JP5013860B2 - ラテックス凝集アッセイについての包括的な方法 - Google Patents
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Description
本発明は、イムノアッセイに関する。このイムノアッセイにおいて反応物の凝集の度合は、サンプル中に存在する分析物の量を示すために用いられる。凝集アッセイは、長年に亘り抗原の存在または非存在の決定において用いられてきた。例えば、U.S.3,171,783は、妊娠を診断するための凝集アッセイの使用を記載する。より具体的には、本発明は、アッセイに関し、このアッセイにおいて、凝集は、特定の分析物に対するラテックス粒子に結合体化した抗体と、目的の分析物とキャリア分子との間の別の結合体との複合体の形成により生じる。サンプルが分析物を含む場合、これは結合体化した分析物と競合し、そして複合体の形成を減少させ、従って凝集を阻害する。凝集の度合に対する効果は、分光光度計において光の吸収によって測定され得る。しかしながら、この方法は欠点を有し、例えば、測定されるべき特定の抗原(分析物)を、アッセイにおいて用いられる試薬の一つとして供給することが必要である。さらに、別の試薬は、測定されるべき抗原(分析物)に特異的な抗体を含まねばならず、この抗体はまたラテックス粒子に結合体化されている。
本発明は、概して、改良された凝集イムノアッセイとして記載され得、ここで、反応成分の一つにおいて、決定されるべき分析物の結合体を含むことを必ずしも必要としない。
・ラテックス粒子に結合体化したジェネリック抗体(例えば、マウスIgGに対する抗体)を含む第1の試薬を得る工程;
・決定されるべき分析物に特異的な抗体(例えば、この分析物のモノクローナル抗体)を含む第2の試薬を得る工程;
・サンプル流体と第1の試薬とを合わせる工程;
・第2の試薬を、合わせた第1の試薬およびサンプルに添加する工程;
・合わせた第1の試薬およびサンプルに、第2の試薬を添加することにより生じた凝集の度合いを測定する工程;
・この凝集の度合を、サンプル中の分析物の量と相関させる工程、
を包含するように、より具体的に記載され得る。
(予想外の発見)
骨密度を測定するための試験、骨粗鬆症および特定の疾患の検出のための試験における強い関心のために、デオキシピリジノリン(Dpd)の存在についてのイムノアッセイが開発されてきた。例えば、上で議論されたUS5,620,861(ここで、標識された抗体が、尿中でDpdの存在に対して呈色反応を生成するために使用される)を参照のこと。本発明者らは、Dpdを測定するために凝集技術を使用することの可能性を調査していた。本発明者らは、ラテックスに結合体化したジェネリック抗体に、Dpd特異的抗体を付加することにより、ラテックス粒子に結合体化したジェネリック抗体(すなわち、Dpdに非特異的)の粒子サイズを決定しようと意図した。このラテックスに結合体化した抗体がジェネリックであり、そしてDpdに特異的で無かったので、Dpd特異的抗体の単層のみが、ラテックス粒子に付加されるだろうと予想された。驚いたことに、このDpd特異的抗体は、ラテックス粒子に付加し続け、従って、誰も予想していなかった凝集が生成されたことが見出された。次いで、Dpdを付加することにより凝集を阻害することが見出された際に、改善されたアッセイが、実現可能であることが発見された。
この新しいイムノアッセイにおいて有用な抗体は、市販のものを含む種々の供給源から得られ得る。抗体作製の方法は、当該分野において公知であり、そして本発明の一部ではない。以下の実施例は、抗マウスIgG(免疫グロブリンクラス)ならびにウサギおよびヤギからの抗体を、ラテックスに結合体化したジェネリック抗体として使用したが、他の類似の抗体の供給源(例えば、ヒツジ)も使用可能である。特定の分析物に対する抗体へのジェネリック抗体の結合体化は、重鎖(すなわち、Fc部分)で生じる必要があることが見出された。抗体の軽鎖(Fab2部分)に対して特異的なジェネリック抗体は、十分な凝集反応を提供しなかった。
実施例において、本発明の方法がデオキシピリジノリン、ジゴキシンおよびテオフィリンを用いて実証されてきたことが理解される。しかしながら、本発明はこれらの分析物に限定されず、イムノアッセイにおいて目的の他の分析物(例えば、hCGおよびトロポニン)と共に使用され得る。
