BR122021001193B1

BR122021001193B1 - Anticorpo monoclonal humanizado específico para o complexo humano alfa beta tcr/cd3

Info

Publication number: BR122021001193B1
Application number: BR122021001193-1A
Authority: BR
Inventors: Daniel Snell; Andreas Menrad; Gina Lacorcia; Srinivas Shankara; Huawei Qiu; Clark Pan; Benjamin Kebble
Original assignee: Genzyme Corporation
Priority date: 2011-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2023-05-16
Also published as: AU2017261557B2; LT2755999T; MY173924A; US11186638B2; CL2014000574A1; PL2755999T3; CR20140127A; TWI593706B; EP2755999A2; ECSP14013307A; JP2014527802A; TW201313741A; RU2014114527A; SG11201400126PA; NI201400019A; US20220153841A1; JP2017108752A; JP6599911B2; AU2012307816B2; AU2017261557A1

Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais humanizados compreendendo as CDRs de anticorpo murino BMA031, que se ligam ao complexo aßTCR/CD3, e possuem propriedades biológicas aperfeiçoadas.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a um anticorpo específico para o alfa beta receptor de célula T (αβTCR). Em particular, a invenção refere-se a um anticorpo humanizado anti-αβTCR, que é derivado a partir do anticorpo monoclonal de murina BMA031, e ao uso de referido anticorpo humanizado em terapia imunossupressora.

Introdução

[0002] O uso de agentes imunossupressores em doenças autoimunes e terapia de transplante de órgão é bem documentado; contudo, o processo está longe de ser ideal. A toxicidade, infecções oportunísticas, excesso de citocina e risco aumentado de câncer são predominantes em pacientes tratados com estes agentes. O uso de biológicos nesta área tem aperfeiçoado o resultado do paciente a algum grau ainda que estes efeitos colaterais permaneçam evidentes.

[0003] O uso de anti-soros policlonais contra linfócitos é bem conhecido para a proposta de imunossupressão. Contudo, os anti-soros são de trabalho intensivo de produzir, mostram propriedades que variam entre bateladas, e a especificidade que pode ser obtida usando antisoros policlonais é limitada.

[0004] A produção de anticorpo monoclonal por tecnologia de hibridoma foi primeiro descrita por Kohler e Milstein (Nature 256:495497 (1975)). Conforme comparado a anti-soros policlonais, os anticorpos monoclonais (mAbs) são mais específicos, e têm propriedades mais consistentes. mAbs têm sido mais frequentemente e bem-sucedidamente usados para terapia imunossupressora em transplante de órgão clínico. Contudo, muitos mAbs usados como agentes imunossupressores para tratamento de doenças autoimunes e em pacientes de transplante, têm uma ampla capacidade imunossupressora, influenciando, desse modo, indesejavelmente, funções de um espectro amplo de células imunes, presumivelmente nem todas envolvidas em rejeição de enxerto.

[0005] Anticorpos monoclonais de camundongo contra antígenos de receptor de superfície de célula T foram, primeiro, produzidos em 1979 usando tecnologia de hibridoma (Kung et al. (1979) Science 206:347-349). Dos três anticorpos monoclonais descobertos por Kung et al., um anticorpo designado muromonab-CD3 (OKT3) tem definido especificidade a receptor CD3 da célula T, reagindo com mais do que 95% de células T maturas periféricas sem afetar os timócitos imaturos. A ligação de OKT3 do complexo de CD3 causa internalização do receptor CD3 e perda de células positivas de CD3 a partir da periferia. O tratamento bem-sucedido de OKT3 está associado com um pronto declínio em células T positivas de CD3 de aproximadamente 60% a menos do que 5%.

[0006] OKT3 tem sido extensivamente usado para o tratamento de pacientes suportando rejeição de aloenxerto agudo após transplante de rim (Russell, P.S., Colvin, R.B., Cosimi, A.B. (1984) Annu. Rev. Med. 35:63 and Cosimi, A.B., Burton, R.C., Colvin, R.B. et al. (1981) Transplantation 32:535). Além disso, OKT3 e complemento de coelho foram usados para purga de células T maturas de tutano doador para impedir enxerto agudo versus doença de hospedeiro (GVHD) em transplante de tutano de osso alogeneico (Prentice, H.G., Blacklock, H.A., Janossy, G. et al. (1982) Lancet 1:700 and Blacklock, H.A., Prentice, H.G., Gilmore, M.J. et al. (1983) Exp. Hematol. 11:37). Onde o tratamento de OKT3 parece ser efetivo na prevenção de GVHD em transplante de tutano de osso alogeneico para leucemia aguda, um tratamento combinado in vitro/in vivo com OKT3 falhou em impedir GVHD durante terapia para imunodeficiência severa combinada (Hayward, A.R. et al. (1982) Clin. Lab. Observ. 100:665). O tratamento de células T com OKT3 induz respostas severas inconsistentes com supressão imune, incluindo ativação de célula T, produção de mediadores imunes e modulação de T3. O complexo de antígeno de T3 reconhecido por CD3-mAbs (por exemplo, OKT3) é postulado para desempenhar um papel crucial durante ativação da célula T. Os linfócitos T alfa/beta reconhecem ligantes de peptídeo-MHC por meio de um conjunto de proteína multimérica denominado o complexo CD3 de receptor de antígeno de célula T (TCR) αβ. Esta estrutura é composta de um dímero variável αβ TCR que liga antígenos, e três dímeros invariantes (CD3Yε, δε e ZZ) que são envolvidos em transporte de superfície de TCR.CD3, estabilização e transdução de sinal. O receptor de célula T alfa beta (αβTCR) é expresso na maioria (aproximadamente 95%) de células T, e tem um papel crítico na ativação de célula T, via engajamento de antígeno exibido em MHC. Os 5% remanescentes de células são receptores de célula T gama delta (YδTCR) positivo. A população de célula positive YδTCR desempenha um papel importante na resposta imatura inata em defesa contra infecções oportunísticas de origem bacteriana, viral e fúngica. As células T gama delta não desempenham um papel na rejeição de enxerto no transplante. Portanto, o direcionamento da população de célula positiva YδTCR e oferecimento da população positiva de YδTCR devem permitir eficácia terapêutica significante, enquanto que mantendo uma proteção imune base contra infecções oportunísticas.

[0007] O anticorpo monoclonal IgG2b de camundongo BMA031 (Borst et al. (Nov. 1990) Hum. Immunol. 29(3):175-88; EP0403156) é específico para o determinante comum do complexo TCR alfa/beta/CD3, e não se liga ao gama-delta TCR. BMA031 é altamente imunossupressor, e é capaz de induzir apoptose de células T ativadas, via um mecanismo de morte de célula induzida por ativação (AICD) (Wesselborg et al. (May 1993) J. Immunol. 150(10): 4338-4345). In vitro ele inibe uma reação de linfócito misturada, e tem mostrado eficácia clínica preliminar na prevenção de rejeição de enxerto em um número de cenários de transplante de órgão sólido, bem como o tratamento de enxerto agudo versus doença de hospedeiro (aGVHD) (Kurrle et al. (Feb 1989) Transplant Proc. 21(1): 1017-1019). BMA031 não engaja receptores Fc gama humano (FCYR) na maioria da população humana (aproximadamente 10% do humano possui FCYRS que não se liga a isotipo de IgG2b de camundongo). Como tal, o anticorpo não causa ativação de célula T, através da ligação cruzada do receptor de célula T e, portanto, ele não induz ativação de célula T, ou a liberação de citocina associada. Neste particular, seu perfil é altamente preferível sobre aquele de OKT3. Contudo, BMA031 é um anticorpo de murina e, como tal, não é adequado para dosagem repetida em indivíduos humanos em vista da resposta de anticorpo anti-camundongo humano (HAMA) aqui induzida.

[0008] Várias versões humanizadas de BMA031 foram descritas (ver, EP 0403156; também, Shearman et al., (1991) J. Immunol. 147:4366-4373). Conforme notado em EP0403156, o mero enxerto de CDR não foi bem-sucedido na retenção de ligação de antígeno. Um clone com modificações de estrutura significante, EUCIV3, ligado de forma bem-sucedida a células T; contudo, conforme notado em EP0403156, a ligação ao αβCR não é tão efetiva quanto o anticorpo de origem BMA031, conforme determinado por ensaios de competição de citometria de fluxo. Também foi mostrado que a capacidade de EuCIV3 de inibir uma resposta imune in vitro é significantemente reduzida conforme comparado a BMA031 (ver, Fig. 2). Além disso, EuCIV3 foi originalmente gerado em um arcabouço de IgG1 ou IgG4 humano do tipo selvagem que ainda retém ligação de FCYR. Estes anticorpos humanizados, portanto, permitem ativação de célula T, proliferação, e a liberação concomitante de citocina e, como tal, foram significantemente diferentes das propriedades originais de BMA031.

[0009] A modificação de glicosilação de anticorpo é conhecida na técnica. Por exemplo, é conhecido que anticorpos aglicosilados podem ter funcionalidade extensivamente modificada; ver, Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318. Contudo, formas aglicosiladas de BMA031 humanizado, ou derivados com padrão de glicosilação modificado, não foram anteriormente descritas.

[0010] Existe uma necessidade na técnica, portanto, de um anticorpo humanizado anti-αβTCR que aperfeiçoa as propriedades de ligação de EUCIV3, e, vantajosamente, retém as propriedades imunossupressoras e ativadoras de célula não-T de BMA031.

Sumário da Invenção

[0011] Em um primeiro aspecto, é proporcionado um anticorpo monoclonal humanizado que compreende as CDRs de BMA031, e retém a afinidade de ligação de BMA031 para seu antígeno cognato. Em uma primeira concretização, referido anticorpo humanizado compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo as CDRs colocadas em SEQ ID NOs: 7, 12 ou 13, e a estrutura IGH3-23 humana colocada em SEQ ID NO: 17, no qual a posição de estrutura 6 é um resíduo doador; em uma concretização alternativa, a posição de estrutura 18 é um resíduo doador. Opcionalmente, posições de estrutura 49 e/ou 69 são resíduos doadores.

[0012] Em uma segunda concretização, o anticorpo monoclonal humanizado compreende a região variável de cadeia pesada compreendendo as CDRs colocadas em SEQ ID NOs: 15 ou 16 e a estrutura IGHV1-3*01 humana colocada em SEQ ID NO: 18, no qual uma ou mais das posições de estrutura 38, 44 e/ou 48 é um resíduo doador; em uma concretização alternativa, as posições de estrutura 44 e 48 são resíduos doadores.

[0013] Em uma terceira concretização, o anticorpo monoclonal humanizado compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo as CDRs colocadas em SEQ ID NO: 14, e a estrutura IGKV3-11*01 humana colocada em SEQ ID NO: 19, no qual as posições de estrutura 70 e/ou 71 são resíduos doadores. Opcionalmente, a posição 46 é um resíduo doador.

[0014] Exemplos de anticorpos, de acordo com a primeira concretização, incluem anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir das cadeias pesadas compreendendo as sequências colocadas em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, e SEQ ID NO: 13, e uma sequência de região variável de cadeia leve compreendendo a sequência conforme colocada em SEQ ID NO: 14.

[0015] Exemplos de anticorpos, de acordo com a segunda concretização, incluem anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir das cadeias pesadas compreendendo as sequências colocadas em SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência conforme colocada em SEQ ID NO: 14. Os anticorpos humanizados, de acordo com as concretizações descritas, são versões humanizadas do BMA031. Suas estruturas primárias diferem daquelas do anticorpo humanizado EuCIV3, que tem ligação aumentada ao αβTCR, conforme comparado a BMA031.

