JP5893807B2

JP5893807B2 - 両親媒性ブロック共重合体、その調製方法、及び前記共重合体と抗腫瘍薬とで形成されたミセル状薬物内包システム

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Publication number: JP5893807B2
Application number: JP2015538265A
Authority: JP
Inventors: リュウ、ケ; ゴン、フェイロン; シュー、ホイ; ラン、ユエウ; ファン、ホアイン; ハン、フェイ; チェ、シン
Original assignee: スーチョウナノメディスンアールアンドディーカンパニー、リミテッド; チャンチョウターゲットメディスンテクノロジーカンパニーリミテッド
Priority date: 2012-10-26
Filing date: 2013-09-22
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2033-09-22
Also published as: JP2015534992A; CA2889518A1; CN103772686B; CA2889518C; EP2913353A1; CN103772686A; EP2913353A4; AU2013334301A1; PT2913353T; AU2013334301B2; US20150283246A1; WO2014063549A1; EP2913353B1; US9393312B2; ES2613876T3

Description

本発明は、両親媒性ブロック共重合体、その調製方法、及び前記共重合体と抗腫瘍薬とで形成された安定したミセル状薬物内包システムに関し、ナノ薬物製剤の分野に属する。

腫瘍は、ヒトの生命を大きく脅かす疾患である。ヒトの生活の質を向上させるための安全で有効な抗腫瘍薬を研究し開発することは、非常に重要である。

タキサン（パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、カバジタキセル、及びラロタキセルを含む）は、非常に有効で広域な抗腫瘍薬のクラスである。その作用機序は主として、微小管を重合して安定させ、急速に分裂する腫瘍細胞を有糸分裂の段階に固定させ、がん細胞の複製を阻止して細胞死に至らせることを含む。タキサンには有意な放射線増感作用があって細胞をＧ２期及びＭ期に停止させ、その間細胞が放射線治療に対して感受性を示すことが、ｉｎｖｉｔｒｏの実験で実証されている。しかし、タキサンのほぼ全ては高度に疎水性であって経口吸収性が低く、これまでの唯一の投与経路は注射である。タキサン水溶液の調製は困難であるので、薬物の溶解度を高めるために、市販の製剤には多くの場合に界面活性剤が添加されていた。しかし、この可溶化法には多くの欠点がある。（１）パクリタキセル（商品名：Ｔａｘｏｌ）用の可溶化剤として使用されるポリオキシエチレン化ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）、ドセタキセル（商品名：Ｔａｘｏｔｅｒｅ）及びカバジタキセル（商品名：ＪＥＶＴＡＮＡ）用の可溶化剤として使用されるＴｗｅｅｎ８０のいずれもが容易にアレルギーを引き起こすため、薬物を使用する前に患者は抗アレルギー治療を受ける必要がある；（２）薬物の安定性が低く、注射後の利用率が高くない。上記製剤中の薬物は希釈すると容易に沈殿する。薬物は、投与前に特殊なフィルターに通さなければならない。注射用の溶液はゆっくりと希釈する必要があり、薬物の沈殿の程度は作業者によって変化する。その結果、不正確な量の薬物が体内に注射され、治療効果が異なるものとなる；（３）血液毒性が高い。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ及びＴｗｅｅｎ８０はいずれも血液毒性の原因になり、これが、治療用量の向上を制限する主な要因である。

ドキソルビシンは、抗腫瘍抗生物質であり、タキサンと同様、細胞毒性薬に属する。ＲＮＡ及びＤＮＡの合成を抑制し、ＲＮＡに対して最も強い抑制作用を有する。ドキソルビシンは広範な抗腫瘍作用を有し、様々な腫瘍に効果がある。細胞周期非特異的薬物として、ドキソルビシンは、様々な成長段階の腫瘍細胞を殺すことができる。ドキソルビシンは主に急性白血病、急性リンパ芽球性白血病、及び骨髄性白血病の治療に使用される。従来のドキソルビシン製剤には、顕著な心毒性や骨髄抑制等の副作用がある。

ドキソルビシンの異性体であるエピルビシンは、ドキソルビシンと比較すると治療効果が同等かわずかに高く、心臓に対する毒性が低い。

クルクミンは、潜在的抗腫瘍活性を持つ非細胞毒性薬として近年広く注目を集めている。クルクミンの顕著な特徴は、副作用がほとんどなく、抗炎症、抗酸化等の補助的な治療効果を有する点にある。クルクミンの最大の欠点は、低水溶性である。クルクミンの安定した水性製剤の調製は、近年ますます注目を集めている。

高分子ミセルは、近年、新規な薬物送達システムとして開発されてきた。ミセルは通常、両親媒性ブロック共重合体への多量の分子鎖の配向によって形成される。薬物はブロック共重合体の疎水性セグメントと薬物分子との間の弱い相互作用によってミセルコアに被包され、親水性セグメントが外側になってミセルを安定化し、典型的なコアシェル構造が形成される。高分子ミセルは、薬物の溶解度及び治療用量を増加させるだけでなく、薬物を内部に被包することによって薬物の劣化及び不活化を回避し、毒性を低下させることもできる。ミセルの直径は通常１００ｎｍ未満であり、シェルは通常、親水性ＰＥＧのセグメントである。従って、ミセルは、細網内皮系（ＲＥＳ）の食作用を回避し、循環時間を増加させ、ＥＰＲ効果（血管透過性・滞留性亢進効果）を通じて腫瘍に対する受動的ターゲティングを達成できる。加えて、高分子ミセルは、分子量が大きいため、腎クリアランスを回避できる。小分子界面活性剤と比べ、高分子ミセルのＣＭＣ（臨界ミセル濃度）は非常に低く、ミセル構造は希釈しても安定状態に維持される。ミセル状薬物内包システムの薬物内包効率（ｄｒｕｇｌｏａｄｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、臨床用量の要件を満たすことができる２５％に達し得る。同時に、この高分子材料は、生分解性及び生体適合性を有する。

高分子ミセルは、特に溶解度の低い抗腫瘍薬にとって、大きな可能性を持つ新規な薬物送達システムであると考えられている。しかし、その溶液中での比較的低い安定性は、この新規な薬物送達システムの臨床研究への移行とって重要な課題となっている。特に、タキサンミセルの安定性は一般に低い。例えば、韓国で最初に承認された注射用パクリタキセルミセル（商品名：ＧｅｎｅｘｏｌＰＭ）は、室温では、溶液中で２４時間しか安定していない（ＬｅｅＳＷら、新規な薬物担体としてのイオン的に固定された高分子ナノ粒子（ＩｏｎｉｃａｌｌｙＦｉｘｅｄＰｏｌｙｍｅｒｉｃＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｓａＮｏｖｅｌＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒ）、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、２００７、２４：１５０８〜１５１６）。ＳａｍｙａｎｇＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、パクリタキセルミセルの安定性を向上させるため、懸命な努力をしてきた。例えば、ブロック共重合体の末端ヒドロキシル基をアセトキシ又はベンゾイルで末端キャップし、疎水性セグメントと薬物との相溶性を高めてミセルの安定性を向上させることが、ＣＮ０１８０９６３２．８に開示されている。しかし、この共重合体を用いて調製されたミセルは、ｉｎｖｉｔｒｏでは室温で３日間しか安定状態になく、ｉｎｖｉｖｏではミセルの安定性は更に低い。パクリタキセルの誘導体であるドセタキセル又はカバジタキセルのミセル溶液の安定性は、更に低い。ドセタキセルミセルを例にとると、現在まで、臨床研究に移行できたケースはほとんどなく、その主要な要因は、ミセル溶液の低い安定性である（ＧａｕｃｈｅｒＧら、タキサンの非経口送達のためのポリエステル系ミセルとナノ粒子（Ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ−ｂａｓｅｄｍｉｃｅｌｌｅｓａｎｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒｔｈｅｐａｒｅｎｔｅｒａｌｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｔａｘａｎｅｓ）、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ、２０１０、１４３：２〜１２）。韓国ＳａｍｙａｎｇＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＮａｎｏｘｅｌＰＭ（商標）ミセル（ｍＰＥＧ−ＰＬＡが高分子添加剤として使用され、ドセタキセルが薬物として使用されている）を例にとると、ミセルの薬物内包効率が５％であり薬物濃度が０．１〜２ｍｇ／ｍｌの場合、ミセルは室温で６時間しか安定していない（ＬｅｅＳＷら、共重合体系送達システムを用いたドセタキセル内包静脈内投与製剤Ｎａｎｏｘｅｌ−ＰＭ（商標）の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｄｏｃｅｔａｘｅｌ−ｌｏａｄｅｄｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ、Ｎａｎｏｘｅｌ−ＰＭ^ＴＭｕｓｉｎｇｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−ｂａｓｅｄｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｔｅｍ）、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ、２０１１、１５５：２６２〜２７１）。ミセルは体内への投与後速やかに分解し、薬物は即座に血液中のタンパク質（例えば、アルブミン）と結合するため、ミセルのＥＰＲ効果は失われる。動物実験の結果は、ＮａｎｏｘｅｌＰＭ（商標）ミセルとドセタキセル注射液とでは薬物の有効性に差がなく、最大耐性用量も改善されないため、ＮａｎｏｘｅｌＰＭ（商標）ミセルには有意な利点はないことを示している。他方、ドセタキセルとカバジタキセルは構造的に類似しているため、カバジタキセルｍＰＥＧ−ＰＬＡミセルの安定性は、ドセタキセルの場合と同等である。我々の研究で、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ／カバジタキセルミセル中の薬物濃度が５ｍｇ／ｍＬの場合、室温ではミセル溶液は２時間しか安定状態にないことがわかっている。ｉｎｖｉｖｏでの有効性も安全性も、有効に改善されていない。加えて、不安定なミセルの大規模な調製には、大きな困難がある。