ラテックス粒子は、イムノアッセイの分野において周知であり、そして市販されている。それらは、一般的に水溶懸濁液の形態において供給される。この粒子は、典型的には約1〜100μmの直径を有し、そして抗体に結合体化し得る反応性の成分を含み、本発明の第1の試薬である、ジェネリック抗体に結合体化したラテックス粒子を形成する。
サンプル中の分析物の存在は、ラテックス粒子に結合体化したジェネリック抗体を含む第1の試薬を、分析物を含んでいると予想されるサンプルと合わせ、次いでその分析物に特異的な抗体を含む第2の試薬が添加された場合に生じる凝集の度合により測定される。凝集の度合は、サンプル中の分析物の量に相関する。あるいは、第2の試薬が最初に添加され、サンプルが2番目に添加され得るが、必ずしも同一の結果を伴わない。
以下の実施例において使用されるマウスIgGに対するラテックス結合体化抗体の代表的な調製は、以下のとおりである:
使用される材料は以下である:
・181ueq/gで100nm粒子を有する10%ラテックス−COOH(Bangs P0001040CN);
・25mM MES(2−N−モルホリノ)エタンスルホン酸、pH6.1−2.665gmのMES(Sigma M5283)を450mLの水に添加し、0.1N NaOHでpH6.1に調整し、500mLにして、0.22μmフィルターを通して濾過することによって、500mL調製した;
・25mM MOPSO(3−N−モルホリノ)−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、pH7.4−0.2810gmのMOPSO(Sigma 8389)を450mLの水に添加し、0.1N NaOHでpH7.4に調整し、500mLにして、0.22μmフィルターを通して濾過することによって調製した;
・EDAC(N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミドヒドロクロライド)(10mg/mL)−15.2mgのEDAC(Sigma E1769)を秤量し、使用の直前に1.52mLの水を添加して調製した;
・BSA(ウシ血清アルブミン)(50mg/mL);
・0.5Mエタノールアミン(Sigma E9508)pH8.5−ストック16Mエタノールアミンを1:32に希釈し、酢酸でpH8.5に調整することによって調製した;
・マウスIgGに対する抗体−ウサギまたはヤギ由来(Pierce 31194またはSigma);
・保存緩衝液:0.1Mグリシン、pH8.2、2mg/mL BSA、0.05% Triton X−100、0.17M NaCl、0.2%NaN3。
本実施例において、慣習的な凝集プロトコルを、操作可能であるように示す。530nMの光波および37℃で凝集の度合を測定するRoche Cobas分析器を使用した。ラテックス粒子とマウスIgG(Fc画分)に対する抗体との結合体(200μL)を、0nMまたは200nMのDpdを含んでいる25μLのサンプルと混合した。次いで、Dpdに対する抗体を添加し、そして吸光度を読取り、Dpdの存在に関連する凝集の度合いを示した。ニュートラビジン(Neutravidin):ビオチン(ラテックス粒子を含んでいるものとラテックス粒子を含んでいないものの両方)と結合体化したDpd(分析物)を含んでいるサンプルについて試験した。下の表において、「ダブルラテックスシステム」と標識される試験とは、マウスIgG抗体およびDpd(分析物)を含むサンプルの両方がラテックス粒子に結合体化された試験をいう。「シングルラテックスシステム」と標識される試験においては、Dpdを含むサンプルはラテックス粒子に結合体化されないが、R1−9〜R−11と標識される結果については、Dpdはニュートラビジン:ビオチンに結合体化された。R1−14およびR1−17の結果において、Dpdはキャリアに結合体化されなかった。後者の試験において、R1−14およびR1−17と標識される結果は、サンプル中にDpd(分析物)が存在しない場合を示し、Dpdに対する抗体をマウスIgG抗体/ラテックスと合わせた場合に、凝集がさらに起こり、そしてDpdが存在する場合、凝集は減少された。試験R1−9、R1−10、R1−11およびR1−14を比較試験する場合、この結果は、ニュートラビジン:ビオチンキャリアまたはラテックス粒子の使用に依存しなかったことが理解され得る。従って、従来の凝集アッセイは、本発明によって単純化され得る。ラテックス粒子に結合体化したジェネリック抗体は、目的の分析物に特異的な抗体と接触した場合、凝集を引き起こし、そしてこの凝集の度合いは、分析物の存在によって減少される。
