CN104684930B - 抗αβTCR抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明系关于包含鼠类抗体BMA031的CDR的人源化单克隆抗体，其结合αβTCR.CD3复合物且具有改良的生物学性质。

Description

抗αβTCR抗体
本发明涉及对αβT细胞受体(αβTCR)具有特异性之抗体。特定而言，本发明涉及源自鼠类单克隆抗体BMA031的人源化抗αβTCR抗体及该人源化抗体在免疫抑制疗法中之用途。
介绍
有大量文件证明免疫抑制剂在自身免疫疾病及器官移植疗法中之用途；然而该方法远非最佳。毒性、伺机性感染、细胞因子风暴(cytokine storm)及癌症风险增加在用这些药剂治疗之患者中普遍存在。在此情形下使用生物制剂已一定程度地改良患者结果，但这些副效应仍明显。
就免疫抑制而言，使用针对淋巴细胞之多克隆抗血清是熟知的。然而，抗血清之产生极为费力，其显示在不同批次间有所变化之性质，且可使用多克隆抗血清获得之特异性是有限的。
藉由杂交瘤技术产生单克隆抗体首先由及Milstein(Nature256:495-497(1975))描述。与多克隆抗血清相比，单克隆抗体(mAb)之特异性更高，且具有更一致性质。mAb已最频繁且成功地在临床器官移植中用于免疫抑制疗法。然而，用作治疗自身免疫疾病之免疫抑制剂及用于移植患者之大多数mAb具有宽免疫抑制能力，因此不合意地影响众多免疫细胞之功能，推测这些免疫细胞并非全部参与移植物排斥。
针对T细胞表面受体抗原之小鼠单克隆抗体首先于1979年使用杂交瘤技术产生(Kung等(1979)Science206:347-349)。在由Kung等发现之三种单克隆抗体中，一种抗体命名为莫罗单抗(muromonab)-CD3(OKT3)，其对T细胞之CD3受体具有经界定之特异性，与95％以上外周成熟T细胞反应而不影响未成熟胸腺细胞。OKT3与CD3复合物之结合引起CD3受体之内在化及从外周损失CD3阳性细胞。成功的OKT3治疗与CD3阳性T细胞自约60％迅速下降至小于5％相关。
OKT3已广泛地用于治疗在肾移植后经受急性同种异体移植物排斥之患者(Russell,P.S.、Colvin,R.B.、Cosimi,A.B.(1984)Annu.Rev.Med.35:63及Cosimi,A.B.、Burton,R.C.、Colvin,R.B.等(1981)Transplantation32:535)。而且，使用OKT3及兔补体自供体骨髓清除成熟T细胞以在同种异体骨髓移植中预防急性移植物抗宿主疾病(GVHD)(Prentice,H.G.,Blacklock,H.A.,Janossy,G.等(1982)Lancet1:700及Blacklock,H.A.、Prentice,H.G.、Gilmore,M.J.等(1983)Exp.Hematol.11:37)。尽管OKT3治疗似乎在用于急性白血病之同种异体骨髓移植中预防GVHD是有效的，但在对严重组合免疫缺陷的治疗过程中，用OKT3进行组合体外/体内治疗无法预防GVHD(Hayward,A.R.等(1982)Clin.Lab.Observ.100:665)。用OKT3处理T细胞诱发若干与免疫抑制不一致之反应，包括T细胞活化、免疫介质之产生及T3调节。假定由CD3-mAb(例如，OKT3)识别之T3抗原复合物在T细胞活化期间起关键作用。α/βT淋巴细胞藉助统称为αβT细胞抗原受体(TCR)·CD3复合物之多聚蛋白总体识别肽-MHC配体。此结构由结合抗原之可变αβTCR二聚物及3个不变二聚物(CD3γε、δε及ζζ)构成，这些不变二聚物参与TCR·CD3表面输送、稳定及信号转导。αβT细胞受体(αβTCR)系在大多数(约95％)的T细胞上表达且经由展示于MHC上之抗原的接合在T细胞活化中具有关键作用。其余5％细胞是γδT细胞受体(γδTCR)阳性。γδTCR阳性细胞群体在针对细菌、病毒及真菌来源之伺机性感染进行防御之先天免疫反应中起重要作用。γδT细胞在移植中之移植物排斥中不起作用。因此，靶向αβTCR阳性细胞群体及节约γδTCR阳性群体应允许显著治疗效果，同时维持针对伺机性感染之基线免疫保护。
小鼠IgG2b单克隆抗体BMA031(Borst等(1990年11月)Hum.Immunol.29(3):175-88；EP0403156)对TCRα/β/CD3复合物上之共同决定簇具有特异性，且不结合γ-δTCR。BMA031具有高度免疫抑制性且能经由活化诱导性细胞死亡(AICD)机制诱导经活化T细胞之细胞凋亡(Wesselborg等(1993年5月)J.Immunol.150(10):4338-4345)。其在体外抑制混合淋巴细胞反应且其已在诸多实体器官移植情形中之移植物排斥之预防中以及急性移植物抗宿主疾病(aGVHD)之治疗中显示初步临床效果(Kurrle等(1989年2月)TransplantProc.21(1):1017-1019)。BMA031不接合大多数人类群体中之人类Fcγ受体(FcγR)(约10％的人具有结合小鼠IgG2b同种型之FcγR)。由此，该抗体不会经由T细胞受体交联引起T细胞活化且因此，其不诱导T细胞活化或相关细胞因子释放。就此而言，其概貌(profile)相对于OKT3之概貌是高度优选的。然而，BMA031系鼠类抗体，且由此鉴于其在人类受试者中所引发之人类抗小鼠抗体(HAMA)反应而不适于重复在人类受试者中剂量给药。
已描述BMA031之若干人源化形式(参见，EP0403156；亦参见Shearman等，(1991)J.Immunol.147:4366-4373)。如EP0403156中所述，仅有CDR移植并不能成功地保持抗原结合。一种具有显著框架修饰之克隆EUCIV3成功地结合T细胞；然而，如EP0403156中所述，与αβTCR之结合不如亲代BMA031抗体有效，如藉由流式细胞术竞争测定法所确定的。我们还显示，EuCIV3抑制体外免疫反应之能力与BMA031相比显著降低(参见图2)。此外，EuCIV3最初在仍保持FcγR结合之野生型人类IgG1或IgG4骨架上产生。因此，这些人源化抗体允许T细胞活化、增殖及伴随之细胞因子释放且由此显著不同于BMA031之原有性质。
抗体糖基化的修饰是本领域已知的。例如，已知非糖基化抗体可具有经广泛修饰之功能；参见Boyd等(1996)Mol.Immunol.32:1311-1318。然而，先前尚未描述人源化BMA031之非糖基化形式或具有经修饰糖基化模式之衍生物。
因此，本领域需要抗αβTCR人源化抗体，其改良EUCIV3之结合性质且有利地保持BMA031之免疫抑制性及非T细胞活化性质。
发明内容
在第一方面中，提供人源化单克隆抗体，其包含BMA031之CDR且保持BMA031对其同源抗原之结合亲和力。在第一实施方案中，该人源化抗体包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:7、12或13中所述之CDR及SEQID NO:17中所述之人类IGH3-23框架，其中框架位置6是供体残基；在替代实施方案中，框架位置18是供体残基。视情况，框架位置49和/或69是供体残基。
在第二实施方案中，人源化单克隆抗体包含重链可变区，该重链可变区包含SEQID NO:15或16中所述之CDR及SEQ ID NO:18中所述之人类IGHV1-3*01框架，其中框架位置38、44和/或48中之一或多者是供体残基；在替代实施方案中，框架位置44及48是供体残基。
在第三实施方案中，人源化单克隆抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQID NO:14中所述之CDR及SEQ ID NO:19中所述之人类IGKV3-11*01框架，其中框架位置70和/或71是供体残基。视情况，位置46是供体残基。
根据第一实施方案之抗体之实例包括包含重链可变区和轻链可变区序列的抗体，所述重链可变区选自包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13中所述之序列的重链，所述轻链可变区序列包含SEQ ID NO:14中所述之序列。
第二实施方案之抗体之实施例包括包含重链可变区和轻链可变区序列的抗体，所述重链可变区选自包含SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16中所述之序列之重链，所述轻链可变区序列包含SEQ ID NO:14中所述之序列。根据所述实施方案之人源化抗体是BMA031之人源化形式。其一级结构与人源化抗体EuCIV3之一级结构不同，EuCIV3与BMA031相比与αβTCR之结合有所减少。
在序列表中，藉助注释或加下划线来指示CDR。框架系在CDR以外之所有序列，其系根据“Kabat”编号系统定义且在适用时藉由使用“IMGT”CDR定义来扩展。若不指示改变框架残基来匹配供体序列，则通常应将该残基理解为受体残基。
人源化抗体可包含恒定区。在一个实施方案中，恒定区是人类来源的。
本发明的人源化抗体可进一步藉由Fc工程改造来修饰。免疫球蛋白易于使Fcγ受体交联，此可导致抗T细胞抗体之组成型T细胞活化。为避免Fcγ交联，可(例如藉由产生Fab或Fv片段来)修饰抗体以去除Fc区；然而，经截短的免疫球蛋白缺乏有益效应子功能且展现较短血清半衰期。因此，人源化抗体之Fc区可经修饰以防止Fcγ交联。例示性技术包括(例如通过由N297Q突变修饰Fc区来)产生非糖基化免疫球蛋白。无法结合Fcγ之免疫球蛋白亦由Armour等(1999)Eur.J.Immunol.29:2613-2624描述。实现IgG1之修饰称为Δab修饰，且由Δa突变(其中IgG残基系于位置327、330及331处取代，且IgG2残基系于位置233-236处取代)与Δb突变(其中缺失残基236)之组合组成。在另一实施方案中，根据本发明的抗体之糖基化模式可经修饰。
在一个实施方案中，抗体包含突变S298N、T299A及Y300S中之一或多者。
在实施方案中，抗体包含突变N297Q、S298N、T299A及Y300S中之两者或更多者。例如，提供包含多重突变N297Q/S298N/Y300S、S298N/T299A/Y300S或S298N/Y300S之人源化抗体。
在第二方面中，提供包含BMA031之CDR且保持BMA031之T细胞抑制性质之人源化单克隆抗体。该人源化抗体优选包含具有SEQ ID NO:12、13、15或16中所述之氨基酸序列之重链可变区及包含SEQ ID NO:14中所述之氨基酸序列之轻链可变区。
在第三方面中，提供至少编码根据所述实施方案的前述方面的人源化单克隆抗体的重链可变区的核酸。该核酸可编码人源化抗体的可变区及恒定区。可在不同核酸上或在相同核酸分子上编码重链及轻链。
根据第四方面，提供表达根据前述方面之核酸之细胞。细胞是(例如)培养中适于表达抗体分子之细胞。核酸可包括信号序列和/或其它序列或修饰，这些其它序列或修饰系抗体分子在细胞中之表达和/或抗体分子自细胞之分泌所必需，或对其进行调节。
在又一实施方案中，如上述方面中所述提供人源化抗体，其用于抑制受试者中之T细胞介导的反应。
例如，T细胞介导的反应可参与选自以下之状况：组织移植(tissuetransplantation)(包括实体器官移植及复合性组织移植)、组织移植(tissue grafting)、多发性硬化及1型糖尿病。
此外，另一实施方案提供用于治疗罹患涉及异常T细胞介导的反应之病况之受试者的方法，其包括向有需要之受试者施用治疗有效剂量之根据所述实施方案之抗体。