タキサンは、過去２０年の抗腫瘍薬の研究開発における最も重要な発見に含まれ、今後２０年、主要な抗腫瘍薬であり続けるだろう。タキサンの用量を制限する毒性のため、研究者の主な焦点は常に、薬効を十分に利用することに向けられてきた。タキサン用の非常に可能性の高い送達システムとしては、ミセルの不安定さは、この薬物送達システムの最大の欠陥になっており、こうした不安定さをもたらす理由は、未だ明らかではない。研究者は、タキサンが被包されたミセルの安定性を向上させるため、懸命な努力をしてきた。例えば、特許第２０１０１０００１０４７号に開示されているように、パクリタキセルミセルの安定性を向上させるため、アミノ酸がミセル溶液に添加されている（アミノ酸は、ミセルの形成中に添加される）が、同開示には、ミセル中のアミノ酸の位置に関する情報はない（ミセルの物理的バリア剤、又はミセルの疎水性コア中に薬物分子と共存する分子としてのみである）。一方で、体内に投与され血液によって希釈された後でもアミノ酸が補助添加物としてなおミセルの安定性を維持できるかどうかは知られておらず、従って、ｉｎｖｉｖｏでの薬物効果は、未だ明らかではない。更に、パクリタキセルとドセタキセルを共に共重合体ミセル中に捕捉させると薬物内包効率とミセルの安定性が大幅に増加することが報告されているが、この二成分薬物内包ミセルは、まだ臨床的に認識されていない（ＳｈａｏＣｈｅｎｇＷｅｉ他、パクリタキセルとドセタキセルの二成分薬物内包ミセルのＩｎｖｉｔｒｏ安定性（Ｉｎｖｉｔｒｏｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｐａｃｌｉｔａｘｅｌａｎｄｄｏｃｅｔａｘｅｌｂｉｎａｒｙ−ｄｒｕｇｌｏａｄｅｄｍｉｃｅｌｌｅｓ）、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、２０１０、４１：４２８〜４３４）。Ｈｕｈらは、ＰＤＥＮＡ−ＰＥＧのブロック共重合体を用いてミセルを合成した。このミセルは、パクリタキセルの被包後、長期安定性を示したが、この重合体材料の安全性を裏付けるデータが不十分なため、臨床での使用にとって安全上の大きな課題を提示している（ＨｕｈＫＭら、パクリタキセルの送達のための屈水性重合体ミセルシステム（Ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｉｃｐｏｌｙｍｅｒｍｉｃｅｌｌｅｓｙｓｔｅｍｆｏｒｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ、２００５、１０１（１〜３）：５９〜６８）。

本発明の目的は、先行技術における上記問題に対処するための両親媒性ブロック共重合体を提供することである。安全性が認められたメトキシポリエチレングリコール（又はポリエチレングリコール）−ポリエステルブロック共重合体が、本発明の両親媒性ブロック共重合体の基本材料として使用され、大きな空間構造を持つ疎水基、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基、フェニルを有するアミノ酸又はその誘導体の導入によりポリエステルセグメントの末端ヒドロキシル基が疎水基で修飾され、そのため、薬物分子とブロック共重合体の疎水性セグメントとの相溶性が向上しており、その間の相互作用が増強されている。大きな空間構造を持つ疎水基の導入は、薬物分子がミセルコアに入り込むためのより大きな空間を提供する。従って、薬物がミセルコアから溶け出すことはより困難であり、そのため、安定性の高い薬物内包ミセルが得られる。本発明の最も重要な意義は、ミセルの溶液中での安定性、とりわけ、ｉｎｖｉｖｏでの安定性を向上させてミセルのＥＰＲ効果を確実なものとし、薬物のより良好な生物学的利用率及び治療効果を実現することにある。

本発明の技術的解決法は、以下の通り提供される。

両親媒性ブロック共重合体であって、その親水性セグメントが４００〜２００００の範囲の数平均分子量を持つポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）であり；その疎水性セグメントがポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリカーボナート（ＰＴＭＣ）及びその誘導体、並びにポリジオキサノン（ＰＰＤＯ）及びその誘導体からなる群から選択され、各々が５００〜１０００００の範囲の数平均分子量を有し、ｔ−ブチルアシル、ｔ−ブチルアセチル、アミノ酸残基及びアミノ酸誘導体残基からなる群から選択される疎水基で末端キャップされていることを特徴とする、上記両親媒性ブロック共重合体。

好適な実施形態においては、前記アミノ酸誘導体が、好ましくはγ−ベンジルグルタミン酸、β−ベンジルアスパラギン酸及びアミノ保護アミノ酸誘導体から選択される。

好適な実施形態においては、前記アミノ酸誘導体が更に好ましくはベンジル又はｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護されたアミノ酸から選択される。

好適な実施形態においては、前記アミノ酸誘導体が、好ましくはｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニンである。

本発明においては、前記疎水性セグメントが、好ましくはポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ），ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリカーボナート（ＰＴＭＣ）及びその誘導体、並びにポリジオキサノン（ＰＰＤＯ）及びその誘導体からなる群から選択され、各々が１，０００〜５０，０００の範囲の数平均分子量を有し；前記親水性セグメントが、好ましくは数平均分子量が７５０〜５，０００の範囲のポリエチレングリコール及びメトキシポリエチレングリコールから選択される。

本発明のもう一つの目的は、前記両親媒性ブロック共重合体を調製する方法を提供することである。

本発明によって提供される技術的解決法は、以下の通り記載される。
前記両親媒性ブロック共重合体を調製する方法は、以下のステップを含む：
１）数平均分子量が４００〜２００００の範囲の親水性セグメントを重合用フラスコに添加し；１００℃〜１３０℃に加熱して真空下で２時間〜４時間脱水し；次いで、疎水性セグメントのモノマーと、触媒として前記モノマーの０．３‰〜１‰の重量のオクタン酸第一スズを添加し；フラスコを真空下で密封して上記反応物質との反応を１００℃〜１５０℃で１２時間〜２４時間行い；次いで、ジクロロメタン、エタノール、テトラヒドロフラン、メタノール、酢酸エチル又はアセトンに溶解させ；ジエチルエーテルを添加して重合体を完全に沈殿させた後、ろ過及び真空下の乾燥によりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である親水性セグメントと疎水性セグメントとで構成されるブロック共重合体を得るステップ；
２）親水性セグメントと疎水性セグメントとで構成されるブロック共重合体を酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、酢酸エチル又は再蒸留水に溶解させ；次いで、ｔ−ブチルアシル、ｔ−ブチルアセチル、アミノ酸残基又はアミノ酸誘導体残基を添加して末端ヒドロキシル基を疎水基に変換するための反応を行い；ろ過して不溶性物質を除去し、十分な量のジエチルエーテルを添加して重合体を沈殿させ；ろ過及び真空下での乾燥により目的の共重合体を得るステップ。

