JP4721702B2 - 分離システム、分離システム構成要素及びそれらの製造方法 - Google Patents

分離システム、分離システム構成要素及びそれらの製造方法 Download PDF

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Description

発明の詳細な説明
発明の背景
本発明は、分離システム及びその構成要素、特に分離システム及びモノリシック透過性ポリマー材料を含む構成要素に関する。
有機モノリシック・マクロポーラス・ポリマー材料及びモノリシックシリカパッキングなどのモノリシックマクロポーラス材料は、クロマトグラフィーまたは抽出システムなどの分離システム用構成成分として公知である。そのような材料の一種類は、少なくともポロゲンを含む重合混合物中で一種以上のモノマーを重合することによって製造したモノリシック・マクロポーラス・ポリマー・プラグまたは固体担体(solid support)として形成される。幾つかの重合混合物に関しては、多孔率及び孔径分布を制御するために重合後に溶解させ得る架橋剤、触媒及び小さな溶解性ポリマーなどの他の物質を配合することが公知である。さらに、このプラグは形成後に変性して官能基を加えることができる。
このプラグまたは固体担体は、通常、クロマトグラフィーカラムまたは圧力容器などのハウジングに収容される。プラグが備えられているハウジング部分は、反応器として機能する。モノリシックカラムを製造するための従来プロセスの一つでは、重合混合物をカラムケーシングに添加し、そこで重合を開始して、カラムの壁内部にマクロポーラスポリマープラグまたは固体担体を形成することができる。
ガス、液体及び超臨界流体クロマトグラフィー、メンブランクロマトグラフィー及び濾過、固相抽出、接触反応器(catalytic reactor)、固相法(solid phase synthesis)などを含むこれらのプラグまたは固体担体には広範な用途がある。プラグまたは固体担体用のカラムまたは他の容器の効率、分離に必要な時間及び、プラグまたは固体担体用のカラムまたは他の容器の再現性(reproducibility)は、重要な商業的因子である。カラムに多孔質ポリマーを備えたクロマトグラフィーカラムなどの分離システムの効率は、マクロポーラスなポリマー材料を含有するカラムまたは他の構成要素の選択性と、ゾーン拡散(zone spreading)との両方に関連する。これらの因子の幾つかは、分離プロセスの間にプラグまたは固体担体中の移動相の分子拡散及び速度に影響を受ける。
この移動相の分子拡散と速度がカラム効率に影響を与える様態(manner)は、カラム効率の記号表示である理論段数相当高さ(Height Equivalent to Theoretical Plate：HETP)におけるこれらの因子の作用を示すことによって、一部説明できよう。Van Deemterの式は、以下のように、ゾーン拡散、流速及びH(HETP)の点からの拡散の間の関係にして示す：
Figure 0004721702
分子拡散は分子の拡散に依存するが、ベッド(bed)のパッキングには依存しない。渦巻き状拡散(Eddy diffusion)は、粒子のパッキングの均質性に依存する。
物質移動由来のゾーン拡散は、無孔粒子及び、1.5ミクロン未満のサイズの多孔質粒子を使用することによって最小化することができる。しかしながら、無孔粒子で充填すると表面積が非常に小さくなり、これは精製プロセスには高いサンプル充填量が必要であるため、(分析プロセスとは対照的に)精製プロセスにとっては不利である。非常に小さな充填粒子を使用すると、現在の計測器を使用する分離プロセスの殆どでは難しい高い圧力や、低い流速が必要であり、これによって所定の分離の時間が長くかかってしまうことがある(１分当たりのHで表されることがある)。
構成成分としてマクロポーラスなポリマー性モノリシックプラグまたは固体担体を含む従来法の分離システムでは、所望のものよりも大きく、均質性が低く、且つミクロポア(micropore)を含むポリマー中に粒子から形成されたプラグまたは固体担体を使用している。粒子のサイズが大きく、その均質性が不足していると、孔径分布での均質性が失われる。従来法での多孔質ポリマー中で孔径が非均質性で大量にミクロポアがあると、van Deemterの等式によって示されているようにゾーン拡散の原因となる。多数のミクロポアはサンプルを捕捉し、一定の時間保持することによってゾーン拡散の原因となる。これは、細孔(pore)の内側及び外側と、固定相と移動相との間の非平衡物質移動(non-equilibrium mass transfer)として従来、示されている。
多孔質ポリマーから形成した従来のプラグまたは固体担体には、孔径の均質性が低く、あまり望ましくない表面特性と、ウォール効果によって発生しているその外壁にボイドがあり、分離システムで所望されるよりも高いゾーン拡散と低い効率となる。
従来法では、重合の間に発生する収縮と、幾つかの従来法の多孔質ポリマー中に重合後に発生する収縮とに関連する問題については、十分な解決策を提供していない。重合溶液中ではモノマーがランダムに分散していて、ポリマーは規則正しく構造をとったモノマーからなるので、重合の間に収縮問題が発生する。したがって、殆どの重合でポリマーの容積は、混合モノマーの容積も小さい。上記製造プロセスの全ての重合の間に収縮が起きる。重合後の収縮に関する問題の一つは、５〜８パーセント未満の有機溶媒含有量の溶液などの、親水性の高い水性移動相または他の高い極性の移動相と、親水性の高いポリマー担体との不適合性により起きる。
重合の間の分離システムで使用した多孔質ポリマー材料とその成分の収縮によって、多孔質ポリマーの表面に不規則なボイド(void)と、ポリマー内部に孔径の不規則性が発生し、これらは生産プロセスの再現性及びカラム効率に有害である。ウォール効果によってカラム効率が低下する一つの理由は、ウォール効果によってサンプルが壁チャネルの中を流れ且つ、分離媒体を迂回することである。生産プロセスの再現性がウォール効果によって低下する一つの理由は、ウォール効果の程度とウォール効果の位置が全てのカラムで予測不可能であるということである。
上記で引用した従来特許での大きなチャネルを備えるカラムは、低い表面積と容量(キャパシティ：capacity)をもつ。カラムの容量が低いのは、高サンプル充填量を必要とする精製プロセスには不利である。収縮問題を解決しようとして多大な努力、時間及び費用をかけたにもかかわらず、従来法では低い容量に対する解決策を示すことができなかった。
上記現象及び／または他の不完全性により、上記方法により製造したカラムには、たとえば、
(1)ビーズを充填した市販のカラムより少し良いかまたは少し悪い(little more or less)分解能をもつカラムを提供する；
(2)これらの方法によって得られた分離は、特に大きな分子の分離に関してシリカビーズまたはポリマービーズを充填した慣用のカラムよりも少し良いまたは少し悪い(little more or no better)分解能及び速度をもつ；
(3)種々の形状及びサイズをもつ不規則粒子の積み重ねによる広範な孔径分布はカラム効率を低下させる；
(4)上記物質の粒径及び形状の非均質性に由来する孔径の非均質性は、ゾーン拡散に大きく影響する；