[0016] Na listagem de sequência, as CDRs são indicadas por meio de anotação ou sublinhadas. As estruturas são todas sequências externas como CDRs, que são definidas de acordo com o sistema de numeração de "Kabat" e estendidas, onde aplicável, pelo uso de definição de CDR "IMGT". Se um resíduo de estrutura não é indicado para ser mudado para se equiparar a uma sequência doadora, ele será ordinariamente compreendido para ser um resíduo aceitador.

[0017] Os anticorpos humanizados podem compreender uma região constante. Em uma concretização, a região constante é de origem humana.

[0018] Os anticorpos humanizados da invenção podem ser, adicionalmente, modificados por engenharia de Fc. As imunoglobulinas são responsáveis pela ligação cruzada dos receptores FCY, que podem conduzir a ativação de célula T constitutiva para anticorpos anti-célula T. De modo a evitar reticulação de FCY, os anticorpos podem ser modificados para remover a região Fc, tal como pela geração de fragmentos Fab ou Fv; contudo, as imunoglobulinas truncadas carecem de funções efetuadoras benéficas, e exibem uma meia-vida de soro mais baixa. Portanto, a região Fc do anticorpo humanizado pode ser modificada para impedir reticulação de Fcy. Técnicas exemplares incluem geração de imunoglobulinas aglicosiladas, por exemplo, por modificação da região Fc por uma mutação de N297Q. As imunoglobulinas que falham em ligar Fcy são também descritas por Armour et al., (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613-2624. A modificação efetuada para IgG1 é conhecida como a modificação Δab, e consiste em uma combinação da mutação Δa, em que resíduos de IgG são substituídos nas posições 327, 330 e 331, e os resíduos de IgG2 substituídos nas posições 233-236, e a mutação Δb, em que o resíduo 236 é anulado. Em outra concretização, o padrão de glicosilação de anticorpos, de acordo com a invenção, pode ser modificado.

[0019] Em uma concretização, o anticorpo compreende uma ou mais das mutações S298N, T299A e Y300S.

[0020] Nas concretizações, o anticorpo compreende duas ou mais das mutações N297Q, S298N, T299A e Y300S. Por exemplo, é proporcionado um anticorpo humanizado compreendendo as mutações múltiplas N297Q/S298N/Y300S, S298N/T299A/Y300S ou S298N/ Y300S.

[0021] Em um segundo aspecto, é proporcionado um anticorpo monoclonal humanizado que compreende as CDRs de BMA031, e retém as propriedades de supressão de célula T de BMA031. Referido anticorpo humanizado preferivelmente compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NOs: 12, 13, 15 ou 16, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NO: 14.

[0022] Em um terceiro aspecto, é proporcionado um ácido nucleico que codifica pelo menos uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo monoclonal humanizado, de acordo com os aspectos precedentes das concretizações descritas. O ácido nucleico pode codificar regiões variável e constante do anticorpo humanizado. Cadeias pesada e leve podem ser codificadas em ácidos nucleicos separados, ou na mesma molécula de ácido nucleico.

[0023] De acordo com um quarto aspecto, é proporcionada uma célula que expressa um ácido nucleico, de acordo com o aspecto precedente. A célula é, por exemplo, uma célula adaptada para expressar moléculas de anticorpo na cultura. O ácido nucleico pode incluir sequências de sinal e/ou outras sequências ou modificações que são requeridas para, ou que modulam, expressão da molécula de anticorpo na célula, e/ou secreção da molécula de anticorpo a partir da célula.

[0024] Em uma concretização adicional, um anticorpo humanizado é proporcionado, conforme descrito nos aspectos precedentes, para uso na supressão de uma resposta mediada por célula T em um indivíduo.

[0025] Por exemplo, uma resposta mediada por célula T pode ser envolvida em uma condição selecionada de transplante de tecido, incluindo transplante de órgão sólido e transplante de tecido composto, enxerto de tecido, esclerose múltipla, e diabetes tipo 1.

[0026] Além disso, outra concretização proporciona um método para tratamento de um indivíduo que sofre de uma condição envolvendo uma resposta mediada por célula T aberrante compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade deste, uma dose farmaceuticamente efetiva de um anticorpo, de acordo com as concretizações descritas.

[0027] Os anticorpos anti-αβTCR não-ativatórios humanizados que não induzem liberação de citocina foram, desse modo, gerados, que são capazes de modulação seletiva do αβTCR e de indução de apoptose de células T positivas de αβTCR ativado. Estes anticorpos foram gerados para uso como agentes imunossupressores em doenças mediadas por célula T. Estes anticorpos foram gerados através de humanização de um anticorpo anti-αβTCR de camundongo BMA031, e por engenharia de Fc dos anticorpos humanizados para impedir engajamento de receptores Fc gama. Os anticorpos, de acordo com as concretizações descritas, retêm a afinidade de ligação de BMA031, diferente das versões humanizadas de BMA031 disponíveis na técnica. Ainda, conforme mostrado em ensaios de educação in vitro, as propriedades imunossupressoras dos anticorpos, de acordo com as concretizações descritas, são superiores àquelas de BMA031. Além disso, diferente dos anticorpos humanizados BMA031 da técnica anterior, os anticorpos, de acordo com as concretizações descritas, não induzem liberação de citocina em PBMC normal.

[0028] De acordo com um quinto aspecto, é proporcionado um anticorpo compreendendo um Fc modificado, em que referido Fc modificado compreende um padrão de glicosilação modificado que reduz ligação de receptor de FCYR, compreendendo uma ou mais de mutações S298N, T299A e Y300S.

[0029] Em uma concretização, o anticorpo compreende duas ou mais das mutações N297Q, S298N, T299A e Y300S.

[0030] Nas concretizações, o anticorpo compreende as mutações múltiplas N297Q/S298N/Y300S, S298N/T299A/Y300S ou S298N/ Y300S.

[0031] Por exemplo, o anticorpo pode ser um anticorpo conforme descrito nos aspectos precedentes da invenção.

[0032] De acordo com um sexto aspecto, é proporcionado um anticorpo multiespecífico compreendendo pelo menos uma cadeia pesada de um primeiro domínio de ligação, conforme descrito nos aspectos precedentes da invenção, e um segundo domínio de ligação específico para um antígeno específico de tumor.

[0033] Em uma concretização, o primeiro domínio de ligação compreende uma cadeia pesada, de acordo com o segundo aspecto da invenção.

[0034] O anticorpo multiespecífico pode compreender muitas conformações diferentes; em uma concretização, ele compreende um anti-TCR/CD3 scFv e um anti-tumor scFv.

[0035] Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico é biespecífico. Breve Descrição das Figuras Fig. 1. Ligações de BMA031 mais fortemente a αβTCR comparadas a EuCIV3.

[0036] Competição de ligação de anticorpo BMA031 etiquetado com PE por anticorpos BMA031 MoIgG2b, BMA031 HuIgG1 e EuCIV3 HuIgG1. EuCIV3 tem uma potência diminuída comparada a BMA031. Fig. 2. EuCIV3 é menos potente do que BMA031 em um ensaio de educação in vitro (IVE).

[0037] Gráficos mostrando perda de desempenho de anticorpo humanizado EuCIV3 em ensaio biológico quando comparado a anticorpo de origem BMA031. Células T CD8+ foram tratadas com anticorpos anti-αβTCR em várias concentrações (eixo-x), e co-cultura com células dendríticas autólogas pulsadas com o peptídeo de CMV 495-503 (pp65) por sete dias. Fig. 3. HEBE1 se liga a αβTCR comparavelmente a BMA031 em um ensaio de competição.

[0038] Competição de ligação de anticorpo BMA031 etiquetado com PE por anticorpos BMA031 HuIgG1, HEBE1 HuIgG1 e EuCIV3 HuIgG1. EuCIV3 tem uma potência diminuída comparada a BMA031 e HEBE1. Fig. 4. HEBE1 tem potência similar a EuCIV3 em um ensaio de educação in vitro (IVE).

[0039] O ensaio IVE foi realizado conforme descrito em relação à Fig. 2. Fig. 5. Esquema mostrando etapas iterativas de mutagênese de domínios variáveis de anti-αβTCR.

[0040] A estrutura em caixa sombreada representa a região FR onde certos resíduos de camundongo assentam. Os resíduos sombreados na primeira fileira de mutações são os aminoácidos de camundongo que são úteis para manter taxa pontual. Os resíduos sombreados na segunda fileira de mutações são os resíduos de camundongo que circundam as regiões CDR que foram retidas durante o processo de linha germinativa final. Fig. 6. Anticorpo humanizado otimizado tem taxa pontual aperfeiçoada comparada a BMA031.

[0041] As cinéticas de dissociação de anticorpo de αβTCR em células T foram medidas por citometria de fluxo. BMA031 tem uma melhor taxa pontual comparada a EuCIV3 e HEBE1. Por otimização do domínio de ligação de HEBE1, foram capazes de aperfeiçoar a taxa pontual de HEBE1.H10 comparada a BMA031. Fig. 7. Anticorpo humanizado otimizado tem taxa pontual aperfeiçoada comparada a BMA031.

[0042] As cinéticas de dissociação de anticorpo de αβTCR em células foram medidas por citometria de fluxo. Por otimização do domínio de ligação de HEBE1, foram capazes de aperfeiçoar a taxa pontual de HEBE1.H66 comparada a BMA031. Fig. 8. Anticorpo humanizado otimizado tem taxa pontual aperfeiçoada comparada a BMA031 em ambos formatos Δab e aglicosilados.

[0043] As cinéticas de dissociação de anticorpo de αβTCR em células T foram medidas por citometria de fluxo. Fig. 9. Optimização de HEBE1 conduz a funcionalidade equivalente como BMA031.

[0044] O ensaio IVE, conforme descrito na Fig. 4. BMA031 inibe a educação de células T CD8+, a medida que elas foram incapazes de lisarem alvos específicos em uma maneira dependente da dose. O anticorpo humanizado de origem, HEBE1, não foi tão potente quanto BMA031, e foi capaz de somente inibir educação na dose mais alta (resultados similares observados com um segundo Ab humanizado não- aperfeiçoado, HEBE1 H13). Aperfeiçoamentos adicionais foram feitos ao anticorpo humanizado, HEBE1 H10, que tem potência equivalente a BMA031 neste ensaio. Fig. 10. Dados data com anticorpos anti-αβTCR.

[0045] Ambos anticorpos de série HEBE1 e GL1 BM mostraram aperfeiçoamentos nos resultados de IVE em comparação com BMA031. Fig. 11. Células positivas de antígeno de ensaio de IVE conforme determinado por ligação de tetrâmero específico de antígeno.

[0046] As células que são positivas de antígeno (isto é, foram educadas dentro do ensaio de IVE) são capazes de se ligarem a um MHC-molécula de tetrâmero. Quando o ensaio de IVE foi conduzido na presença de anticorpo que foi capaz de impedir a educação de células T a antígeno, existiram poucas células capazes de se ligarem ao MHC- tetrâmero no final do ensaio. Fig. 12. Proliferação de PBMCs na presença de anticorpos anti-αβTCR, OKT3 e esferas estimulatórias.

[0047] A atividade estimulatória de OKT3 não foi vista em anticorpos anti-αβTCR nesta comparação. Fig. 13. Liberação de citocina de PBMCs na presença de anticorpos anti-αβTCR.

[0048] O perfil de liberação de citocina de anticorpos anti-αβTCR foi similar ao perfil demonstrado por BMA031. Fig. 14. Liberação de IFN-gama de células T em ensaio de IVE.

[0049] Células T CD8+ foram tratadas com anticorpos anti-αβTCR em várias concentrações (ver Fig. 2, eixo-x) e co-cultivadas com células dendríticas autólogas pulsadas com o CMV peptídeo 495-503 (pp65) por sete dias em um ensaio de educação in vitro (IVE). A liberação de IFN-gama foi medida neste ensaio. Fig. 15. Apoptose induzida por ativação por anticorpos anti-αβTCR.

