CN110575435A - 一种超分子抗肿瘤药物体系及其构建方法 - Google Patents

一种超分子抗肿瘤药物体系及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110575435A
CN110575435A CN201910682283.5A CN201910682283A CN110575435A CN 110575435 A CN110575435 A CN 110575435A CN 201910682283 A CN201910682283 A CN 201910682283A CN 110575435 A CN110575435 A CN 110575435A
Authority
CN
China
Prior art keywords
supramolecular
acryl
antitumor drug
drug
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910682283.5A
Other languages
English (en)
Inventor
何建芳
李晓东
朱蔚璞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN201910682283.5A priority Critical patent/CN110575435A/zh
Publication of CN110575435A publication Critical patent/CN110575435A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供了一种超分子抗肿瘤药物体系及其构建方法，超分子抗肿瘤药物体系包括纳米胶束载体PEG6‑PPC1和负载在纳米载体上的抗肿瘤药物阿霉素，载药量为15wt％。该超分子抗肿瘤药物体系通过合成无毒的PEG6‑PPC1纳米胶束载体并在其上负载抗肿瘤药物阿霉素构建一种超分子抗肿瘤药物体系，该方法简单，易于推广，有利于研制一种稳定安全高效的超分子纳米抗肿瘤药物。同时构建的超分子抗肿瘤药物体系经体外细胞学检测表明该体系稳定性良好，大大提高了体外肿瘤细胞对药物的摄取性能，同时载药量最高达15wt％具有更安全更有效的抗肿瘤作用。

