04/009823)。儘管此等增強子通常位於載體上啟動子上游之位點處，但其亦可位於別處，例如，在未經轉譯區內或聚腺苷酸化信號下游。可基於與用於表現之宿主細胞之相容性來選擇及定位增強子。
另外，載體(例如，表現載體)可包含用於選擇帶有載體 之宿主細胞之可選標記物及(在可複製載體之情況下)複製起點。編碼賦予抗生素抗性或抗藥性之產物之基因係常見可選標記物且可用於原核細胞(例如，f3-內醯胺酶基因(安比西林抗性(ampicillin resistance))、Tet基因(四環素抗性)及真核細胞(例如，新黴素(neomycin)(G418或遺傳黴素)、gpt(黴酚酸)、安比西林或潮黴素抗性(hygromycin resistance)基因)。二氫葉酸還原酶標記物基因允許用甲胺蝶呤在多種宿主中進行選擇。編碼宿主之營養缺陷型標記物之基因產物之基因(例如，LEU2、URA3、HIS3)通常在酵母中用作可選標記物。亦涵蓋使用病毒(例如，桿狀病毒)或噬菌體載體及能整合至宿主細胞基因組中之載體(例如反轉錄病毒載體)。
在真核系統中，聚腺苷酸化及終止信號係可操作地連接至編碼本發明抗體之多核苷酸。此等信號通常位於開放閱讀框之3'處。在哺乳動物系統中，聚腺苷酸化/終止信號之非限制性實例包括彼等源自生長激素、延長因子1α及病毒(例如，SV40)基因或反轉錄病毒長末端重複。在酵母系統中，聚腺苷酸化/終止信號之非限制性實例包括彼等源自磷酸甘油酸酯激酶(PGK)及醇去氫酶1(ADH)基因者。在原核系統中，通常無需聚腺苷酸化信號，而是通常採用較短且界定較充分之終止子序列。可基於與用於表現之宿主細胞之相容性來選擇聚腺苷酸化/終止序列。除上述特徵外，可用於提高產率之其他特徵亦包括染色質重塑(chromatin remodeling)元件、內含子及宿主細胞特異性密 碼子修飾。本發明抗體之密碼子使用可經修改以適應宿主細胞之密碼子偏性，從而增加轉錄物及/或產物產率(例如，Hoekema,A.等人(1987)Mol.Cell Biol.7(8)：2914-24)。可基於與用於表現之宿主細胞之相容性來選擇密碼子。
因此，本發明係關於編碼人類化免疫球蛋白或其重鏈或輕鏈之經分離核酸分子。本發明亦係關於編碼免疫球蛋白及其鏈之抗原結合部分之經分離核酸分子。
抗體可藉由(例如)在適宜宿主細胞中表現一或多種編碼抗體之重組核酸產生。宿主細胞可使用任何適宜方法產生。例如，可將本文所述表現構築體(例如，一或多種載體，例如，哺乳動物細胞表現載體)引入適宜宿主細胞中，且所得細胞可維持(例如，在培養中、在動物中、在植物中)在適於表現構築體或載體之條件下。宿主細胞可為原核細胞，包括細菌細胞，例如大腸桿菌(例如，菌株DH5aTM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、PerC6(Crucell,Leiden,NL)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)及/或其他適宜細菌；真核細胞，例如真菌或酵母細胞(例如，巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)、曲黴菌(Aspergillus sp.)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙鏈孢黴(Neurospora crassa))或其他低等真核細胞及高等真核細胞，例如彼等昆蟲細胞(例如，果蠅Schnieder S2細胞、Sf9昆蟲細胞)(WO 94/126087(O'Connor))、BTI-TN-5B1-4(High FiveTM)昆蟲細胞(Invitrogen)、哺乳動物細胞(例如，COS 細胞，例如COS-1(ATCC登錄號CRL-1650)及COS-7(ATCC登錄號CRL-1651)、CHO(例如，ATCC登錄號CRL-9096)、CHO DG44(Urlaub,G.及Chasin,L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77(7)：4216-4220)、293(ATCC登錄號CRL-1573)、HeLa(ATCC登錄號CCL-2)、CVI(ATCC登錄號CCL-70)、WOP(Dailey,L.等人(1985)J.Virol.,54：739-749)、3T3、293T(Pear,W.S.，等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90：8392-8396)、NSO細胞、SP2/0細胞、HuT 78細胞及諸如此類；或植物細胞(例如，菸草細胞、浮萍(lemna,duckweed)細胞及藻類細胞)。例如，參見Ausubel,F.M.等人編輯Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons公司(1993)。在一些實施例中，宿主細胞並非多細胞有機體(例如，植物或動物)之一部分，例如，其係經分離宿主細胞或係細胞培養物之一部分。
可在旋轉燒瓶、振盪燒瓶、滾瓶、波式反應器(例如，System 1000，來自wavebiotech.com)或中空纖維系統中培養宿主細胞，但對於大規模生產而言，較佳尤其對於懸浮培養而言使用攪拌槽反應器或袋反應器(例如，Wave Biotech,Somerset,New Jersey USA)。攪拌槽反應器可適於使用(例如)噴布器、擋板或低剪切葉輪通氣。對於鼓泡塔及氣舉式反應器而言，可使用利用空氣泡或氧氣泡直接通氣。倘在無血清培養基中培養宿主細胞，則可用細胞保護劑(例如普流尼克F-68,pluronic F-68)補充培養基以幫助 防止細胞因通氣過程而受到損害。端視宿主細胞特性而定，可使用微載體作為錨定依賴性細胞系之生長基質，或該等細胞可適於懸浮培養。可利用多種操作模式來培養宿主細胞，尤其脊椎動物宿主細胞，該等模式係(例如)分批、補料分批、重複分批處理(參見Drapeau等人(1994)Cytotechnology 15：103-109)、持續分批製程或灌注培養。儘管可在含血清培養基(此等培養基包含胎牛血清(FCS))中培養經重組轉化哺乳動物宿主細胞，但較佳在無血清培養基(例如如Keen等人(1995)Cytotechnology 17：153-163中所揭示)或市售培養基(例如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex NJ,USA))中培養此等宿主細胞，若需要，在該等無血清培養基或市售培養基中補充能源(例如葡萄糖)及合成生長因子(例如重組胰島素)。宿主細胞之無血清培養可能要求彼等細胞適於在無血清條件下生長。一種適應方法係在含血清培養基中培養此等宿主細胞且重複地將80%培養基交換為無血清培養基，以使宿主細胞學會適應無血清條件(例如，參見Scharfenberg,K.等人(1995)Animal Cell Technology：Developments Towards the 21st Century(Beuvery,E.C.等人編輯)，第619-623頁，Kluwer Academic publishers)。