因此，已产生不诱导细胞因子释放之人源化非活化抗αβTCR抗体，其能选择性调节αβTCR并诱导经活化αβTCR阳性T细胞之细胞凋亡。已经产生这些抗体以供在T细胞介导疾病中用作免疫抑制剂。已通过小鼠抗αβTCR抗体BMA031之人源化及藉由对人源化抗体之Fc工程改造以防止接合Fcγ受体来产生这些抗体。与本领域中可用的BMA031之人源化形式不同，根据所述实施方案之抗体保持BMA031之结合亲和力。此外，如体外驯化(education)测定法中所示，根据所述实施方案的抗体之免疫抑制性质优于BMA031。而且，与现有技术之人源化BMA031抗体不同，根据所述实施方案的抗体不在正常PBMC中诱导细胞因子释放。
根据第五方面，提供包含经修饰Fc之抗体，其中该经修饰Fc包含减少FcγR受体结合之经修饰的糖基化模式，该抗体包含突变S298N、T299A及Y300S中之一或多者。
在一个实施方案中，抗体包含突变N297Q、S298N、T299A及Y300S中之两者或更多者。
在实施方案中，抗体包含多重突变N297Q/S298N/Y300S、S298N/T299A/Y300S或S298N/Y300S。
例如，抗体可为如本发明前述方面中所述之抗体。
根据第六方面，提供多特异性抗体，其至少包含如本发明前述方面中所述第一结合域之重链及对肿瘤特异性抗原具有特异性之第二结合域。
在一个实施方案中，第一结合域包含根据本发明第二方面之重链。
多特异性抗体可包含许多不同构型；在一个实施方案中，其包含抗TCR/CD3scFv及抗肿瘤scFv。
在一个实施方案中，多特异性抗体具有双特异性。
附图简述
图1.BMA031与EuCIV3相比更强地结合αβTCR。
BMA031MoIgG2b、BMA031HuIgG1及EuCIV3HuIgG1抗体与经PE标记之BMA031抗体竞争结合。EuCIV3与BMA031相比效能有所降低。
图2.在体外驯化(IVE)测定法中，EuCIV3之效能低于BMA031。
该曲线显示在生物学测定法中当与亲代BMA031抗体比较时EuCIV3人源化抗体之性能损失。用不同浓度(x轴)之抗αβTCR抗体处理CD8+T细胞且将其与用CMV肽495-503(pp65)脉冲处理之自体树突细胞共培养7天。
图3.在竞争测定法中，HEBE1与BMA031相当地结合αβTCR。
BMA031HuIgG1、HEBE1HuIgG1及EuCIV3HuIgG1抗体与经PE标记之BMA031抗体竞争结合。EuCIV3与BMA031及HEBE1相比效能有所降低。
图4.在体外驯化(IVE)测定法中，HEBE1与EuCIV3之效能相似。
如图2中所述实施IVE测定法。
图5.示意性显示抗αβTCR可变域之多轮诱变。
阴影框中之框架绘示具有某些小鼠残基之FR区。第一列突变中之阴影残基是可用于维持解离速率之小鼠氨基酸。第二列突变中之阴影残基是在CDR区周围在最终种系形成(germlining)过程期间保持之小鼠残基。
图6.最优化人源化抗体与BMA031相比具有改良的解离速率。
藉由流式细胞术测量抗体自T细胞上之αβTCR解离之动力学。BMA031与EuCIV3及HEBE1相比具有更优的解离速率。与BMA031相比，藉由最优化HEBE1之结合域能改良HEBE1.H10之解离速率。
图7.最优化人源化抗体与BMA031相比具有改良的解离速率。
藉由流式细胞术测量抗体自T细胞上之αβTCR解离之动力学。与BMA031相比，藉由最优化HEBE1之结合域能改良HEBE1.H66之解离速率。
图8.在Δab及非糖基化模式二者方面，最优化人源化抗体与BMA031相比具有改良的解离速率。
藉由流式细胞术测量抗体自T细胞上之αβTCR解离之动力学。
图9.HEBE1之最优化使得功能与BMA031等效。
IVE测定法如图4中所述。BMA031抑制CD8+T细胞之驯化，因为其不能以剂量依赖性方式溶解特定靶物。亲代人源化抗体HEBE1之效能不如BMA031且仅能以最高剂量抑制驯化(以第二未经改良人源化Ab HEBE1H13观察到相似结果)。在此测定法中，对人源化抗体HEBE1H10作出其它改良，该抗体之效能与BMA031等效。
图10.抗αβTCR抗体之IVE数据。
HEBE1及GL1BM系列抗体二者与BMA031相比皆显示IVE结果之改良。
图11.来自IVE测定法之抗原阳性细胞，如藉由抗原特异性四聚物结合所测定。
抗原阳性细胞(即，已在IVE测定法内驯化)能结合MHC-四聚物分子。当在已能防止T细胞针对抗原进行驯化之抗体存在下实施IVE测定法时，在测定法结束时能结合MHC-四聚物之细胞较少。
图12.在抗αβTCR抗体OKT3及刺激珠粒存在下PBMC之增殖。
在此比较中在抗αβTCR抗体中未见到OKT3之刺激活性。
图13.在抗αβTCR抗体存在下自PBMC之细胞因子释放。
抗αβTCR抗体之细胞因子释放概貌与藉由BMA031所示之概貌相似。
图14.在IVE测定法中自T细胞之IFN-γ释放。
在体外驯化(IVE)测定法中用不同浓度(参见图2，x轴)之抗αβTCR抗体处理CD8+T细胞且将其与用CMV肽495-503(pp65)实施脉冲处理之自体树突细胞共培养7天。在此测定法中测量IFN-γ释放。
图15.藉由抗αβTCR抗体之活化诱导的细胞凋亡。
藉由抗αβTCR抗体BMA031及HEBE1H66之结合诱导抗原刺激之CD8+T细胞凋亡。HEBE1H66诱导细胞凋亡之能力与BMA031相比增加。
图16.糖基化突变体及非糖基化抗体之分离
考马斯蓝(Coomassie-blue)染色凝胶显示糖基化突变体之表达及纯化
图17.αβTCR抗体突变体与人类FcγRIIIa之结合，其使用Biacore.
使用Biacore来评估与重组人类FcγRIIIa(V158及F158)之结合。
图18.αβTCR抗体突变体与人类FcγRI之结合，其使用Biacore。
使用Biacore来评估与重组人类及FcγRI之结合。
图19.在糖基化突变体抗αβTCR抗体存在下自PBMC之细胞因子释放(第2天)。
抗αβTCR抗体之TNFa、GM-CSF、IFNy及IL10之细胞因子释放概貌与藉由BMA031及H66δAB所示之概貌相似。
图20.在糖基化突变体抗αβTCR抗体存在下自PBMC之细胞因子释放(第2天)。
抗αβTCR抗体之IL6、IL4及IL2之细胞因子释放概貌与藉由BMA031及H66δAB所示之概貌相似。
图21.在糖基化突变体抗αβTCR抗体存在下自PBMC之细胞因子释放(第4天)。
抗αβTCR抗体之TNFa、GM-CSF、IFNy及IL10之细胞因子释放概貌与藉由BMA031及H66δAB所示之概貌相似。
图22.在糖基化突变体抗αβTCR抗体存在下自PBMC之细胞因子释放(第4天)。
抗αβTCR抗体之IL6、IL4及IL2之细胞因子释放概貌与藉由BMA031及H66δAB所示之概貌相似。
图23：TRACER之结合概貌。
双特异性抗体与肿瘤靶细胞及人类T细胞二者之结合概貌，藉由流式细胞术评估。
图24：不同T细胞募集臂(recruitment arm)之细胞毒性活性。
已产生一组人源化BMA031抗体，且已自此组选择展示针对肿瘤抗原表达细胞系之细胞毒性活性之诸多抗体。
图25：不同T细胞募集臂之细胞因子释放概貌。
具有不同T细胞募集臂之一组TRACER显示相似的细胞因子释放概貌。在靶细胞存在下在T细胞活化后检测到大量细胞因子，而在仅未受刺激之人类PBMC存在下，所观察到之细胞因子水平显著较低。
图26：CD52抗体突变体与人类FcγRIIIa之结合，其使用Biacore。
使用Biacore来评估修饰的抗-CD52与重组人类FcγRIIIa(V158)之结合。使用在Fc域包含S298N/Y300S突变的抗-CD52来评估修饰的分子的效应子功能。A:结合CD52肽。B:结合FcγRIIIa(V158)。C:结合小鼠FcRn的对照。
发明详述
除非另有说明，否则本文所用所有技术及科学术语皆具有与本领域的普通技术人员通常所理解之含义相同的含义。可在本发明方法及技术中使用任何与彼等本文所描述方法及材料相似或等效者。本文引用之所有出版物皆通过提述以其整体并入本文中，以达成描述及揭示可结合本发明使用之出版物中所报导的方法、试剂及工具之目的。
除非另有说明，否则本申请案之方法及技术通常系根据本领域熟知且如本说明书通篇引用及讨论之各种一般和较具体的参考文献中所述之常规方法实施。例如，参见Gennaro,A.R.编(1990)Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPublishing公司；Hardman,J.G.、Limbird,L.E.及Gilman,A.G.编(2001)ThePharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill公司；Colowick,S.等编，Methods In Enzymology,Academic Press 公司；Weir,D.M.及Blackwell,C.C.编(1986)Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷，Blackwell ScientificPublications；Maniatis,T.等编(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，第I-III卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.等编(1999)ShortProtocols in Molecular Biology，第4版，John Wiley&Sons；Ream等编(1998)MolecularBiology Techniques:An Intensive Laboratory Course,Academic Press；Newton,C.R.及Graham,A.编(1997)PCR(Introduction to Biotechniques Series)，第2版，Springer-Verlag。
本文所提及之人源化单克隆抗体系由已移植来自非人类抗体之互补决定区(CDR)之人类抗体框架构成之抗体。亦可改变人类受体框架。设计及产生人源化抗体之程序是本领域熟知的，且已描述于(例如)以下文件中：Cabilly等，美国专利第4,816,567号；Cabilly等，欧洲专利申请案0125023；Boss等，美国专利第4,816,397号；Boss等，欧洲专利申请案0120694；Neuberger,M.S.等，WO86/01533；Neuberger,M.S.等，欧洲专利申请案0194276B1；Winter，美国专利第5,225,539号；Winter，欧洲专利申请案0239400；Padlan,E.A.等，欧洲专利申请案0519596。有关抗体、人源化抗体、人类工程改造的抗体及其制备方法之其它细节可参见Kontermann,R.及Dübel,S.编(2001,2010)Antibody Engineering，第2版，Springer-Verlag,New York,NY。
除非另有说明，否则术语“抗体”用于指整个抗体以及此等抗体之抗原结合片段。例如，该术语涵盖四链IgG分子以及抗体片段。
本文所用术语“抗体片段”系指完整全长抗体之部分，例如如下文所进一步描述。
抗体可属于任一类别，例如IgG、IgA或IgM；及任何亚类，例如IgG1或IgG4。不同类别及亚类之免疫球蛋白具有可在不同应用中有利之不同性质。例如，IgG4抗体与Fc受体之结合有所减少。
在本文所述抗体之语境下，特异性意指所主张的抗体能选择性结合其经界定的同源抗原，该抗原系αβTCR.CD3复合物。本发明的抗体结合在细胞上表达之αβTCR.CD3复合物。