(5)上記物質の多量のミクロポアも、ゾーン拡散に大きく影響する；及び
(6)カラムで使用する材料の収縮により、カラム効率が低下する、のような幾つかの欠点がある。これらの欠点は、高分解能クロマトグラフィーにおけるこれらの使用を制限する。
米国特許第5,453,185号は、モノマーの一部を置換するために不溶性ポリマーを使用して重合混合物中のモノマー量を減少させることによって、収縮を軽減させる方法を提案した。この特許では収縮は軽減するが、多量の官能性モノマーを必要とするカラムの容量及び保持容量因子(retention capacity factor)に不利である。これらの特許では、カラム効率及び生産プロセスの再現性に対して不利である、分解能における収縮の悪影響、多孔質ポリマー表面上の不規則ボイド及びポリマー内部の孔径の不規則性については述べられていない。
従来法の欧州特許第1,188,736号は、一端を封止し、もう一端を開放にしたポリテトラフルオロエチレン管の内部で、モノマー、架橋剤、ポロゲン性溶媒(porogenic solvent)及び開始剤の現場での共重合(in situ polymerization)により、多孔質ポリ(エチレングリコールメタクリレート-コ-エチレングリコールジメタクリレート)の製造法について記載する。得られたカラムは、ガス-液体クロマトグラフィーに使用した。この従来法のアプローチは、開放端部をもつプラスチック管での重合を利用するので、得られた材料が少なくとも一部、実用的な用途に望ましい特徴をもたないという欠点がある。
米国特許第2,889,632号、同第4,923,610号、及び同第4,952,349号は、二つのプレートとセパレータとを含む封止デバイス内で薄いマクロポーラス膜を製造する方法を開示する。この方法では、所望の膜担体は、多孔質ポリマーシートの薄層を打ち抜き、所望の官能基をもつように変性(修飾：modification)させた。多孔質シートの層は、「膜分離」用に担体デバイス中に保持される。これらの特許は、欧州特許第1,188,736号に記載の方法を拡大適用して、多孔質膜を製造し、膜分離の実質的な用途の方法を改善している。得られた材料は、２ナノメートル未満のサイズのミクロポアから大きな細孔までの細孔を含むマクロポーラス膜である。ポリマーの粒径は0.5マイクロメートル未満である。膜分離の分離メカニズムは、慣用の液体クロマトグラフィーとは異なる。
この多孔質材料には幾つかの欠点がある；たとえば、(1)膜の薄さがその保持因子を制限する；及び(2)これらの粒子によって形成される細孔は小さく、個々の膜の厚さよりももっと長いベッド長をもつ液体クロマトグラフィーカラムで高い流速で使用できない、という点である。ミクロポア及び他の捕捉細孔は、分離すべき分子を捕捉し、ゾーン拡散の原因となる。本明細書中で使用する「捕捉細孔：trapping pore」なる用語は、分離される分子よりもやや大きいサイズ〜分離される細孔の直径の７倍までの範囲の細孔などのゾーン拡散の原因となる細孔を意味する。
米国特許第5,334,310号；同第5,453,185号及び同第7,728,457号は、それぞれ、封止カラム内で現場でマクロポーラスのポリ(グリシジルメタクリレート-コ-エチレングリコールジメタクリレート)ポリスチレンの製造法を開示する。この方法は、タンパク質の分離用の液体クロマトグラフィーカラムの製造に関する、欧州特許第1,188,736号及び米国特許第2,889,632号、同第4,923,610号及び同第4,952,349号のいずれにも記載の方法を拡張する。米国特許第5,334,310号；同第5,453,185号及び同第5,728,457号は、ビーズをもつ慣用の充填カラムの隙間容積を除去することによってカラム効率を改善することを目的とする。これらの特許に従って形成したプラグは、ポロゲンのタイプ及び量、モノマー並びに重合温度によって制御される細孔孔径分布をもつ。マクロポーラスポリマーは、移動相の輸送用に凝集物の間に大きな細孔チャネルを形成する種々のサイズの粒子の内部連通した凝集物からなる。凝集物または塊(cluster)中には、分離用の小さな細孔が存在する。小さな粒子は、約100〜300ナノメートルの緊密充填された非常に小さな粒子から形成される。
これらの特許に従って製造した材料は、これらの粒子の中または間のミクロポアがサンプル分子を物理的に捕捉または分離を悪くするという欠点がある。これらの特許は、ビーズを充填したベッドのようにモノリシック媒体中に間隙空間(interstitial space)がないと請求しているが、凝集物と内部連通粒子の間の大きなチャネルは実際には、ビーズを充填した慣用のカラムのビーズの間の間隙空間と同じ問題を生じさせている。種々のサイズの凝集物または塊から形成した大きなチャネルは不均質(inhomogeneous)であり、狭い粒径分布であってもランダムな間隙空間を提供する。ランダムな間隙空間のため、カラム効率は低い。
米国特許第5,334,310号；同第5,453,185号及び同第5,728,457号は、平方ミクロメートルから平方メートルの断面積をもつカラムの内部の分離媒体の製造について開示する。これらの特許で開示されたプロセスには幾つかの不都合な点がある。不都合な点のいくつかは、Chemistry of Materials、1997年、９巻、1898頁の1997年のこれらの特許に記載の本発明者らによって開示された。
一つの大きな不都合な点は、上記特許のプロセスから製造した大きな直径(26mm I.D.)のカラムは、孔径分布がクロマトグラフィー分離に有効であるには不規則すぎるという点である。不規則な孔径分布は、重合の発熱の悪影響、ポリマーの熱孤立効果(heat isolating effect)、熱伝達の不能、開始剤の自己加速分解(autoaccelerated decomposition)及び直径26mmのモールド中で開始剤としてアゾビスイソブチロニトリルを使用することによる窒素の同時迅速放出によって生じる。重合の発熱及び熱伝達の問題によって生じたカラムの温度上昇及び温度差によって、15mmを超える直径のモールドなどの大きな直径のモールドでは重合が促進され、カラムの中心とカラムの外壁との間に温度勾配ができて、細孔構造が不均質になってしまうことが知見された。この文献では、この問題は、重合混合物をゆっくりと添加することによって軽減されるだろうと示唆された。これによって問題は一部解決されようが、完全な問題解決には至らない。大きな直径のカラムに関しては、細孔分布が不均質になる温度勾配が依然としてある。
この問題は、Analytical Chemistry、2000年、72巻、5693頁の刊行物の理論計算によっても証明された。この著者は、放射状流クロマトグラフィー(radial flow chromatography)用の大きな直径のカラムを構築するために、細いシリンダーを積み重ねることによるモジュール的アプローチ(modular approach)を提案する。しかしながら、連続プラグを形成するためのディスク間の封止が困難で、時間を要する。