可使所述實施例之抗體分泌至培養基中且使用多種技術自其回收並純化以提供適於期望用途之純化程度。例如，當與包含治療性抗體之培養基比較時，治療性抗體用於治療人類患者之用途通常要求至少95%純度(如藉由還原性 SDS-PAGE所測定)，更通常為98%或99%純度。在第一情形下，可使用離心、之後上清液之澄清步驟使用(例如，微濾、超濾及/或深層過濾)去除來自培養基之細胞碎片。或者，可藉由微濾、超濾或深層過濾收穫抗體而不預先離心。可利用多種其他技術，例如透析及凝膠電腦及層析技術，例如羥磷石灰(HA)、親和力層析(視情況涉及親和力標記系統，例如多組胺酸)及/或疏水相互作用層析(HIC)(參見US 5,429,746)。在一個實施例中，在各種澄清步驟後，使用蛋白質A或G親和力層析、之後其他層析步驟(例如離子交換及/或HA捕獲、陰離子或陽離子交換、尺寸排除層析及硫酸銨沈澱)來捕獲抗體。亦可採用各種病毒去除步驟(例如，使用例如DV-20過濾器之奈米過濾)。在該等各種步驟後，提供包含至少10 mg/ml或更大(例如，100 mg/ml或更大)本發明抗體之經純化製劑且因此，形成本發明之另一實施例。可藉由超速離心產生至100 mg/ml或更大之濃度。此等製劑實質上不含本發明抗體之聚集形式。
細菌系統尤其適於表現抗體片段。此等片段係位於細胞內或周質內。可根據彼等熟習此項技術者已知之方法提取不溶性周質蛋白並使其再摺疊以形成活性蛋白，參見Sanchez等人(1999)J.Biotechnol.72：13-20；Cupit,P.M.等人(1999)Lett.Appl.Microbiol.29：273-277。
本發明亦係關於包含本發明核酸(例如，載體，例如，表現載體)之細胞。例如，可藉由適於所選宿主細胞之方 法(例如，轉化、轉染、電穿孔、感染)將編碼所述實施例之人類化免疫球蛋白之重鏈及輕鏈之核酸(即，一或多種核酸)或包含此(等)核酸之構築體(即，一或多種構築體，例如，一或多種載體)引入適宜宿主細胞中，其中核酸係或變得可操作地連接至一或多個表現控制元件(例如，在載體中、在藉由細胞中之過程產生之構築體中、整合至宿主細胞基因組中)。宿主細胞可維持在適於表現之條件(例如，在誘導子、補充有適當鹽、生長因子、抗生素、營養補充劑等之適宜培養基存在下)下，藉此產生經編碼多肽。若需要，則可自(例如)宿主細胞、培養基或乳分離經編碼人類化抗體。此方法涵蓋在轉基因動物或植物(例如，菸草)之宿主細胞(例如，乳腺細胞)中之表現(例如，參見WO 92/03918)。
3.治療性應用
在保證免疫抑制及/或發生自體免疫病況之諸多情形下，T細胞活性之抑制係合意的。因此，指示在涉及不適當或不期望免疫反應之疾病(例如發炎、自體免疫及涉及此等機制之其他病況)之治療中靶向αβTCR.CD3複合物。在一個實施例中，此疾病或病症係自體免疫及/或發炎疾病。此等自體免疫及/或發炎疾病之實例係全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎(RA)及發炎性腸病(IBD)(包括潰瘍性結腸炎(UC)及克隆氏(Crohn's disease)(CD))、多發性硬化(MS)、硬皮病及1型糖尿病(T1D)；及其他疾病及病症，例如PV(pemphigus vulgaris)、牛皮癬、特應性皮 炎、乳糜瀉、慢性阻塞性肺病、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、格雷夫斯氏病(Graves' disease)(甲狀腺)、薛格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、基蘭-巴瑞德症候群(Guillain-barré syndrome)、古德帕斯氏(Goodpasture's syndrome)、艾迪森氏病(Addison's disease)、韋格納肉芽腫(Wegener's granulomatosis)、原發性膽道硬化、硬化性膽管炎、自體免疫性肝炎、風濕性多肌痛、雷諾現象(Raynaud's phenomenon)、顳動脈炎、巨細胞動脈炎、自體免疫性溶血性貧血、惡性貧血、結節性多動脈炎、貝西氏病(behcet's disease)、原發性膽汁性肝硬化、葡萄膜炎、心肌炎、風濕熱、強直性脊柱炎、腎絲球腎炎、類肉瘤病、皮肌炎、重症肌無力、多肌炎、斑禿及白斑。
在一個實施例中，此疾病或病症係SLE、RA或IBD。在一個實施例中，此疾病或病症係MS。
在另一實施例中，使用所述實施例之抗體藉由對個體實施免疫抑制來輔助移植。此應用減輕移植物抗宿主疾病。關於對移植物抗宿主疾病之現有治療之說明，例如，參見Svennilson,Bone Marrow Transplantation(2005)35：S65-S67及其中所引用之參考文獻。有利地，本發明抗體可與其他可用療法組合使用。
就自體免疫疾病之治療而言，組合療法可包括投與本發明抗體以及藥劑，該藥劑連同抗體包含預防或治療此等自體免疫疾病之有效量。倘若該自體免疫疾病係1型糖尿 病，則組合療法可涵蓋一或多種促進胰腺β細胞生長或增強β細胞移植之藥劑，例如β細胞生長或存在因子或免疫調節抗體。倘若該自體免疫疾病係類風濕性關節炎，則該組合療法可涵蓋以下中之一或多者：甲胺蝶呤、抗TNF-β抗體、TNF-β受體-Ig融合蛋白、抗IL-15或抗IL-21抗體、非類固醇抗發炎藥物(NSAID)或疾病調節抗風濕藥物(DMARD)。例如，另一藥劑可為生物藥劑，例如抗TNF劑(例如，Enbrel®、英夫利昔單抗(infliximab)(Remicade®)及阿達木單抗(adalimumab)(Humira®)或利妥昔單抗(rituximab)(Rituxan®)。倘若該自體免疫疾病係造血移植排斥，則可投與造血生長因子(例如紅細胞生成素、G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-11、血小板生成素等)或抗微生物劑(例如抗生素、抗病毒劑、抗真菌藥物)。倘若該自體免疫疾病係牛皮癬，則另一藥劑可為以下中之一或多者：焦油及其衍生物、光療劑、皮質類固醇、環孢菌素A、維生素D類似物、甲胺蝶呤、p38促細胞分裂劑活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑以及生物藥劑(例如抗TNF劑及Rituxan®)。倘若該自體免疫疾病係發炎性腸病(IBD)(例如，克隆氏病或潰瘍性結腸炎)，則另一藥劑可為以下中之一或多者：胺基水楊酸鹽、皮質類固醇、免疫調節劑、抗生素或生物藥劑(例如Remicade®及Humira®)。
組合治療可以熟習此項技術者認為需要或便利之任何方式實施，且出於本說明書之目的，預計不限制所欲組合使用化合物之順序、量、重複性或相對量。因此，可將所述 實施例抗體調配成醫藥組合物用於療法中。
4.醫藥組合物
在較佳實施例中，提供包含本發明抗體或一或多種可藉由如本發明先前態樣中所界定之分析方法鑑別之配體的醫藥組合物。配體可為免疫球蛋白、肽、核酸或小分子，如本文所述。其在下文論述中稱作「化合物」。