本発明のもう一つの目的は、前記両親媒性ブロック共重合体と抗腫瘍薬とによって形成されたミセル状薬物内包システムを提供することである。

本発明の技術的解決法は、以下の通り提供される。
前記両親媒性ブロック共重合体と抗腫瘍薬とで形成されたミセル状薬物内包システムであって、前記両親媒性ブロック共重合体の少なくとも一種、治療有効量の抗腫瘍薬の少なくとも一種、及び薬学的に許容される医薬助剤を含む上記ミセル状薬物内包システム。

好適な実施形態においては、前記医薬助剤が凍結乾燥用添加剤である。

好適な実施形態においては、前記凍結乾燥用添加剤が、ラクトース、マンニトール、スクロース、トレハロース、フルクトース、グルコース、アルギン酸ナトリウム及びゼラチンのうちの少なくとも一種である。

前記医薬助剤は、酸化防止剤、金属イオン錯化剤、ｐＨ調節剤又は等張性調節剤等を更に含み；前記酸化防止剤が亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム又はメタ重亜硫酸ナトリウム等であり；前記金属イオン錯化剤がエデト酸２ナトリウム、エデト酸カルシウム２ナトリウム又はシクロヘキシレンジアミン四酢酸ナトリウム等であり；前記ｐＨ調節剤がクエン酸、重炭酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム又はリン酸二水素ナトリウム等であり；前記等張性調節剤が塩化ナトリウム又はグルコース等である。

好適な実施形態においては、前記抗腫瘍薬が、パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、カバジタキセル及びラロタキセルを含むタキサン、クルクミン、ドキソルビシン、エピルビシン等の少なくとも一種である。

好適な実施形態においては、両親媒性ブロック共重合体の薬物に対する重量比が９９．５：０．５〜５０：５０の範囲、好ましくは９９：１〜７５：２５の範囲である。

好適な実施形態においては、前記凍結乾燥用添加剤が、重量で全システムの０〜９９．９％、好ましくは１０．０％〜８０．０％を占める。

本発明における抗腫瘍薬−重合体ミセル状製剤は、好ましくは、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、腸がん、肺がん、肝臓がん、頭部及び頸部がん等からなる群から選択されるがんの治療に使用できる。

本発明において言及する治療有効量とは、前記ミセル状薬物内包システム（ｄｒｕｇ−ｌｏａｄｉｎｇｓｙｓｔｅｍ）に含有されている、がん（特に、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、腸がん、肺がん、肝臓がん、頭部及び頸部がん等）の治療に有効な抗腫瘍薬の量を意味する。

本発明のミセル状薬物内包システムは注射によって投与してもよく、一般的には凍結乾燥粉末として調製される。加えて、当業者は、投与用量を既存の抗腫瘍薬の用量を参照することにより判断し、個々の条件に応じて調節してもよい。

本発明は、透析法、直接溶解法、フィルム水和法、固体分散法及び高エネルギーホモ乳化法、好ましくはフィルム水和法及び固体分散法を含む、両親媒性ブロック共重合体と抗腫瘍薬とで形成された前記ミセル状薬物内包システムを調製する方法を更に提供する。

前記フィルム水和法のステップは、重合体と薬物とを有機溶媒に溶解させるステップ；溶媒をロータリーエバポレーションによって除去するステップ；次いで、薬物内包ミセルの溶液を得るために注射用水を添加して薬物フィルムを溶解させるステップ；及びろ過滅菌及び凍結乾燥後にミセルの凍結乾燥粉末を得るステップを含む。

前記固体分散法のステップは、薬物を溶融状態にある重合体に加熱しながら溶解させて澄明な混合物を得るステップ（このステップの間に溶解を助けるために少量の有機溶媒を添加してもよい）；注射用水を添加して溶解させ、ミセルの溶液を得るステップ；及びろ過滅菌及び凍結乾燥後にミセルの凍結乾燥粉末を得るステップを含む。

先行技術と比べ、本発明は以下の特徴を有する。
１）本発明においては、大抵の抗腫瘍薬の疎水性と大きな立体構造とを考慮し、ポリエステルセグメントの末端ヒドロキシル基を疎水基で修飾し、これにより薬物分子とブロック共重合体の疎水性セグメントとの相溶性を向上させ、その間の相互作用を増大させている。一方で、ミセルコア内の薬物分子を収容する空間を大きくし、薬物分子はミセルコア内に規制されており、溶解してミセルコアを出ることは難しい。従って、ｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏの両方で安定性の高い一連の薬物内包ミセルが得られる。前記薬物内包ミセルは、凍結乾燥製剤として調製可能である。
２）本発明の両親媒性ブロック共重合体によって調製された抗腫瘍薬内包ミセルの凍結乾燥製剤は、還元後速やかに分散して（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ）青みがかったオパール色の澄明な溶液を形成することが実験で実証されている。溶液は室温で少なくとも２４時間、明らかな薬物の沈殿も起こさず安定しており、注射後、ｉｎｖｉｖｏで潜在的なＥＰＲ効果をもたらす。本発明は、産業上の利用への見通しが有望である。

ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢ、ＰＤＩ＝１．０５のゲル浸透クロマトグラムである。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ、ＰＤＩ＝１．０５のゲル浸透クロマトグラムである。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−Ａｓｐ、ＰＤＩ＝１．０５のゲル浸透クロマトグラムである。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＳ、ＰＤＩ＝１．０５のゲル浸透クロマトグラムである。ＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＳ、ＰＤＩ＝１．０５のゲル浸透クロマトグラムである。ｍＰＥＧ_５０００−ＰＣＬ_４０００−ＢＰ、ＰＤＩ＝１．０７のゲル浸透クロマトグラムである。ｍＰＥＧ_５０００−ＰＣＬ_４０００−ＢＰの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。ｍＰＥＧ_５０００−ＰＣＬ_４０００−ＢＰ／パクリタキセルミセルのサイズ分布を示す図である。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ／ドセタキセルミセルのサイズ分布を示す図である。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢ／カバジタキセルミセルのサイズ分布を示す図である。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ／ドセタキセルミセル溶液の安定性試験の結果を示す図である。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢ／カバジタキセルミセル溶液の安定性試験の結果を示す。ドセタキセル注射液及びドセタキセルミセル注射液のＨ４６０腫瘍に対する抑制を示す。ドセタキセル注射液及びドセタキセルミセル注射液のＨ４６０腫瘍に対する抑制を示す。ドセタキセル注射液及びドセタキセルミセル注射液のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍に対する抑制を示す。ドセタキセル注射液及びドセタキセルミセル注射液のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍に対する抑制を示す。ドセタキセルミセルを静脈内投与（５ｍｇ／ｋｇ）したラットからの血漿中のドセタキセルの薬物濃度−時間曲線を示す。カバジタキセルミセルを静脈内投与（５ｍｇ／ｋｇ）したラットからの血漿中のカバジタキセルの薬物濃度−時間曲線を示す。ドセタキセルミセルを静脈内投与（５ｍｇ／ｋｇ）したラットからの血漿中の薬物の総量及びドセタキセルの被包された薬物の濃度−時間曲線を示す。カバジタキセルミセルを静脈内投与（５ｍｇ／ｋｇ）したラットからの血漿中の薬物の総量及びカバジタキセルの被包された薬物の濃度−時間曲線を示す。担腫瘍（ＭＸ−１）ヌードマウスからの腫瘍組織中のドセタキセル（静脈内投与１０ｍｇ／ｋｇ）の濃度−時間曲線を示す。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ／パクリタキセルミセル及びベンゾイルでキャップされたｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００／パクリタキセルミセルを静脈内投与したラットからの血漿中のパクリタキセルの薬物濃度−時間曲線を示す。