米国特許第5,334,310号；同第5,453,185号及び同第5,728,457号は、弱アニオン交換及び逆相カラムの材料について開示する。この製造された弱アニオン交換器は、低分解能、低容量、低剛性(low rigidity)、遅い分離及び非常に低い再現性であった。この逆相媒体は、非常に小さな容量、非理想的分解能及び非常に悪い再現性をもつ。この非常に極性の移動相中での非常に疎水性媒体の収縮によるウォールチャネリング効果(wall channeling effect)により、これらは、水中８%アセトニトリル未満などの高い水分量の移動相では使用することができない。この媒体も、分離の間に圧縮されて、カラムのヘッドに過剰のボイド容積ができる。上記特許は、弱カチオン交換器、強カチオン交換器、強アニオン交換器、順相媒体及び疎水性相互作用媒体(interaction media)の製造法については殆ど指針を示していない。膜、ビーズまたはゲルをベースとするこれらの媒体は、公知である。しかしながら、この製造法はオフラインで実施されており、モノリシックカラムの現場製造に関しては使用できない。米国特許第2,889,632号；同第4,923,610号及び同第4,952,349号に従って製造したモノリシックカラムは、容量が低く分解能が低い。
発明の概要
従って、本発明の目的は、分離効率的開口部(separation-effective opening)を持つポリマーと相乗作用関係を持つ改良分離システムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、改良クロマトグラフィーカラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、クロマトグラフィーカラムを製造するための改良装置を提供することである。
本発明のさらなる目的は、クロマトグラフィーカラムを形成するための改良法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、優れた透過可能なモノリシック媒体を提供することである。
本発明のさらなる目的は、優れた分解能の透過可能なモノリシックカラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、優れた容量をもつ透過可能なモノリシックカラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、優れた流速のカラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、水性溶媒を使用したときに、膨潤傾向の低いカラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、優れた再現性をもつカラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、容量または分解能または流速を改良する目的に関して選択され、制御された孔径をもつ透過可能なモノリシックカラムを形成するための改良法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、分取(preparative separation)用の大きな直径のカラムの製造法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、放射線法を使用して透過可能なポリマー担体を含むポリマー性材料の製造法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、優れた弱アニオン交換カラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、優れた逆相カラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、高性能強アニオン交換カラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、高性能弱カチオン交換カラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、高性能強カチオン交換カラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、高性能順相カラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、重合の間の収縮または洗浄若しくは分離の間の媒体の膨潤によって生じた分離媒体の品質の低下を防止するための方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、非常に似通った特徴のカラムのアレイを一緒に操作する、クロマトグラフィーシステムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、液体、ガス及び超臨界流体クロマトグラフィー、エレクトロクロマトグラフィー(electrochromatography)、接触反応器、濾過または、サンプルから少なくとも一部水平に配置または隣接した透過可能なポリマー担体または固体透過可能なポリマーホルダーを必要とするものなどの、クロマトグラフィーの用途でモノリシック透過可能な固体担体を製造するための新規プロセスを提供することである。
本発明のさらなる目的は、新規高分解能媒体及び、それを得るための新規方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、より均質なサイズ及び形状の内部連通した凝集粒子から得られる、均質な分離効率的な開口部サイズ分布をもつ優れた透過可能な固体担体を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ミクロポアが少ないかまたは全くない優れた透過可能な固体担体を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ポリマー担体の壁にボイドがない優れた透過可能な固体担体を提供することである。
本発明のさらなる目的は、モノリシッククロマトグラフィー媒体の容量を改良するための方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、優れた分解能の透過可能なモノリシックカラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、容量または分解能または流速を改良する目的のために選択された、制御されたサイズの分離効率的な開口部をもつ透過可能なモノリシックカラムを形成するための改良法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、分取用の大きな直径のカラムの製造法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、高性能接触反応器を提供することである。
本発明のさらなる目的は、高性能固相抽出ベッドを提供することである。
本発明のさらなる目的は、制御された微細な完全渦巻き状表面構造をもつが、殆どまたは全くミクロポアをもたない共有結合した粒子の優れた透過可能なモノリシック媒体を提供することである。
本発明のさらなる目的は、重合反応の間に熱的作用のための不均質性が無視し得るモノリシック・クロマトグラフィー・ベッドを提供することである。
本発明のさらなる目的は、カラムへの熱伝導に信頼性のあるクロマトグラフィーカラムでの重合を制御するための新規方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ベッドに衝突する制御された放射線により、重合速度及び得られた温度勾配を制御することである。