本發明醫藥組合物係包含一或多種能作為活性成份調節T細胞活性之化合物的標的組合物。化合物係呈任何醫藥上可接受之鹽形式，或例如，若適當，則呈類似物形式、游離鹼形式、互變異構物形式、對映異構物形式、外消旋異構物形式或其組合形式。當以取決於特定情形之量投與時，預計包含本發明活性成份之醫藥組合物之活性成份展現(例如)治療移植物抗宿主疾病之治療活性。
在另一實施例中，本發明之一或多種化合物可與任一業內認可之已知適於治療特定適應症之化合物組合用於治療任一上述病況。因此，本發明之一或多種化合物可與一或多種業內認可之已知適於治療上述適應症之化合物組合，以使得可將單一便利組合物投與個體。可調整劑量方案以提供最佳治療反應。
例如，可每日投與若干分開劑量或者該劑量可依照治療情形之緊急程度所示按比例減少。
活性成份可以便利方式投與，例如藉由經口、靜脈內(若溶於水)、肌內、皮下、鼻內、皮內或栓劑途徑或植入(例如，使用緩釋分子)。
端視投與途徑而定，活性成份可能需要以材料塗佈以保護該等成份免受酶、酸及可使該成份不活化之其他天然條件之作用。
為藉由除非經腸投與以外之手段投與活性成份，其將藉由防止其不活化之材料塗佈或與該材料一起投與。例如，活性成份可在佐劑中投與，與酶抑制劑共投與或在脂質體中投與。佐劑係以其最寬泛含義使用且包括任何免疫刺激化合物，例如干擾素。本文所涵蓋佐劑包括間苯二酚；非離子型表面活性劑，例如聚氧乙烯油基醚及正十六基聚乙烯醚。酶抑制劑包括胰腺胰蛋白酶。
脂質體包括水包油包水型CGF乳液以及習用脂質體。
活性成份亦可經非經腸或腹膜內投與。
分散液亦可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中及在油中製備。在普通儲存及使用條件下，該等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。
適於注射使用之醫藥形式包括無菌水溶液(若溶於水)或分散液及用於即時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。在所有情況下，該形式必須無菌且其流動程度必須使其具有易注射性。其必須在製造及儲存條件下穩定且必須針對諸如細菌及真菌等微生物之污染作用進行防腐。載劑可為溶劑或分散液介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)、其適宜混合物及植物油。可藉由(例如)使用諸如卵磷脂等包衣、藉由維持所需粒徑(在分散液之情況下)以及藉由使用 表面活性劑維持適當的流動性。
可藉由各種抗細菌劑或抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞或諸如此類)來防止微生物之作用。在某些情形中，其較佳可包括等滲劑，例如，糖或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由使用延遲吸收之試劑組合物(例如，單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
藉由在適當溶劑中以所需量納入活性成份與(視需要)上文所列舉之若干其他成份、之後過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。一般來說，藉由將經滅菌活性成份納入無菌媒劑中來製備分散液，該媒劑含有基本分散介質及來自彼等上文所列舉成份之所需其它成份。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情況下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥技術，其可自預先經無菌過濾之溶液產生活性成份與任一額外期望成份之粉末。
各種其他材料可作為包衣存在或其存在可以其他方式改進劑量單元之物理形式。當然，在製備任何劑量單元形式中所用任一材料應具藥用純度且所採用之量應實質上無毒。另外，可將活性成份納入緩釋製劑及調配物中。
本文所用「醫藥上可接受之載劑及/或稀釋劑」包括任何及全部溶劑、分散介質、塗佈劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑、及諸如此類。此等醫藥活性物質之介質及試劑之使用為業內所熟知。除任何與活性成份不相容之習用介質或試劑之外，本發明涵蓋其於治療組合 物中之使用。亦可將補充性活性成份納入組合物中。
以劑量單元形式來調配非經腸組合物尤其有利於方便投與及達成劑量一致性。本文所用劑量單元形式係指適宜作為單位劑量供欲受治療哺乳動物個體使用之物理離散單元；各單元含有經計算可產生期望治療效果的預定量活性材料與所需醫藥載劑。本發明新穎劑量單位形式之規格取決於且直接依賴於以下因素：(a)活性材料之獨特特性及欲達成之特定治療效應，及(b)業內調配此活性材料以治療具有機體健康受損之患病狀態之活個體之疾病的固有限制條件。
將主要活性成份以有效量與醫藥上可接受之適宜載劑以劑量單元形式調配以供便利且有效地投與。在含有補充性活性成份之組合物之情況下，參照該等成份之慣用投與劑量及方式來確定給藥。
為有助於將肽化合物(包括抗體)遞送至細胞，肽可經修飾以改良其穿過細胞膜之能力。例如，US 5,149,782揭示使用融合肽、離子通道形成肽、膜肽、長鏈脂肪酸及其他膜摻合劑以增加跨細胞膜之蛋白質輸送。該等及其他方法亦闡述於WO 97/37016及US 5,108,921中，其以引用方式併入本文中。
在又一態樣中提供上文所定義之本發明活性成份，其單獨或與業內認可之已知適於治療特定適應症之化合物組合用於治療疾病。因此，提供本發明活性成份之用途，其用於製造用以治療與異常免疫反應相關之疾病之藥劑。
此外，提供治療與異常免疫反應相關之病況之方法，其包括向個體投與治療有效量之可使用如上文所述分析方法鑑別之配體。
僅出於闡釋目的，在以下實例中進一步闡述本發明。
比較實例1 EuCIV3之結合及生物學活性比BMA031降低
已使用流式細胞術顯示，EuCIV3在T細胞結合性方面低於BMA031(圖1)。在此競爭分析中，在固定濃度之直接經藻紅素標記之MoIgG2b-BMA031(鼠類競爭劑)及增加濃度之抗αβTCR抗體存在下，在冰上培育T細胞。在20分鐘培育後，洗滌細胞且藉由流式細胞術檢測結合表面之直接經藻紅素標記之MoIgG2b-BMA031。BMA031 HuIgG1嵌合抗體之競爭力遠比EuCIV3有效得多。
為評估其在活體內抑制T細胞活性之能力，在活體外馴化(IVE)分析中用不同濃度(參見圖2，x軸)之抗αβTCR抗體處理CD8+T細胞且將其與用CMV肽495-503(pp65)實施脈衝處理之自體樹突細胞(DC)共培養7天。