本発明のより深い理解のため、以下の実施例を示して本発明を更に説明する。ただし、実施例は決して本発明を制限することを意図したものではない。

（例１）両親媒性ブロック共重合体の調製
（１）ｔ−ブチルアシルで末端キャップされたメトキシポリ（エチレングリコール）−ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）ブロック共重合体（ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢ）の合成
１８．２ｇのｍＰＥＧ（数平均分子量２，０００）を重合用フラスコに添加し、１００℃に加熱し、真空下で３時間脱水した。次いで、２６ｍｇのオクタン酸第一スズと、１１．６ｇのグリコリド（ＧＡ）と、１４．４ｇのＤ、Ｌ−ラクチド（Ｄ，Ｌ−ＬＡ）とを添加した。フラスコを真空下で密封し、１３０℃で１５時間重合を行った。反応物質をジクロロメタンに溶解し、大量のジエチルエーテルを添加して重合体を完全に沈殿させた。ろ過及び真空下での乾燥後、ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００ブロック共重合体が得られた。

４ｇのｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００を２０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、０．５ｇの炭酸カリウムを添加し、０．２５ｇの塩化ピバロイルを撹拌下に添加した。室温で２４時間反応を行った。不溶性物質をろ過によって除去した。大量のジエチルエーテルを添加して重合体を完全に沈殿させた。ろ過及び真空下での乾燥後、ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢが得られた。
注記：ＴＢはｔ−ブチルアシルの略語である。

ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢのゲル浸透クロマトグラムを図１に示した。ただし、ＰＤＩは１．０５である。
重水素化クロロホルムを溶媒として、４００ＭＢｒｕｋｅｒＮＭＲ装置を用いて重合体構造の特性を明らかにした。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢの^１ＨＮＭＲデータは以下のように示された。
¹H NMR (CDCl₃) δ (1.56 ppm，(CH₃)₃C，CHCH₃O)，δ (3.55-3.75ppm, 4H, CH₂CH₂O)，δ (5.15-5.23ppm, 1H, CHCH₃O).

（２）ｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニン残基で末端キャップされたメトキシポリ（エチレングリコール）−ポリラクチドブロック共重合体（ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ）の合成
２０ｇのｍＰＥＧ（数平均分子量２，０００）を重合用フラスコに添加し、１２０℃に加熱し、真空下で３時間脱水した。２５ｍｇのオクタン酸第一スズと、２５ｇのＤ、Ｌ−ラクチド（Ｄ，Ｌ−ＬＡ）とを添加した。反応フラスコを真空下で密封した。重合を１３０℃で１２時間行い、反応物質をエタノールに溶解した。大量のジエチルエーテルを添加して重合体を完全に沈殿させた。ろ過及び真空下での乾燥後、ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００ブロック共重合体が得られた。

６．６５ｇのＢｏｃ−Ｌ−フェニルアラニンを５０ｍｌの無水酢酸エチルに溶解し、４．２ｍｌのトリエチルアミンを添加した。上記溶液を−１０℃に冷却し、３．６６ｍｌの塩化ピバロイルを添加した。撹拌下に０℃で２時間、次いで、室温で更に１時間、反応を行った。不溶性物質をろ過によって除去し、溶媒を真空下で除去して粘稠液を得た。

２５ｍｌのジクロロメタンを溶解のために添加した。得られた溶液を、１５ｇのｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００を含有する７５ｍｌのジクロロメタン溶液に添加した。完全混合後、１４ｍｌのピリジンと１６０ｍｇのテトラメチルアミノピリジンとを添加した。混合物を０℃で２時間、次いで、室温で更に２４時間反応させた。ろ過及び溶媒の除去後、得られた重合体を１００ｍｌのエタノールに再溶解させ、−２０℃で１時間冷却した。ろ過及び真空下での乾燥後、ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰが得られた。
注記：ＢＰは、ｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニン残基の略語である。

ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰのゲル浸透クロマトグラムを図２に示した。ただし、ＰＤＩは１．０５である。
重水素化クロロホルムを溶媒として、４００ＭＢｒｕｋｅｒＮＭＲ装置を用いて重合体構造の特性評価を行った。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰの^１ＨＮＭＲスペクトルを図３に示した。^１ＨＮＭＲデータは以下の通りであった。
¹H NMR (CDCl₃) δ (1.38-1.41ppm, 9H, (CH₃) ₃C,), δ (1.51-1.60ppm, 3H, CHCH₃O), δ(3.38ppm, 2H, CH₂C₆H₅), δ (3.63-3.70ppm, 4H, CH₂CH₂O), δ (4.60-4.66ppm, 1H, CHCH₂C₆H₅), δ (5.15-5.17ppm, 1H, CHCH₃O).

（３）β−ベンジル−アスパラギン酸残基で末端キャップされたメトキシポリ（エチレングリコール）−ポリラクチドブロック共重合体（ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−Ａｓｐ）の合成
ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００の合成は、例１（２）と同じである。

１００ｍｌの脱イオン水と１００ｍｌのジオキサンとを（混合溶媒として）２２．３ｇのＬ−アスパラギン酸ベンジルに添加して撹拌し、次いで、３０ｍｌの４ＮのＮａＯＨを添加し、ベンジルエステルが溶解するまで撹拌した。反応フラスコを氷浴で冷却し、温度を４℃未満に制御した。これとは別に、８．７ｍｌの臭化ブロモアセチルを、３５ｍｌの精製ジオキサンと約２５ｍｌの４ＮのＮａＯＨに溶解させた。激しい撹拌下、二つの溶液を二つの滴下漏斗を通じて同時に滴加した。ｐＨ値を８と９の間に制御した（添加には約３０分かかった）。添加完了後、反応を５分間継続し、濃塩酸を用いてｐＨ値を２に調節した。２００ｍｌのジエチルエーテルを抽出に用いた。混合物は、有機層に含有されていた。有機層を飽和ＮａＣｌ溶液で５回洗浄した。最後に、乾燥のため有機層に無水硫酸マグネシウムを４８時間添加した。真空下での濃縮によって黄色の粘稠油が得られ、ペトリ皿に入れ、２５ｇのＬ−アスパラギン酸ブロモアセチルベンジルを結晶として得た。

１０ｇのｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、５ｍｌのトリエチルアミンと２．５ｇのＬ−アスパラギン酸ブロモアセチルベンジルとを添加した。反応物質を室温で２４時間撹拌し、ジエチルエーテルを用いて沈殿させ、真空下で乾燥すると、ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−Ａｓｐが得られた。
注記：Ａｓｐは、ベンジルアスパラギン酸残基の略語である。

ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−Ａｓｐのゲル浸透クロマトグラムを図４に示した。ただし、ＰＤＩは１．０５である。

重水素化クロロホルムを溶媒として、４００ＭＢｒｕｋｅｒＮＭＲを用いて重合体構造の特性を明らかにした。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−Ａｓｐの^１ＨＮＭＲデータは以下の通りであった。
¹H NMR (CDCl₃) δ (1.51-1.60ppm, 3H, CHCH₃O)，δ (2.90-3.15ppm, 2H, OCOCH₂)，δ(3.63-3.70ppm, 4H, CH₂CH₂O)，δ(5.13-5.15ppm, 2H, CH₂C₆H₅)，δ (5.15-5.17ppm, 1H, CHCH₃O)，δ(7.34ppm, 5H, C₆H₅).