人类αβTCR/CD3复合物系在T细胞表面上呈递之T细胞受体复合物。参见Kuhns等，(2006)Immunity24:133-139。鼠类单克隆抗体BMA031靶向此复合物(参见欧洲专利申请案EP0403156；SEQ ID NO:1及2)。
天然免疫球蛋白具有共同核心结构，其中两条相同轻链(约24kD)及两条相同重链(约55或70kD)形成四聚物。各链之氨基末端部分称为可变(V)区且可与各链之其余部分之较保守的恒定(C)区相区别。称为J区之C末端部分系在轻链之可变区(亦称为VL域)内。在重链可变区(亦称为VH域)内除J区外存在D区。免疫球蛋白之多数氨基酸序列变异限定于称为超可变区或互补决定区(CDR)的V区内直接参与抗原结合之3个单独的位置。自氨基末端进行，将这些区分别命名为CDR1、CDR2及CDR3。CDR藉由较保守框架区(FR)保持在适宜位置。自氨基末端进行，将这些区分别命名为FR1、FR2、FR3及FR4。CDR及FR区之位置及编号系统已由Kabat等界定(Kabat,E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,U.S.Government Printing Office(1991)及其可在线查找之更新内容)。另外，CDR区边界已进一步藉由IMGT命名法定义。
根据所述实施方案之抗体之可变区可参见SEQ ID NO:5-7及12-16，且可藉由人源化BMA031获得，亦即，藉由将BMA031之CDR转移至人类框架获得。描述了人源化抗体之两个系列，即HEBE1系列，包含SEQ ID NO:5-7、12及13；及GL1BM系列，包含如SEQ ID NO:8、15及16中所示之重链可变区。在两种情形下，所用轻链可变区系如SEQ ID NO:14(GL1BM VK43)中所示。
所用人类框架系IGH3-23(在HEBE1之情况下)以及IGHV1-3*01及IGKV3-11*01(在GL1BM之情况下)。
恒定区可源自任何人类抗体恒定区。可将可变区基因与恒定区基因在框架内克隆至表达载体中以表达免疫球蛋白重链及轻链。可将此等表达载体转染至抗体产生宿主细胞中用于抗体合成。
人类抗体可变区及恒定区可源自序列数据库。例如，可在IMGT/LIGM数据库中得到免疫球蛋白序列(Giudicelli等，(2006)Nucleic Acids Res.34：(增刊1)：D781-D784)或VBase(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)。
非糖基化抗体可具有经广泛修饰之功能；参见Boyd等(1996)Mol.Immunol.32:1311-1318。本文所提及之“δab”或Δab修饰系如Armour等，(1999)Eur.J.Immunol.29:2613-2624中所述之Fc修饰。用于修饰抗体Fc区之糖基化之技术是本领域已知的，且包括化学、酶促及突变手段，例如，CH2域中之N297位置的突变。用于使抗体基因突变以产生非糖基化IgG分子之技术描述于Tao及Morrison(1989)J.Immunol.143:2595-2601中。
本文所提及之“核酸”包括编码本发明抗体之DNA分子。优选者系适于在宿主细胞中表达抗体基因之表达载体。用于抗体基因表达之表达载体及宿主细胞是本领域已知的；参见，例如，Morrow,K.J.Genetic Engineering&Biotechnology News(2008年6月15日)28(12)，及Backliwal,G.等(2008)Nucleic Acids Res.36(15):e96-e96。
1.抗体
本发明涵盖人源化抗αβTCR抗体之抗原结合片段。抗体片段能结合αβTCR.CD3复合物。其涵盖Fab、Fab'、F(ab')2及F(v)片段、或个别轻链或重链可变区或其部分。片段包括(例如)Fab、Fab'、F(ab')2、Fv及scFv。这些片段缺乏完整抗体之Fc部分，比完整抗体更快速地自循环清除，且可具有较低的非特异性组织结合性。这些片段可使用熟知方法自完整抗体产生，例如藉由用酶诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab')2片段)进行蛋白水解切割。
抗体及片段亦涵盖结合αβTCR.CD3复合物之单链抗体片段(scFv)。scFv包含可操作地连接至抗体轻链可变区(VL)之抗体重链可变区(VH)，其中重链可变区及轻链可变区一起或单独地形成结合αβTCR之结合位点。scFv可包含氨基末端处之VH区及羧基末端处之VL区。或者，scFv可包含氨基末端处之VL区及羧基末端处之VH区。此外，尽管Fv片段之两个域VL及VH系藉由不同的基因编码，但其可使用重组方法藉由合成连接体接合，该合成连接体使其能够作为VL和VH区配对形成单价分子的蛋白单链(称为单链Fv(scFv))。scFv可任选地进一步在重链可变区与轻链可变区之间包含多肽连接体。
抗体及片段亦涵盖如Ward,E.S.等(1989)Nature341:544-546中所述之域抗体(dAb)片段，其系由VH域组成。
抗体及片段亦涵盖重链抗体(HCAb)。据报告，这些抗体仅使用重链可变区形成抗原结合区，此乃因这些功能抗体仅系重链二聚物(称作“重链抗体”或“HCAb”)。因此，抗体及片段可为特异性地结合αβTCR.CD3复合物之重链抗体(HCAb)。
抗体及片段亦涵盖作为对αβTCR.CD3复合物具有特异性之SMIP或结合域免疫球蛋白融合蛋白之抗体。这些构建体系单链多肽，其包含实施抗体效应子功能所必需之融合至免疫球蛋白域之抗原结合域(参见WO2005/017148)。
抗体及片段亦涵盖双链抗体(diabodies)。这些双链抗体系二价抗体，其中VH及VL域在单多肽链上表达，但使用过短而不允许在相同链上之两个域之间配对之连接体。此迫使这些域与另一链之互补域配对且藉此产生两个抗原结合位点(例如，参见WO93/11161)。双链抗体可具有双特异性或单特异性。
抗体或其抗体片段不与除αβTCR.CD3复合物以外之任何靶物交叉反应。
抗体或其片段可经修饰以增加其血清半衰期，例如，藉由添加分子(例如PEG或其它水溶性聚合物，包括多糖聚合物)以增加半衰期。
抗体及其片段可具有双特异性。例如，双特异性抗体可与单抗体(或抗体片段)类似，但具有两个不同抗原结合位点(可变区)。双特异性抗体可藉由各种方法(例如化学技术、“多源杂交瘤(polydoma)”技术或重组DNA技术)产生。双特异性抗体可对至少两个不同表位具有结合特异性，这些表位中之至少一者系αβTCR.CD3复合物。另一特异性可选自任何有用或期望的特异性，包括(例如)对延长体内半衰期之人类血清白蛋白之特异性。
在肿瘤学应用之临床中使用双特异性抗体现已成为现实，其中三功能卡妥索单抗(Catumaxomab)已批准用于恶性腹水之情形，且双特异性抗体兰妥莫单抗(Blinatumomab)现已处于血液恶性病之II期试验中。这些分子共同具有结合T细胞之结合臂及结合肿瘤靶细胞之第二臂，从而导致T细胞介导之肿瘤靶物溶解。这些分子亦共同经由位于细胞表面上之CD3蛋白募集T细胞。经由CD3募集之替代系利用亦在细胞表面上表达之αβT细胞受体(αβTCR)。因此，可使用根据本发明的抗体藉由将对肿瘤相关抗原之特异性与对αβT细胞受体(αβTCR)之特异性组合来产生抗肿瘤抗体。
2.抗体产生
本文所述抗体之可变域之氨基酸序列系如SEQ ID NO:5-7及12-16中所述。抗体产生可藉由任何本领域已知技术实施，包括在转基因生物体，如羊(参见Pollock等(1999)J.lmmunol.Methods231:147-157)、鸡(参见Morrow,K.J.J.(2000)Genet.Eng.News20:1-55)、小鼠(参见Pollock等，见上文)或植物(参见Doran,P.M.(2000)Curr.OpinionBiotechnol.11:199-204,Ma.J.K-C.(1998)Nat.Med.4:601-606,Baez,J.等(2000)BioPharm.13:50-54,Stoger,E.等(2000)Plant Mol.Biol.42:583-590)中。抗体亦可藉由化学合成或藉由在宿主细胞中表达编码抗体之基因来产生。
分离编码抗体之多核苷酸并将其插入可复制的构建体或载体(例如质粒)中以供在宿主细胞中进一步繁殖或表达。本领域可用适于表达根据所述实施方案之人源化免疫球蛋白之构建体或载体(例如，表达载体)。可用多种载体，包括以单拷贝或多拷贝维持于宿主细胞中或变为整合至宿主细胞之染色体中之载体。可将构建体或载体引入合适的宿主细胞中，且可产生表达人源化免疫球蛋白之细胞并维持于培养中。可使用单一载体或多个载体来表达人源化免疫球蛋白。
使用常规程序(例如，寡核苷酸探针)容易分离并测序编码抗体之多核苷酸。可使用之载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微型染色体，其中质粒系典型的实施方案。通常，此等载体进一步包括信号序列、复制起点、一或多个标记物基因、增强子元件、启动子及转录终止序列，其可操作地连接至轻链和/或重链多核苷酸以促进表达。可将编码轻链及重链之多核苷酸插入不同的载体中且同时或依序引入(例如，藉由转化、转染、电穿孔或转导)相同的宿主细胞中，或者若需要，可在此引入之前将重链及轻链二者插入相同载体中。
可提供用于在适宜宿主细胞中表达之启动子。启动子可为组成型或诱导型。例如，启动子能够可操作地连接至编码人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白链之核酸，以使其引导编码多肽的表达。可用原核及真核宿主的多种适宜的启动子。原核启动子包括用于大肠杆菌(E.coli)之lac、tac、T3、T7启动子；3-磷酸甘油酸激酶或其它糖分解酶(例如，烯醇酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶及葡糖激酶)之启动子。真核启动子包括诱导型酵母启动子，例如醇脱氢酶2启动子、异细胞色素C启动子、酸性磷酸酶启动子、金属硫蛋白启动子及负责氮代谢或麦芽糖/半乳糖利用之酶启动子；RNA聚合酶II启动子，包括病毒启动子，例如多瘤病毒启动子、禽痘病毒及腺病毒(例如，腺病毒2)启动子、牛乳头瘤病毒启动子、鸟类肉瘤病毒启动子、巨细胞病毒启动子(特定而言，立即早期基因启动子)、逆转录病毒启动子、肝炎B病毒启动子、肌动蛋白启动子、劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus)(RSV)启动子及早期或晚期猿猴病毒40；及非病毒启动子，例如EF-1α启动子(Mizushima及Nagata(1990)Nucleic Acids Res.18(17):5322)。那些本领域的技术人员将能选择表达人源化抗体或其部分之适当启动子。
若适当，例如，对于在高等真核生物细胞中之表达而言，可包括其它增强子元件以代替彼等发现位于上述启动子中者或包括其它增强子元件以及彼等发现位于上述启动子中者。适宜哺乳动物增强子序列包括来自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、金属硫蛋白及胰岛素之增强子元件。或者，可使用来自真核细胞病毒之增强子元件，例如SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子、杆状病毒增强子或鼠类lgG2a基因座(参见WO04/009823)。尽管此等增强子通常位于载体上启动子上游之位点处，但其亦可位于别处，例如，在未翻译区内或聚腺苷酸化信号下游。可基于与用于表达之宿主细胞之相容性来选择及定位增强子。