自HemaCare公司，Van Nuys,CA獲得HLA-A2+個體之正常供體之血液分離術(aphaeresis)產物。藉由於Ficoll(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上離心來分離PBMC。使用磁珠(Invitrogen,Carlsbad,California)根據製造商說明書分離CD8+T細胞。為產生自體未成熟樹突細胞，將PBMC再懸浮於RPMI 1640/5%人類AB血清(Sigma)中，平鋪於三頸燒瓶(triple flask)(Corning)中且在37℃/5% CO2下培育2小時 以上。然後用PBS沖洗貼壁單核球且在補充有GM-CSF(Immunex,Seattle,WA)及IL-4(PeproTech,Rocky Hill,NJ)之RPMI 1640/5%人類AB血清中培養6天。在建立T細胞/DC共培養物之前，用肽(10 μg/ml)對DC實施4小時脈衝處理且隨後使其成熟。藉由添加50 ng/ml TNF-α、25 ng/ml IL-1β、10 ng/ml IL-6、500 ng/ml PGE-2(PeproTech,Rocky Hill,NJ)產生成熟樹突細胞且將樹突細胞再培養24小時。然後以10：1之T：DC比率將經肽脈衝處理之DC添加至先前經分離之CD8+T細胞中。立即用添加至培養物中之IL-2(100 IU/ml)進給培養物。在第4天用IL-2(100 IU/ml)補充培養物。在第7天於鉻釋放分析中分析大量培養物之肽反應性。
圖2中之圖形顯示來自鉻釋放分析之溶解數據，其中未經處理之T細胞經pp65肽順利地馴化且能溶解>50%之特定靶標。BMA031抑制該等T細胞之馴化，此乃因其不能以劑量依賴性方式溶解特定靶標。人類化抗體EuCIV3之效能低於BMA031且僅能以最高劑量抑制馴化。
實例2 BMA031嵌合抗體之Fc改造 活體外特性
已在一組分析中評估BMA031之活體外特性。表1顯示BMA031之活體外特性。在該等分析中比較BMA031與OKT3。
在PBMC增殖分析中，將人類PBMC與增加濃度之治療 性抗體一起培養72小時，添加3H-胸苷並在18小時後收穫細胞。
對於T細胞空乏/細胞介素釋放分析而言，將人類PBMC與增加濃度之治療性抗體一起培養且每天分析細胞計數及活力(Vi-Cell,Beckman Coulter)直至第7天。亦收穫細胞上清液，在-20℃下儲存且在8重細胞介素組(Bio-Rad)上分析。
BMA031不誘導：(i)PBMC增殖；(ii)T細胞空乏；(iii)CD25表現；或(iv)細胞介素釋放。相比之下，OKT3會誘導全部上述效應。BMA031及OKT3能在活體外馴化(IVE)分析中阻斷針對肽之CD8+細胞馴化且亦能阻斷混合淋巴球反應(MLR)。BMA031亦誘導經活化T細胞之細胞凋亡(活化誘導性細胞死亡；AICD)。
與BMA031不同，BMA031之具有野生型人類IgG1恆定區之嵌合形式(HuIgG1)具有與OKT3相當之活體外特性(表1)。假定，FcγR之參與對於HuIgG1 BMA031與BMA031 MoIgG2b相比活體外特性之此變化至關重要。因此，製備BMA031 HuIgG1之F(ab')2片段且發現該等片段恢復BMA031 MoIgG2b之特性。藉由Fc改造來納入修飾，該等修飾在突變中去除FcγR結合(稱為「δab」)(Armour等人(1999)Eur.J.Immunol.,29：2613-2624)及產生HuIgG4之非糖基化形式(N297Q)。HuIgG1 δab及HuIgG4 agly抗αβTCR抗體具有與BMA031 MoIgG2b相同之活體外特性(表1)。
實例3 具有經改良結合之人類化抗體之構築
已產生BMA031之人類化形式之兩個系列，稱為HEBE1系列(IGH3-23)及GL1BM系列(IGHV1-3＊01 & IGKV3-11＊01；參見VBase,vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)。將BMA031重鏈CDR區初始移植至IGH3-23框架區(參見SEQ ID NO：5及6)上改良抗體與αβTCR之結合，如藉由競爭分析所顯示(圖3)；參見實例2。然而，此改良並不轉化為抗體之功能改良，如藉由IVE分析所顯示(圖4)。
實例4 人類化抗體之最佳化
人類化抗體之最佳化策略係基於誘變及功能篩選。以小鼠至人類之可變結構域之4個框架區中每一者中一者中之胺基酸殘基的塊變化(block change)開始最佳化。鑑別GL1BM HC、GL1BM LC及HEBE1 HC系列中每一者中之關鍵框架區。在此鑑別後，將彼等框架區內之個別殘基自原 有小鼠序列突變成人類種系殘基。發現與小鼠序列之一致性對保持抗體之結合性質至關重要之框架殘基保持作為小鼠殘基。否則，改變框架殘基以匹配人類種系胺基酸序列。此在序列內持續進行直至鑑別最低數目之保持抗體之原有結合性質之小鼠殘基。參見圖5。已顯示，來自該等系列之若干抗體與BMA031相比具有經改良之結合，如藉由T細胞之抗體解離速率所測定(圖6、7及8)。
對於解離速率分析而言，在室溫下將105個人類T細胞在含有2 μg/ml表示為HuIgG1-△ab之抗體之100 μL完全生長培養基中培育30分鐘至60分鐘。然後洗滌細胞，將其再懸浮於50 μL完全生長培養基中並添加20 μg/ml HEBE1 F(ab')2以防止所解離候選抗體之再結合。在此時程分析結束時，將細胞固定且藉由流式細胞術經由PE標記之山羊抗HuIgG二級抗體量測結合細胞表面之殘留HuIgG1-△ab抗體之量。
亦已顯示，在IVE(圖9、10及11)中及MLR分析中，抗體在防止免疫反應方面有活性。在IVE分析中，使用四聚物結合作為IVE之定量量度。藉由用對馴化肽具有特異性之直接標記之四聚物將T細胞染色來測定具有抗原特異性之細胞之百分比。簡言之，在第7天，用四聚物藉由標準流式細胞術染色方案對來自IVE之CD8+T細胞染色且在BD FACSCalibur上分析。另外，人類化抗體與BMA031相比顯示對PBMC及細胞介素釋放具有相當的增殖潛力程度(圖12及13)。
該等抗體亦在IVE分析中顯示抑制T細胞釋放IFNγ之能力(圖14)。另外，已顯示，諸多該等抗體與BMA031相比誘發經活化αβTCR-陽性T細胞之活化誘導性細胞死亡(AICD)之能力有所改良(圖15)。在AICD分析中，將抗原特異性CD8+T細胞與治療性抗體一起培養。在24小時、48小時及72小時時，對細胞實施細胞凋亡標記物膜聯蛋白V及7-AAD染色。亦用四聚物對細胞染色以追蹤對抗原特異性T細胞具有效應之細胞凋亡。
總之，已作出優於將BMA031人類化之先前嘗試之顯著改良。經由此方法發現解離速率與BMA031相比有所改良之抗體係意外發現。此對結合之改良與對抑制免疫反應之效能之改良相關，如在IVE分析中所顯示(圖10及11)。抗體對αβTCR之特異性、藉由人類化降低之免疫原性、經活化T細胞之特異性細胞凋亡及T細胞活化在抗體結合後之缺乏使該等抗體成為用於治療目的之極佳候選物。
實例5 效應子功能降低之Fc突變體之產生
設計並產生經改造Fc變體，其中緊靠天然Asn297位點於胺基酸Ser 298位置處引入糖基化位點。保持或藉由突變剔除Asn297處之糖基化。突變及糖基化結果闡述於表2中。
藉由Quikchange使用pENTR_LIC_IgG1模板對αβ T細胞受體抗體純系66號實施突變。利用LIC引子擴增HEBE1△ab IgG1 66號之VH結構域，且藉由LIC將其選殖至經突變或野生型pENTR_LIC_IgG1中以產生全長Ab突變體或野生型。利用DraIII/XhoI雙消化驗證亞選殖，從而在順利的純系中產生約1250 bp插入。然後經由Gateway選殖將彼等全長突變體選殖至表現載體pCEP4(-E+I)Dest中。然後藉由DNA定序確認突變。