本発明のさらなる目的は、媒体エネルギー、X-線(たとえば200kEV未満)、UVまたは可視線を提供するような、比較的安全な放射線源で重合を制御することである。
本発明のさらなる目的は、殆どまたは全くミクロポアをもたない、透過可能な高容量カラムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、ナノメートルからミリメートルの小さな直径を持つカラムの製造法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、100nm以下の中位の直径と、1000mm以下の大きな直径のクロマトグラフィー的に均一カラムを製造する方法を提供することである。
本発明の上記及びさらなる目的に従って、重合混合物をポロゲンまたは溶媒と一緒に適所で重合して、分離効率的開口部をもつポリマープラグを形成する。本明細書中、「分離効率的開口部：separation-effective openings」なる用語は、クロマトグラフィーなどの分離プロセスに関与する細孔またはチャネルまたは他の開口部を意味するものとする。細孔は通常、実質的に丸い粒子の開口部を意味するが、粒子内(細孔内)を通過する直通の細孔(through pore)または粒子の中の開口部、あるいは場合によっては粒子の凝集物の開口部若しくは通り抜ける開口部であってもよい。断面が実質的に丸いことによって、細孔は完全な円ではなく、たとえば、細孔は隣接する球面の間の空間である不完全な球体の領域によって境界が定められていてもよい。
他の用語は、本明細書中で使用されるにつれて以下に定義する。分離因子は、保持及び容量をもたらすこれらの因子または分離プロセスに関与する他の因子を含む。本明細書中で使用する「マクロポーラス：macroporous」なる用語は、分離システムでモノリシック材料について言及する際に通常の意味を与えられる。その通常の意味は、その細孔または他のボイドが、実質的に円形の断面をもち、他よりも実質的に長い断面寸法をもたない細孔に開口部を限定するその意味通りのものではなく、開口部の長さを考慮しないで、50nmを超える直径をもつ、粒子の小球の間の細孔または他のボイドを意味する。本明細書中で使用する「透過可能な：permeable」なる用語は、分離業界でモノリシック材料を指す「マクロポーラス」と同様に解釈されるべきであるが、「マクロポーラス」なる用語の文字通りの意味との混同を避けるために細孔を含むものと、チャネル及び他の開口部をもつ材料とを区別するために「マクロポーラス」なる用語に優先して使用される。本明細書中、「透過可能な無孔質：permeable non-porous」なる用語は、チャネルなどの開口部をもつが、上記定義のごとき細孔を含まない媒体を指すものとする。
本発明の一態様において、重合の間の収縮は補正(compensate)され、本発明のもう一つの態様では、後に収縮するかもしれない重合後の膨潤が防止される。収縮によってポリマー表面には大きなボイドが形成し、ポリマー内部では孔径分布の均質性が失われるかもしれない。このボイドは、重合の間で発生した時には、重合前のモノマーの容積と比較して規則正しいポリマーの小さい容積によって発生するものと考えられる。このボイドは、殆ど界面自由エネルギーの違いにより、カラム壁とポリマーとの間に存在する。このボイドは、おそらく重合用の一般的な開始剤である、アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)によって発生した窒素ガスによって占められている。
第一の態様では、収縮の補正は、重合の間に十分な圧力を適用して、分離効率的な開口部を均一分散させて、ウォール効果ボイドを防止することによって達成される。この圧力は、粒径と、プラグ中の開口部の性質及び形状を幾らか制御することも知見された。収縮に適応させるために重合の間にカラムを大気圧に保持すると、確実にボイドの形成を防止できる。通常、便宜上250psiの圧力を使用するが、より高い圧力及びより低い圧力もうまく使用できた。適度の量の圧力下でさえもプラグが収縮を停止するとボイドが除去される。第二の態様では、重合後に発生する収縮も防止される。たとえば、プラグによっては有機溶媒などの数種の溶液に暴露されると膨張し、たとえば水性移動相で分離を実施する間など後になって収縮して、ボイドを形成する傾向がある。これらの態様において、溶液に暴露したときにカラムが収縮しないように保持することによって収縮を防止する。圧力を適用することは、水溶液に暴露する間の収縮を防止する一つの方法である。収縮及び／または膨潤を補正し、収縮を軽減し、収縮を防止するための他の方法も、以下詳細に記載の如く使用する。外部適用した圧力は、反応している重合混合物と、そしてカラムの内壁と重合混合物との間の内部の不均一な力を抑えて、均質な分離効率因子、分離効率的開口部サイズ及び分布、並びにポリマーのカラム内壁に対する均一な連続接触を保持する。
意外にも、収縮を補正するために重合の間に圧力に暴露する場合、または水性移動相中などで親水性溶液に暴露した時に、収縮を補正するための幾つかの逆相カラムの場合には、ポリマープラグの幾つかのタイプは細孔を含まない。そのかわり、これらはそれら(分離効率的開口部)の間に、比較的大きなフローチャネルと共に共有結合した、約２マイクロメートルの直径の固体粒子を含む。驚いたことに、これらの粒子は細孔をもたないのに、プラグのクロマトグラフィー容量は高い。これは、約50〜200nmの深さと幅の溝またはひだ及び他の異様な表面特徴が予想外に形成したために起こったものと考えられる。典型的な粒子は、非常に小さな星状体(asteroid)の望遠像(telescopic view)に似ている。
重合の間に適用した圧力は、望ましい結果に従って選択し、たとえば一次的に増加する圧力、一定圧力または段階勾配圧力(step pressure gradient)であってもよい。一態様において、分離効率的な開口部のサイズは、重合の間に細孔を生成するポロゲンと、重合後にプラグから洗浄しなければならないポロゲンの種類及び割合を選択することによって制御する。この割合は、所望の特徴を得るために試行によって選択する。ポロゲンの総量も選択する。
もう一つの態様では、幾つかのプラグは有機洗浄溶液などの溶液に暴露したときに膨潤し、次いで水性移動相で分離する間などその後に収縮して、カラム壁とポリマー担体のとの間にボイドと、分離効率的開口部サイズ分布にばらつきを作ってしまう。たとえば、分離効率的な開口部をもつ数種の逆相プラグは、重合した時は収縮し、他のものは収縮せず、重合後に、水または数種の他の極性溶液に暴露した場合、重合の間に収縮しなかったプラグの幾つかと収縮したものの幾つかは収縮するかもしれない。この場合、この収縮の補正は、重合の間のピストンによる圧縮及び／または、並べ替え若しくは再配置させるためまたは収縮を補正するために分離実験の間に起きるかもしれない収縮以上の収縮を通常引き起こすだろう条件の間の重合後の圧縮である。収縮が圧力で補正される場合または、ボイドの発生を防止するために収縮が防止されるいずれの場合でも、ピストンなどの非流体圧力が流体を使用する圧力よりも好ましい。「圧縮：compression」なる用語をゲルモノリスの細孔を開口させるために塩溶液をゲルモノリスに適用することを示すために使用する場合には、本明細書中で使用する「圧力：pressure」なる用語は、「圧縮」なる用語を除外し且つこれとは区別する。この問題を解決するもう一つの方法は、逆相媒体に親水性を導入して膨潤させて、分離実験の間に非常に親水性環境中でポリマーの収縮を防止することである。