另外，载体(例如，表达载体)可包含用于选择带有载体之宿主细胞之可选标记物及(在可复制载体之情况下)复制起点。编码赋予抗生素抗性或抗药性之产物之基因系常见可选标记物且可用于原核细胞(例如，f3-内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性(ampicillinresistance))、Tet基因(四环素抗性)及真核细胞(例如，新霉素(neomycin)(G418或遗传霉素)、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素抗性(hygromycin resistance)基因)。二氢叶酸还原酶标记物基因允许用甲胺蝶呤在多种宿主中进行选择。编码宿主之营养缺陷型标记物之基因产物之基因(例如，LEU2、URA3、HIS3)通常在酵母中用作可选标记物。亦涵盖使用病毒(例如，杆状病毒)或噬菌体载体及能整合至宿主细胞基因组中之载体(例如逆转录病毒载体)。
在真核系统中，聚腺苷酸化及终止信号系可操作地连接至编码本发明抗体之多核苷酸。此等信号通常位于开放阅读框之3'处。在哺乳动物系统中，聚腺苷酸化/终止信号之非限制性实例包括源自生长激素、延长因子1α及病毒(例如，SV40)基因或逆转录病毒长末端重复的那些。在酵母系统中，聚腺苷酸化/终止信号之非限制性实施例包括源自磷酸甘油酸酯激酶(PGK)及醇脱氢酶1(ADH)基因的那些。在原核系统中，通常无需聚腺苷酸化信号，而是通常采用较短且界定较充分之终止子序列。可基于与用于表达之宿主细胞之相容性来选择聚腺苷酸化/终止序列。除上述特征外，可用于提高产率之其它特征亦包括染色质重塑(chromatin remodeling)元件、内含子及宿主细胞特异性密码子修饰。本发明抗体之密码子选择可经修改以适应宿主细胞之密码子偏好，从而增加转录物和/或产物产率(例如，Hoekema,A.等(1987)Mol.Cell Biol.7(8):2914-24)。可基于与用于表达之宿主细胞之相容性来选择密码子。
因此，本发明涉及编码人源化免疫球蛋白或其重链或轻链之分离的核酸分子。本发明亦涉及编码免疫球蛋白及其链之抗原结合部分之分离的核酸分子。
抗体可藉由(例如)在适宜宿主细胞中表达一或多种编码抗体之重组核酸产生。宿主细胞可使用任何适宜方法产生。例如，可将本文所述表达构建体(例如，一或多种载体，例如，哺乳动物细胞表达载体)引入适宜的宿主细胞中，且所得细胞在适于表达构建体或载体之条件下可维持(例如，在培养中、在动物中、在植物中)。宿主细胞可为原核细胞，包括细菌细胞，例如大肠杆菌(例如，菌株DH5aTM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、PerC6(Crucell,Leiden,NL)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和/或其它适宜细菌；真核细胞，例如真菌或酵母细胞(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、曲霉属菌种(Aspergillus sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))或其它低等真核细胞及高等真核细胞，例如来自昆虫的那些(例如，果蝇Schnieder S2细胞、Sf9昆虫细胞)(WO94/126087(O'Connor))、BTI-TN-5B1-4(HighFiveTM)昆虫细胞(Invitrogen)、哺乳动物细胞(例如，COS细胞，例如COS-1(ATCC登录号CRL-1650)及COS-7(ATCC登录号CRL-1651)、CHO(例如，ATCC登录号CRL-9096)、CHO DG44(Urlaub,G.及Chasin,L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77(7):4216-4220)、293(ATCC登录号CRL-1573)、HeLa(ATCC登录号CCL-2)、CVI(ATCC登录号CCL-70)、WOP(Dailey,L.等(1985)J.Virol.,54:739-749)、3T3、293T(Pear,W.S.,等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:8392-8396)、NSO细胞、SP2/0细胞、HuT78细胞等等；或植物细胞(例如，烟草细胞、浮萍(lemna)(青萍(duckweed))细胞及藻类细胞)。例如，参见Ausubel,F.M.等编Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and John Wiley&Sons公司(1993)。在一些实施方案中，宿主细胞并非多细胞生物体(例如，植物或动物)之部分，例如，其系分离的宿主细胞或系细胞培养物之一部分。
可在旋转烧瓶、振荡烧瓶、滚瓶、波式反应器(例如，System1000，来自wavebiotech.com)或中空纤维系统中培养宿主细胞，但对于大规模生产而言，优选尤其对于悬浮培养而言使用搅拌槽反应器或袋反应器(例如，Wave Biotech,Somerset,NewJersey USA)。搅拌槽反应器可适于使用(例如)喷布器、挡板或低剪切叶轮通气。对于鼓泡塔及气升式反应器而言，可使用利用空气泡或氧气泡直接通气。倘在无血清培养基中培养宿主细胞，则可用细胞保护剂，例如普流尼克F-68(pluronic F-68)补充培养基以帮助防止细胞因通气过程而受到损害。依赖于宿主细胞特性，可使用微载体作为锚定依赖性细胞系之生长基质，或这些细胞可适于悬浮培养。可利用多种操作模式来培养宿主细胞，尤其脊椎动物宿主细胞，这些模式系(例如)分批、补料分批、重复分批处理(参见Drapeau等(1994)Cytotechnology15:103-109)、延长的分批过程或灌注培养。尽管可在含血清培养基(此等培养基包含胎牛血清(FCS))中培养经重组转化的哺乳动物宿主细胞，但优选在无血清培养基(例如Keen等(1995)Cytotechnology17:153-163中所揭示)或商业上可得到的培养基，如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex NJ,USA)中培养此等宿主细胞，若需要，在这些无血清培养基或商业上可得到的培养基中补充能源(例如葡萄糖)及合成生长因子(例如重组胰岛素)。宿主细胞之无血清培养可能要求彼等细胞适于在无血清条件下生长。一种适应方法系在含血清培养基中培养此等宿主细胞且重复地将80％培养基交换为无血清培养基，以使宿主细胞学会适应无血清条件(例如，参见Scharfenberg,K.等(1995)Animal CellTechnology:Developments Towards the21st Century(Beuvery,E.C.等编)，第619-623页，Kluwer Academic publishers)。
可使所述实施方案之抗体分泌至培养基中且使用多种技术自其回收并纯化以提供适于期望用途之纯化程度。例如，当与包含治疗性抗体之培养基比较时，治疗性抗体用于治疗人类患者之用途通常要求至少95％纯度(如藉由还原性SDS-PAGE所确定的)，更通常为98％或99％纯度。在第一情形下，可使用离心、之后上清液之澄清步骤使用(例如，微滤、超滤和/或深层过滤)去除来自培养基之细胞碎片。或者，可藉由微滤、超滤或深层过滤收获抗体而不预先离心。可利用多种其它技术，例如透析及凝胶电泳及层析技术，例如羟基磷石灰(HA)、亲和层析(任选地涉及亲和标记系统，例如多组胺酸)和/或疏水相互作用层析(HIC)(参见US5,429,746)。在一个实施方案中，在各种澄清步骤后，使用蛋白质A或G亲和层析、之后其它层析步骤(例如离子交换和/或HA层析、阴离子或阳离子交换、大小排阻层析及硫酸铵沉淀)来捕获抗体。亦可采用各种病毒去除步骤(例如，使用例如DV-20过滤器之纳米过滤)。在这些各种步骤后，提供包含至少10mg/ml或更大(例如，100mg/ml或更大)的本发明抗体之经纯化的制剂且因此，形成本发明之另一实施方案。可藉由超速离心产生至100mg/ml或更大之浓度。此等制剂基本上不含本发明抗体之聚集形式。
细菌系统尤其适于表达抗体片段。此等片段系位于细胞内或周质内。可根据本领域的技术人员已知之方法提取不溶性周质蛋白并使其重折叠以形成活性蛋白，参见Sanchez等(1999)J.Biotechnol.72:13-20；Cupit,P.M.等(1999)Lett.Appl.Microbiol.29:273-277。
本发明亦系关于包含本发明核酸(例如，载体，例如，表达载体)之细胞。例如，可藉由适于所选宿主细胞之方法(例如，转化、转染、电穿孔、感染)将编码所述实施方案之人源化免疫球蛋白之重链及轻链之核酸(即，一或多种核酸)或包含此(等)核酸之构建体(即，一或多种构建体，例如，一或多种载体)引入适宜宿主细胞中，其中核酸系或变为可操作地连接至一或多个表达控制元件(例如，在载体中、在藉由细胞中之过程产生之构建体中、整合至宿主细胞基因组中)。宿主细胞可在适于表达之条件下(例如，在诱导子、补充有适当盐、生长因子、抗生素、营养补充剂等之适宜培养基存在下)维持，藉此产生经编码多肽。若需要，则可自(例如)宿主细胞、培养基或乳分离经编码的人源化抗体。此方法涵盖在转基因动物或植物(例如，烟草)之宿主细胞(例如，乳腺细胞)中之表达(例如，参见WO92/03918)。
3.治疗性应用
在保证免疫抑制和/或发生自身免疫病况之诸多情形下，T细胞活性之抑制系合意的。因此，指示在涉及不适当或不期望免疫反应之疾病(例如发炎、自身免疫及涉及此等机制之其它病况)之治疗中靶向αβTCR.CD3复合物。在一个实施方案中，此疾病或病症系自身免疫和/或炎性疾病。此等自身免疫和/或炎性疾病之实例系全身性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)及炎性肠病(IBD)(包括溃疡性结肠炎(UC)及克罗恩氏病(Crohn's disease)(CD))、多发性硬化(MS)、硬皮病及1型糖尿病(T1D)；及其它疾病及病症，例如PV(寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris))、牛皮癣、特应性皮炎、乳糜泻、慢性阻塞性肺病、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、格雷夫斯氏病(Graves'disease)(甲状腺)、斯耶格伦综合征(Sjogren's syndrome)、吉兰-巴雷综合征(Guillain-barré syndrome)、古德帕斯丘综合征(Goodpasture's syndrome)、艾迪森氏病(Addison's disease)、韦格纳肉芽肿(Wegener's granulomatosis)、原发性胆道硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛、雷诺现象(Raynaud's phenomenon)、颞动脉炎、巨细胞动脉炎、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、结节性多动脉炎、贝西氏病(behcet's disease)、原发性胆汁性肝硬化、葡萄膜炎、心肌炎、风湿热、强直性脊柱炎、肾丝球肾炎、类肉瘤病、皮肌炎、重症肌无力、多肌炎、斑秃及白斑。
在一个实施方案中，此疾病或病症系SLE、RA或IBD。在一个实施方案中，此疾病或病症系MS。