使用兩種構築體，即存於pCEP4中之HEBE1 Agly IgG4及HEBE1△ab IgG1作為HEK293轉染中之對照。
在三頸燒瓶中將突變體、wt及對照(Agly及△ab)轉染至HEK293-EBNA細胞中以供表現。在多通道蠕動幫浦上利用1 ml HiTrap蛋白質A管柱(GE)自160 ml條件化培養基(CM)純化蛋白質。在4-20% Tris-甘胺酸還原性及非還原性 SDS-PAGE上分析5毫克各上清液(參見圖16)。非糖基化突變體(N297Q、T299A及Agly對照)之重鏈較低(黑色箭頭)，此與該等抗體中之聚糖損失一致。然而，經改造糖基化抗體(NSY、STY、SY、△ab及wt對照，紅色箭頭)之重鏈以與野生型對照相同之方式遷移。此結果與298位置處之經改造糖基化位點之預期結果一致。SEC-HPLC分析指示，全部突變體皆表現為單體。
藉由LC-MS分析糖基化
在37℃下使經改造H66 IgG1 Fc變體經20 mM DTT部分地還原30 min。藉由毛細管LC/MS在與QSTAR qq TOF混合系統(Applied Biosystem)耦合之Agilent 1100毛細管HPLC系統上分析試樣。使用在Analyst QS 1.1(Applied Bisoystem)中利用基線校正及電腦建模重構之Bayesian蛋白質進行數據分析。對於突變體S298N/T299A/Y300S H66抗體前導物(lead)而言，在胺基酸298處觀察到一個糖基化位點，其中檢測到雙觸角及三觸角複合型聚糖作為主要物質，以及G0F、G1F及G2F。
αβTCR抗體突變體與人類FcγRIIIa及FcγRI之結合，其中使用Biacore
使用Biacore來評估與重組人類FcγRIIIa(V158及F158)及FcγRI之結合。經由Biacore提供之標準胺偶合程序利用抗HPC4抗體固定CM5晶片之全部4個流動池(flowcell)。在10 mM乙酸鈉(pH 5.0)中將抗HPC4抗體稀釋至50 μg/mL以供偶合反應且以5 μL/min注射25 min。將約12,000 RU抗體固 定至晶片表面。在具有1 mM CaCl2之結合緩衝液HBS-P中將重組人類FcγRIIIa-V158及FcγRIIIa-F158稀釋至0.6 μg/mL，且以5 μL/min分別注射至流動池2及4中，並持續3 min，以將300-400 RU受體捕獲至抗HPC4晶片。為區別低結合劑，將為此分析中通常使用之rhFcγRIIIa三倍之rhFcγRIIIa捕獲至抗HPC4表面。使用流動池1及3作為參照對照。在結合緩衝液中將各抗體稀釋至200 nM且注射於全部4個流動池上並持續4 min，之後在緩衝液中解離5 min。利用存於HBS-EP緩衝液中之10 mM EDTA以20 μL/min使表面再生3 min。
結果顯示於圖17中。
亦使用Biacore來比較FcγRI結合。使用Zeba去鹽管柱將抗四His抗體緩衝交換為10 mM乙酸鈉(pH 4.0)且在乙酸鹽緩衝液中稀釋至25 μg/mL以供胺偶合。在以5 μL/min注射20 min後，用約9000 RU抗四His抗體固定CM5晶片之兩個流動池。與先前實驗相似，將10倍FcγRI捕獲至抗四His表面以比較弱結合劑。在HBS-EP結合緩衝液中將重組人類FcγRI稀釋10 μg/mL且以5 μL/min注射至流動池2並持續1 min以將約1000 RU受體捕獲至抗四His晶片。以30 μL/min將單濃度抗體(100 nM)注射於捕獲受體及對照表面上並持續3 min。將解離監測3 min。以20 μL/min經30 sec兩次注射10 mM甘胺酸(pH 2.5)使表面再生。
結果顯示於圖18中。
結果表明，糖改造突變體與FcγRIIIa或FcγRI之結合極 少。特定而言，H66 S298N/T299A/Y300S幾乎完全不與兩種受體結合。選擇此突變體作為前導物進行詳細表徵。
使用圓二色性(CD)表徵穩定性
藉由Far-UV CD熱熔化實驗監測S298N/T299A/Y300S抗體突變體之穩定性，其中監測隨溫度增加(其最終導致抗體解摺疊)216 nm及222 nm下之CD信號。在Jasco 815分光光度計上在路徑長度為10 mm之石英光析管(Hellma公司)中以約0.5 mg/mL之蛋白質濃度(於PBS緩衝液中)收集CD譜。藉由熱電帕耳帖(peltier)(Jasco model AWC100)控制溫度且使其以1℃/min之速率自25℃線性變化至89℃。收集CD信號及HT電壓二者。自210-260 nm獲得數據，其中數據間隔為0.5 nm且溫度間隔為1℃。掃描速度係50 nm/min且數據間距(data pitch)為0.5 nm。使用2.5 nm之帶寬與中等靈感度設定。針對各試樣實施4次重複掃描。結果表明，δAB H66與S298N/T299A/Y300S H66突變體二者皆顯示相似熱性質且具有63℃左右之相同降解起始溫度。換言之，突變體與δAB模式一樣穩定。
參見圖18。
實例6 Fc-改造突變體之功能分析
如實例2中所述實施PBMC增殖及細胞介素釋放分析。將正常供體PBMC解凍且在以下條件(皆在含有補體之培養基中)下處理：
˙未經處理
˙BMA031、moIgG2b 10 μg/ml
˙OKT3、moIgG2a 10 μg/ml
˙H66、huIgG1 δAB 10 μg/ml、1 μg/ml及0.1 μg/ml
˙H66、huIgG1 S298N/T299A/Y300 10 μg/ml、1 μg/ml及0.1 μg/ml
在第2天(D2)及第4天(D4)收穫細胞介素以供Bioplex分析(IL2、IL4、IL6、IL8、IL10、GM-CSF、IFNg、TNFa)。在D4對細胞染色以供CD4、CD8、CD25及abTCR表現。
顯示於圖19-22中之結果顯示，在全部基於細胞之分析中，H66 S298N/T299A/Y300S之性質與H66 δAB相似，從而顯示藉由CD25表現之T細胞活化最低；結合abTCR，但與δAB之動力學略有不同；在D2與D4時間點之細胞介素釋放最低；就若干細胞介素而言，在D4，突變體實際上優於δAB。
因此，S298N/T299A/Y300S突變體與δAB突變一樣有效地消除效應子功能。
實例7 雙特異性抗體
構築雙特異性分子，其係由兩個經由短胺基酸連接體連接在一起之單鏈抗體(scFv)構成，其中一個臂能結合腫瘤靶標且另一者能經由αβ TCR結合T細胞。雙特異性分子在本文中稱作TRACER(T細胞受體活化細胞毒性使能R)。
製備以下人類化抗αβTCR scFv構築體：GL1BM△SxVK1
GL1BM△SxVK27
GL1BM△SVH11xVK1
GL1BM△SVH15xVK1
GL1BM△SVH28xVK43
GL1BM△SVH31xVK43
重鏈及輕鏈之序列係如SEQ ID no 14-16及20-24中所述。
對該等分子之表徵包含對與腫瘤靶標及T細胞之結合之評估、活體外細胞毒性活性及在腫瘤靶細胞存在及不存在下之細胞介素釋放特性。