Description

一种超分子抗肿瘤药物体系及其构建方法
技术领域
本发明涉及高分子材料合成和基础医学研究领域，涉及一种超分子纳米载药体系的构建和抗肿瘤作用研究
背景技术
现有大部分抗肿瘤化疗药物水溶性差，体内半衰期短，导致体内的药物浓度在短时间循环后会很快降低，需要每次使用较大剂量或者分多次进行给药；而抗癌药物本身缺乏对肿瘤细胞的特异选择性，在杀死癌细胞的同时不可避免地对正常组织也造成巨大挫伤，从而引起严重的毒副作用，如胃肠道反应、免疫功能下降、骨髓抑制、心肌毒性及神经系统毒性等，导致化疗病患恶心、呕吐、脱发甚至衰竭死亡，致使大部分病患排斥抗拒化学治疗，一定程度上限制了化疗在临床上的广泛使用。因此，如何进一步提高化疗药物的疗效并降低其毒副作用已成为现今临床化疗迫切需要解决的问题。
作为一类具有分子识别能力的分子间非共价键的强相互作用，通过主体分子对客体分子的选择性识别进行组装，类似“锁和钥匙”的分子间专一性结合，已被广泛地应用于各类超分子组装体的构建。目前，在临床治疗中这一系列药物载体仍存在一定缺陷，由于药物是通过物理作用负载于载体之内，其包载稳定性差，易提前爆释致使血药浓度难以掌握；同时不稳定的结合方式及胶束空间的局限性也导致了该类剂型载药量低。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种超分子抗肿瘤药物体系及其构建方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种超分子抗肿瘤药物体系，包括纳米胶束载体PEG6-PPC1和负载在纳米载体上的抗肿瘤药物阿霉素，载药量为15wt％。
一种上述的一种超分子抗肿瘤药物体系的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)载体材料mPEG-acryl的合成：
通过mPEG(聚乙二醇单甲醚)的端羟基与丙烯酰氯进行酰化反应对mPEG进行双键化修饰：在无水无氧条件下，将10g甲苯共沸除水后的mPEG，溶于250mL无水THF(四氢呋喃)中，滴加0.56mL TEA(三乙胺)后在0℃下搅拌30分钟，缓慢滴加0.32mL丙烯酰氯，并于室温下反应24h。然后滤除不溶物，并浓缩滤液，加入冷乙醚直至沉淀完全，得到粗产物。进一步通过透析提纯得到终产物mPEG-acryl。
(2)载体材料PPC-acryl的合成：
在无水无氧处理后的圆底烧瓶中，加入10g PPC(聚对苯二甲酸酯碳酸酯)，并加入150ml无水二氯甲烷进行溶解，在0℃下滴加1.59mL三乙胺并搅拌30分钟，再缓慢滴加0.92mL丙烯酰氯，并在室温下反应24h。反应结束后滤除不溶物，浓缩滤液并通过150ml二氯甲烷和150ml水进行萃取，有机相用无水硫酸镁进行干燥后，过滤、旋蒸除去溶剂后干燥24小时获得产物PPC-acryl。
(3)未载药纳米胶束载体的制备：
将步骤(1)和(2)中制备获得的mPEG-acryl、PPC-acryl按摩尔比为6:1混合均匀组装成纳米胶束载体PEG6-PPC1，纳米胶束载体的颗粒尺寸为118nm。
(4)药物阿霉素的处理：
将0.5g盐酸阿霉素溶于20ml水中，并加入等量三乙胺，密封搅拌12h后离心得到粗产物，将粗产物进一步用水洗涤除去三乙胺盐，真空干燥至恒重得到终产物。
(5)抗肿瘤药物体系的制备：
在步骤(3)制得的纳米胶束载体PEG6-PPC1上负载步骤(4)制得的阿霉素，阿霉素与纳米胶束载体的投料质量比为1.5:10。
进一步地，所述mPEG的分子量为5000，PPC的分子量为3500。
本发明的有益效果是通过合成无毒的PEG6-PPC1纳米胶束载体并在其上负载抗肿瘤药物阿霉素构建一种超分子抗肿瘤药物体系，该方法简单，易于推广，有利于研制一种稳定安全高效的超分子纳米抗肿瘤药物。同时构建的超分子抗肿瘤药物体系经体外细胞学检测表明该体系稳定性良好，大大提高了体外肿瘤细胞对药物的摄取性能，同时载药量最高达15wt％具有更安全更有效的抗肿瘤作用。
附图说明
图1载药胶束在不同药物负载量下及不同稀释条件下的粒径及分布：未载药胶束粒径(A)理论载药量为5wt％胶束粒径(B)；理论载药量为10wt％胶束粒径(C)及理论载药量为15wt％胶束粒径(D)；
图2不同浓度药物加药即刻PEG6-PPC1胶束及阿霉素(DOX)对Hela细胞形态影响；
图3药物作用2天后PEG6-PPC1胶束及阿霉素(DOX)对Hela细胞形态影响。
具体实施方式
实施例1：构建超分子抗肿瘤药物体系
1.载体材料mPEG-acryl的合成
通过mPEG的端羟基与丙烯酰氯进行酰化反应对mPEG进行双键化修饰：在无水无氧条件下，将甲苯共沸除水后的mPEG(分子量为5000，PEG5000，10g，2mmol)溶于250mL无水THF中，滴加0.56mL TEA后在0℃下搅拌30分钟，缓慢滴加0.32mL丙烯酰氯，并于室温下反应24h。采用真空抽滤滤除不溶物，并旋蒸浓缩滤液，加入冷乙醚直至沉淀完全，得到粗产物。进一步通过透析提纯得到终产物mPEG-acryl，并将其溶于氘代氯仿中，通过1H NMR对合成的聚乙二醇丙烯酸酯结构进行表征，表明相应的质子峰均很好地对应于合成的聚乙二醇丙烯酸酯结构上的氢，而归属于聚乙二醇与丙烯酰氯间的连接亚甲基质子峰Hc的出现及归属于丙烯酰氯上的两个双键质子峰He和Hd的出现证实了聚乙二醇与丙烯酰氯的成功反应。且通过积分可知双键质子峰He和Hd积分面积与聚乙二醇的单甲氧基Ha的积分面积比例与理论值相符，进一步证实了载体材料mPEG-acryl的成功制备。
2.载体材料PPC-acryl的合成
在无水无氧处理后的圆底烧瓶中，加入PPC(分子量为3500，10g，2.86mmol)，并加入150ml无水二氯甲烷进行搅拌溶解，在0℃下滴加1.59mL三乙胺并搅拌30分钟，再缓慢滴加0.92mL丙烯酰氯，并在室温下反应24h。反应结束后抽滤滤除不溶物，浓缩滤液后通过150ml二氯甲烷和150ml水进行水洗萃取，有机相用无水硫酸镁进行干燥后，过滤旋蒸除去溶剂后干燥24小时获得产物PPC-acryl，并将其溶于氘代氯仿中，通过1H NMR对其结构进行表征分析，分析结果表明归属于双键信号峰Ha，Hb和Hc的出现且三者的积分面积与PPC上的甲基He的积分面积比例与理论值相符。其余质子峰均很好地对应于合成的聚乙二醇丙烯酸酯结构。证实了寡聚碳酸亚丙酯双丙烯酸酯的成功制备，无其它副产物产生。