（４）チロシン残基で末端キャップされたメトキシルポリ（エチレングリコール）−ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）ブロック共重合体（ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＳ）の合成
ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００の合成は、例１（１）と同じである。

１０ｇのｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００を２００ｍｌの再蒸留水に溶解させ、次いで、１．９１ｇの１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩と１．８ｇのチロシンとを添加した。室温で４８時間反応を行った後、２００ｍｌのジクロロメタンを用いて生成物を３回抽出した。一体化した有機層を飽和塩水で５回洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ジエチルエーテルを用いて沈殿させた。真空下での乾燥後、ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＳが得られた。
注記：ＴＳは、チロシン残基の略語である。

ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＳのゲル浸透クロマトグラムを図５に示した。ただし、ＰＤＩは１．０５である。

重水素化クロロホルムを溶媒として、４００ＭＢｒｕｋｅｒＮＭＲ装置を用いて重合体構造の特性を明らかにした。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＳの^１ＨＮＭＲデータは以下の通りであった。
¹H NMR (CDCl₃) δ (1.51-1.60ppm, 3H, CHCH₃O)，δ (2.94-3.00ppm, 2H, CH₂C₆H₅)，δ (3.63-3.70ppm, 4H, CH₂CH₂O)，δ (5.15-5.17ppm, 1H, CHCH₃O)，δ(6.74-6.93ppm, 5H, C₆H₅).

（５）チロシン残基で末端キャップされたポリ（エチレングリコール）−ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）ブロック共重合体（ＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＳ）の合成
ＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００の合成方法は、例１（１）に記載された通りである。

１０ｇのＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００を２００ｍｌの再蒸留水に溶解させ、次いで、１．９１ｇの１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩と１．８ｇチロシンとを添加した。室温で４８時間反応を行った後、２００ｍｌのジクロロメタンを用いて生成物を３回抽出した。一体化した有機相を飽和塩水で５回洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ジエチルエーテル中で沈殿させた。真空下での乾燥後、ＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＳが得られた。
注記：ＴＳは、チロシン残基の略語である。

ＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＳのゲル浸透クロマトグラムを図６に示した。ただし、ＰＤＩは１．０５である。

重水素化クロロホルムを溶媒として、４００ＭＢｒｕｋｅｒＮＭＲを用いて重合体構造の特性を明らかにした。ＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＳの^１ＨＮＭＲデータは以下の通りであった。
¹H NMR (CDCl₃) δ (1.51-1.60ppm, 3H, CHCH₃O)，δ (2.94-3.00ppm, 2H, CH₂C₆H₅)，δ (3.63-3.70ppm, 4H, CH₂CH₂O)，δ (5.15-5.17ppm, 1H, CHCH₃O)，δ(6.74-6.93ppm, 5H, C₆H₅).

（６）ｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニン残基で末端キャップされたメトキシルポリ（エチレングリコール）−ポリカプロラクトンブロック共重合体（ｍＰＥＧ_５０００−ＰＣＬ_４０００−ＢＰ）の合成
２０ｇのｍＰＥＧ（数平均分子量５，０００）を重合用フラスコに添加し、１３０℃に加熱し、真空下で４時間脱水した。２０ｍｇのオクタン酸第一スズと２０ｇのカプロラクトン（ＣＬ）とを添加した。反応フラスコを真空下で密封した後、上記反応物質を１３０℃で２４時間反応させ、ジクロロメタンに溶解し、大量のジエチルエーテルの添加によって完全に沈殿させた。ろ過及び真空乾燥後、ｍＰＥＧ_５０００−ＰＣＬ_４０００ブロック共重合体が得られた。

２５ｍｌのジクロロメタンを溶解のために添加した。得られた溶液を、３０ｇのｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００を含有する１５０ｍｌのジクロロメタン溶液に添加し、完全に混合した。１４ｍｌのピリジンと１６０ｍｇのテトラメチルアミノピリジンとを添加した。混合物を０℃で２時間、次いで、室温で更に２４時間反応させた。ろ過後、重合体溶液を−２０℃のジエチルエーテル中で沈殿させ、真空下で乾燥させるとｍＰＥＧ_５０００−ＰＣＬ_４０００−ＢＰが得られた。
注記：ＢＰは、ｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニン残基の略語である。

ｍＰＥＧ_５０００−ＰＣＬ_４０００−ＢＰのゲル浸透クロマトグラムを図７に示した。ただし、ＰＤＩは１．０８である。
重水素化クロロホルムを溶媒として、４００ＭＢｒｕｋｅｒＮＭＲを用いて重合体構造の特性を明らかにした。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰの^１ＨＮＭＲスペクトルを図８に示した。^１ＨＮＭＲデータは以下の通りであった。
¹H NMR (CDCl₃) δ (1.38-1.43ppm，9H，（CH₃）₃C，)，δ (1.53-1.64ppm, 4H, CH₂CH₂CH₂)，δ(2.34ppm, 2H, COCH₂CH₂)，δ(3.63-3.70ppm, 4H, CH₂CH₂O)，δ(4.06-4.15ppm, 2H, OCH₂CH₂).

（例２）抗腫瘍薬内包高分子ミセルの凍結乾燥製剤の調製
（１）ｍＰＥＧ_５０００−ＰＣＬ_４０００−ＢＰ／パクリタキセルミセル及びその凍結乾燥製剤の調製
例１において調製したｍＰＥＧ_５０００−ＰＣＬ_４０００−ＢＰを１５０ｍｇと、３０ｍｇのパクリタキセルとを２ｍｌのテトラヒドロフランに溶解させた。５ｍｌの超純水を撹拌下に滴加した。添加後、溶液を室温で一晩撹拌し、次いで、有機溶媒を除去して明らかな青オパール色のパクリタキセルミセルの澄明な溶液を得た。１２０ｍｇのマンニトールを添加し、得られた溶液を０．２２μｍメンブレンフィルターに通して滅菌し、凍結乾燥してパクリタキセルミセルの凍結乾燥粉末を得た。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析により、パクリタキセルミセルの薬物被包効率（ｄｒｕｇｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は９８．６％であり、薬物内包効率は１１．２％を超えていた。粒子径測定の結果を図９に示した。ミセルの平均粒子径は３３．８ｎｍであり、多分散性指数（ＰＤＩ）は０．１であった。

凍結乾燥粉末を生理食塩水中で還元し、５ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。溶液は、７日よりも長く室温で安定を保った。これは、アセトキシル又はベンゾイルで末端キャップされた重合体のミセルの場合より有意に長かった。

（２）ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ／ドセタキセルミセル及びその凍結乾燥製剤の調製
１００ｍｇのドセタキセルと例１において調製したｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ１．９ｇとを、２５ｍｌの無水エタノールに溶解させた。有機溶媒を４５℃でロータリーエバポレーションによって除去し、２５ｍｌの生理食塩水を添加して薬物を含有する薄膜を溶解させた。４００ｍｇのラクトースを添加し、次いで、溶液を０．２２μｍメンブレンフィルターに通して滅菌し、凍結乾燥してドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末を得た。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により、ミセルの薬物被包効率が９５．８％であり、薬物内包効率が４．７６％であることが示された。粒子径測定の結果を図１０に示した。平均粒子径は２３．３ｎｍであり、多分散性指数（ＰＤＩ）は０．０２であった。

凍結乾燥粉末を生理食塩水中で還元して５ｍｇ／ｍＬの溶液を得、室温で９０日間保管した。溶液中に溶解しているドセタキセルの含有量は、９０％を超えていた。

（３）ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢ／カバジタキセルミセル及びその凍結乾燥製剤の調製
例１において調製したｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢを１．９ｇ、溶融するまで５０℃に加熱した。１００ｍｇのカバジタキセルを溶融した重合体に撹拌下に添加して溶解させると、澄明で透明な混合物が得られた。次いで、２５ｍｌの５０℃生理食塩水を添加して重合体／薬物の混合物を溶解させてミセル溶液を得た。４００ｍｇのスクロースを添加し、溶液を０．２２μｍメンブレンフィルターでろ過して滅菌し、凍結乾燥してカバジタキセルミセルの凍結乾燥粉末を得た。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により、薬物被包効率が９６．２％であり、薬物内包効率が４．８２％を超えていることが示された。粒子径測定の結果を図１１に示した。平均粒子径は２４．２ｎｍであり、多分散性指数（ＰＤＩ）は０．０２であった。