[0050] Células T CD8+ estimuladas por antígeno foram induzidas para apoptose por ligação de anticorpos anti-αβTCR BMA031 e HEBE1 H66. A capacidade de HEBE1 H66 para induzir apoptose foi aumentada comparada a BMA031. Fig. 16. Isolamento de mutantes de glicosilação e anticorpos aglicosilados

[0051] Gel corado com Coomassie-blue mostrando expressão e purificação de mutantes de glicosilação. Fig. 17. Ligação de mutantes de anticorpo αβTCR a FcYRIIIa humano usando Biacore.

[0052] Biacore foi usado para avaliar ligação a FcYRIIIa humano recombinante (V158 & F158). Fig 18. Ligação de mutantes de anticorpo αβTCR a FCYRI humano usando Biacore.

[0053] Biacore foi usado para avaliar ligação a humano recombinante e FcYRI. Fig. 19. Liberação de citocina de PBMCs na presença de anticorpos anti-αβTCR mutantes de glicosilação (dia 2).

[0054] O perfil de liberação de citocina para TNFa, GM-CSF, IFNy e IL10 de anticorpos anti-αβTCR foi similar ao perfil demonstrado por BMA031 e H66 delta AB. Fig. 20. Perfil de liberação de PBMCs na presença de anticorpos anti- αβTCR mutantes de glicosilação (dia 2).

[0055] O perfil de liberação de citocina para IL6, IL4 e IL2 de anticorpos anti-αβTCR foi similar ao perfil demonstrado por BMA031 e H66 delta AB. Fig. 21. Perfil de liberação de PBMCs na presença de anticorpos anti- αβTCR mutantes de glicosilação (dia 4).

[0056] O perfil de liberação de citocina para TNFa, GM-CSF, IFNy e IL10 de anticorpos anti-αβTCR foi similar ao perfil demonstrado por BMA031 e H66 delta AB. Fig. 22. Perfil de liberação de PBMCs na presença de anticorpos anti- αβTCR mutantes de glicosilação (dia 4).

[0057] O perfil de liberação de citocina para IL6, IL4 e IL2 de anticorpos anti-αβTCR foi similar ao perfil demonstrado por BMA031 e H66 delta AB. Fig. 23. Perfis de ligação de TRAÇADORES.

[0058] Os perfis de ligação de anticorpos biespecíficos para ambas células alvos de tumor e células T humanas avaliados por citometria de fluxo. Fig. 24. Atividade citotóxica de braços de recrutamento de célula T diferente.

[0059] Um painel de anticorpos humanizados BMA031 foi criado, e a partir deste painel, um número de anticorpos foi selecionado que exibe atividade citotóxica contra linhas de célula que expressam antígeno de tumor. Fig. 25. Perfil de liberação de citocina de braços de recrutamento de célula T diferente.

[0060] Um painel de TRAÇADORES com braços de recrutamento de célula T diferente mostra perfis de liberação de citocina similares. Grandes quantidades de citocinas são detectadas em seguida á ativação de células T na presença de células alvos, pelo que na presença de PBMC humano somente não-estimulado, os níveis de citocina observados são significantemente inferiores. Fig. 26. Ligação de mutantes de anticorpo CD52 a FcYRIIIa humano usando Biacore.

[0061] Biacore foi usado para avaliar ligação de anti-CD52 modificado a FcYRIIIa humano recombinante (V158). Anti-CD52 compreendendo mutações S298N/Y300S no domínio Fc foram usados para avaliar a função efetuadora da molécula modificada. A: ligação a CD52 peptídeo. B: ligação a FcYRIIIa (V158). C: ligação de controle a FcRn de camundongo.

Descrição Detalhada da Invenção

[0062] A menos que de outro modo citado, todos os termos técnicos e científicos aqui usados, têm o mesmo significado, conforme comumente compreendido por um técnico no assunto ao qual essa invenção pertence. Quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos, podem ser usados nos métodos ou técnicas da presente invenção. Todas as publicações aqui citadas são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para a proposta de descrição e revelação das metodologias, reagentes, e ferramentas reportados nas publicações que podem ser usadas em conjunto com a invenção.

[0063] Os métodos e técnicas do presente pedido são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica, e conforme descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas através de todo o presente relatório descritivo, a menos que, de outro modo, indicado. Ver, por exemplo, Gennaro, A.R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.; Hardman, J.G., Limbird, L.E., e Gilman, A.G., eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D.M. and Blackwell, C.C., eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C.R. and Graham, A., eds. (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed., Springer-Verlag.

[0064] Um anticorpo monoclonal humanizado, conforme aqui referido, é um anticorpo que é composto de uma estrutura de anticorpo humano, em que foram enxertadas regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de um anticorpo não-humano. Mudanças na estrutura aceitadora humana podem também serem feitas. Os procedimentos para o desenho e produção de anticorpos humanizados são bem conhecidos na técnica, e foram descritos, por exemplo, em Cabilly et al., Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567; Cabilly et al., Pedido de Patente Europeu 0 125 023; Boss et al., Patente dos Estados Unidos No. 4.816.397; Boss et al., Pedido de Patente Europeu 0 120 694; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., Pedido de Patente Europeu 0 194 276 B1; Winter, Patente dos Estados Unidos No. 5.225.539; Winter, Pedido de Patente Europeu 0 239 400; Padlan, E.A. et al., Pedido de Patente Europeu 0 519 596. Detalhes adicionais nos anticorpos, anticorpos humanizados, anticorpos projetados humanos, e métodos para sua preparação, pode ser encontrados em Kontermann, R. e Dübel, S. eds. (2001, 2010) Antibodies Engineering, 2nd ed., Springer-Verlag, New York, NY.

[0065] O termo "anticorpo", a menos que de outro modo indicado, é usado para se referir a anticorpos completos, bem como fragmentos de ligação de antígeno de tais anticorpos. Por exemplo, o termo envolve moléculas de IgG de quatro cadeias, bem como fragmentos de anticorpo.

[0066] Conforme aqui usado, o termo "fragmentos de anticorpo" se refere a porções de um anticorpo de comprimento total intacto, por exemplo, conforme adicionalmente descrito abaixo.

[0067] Os anticorpos podem ser de qualquer classe, tais como IgG, IgA ou IgM; e de qualquer subclasse, tais como IgG1 ou IgG4. Classes e subclasses diferentes de imunoglobulina têm propriedades diferentes, que podem ser vantajosas em aplicações diferentes. Por exemplo, os anticorpos de IgG4 têm ligação reduzida a receptores de Fc.

[0068] Especificidade, no contexto dos anticorpos aqui descritos, significa que o anticorpo reivindicado seja capaz de ligar seletivamente seu antígeno cognato definido, que é o complexo de αβTCR.CD3. Os anticorpos da invenção ligam o complexo de αβTCR.CD3 expresso nas células.

[0069] O complexo humano αβTCR/CD3 é o complexo de receptor de célula T apresentado na superfície de células T. Ver, Kuhns et al., (2006) Immunity 24:133-139. Este complexo é direcionado pelo anticorpo monoclonal de murina BMA031 (ver, Pedido de Patente Europeu EP 0 403 156; SEQ ID NOs: 1 e 2).

[0070] As imunoglobulinas que ocorrem naturalmente têm uma estrutura de núcleo comum em que duas cadeias leves idênticas (cerca de 24 kD) e duas cadeias pesadas idênticas (cerca de 55 ou 70 kD), formam um tetrâmero. A porção amino-terminal de cada cadeia é conhecida como a região variável (V), e pode ser distinguida a partir das regiões constantes (C) mais conservadas do restante de cada cadeia. Dentro da região variável da cadeia leve (também denominado domínio VL) está uma porção C-terminal conhecida como a região J. Dentro da região variável da cadeia pesada (também denominada o domínio VH), existe uma região D em adição à região J. Muita da variação da sequência de aminoácido em imunoglobulinas é confinada a três localizações separadas nas regiões V como regiões hipervariáveis ou regiões de determinação de complementaridade (CDRs), que são diretamente envolvidas na ligação de antígeno. Procedendo do aminoterminal, estas regiões são designadas CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente. As CDRs são mantidas no local por regiões de estrutura mais conservadas (FRs). Procedendo do amino-terminal, estas regiões são designadas FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente. As localizações das regiões CDR e FR e um sistema de numeração foram definidos por Kabat et al. (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health e Human Services, U.S. Government Printing Office (1991), e atualizações destes, que podem ser encontradas online). Em adição, os limites de região de CDR foram adicionalmente definidos por nomenclatura de IMGT.

[0071] As regiões variáveis de anticorpos, de acordo com as concretizações descritas, podem ser encontradas em SEQ ID NOs: 5-7 e 12-16, e podem ser obtidas por humanização de BMA031, isto é, por transferência como CDRs de BMA031 a uma estrutura humana. As séries de anticorpos humanizados são descritas; a série de HEBE1, compreendendo SEQ ID NOs: 5-7, 12 e 13, e a série de GL1BM, compreendendo região variável de cadeia pesadas conforme mostrada em SEQ ID NOs: 8, 15 e 16. Em ambos os casos, a região variável de cadeia leve usada é conforme mostrado em SEQ ID NO: 14 (GL1BM VK43).

[0072] As estruturas humanas usadas são IGH3-23 no caso de HEBE1, e IGHV1-3*01 e IGKV3-11*01 no caso de GL1BM.

[0073] As regiões constantes podem ser derivadas de quaisquer regiões constantes do anticorpo humano. Os genes de região variável podem ser clonados em vetores de expressão na estrutura com genes de região constante para expressar cadeias de imunoglobulina pesada e leve. Tais vetores de expressão podem ser transfectados no anticorpo que produz células hospedeiras para síntese de anticorpo.

[0074] As regiões variáveis e constantes de anticorpo humano podem ser derivadas de bases de dados de sequência. Por exemplo, sequências de imunoglobulina são disponíveis na base de dados IMGT/LIGM (Giudicelli et al., (2006) Nucleic Acids Res. 34 :(suppl. 1): D781-D784) ou VBase (vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk).

[0075] Os anticorpos aglicosilados podem ter funcionalidade extensivamente modificada; ver, Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318. Uma modificação "delta ab" ou Δab, referida aqui, é uma modificação de Fc, conforme descrito em Armour et al., (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613-2624. Técnicas para modificação de glicosilação de regiões Fc de anticorpo são conhecidas na técnica, e incluem meios químicos, enzimáticos e mutacionais, por exemplo, mutação da porção N297 no domínio de CH2. Técnicas para mutação de genes de anticorpo para produção de moléculas de IgG aglicosiladas são descritas em Tao e Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595-2601.

[0076] "Ácidos nucleicos", conforme aqui referidos, incluem moléculas de DNA que codificam os anticorpos da invenção. Preferidos são vetores de expressão, que são adequados para expressão dos genes de anticorpo em uma célula hospedeira. Os vetores de expressão e células hospedeiras para expressão de gene de anticorpo são conhecidos na técnica; ver, por exemplo, Morrow, K.J. Genetic Engineering & Biotechnology News (June 15, 2008) 28(12), and Backliwal, G. et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36(15): e96-e96.

1. Anticorpos

[0077] A invenção envolve fragmentos de ligação de antígeno do anticorpos anti-αβTCR humanizados. Os fragmentos dos anticorpos são capazes de ligação do complexo de αβTCR.CD3. Eles envolvem fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, e F(v), ou regiões variáveis de cadeia pesada ou leve individuais, ou porção destas. Os fragmentos incluem, por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv e scFv. Estes fragmentos carecem da porção de Fc de um anticorpo de impacto, mais rapidamente a partir da circulação, e podem ter menos ligação de tecido não-específica do que um anticorpo intacto. Estes fragmentos podem ser produzidos de anticorpos intactos usando métodos conhecidos, por exemplo, por clivagem proteolítica com enzimas, tais como papaína (para produzir fragmentos Fab), ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2).