3.未载药纳米粒子的制备
将制备取得的mPEG-acryl：PPC-acryl按摩尔比率为6:1混合组装成PEG6-PPC1，颗粒尺寸为118nm。
4.药物阿霉素的处理
盐酸阿霉素进行脱盐处理得到疏水药物阿霉素：将0.5g盐酸阿霉素溶于20ml水中，并加入过量三乙胺，密封搅拌12h后离心得到粗产物，将粗产物进一步用水洗涤除去三乙胺盐，真空干燥至恒重得到终产物。
5.载药纳米粒子的制备
PEG6-PPC1纳米粒子进行阿霉素负载，阿霉素与载体胶束的投料质量比为1.5:10。
实施例2：超分子抗肿瘤药物体系的稳定性分析
作为纳米药物载体在体内需实现药物的稳定运输，但由于人体环境的复杂性及多变性，尤其是静脉注射给药后，大量的体液环境稀释可使超分子抗肿瘤药物体系大幅降低从而导致超分子抗肿瘤药物体系快速解离及负载药物的提前爆释，故超分子抗肿瘤药物体系的稳定性也是一个需重视的关键问题。本实施例中采用高倍稀释法对制备的纳米药物的稳定性进行分析，超分子抗肿瘤药物体系中阿霉素的载药量为5wt％、10wt％、15wt％，并分别用生理盐水进行10倍，400倍，2000倍的稀释，结果如图1所示，随着浓度的稀释，不同载药量的超分子抗肿瘤药物体系粒径尺寸基本保持不变，仅5nm左右的变化幅度，且分布也较窄，说明本发明的超分子抗肿瘤药物体系具有较好的稳定性。
实施例3：本发明的超分子抗肿瘤药物体系体外抗肿瘤细胞研究
将纳米胶束载体PEG6-PPC1、阿霉素、实施例1制备的超分子抗肿瘤药物体系与Hela细胞共同孵育48小时。如图2和3所示，左边第一列为加入纳米胶束载体PEG6-PPC1后的细胞状态，从上到下胶束浓度分别为0.01mg/L，0.1mg/L，1mg/L，10mg/L，100mg/L和1000mg/L，从图中可以看出Hela细胞在与不同浓度的未载药纳米胶束共同孵育48小时后仍呈现较好的生长状态，细胞形态饱满，且铺满整个视野，各个浓度组间没有差异。中间一列和右边一列分别为阿霉素组和超分子抗肿瘤药物体系组，从上到下药物浓度分别为0.01mg/L，0.1mg/L，1mg/L，2.5mg/L，5mg/L和10mg/L。在共同孵育48小时后，发现两组的细胞状态相似，随着药物浓度的增高，细胞成圆形皱缩逐渐明显；最高浓度的超分子抗肿瘤药物体系组细胞出现漂浮现象。相同浓度的阿霉素(DOX)和超分子抗肿瘤药物体系组的细胞形态无明显差异，呈现相似的抑制毒性。
以上研究结果证明，.本发明制备的超分子抗肿瘤药物体系具有良好的稳定性，阿霉素载药量为15wt％，体外细胞毒性进行评测证实了纳米胶束载体PEG6-PPC1的无毒性；通过纳米胶束载体负载可大大提高体外肿瘤细胞对疏水药物的摄取性能。证实了超分子抗肿瘤药物体系可快速地被吞入肿瘤细胞，实现负载药物的快速释放，并进入肿瘤细胞核进行细胞抑制作用。
在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种超分子抗肿瘤药物体系，其特征在于：包括纳米胶束载体PEG6-PPC1和负载在纳米载体上的抗肿瘤药物阿霉素，载药量为15wt％。
2.一种权利要求1所述的一种超分子抗肿瘤药物体系的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)载体材料mPEG-acryl的合成：
在无水无氧条件下，将10g甲苯共沸除水后的mPEG，溶于250mL无水THF中，滴加0.56mLTEA后在0℃下搅拌30分钟，滴加0.32mL丙烯酰氯，并于室温下反应24h。然后滤除不溶物，并浓缩滤液，加入冷乙醚直至沉淀完全，得到粗产物。进一步通过透析提纯得到终产物mPEG-acryl。
(2)载体材料PPC-acryl的合成：
在无水无氧处理后的圆底烧瓶中，加入10g PPC，并加入150ml无水二氯甲烷进行溶解，在0℃下滴加1.59mL三乙胺并搅拌30分钟，再滴加0.92mL丙烯酰氯，并在室温下反应24h。反应结束后滤除不溶物，浓缩滤液并通过150ml二氯甲烷和150ml水进行萃取，有机相用无水硫酸镁进行干燥后，过滤、旋蒸除去溶剂后干燥24小时获得产物PPC-acryl。
(3)未载药纳米胶束载体的制备：
将步骤(1)和(2)中制备获得的mPEG-acryl、PPC-acryl按摩尔比为6:1混合均匀组装成纳米胶束载体PEG6-PPC1，纳米胶束载体的颗粒尺寸为118nm。
(4)药物阿霉素的处理：
将0.5g盐酸阿霉素溶于20ml水中，并加入120ml三乙胺，密封搅拌12h后离心得到粗产物，将粗产物进一步用水洗涤除去三乙胺盐，真空干燥至恒重得到终产物。
(5)抗肿瘤药物体系的制备：
在步骤(3)制得的纳米胶束载体PEG6-PPC1上负载步骤(4)制得的阿霉素，阿霉素与纳米胶束载体的投料质量比为1.5:10。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述mPEG的分子量为5000，PPC的分子量为3500。
CN201910682283.5A 2019-07-26 2019-07-26 一种超分子抗肿瘤药物体系及其构建方法 Pending CN110575435A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910682283.5A CN110575435A (zh) 2019-07-26 2019-07-26 一种超分子抗肿瘤药物体系及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910682283.5A CN110575435A (zh) 2019-07-26 2019-07-26 一种超分子抗肿瘤药物体系及其构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110575435A true CN110575435A (zh) 2019-12-17