藉由流式細胞術評估之結合特性顯示，抗αβ TCR雙特異性抗體能結合腫瘤靶細胞系與T細胞二者。參見圖23。
藉由流式細胞術量測之活體外細胞毒性活性顯示，經由抗αβ TCR雙特異性抗體募集之T細胞能誘導T細胞介導之溶解。參見圖24。
細胞介素釋放特性分析已顯示，在結合雙特異性抗體之兩個臂後，T細胞釋放大量TH1/TH2細胞介素，此在靶細胞不存在下觀察不到。總之，此作用機制顯示與文獻中所述基於CD3之雙特異性相似之特性。
SEQ ID NO：1
BMA031重鏈可變結構域：EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVHYCARGSYYDYDGFVYWGQG
TLVTVSA
SEQ ID NO：2
BMA031輕鏈可變結構域：QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSATSSV.SYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：3
EuCIV3重鏈可變結構域：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYKFTSYVMHWVKQAPGQGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKATLTADESTNTAYMELSSLRSEDTAVHYCARGSYYDYDGFVYWGQ
GTLVTVSS
SEQ ID NO：4
EuCIV3輕鏈可變結構域：DIQMTQSPSTLSASVGDRVTMTCSATSSV.SYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPARFIGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK(h)
SEQ ID NO：5
HEBE1重鏈可變結構域：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYKFTSYVMHWVKQAPGKGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKATLSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVHYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：6
HEBE1輕鏈可變結構域：DIQMTQSPSTLSASVGDRVTMTCSATSSVSYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPARFIGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：7
HEBE1 H10重鏈可變結構域：EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTSYVMHWVKQAPGKGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKATLSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVHYCARGSYYDYDGFVYWGQ
GTLVTVSS
SEQ ID NO：8
GL1BM重鏈可變結構域：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVRQAPGQRLEWMGYINPYNDVTKYNEKFKGKATITRDTSANTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSYYDYDGFVYWG
QGTLVTVSS
SEQ ID NO：9
GL1BM輕鏈可變結構域： EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWYQQKPGQAPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：10
HuIgG1 Fc δab：ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：11
HuIgG4 agly Fc：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：12
HEBE1 H66重鏈可變結構域：EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGYKFTSYVMHWVRQAPGKGLEWVGYINPYNDVTKYNEKFKGRFTLSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：13
HEBE1 H71重鏈可變結構域：EVQLLESGGGLVQPGGSVRLSCAASGYKFTSYVMHWVRQAPGKGLEWVGYINPYNDVTKYNEKFKGRFTLSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：14
GL1BM VK43輕鏈可變結構域：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWYQQKPGQAPRRLIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：15
GL1BM VH28重鏈可變結構域：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVKQAPGQGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：16
GL1BM VH31重鏈可變結構域：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVRQAPGQGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：17
IGH3-23重鏈
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
SEQ ID NO：18
IGHV1-3 ＊ 01重鏈
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
SEQ ID NO：19
IGKV3-11 ＊ 01輕鏈
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP
SEQ ID No.20
GL1BM VH△S
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWV RQAPGQRLEWMGYINPYNDVTKYNEKFKGKATITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No 21