前記凍結乾燥粉末を生理食塩水中で還元して５ｍｇ／ｍＬの溶液を得、室温で９０日間保管した。溶液中に溶解したカバジタキセルの含有量は、９０％を超えていた。

（４）ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ／クルクミン及びその凍結乾燥製剤の調製
１００ｍｇのクルクミンと例１において調製したｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ１．９ｇとを、２５ｍｌの無水エタノールに溶解させた。５０℃でロータリーエバポレーションにより有機溶媒を除去した。２５ｍｌの生理食塩水を添加して薬物を含有する薄膜を溶解させた。４００ｍｇのアルギン酸ナトリウムを添加し、溶液を０．２２μｍメンブレンフィルターに通して滅菌し、凍結乾燥してクルクミンミセルの凍結乾燥粉末を得た。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により、薬物被包効率が９８．９％であり、薬物内包効率が４．８８％であることが示された。平均粒子径は１５．３ｎｍであり、多分散性指数（ＰＤＩ）は０．０２であった。

前記凍結乾燥粉末を生理食塩水中で還元して５ｍｇ／ｍＬの溶液を得、室温で７日間保管した。溶液に溶解しているクルクミンの含有量は、９０％を超えていた。

（５）ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢ／ドキソルビシン及びその凍結乾燥製剤の調製
例１において調製したｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢを３００ｍｇと、４０ｍｇの塩酸ドキソルビシンとを４０℃でクロロホルムに溶解させた。０．１ｍｌのトリエチルアミンを添加し、室温で１時間撹拌した。有機溶媒をロータリーエバポレーションによって除去し、５０ｍｌの１０ｍＭのＨＢＳ緩衝液を添加して薬物を含有する薄膜を溶解させた。トリエチルアミン塩酸塩を透析又は限外ろ過によって除去し、次いで、２５０ｍｇのゼラチンを添加した。溶液を０．２２μｍメンブレンフィルターに通して滅菌し、凍結乾燥してドキソルビシンミセルの凍結乾燥粉末を得た。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により、薬物被包効率が９４．７％であり、薬物内包効率が２２．４７％を超えていることが示された。平均粒子径は１９．４ｎｍであり、多分散性指数（ＰＤＩ）は０．０４であった。

前記凍結乾燥粉末を生理食塩水中で還元して２ｍｇ／ｍＬの溶液を得、室温で２４時間保管した。溶液中に溶解したドキソルビシンの含有量は、９０％を超えていた。

（例３）安定性試験
（１）ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ／ドセタキセルミセルの安定性試験
ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ／ドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末を還元し（ドセタキセル濃度：６ｍｇ／ｍｌ）、２５℃の定温器で一定期間保管した。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清の薬物含有量をＨＰＬＣによって測定した。

溶解状態での薬物の含有量の経時変化を図１２に示した。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ／ドセタキセルミセルの溶液中に溶解した薬物の含有量は、最初の１５日間にある程度減少した。その後、薬物の放出は、ずっと遅くなった。溶解状態での薬物の含有量は、９０日にわたり９０％を超えたままであった。

（２）ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢ／カバジタキセルミセルの安定性試験
ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢ／カバジタキセルミセルの凍結乾燥粉末を還元し（カバジタキセル濃度：６ｍｇ／ｍｌ）、２５℃の定温器で一定期間保管した。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清の薬物含有量をＨＰＬＣによって測定した。

溶解状態での薬物の含有量の経時変化を図１３に示した。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＧＡ_２０００−ＴＢ／カバジタキセルミセルの溶液中に溶解した薬物の含有量は、最初の３日間にある程度減少した。その後、薬物の放出は、ずっと遅くなった。溶解状態での薬物の含有量は、９０日にわたり９０％を超えたままであった。

（例４）薬力学試験
（１）ドセタキセル注射液及びドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末のヌードマウスにおけるヒト肺がんＨ４６０腫瘍に対する抑制
Ａ．薬物及び試薬：
０．９％生理食塩水に溶解させた、例２において調製したものと同じＳｈａｎｄｏｎｇＴａｒｇｅｔＤｒｕｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ．が供給するドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末
ドセタキセル注射液、チューブ一本当たり０．５ｍｌ：２０ｍｇ、ＱｉｌｕＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．製造
０．９％生理食塩水に溶解させた、ＳｈａｎｄｏｎｇＴａｒｇｅｔＤｒｕｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ．が供給する溶媒対照（ブランクミセル、１０ｍｇ／ｋｇ）

Ｂ．実験動物：
ＢＡＬＢ／ｃｎｕマウス、４〜６週齢、どちらかの性（腫瘍により、各試験で同性のものを使用）は、ＢｅｉｊｉｎｇＨＦＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＣｏ．，Ｌｔｄ．、証明書番号：ＳＣＸＫ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）２００９−０００４から供給された。

Ｃ．飼育施設：
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣｅｎｔｅｒ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓのバリア飼育施設。登録番号：ＳＹＸＫ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）２００９−０００４；有効期間：２００９年２月２５日〜２０１４年２月２５日。

Ｄ．腫瘍細胞株：
ＡＴＣＣからのヒト肺がんＨ４６０細胞を我々の実験室にてｉｎｖｉｔｒｏで培養し、ヌードマウスに接種して腫瘍を形成し、継代培養して保存した。

Ｅ．試験方法
良好な状態にあり、十分に成長したＨ４６０腫瘍を持つ担腫瘍動物を選択し、頸椎脱臼によって屠殺した。滅菌状態下で腫瘍を摘出し、外科用メスで直径２〜３ｍｍに細かく切断し、ヌードマウスの腋窩の皮下にトロカールを用いて接種した。接種から７〜８日後、担腫瘍マウスの腫瘍の平均体積は約１１０〜１２０ｍｍ^３であった。動物は腫瘍サイズに基づき、マウス８匹ずつの群にグループ分けした。

陰性対照群、溶媒対照群、ドセタキセル注射液群（１０ｍｇ／ｋｇ／回）、及びドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末用の群（ドセタキセル基準で１０ｍｇ／ｋｇ／回）を設定した。ただし、陰性対照群の動物の腫瘍は自然に成長し、溶媒対照群に用いた溶媒は、ドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末用の群と同じ体積とした。ドセタキセル注射液は希釈してドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末用の群と同じ体積とした。各群の動物には、同時に静脈注射した。

グループ分けした日から、各群の動物には予定通り３日おきに、合計で３回静脈内投与した。陰性対照群の平均腫瘍体積が約２，０００ｍｍ^３に達した時点で観察を終了した。

実験統計及び評価方法：
（Ａ）腫瘍体積計算式：Ｖ＝ａ×ｂ^２／２（式中、ａ及びｂは、それぞれ長さ及び幅を表す）
（Ｂ）相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を式Ｖｔ／Ｖｏによって計算した（式中、Ｖｏはグループ分けの日に測定したＴＶ、Ｖｔはその後に測定したＴＶである）
ＴＶは腫瘍体積を表す。
（Ｃ）相対腫瘍増殖速度（Ｔ／Ｃ（％））を、抗腫瘍活性を評価するための基準として使用し、以下の式によって計算した：
Ｔ／Ｃ（％）＝治療群のＲＴＶ（Ｔ）／陰性対照群のＲＴＶ（Ｃ）×１００
（Ｄ）薬物の腫瘍成長に対する抑制率を、以下の式によって計算した：
腫瘍抑制率（％）＝（対照群の平均腫瘍重量−治療群の平均腫瘍重量）／対照群の平均腫瘍重量×１００
（Ｅ）腫瘍重量、腫瘍体積、ＲＴＶ及び他の基準に関する群間の差についての統計的有意性を、ｔ−検定によって計算した。
（Ｆ）評価基準：Ｔ／Ｃ（％）＞４０を効果なしと判定し、Ｔ／Ｃ（％）≦４０且つＰ＜０．０５を効果ありと判定した。