Family

ID=68810471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910682283.5A Pending CN110575435A (zh) 2019-07-26 2019-07-26 一种超分子抗肿瘤药物体系及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110575435A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040191305A1 (en) * 2002-05-31 2004-09-30 Perricone Nicholas V. Methods for formulating stabilized insulin compositions
CN103772686A (zh) * 2012-10-26 2014-05-07 苏州雷纳药物研发有限公司 一种两亲性嵌段共聚物及其制备方法、以及该共聚物与抗肿瘤药物形成的胶束载药系统

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040191305A1 (en) * 2002-05-31 2004-09-30 Perricone Nicholas V. Methods for formulating stabilized insulin compositions
CN103772686A (zh) * 2012-10-26 2014-05-07 苏州雷纳药物研发有限公司 一种两亲性嵌段共聚物及其制备方法、以及该共聚物与抗肿瘤药物形成的胶束载药系统

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Y. WU等: ""Core-crosslinked pH-sensitive degradable micelles: A promising approach to resolve the extracellular stability versus intracellular drug release dilemma"", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》 *
李晓军: ""细乳液聚合制备载药纳米粒子及其抗肿瘤性能研究"", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2010528105A (ja) 癌の診断と治療を同時に遂行する抗癌剤
CN108670954B (zh) 一种共载化疗药物的甘草次酸前药胶束及其制备方法
CN112076159B (zh) 具有不对称膜结构的载药聚合物囊泡及制备方法与在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用
Zhu et al. Y-shaped biotin-conjugated poly (ethylene glycol)–poly (epsilon-caprolactone) copolymer for the targeted delivery of curcumin
CN108310395B (zh) 一种表面电荷可转换的聚合物纳米药物载体及制备方法和应用
CN109288813B (zh) 含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒及其制备方法
CN111298132B (zh) 一种树状分子吉西他滨自组装纳米前药及其制备方法和应用
EP2657242A2 (en) Amphiphilic cyclic phosphazene trimer, hydrophobic pharmaceutical formulation micellized by amphiphilic cyclic phosphazene trimer, and preparation methods thereof
CN110917361A (zh) 一种pH响应型的姜黄素丁二酸酐前药纳米胶束及其制备方法和应用
CN112156066B (zh) 一种包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统的制备方法
CN111170910B (zh) 姜黄素对称衍生物及其制备和在制备抗肿瘤药物中的应用
KR101429668B1 (ko) 양친성 저분자량 히알루론산 복합체를 포함하는 나노 입자 및 그의 제조 방법
CN104352498A (zh) 肿瘤靶向丝裂霉素c和甲氨喋呤的双药制剂及其制备方法
CN112006986A (zh) 一种维生素e琥珀酸酯聚乙二醇纳米胶束及其制备方法和应用
CN114712311B (zh) 一种丝素蛋白肽自组装载药纳米粒的制备及其肾保护作用
CN110575435A (zh) 一种超分子抗肿瘤药物体系及其构建方法
CN108434124B (zh) 一种表阿霉素ves复合物和制备方法及其应用
CN114642652B (zh) 一种岩藻多糖自组装载药纳米粒制备及应用
CN113461754B (zh) 一种碱基修饰的阿霉素前药及其制备方法和应用
KR101332001B1 (ko) 양친성 저분자량 히알루론산 복합체를 포함하는 나노 입자 및 그의 제조 방법
CN104706595A (zh) 一种肿瘤靶向丝裂霉素c类脂质体及其制备方法
CN102973525A (zh) 一种担载蒽环类抗肿瘤抗生素的纳米胶束制剂及制备方法
CN110721319B (zh) 同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药及前药纳米粒子的制备方法
CN107744503B (zh) 酶敏感性两亲性聚酯MePEG-Peptide-PER-CL给药纳米粒的制备方法
CN113045687B (zh) 一种聚合物、纳米自组装体、药物递送系统及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191217

RJ01 Rejection of invention patent application after publication