GL1BM VK1
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWYQQKPGQAPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID No 22
GL1BM VK27
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWYQQKPGQAPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSMEPEDFAVYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID No：23
GL1BM VH△S VH11
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKATITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No 24
GL1BM VH△S VH15
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVKQAPGQGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKATITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSYYDYDGFVYWGQ GTLVTVSS
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<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 1
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 2
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：EuCIV3重鏈可變結構域
<400> 3
<210> 4
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：EuCIV3輕鏈可變結構域
<400> 4
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：HEBE1重鏈可變結構域
<400> 5
<210> 6
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：HEBE1輕鏈可變結構域
<400> 6
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：HEBE1 H10重鏈可變結構域
<400> 7
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：GL1BM重鏈可變結構域
<400> 8
<210> 9
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：GL1BM輕鏈可變結構域
<400> 9
<210> 10
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
<210> 11
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：HuIgG4 agly Fc
<400> 11
<210> 12
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：HEBE1 H66重鏈可變結構域
<400> 12
<210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：HEBE1 H71重鏈可變結構域
<400> 13
<210> 14
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：GL1BM VK43輕鏈可變結構域
<400> 14
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：GL1BM VH28重鏈可變結構域
<400> 15
<210> 16
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：GL1BM VH31重鏈可變結構域
<400> 16
<210> 17
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
<210> 18
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
<210> 19
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：GL1BM VH△S
<400> 20
<210> 21
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：GL1BM VK1
<400> 21
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：GL1BM VK27
<400> 22
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：GL1BM VH△S VH11
<400> 23
<210> 24
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：GL1BM VH△S VH15
<400> 24
圖1. BMA031與EuCIV3相比更強地結合αβTCR。
BMA031 MoIgG2b、BMA031 HuIgG1及EuCIV3 HuIgG1抗體與經PE標記之BMA031抗體競爭結合。EuCIV3與BMA031相比效能有所降低。
圖2. 在活體外馴化(IVE)分析中，EuCIV3之效能低於BMA031。
該曲線顯示在生物學分析中當與親代BMA031抗體比較時EuCIV3人類化抗體之性能損失。用不同濃度(x軸)之抗αβTCR抗體處理CD8+T細胞且將其與用CMV肽495-503(pp65)脈衝處理之自體樹突細胞共培養7天。
圖3.在競爭分析中，HEBE1與BMA031相當地結合αβTCR。
BMA031 HuIgG1、HEBE1 HuIgG1及EuCIV3 HuIgG1抗體與經PE標記之BMA031抗體競爭結合。EuCIV3與BMA031及HEBE1相比效能有所降低。
圖4.在活體外馴化(IVE)分析中，HEBE1與EuCIV3之效能相似。
如圖2中所述實施IVE分析。
圖5.示意性顯示抗αβTCR可變結構域之多輪誘變。