在另一实施方案中，使用所述实施方案之抗体藉由对个体实施免疫抑制来辅助移植。此应用减轻移植物抗宿主疾病。关于对移植物抗宿主疾病之现有治疗之说明，例如，参见Svennilson,Bone Marrow Transplantation(2005)35:S65-S67及其中所引用之参考文献。有利地，本发明抗体可与其它可用疗法组合使用。
就自身免疫疾病之治疗而言，组合疗法可包括施用本发明抗体以及药剂，该药剂连同抗体包含预防或治疗此等自身免疫疾病之有效量。倘若该自身免疫疾病系1型糖尿病，则组合疗法可涵盖一或多种促进胰腺β细胞生长或增强β细胞移植之药剂，例如β细胞生长或存活因子或免疫调节抗体。倘若该自身免疫疾病系类风湿性关节炎，则该组合疗法可涵盖以下中之一或多者：甲胺蝶呤、抗TNF-β抗体、TNF-β受体-Ig融合蛋白、抗IL-15或抗IL-21抗体、非甾体抗炎药(NSAID)或疾病调节抗风湿药物(DMARD)。例如，另一药剂可为生物药剂，例如抗TNF剂(例如，英利昔单抗(infliximab)(类克及阿达木单抗(adalimumab)或利妥昔单抗(rituximab)倘若该自身免疫疾病系造血移植排斥，则可施用造血生长因子(例如红细胞生成素、G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-11、血小板生成素等)或抗微生物剂(例如抗生素、抗病毒剂、抗真菌药物)。倘若该自身免疫疾病系牛皮癣，则另一药剂可为以下中之一或多者：焦油及其衍生物、光疗剂、皮质类固醇、环孢菌素A、维生素D类似物、甲胺蝶呤、p38促细胞分裂剂活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂以及生物药剂(例如抗TNF剂及倘若该自身免疫疾病系炎性肠病(IBD)(例如，克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)，则另一药剂可为以下中之一或多者：氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫调节剂、抗生素或生物药剂(例如类克及
组合治疗可以本领域技术人员认为需要或便利之任何方式实施，且出于本说明书之目的，预计不限制所欲组合使用化合物之顺序、量、重复性或相对量。因此，可将所述实施方案抗体调配成药物组合物用于疗法中。
4.药物组合物
在优选实施方案中，提供包含本发明抗体或一或多种可藉由如本发明先前方面中所界定之分析方法鉴别之配体的药物组合物。配体可为免疫球蛋白、肽、核酸或小分子，如本文所述。其在下文论述中称作“化合物”。
本发明药物组合物系包含一或多种能作为活性成份调节T细胞活性之化合物的标的组合物。化合物系呈任何医药上可接受之盐形式，或例如，若适当，则呈类似物形式、游离碱形式、互变异构物形式、对映异构物形式、外消旋异构物形式或其组合。当以取决于特定情形之量施用时，预计包含本发明活性成份之药物组合物之活性成份展现(例如)治疗移植物抗宿主疾病之治疗活性。
在另一实施方案中，本发明之一或多种化合物可与任一本领域认可之已知适于治疗特定适应症之化合物组合用于治疗任一上述病况。因此，本发明之一或多种化合物可与一或多种本领域认可之已知适于治疗上述适应症之化合物组合，以使得可将方便的单一组合物施用于受试者。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。
例如，可每日施用若干分开剂量或者该剂量可依照治疗情形之紧急程度所示按比例减少。
活性成份可以便利方式施用，例如藉由经口、静脉内(若溶于水)、肌内、皮下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入(例如，使用缓释分子)。
依赖于施用途径，活性成份可能需要以材料涂覆以保护这些成份免受酶、酸及可使该成份失活之其它天然条件之作用。
为藉由除胃肠外施用以外之手段施用活性成份，其将藉由防止其失活之材料涂覆或与该材料一起施用。例如，活性成份可在佐剂中施用，与酶抑制剂共施用或在脂质体中施用。佐剂系以其最宽泛含义使用且包括任何免疫刺激化合物，例如干扰素。本文所涵盖佐剂包括间苯二酚；非离子型表面活性剂，例如聚氧乙烯油基醚及正十六基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰腺胰蛋白酶。
脂质体包括水包油包水型CGF乳液以及常规脂质体。
活性成份亦可经胃肠外或腹膜内施用。
分散液亦可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中及在油中制备。在普通储存及使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适于注射使用之医药形式包括无菌水溶液(若溶于水)或分散液及用于实时制备无菌可注射溶液或分散液之无菌粉末。在所有情况下，该形式必须无菌且其流动程度必须使其具有易注射性。其必须在制造及储存条件下稳定且必须针对诸如细菌及真菌等微生物之污染作用进行防腐。载剂可为溶剂或分散液介质，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液体聚乙二醇及诸如此类)、其适宜混合物及植物油。可藉由(例如)使用诸如卵磷脂等包衣、藉由维持所需粒径(在分散液之情况下)以及藉由使用表面活性剂维持适当的流动性。
可藉由各种抗细菌剂或抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸、氯丁醇、苯酚、山梨酸、thirmerosal(硫柳汞)或诸如此类)来防止微生物之作用。在某些情形中，其优选可包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可注射组合物之延长吸收可藉由使用延迟吸收之试剂组合物(例如，单硬脂酸铝及明胶)来达成。
藉由在适当溶剂中以所需量并入活性成份与(视需要)上文所列举之若干其它成份、之后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般来说，藉由将经灭菌活性成份并入无菌运载体中来制备分散液，该运载体含有基本分散介质及来自彼等上文所列举成份之所需其它成份。在用于制备无菌可注射溶液之无菌粉末之情况下，优选制备方法系真空干燥及冷冻干燥技术，其可自预先经无菌过滤之溶液产生活性成份与任一额外期望成份之粉末。
各种其它材料可作为包衣存在或其存在可以其它方式改进剂量单元之物理形式。当然，在制备任何剂量单元形式中所用任一材料应具药用纯度且所采用之量应基本上无毒。另外，可将活性成份并入缓释制剂及调配物中。
本文所用“医药上可接受之载剂和/或稀释剂”包括任何及全部溶剂、分散介质、涂覆物、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂、及诸如此类。此等医药活性物质之介质及试剂之使用是本领域所熟知的。除任何与活性成份不相容之常规介质或试剂之外，本发明涵盖其于治疗组合物中之使用。亦可将补充性活性成份并入组合物中。
以剂量单元形式来调配胃肠外组合物尤其有利于方便施用及达成剂量一致性。本文所用剂量单元形式系指适宜作为单位剂量供欲受治疗哺乳动物个体使用之物理离散单元；各单元含有经计算可产生期望治疗效果的预定量活性材料与所需医药载剂。本发明新颖剂量单位形式之规格取决于且直接依赖于以下因素：(a)活性材料之独特特性及欲达成之特定治疗效果，及(b)本领域调配此活性材料以治疗具生物体健康受损之患病状态之活受试者之疾病的固有限制条件。
将主要活性成份以有效量与医药上可接受之适宜载剂以剂量单元形式调配以供便利且有效地施用。在含有补充性活性成份之组合物之情况下，参照这些成份之惯用施用剂量及方式来确定给药。
为有助于将肽化合物(包括抗体)递送至细胞，肽可经修饰以改良其穿过细胞膜之能力。例如，US5,149,782揭示使用融合肽、离子通道形成肽、膜肽、长链脂肪酸及其它膜掺合剂以增加跨细胞膜之蛋白质输送。这些及其它方法亦描述于WO97/37016及US5,108,921中，其以引用方式并入本文中。
在又一方面中提供上文所定义之本发明活性成份，其单独或与本领域认可之已知适于治疗特定适应症之化合物组合用于治疗疾病。因此，提供本发明活性成份之用途，其用于制造用以治疗与异常免疫反应相关之疾病之药剂。
此外，提供治疗与异常免疫反应相关之病况之方法，其包括向个体施用治疗有效量之可使用如上文所述分析方法鉴别之配体。
仅出于说明的目的，在以下实施例中进一步描述本发明。
比较实施例1
EuCIV3之结合及生物学活性比BMA031降低
已使用流式细胞术显示，EuCIV3在T细胞结合性方面劣于BMA031(图1)。在此竞争测定法中，在固定浓度之直接经藻红素标记之MoIgG2b-BMA031(鼠类竞争剂)及增加浓度之抗αβTCR抗体存在下，在冰上温育T细胞。在20分钟温育后，洗涤细胞且藉由流式细胞术检测结合表面之直接经藻红素标记之MoIgG2b-BMA031。BMA031HuIgG1嵌合抗体之竞争力远比EuCIV3有效得多。
为评估其在体内抑制T细胞活性之能力，在体外驯化(IVE)测定法中用不同浓度(参见图2，x轴)之抗αβTCR抗体处理CD8+T细胞且将其与用CMV肽495-503(pp65)实施脉冲处理之自体树突细胞(DC)共培养7天。
自HemaCare公司，Van Nuys,CA获得来自HLA-A2+个体之正常供体之血液分离术(aphaeresis)产物。藉由于Ficoll(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上离心来分离PBMC。使用磁珠(Invitrogen,Carlsbad,California)根据制造商说明书分离CD8+T细胞。为产生自体未成熟树突细胞，将PBMC重悬于RPMI1640/5％人类AB血清(Sigma)中，平铺于三颈烧瓶(triple flask)(Corning)中且在37℃/5％CO2下温育2小时以上。然后用PBS冲洗贴壁(adherent)单核细胞且在补充有GM-CSF(Immunex,Seattle,WA)及IL-4(PeproTech,RockyHill,NJ)之RPMI1640/5％人类AB血清中培养6天。在建立T细胞/DC共培养物之前，用肽(10μg/ml)对DC实施4小时脉冲处理且随后使其成熟。藉由添加50ng/ml TNF-α、25ng/ml IL-1β、10ng/ml IL-6、500ng/ml PGE-2(PeproTech,Rocky Hill,NJ)产生成熟树突细胞且将树突细胞再培养24小时。然后以10:1之T:DC比率将经肽脉冲处理之DC添加至先前经分离之CD8+T细胞中。立即用添加至培养物中之IL-2(100IU/ml)补料至培养物。在第4天用IL-2(100IU/ml)补充培养物。在第7天于铬释放测定法中分析本体培养物(bulk culture)之肽反应性。
图2中之图形显示来自铬释放测定法之溶解数据，其中未经处理之T细胞经pp65肽成功地驯化且能溶解>50％之特定靶物。BMA031抑制这些T细胞之驯化，此乃因其不能以剂量依赖性方式溶解特定靶物。人源化抗体EuCIV3之效能低于BMA031且仅能以最高剂量抑制驯化。
实施例2
BMA031嵌合抗体之Fc工程改造
体外概貌
已在一组测定法中评估BMA031之体外概貌。表1显示BMA031之体外概貌。在这些测定法中比较BMA031与OKT3。
在PBMC增殖测定法中，将人类PBMC与增加浓度之治疗性抗体一起培养72小时，添加3H-胸苷并在18小时后收获细胞。