[0078] Os anticorpos e fragmentos também envolvem fragmentos de anticorpo de cadeia simples (scFv) que se ligam ao complexo de αβTCR.CD3. Um scFv compreende uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) ligada de forma operacional a uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL), no qual a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve, juntas ou individualmente, formam um local de ligação que liga αβTCR. Um scFv pode compreender uma região VH na extremidade amino-terminal, e uma região VL na extremidade carbóxi-terminal. Alternativamente, scFv pode compreender uma região VL na extremidade amino-terminal e uma região VH na extremidade carbóxi-terminal. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que os capacitam a serem produzidos como uma cadeia de proteína simples em que o par de regiões VL e VH para forma moléculas monovalentes (conhecidas como Fv (scFv) de cadeia simples). Um scFv pode, opcionalmente, compreender adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve.

[0079] Os anticorpos e fragmentos também envolvem fragmentos de anticorpo de domínio (dAb), conforme descritos em Ward, E.S. et al. (1989) Nature 341:544-546, que consiste de um domínio VH.

[0080] Os anticorpos e fragmentos também envolvem anticorpos de cadeia pesada (HCAb). Estes anticorpos são reportados para formarem regiões de ligação de antígeno usando somente região variável de cadeia pesada, em que estes anticorpos funcionais são dímeros de cadeias pesadas somente (referidos como "anticorpos de cadeia pesada" ou "HCAbs"). Consequentemente, os anticorpos e fragmentos podem ser anticorpos de cadeia pesada (HCAb) que especificamente se ligam ao complexo de αβTCR.CD3.

[0081] Os anticorpos e fragmentos também envolvem anticorpos que são SMIPs ou proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação específicas para complexo de ααTCR.CD3. Estes construtos são polipeptídeos de ligação simples compreendendo domínios de ligação de antígeno fundidos a domínios de imunoglobulina necessários para efetuar funções efetuadoras de anticorpo (ver, WO 2005/017148).

[0082] Os anticorpos e fragmentos também envolvem diacorpos. Estes são anticorpos bivalentes em que domínios de VH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptídeo simples, mas usando um ligante que é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Isto força os domínios a emparelharem com domínios complementares de outra cadeia e, desse modo, criam dois locais de ligação de antígeno (ver, por exemplo, WO 93/11161). Diacorpos podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

[0083] O anticorpo, ou fragmento de anticorpo deste, não reagem por cruzamento com qualquer alvo outro do que o complexo de αβTCR.CD3.

[0084] O anticorpo, ou fragmento deste, pode ser modificado de modo a aumentar sua meia-vida do soro, por exemplo, por adição de moléculas - tais como PEG ou outros polímeros solúveis em água, incluindo polímeros de polissacarídeo para aumentar a meia-vida.

[0085] Os anticorpos e fragmentos destes podem ser biespecíficos. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos podem se assemelharem a anticorpos simples (ou fragmentos de anticorpo), mas têm dois locais de ligação de antígeno diferentes (regiões variáveis). Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por vários métodos - tais como técnicas químicas, técnicas de "polidoma", ou técnicas de DNA recombinante. Os anticorpos biespecíficos podem ter especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes, pelo menos um do qual é o complexo de αβTCR.CD3. A outra especificidade pode ser selecionada de quaisquer especificidades úteis ou desejadas, incluindo, por exemplo, especificidade a albumina de soro humano para a extensão de meia-vida in vivo.

[0086] O uso de anticorpos biespecíficos na clínica para aplicações de oncologia está agora se tornando realidade com o Catumaxomab trifuncional (Removmab®) aprovado para uso em casos de ascite maligna, e o anticorpo biespecífico Blinatumomab agora em ensaios de fase II em malignidades hematológicas. Estas moléculas têm em comum um braço de ligação que se liga a células T, e um segundo braço que se liga à célula alvo de tumor que resulta em lises mediada por célula T do tumor alvo. Também em comum, estas células T recrutam moléculas, via a proteína CD3 localizada na superfície da célula. Uma alternativa ao recrutamento, via CD3, é para fazer uso do receptor de célula T αβ (αβ TCR) que é também expresso na superfície da célula. Consequentemente, os anticorpos, de acordo com a presente invenção, podem ser usados para desenvolver anticorpos de anti-tumor por combinação de uma especificidade para um antígeno associado a tumor com uma especificidade para o receptor de célula T αβ (αβ TCR). 2. Produção de anticorpo

[0087] As sequências de aminoácido dos domínios variáveis dos anticorpos aqui descritas são colocadas em SEQ ID NOs: 5-7 e 12-16. A produção de anticorpo pode ser realizada por qualquer técnica conhecida na técnica, incluindo em organismos transgênicos, tais como cabras (ver, Pollock et al. (1999) J. lmmunol. Methods 231:147-157), galinhas (ver, Morrow, K.J.J. (2000) Genet. Eng. News 20:1-55), camundongos (ver Pollock et al., supra), ou plantas (ver, Doran, P.M. (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11:199-204, Ma. J.K-C. (1998) Nat. Med. 4:601-606, Baez, J. et al. (2000) BioPharm. 13:50-54, Stoger, E. et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590). Os anticorpos podem também serem produzidos por síntese química, ou por expressão de genes que codificam os anticorpos em células hospedeiras.

[0088] Um polinucleotídeo que codifica o anticorpo é isolado e inserido em um construto replicável, ou vetor, tal como um plasmídeo para propagação ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Os construtos ou vetores (por exemplo, vetores de expressão) adequados para a expressão de uma imunoglobulina humanizada, de acordo com as concretizações descritas, são disponíveis na técnica. Uma variedade de vetores é disponível, incluindo vetores que são mantidos em cópia simples ou cópias múltiplas em uma célula hospedeira, ou que se tornam integrados no(s) cromossomo(s) de célula hospedeira. Os construtos ou vetores podem ser introduzidos em uma célula hospedeira adequada, e células que expressam uma imunoglobulina humanizada podem ser produzidas e mantidas na cultura. Um vetor simples ou vetores múltiplos podem ser usados para a expressão de uma imunoglobulina humanizada.

[0089] Os polinucleotídeos que codificam o anticorpo são prontamente isolados e sequenciados usando procedimentos convencionais (por exemplo, sondas de oligonucleotídeo). Os vetores que podem ser usados incluem plasmídeo, vírus, fago, transposons, minicromossomos de cujos plasmídeos são uma concretização típica. Geralmente tais vetores adicionalmente incluem uma sequência de sinal, origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor, e sequências de terminação de transcrição ligada de forma operacional ao polinucleotídeo de cadeia pesada e/ou cadeia leve de modo a facilitar expressão. Os polinucleotídeos que codificam as cadeias leves e pesadas podem ser inseridos em vetores separados e introduzidos (por exemplo, por transformação, transfecção, eletroporação ou transdução) na mesma célula hospedeira concorrentemente ou sequencialmente ou, se desejado, ambas da cadeia pesada e cadeia leve podem ser inseridas no mesmo vetor antes de tal introdução.

[0090] Um promotor pode ser provido para expressão em uma célula hospedeira adequada. Os promotores podem ser constitutivos ou induzíveis. Por exemplo, um promotor pode ser ligado de forma operacional a um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina humanizada ou cadeia de imunoglobulina, tal que ele direciona expressão do polipeptídeo codificado. Uma variedade de promotores adequados para hospedeiros procarióticos e eucarióticos é disponível. Os promotores procarióticos incluem promotores lac, tac, T3, T7 para E. coli; 3-fosfoglicerato quinase, ou outras enzimas glicolíticas, por exemplo, enolase, gliceraldeído 3-fosfato dehidrogenase, hexoquinase, piruvato decarbóxilase, fosfofructoquinase, glicose 6 fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase e glucoquinase. Os promotores eucarióticos incluem promotores de levedura induzíveis, tais como álcool dehidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, metalotionein e enzimas responsáveis por metabolismo de nitrogênio, ou utilização de maltose/galactose; promotores de RNA polimerase ll incluindo promotores virais, tais como polioma, fowlpox e adenovírus (por exemplo, adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus (em particular, o promotor de gene precoce imediato), retrovírus, vírus da hepatite B, actina, promotor de vírus de sarcoma rous (RSV), e o vírus Símio 40 precoce ou posterior, e promotores não-virais, tais como EF-1 alfa (Mizushima and Nagata (1990) Nucleic Acids Res. 18(17):5322). Aqueles técnicos no assunto serão capazes de selecionar o promotor apropriado para expressão de um anticorpo humanizado, ou porção deste.

[0091] Onde apropriado, por exemplo, para expressão em células de eucarióticos mais altos, elementos intensificadores adicionais podem ser incluídos, ao invés de, ou bem como, aqueles encontrados localizados nos promotores descritos acima. Sequências intensificadoras de mamífero adequadas incluem elementos intensificadores de globina, elastase, albumina, fetoproteína, metalotionina e insulina. Alternativamente, pode- se usar um elemento intensificador de um vírus de célula eucariótica, tais como intensificador SV40, intensificador de promotor precoce de citomegalovírus, intensificador de polioma, intensificador baculoviral, ou local de lgG2a de murina (ver, WO 04/009823). Enquanto que tais intensificadores estão frequentemente localizados no vetor em um local à montante do promotor, eles podem também estarem localizados em qualquer lugar, por exemplo, dentro da região não-transladada, ou à jusante do sinal de poliadenilação. A escolha e posicionamento do intensificador podem ser baseados na compatibilidade com a célula hospedeira usada para expressão.

[0092] Em adição, os vetores (por exemplo, vetores de expressão) podem compreender um marcador selecionável para seleção de células hospedeiras que conduzem o vetor, e, no caso de um vetor replicável, uma origem de replicação. Os genes que codificam produtos que conferem resistência à antibiótico ou à fármaco são marcadores comuns selecionáveis, e podem ser usados em procariótico (por exemplo, gene f3-lactamase (resistência á ampicilina), gene Tet (resistência á tetraciclina) e células eucarióticas (por exemplo, neomicina (G418 ou geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina, ou genes de resistência à higromicina). Os genes marcadores de dihidrofolato redutase permitem seleção com metotrexato em uma variedade de hospedeiros. Os genes que codificam o produto de gene de marcadores auxotróficos do hospedeiro (por exemplo, LEU2, URA3, HIS3) são frequentemente usados como marcadores selecionáveis em levedura. O uso de vetores virais (por exemplo, baculovírus), ou vetores de fago, e vetores que são capazes de se integrarem no genoma da célula hospedeira, tais como vetores retrovirais, são também contemplados.

[0093] Em sistemas eucarióticos, sinais de poliadenilação e de terminação são ligados de forma operacional a polinucleotídeo que codifica o anticorpo da invenção. Tais sinais são tipicamente colocados 3' da estrutura de leitura aberta. Em sistemas de mamífero, exemplos não-limitativos de sinais de poliadenilação/terminação incluem aqueles derivados de hormônios de crescimento, fator-1 de alongamento alfa, e genes virais (por exemplo, SV40), ou repetições terminais longas retrovirais. Em sistemas de levedura, exemplos não-limitativos de sinais de polidenilação/terminação incluem aqueles derivados a partir dos genes de fosfoglicerato quinase (PGK) e do álcool dehidrogenase 1 (ADH). Em sistemas procarióticos, sinais de poliadenilação são tipicamente não requeridos e são, ao invés, usuais para empregar sequências terminadoras mais curtas e mais definidas. A escolha de sequências de poliadenilação/terminação pode ser baseada sob compatibilidade com a célula hospedeira usada para expressão. Em adição ao acima, outras características que podem ser empregadas para intensificar rendimentos incluem elementos de remodelagem de cromatina, íntrons, e modificação de códon específica de célula hospedeira. O uso do códon dos anticorpos da invenção pode ser modificado para acomodar inclinação de códon da célula hospedeira, tal como para aumentar transcrito e/ou rendimento de produto (por exemplo, Hoekema, A. et al. (1987) Mol. Cell Biol. 7(8):2914-24). A escolha de códons pode ser baseada na compatibilidade com a célula hospedeira usada para expressão.