より具体的には、重合混合物を好ましい態様ではカラムに、または他の適切なモールドに適用し、そのカラムまたはモールド中で重合を開始する。モールドのカラムは十分に封止して：(1)重合をオーブン中で行う場合には、蒸発による計画外の損失を防止する；または(2)重合を水浴中で行う場合には、汚染若しくは希釈を防止する。重合の間、この重合溶液に圧力を適用する。重合が分離媒体の固体プラグになるか、または重合が完了するまで、収縮によるボイド形成を防止するために大気圧より上のレベルに圧力を保持するのが好ましい。重合の間に重合溶液が接触するカラムまたはモールドの内面は、非反応性であるか、またはプラグ表面への接着性を高めるように処理することができる。
幾つかの態様では、重合混合物は、(1)選択したモノマー；(2)数種のカラムによっては、添加剤；(3)開始剤または触媒；及び(4)単数または複数種類のポロゲンを含めて、分離効率的開口部を形成する。幾つかの態様では、重合の前後に官能基を添加することができる。添加すべきポロゲン、開始剤、官能基、添加剤及び反応条件並びにモノマー及び／またはポリマーは、逆相、弱カチオン、強カチオン、弱アニオン、強アニオンカラム、アフィニティー担体、順相、固相抽出及び接触ベッド(catalytic bed)などの具体的なカラムの種類に関して選択される。重合混合物の成分を選択して、所望の品質のカラムを提供する。
本発明に従ったクロマトグラフィーカラムは、透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグを受容するために内壁をもつケーシングを含むのが好ましく、当該ケーシングでは、分離効率的開口部または表面特徴は、重合混合物中のポロゲンによってポリマー中に形成された制御されたサイズを示し、且つ重合の間に圧力によってサイズが制御される。このプラグは、クロマトグラフィーカラムでサンプル用担体としての機能を果たす。この透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグは、プラグ壁に目に見える不連続性がなく、且つプラグ内に実質的に不連続性も開口部ももたない平滑壁をもつ。本明細書中における「不連続性：discontinuity」なる用語は、肉眼で目視されるに足るサイズの通常の平滑性若しくはパターンからの高くなった部分若しくは開口部若しくは窪み若しくはその他の変化を意味する。本明細書において、「サイズ補正型ポリマー：size-compensated polymer」または「サイズ補正型ポリマー性：size-compensated polymeric」なる用語は、分離効率的な開口部をもつモノリシック・ポリマー性透過可能な材料を意味し、前記分離効率的な開口部中の不連続点、均質性の欠如は、本明細書中でいう方法、たとえば幾つかのタイプのカラムの場合には極性溶液に暴露する間に、重合の間若しくは重合後に圧力を適用することによって、または水溶液で洗浄する間に、若しくは水溶液を使用して分離操作で使用する間のいずれかで、水溶液の存在下で圧力を適用することによって水溶液の存在下でさらなる収縮を防止するカラムを使用することによって、防止されてきた。
一態様では、重合の間に重合混合物を含むように適合された温度制御した反応チャンバと、前記温度制御した反応チャンバ内で前記重合混合物に圧力を適用するための手段とを使用してカラムを製造する。この重合混合物は、少なくともポリマー形成性材料とポロゲンとを含む。一態様において、圧力は、外部流体または機械的圧力下、重合混合物と接触した平滑面をもつ移動可能な部材によって適用するが、圧力は、窒素ガスなどのガスまたは、加圧下の液体で重合混合物に直接適用することができる。
逆相媒体の態様は、従来法由来の種々の疎水性及び親水性で形成した。逆相媒体としては、ポリスチレン類、ポリメタクリレート類及びそれらの組み合わせが挙げられる。これらの媒体は、フェニル、C4、C8、C12、C18及びヒドロキシル基などの所望の官能基、または水性移動相に種々の選択性及び湿潤性を与える疎水性及び親水性基の他の組み合わせを含むモノマーの直接重合によって製造する。この重合条件及びポロゲンは、大きな分子、特にタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド及び合成ホモポリマーの高分解能分離を与えるように研究且つ選択する。一態様において、逆相媒体は、ポリ(スチレン-コ-ジビニルベンゼン)をベースとする。本特許のもう一つの態様では、逆相媒体は、ポリ(ステアリルメタクリレート-コ-ジビニルベンゼン)をベースとする。もう一つの態様では、逆相媒体は、ポリ(ブチルメタクリレート-コ-エチレングリコールジメタクリレート)をベースとする。
例外的な特徴をもつ逆相プラグは、ジビニルベンゼン(DVB)を含む架橋剤、及びエチレングリコールジメタクリレート、及びスチレン(ST)または種々の炭素鎖長を含むメタクリレート(MA)などのモノマーのコポリマーから主として形成される。通常、架橋剤が40重量%を超えるときに最適結果が得られる。好ましくはジビニルベンゼンとスチレンの比はジビニルベンゼンの値が７：１〜９：１の重量範囲、好ましくは４：１であるが、その代わりに64 DVBまたは40パーセントスチレン及び72重量パーセントDVBまたは１gジビニルベンゼン、１gスチレンであってもよい。カラムは、17：３〜19：１、好ましくはジビニルベンゼン９部対スチレン１部の範囲の比であってもよい。親水性官能基をもつモノマーを添加して、水性移動相中のポリマー媒体の収縮を軽減し、分離時のウォール効果を防止することができる。全モノマー中のDVBの含有量は40%〜100%であるのが好ましい。好ましい一態様では、カラムの充填容量を改善するためにはDVB含有量は80%である(これは市販品の最高値である)。プラグは疎水性表面基をもつメタクリレートも含有でき、または代わりに尿素ホルムアルデヒド若しくはシリカを含むビニル化合物であってもよい。
イオン交換プラグは、主としてメタクリレートポリマーから形成される。弱アニオン交換プラグは、主としてグリシジルメタクリレート(GMA)及びエチレングリコールジメタクリレート(EDMA)のポリマーから形成される。強アニオン交換器プラグは、主としてグリシジルメタクリレート、2-(アクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムメチルサルフェート(ATMS)、エチレングリコールジメタクリレートのポリマーである。重合混合物は、1,4-ブタンジオール、プロパノール及びAIBNも含んでもよい。弱カチオン交換器プラグは、主としてグリシジルメタクリレート、アクリル酸(AA)、及びエチレングリコールジメタクリレートから形成される。強カチオン交換器プラグは、主としてグリシジルメタクリレート、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸(AMPS)及びエチレングリコールジメタクリレートから形成される。これら全てのイオン交換器において、官能基は、プラグの形成の前後に添加することができる。全モノマー中のEDMA含有量は、40%〜80%が好ましい。