Ｆ．結果及び結論：
ドセタキセル注射液群（１０ｍｇ／ｋｇ／回）とドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末用の群（１０ｍｇ／ｋｇ／回）のいずれも、ヌードマウスのＨ４６０腫瘍の成長に対して有意な抑制効果を示し、腫瘍体積は有意に減少した。ドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末用の群（１０ｍｇ／ｋｇ／回）では、腫瘍体積は投与期間中徐々に減少し、腫瘍体積は、ほぼ１０日間、投与前の平均体積未満に維持された。ドセタキセル注射液群（１０ｍｇ／ｋｇ／回）と比較すると、同じ用量で静脈内注射されたドセタキセルミセルの腫瘍に対する抑制効果は有意に向上し、腫瘍重量に対する抑制率は、前者の群では６８．３５％、後者の群では９７．５％であり、相対腫瘍増殖速度は、前者の群では２５．２５％、後者の群では３．７８％と、有効性が増強されたことを示唆している。

ドセタキセル注射液及びドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末のＨ４６０腫瘍に対する抑制効果を、図１４及び図１５に示した。

ドセタキセル注射液及びドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末のＨ４６０腫瘍に対する抑制率と、相対腫瘍増殖速度を、表１及び表２に示した。

（２）ドセタキセル注射液及びドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末のヌードマウスにおけるヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍に対する抑制
Ａ．薬物及び試薬：例４（１）に同じ。

Ｂ．実験用動物：例４（１）に同じ。

Ｃ．飼育施設：例４（１）に同じ。

Ｄ．腫瘍細胞株：
ＡＴＣＣから得たヒト乳がんＭＡＤ−ＭＢ−２３１細胞を我々の実験室にてｉｎｖｉｔｒｏで培養し、ヌードマウスに接種して腫瘍を形成し、継代培養して保存した。

Ｅ．試験方法
良好な状態にあり、十分に成長したＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を持つ担腫瘍動物を選択し、頸椎脱臼によって屠殺した。滅菌状態下で腫瘍を摘出し、外科用メスで直径２〜３ｍｍに細かく切断し、ヌードマウスの腋窩の皮下にトロカールを用いて接種した。接種から１１日後、担腫瘍マウスの腫瘍の平均体積は約１１０〜１２０ｍｍ^３であった。動物は腫瘍サイズに基づき、マウス８〜９匹ずつの群にグループ分けした。

陰性対照群、溶媒対照群、ドセタキセル注射液群（１０ｍｇ／ｋｇ／回）、及びドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末用の群（ドセタキセル基準で１０ｍｇ／ｋｇ／回）を設定した。ただし、陰性対照群の動物の腫瘍は自然に成長し、溶媒対照群に用いた溶媒は、ドセタキセルミセル群（１０ｍｇ／ｋｇ用量）と同じ体積とした。ドセタキセル注射液は希釈してドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末用の群と同じ体積とした。各群の動物には、同時に静脈注射した。

実験統計及び評価方法：
（Ａ）腫瘍体積計算式：Ｖ＝ａ×ｂ^２／２（式中、ａ及びｂは、それぞれ長さ及び幅を表す）
（Ｂ）相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を式Ｖｔ／Ｖｏによって計算した（式中、Ｖｏはグループ分けの日に測定したＴＶ、Ｖｔはその後に測定したＴＶである）
（Ｃ）相対腫瘍増殖速度（Ｔ／Ｃ（％））を、抗腫瘍活性を評価するための基準として使用し、以下の式によって計算した：
Ｔ／Ｃ（％）＝治療群のＲＴＶ（Ｔ）／陰性対照群のＲＴＶ（Ｃ）×１００
（Ｄ）薬物の腫瘍成長に対する抑制率を、以下の式によって計算した：
腫瘍抑制率（％）＝（対照群の平均腫瘍重量−治療群の平均腫瘍重量）／対照群の平均腫瘍重量×１００
（Ｅ）腫瘍重量、腫瘍体積、ＲＴＶ及び他の基準に関する群間の差についての統計的有意性を、ｔ−検定によって計算した。
（Ｆ）評価基準：Ｔ／Ｃ（％）＞４０を効果なしと判定し、Ｔ／Ｃ（％）≦４０且つＰ＜０．０５を効果ありと判定した。

Ｆ．結果及び結論：
ドセタキセル注射液群（１０ｍｇ／ｋｇ／回）及びドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末用の群（１０ｍｇ／ｋｇ／回）の乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を持つマウスには、間欠的に３回静脈内注射した。ヌードマウスにおける腫瘍成長は、薬物によって有意に抑制された。３回の投与後、腫瘍体積は、投与前の体積と比較して次第に減少した。ドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末用の群（１０ｍｇ／ｋｇ／回）では、腫瘍成長はほぼ停止した。ドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末用の群のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍に対する抑制効果は、同じ用量のドセタキセル注射液群と比べて良好であった。

ドセタキセル注射液及びドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍に対する抑制効果を、図１６及び図１７に示した。

ドセタキセル注射液及びドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍に対する抑制率と、相対腫瘍増殖速度を、表３及び表４に示した。

（例５）薬物動態研究
（１）ラットにおける血漿薬物動態比較研究
Ａ．実験動物：
体重２４０±２０ｇの雄のＳＤラットを、各群６匹ずつ４つの群（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ）にランダムに分けた。

Ｂ．実験用調製物：
ドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末（ａ）を、例２（２）の手順で調製した；バッチ番号：２０１２０９０７；規格：２０ｍｇドセタキセル／ボトル；
カバジタキセルミセルの凍結乾燥粉末（ｂ）を、例２（３）の手順で調製した；バッチ番号：２０１２０８３０；規格：２０ｍｇカバジタキセル／ボトル；
Ｄｏｐａｆｅｉ（ドセタキセル注射液、ｃ）は、ＱｉｌｕＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．の製品である；バッチ番号：１１２０３１２ＴＡ：規格：０．５ｍｌ、２０ｍｇ；
カバジタキセルの凍結乾燥粉末（ｄ）を、Ｔｗｅｅｎ−８０を可溶化剤として調製した。

Ｃ．投与及びサンプル採集：
実験用調製物を、使用直前に適切な濃度に溶解又は希釈した。５ｍｇ／ｋｇのドセタキセルミセル（ａ）と、カバジタキセルミセル（ｂ）（それぞれドセタキセル及びカバジタキセルの含有量基準）を、それぞれＩ群及びＩＩ群のラットに尾静脈から注射し、５ｍｇ／ｋｇのドセタキセル注射液（ｃ）及びカバジタキセルの凍結乾燥粉末（ｄ）を、それぞれＩＩＩ群及びＩＶ群のラットに尾静脈から注射した。投与後の異なる時点で血液サンプルをラットの眼窩静脈叢から採取し、ヘパリンが入った抗凝固遠心分離管に入れて遠心分離し、血漿を得た。将来の使用に備え、血漿サンプルを−８０℃の超低温フリーザーで保管した。

Ｄ．血漿中濃度−時間曲線及び薬物動態パラメーター：
メタノールで沈殿させてタンパク質を除去した後、血漿サンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析し、ドセタキセル又はカバジタキセル（ｃａｂａｚｉｔａｘｅ）の全薬物濃度を判定した。各治療群の血漿中薬物濃度対時間曲線を図１８（ラットに静脈内投与したドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末（ａ）及びドセタキセル注射液（ｃ）の血漿中濃度対時間曲線）、及び図１９（ラットに静脈内投与したカバジタキセルの凍結乾燥粉末ミセル（ｂ）及びカバジタキセルの凍結乾燥粉末（ｄ）の血漿中濃度−時間曲線）に示した。