[0094] A invenção, desse modo, se refere a moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam as imunoglobulinas humanizadas, ou cadeias pesada ou leve, destas. A invenção também se refere a moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam uma porção de ligação de antígeno das imunoglobulinas e suas cadeias.

[0095] Os anticorpos podem ser produzidos, por exemplo, pela expressão de um ou mais ácidos nucleicos recombinantes que codificam o anticorpo em uma célula hospedeira adequada. A célula hospedeira pode ser produzida usando qualquer método adequado. Por exemplo, os construtos de expressão (por exemplo, um ou mais vetores, por exemplo, um vetor de expressão de célula de mamífero) aqui descritos, podem ser introduzidos em uma célula hospedeira adequada, e a célula resultante pode ser mantida (por exemplo, em cultura, em um animal, em uma planta) sob condições adequadas para expressão do(s) construto(s) ou vetor(es). As células hospedeiras podem ser procarióticas, incluindo células bacterianas tais como E. coli (por exemplo, cepa DH5a™) (Invitrogen, Carlsbad, CA), PerC6 (Crucell, Leiden, NL), B. subtilis e/ou outras bactérias adequadas; células eucarióticas, tais como células fungais ou de levedura (por exemplo, Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), ou outras células eucarióticas inferiores, e células de eucariotos mais altos, tais como aquelas de insetos (por exemplo, Drosophila células Schnieder S2, células de inseto Sf9) (WO 94/126087 (O'Connor)), células de inseto BTI-TN-5B1-4 (High Five™) (Invitrogen), mamíferos (por exemplo, células COS, tais como COS-1 (ATCC Acesso No. CRL-1650) e COS-7 (ATCC Acesso No. CRL-1651), CHO (por exemplo, ATCC Acesso No. CRL-9096), CHO DG44 (Urlaub, G. and Chasin, L.A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7):4216-4220), 293 (ATCC Acesso No. CRL-1573), HeLa (ATCC Acesso No. CCL-2), CVl (ATCC Acesso No. CCL-70), WOP (Dailey, L., et al. (1985) J. Virol., 54:739-749), 3T3, 293T (Pear, W.S., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396), células NSO, células SP2/0, células HuT 78, e similares, ou plantas (por exemplo, tabaco, lentilha (lentilha de água), e algas). Ver, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993). Em algumas concretizações, a célula hospedeira não é parte de um organismo multicelular (por exemplo, planta ou animal), por exemplo, ela é uma célula hospedeira isolada, ou é parte de uma cultura de célula.

[0096] As células hospedeiras podem ser cultivadas em frascos giratórios, frascos de agitação, frascos de rolo, reatores de ondas (por exemplo, System 1000 de wavebiotech.com), ou sistemas de fibra oca, mas é preferido para produção de grande escala que reatores de tanque agitado ou reatores de saco (por exemplo, Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA) sejam usados particularmente para culturas de suspensão. Os reatores de tanque agitado podem ser adaptados para aeração usando, por exemplo, aspersores, chicanas, ou propulsores de baixo cisalhamento. Para colunas de bolha e reatores de elevação, aeração direta com bolhas de ar ou de oxigênio, pode ser usada. Onde as células hospedeiras são cultivadas em um meio de cultura livre de soro, o meio pode ser suplementado com um agente protetor de célula, tal como pluronic F-68, para ajudar a impedir dano de célula como um resultado do processo de aeração. Dependendo das características da célula hospedeira, micro transportadores podem ser usados como substratos de crescimento para linhas de célula dependentes da ancoragem, ou as células podem ser adaptadas para cultura de suspensão. A cultura de células hospedeiras, particularmente células hospedeiras de vertebrados, pode utilizar uma variedade de modos operacionais, tais como batelada, alimentada-batelada, processamento de batelada repetida (ver, Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15:103109), processo de batelada estendida, ou cultura de perfusão. Embora células hospedeiras de mamífero recombinantemente transformadas possam ser cultivadas em meio contendo soro, tal como meio compreendendo soro bovino fetal (FCS), é preferido que tais células hospedeiras sejam cultivadas em meio livre de soro, tal como revelado em Keen et al. (1995) Cytotechnology 17:153-163, ou meio comercialmente disponível, tal como ProCHO-CDM ou UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA), suplementado, onde necessário, com uma fonte de energia, tal como glicose, e fatores de crescimento sintético, tal como insulina recombinante. A cultura livre de soro das células hospedeiras pode requerer que aquelas células sejam adaptadas para crescer em condições livres de soro. Uma abordagem de adaptação é cultivar tais células hospedeiras em meio contendo soro, e troca repetidamente de 80% do meio de cultura para o meio livre de soro de modo que as células hospedeiras aprendam a se adaptarem em condições livres de soro (ver, por exemplo, Scharfenberg, K. et al. (1995) Animal Cell Technology: Developments Towards the 21st Century (Beuvery, E.C. et al., eds), pp.619-623, Kluwer Academic publishers).

[0097] Os anticorpos, de acordo com as concretizações descritas, podem ser secretados no meio, e recuperados e purificados deste, usando uma variedade de técnicas para proporcionar um grau de purificação adequado para o uso pretendido. Por exemplo, o uso de anticorpos terapêuticos para o tratamento de pacientes humanos tipicamente pede pelo menos 95% de pureza, conforme determinado por redução de SDS-PAGE, mais tipicamente 98% ou 99% de pureza, quando comparado ao meio de cultura compreendendo os anticorpos terapêuticos. No primeiro exemplo, fragmentos de célula a partir do meio de cultura podem ser removidos usando centrifugação, seguida por uma etapa de clareamento do sobrenadante usando, por exemplo, microfiltragem, ultrafiltragem e/ou filtragem de profundidade. Alternativamente, o anticorpo pode ser coletado por microfiltragem, ultrafiltragem ou filtragem de profundidade sem centrifugação anterior. Uma variedade de outras técnicas, tais como diálise e eletroforese de gel, e técnicas cromatográficas, tais como hidroxiapatita (HA), cromatografia de afinidade (opcionalmente envolvendo um sistema de marcação por afinidade, tal como polihistidina) e/ou cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) (ver, US 5.429.746), são disponíveis. Em uma concretização, os anticorpos, em seguida a várias etapas de clareamento, são capturados usando cromatografia de afinidade de Proteína A ou G, seguida por etapas adicionais de cromatografia, tais como cromatografia de troca de íon e/ou cromatografia de HA, cromatografia de troca de ânion ou de cátion, cromatografia de exclusão de tamanho, e precipitação de sulfato de amônia. Várias etapas de remoção de vírus podem também serem empregadas (por exemplo, nano filtragem usando, por exemplo, um filtro DV-20). Em seguida a estas várias etapas, uma preparação purificada compreendendo pelo menos 10 mg/mL ou maior, por exemplo, 100 mg/mL ou maior, do anticorpo da invenção, é proporcionada e, portanto, formam outra concretização da invenção. A concentração a 100 mg/mL ou maior pode ser gerada por ultracentrifugação. Tais preparações são substancialmente livres de formas agregadas de anticorpos da invenção.

[0098] Os sistemas bacterianos são particularmente adequados para a expressão de fragmentos de anticorpo. Tais fragmentos estão localizados intracelularmente, ou no interior do periplasma. Proteínas periplásmicas insolúveis podem ser extraídas e redobradas para formar proteínas ativas de acordo com métodos conhecidos àqueles técnicos no assunto, ver, Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol. 72:13-20; Cupit, P.M. et al. (1999) Lett. Appl. Microbiol. 29:273-277.

[0099] A presente invenção também se refere a células compreendendo um ácido nucleico, por exemplo, um vetor, da invenção (por exemplo, um vetor de expressão). Por exemplo, um ácido nucleico (isto é, uma ou mais ácidos nucleicos) que codifica as cadeias pesada e leve de uma imunoglobulina humanizada, de acordo com as concretizações descritas, ou um construto (isto é, um ou mais construtos, por exemplo, um ou mais vetores) compreendendo tal(is) ácido(s) nucleico (s), pode(m) ser introduzido(s) em uma célula hospedeira adequada por um método apropriado à célula hospedeira selecionada (por exemplo, transformação, transfecção, eletroporação, infecção), com o(s) ácido(s) nucleico(s) sendo, ou tornando-se, ligado de forma operacional(s) a um ou mais elementos de controle de expressão (por exemplo, em um vetor, em um construto criado por processos na célula, integrado no genoma da célula hospedeira). As células hospedeiras podem ser mantidas sob condições adequadas para expressão (por exemplo, na presença de indutor, meio adequado suplementado com sais apropriados, fatores de crescimento, antibiótico, suplementos nutricionais, etc.), pelo que o(s) polipeptídeo(s) codificado(s) é/são produzido(s). Se desejado, o anticorpo humanizado codificado pode ser isolado, por exemplo, a partir das células hospedeiras, meio de cultura, ou leite. Este processo envolve expressão em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula de glândula mamária) de um animal transgênico ou planta (por exemplo, tabaco) (ver, por exemplo, WO 92/03918). 3. Aplicações terapêuticas

[00100] A supressão de atividade de célula T é desejável em um número de situações em que imunossupressão é justificada, e/ou uma condição autoimune ocorre. Consequentemente, o direcionamento do complexo de αβTCR.CD3 é indicado no tratamento de doenças envolvendo uma resposta humana inapropriada ou indesejada, tal como inflamação, autoimunidade, e outras condições envolvendo tais mecanismos. Em uma concretização, tal doença ou distúrbio é uma doença autoimune e/ou inflamatória. Exemplos de tais doenças autoimune e/ou inflamatória são Eritematose de Lúpus Sistêmica (SLE), Artrite Reumatoide (RA) e doença inflamatória do intestino (IBD) (incluindo, colite ulcerativa (UC) e doença de Crohn (CD)), esclerose múltipla (MS), escleroderma e diabetes tipo 1 (T1D), e outras doenças e distúrbios, tal como PV (pênfigo vulgaris), psoríase, dermatite atópica, doença celíaca, doença do Pulmão Obstrutiva Crônica, tireoidite de Hashimoto, doença Graves (tireoide), síndrome de Sjogren, síndrome de Guillain-barré, síndrome de Goodpasture, doença de Addison, granulomatose de Wegener, esclerose biliar primária, colangite esclerozante, hepatite autoimune, polimialgia reumática, fenômeno de Raynaud, artrite temporal, artrite de célula gigante, anemia hemolítica autoimune, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, doença de behcet, cirrose biliar primária, uveíte, miocardite, febre reumática, espondilite anquilosante, glomerulenefrite, sarcoidose, dermatomiosite, miastenia gravis, polimiosite, alopecia areata, e vitilgo.

[00101] Em uma concretização, tal doença ou distúrbio é SLE, RA ou IBD. Em uma concretização, tal doença ou distúrbio é MS.