对于T细胞耗竭/细胞因子释放测定法而言，将人类PBMC与增加浓度之治疗性抗体一起培养且每天分析细胞计数及活力(Vi-Cell,Beckman Coulter)直至第7天。亦收获细胞上清液，在-20℃储存且在8重细胞因子组(Bio-Rad)上分析。
BMA031不诱导：(i)PBMC增殖；(ii)T细胞耗竭；(iii)CD25表达；或(iv)细胞因子释放。相比之下，OKT3会诱导全部上述效应。BMA031及OKT3能在体外驯化(IVE)测定法中阻断针对肽之CD8+细胞驯化且亦能阻断混合的淋巴细胞反应(MLR)。BMA031亦诱导经活化T细胞之细胞凋亡(活化诱导性细胞死亡；AICD)。
与BMA031不同，BMA031之具有野生型人类IgG1恒定区之嵌合形式(HuIgG1)具有与OKT3相当之体外概貌(表1)。我们假定，FcγR之参与对于HuIgG1BMA031与BMA031MoIgG2b相比体外概貌之此变化至关重要。因此，我们制备BMA031HuIgG1之F(ab')2片段且发现这些片段恢复BMA031MoIgG2b之概貌。藉由Fc工程改造我们并入了修饰，这些修饰在突变中去除FcγR结合(称为”δab”)(Armour等(1999)Eur.J.Immunol.,29:2613-2624)及产生HuIgG4之非糖基化形式(N297Q)。HuIgG1δab及HuIgG4agly抗αβTCR抗体具有与BMA031MoIgG2b相同之体外概貌(表1)。
表1
实施例3
具有经改良结合之人源化抗体之构建
已产生BMA031之人源化形式之两个系列，称为HEBE1系列(IGH3-23)及GL1BM系列(IGHV1-3*01&IGKV3-11*01；见VBase,vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)。将BMA031重链CDR区初始移植至IGH3-23框架区(参见SEQ ID NO:5及6)上改良了抗体与αβTCR之结合，如藉由竞争测定法所显示(图3)；参见实施例2。然而，此改良并不转化为抗体之功能改良，如藉由IVE测定法所显示(图4)。
实施例4
人源化抗体之最优化
人源化抗体之最优化策略系基于诱变及功能筛选。以小鼠至人类之可变域之4个框架区中每一者中一者中之氨基酸残基的块变化(block change)开始最优化。鉴别GL1BMHC、GL1BM LC及HEBE1HC系列中每一者中之关键框架区。根据此鉴别，将彼等框架区内之个别残基自原有小鼠序列突变成人类种系残基。发现与小鼠序列之一致性对保持抗体之结合性质至关重要之框架残基保持作为小鼠残基。否则，改变框架残基以匹配人类种系氨基酸序列。此在序列内持续进行直至鉴别最低数目之保持抗体之原有结合性质之小鼠残基。参见图5。已显示，来自这些系列之若干抗体与BMA031相比具有经改良之结合，如藉由T细胞之抗体解离速率所测定(图6、7及8)。
对于解离速率测定法而言，在室温下将105个人类T细胞在含有2μg/ml表示为HuIgG1-Δab之抗体之100μL完全生长培养基中温育30-60分钟。然后洗涤细胞，将其重悬于50μL完全生长培养基中并添加20μg/ml HEBE1F(ab')2以防止所解离候选抗体之再结合。在此时程测定法结束时，将细胞固定且藉由流式细胞术经由PE标记之山羊抗HuIgG二级抗体测量结合细胞表面之残留HuIgG1-Δab抗体的水平。
亦已显示，在IVE(图9、10及11)中及MLR测定法中，抗体在防止免疫反应方面有活性。在IVE测定法中，使用四聚物结合作为IVE之定量量度。藉由用对驯化肽具有特异性之直接标记之四聚物将T细胞染色来确定具有抗原特异性之细胞之百分比。简言之，在第7天，用四聚物藉由标准流式细胞术染色方案对来自IVE之CD8+T细胞染色且在BD FACSCalibur上分析。另外，人源化抗体与BMA031相比显示对PBMC及细胞因子释放具有相当的增殖潜力水平(图12及13)。
这些抗体亦在IVE测定法中显示抑制从T细胞释放IFNγ之能力(图14)。另外，我们已显示，诸多这些抗体与BMA031相比诱发经活化αβTCR-阳性T细胞之活化诱导性细胞死亡(AICD)之能力有所改良(图15)。在AICD测定法中，将抗原特异性CD8+T细胞与治疗性抗体一起培养。在24小时、48小时及72小时时，对细胞实施细胞凋亡标记物膜联蛋白V及7-AAD染色。亦用四聚物对细胞染色以追踪对抗原特异性T细胞具有效应之细胞凋亡。
总之，我们已作出对于将BMA031人源化之先前尝试之显著改良。经由此方法发现解离速率与BMA031相比有所改良之抗体系意外发现。此对结合之改良与对抑制免疫反应之效能之改良相关，如在IVE测定法中所显示的(图10及11)。抗体对αβTCR之特异性、藉由人源化降低之免疫原性、经活化T细胞之特异性细胞凋亡及T细胞活化在抗体结合后之缺乏使得这些抗体成为用于治疗目的之优异候选物。
实施例5
效应子功能降低之Fc突变体之产生
设计并产生经工程改造的Fc变体，其中紧邻天然存在的Asn297位点于氨基酸Ser298位置处引入糖基化位点。保持或藉由突变敲除Asn297处之糖基化。突变及糖基化结果描述于表2中。
表2
藉由Quikchange使用pENTR_LIC_IgG1模板对αβT细胞受体抗体克隆66号实施突变。利用LIC引物扩增HEBE1Δab IgG166号之VH域，且藉由LIC将其克隆至经突变或野生型pENTR_LIC_IgG1中以产生全长Ab突变体或野生型。利用DraIII/XhoI双消化验证亚克隆，从而在成功的克隆中产生约1250bp插入。然后经由Gateway克隆将彼等全长突变体克隆至表达载体pCEP4(-E+I)Dest中。然后藉由DNA测序确认突变。
使用两种构建体，即pCEP4中之HEBE1Agly IgG4及HEBE1Δab IgG1作为HEK293转染中之对照。
在三颈烧瓶中将突变体、野生型及对照(Agly及Δab)转染至HEK293-EBNA细胞中以供表达。在多通道蠕动泵上利用1ml HiTrap蛋白质A柱(GE)自160ml条件化培养基(CM)纯化蛋白质。在4-20％Tris-甘胺酸还原性及非还原性SDS-PAGE上分析5微克各上清液(参见图16)。非糖基化突变体(N297Q、T299A及Agly对照)之重链较低(黑色箭头)，此与这些抗体中之聚糖损失一致。然而，经工程改造的糖基化抗体(NSY、STY、SY、Δab及野生型对照，红色箭头)之重链以与野生型对照相同之方式迁移。此结果与298位置处之经工程改造糖基化位点之预期结果一致。SEC-HPLC分析指示，全部突变体皆表达为单体。
藉由LC-MS分析糖基化
在37℃使经工程改造的H66IgG1Fc变体经20mM DTT部分地还原30分钟。藉由毛细管LC/MS在与QSTAR qq TOF混合系统(Applied Biosystem)耦合之Agilent1100毛细管HPLC系统上分析试样。使用在Analyst QS1.1(Applied Bisoystem)中具有基线校正及计算机建模之Bayesian蛋白质重构体进行数据分析。对于突变体S298N/T299A/Y300S H66抗体前导物(lead)而言，在氨基酸298处观察到一个糖基化位点，其中检测到双触角及三触角复合型聚糖作为主要物质，以及G0F、G1F及G2F。
αβTCR抗体突变体与人类FcγRIIIa及FcγRI之结合，其中使用Biacore
使用Biacore来评估与重组人类FcγRIIIa(V158及F158)及FcγRI之结合。经由Biacore提供之标准胺偶合程序利用抗HPC4抗体固定CM5芯片之全部4个流动池(flowcell)。在10mM乙酸钠(pH5.0)中将抗HPC4抗体稀释至50μg/mL以供偶合反应且以5μL/分钟注射25分钟。将约12,000RU抗体固定至芯片表面。在具有1mM CaCl2之结合缓冲液HBS-P中将重组人类FcγRIIIa-V158及FcγRIIIa-F158稀释至0.6μg/mL，且以5μL/分钟分别注射至流动池2及4中，并持续3分钟，以将300-400RU受体捕获至抗HPC4芯片。为区别低结合剂，将为此测定法中通常使用之rhFcγRIIIa三倍之rhFcγRIIIa捕获至抗HPC4表面。使用流动池1及3作为参照对照。在结合缓冲液中将各抗体稀释至200nM且注射于全部4个流动池上并持续4分钟，之后在缓冲液中解离5分钟。利用存于HBS-EP缓冲液中之10mM EDTA以20μL/分钟使表面再生3分钟。
结果显示于图17中。
亦使用Biacore来比较FcγRI结合。使用Zeba脱盐柱将抗四His抗体缓冲交换为10mM乙酸钠(pH4.0)且在乙酸盐缓冲液中稀释至25μg/mL以供胺偶合。在以5μL/分钟20分钟注射后，用约9000RU抗四His抗体固定CM5芯片之两个流动池。与先前实验相似，将10倍FcγRI捕获至抗四His表面以比较弱结合剂。在HBS-EP结合缓冲液中将重组人类FcγRI稀释10μg/mL且以5μL/分钟注射至流动池2并持续1分钟以将约1000RU受体捕获至抗四His芯片。以30μL/分钟将单浓度抗体(100nM)注射于捕获受体及对照表面上并持续3分钟。将解离监测3分钟。以20μL/分钟经30秒两次注射10mM甘氨酸(pH2.5)使表面再生。
结果显示于图18中。
结果表明，糖改造突变体与FcγRIIIa或FcγRI之结合极少。特定而言，H66S298N/T299A/Y300S几乎完全不与两种受体结合。选择此突变体作为前导物进行详细表征。
使用圆二色性(CD)表征稳定性
藉由Far-UV CD热熔化实验监测S298N/T299A/Y300S抗体突变体之稳定性，其中监测随温度增加(其最终导致抗体解折叠)216nm及222nm下之CD信号。在Jasco815分光光度计上在路径长度为10mm之石英小杯(Hellma公司)中以约0.5mg/mL之蛋白质浓度(于PBS缓冲液中)收集CD谱。藉由热电帕耳帖(peltier)(Jasco model AWC100)控制温度且使其以1℃/分钟之速率自25℃线性变化至89℃。收集CD信号及HT电压二者。自210-260nm获得数据，其中数据间隔为0.5nm且温度间隔为1℃。扫描速度系50nm/分钟且数据间距(data pitch)为0.5nm。使用2.5nm之带宽与中等灵感度设定。针对各试样实施4次重复扫描。结果表明，δABH66与S298N/T299A/Y300S H66突变体二者皆显示相似热性质且具有约63℃之相同降解起始温度。换言之，突变体与δAB形式一样稳定。
参见图18。
实施例6
Fc-工程改造突变体之功能分析
如实施例2中所述实施PBMC增殖及细胞因子释放测定法。将正常供体PBMC解冻且在以下条件(皆在含有补体之培养基中)下处理：
·未经处理
·BMA031、moIgG2b10μg/ml
·OKT3、moIgG2a10μg/ml
·H66、huIgG1δAB10μg/ml、1μg/ml及0.1μg/ml
·H66、huIgG1S298N/T299A/Y30010μg/ml、1μg/ml及0.1μg/ml
在第2天(D2)及第4天(D4)收获细胞因子以供Bioplex分析(IL2、IL4、IL6、IL8、IL10、GM-CSF、IFNg、TNFa)。在D4对细胞染色以供CD4、CD8、CD25及abTCR表达。
显示于图19-22中之结果显示，在全部基于细胞之测定法中，H66S298N/T299A/Y300S之行为与H66δAB相似，从而显示藉由CD25表达之最小T细胞活化；结合abTCR，但与δAB之动力学略有不同；在D2与D4时间点之最小细胞因子释放；就若干细胞因子而言，在D4，突变体实际上优于δAB。
因此，S298N/T299A/Y300S突变体与δAB突变一样有效地消除效应子功能。
实施例7
双特异性抗体