EDMAなどの架橋剤の量が増えると、水性相中の媒体の膨潤が軽減されることによってカラムの剛性が高まる。重合混合物はそれぞれ加圧重合下で変性して、高い流速と低い流速(flow velocity)の両方で高い流速(flow rate)と高い分解能とを得る。相互作用させるために所望の官能基を含有するモノマーの共重合と、所望の相互作用官能基を得るために他の官能性モノマーの制御変性とを合わせて、分離媒体の剛性を改良しつつ、カラムの容量を増加させる。この制御変性は、潜在的に疎水性の表面積を親水性官能基で覆うことによって、通常カラムの親水性も改良することができる。変性条件は、媒体の高い親水性及び高い容量を提供するだけでなく、水溶液中でのポリマーマトリックスの膨潤も防止するように選択し、これはビーズ及びモノリスのいずれをも含む他の非常に親水性のポリマーマトリックスでおきる。
ポリマープラグは、環状シリンダー、若しくは巻き組織の、湾曲した若しくは真っ直ぐのキャピラリー管またはマイクロチップ若しくは他の寸法若しくは形状をもつものであってもよい、慣用の液体クロマトグラフィーカラムを含む任意のサイズまたは形状のカラムに形成することができる。その成分に分離すべきサンプルまたは混合物をカラムに注入し、液相はカラムの中を移動して、サンプルをその成分に分離する。成分は、検出及び／またはフラクションコレクタに集められ及び／またはガスクロマトグラフィーまたは質量分析計などのもう一つのデバイスに挿入されてもよい。一態様において、複数のカラムを、揚水システム(pumping system)、溶媒システム及び検出システムを含むクロマトグラフィーシステムで並列に接続する。このカラムは、これらを関連する分離と共に動作できるために高い再現性をもつ透過可能なポリマーカラムである。一態様では、25mmを大きく超える直径をもつクロマトグラフィーディスクまたはプラグを製造する。
一態様では、反応は、時間、水浴の温度、及び重合混合物中の反応体だけに依存する代わりにまたはこれに加えて、UV-可視光、X-線またはγ-線などの電磁放射線などの独立の手段によって制御される。この態様の一形態では、熱は、熱源から加えるか、または所望の温度範囲に反応素材の温度を保持するか、所望により反応の間、変動させるためのフィードバックの制御下、反応器中で熱素材(thermal mass)の冷却剤のかなり多くの部分と接触させた冷却手段によって除去することができる。もう一つの形態では、可変強度または可変波長X-線を使用して、発熱を制御できる速度で、反応物を混合する重合速度を制御することができる。X-線照射はカラムを貫通してカラム内にくまなくエネルギーを付与するか、選択した部分にエネルギーを付与して重合速度を速めたり遅くしたりする。これは、モノマーをその二重結合を解離するように十分に放射してモノマーをフリーラジカルにして、その反応性を高めることによって実施することができる。もう一つの方法は、反応素材に関して使用すべき温度範囲で照射することによって活性化する放射線に感受性の開始剤を使用することである。この開始剤は、モノマー単独よりもかなり短い活性化時間及び低い温度をもつように選択する。この開始剤は、十分な強度の放射線によってのみフリーラジカルを形成するので、放射線は、他の因子とは独立して重合反応を制御するために使用することができる。もう一つの方法は、重合を開始させるために光開始剤と組み合わせて放射線増感剤またはシンチレーターを使用することである。X-線シンチレーターなどの放射線増感剤は、溶媒を通して転送された放射線エネルギーを吸収した後、放射線のエネルギーを所望の波長で光の発光によって光開始剤に移動させる。発光波長は、光開始剤の吸収波長と同一でなければならない。
X-線などの照射を使用する重合は、マイクロメートルからメートルの断面をもつモノリシック材料の製造用に使用する。X-線は、物質を深さ方向に貫通することができる。有機及び無機ポリマーのいずれも、X-線またはγ-線を使用して製造することができる。高エネルギーX-線及びγ-線は材料を高い深度で進行することができる。低エネルギー〜中程度のX-線はそれほど深く材料を貫通しないので重合時間が長くなるが、使用にはより安全である。一態様において、低エネルギーX-線を使用して、X-線シンチレーター及び光開始剤の組み合わせを使用して重合を開始する。本出願人は、12時間未満から１週間を超える重合時間を非熱的(光開始)制御することによって、満足できるクロマトグラフィーカラムを提供することを知見した。カラムの熱重合は、通常、暴走する発熱反応と、直径20mmを超えるカラムでは極端な温度勾配があるという欠点がある。このため、クロマトグラフィー特性を劣化させる不均一性を生じる。X-線若しくはγ-線、またはまさにUVと共に利用可能なゆっくりした、制御された重合速度によって、適度な重合速度を保持しつつ、許容可能な発熱速度のゆっくりした重合をもたらす。発熱に対して温度勾配は、直径1メーターを超えるカラムの特性を低下させないほど十分に小さくできるかもしれない。
過剰の発熱速度及び得られたプロセス(重合)温度及び温度勾配は、安定化剤の選択によって防ぐことができる。この安定化剤は、反応が、所望のポリマーが形成する速度までであるが、高すぎる温度を生じる早すぎない速度以下で、自由に反応が進行できるような特性をもたねばならない。たとえば、過酸化物開始剤に関しては、ジステリルヒオヂプロピオネート(disterylhiodipropionate：DSTDP)はヒドロキシル基をクエンチし、これは副反応に起因し、後に主反応と比較して一事象当たりさらに熱を発生させるだろう。もう一つのアプローチは、主反応に安定化剤を使用することである。この安定化剤は、主溶媒での限定された溶解性または反応温度での活性及び、反応温度よりもっと大きい溶解性に関して選択する。類似の条件下で、ポロゲンに優先的に溶解性で、且つ溶解性または活性が温度依存性である安定化剤を使用することができる。
より多い容積の媒体を作成するためにカラムサイズをスケールアップすることは、分取クロマトグラフィー及び接触反応器では非常に望ましい。本発明の一態様において、大きな直径のカラムは、カラム内部で二段階重合によって製造する。第一に、ターゲットのカラムよりも小さい直径をもつ複数の細い筒状カラムを、加圧下または圧力をかけずにモールド中で製造する。この細いカラムを、細いカラムの製造で使用したのと同一重合溶液を満たした大きなカラム内部に設置する。細いカラムの一端の厚さは、これは発熱性の重合の間の熱損失問題のため、温度勾配の形成を防止するために公知の最大である８mmを超えてはならない。温度勾配によって不均質な孔径分布が生じ、これはクロマトグラフィーでの使用に不利である。