上の試験において、マウスIgGに対する抗体を、(Dpdに対する抗体のような)抗体のFc画分であると示した。上記のR1−14およびR1−17のように報告された試験と類似の試験において、Dpdに対する抗体は、Fc画分ではなく、代わりにF(ab’)(2)フラグメントであった。このF(ab’)(2)フラグメントは、抗原に結合体化する抗体の一部分であり、一方Fc部分は抗原を破壊し得る免疫系の細胞(例えば、貪食細胞)に結合体化する。実施例1において示された結果とは対照的に、Dpdに対する抗体のF(ab’)(2)フラグメントは、凝集を引き起こさないことが見出された。分析物(抗原)に対する抗体は、Fc部分であるべきであり、そして凝集は分析物に対する抗体のFc部分によって影響を受けると結論付けられ得る。
実施例1におけるR1−14およびR1−17の試験と類似するが、分析物としてDpdの代わりにピリジノリン(Pyd)を使用して、別の試験を実施した。凝集が起こったことが見出されたが、それはPydによってほとんど阻害されていないことが見出された。従って、本発明のアッセイは、Dpdの存在を測定するために有用であるが、Pyd化合物には関しないと結論付けられた。
実施例3の結果を、実施例1(R1−14およびR1−17)におけるDpdに対する抗体の変わりに、ジゴキシンに対する抗体を用いた別の試験において確認した。凝集は達成されたが、分析物としてDpdを添加することにより、凝集を阻害しなかった。従って、このアッセイのDpdに対する特異性および、非特異的結合が確認された。
実施例1において使用した吸光度における変化、すなわち0分と2分との間の差を報告する第2の方法を選択して、試験を実施し、従来の凝集アッセイと本発明のアッセイ方法とを比較した。各アッセイにおいて使用される3つの成分を以下のようにまとめた:
本発明のアッセイを、Dpdではなくジゴキシン(治療用薬物)を用いて繰返した。使用した要素は以下のとおりである:
第1の成分:ラテックス−マウスIgG(Fc)に対する抗体、10μg
第2の成分:ジゴキシンに対する抗体(<ジゴキシン>)、5μg/mg
サンプル:ジゴキシン
このアッセイを、ジゴキシンをDpdに置き換えて繰返した。この試験の結果を以下の表に示す。
凝集の阻害が、ラテックス粒子に結合体化したマウスIgG(Fc)に対する抗体の濃度によって影響を受けることが見出されてきた。最適な濃度は、実験において見出され、上記の実施例において代表的に使用した10μg/mg濃度のマウスIgG(Fc)に対する抗体を、10倍、20倍および40倍に希釈した。Dpd(分析物)の0nMの添加と100nMの添加との間の吸光度変化を測定し、そして以下の表において比較した。Dpdに対する抗体を、また変えた。なぜならその濃度が凝集の度合に影響を及ぼすからである。Dpd抗体の3種類の濃度(5.34μg/mg、13.34μg/mgおよび26.68μg/mg)を試験した。
ラテックス粒子に結合体化したマウスIgG(Fc)に対する抗体(10μg/mg)の20倍希釈および実施例7において見出されるDpdに対する抗体(<Dpd>)(13.34μg/mL)を使用して、最適な凝集阻害、種々の濃度のDpd(分析物)の一連の16複製物を提供した。概して、変異係数は10%以下であることが見出された。例外を、Dpdの最も低い濃度に限定した。
前述の実施例により、ヤギおよびウサギの供給源から得たマウスIgG(Fc)に対するラテックスに結合体化した抗体を使用して得た結果を報告してきた。マウスIgGに対する抗体の他の供給源のさらなる試験を実施し、そして以下に報告する。使用した供給源は、以下のとおりであった:
(a)マウスIgG(Fc)に対するウサギ由来抗体
(b)マウスIgGに対するウサギ由来抗体−異なる供給業者からの(a)の複製
(c)マウスIgG(Fc)に対するヤギ由来抗体
(d)マウスIgG(Fab2)に対するヤギ由来抗体
(e)マウスIgG(重鎖および軽鎖)に対するウサギ由来抗体
(f)マウスIgG(重鎖)に対するヤギ由来抗体
(g)ヒト血清タンパク質に対して吸収される、マウスIgG(Fc)に対するヤギ由来抗体。
本発明の方法を、ヒト血清中のテオフィリンの存在をモニタリングするために使用した場合、ヒト血清が凝集に影響を及ぼすようであることが見出された。実験において、マウスIgG(Fc)に対するウサギ由来抗体の10μgと結合体化したラテックスを、ヒト血清中において、テオフィリンに対するモノクローナル抗体および3つの既知濃度のテオフィリン(Chiron)と合わせた。