构建双特异性分子，其系由两个经由短氨基酸连接体连接在一起之单链抗体(scFv)构成，其中一个臂能结合肿瘤靶物且另一者能经由αβTCR结合T细胞。双特异性分子在本文中称作TRACER(T细胞受体活化细胞毒性EnableR)。
制备以下人源化抗αβTCR scFv构建体：
GL1BMΔSxVK1
GL1BMΔSxVK27
GL1BMΔSVH11xVK1
GL1BMΔSVH15xVK1
GL1BMΔSVH28xVK43
GL1BMΔSVH31xVK43
重链及轻链之序列系如SEQ ID no14-16及20-24中所述。
对这些分子之表征包含对与肿瘤靶物及T细胞之结合之评估、体外细胞毒性活性及在肿瘤靶细胞存在及不存在下之细胞因子释放概貌。
藉由流式细胞术评估之结合概貌显示，抗αβTCR双特异性抗体能结合肿瘤靶细胞系与T细胞二者。参见图23。
藉由流式细胞术测量之体外细胞毒性活性显示，经由抗αβTCR双特异性抗体募集之T细胞能诱导T细胞介导之溶解。参见图24。
细胞因子释放概貌分析已显示，在结合双特异性抗体之两个臂后，自T细胞释放高水平的TH1/TH2细胞因子，此在靶细胞不存在下观察不到。总之，此作用机制显示与文献中所述基于CD3之双特异性相似之概貌。
实施例8
抗-CD52抗体中经工程改造的Fc变体的制备和表征
为了测试本申请所述的Fc突变的适用性的普遍性，还在抗-CD52抗体(克隆2C3)中制备了糖基化突变体S298N/Y300S以察看具有FcγRIII结合损失的效应子功能调节是否适用于不同的抗体骨架。通过快速变化诱变制备S298N/Y300S2C3变体DNA。在HEK293瞬时转染之后，从条件培养基纯化蛋白质。平行地产生抗-CD522C3野生型抗体作为对照。使用Biacore以表征经纯化的抗体的结合性质、抗原-结合和FcγRIII(参见图26)。
S298N/Y300S2C3变体紧密结合CD52肽，而且结合传感图(binding sensorgram)与野生型对照是不能区分的，这说明Fc域上的此突变不影响其抗原结合(图26A)。
为了测定Fc效应子功能，将FcγRIII受体(Val158)用于结合研究。将突变体和野生型对照抗体稀释至200nM和注射至HPC4-标签捕获的FcγRIIIa。FcγRIII结合对于S298N/Y300S突变体是几乎不可检出的，这指示此变体的效应子功能的损失(图26B)。此突变体还以与野生型抗体对照相同的亲和性结合FcRn受体，因此我们预期其循环半衰期或其它药物动力学性质方面无变化(参见图26C)。我们作出如下结论：S298N/Y300S突变一般地对于抗体是可适用的，从而降低或消除不期望的Fc效应子功能，例如，通过人Fcγ受体的接合来进行。

Claims (14)

1.一种对人类αβTCR/CD3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14中所述氨基酸序列。
2.根据权利要求1的人源化单克隆抗体，其中所述重链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13。
3.根据权利要求1的人源化单克隆抗体，其中所述重链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
4.根据权利要求1的人源化单克隆抗体，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1的人源化单克隆抗体，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
6.根据前述任一项权利要求的人源化单克隆抗体，其进一步包含人类来源的恒定区。
7.根据权利要求6的人源化单克隆抗体，其进一步包含减少Fcγ受体结合的Fc修饰。
8.根据权利要求7的人源化单克隆抗体，其包含非糖基化Fc区或δab修饰。
9.根据权利要求7的人源化单克隆抗体，其包含经修饰的糖基化模式。
10.一种核酸，其至少编码根据权利要求1至9中任一项的人源化单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。
11.一种细胞，其表达根据权利要求10的核酸。
12.根据权利要求1-9中任一项的人源化单克隆抗体，其用于抑制受试者中的T细胞介导的反应。
13.根据权利要求12使用的人源化单克隆抗体，其中该T细胞介导的反应参与选自以下的状况：组织移植(tissue transplantation)、多发性硬化及1型糖尿病。
14.根据权利要求13使用的人源化单克隆抗体，其中所述组织移植(tissuetransplantation)选自下组：实体器官移植、复合性组织移植和组织移植(tissuegrafting)。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
PT3366705T (pt) * 2012-09-12 2023-07-19 Genzyme Corp Polipéptidos contendo fc com glicosilação alterada e função efetora reduzida
IL275376B2 (en) 2013-03-11 2024-01-01 Genzyme Corp Polypeptides with hyperglycosidic bonds
SG10201803473WA (en) * 2013-10-30 2018-06-28 Genzyme Corp Methods for enhancing immunosuppressive therapy by multiple administration of alpha beta tcr-binding polypeptide
SG10201808158UA (en) 2014-03-19 2018-10-30 Genzyme Corp Site-specific glycoengineering of targeting moieties
CA2964123C (en) 2014-10-09 2023-09-05 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
WO2016059220A1 (en) 2014-10-16 2016-04-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Tcr-activating agents for use in the treatment of t-all
KR20180020202A (ko) * 2015-06-01 2018-02-27 메디진 이뮤노테라피스 게엠바하 T 세포 수용체 특이적 항체
CA3069842A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Improved dual specificity polypeptide molecule
RU2708558C1 (ru) * 2018-12-13 2019-12-09 Российская Федерация, от имени которой выступает ФОНД ПЕРСПЕКТИВНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Способ создания противоопухолевой иммунологической защиты к клеткам лимфомы EL-4
MA55529A (fr) 2019-04-03 2022-02-09 Genzyme Corp Polypeptides de liaison anti-alpha bêta tcr à fragmentation réduite
KR102503349B1 (ko) 2019-05-14 2023-02-23 프로벤션 바이오, 인코포레이티드 제1형 당뇨병을 예방하기 위한 방법 및 조성물
CN113122503B (zh) * 2019-12-30 2022-10-11 博雅缉因（北京）生物科技有限公司 一种靶向t细胞淋巴瘤细胞的通用型car-t及其制备方法和应用
WO2021136415A1 (zh) * 2019-12-30 2021-07-08 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种纯化ucart细胞的方法与应用
CN113122504A (zh) * 2019-12-30 2021-07-16 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种纯化ucart细胞的方法与应用
CN113088495A (zh) * 2020-01-09 2021-07-09 苏州方德门达新药开发有限公司 工程改造的t细胞、其制备及应用
WO2023227018A1 (zh) * 2022-05-25 2023-11-30 羿尊生物医药（浙江）有限公司 靶向细胞膜受体蛋白的融合蛋白及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0403156A1 (en) * 1989-06-07 1990-12-19 Genzyme Corporation Improved monoclonal antibodies against the human alpha/beta t-cell receptor, their production and use

Family Cites Families (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5149782A (en) 1988-08-19 1992-09-22 Tanox Biosystems, Inc. Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents
EP0359096B1 (en) 1988-09-15 1997-11-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Antibodies having modified carbohydrate content and methods of preparation and use
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5837821A (en) 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
WO1994026087A2 (en) 1993-05-14 1994-11-24 Connor Kim C O Recombinant protein production and insect cell culture and process
US5429746A (en) 1994-02-22 1995-07-04 Smith Kline Beecham Corporation Antibody purification
US5792456A (en) 1994-08-04 1998-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Mutant BR96 antibodies reactive with human carcinomas
ES2167391T3 (es) 1994-09-16 2002-05-16 Merck Patent Gmbh Inmunoconjugados ii.