陰影框中之框架繪示具有某些小鼠殘基之FR區。第一列突變中之陰影殘基係可用於維持解離速率之小鼠胺基酸。第二列突變中之陰影殘基係在CDR區周圍在最終種系形成 (germlining)過程期間保持之小鼠殘基。
圖6.最佳化人類化抗體之解離速率與BMA031相比有所改良。
藉由流式細胞術量測抗體自T細胞上之αβTCR解離之動力學。BMA031之解離速率優於EuCIV3及HEBE1。與BMA031相比，藉由最佳化HEBE1之結合結構域能改良HEBE1.H10之解離速率。
圖7.最佳化人類化抗體之解離速率與BMA031相比有所改良。
藉由流式細胞術量測抗體自T細胞上之αβTCR解離之動力學。與BMA031相比，藉由最佳化HEBE1之結合結構域能改良HEBE1.H66之解離速率。
圖8.在△ab及非糖基化模式二者方面，最佳化人類化抗體之解離速率與BMA031相比有所改良。
藉由流式細胞術量測抗體自T細胞上之αβTCR解離之動力學。
圖9. HEBE1之最佳化使得功能與BMA031等效。
IVE分析如圖4中所述。BMA031抑制CD8+T細胞之馴化，此乃因其不能以劑量依賴性方式溶解特定靶標。親代人類化抗體HEBE1之效能不如BMA031且僅能以最高劑量抑制馴化(對於第二未經改良人類化Ab HEBE1 H13而言，觀察到相似結果)。在此分析中，對人類化抗體HEBE1 H10作出其他改良，該抗體之效能與BMA031等效。
圖10.抗αβTCR抗體之IVE數據。
HEBE1及GL1 BM系列抗體二者與BMA031相比皆顯示IVE結果之改良。
圖11.來自IVE分析之抗原陽性細胞，如藉由抗原特異性四聚物結合所測定。
抗原陽性(即，已在IVE分析內馴化)細胞能結合MHC-四聚物分子。當在已能防止T細胞針對抗原進行馴化之抗體存在下實施IVE分析時，在分析結束時能結合MHC-四聚物之細胞較少。
圖12.在抗αβTCR抗體OKT3及刺激珠粒存在下PBMC之增殖。
在此比較中在抗αβTCR抗體中未觀察到OKT3之刺激活性。
圖13.在抗αβTCR抗體存在下自PBMC之細胞介素釋放。
抗αβTCR抗體之細胞介素釋放特性與藉由BMA031所示之特性相似。
圖14.在IVE分析中自T細胞之IFN-γ釋放。
在活體外馴化(IVE)分析中用不同濃度(參見圖2，x軸)之抗αβTCR抗體處理CD8+T細胞且將其與用CMV肽495-503(pp65)實施脈衝處理之自體樹突細胞共培養7天。在此分析中量測IFN-γ釋放。
圖15.藉由抗αβTCR抗體之活化誘導細胞凋亡。
藉由抗αβTCR抗體BMA031及HEBE1 H66之結合誘導抗原刺激之CD8+T細胞凋亡。HEBE1 H66誘導細胞凋亡之能 力與BMA031相比有所增加。
圖16.糖基化突變體及非糖基化抗體之分離
考馬斯藍(Coomassie-blue)染色凝膠顯示糖基化突變體之表現及純化
圖17. αβTCR抗體突變體與人類FcγRIIIa之結合，其中使用Biacore.
使用Biacore來評估與重組人類FcγRIIIa(V158及F158)之結合。
圖18. αβTCR抗體突變體與人類FcγRI之結合，其中使用Biacore。
使用Biacore來評估與重組人類及FcγRI之結合。
圖19.在糖基化突變體抗αβTCR抗體存在下自PBMC之細胞介素釋放(第2天)。
抗αβTCR抗體之TNFa、GM-CSF、IFNy及IL10之細胞介素釋放特性與藉由BMA031及H66 δAB所示之特性相似。
圖20.在糖基化突變體抗αβTCR抗體存在下自PBMC之細胞介素釋放(第2天)。
抗αβTCR抗體之IL6、IL4及IL2之細胞介素釋放特性與藉由BMA031及H66δAB所示之特性相似。
圖21.在糖基化突變體抗αβTCR抗體存在下自PBMC之細胞介素釋放(第4天)。
抗αβTCR抗體之TNFa、GM-CSF、IFNy及IL10之細胞介素釋放特性與藉由BMA031及H66 δAB所示之特性相似。
圖22.在糖基化突變體抗αβTCR抗體存在下自PBMC之 細胞介素釋放(第4天)。
抗αβTCR抗體之IL6、IL4及IL2之細胞介素釋放特性與藉由BMA031及H66 δAB所示之特性相似。
圖23：TRACER之結合特性。
雙特異性抗體與腫瘤靶細胞及人類T細胞二者之結合特性，如藉由流式細胞術所評估。
圖24：不同T細胞募集組別之細胞毒性活性。
已產生一組人類化BMA031抗體，且已自此組選擇諸多展示針對腫瘤抗原表現細胞系之細胞毒性活性之抗體。
圖25：不同T細胞募集組別之細胞介素釋放特性。
具有不同T細胞募集組別之一組TRACER顯示相似的細胞介素釋放特性。在靶細胞存在下在T細胞活化後檢測到大量細胞介素，而在僅未受刺激之人類PBMC存在下，所觀察到之細胞介素之含量顯著較低。

Claims (14)

  1. 一種對人類αβTCR/CD3複合物具有特異性之人類化單株抗體，其包含具有選自由SEQ ID NO：7、12、13、15及16所示之胺基酸序列所組成之群的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列的輕鏈可變區序列。
  2. 如請求項1之人類化單株抗體，其中該重鏈可變區係選自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列所組成之群。
  3. 如請求項1之人類化單株抗體，其中重鏈可變區係選自由SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列所組成之群。
  4. 如請求項1之人類化單株抗體，其中該重鏈可變區具有如SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列。
  5. 如請求項1之人類化單株抗體，其中該重鏈可變區具有如SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之人類化單株抗體，其進一步包含人類來源之恆定區。
  7. 如請求項6之人類化單株抗體，其進一步包含減少Fcγ受體結合之Fc修飾。
  8. 如請求項7之人類化單株抗體，其包含非糖基化Fc區或δab修飾。
  9. 如請求項7之人類化單株抗體，其包含經修飾之糖基化模式。
  10. 一種核酸，其至少編碼如請求項1至9中任一項之人類化 單株抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區。
  11. 一種細胞，其表現如請求項10之核酸。
  12. 一種如請求項1至9中任一項之人類化單株抗體的用途，其係用於製備抑制T細胞介導反應的藥物。
  13. 如請求項12之用途，其中該T細胞介導反應參與選自由組織移植(tissue transplantation)、多發性硬化及1型糖尿病所組成之群之病況。
  14. 如請求項13之用途，其中該組織移植(tissue transplantation)係選自由實體器官移植、複合性組織移植)及組織移植(tissue grafting)所組成之群。
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