87個の臨床的尿サンプルのセットを、ラテックス粒子に結合体化したマウスIgG(Fc)に対するウサギ由来抗体の10μg/mLおよびDpdに対する抗体の13.34μg/mLを用いて試験した。この結果を、Bayer Immuno−1TM Auto Analyzer(Dpd Assay)を用いて得られた結果と比較した。この結果は、方向性は似ていたが、相関を85%まで改善する4つの範囲外にある値を取り除いたにも関わらず、統計的な相関はわずかに約50%であった。
Claims (17)
- 粒子の凝集によってサンプル中の分析物の存在を決定するための方法であって、該方法は以下:
(a)ラテックス粒子に結合体化した第1の抗体を含む第1の試薬を得る工程;
(b)該分析物に特異的な第2の抗体を含む第2の試薬を得る工程;
(c)該サンプルと該第1の試薬とを合わせる工程;
(d)該第2の試薬を、工程(c)の該合わせたサンプルおよび第1の試薬に添加する工程;
(e)工程(d)により生じる凝集の度合を測定する工程;および
(f)工程(e)において測定された凝集の度合を、該サンプル中の分析物の量と相関させる工程、
を包含し、
該第1の抗体は、該第2の抗体のFc部分に対して特異的であり、
分析物が存在しないとき、第1の試薬と第2の試薬とを合わせると、凝集がおこる、方法。 - 前記分析物が、デオキシピリジノリン(Dpd)である、請求項1に記載の方法。
- 前記分析物が、ジゴキシンである、請求項1に記載の方法。
- 前記分析物が、テオフィリン(theophylline)である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の抗体が、マウスIgGに対する抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記マウスIgGに対する抗体が、ウサギに由来する、請求項5に記載の方法。
- 前記マウスIgGに対する抗体が、ヤギに由来する、請求項5に記載の方法。
- 前記分析物に特異的な第2の抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1に記載の方法。
- 粒子の凝集によってサンプル中の分析物の存在を決定するためのシステムであって、該システムは以下:
(a)ラテックス粒子に結合体化した第1の抗体を含む第1の試薬;
(b)該分析物に特異的な第2の抗体を含む第2の試薬であって、分析物が存在しないとき、第1の試薬と第2の試薬とを合わせると、凝集を引き起こす試薬;および
(c)該ラテックス粒子の凝集によって、所定の波長で吸収される光の量を測定し、それにより、該サンプルと、該第1の試薬と該第2の試薬とを合わせた場合に、サンプル中の該分析物の存在の効果を決定する、手段、
を備え、
該第1の抗体は、該第2の抗体のFc部分に対して特異的である、
システム。 - 前記分析物が、Dpdである、請求項9に記載のシステム。
- 前記分析物が、ジゴキシンである、請求項9に記載のシステム。
- 前記分析物が、テオフィリンである、請求項9に記載のシステム。
- 前記第1の抗体が、マウスIgGに対する抗体である、請求項9に記載のシステム。
- 前記マウスIgGに対する抗体が、ウサギに由来する、請求項13に記載のシステム。
- 前記マウスIgGに対する抗体が、ヤギに由来する、請求項13に記載のシステム。
- 前記分析物に特異的な第2の抗体が、モノクローナル抗体である、請求項9に記載のシステム。
- 粒子の凝集によってサンプル中の分析物の存在を決定するための方法であって、該方法は以下:
(a)ラテックス粒子に結合体化した第1の抗体を含む第1の試薬を得る工程;
(b)該分析物に特異的な第2の抗体を含む第2の試薬を得る工程;
(c)該第2の試薬と該第1の試薬とを合わせる工程;
(d)該サンプルを、工程(c)の該合わせた第1の試薬および第2の試薬に添加する工程;
(e)工程(d)により生じる凝集の度合を測定する工程;および
(f)工程(e)において測定された凝集の度合を、該サンプル中の分析物の量と相関させる工程、
を包含し、
該第1の抗体は、該第2の抗体のFc部分に対して特異的であり、
分析物が存在しないとき、第1の試薬と第2の試薬とを合わせると、凝集がおこる、方法。
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