[00102] Em outra concretização, os anticorpos, de acordo com as concretizações descritas, são usados para auxiliar transplante por imunossupressão do indivíduo. Tal uso alivia a doença de enxerto- versus-hospedeiro. Para uma descrição de tratamentos existentes para doença enxerto-versus-hospedeiro, ver, por exemplo, Svennilson, Bone Marrow Transplantation (2005) 35: S65-S67, e referências aqui ditadas. Vantajosamente, os anticorpos da invenção podem ser usados em combinação com outras terapias disponíveis.

[00103] Com relação ao tratamento de doenças autoimunes, a terapia de combinação pode incluir administração de um anticorpo da presente invenção junto com um medicamento, que, junto com o anticorpo, compreende uma quantidade efetiva para prevenção ou tratamento de tais doenças autoimunes. Onde referida doença autoimune é Diabetes tipo 1, a terapia de combinação pode envolver um ou mais de um agente que promove o crescimento de células beta pancreáticas, ou intensifica o transplante de célula beta, tais como crescimento de célula beta ou fatores de sobrevivência ou anticorpos imunomodulatório. Onde referida doença autoimune é artrite reumatoide, referida combinação pode envolver uma ou mais de metotrexato, um anticorpo anti-TNF-αβ, uma proteína de fusão de receptoMg TNF-Y, um anti-IL-15 ou anticorpo antianti-IL-21, um fármaco anti-inflamatório não-esteroidal (NSAID), ou um fármaco anti- reumático de modificação de doença (DMARD). Por exemplo, o agente adicional pode ser um agente biológico, tal como um agente anti-TNF (por exemplo, Enbrel®, infliximab (Remicade®) e adalimumab (Humira®) ou rituximab (Rituxan®). Onde referida doença autoimune é rejeição de transplante hematopoiético, fator(es) de crescimento hematopoiético (tais como eritropoietina, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-11, trombopoietina, etc.) ou antimicrobiano(s) (tais como fármacos antibióticos, antivirais, antifúngicos), podem ser administrados. Onde referida doença autoimune é psoríase, o agente adicional pode ser um ou mais de alcatrão e derivados destes, fototerapia, corticosteroides, Ciclosporina A, análogos de vitamina D, metotrexato, inibidores de proteína quinase ativada por mitógeno p38 (MAPK), bem como agentes biológicos, tais como agentes anti-TNF- e Rituxan®. Onde referida doença autoimune é uma doença inflamatória do rim (IBD) tais como, por exemplo, Doença de Crohn ou colite ulcerativa, o agente adicional pode ser um ou mais de aminosalicilatos, corticosteroides, imunomoduladores, antibióticos, ou agentes biológicos, tais como Remicade® e Humira®.

[00104] O tratamento de combinação pode ser efetuado de qualquer modo conforme, de fato, necessário, ou conveniente, pelo técnico no assunto, e para a proposta deste relatório descritivo, nenhuma limitação com relação à ordem, quantidade, repetição ou quantidade relativa dos compostos a serem usados em combinação, é contemplada. Consequentemente, os anticorpos, de acordo com as concretizações descritas, podem ser formulados em composições farmacêuticas para uso na terapia. 4. Composições Farmacêuticas

[00105] Em uma concretização preferida, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo, de acordo com a invenção, ou um ligante, ou ligantes, identificáveis por um método de ensaio, conforme definido no aspecto anterior da invenção. Os ligantes podem ser imunoglobulinas, peptídeos, ácidos nucleicos, ou moléculas pequenas, conforme aqui discutido. Eles são referidos a, na seguinte discussão, como "compostos".

[00106] Uma composição farmacêutica, de acordo com a invenção, é uma composição de matéria compreendendo um composto ou compostos capazes de modular atividade de célula T como um ingrediente ativo. O composto está na forma de qualquer sal farmaceuticamente aceitável, ou, por exemplo, onde apropriado, um análogo, forma de base livre, tautômero, racemato enantiômero, ou combinação destes. Os ingredientes ativos de uma composição farmacêutica compreendendo o ingrediente ativo, de acordo com a invenção, são contemplados para exibir atividade terapêutica, por exemplo, no tratamento de doença de enxerto-versus-hospedeiro, quando administrado em quantidade que depende do caso particular.

[00107] Em outra concretização, um ou mais compostos da invenção podem ser usados em combinação com qualquer composto reconhecido na técnica conhecido por ser adequado para tratamento da indicação particular no tratamento de qualquer das condições antes mencionadas. Consequentemente, um ou mais compostos da invenção podem ser combinados com um ou mais dos compostos reconhecidos na técnica conhecidos por serem adequados para tratamento das indicações precedentes, tal que uma composição conveniente, simples, possa ser administrada ao indivíduo. O regime de dosagem pode ser ajustado para proporcionar a resposta terapêutica ótima.

[00108] Por exemplo, várias doses divididas podem ser administradas diariamente, ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida, conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica.

[00109] O ingrediente ativo pode ser administrado em uma maneira conveniente, tal como pelas rotas oral, intravenosa (onde solúvel em água), intramuscular, subcutânea, intranasal, intradérmica ou de supositório, ou implante (por exemplo, usando moléculas de baixa liberação).

[00110] Dependendo da rota de administração, o ingrediente ativo pode ser requerido ser revestido em um material para proteger referidos ingredientes da ação de enzimas, ácidos e outras condições naturais que podem inativar referido ingrediente.

[00111] De modo a administrar o ingrediente ativo por meio outro do que administração parenteral, ele será revestido por, ou administrado com um material para impedir sua inativação. Por exemplo, o ingrediente ativo pode ser administrado em um adjuvante, coadministrado com inibidores de enzima ou em lipossomas. O adjuvante é usado em seu sentido mais amplo, inclui qualquer composto de estimulação imune, tal como interferon. Os adjuvantes aqui contemplados incluem resorcinóis, surfactantes não-iônicos, tais como polioxietileno oleil éter e n-hexadecil polietileno éter. Os inibidores de enzima incluem tripsina pancreática.

[00112] Os lipossomas incluem emulsões de CGF de água-em-óleo- em água, bem como lipossomas convencionais.

[00113] O ingrediente ativo pode também ser administrado parenteralmente ou intraperitonealmente.

[00114] As disperses podem também serem preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e misturas destes, e em óleos. Sob condições ordinárias de armazenagem e uso, estas preparações contêm um conservante para impedir o crescimento de micro-organismos.

[00115] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (onde solúvel em água), ou dispersões, e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis, ou dispersão. Em todos os casos, a forma deve ser estéril, e deve ser fluida a extensão que fácil seringabilidade exista. Ela deve ser estável sob as condições de manufatura e armazenagem, e deve ser preservada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactéria e fungo. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e similares), misturas adequadas destes, e óleos vegetais. A fluidez correta pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos.

[00116] A prevenção da ação de micro-organismos pode ser proporcionada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tirmerosal e similares. Em certos casos, pode ser preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provida pelo uso nas composições dos agentes que retardam absorção, por exemplo, alumínio monoestearato e gelatina.

[00117] As soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação do ingrediente ativo na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas por incorporação do ingrediente ativo esterilizado em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles acima enumerados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem à vácuo e a técnica de secagem por congelamento, que produz um pó do ingrediente ativo, mais qualquer ingrediente desejado adicional de solução filtrada previamente estéril deste.

[00118] Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou, de outro modo, para modificar a forma física da unidade de dosagem. Naturalmente, qualquer material usado na preparação de qualquer unidade de dosagem deve ser farmaceuticamente puro, e substancialmente não-tóxico nas quantidades empregadas. Em adição, o ingrediente ativo pode ser incorporado em preparações e formulações de liberação sustentada.

[00119] Conforme aqui usado "transportador farmaceuticamente aceitável e/ou diluente" incluem qualquer e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, e agentes de retardamento de absorção, e similares. O uso de tal meio e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecido na técnica. Exceto visto que qualquer meio convencional ou agente é incompatível com o ingrediente ativo, o uso deste nas composições terapêuticas é contemplado. Os ingredientes ativos suplementares podem também serem incorporados nas composições.

[00120] É especialmente vantajoso formular composições parenterais em unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem, conforme aqui usado, se refere a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade pré-determinada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico requerido. A especificação para as novas formas de unidade de dosagem da invenção é determinada por, e depende diretamente de (a) as características únicas do material ativo e o efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes na técnica de composição, tal como material ativo para o tratamento de doença em indivíduos vivos tendo uma condição adoentada em que a saúde corpórea é prejudicada.

[00121] Os ingredientes ativos principais são compostos para administração conveniente e efetiva em quantidades efetivas com um transportador farmaceuticamente aceitável adequado na forma de unidade de dosagem. No caso de composições contendo ingredientes ativos suplementares, as dosagens são determinadas por referência a dose usual e maneira de administração dos referidos ingredientes.

[00122] De modo a facilitar a distribuição de compostos de peptídeo, incluindo anticorpos, a células, peptídeos podem ser modificados de modo a aperfeiçoar sua capacidade de atravessar uma membrana de célula. Por exemplo, US 5.149.782 revela o uso de peptídeos fusogênicos, peptídeos de formação de canal de íon, peptídeos de membrana, ácidos graxos de cadeia longa, e outros agentes de mistura de membrana, para aumentar o transporte de proteína através da membrana da célula. Estes e outros métodos são também descritos em WO 97/37016 e US 5.108.921, incorporados aqui por referência.

[00123] Em um aspecto adicional, é proporcionado o ingrediente ativo da invenção, conforme aqui antes definido, para uso no tratamento de doença, ou sozinho ou em combinação, com compostos reconhecidos na técnica conhecidos por serem adequados para tratamento da indicação particular. Consequentemente, é proporcionado o uso de um ingrediente ativo da invenção para a manufatura de um medicamento para o tratamento de doença associada com uma resposta imune aberrante.

[00124] Além disso, é proporcionado um método para tratamento de uma condição associada com uma resposta imune aberrante, compreendendo administrar a um indivíduo, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um ligante identificável usando um método de ensaio, conforme descrito acima.

[00125] A invenção é adicionalmente descrita, para a proposta de ilustração somente, nos seguintes exemplos. Exemplo Comparativo 1 Ligação e atividade biológica de EuCIV3 são diminuídas comparadas com BMA031

[00126] Usando citometria de fluxo, mostrou-se que EuCIV3 é inferior a BMA031 na ligação de célula T (Fig. 1). Neste ensaio de competição, as células T foram incubadas em gelo na presença de uma concentração fixa de Ficoeritrina diretamente etiquetado MoIgG2b- BMA031 (competidor de murina), e uma concentração aumentada de anticorpos anti-αβTCR. Após 20 minutos de incubação, as células foram lavadas, e a superfície ligada a Ficoeritrina diretamente etiquetado MoIgG2b-BMA031 foi detectada por citometria de fluxo. O anticorpo quimérico de BMA031 HuIgG1 compete muito mais efetivamente do que EuCIV3.

[00127] De modo a avaliar sua capacidade de inibir atividade de célula T in vivo, células T CD8+ T foram tratadas com anticorpos anti- αβTCR em várias concentrações (ver, Fig. 2, eixo-x), e co-cultivadas com células dendríticas autólogas (DCs) pulsadas com o peptídeo CMV 495-503 (pp65) por sete dias em um ensaio de educação in vitro (IVE).