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
WO1997014719A1 (en) 1995-10-16 1997-04-24 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
SE9601245D0 (sv) 1996-03-29 1996-03-29 Pharmacia Ab Chimeric superantigens and their use
UA71889C2 (uk) 1996-04-02 2005-01-17 Йєда Рісерч Енд Дівелопмент Ко. Лтд. Модулятори зв'язаного з рецептором tnf фактора (traf), їх одержання та застосування
AU3968897A (en) 1996-08-02 1998-02-25 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6953675B2 (en) 1997-11-06 2005-10-11 Immunomedics, Inc. Landscaped antibodies and antibody fragments for clinical use
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1115740A1 (en) 1998-09-23 2001-07-18 The Regents of the University of California Synthetic peptides, conjugation reagents and methods
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
CN1110322C (zh) 1999-07-21 2003-06-04 中国医学科学院医药生物技术研究所 单克隆抗体Fab'－平阳霉素偶联物及其抗肿瘤作用
AU2001270609A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
EP2341060B1 (en) 2000-12-12 2019-02-20 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US20050107595A1 (en) 2001-06-20 2005-05-19 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US6900292B2 (en) 2001-08-17 2005-05-31 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human erythropoietin with increased biological activities
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040018557A1 (en) 2002-03-01 2004-01-29 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
EP1534335B9 (en) 2002-08-14 2016-01-13 Macrogenics, Inc. Fcgammariib-specific antibodies and methods of use thereof
BRPI0314814C1 (pt) 2002-09-27 2021-07-27 Xencor Inc anticorpo compreendendo uma variante de fc
PT1562972E (pt) 2002-10-15 2010-11-10 Facet Biotech Corp Alteração de afinidades de ligação ao fcrn ou semi-vidas séricas de anticorpos por mutagénese
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
BRPI0411132B8 (pt) 2003-06-12 2021-05-25 Lilly Co Eli protéina de fusão heteróloga e seus usos
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
RU2392324C2 (ru) * 2003-09-18 2010-06-20 Симфоген А/С Способ связывания интересующих последовательностей
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
KR101520209B1 (ko) 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
CA2545603A1 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto
US7001978B2 (en) 2003-11-19 2006-02-21 Xerox Corporation Unsaturated ester substituted polymers with reduced halogen content
EP2221315A1 (en) 2003-12-04 2010-08-25 Xencor, Inc. Methods of generating variant proteins with increased host string content and compositions thereof
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
DE602005015542D1 (de) 2004-01-12 2009-09-03 Applied Molecular Evolution Varianten der fc-region
EP2053062A1 (en) 2004-03-24 2009-04-29 Xencor, Inc. Immunoglobin variants outside the Fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
ATE455861T1 (de) 2004-05-04 2010-02-15 Novo Nordisk Healthcare Ag O-verknüpfte glykoformen von faktor vii und verfahren zu deren herstellung
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
EP1919950A1 (en) 2004-07-15 2008-05-14 Xencor, Inc. Optimized fc variants
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP1799700A4 (en) 2004-09-27 2009-02-11 Centocor Inc SRAGE MIMETIC BODIES, COMPOSITIONS, PROCESSES AND USES
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
JP4829609B2 (ja) * 2004-12-22 2011-12-07 独立行政法人科学技術振興機構 ヒト抗体酵素およびその生産方法
EP1866339B8 (en) 2005-03-25 2021-12-01 GITR, Inc. Gitr binding molecules and uses therefor
JP2008537941A (ja) 2005-03-31 2008-10-02 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化特性を有するＦｃ変異体
EP1871808A2 (en) 2005-03-31 2008-01-02 Xencor, Inc. Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES
US8163881B2 (en) 2005-05-31 2012-04-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Immunoglobulin molecules with improved characteristics
EP2937360A1 (en) 2005-06-17 2015-10-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Ilt3 binding molecules and uses therefor
CN101506238B (zh) 2005-06-30 2013-11-06 森托科尔公司 具有提高治疗活性的方法和成分
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CZ2005627A3 (cs) 2005-10-03 2006-09-13 Flek@Jaroslav Zubní kartácek
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
JP5597793B2 (ja) * 2006-06-19 2014-10-01 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション Ｉｌｔ３結合分子およびその使用
FI20060946A0 (fi) 2006-10-26 2006-10-26 Glykos Finland Oy Influenssaviruksen nukleiinihappoja ja peptidejä
JP2010512306A (ja) 2006-10-27 2010-04-22 ザ ロックフェラー ユニバーシティー 抗炎症特性が増強され、細胞毒性特性が減少したポリペプチドおよび関連する方法
CL2007003411A1 (es) 2006-11-28 2008-07-04 Centelion Proteina fusion que consiste en una region fc de una inmunoglobulina con un fragmento o dominio soluble de un receptor para fgf; polinucleotido que la codifica y vector y celula que lo comprenden; composicion farmaceutica que comprende la proteina fu
DK2740744T3 (da) * 2007-01-09 2018-04-23 Biogen Ma Inc Sp35-antistoffer og anvendelser deraf
WO2008091954A2 (en) 2007-01-23 2008-07-31 Xencor, Inc. Optimized cd40 antibodies and methods of using the same
CA2683568A1 (en) 2007-05-08 2008-11-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
US20100260751A1 (en) 2007-09-28 2010-10-14 Raju T Shantha Methods and Structural Conformations of Antibody Preparations with Increased Resistance to Proteases
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
AU2008312457B2 (en) 2007-10-19 2014-04-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-TENB2 antibodies and antibody drug conjugates
JP5647899B2 (ja) 2008-01-08 2015-01-07 ラツィオファルム ゲーエムベーハーｒａｔｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ オリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用するポリペプチドの複合糖質化
SI2657253T1 (sl) 2008-01-31 2017-10-30 Genentech, Inc. Protitelesa proti CD79b in imunokonjugati in postopki za uporabo
EP2268807A2 (en) 2008-04-21 2011-01-05 Novo Nordisk A/S Hyperglycosylated human coagulation factor ix
UA40611U (ru) 2008-05-26 2009-04-27 Владимир Семенович Живченко Способ десульфурации железоуглеродистого расплава в тигельной печи
AU2009288354A1 (en) 2008-08-26 2010-03-11 Macrogenics Inc. T-cell receptor antibodies and methods of use thereof
EP2233499A1 (en) 2009-03-26 2010-09-29 CSL Behring AG Antibody composition with altered Fab sialylation
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
ME03447B (me) * 2010-03-04 2020-01-20 Macrogenics Inc Anтitela reakтivna sa b7-нз, njihovi imunološki akтivni fragmenтi i upotreba
EP2603528B1 (en) 2010-08-10 2016-10-12 Glycotope GmbH Fab-glycosylated antibodies
AR085302A1 (es) 2011-02-24 2013-09-18 Sanofi Sa Metodo de produccion de anticuerpos sialilados
AU2012229330B2 (en) 2011-03-11 2016-04-21 Amicus Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the treatment of Fabry disease
TWI622597B (zh) 2011-03-28 2018-05-01 賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
PT3366705T (pt) 2012-09-12 2023-07-19 Genzyme Corp Polipéptidos contendo fc com glicosilação alterada e função efetora reduzida
IL275376B2 (en) 2013-03-11 2024-01-01 Genzyme Corp Polypeptides with hyperglycosidic bonds
SG10201808158UA (en) 2014-03-19 2018-10-30 Genzyme Corp Site-specific glycoengineering of targeting moieties
WO2015157446A1 (en) 2014-04-08 2015-10-15 University Of Georgia Research Foundation Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
CA2964123C (en) 2014-10-09 2023-09-05 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
WO2018071076A2 (en) 2016-07-07 2018-04-19 Northwestern University Enhanced conductivity, adhesion and environmental stability of printed graphene inks with nitrocellulose

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0403156A1 (en) * 1989-06-07 1990-12-19 Genzyme Corporation Improved monoclonal antibodies against the human alpha/beta t-cell receptor, their production and use

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Publication number Publication date
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