一方で、限外ろ過によって遊離薬物を除去した後、血漿サンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析し、被包されたドセタキセル又はカバジタキセルの濃度を判定した。ドセタキセルミセル及びカバジタキセルミセルを静脈内投与されたラットの血漿中の全薬物及び被包された薬物の濃度−時間曲線を描き、図２０（ドセタキセルミセル、静脈内投与５ｍｇ／ｋｇ），及び図２１（カバジタキセルミセル、静脈内投与５ｍｇ／ｋｇ）に示した。

Ｅ．結果：
結果は、ドセタキセルミセル群とカバジタキセルミセル群のいずれも、対応する注射液群と比較して、有意に薬物の血漿中濃度が高く、排出半減期が長いことを示唆している。特に、ドセタキセルミセル及びドセタキセル注射液（静脈内投与５ｍｇ／ｋｇ、ドセタキセル基準）の血漿ＡＵＣは、それぞれ３，７３２ｎｇ／ｍｌｈ及び４３６ｎｇ／ｍｌｈであり、ｔ_１／２は、それぞれ１．９ｈ及び０．１ｈであった。カバジタキセルミセル及びカバジタキセル注射液（静脈内投与５ｍｇ／ｋｇ、カバジタキセル基準）の血漿ＡＵＣは、それぞれ４，２９５ｎｇ／ｍｌｈ及び４８２ｎｇ／ｍｌｈであり、ｔ_１／２は、それぞれ２．７ｈ及び０．３ｈであった。ドセタキセルミセル群及びカバジタキセルミセル群の血漿ＡＵＣは、対応する注射液群のそれぞれ８．５６倍及び８．９１倍であった。加えて、図２０及び図２１に示すように、静脈内投与から２４時間後、血漿中のドセタキセルミセル及びカバジタキセルミセルはいずれも、主に被包されたミセルの形態であった。ミセル投与の血漿薬物動態特性は、本発明によって調製されたミセルの優れた安定性と、独特なｉｎｖｉｖｏ放出特性を示唆している。

（２）担腫瘍マウスの腫瘍組織における薬物分布の比較研究
Ａ．実験動物：
腋窩に５×１０^６の密度でＭＸ−１ヒト乳がん細胞を接種した雌のヌードマウスを、腫瘍が体積約５００ｍｍ^３に成長した後、ランダムに２つの群に分けた（Ｉ群：ドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末用の群、ＩＩ群：ドセタキセル注射液の群）。２群のマウスの体重は、それぞれ２４．９±１．２ｇ及び２５．０±１．３ｇであり、有意な差はなかった（Ｐ＞０．０５）。各群は次いで、担腫瘍マウス１０匹ずつの７つの下位群に均等に分けた。

Ｂ．実験用調製物：
ドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末を、例２（２）の手順で調製した；バッチ番号：２０１２０９０７；規格：２０ｍｇ／ボトル；
Ｄｏｐａｆｅｉ（ドセタキセル注射液）は、ＱｉｌｕＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．の製品である；バッチ番号：１１２０３１２ＴＡ：規格：０．５ｍｌ，２０ｍｇ。

Ｃ．投与及びサンプル採集：
ドセタキセル注射液及びドセタキセルミセルの凍結乾燥粉末を使用直前に適切な濃度に溶解又は希釈し、１０ｍｇ／ｋｇの用量（ドセタキセル基準）でそれぞれＩ群及びＩＩ群の動物に尾静脈から注射した。各群のマウスを、投与してから５分、１５分、３０分、１時間、３時間、８時間、及び２４時間後に屠殺し、腫瘍組織をこすり取り（ｓｃｒａｐｐｅｄ）、計量し、将来の使用に備え、−８０℃の超低温フリーザーで保管した。

Ｄ．腫瘍組織における薬物分布：
ホモジネート後、腫瘍組織をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析し、ドセタキセルの濃度を判定した。各治療群からの腫瘍組織における薬物の濃度−時間曲線を図２２に示した。同じ用量（１０ｍｇ／ｋｇ）では、投与後２４時間以内のヌードマウスの腫瘍組織内のドセタキセルのＡＵＣは、注射液群（Ｉ群）では４５．５２８ｍｇ／Ｌｈ、ミセル群（ＩＩ群）では５７．０８９ｍｇ／Ｌｈであった。これらの結果は、ドセタキセルミセル群の腫瘍組織における薬物分布は、ドセタキセル注射液群よりも有意に高く、（Ｐ＜０．０１）、その差は２５．４％であったことを示している。

上記の実施例は本発明の好適な実施形態である。しかし、本発明の実施形態は上記の実施例によって限定されるものではない。本発明の精神又は原理を逸脱しない限り、本発明に対するいかなる変形、変更、置換、組合せ及び単純化も、本発明の均等物であり、本発明の範囲に含まれる。

（例６）Ｂｏｃ−フェニルアラニンで末端キャップされたｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００共重合体／パクリタキセルミセル、及びベンゾイルで末端キャップされたｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００共重合体／パクリタキセルミセルのｉｎｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏ安定性についての比較研究
（１）共重合体の調製：ベンゾイルで末端キャップされたｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００共重合体を、ＣＮ０１８０９６３２．８に記載の方法で合成した。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰを、本出願の例１（２）に記載の方法で合成した。２つの共重合体のうちのいずれかを添加剤として用い、パクリタキセルを薬物として用いてパクリタキセルミセルを調製した。

（２）ミセルの調製：１５０ｍｇの共重合体と、３０ｍｇのパクリタキセルとを５ｍｌのエタノールに溶解させた。溶媒を４５℃でロータリーエバポレーションによって除去した。次いで、５ｍｌの生理食塩水を添加し、薬物を溶解させた。得られた溶液を０．２２μｍメンブレンに通してろ過し、３７^ｏＣで保管して安定性を観察した。

（３）安定性試験方法：ミセル溶液を尾静脈からラットの血液中に注射し、血液サンプルを異なる時点に採取して高速液体クロマトグラフィーにかけ、血液中のパクリタキセル含有量を判定した。

（４）結果及び結論：二種類のミセルの血漿中薬物濃度−時間曲線を図２３に示した。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ／パクリタキセルミセル群の血漿中濃度は、ベンゾイルでキャップされたｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００共重合体／パクリタキセルミセル群よりも有意に高く、８０％を超える薬物がミセルに被包されており、優れたｉｎｖｉｖｏ安定性を示唆している。ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ／パクリタキセルミセルの場合は、少なくとも４８時間にわたり、薬物の沈殿は観察されなかったが、ベンゾイルでキャップされたｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００共重合体／パクリタキセルミセルでは、１７時間後に著しい薬物の沈殿が発生し、ｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_１８００−ＢＰ／パクリタキセルミセルの安定性は、ベンゾイルでキャップされたｍＰＥＧ_２０００−ＰＬＡ_{１８００／}パクリタキセルミセルよりも有意に高いことを示唆している。

Claims

両親媒性ブロック共重合体の少なくとも一種、治療有効量の抗腫瘍薬の少なくとも一種、及び薬学的に許容される医薬助剤を含む、ミセル状薬物内包システムであって、
前記両親媒性ブロック共重合体は、親水性セグメントと疎水性セグメントとを含み；前記親水性セグメントが７５０〜５０００の範囲の数平均分子量を持つポリエチレングリコール又はメトキシポリエチレングリコールであり；前記疎水性セグメントがポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリカーボナート、及びポリジオキサノンからなる群から選択され、各々が１０００〜５００００の範囲の数平均分子量を有し、かつ疎水基で末端キャップされ；前記疎水基がｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニンであることを特徴とする、ミセル状薬物内包システム。
前記医薬助剤が凍結乾燥用添加剤であることを特徴とする、請求項１に記載のミセル状薬物内包システム。
前記凍結乾燥用添加剤が、ラクトース、マンニトール、スクロース、トレハロース、フルクトース、グルコース、アルギン酸ナトリウム及びゼラチンのうちの少なくとも一種であることを特徴とする、請求項２に記載のミセル状薬物内包システム。
前記抗腫瘍薬が、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、ラロタキセル、クルクミン、ドキソルビシン及びエピルビシンのうちの少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載のミセル状薬物内包システム。