[00128] Produtos de afarese doadores normais de HLA-A2+ individuais foram obtidos de HemaCare Corp., Van Nuys, CA). PBMC foram isolados por centrifugação sobre Ficoll (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Células T CD8+ foram isoladas usando esferas magnéticas (Invitrogen, Carlsbad, California), de acordo com as instruções do fabricante. Para gerar células dendríticas imaturas autólogas, PBMCs foram ressuspensos em soro AB humano RPMI 1640/5% (Sigma), colocados em frascos triplos (Corning) e incubados por mais do que 2 horas a 37oC/5%CO2. Os monócitos aderentes foram, em seguida, enxaguados com PBS e cultivados por 6 dias em soro AB humano RPMI 1640/5% suplementado com GM-CSF (Immunex, Seattle, WA) e IL-4 (PeproTech, Rocky Hill, NJ). Antes de estabelecer as co-culturas de célula/DC, os DCs foram pulsados com peptídeos (10ug/mL) por 4 horas e, em seguida, maturados. As células dendríticas maturas foram geradas pela adição de 50ng/mL de TNF-alfa, 25ng/mL de IL-1β, 10ng/mL de IL-6, 500ng/mL de PGE-2 (PeproTech, Rocky Hill, NJ), e cultura das células dendríticas por um adicional de 24 horas. Os DCs pulsados por peptídeo foram, em seguida, adicionados às células T CD8+ previamente isoladas a uma razão de T:DC de 10:1. As culturas foram imediatamente alimentadas com IL-2 (100 IU/mL) adicionado às culturas. As culturas foram suplementadas com IL-2 (100 IU/mL) no dia 4. As culturas a granel foram ensaiadas para reatividade de peptídeo em um ensaio de liberação de cromo no dia 7.

[00129] O gráfico na Fig. 2 mostra dados de lises a partir do ensaio de liberação de cromo, onde células T não-tratadas foram bem- sucedidamente educadas contra peptídeo pp65, e capazes de lisar alvos específicos a >50%. BMA031 inibe a educação destas células T, a medida que elas foram incapazes de lisar alvos específicos em uma maneira dependente da dose. O anticorpo humanizado EuCIV3 foi menos potente do que BMA031, e foi somente capaz de inibir educação na dose mais alta. Exemplo 2 Engenharia de Fc de anticorpos quiméricos BMA031 Perfil in vitro

[00130] Avaliou-se o perfil in vitro de BMA031 em um painel de ensaios. A Tabela 1 mostra o perfil in vitro de BMA031. BMA031 é comparado a OKT3 nestes ensaios.

[00131] No ensaio de proliferação de PBMC, PBMCs humanos foram cultivados com concentrações aumentadas de anticorpo terapêutico por 72 horas, 3H- timidina foi adicionada e as células foram coletadas 18 horas mais tarde.

[00132] Para o ensaio de depleção/perfil de liberação de célula T, PBMCs humanos foram cultivados com concentrações aumentadas de anticorpo terapêutico, e foram analisados diariamente para contagens de célula e viabilidade (Vi-Cell, Beckman Coulter) fora para o dia 7. Os sobrenadantes de célula foram também coletados, armazenados a - 20oC, e analisados em um painel de citocina 8-plex (Bio-Rad).

[00133] BMA031 não induz: (i) proliferação de PBMC; (ii) depleção de célula T; (iii) expressão de CD25; ou (iv) perfil de liberação. Em contraste, OKT3 induz todos dos efeitos antes mencionados. BMA031 e OKT3 são capazes de bloquearem a educação de células CD8+ para peptídeo em um ensaio de educação in vitro (IVE), e são também capazes de bloquearem uma reação de linfócito misturada (MLR). BMA031 também induz apoptose de células T ativadas (morte de célula induzida por ativação; AICD).

[00134] Diferente de BMA031, uma versão quimérica de BMA031 (HuIgG1), com região constante de IgG1 humana tipo selvagem, tem um perfil in vitro comparável a OKT3 (Tabela 1). Postulou-se que envolvimento de FCYR foi crítico para esta mudança de perfil in vitro para HuIgG1 BMA031 comparada a BMA031 MoIgG2b. Portanto, produziu- se fragmentos F(ab’)2 de BMA031 HuIgG1, e encontramos estes para recuperar o perfil de BMA031 MoIgG2b. Por projeto de Fc, incorporou- se modificações que removem ligação de FCYR em mutações conhecidas como "delta ab" (Armour et al. (1999) Eur. J. Immunol., 29:2613-2624), e por geração de forma aglicosilada de HuIgG4 (N297Q). Anticorpos anti-αβTCR HuIgG1 delta ab e HuIgG4 agly têm o mesmo perfil in vitro como BMA031 MoIgG2b (Tabela 1).

Exemplo 3 Construção de anticorpos humanizados com ligação aperfeiçoada

[00135] Gerou-se duas séries de versões humanizadas de BMA031 denominadas séries HEBE1 (IGH3-23) e séries GL1BM (IGHV1-3*01 & IGKV3-11*01; ver, VBase, vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk). O enxerto inicial de regiões CDR de cadeia pesada de BMA031 em regiões de estrutura de IGH3-23 (ver, SEQ ID NOs: 5 e 6) aperfeiçoa a ligação do anticorpo ao αβTCR, conforme mostrado por um ensaio de competição (Fig. 3); ver, Exemplo 2. Contudo, este aperfeiçoamento não se traduz em um aperfeiçoamento funcional no anticorpo, conforme mostrado por um ensaio de IVE (Fig. 4). Exemplo 4 Otimização de anticorpos humanizados

[00136] A estratégia para otimização dos anticorpos humanizados foi baseada na mutagênese e classificação funcional. A otimização foi iniciada com mudanças de bloco de resíduos de aminoácido em uma de cada das quatro regiões de estrutura dos domínios variáveis, de camundongo para humano. As regiões de estrutura chaves foram identificadas em cada uma das séries de GL1BM HC, GL1BM LC e HEBE1 HC. Seguindo esta identificação, os resíduos individuais, dentro destas regiões de estrutura, foram mutados a resíduos de linha germinal humana a partir da sequência de camundongo original. Os resíduos de estrutura para qual identidade com a sequência de camundongo foi verificada ser importante para retenção das propriedades de ligação do anticorpo foram retidos como resíduos de camundongo. De outro modo, os resíduos de estrutura foram mudados para equipararem a sequência de aminoácido de linha germinal humana. Isto foi continuado através da sequência até que o número mínimo de resíduos de camundongo, para reter as propriedades de ligação originais do anticorpo, foi identificado. Ver Fig. 5. Demonstrou-se que vários dos anticorpos destas séries têm uma ligação aperfeiçoada comparada a BMA031, conforme determinado pela taxa pontual de anticorpos de células T (Figs. 6, 7 e 8).

[00137] Para ensaios de taxa pontual, 105 células T humanas foram incubadas por 30-60 minutos à temperatura ambiente em 100 μL de meio de crescimento total contendo 2 μg/mL dos anticorpos expressos como HuIgG1-Δab. As células foram, em seguida, lavadas, ressuspensas em 50 μL de meio de crescimento total, e 20ug/mL de HEBE1 F(ab’)2 foi adicionado de modo a impedir religação dos anticorpos candidatos dissociados. No final deste ensaio de curso de tempo, as células foram fixadas, e o nível de anticorpos HuIgG1-Δab remanescentes ligados à superfície da célula foi medido por citometria de fluxo, via um anticorpo secundário de anti-HuIgG de cabra etiquetado com PE.

[00138] Demonstrou-se que os anticorpos são ativos na prevenção da resposta imune em uma IVE (Figs. 9, 10 e 11) e de ensaio de MLR. No ensaio de IVE, ligação de tetrâmero foi usada como uma medição quantitativa para o IVE. A percentagem de células que foram específicas de antígeno foi determinada por coloração das células T com um tetrâmero diretamente etiquetado que é específico para a educação do peptídeo. Brevemente, células CD8+ de dia 7 a partir da IVE foram coloridas com tetrâmero por protocolos de coloração de citometria de fluxo padrões, e analisadas em BD FACSCalibur. Em adição, os anticorpos humanizados demonstraram níveis comparáveis de potencial proliferativo em PBMCs e perfil de liberação, conforme comparados a BMA031 (Figs. 12 e 13).

[00139] Os anticorpos também mostraram uma capacidade de inibir a liberação de IFNY de células T em um ensaio de IVE (Fig. 14). Em adição, mostrou-se que um número destes anticorpos têm uma capacidade aperfeiçoada de induzir morte de célula induzida por ativação (AICD) de células T αβTCR-positivas comparada a BMA031 (Fig. 15). No ensaio de AICD, células T CD8+ específicas de antígeno foram cultivadas com anticorpo terapêutico. Em 24 horas, 48 horas e 72 horas foram coloridas por marcadores de apoptose Annexin-V e 7-AAD. As células foram também coloridas com tetrâmero para trilhar apoptose com efeitos em células T específicas de antígeno.

[00140] Em conclusão, produziu-se aperfeiçoamento significante sobre tentativas anteriores para humanizar BMA031. A descoberta de anticorpos com uma taxa pontual aperfeiçoada comparada a BMA031 é uma descoberta inesperada, via este processo. Este aperfeiçoamento na ligação se correlaciona com um aperfeiçoamento na potência para suprimir uma resposta imune conforme demonstrado no ensaio de IVE (Figs. 10 e 11). A especificidade dos anticorpos para αβTCR, a imunogenicidade diminuída por humanização, a apoptose específica de células T ativadas, e a falta de ativação de célula T após ligação do anticorpo, tornam estes anticorpos excelentes candidatos para proposta terapêutica. Exemplo 5 Geração de mutantes de Fc para função efetuadora reduzida.

[00141] O projeto de variantes de Fc foi desenhado e gerado onde um local de glicosilação é introduzido na posição de aminoácido Ser 298, em seguida para o local de Asn297 que ocorre naturalmente. A glicosilação em Asn297 foi, ou mantida, ou eliminada por mutações. Os resultados das mutações e glicosilação são colocadas na Tabela 2.

[00142] Mutações foram feitas na cadeia pesada de clone de anticorpo de receptor de célula T αβ #66 por Quikchange usando um gabarito pENTR_LIC_IgG1. O domínio de VH de HEBE1 Δab IgG1 #66 foi amplificado com iniciadores de LIC, e clonado em pENTR_LIC_IgG1 mutado ou tipo selvagem por LIC para criar um mutante Ab de comprimento total, ou tipo selvagem. A subclonagem foi verificada com digestão dupla de DraIII/XhoI, produzindo ~1250 bp de inserto nos clones bem-sucedidos. Aqueles mutantes de comprimento total foram, em seguida, clonados em um vetor de expressão, pCEP4(-E+I)Dest, via clonagem Gateway. As mutações foram, em seguida, confirmadas por sequenciamento de DNA.

[00143] Dois construtos, HEBE1 Agly IgG4 e HEBE1 Δab IgG1 em pCEP4, foram usados como controles em transfecção de HEK293.

[00144] Os mutantes, wt e controles (Agly e Δab) foram transfectados em células HEK293-EBNA em frasco triplo para expressão. As proteínas foram purificadas de 160 ml de meio condicionado (CM) com 1 ml de colunas de proteína A HiTrap (GE) em bomba peristáltica de canal múltiplo. Cinco microgramas de cada sobrenadante foram analisados em 4-20% de Tris-Glicina de redução e SDS-PAGE de não- redução (ver Figura 16). A cadeia pesada dos mutantes aglicosilados (N297Q, T299A, e controle de Agly, é inferior (seta em negro), consistente com a perda dos glicanos neste anticorpo. As cadeias pesadas dos anticorpos glicosilados projetados (NSY, STY, SY, Δab, e controle de wt, setas em vermelho); contudo, migram do mesmo modo como o controle tipo selvagem. Este resultado é consistente com o resultado esperado de local de glicosilação projetado nas posições 298. A análise de SEC-HPLC indicou que todos os mutantes são expressos como monômeros.

Análise de glicosilação por LC-MS.