分離システムで使用するためのサイズ補正型ポリマーの製造において、所定のタイプの分離の特徴は、重合の間にまたは水性溶媒若しくは洗浄液などの極性溶媒を使用するか若しくは接触させた時に圧力を適用する逆相分離媒体を形成する際に使用したような数種のポリマーの場合には、適用する圧力の量を変えることによって、用途に応じて所定のポリマーを調整することができる。ポリマー自体の性質をある種の用途のために選択した後に、カラムを製造し、試験することができる。試験に基づいて、圧力を適用することによって幾つかのカラムでは特性を変更することができる。カラムによっては圧力を適用すると、他の理由で粒径の変化、ポリマーの中の分離効率的開口部のサイズ分布及び均一性が増加するので粒径の均一性があがると考えられる。粒径及び孔径の均質性が高くなると分解能が改善される。通常、圧力が増加すると容積及び分解能及び圧力-時間勾配が改善される。幾つかのカラムでは、ミクロポアが大きく減少または排除されて、重合の間及び／または使用若しくは極性溶媒を用いるポリマーの洗浄の間に、圧力を適用することによってゾーン拡散を軽減する。
上記記載から、本発明の新規モノリシック固体担体は、たとえば、
(1)従来法よりも優れた方法でクロマトグラムを提供する；
(2)簡単且つ安価に製造することができる；
(3)従来法の分離よりも分離によっては高い流速を提供できるので、分離時間を短縮できる；
(4)幾つかの分離プロセスに関しては、従来法のプロセスよりも低い圧力で、分離プロセス用に高分解能の分離を提供できる；
(5)カラムのコストを軽減することによって使い捨てのカラムで高い分解能を提供できる；
(6)モノリシック透過可能なポリマーチップを使用してマイクロチップ及びキャピラリー用、並びに質量分析用などの、任意の寸法、特に小さな寸法で製造でき、円筒クロマトグラフィー用には円筒カラムなどの多くの異なる形状のカラムを容易に製造できる；
(7)小さな分子及び大きな分子のいずれも迅速に分離する；
(8)中でも抽出、クロマトグラフィー、電気泳動、超臨界流体クロマトグラフィー及び触媒用の固体担体、TLC並びに集積CEC分離または化学反応を含む多くのプロセス用の優れた分離媒体を提供することができる；
(9)特定の公知の透過可能なモノリシック分離媒体に優れた特徴を提供することができる；
(10)均質な分離効率的開口部サイズ分布をもった大きな直径のカラムの分離用に新規アプローチを提供する；
(11)非常に水性の移動相でウォール効果を持たず、且つ優れたカラム効率をもつ分離媒体を提供する；
(11)分離効率因子を改善する；及び
(12)逆相カラムでの膨潤及び収縮問題を軽減する、のような幾つかの好都合な点をもつと理解できる。
本発明の上記及び他の特徴は、付記図面を参照し、以下の詳細な記載からよりよく理解されよう。
詳細な説明
大まかに言えば、重合可能な混合物をポロゲンまたは溶媒の入った容器に入れ、重合して、クロマトグラフィーカラムなどの分離システムで使用するための分離効率的な開口部をもつプラグを形成する。好都合には、この重合は、クロマトグラフィーカラムまたは抽出チャンバなどのプラグを使用すべき容器内で実施する。本発明の一態様において、混合物を重合し、同時に重合の間の収縮作用を補正して、サイズ補正型ポリマープラグを形成する。他の態様では、水の存在下で膨潤傾向のある材料に圧力を適用して、サイズ補正型ポリマープラグのもう一つの態様を形成することによって、収縮を防止する。さらに他の態様では、分離効率的開口部サイズ及び分布を、圧力により及び／または重合混合物の成分の選択により及び／または電磁照射などの外部からの影響を使用するプロセスによって制御する。収縮は容器の壁に隣接して大きなボイドをもたらし、カラム内の孔径分布に悪影響を与えるかもしれないので、収縮を補正または防止する。
好ましい態様において、重合の間に収縮するに連れて分離効率的開口部をもつ材料の強度を少なくとも保持するために重合の間に圧力を適用することによって補正を実施する。収縮に適応させるためにカラムを大気圧に保持しても、全ての場合でボイドの形成を防止できず、再現性が低くなることがある。ポリマー、モノマー、開始剤及びポロゲンをカラムの特徴を改善するために選択し、重合の間に加圧下で重合の態様で、または他のプロセスで使用することができる。もう一つの態様では、プラグが形成した後で、及び幾つかの逆相プラグの場合には重合後に水溶液による洗浄などの他の反応により生じた膨潤の後またはその間に、圧力をプラグに適用する。重合溶液を重合の間に接触させるカラムまたはモールドの表面は非反応性であるか、または接着を高めるために処置することができる。
一態様において、重合混合物は、少なくとも一種のビニル化合物とポロゲンとを含む。開始剤を重合混合物に配合するか、開始プロセスをビニルモノマーとポロゲンとに適用して、分離用のポリマープラグを使用する他のデバイスまたはクロマトグラフィーカラム用のモノリシックプラグを形成する。通常、重合混合物は、ビニルモノマーに加えて、ビニルポリマー、またはモノマーとポリマーとの混合物、開始剤並びにポロゲンを含む。しかしながら、重合混合物中に開始剤を配合しない重合への他のアプローチも当業界では公知であり、放射線照射などを使用してポリマーを形成することができる。さらに、本発明の側面の幾つかは、尿素ホルムアルデヒドまたはシリカなどのビニル基以外のモノマー及びポリマーを重合反応に適用して、尿素ホルムアルデヒドまたはシリカプラグを形成することができる。
これらのプロセスによって形成したクロマトグラフィーカラムは、重合の間に圧力によって部分的に及び、重合混合物の成分及び成分の割合を選択することによって部分的にサイズを制御し、且つ重合の間に形成した予備選択したサイズ分布の分離効率的開口部をもつ透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグを受容するために内壁をもつ担体を含む。たとえば、分離効率的開口部サイズは、他の幾つかの成分の量に応じて重合混合物中のポロゲンの量及びタイプによって制御する。圧力は、カラムの壁の強度の値に対して大気圧よりもやや上の範囲に選択することができる。透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグは平滑壁をもち、プラグ内に実質的にミクロポアをもたない。このプラグは表面官能基をもっていてもよい。たとえばフェノール基などの疎水性表面基を添加して、逆相プラグで水性ベースの溶媒との膨潤を低下させることができるが、この場合、容量も減少するかもしれない。同様に親水性表面基を添加して、逆相プラグの容量を増加させることもできる。
壁にミクロポアもチャネル形成開口部も含まない、透過可能な、モノリシック・ポリマー・プラグの一態様は、主としてビニルポリマーから形成されるが、本発明の実施において他の多くのポリマーを使用することができる。弱イオン交換透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグは、主として、2.5と3.5の間の値：1.8と2.2の間の値、好ましくは３：２の値の重量比でグリシジルメタクリレートとエチレンジメタクリレートなどのメタクリレートのポリマーから形成される。例外的な特徴をもつ逆相の透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグは、ジビニルベンゼンとスチレンとのポリマーから主として形成される。好ましくはジビニルベンゼンとスチレンの重量比は、おおよそ3.5と4.5の間の値：0.8と1.2の間の値、好ましくは４：１の範囲内であるが、かわりに64DVB(ジビニルベンゼン)または40パーセントスチレンと72重量パーセントDVBまたは２：３の比から３：２の比の範囲、好ましくは１：１のジビニルベンゼン対スチレンの比でもよい。カラムは８：１〜１０：１の比の範囲、好ましくは９：１のジビニルベンゼン対スチレンの比であってもよい。100パーセントDVBも好ましい。