[00145] As variantes de Fc de H66 IgG1 Fc projetadas foram parcialmente reduzidas com 20 mM de DTT a 37°C por 30 min. As amostras foram analisadas por LC/MS capilar em um sistema de HPLC capilar Agilent 1100 acoplando com um sistema híbrido QSTAR qq TOF (Applied Biosystem). Reconstrução de proteína de Bayesian com correção de nível e modelagem de computador em Analyst QS 1.1 (Applied Bisoystem) foi usado para análise de dados. Para mutante S298N/T299A/Y300S H66 que o anticorpo conduz, um local de glicosilação foi observado no aminoácido 298 com glicanos tipo complexos bi-antenários e tri-antenários detectados como a espécie maior, bem como G0F, G1F e G2F.

Ligação de mutantes de anticorpo αβTCR em FcYRIIIa e FCYRI humano usando Biacore.

[00146] Biacore foi usado para avaliar a ligação a FcYRIIIa humano recombinante (V158 & F158) e FCYRI. Todas as 4 células de fluxo de um chip de CM5 foram imobilizadas com anticorpo anti-HPC4, via o procedimento de acoplamento de amina padrão provido por Biacore. O anticorpo anti-HPC4 foi diluído em 50 μg/mL em 10 mM de acetato de sódio, pH 5,0, para a reação de acoplamento, e injetado por 25 min a 5 μL/min. Aproximadamente 12.000 RU de anticorpo foi imobilizado à superfície do chip. FcYRIIIa-V158 e FcYRIIIa-F158 humanos recombinantes foram diluídos a 0,6 μg/mL em tampão de ligação, HBS- P com 1 mM de CaCl2, e injetados em células de fluxo 2 e 4, respectivamente, por 3 min a 5 μL/min para capturar 300 - 400 RU receptor ao chip de anti-HPC4. De modo a distinguir entre os ligantes baixos, três vezes mais rhFcYRIIIa foi capturado na superfície do anti- HPC4 do que usualmente usado neste ensaio. As células de fluxo 1 e 3 foram usadas como controles de referência. Cada anticorpo foi diluído a 200 nM em tampão de ligação e injetado sobre todas as 4 células de fluxo por 4 min, seguido por 5 min de dissociação em tampão. As superfícies foram regeneradas com 10mM de EDTA em tampão HBS- EP por 3 min a 20 μL/min.

[00147] Os resultados são mostrados na Figura 17.

[00148] Biacore foi também usado para comparar a ligação de FCYRI. Anticorpos His anti-tetra His foram trocados por tampão em 10 mM de acetato de sódio, pH 4,0, usando uma coluna de desalgamento Zeba, e diluídos a 25 μg/mL no tampão de acetato para acoplamento de amina. Duas células de fluxo de um chip de CM5 foram imobilizadas com ~9000 RU dos anticorpos anti-Tetra-His após 20 min de injeção a 5 μL/min. Similar ao experimento anterior, dez vezes mais FCYRI foi capturado à superfície anti-tetra-His de modo a comparar ligantes fracos. FCYRI humano recombinante foi diluído em 10 μg/mL em tampão de ligação de HBS-EP e injetado à célula de fluxo 2 por 1 min a 5μL/min para capturar ~1000 RU receptor ao chip de anti-tetra-His. Uma concentração simples de anticorpo, 100 nM, foi injetada por 3 min a 30 μL/min sobre o receptor capturado e superfície de controle. A dissociação foi monitorada por 3 min. A superfície foi regeneração com duas injeções de 30 segundos de 10mM de glicina, pH 2,5, a 20 μL/min.

[00149] Os resultados são mostrados na Figura 18.

[00150] O resultado sugere muito pouca ligação dos mutantes glicoprojetados em FcyRIIIa ou FcyRI. H66 S298N/T299A/Y300S, em particular, aboliu quase completamente ligação a ambos receptores. Este mutante foi escolhido como a condução para a caracterização detalhada.

Caracterização de estabilidade usando Dicroismo Circular (CD).

[00151] A estabilidade do mutante de anticorpo S298N/T299A/ Y300S foi monitorada por um experimento de termo fusão Far-UV CD onde o sinal de CD a 216 nm e 222 nm foi monitorado como aumento de temperatura que eventualmente conduz a desdobramento do anticorpo. O espectro de CD foi coletado em um espectrômetro Jasco 815 em uma concentração de proteína de aproximadamente 0,5 mg/mL em tampão de PBS em uma cuba de quartzo (Hellma, Inc) com um comprimento de trajetória de 10 mm. A temperatura foi controlada por um peltier termoelétrico (Jasco model AWC100), e foi aumentada a uma taxa de 1 °C/min de 25-89°C. O sinal de CD e tensão de HT foram ambos coletados. O dado foi obtido de 210-260 nm com intervalos de dado de 0,5 nm e em intervalos de temperatura de 1°C. A velocidade de escaneamento foi 50 nm/min, e um passo de dado de 0,5 nm. Uma largura de banda de 2,5 nm foi usada com um ajuste de sensibilidade de meio. 4 escaneamentos replicados foram realizados para cada amostra. O resultado sugere que ambos delta AB H66 e o mutante S298N/T299A/Y300S H66 mostram comportamento térmico similar, e têm a mesma temperatura de início para degradação ao redor de 63°C. Em outras palavras, o mutante é tão estável quanto o formato delta AB. Ver Figura 18. Exemplo 6 Análise funcional de mutantes projetados de Fc

[00152] Ensaios de proliferação de PBMC e perfil de liberação foram conduzidos conforme colocado no Exemplo 2. PBMCs doadores normais foram descongelados e tratados sob as seguintes condições (todo meio contendo complemento): Não-tratado BMA031, moIgG2b 10ug/mL OKT3, moIgG2a 10ug/mL H66, huIgG1 deltaAB 10 ug/mL, 1 ug/mL e 0,1 ug/mL H66, huIgG1 S298N/T299A/Y300S 10 ug/mL, 1 ug/mL e 0,1 ug/mL

[00153] Citocinas foram coletadas no dia 2 (D2) e dia 4 (D4) para Bioplex Analysis (IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, GM-CSF, IFNg, TNFa). As células foram coloridas em D4 para CD4, CD8, CD25 e expressão de abTCR.

[00154] Os resultados, mostrados nas Figuras 19-22, demonstram que H66 S298N/T299A/Y300S se comportou similarmente ao H66 deltaAB em todos os ensaios à base de célula, mostrando ativação de célula T mínima por expressão de CD25; ligação a abTCR, embora com cinéticas levemente diferentes para deltaAB; perfil de liberação mínimo em ambos pontos de tempo D2 e D4; o mutante foi, de fato, superior a deltaAB em D4 em relação de várias das citocinas.

[00155] O mutante S298N/T299A/Y300S, desse modo, elimina a função efetuadora tão efetivamente quanto a mutação de deltaAB. Exemplo 7 Anticorpos biespecíficos

[00156] Moléculas biespecíficas foram construídas compreendidas de dois anticorpos de cadeia simples (scFv) ligados juntos, via um ligante de aminoácido curto, pelo que um braço é capaz de ligar um alvo de tumor, e o outro capaz de ligar células T, via o αβ TCR. A molécula biespecífica é referida aqui como um TRAÇADOR (Receptor de célula T Ativada Citotóxica EnableR).

[00157] Os seguintes construtos humanizados anti-αβTCR scFv foram produzidos: GL1BMΔSxVK1 GL1BMΔSxVK27 GL1BMΔSVH11xVK1 GL1BMΔSVH15xVK1 GL1BMΔSVH28xVK43 GL1BMΔSVH31xVK43

[00158] As sequências das cadeias pesada e leve são colocadas em SEQ ID nos 14-16 e 20-24.

[00159] A caracterização destas moléculas compreende uma avaliação de ligação a alvo de tumor e células T, atividade citotóxica in vitro e perfil de liberação de citocina na presença e ausência de células alvos de tumor.

[00160] O perfil de ligação avaliado por citometria de fluxo mostra que anticorpos biespecíficos anti-αβ TCR são capazes de se ligarem ambos a linha de célula alvo de tumor e às células T. Ver Figura 23.

[00161] A atividade citotóxica in vitro medida por citometria de fluxo mostra que células T recrutadas, via anticorpo biespecífico anti-αβ TCR são capazes de induzirem lises mediada por célula T. Ver Figura 24.

[00162] A análise do perfil de liberação de citocina mostrou que após ligação de ambos os braços do anticorpo biespecífico, existe um alto nível de perfil de liberação de TH1/TH2 a partir das células T que não é visto na ausência de células alvos. Tomado junto, este mecanismo de ação mostra um perfil similar àquele dos biespecíficos à base de CD3 descritos na literatura. Exemplo 8: Preparação e caracterização de uma variante de Fc projetada em anticorpo anti-CD52.

[00163] De modo a testar a generalidade da aplicabilidade das mutações de Fc aqui descritas, o mutante de glicosilação S298N/Y300S foi também preparado em um anticorpo anti-CD52 (clone 2C3) para ver se a modulação da função efetuadora com a perda de ligação de FCYRIII se aplica a um suporte de anticorpo diferente. O DNA variante de S298N/Y300S 2C3 foi preparado por mutagênese de mudança rápida. A proteína foi purificada de meio condicionado após transfecção transiente de HEK293. Anticorpos tipo selvagem anti-CD52 2C3 foi produzido em paralelo como um controle. Biacore foi usado para caracterizar a ligação de antígeno, FCYRIII, e propriedades de ligação dos anticorpos purificados (ver Figura 26).

[00164] A variante de S298N/Y300S 2C3 se liga a peptídeo CD52 apertadamente e o sensograma de ligação é indistinguível com o controle tipo selvagem, sugerindo que esta mutação no domínio de Fc não afeta sua ligação de antígeno (Figura 26A).

[00165] Para ensaiar a função efetuadora de Fc, receptor de FCYRIII (Val158) foi usado em estudos de ligação. O mutante e anticorpo de controle tipo selvagem foram diluídos a 200 nM e injetados a HPC4- etiqueta capturado FcyRIIIa. A ligação de FcyRIII é quase indetectável para o mutante de S298N/Y300S, que indica perda de função efetuadora com esta variante (Figura 26B). O mutante também se liga a receptor de FcRn com a mesma afinidade como o controle de anticorpo tipo selvagem de modo que não esperou-se nenhuma mudança em sua meia-vida de circulação, ou outras propriedades farmacocinéticas. (ver Figura 26C). Concluiu-se que a mutação de S298N/Y300S é aplicável a anticorpos em geral, para reduzir ou eliminar a função efetuadora de Fc indesejada, por exemplo, através do engajamento de receptores de Fcy humanos.

Claims

1. Anticorpo monoclonal humanizado específico para o complexo humano αβTCR/CD3, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas sequências como apresentadas em SEQ ID NO: 7, 12, 13, 15 e 16, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido como apresentada em SEQ ID NO: 14.

2. Anticorpo monoclonal humanizado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada é selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13

3. Anticorpo monoclonal humanizado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada é selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16.

4. Anticorpo monoclonal humanizado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada apresenta a sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 15.

5. Anticorpo monoclonal humanizado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada apresenta a sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 16.

6. Anticorpo monoclonal humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma região constante de origem humana.

7. Anticorpo monoclonal humanizado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma modificação de Fc que reduz a ligação do receptor de FCY.

8. Anticorpo monoclonal humanizado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma região Fc aglicosilada ou modificação delta ab.

9. Anticorpo monoclonal humanizado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um padrão de glicosilação modificado.

10. Anticorpo monoclonal humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para uso na supressão de uma resposta mediada por célula T em um indivíduo.

11. Anticorpo monoclonal humanizado, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a resposta mediada por célula T está envolvida em uma condição selecionada a partir de transplante de tecido, incluindo transplante de órgão sólido e transplante de tecido composto, enxerto de tecido, esclerose múltipla, e diabetes tipo 1.