図１において、重合混合物を製造するステップ１２と、混合物を重合するステップ１４と、クロマトグラフィー実施用カラムを製造するステップ１６と、クロマトグラフィー実施ステップ１８とを含む、クロマトグラフィーカラムの製造法の一態様１０のブロック図が示されている。混合物を重合するステップ１４で使用する重合混合物は、モノマー及びまたは重合可能なポリマー、開始剤または開始プロセス(たとえば照射)と、ポロゲンを含むが、これらの多くは当業界で公知である。クロマトグラフィー混合物を製造するステップ１２、重合のステップ１４、クロマトグラフィー実施用に製造するステップ１６と、クロマトグラフィーを実施するステップ１８は全て、異なる形態をとってもよい。これらの変形の幾つかについては後述する。
ステップ１４は、重合化合物を圧縮してボイドを減少させつつ重合化合物を反応させるサブステップ２０と、ポリマーを洗浄するサブステップ２２と、態様によっては、特定の官能基を添加するためにポリマーを反応させるステップ２４とを含む。実行可能なカラムは、重合しながら重合混合物を圧縮せずに得ることができるが、この圧縮を適用することによって顕著な改良点が得られた。これらの改良点は、競合する市販のカラムと、幾つかのタイプのカラム及び用途によっては競合しないカラムとの間に差を付けるのに十分に顕著であった。この圧縮によって形成が回避されるボイド及び非均質分離効率的開口部は、封止容器内での重合の間にポリマーの収縮によって生じた空き空間が不均質分散することに起因するのかもしれない。空き空間の不均質分散は、カラム壁表面、ポリマー表面、窒素及びポロゲンとの間の表面張力の差によるかもしれない。圧縮は、この収縮をとり、重合の間にカラムの全容積を小さくするのに十分でなければならない。このプロセスは、カラムの分離効率的開口部サイズにも影響を与え、所望により分離効率的開口部サイズを変動させるためにステップ・バイ・プロセスによって使用することができる。
洗浄ステップ２２は、具体的なカラムに関して使用し得るが、カラムの中に残らないようにするポロゲン及び未反応モノマーまたは他の成分を除去するための慣用のステップである。このステップの後に、カラムがタンパク質を分離しようとする場合には重要である、上記基のような官能基を添加する方法の反応が続く。態様によっては、この洗浄ステップはプラグの膨潤、続いて後に収縮を引き起こす。この収縮はチャネル形成性ボイドを引き起こすので、一態様では圧力を膨潤プラグに適用して、収縮の間のボイド形成を防止する。
図２には、圧力供給源２３、重合混合物３２、圧縮ピストン２７と閉じこめ容器(confinement vessel)２１に圧力を適用するための圧力転写機構(pressure transfer mechanism)２５をもつ、重合装置２８のブロック図が示されている。好ましい態様では、圧力供給源２３は、一定の油圧の調整供給源であるが、スプリングなどの他の供給源または空気若しくは不活性ガスの供給源も使用し得る。同様に、好ましい態様では、機構２５は、重合の間にピストン面が押される重合化プラグに平滑面を与えるために平滑面をもつピストンであるが、透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグに直接適用するガスなどの他の供給源も使用し得る。好ましい態様では、圧縮ピストン２７は、重合反応の間に、区画３２内で重合混合物に圧力を及ぼすためにカラム部分２１の内側に移動する。重合反応が完了すると、ポロゲンはカラム内にくみ上げられた溶媒によって除去することができる。重合は、温度制御した環境２９で生じ、好ましい態様では水浴であるが、加熱チャンバなどの任意のそのような温度制御機構であってもよい。このデバイス用の材料は、当業界で公知の任意の慣用の材料であってよい。
図３には、金属カラムケーシング１０２２、閉じこめ容器８８、圧力転写機構２５、圧縮ピストン１１２及び圧力キャップ８０をもつ重合装置２８の一態様の断面図が示されている。金属カラム１０２２は、それらの間でシール１０２１によって閉じこめ容器８８に対してきっちりと保持されている。シール１０２１の圧縮は、装置のバレル１２２と、ねじ山１０５３でカラム１０２２に取り付けられているレンチフラット１０２３にショルダー１０５２によって与えられ、かくしてカラム１０２２と閉じこめ容器８８との間に漏れのない接続(leak free connection)を提供する。圧縮ピストン１１２、o-リング１１０、ロッド１０６、支持カラー１０４、もう一つのo-リング１００、及び油圧ピストンヘッド６０２からなる転写機構２５は、これらは全て、圧縮ピストン１１２とo-リング１１０が閉じこめ容器８８の内側で密封形成できるように、バレル１２２内に配置且つ組み込まれる。圧力キャップ８０は、それらの間のガスケット９４と共に、バレル１２２に組み込まれた流体入り口ポート３３を含む。
圧力キャップ８０とバレル１２２はぴったりと接続されて、流体入り口３３を通って適用される加圧流体が漏れないようにする。次いで転写機構２５は図示の如く配置されて、閉じこめ容器８８の中に容積を作る。O-リング１００におけるバレル１２２の内径対閉じこめ容器８８の内径の比の二乗は、圧力倍増率(pressure multiplication factor)を与える。カラム１０２２の反対端は、カラム区画３２内の重合反応体で充填され、閉じこめプラグ(containment plug)１０２４は開口部にはめ込まれる。閉じこめキャップ６０４は、カラム１０２２に通されて、閉じこめプラグで開口部を封止する。好ましい態様では封止するためにぴったりした接続プラグ１０２４を示すが、o-リングなどの別の封止処置も容易に使用して前面シール(face seal)または放射状シール(radial seal)を提供することができる。流体入り口３３は、制御可能な流体ポンプまたは圧縮ガスの調整ボトルなどの制御された供給源に接続される。
この好ましい態様の記載では、流体入り口３３を通して適用した圧縮ガスまたは圧縮液体のいずれかの、流体供給源を使用するが；圧縮力は、別の手段、これらに限定されないが、たとえば転移機構２５上のバネによる圧迫、圧縮を提供するために重力を使用する転移機構２５上に積み重ねられたおもり、またはカラム区画３２内部に転移機構２５によってモノリシック・ポリマー・カラム材料を圧縮させるために配置した求心力によって容易に供給することができる。
一度組み立てたら、装置２８を、好ましい態様では熱的に制御した水浴である、温度制御環境２７に設置する。次いで、流体入り口ポート３３を通して流体圧力を適用し、前記流体入り口ポートは、圧力キャップ８０、ガスケット９４、油圧ピストンヘッド６０２及びo-リング１００に含まれる。この適用した力は油圧ピストンヘッド６０２を圧力キャップ８０から離し、ロッド１０６の端部に力を及ぼす。このロッド１０６は圧縮ピストンに力を伝達し、圧縮力を好ましくは平滑面１１０１でモノリシック・ポリマー・カラム材料に適用する。この平滑面は、最終用途の分析的流体に暴露されるモノリシック・ポリマー材料上に連続した均一面を作り、圧縮ピストン１１２へのモノリシック・ポリマー・カラム材料の接着を軽減する。
閉じこめプラグ１０２４、カラム１０２２、シール１０２１、閉じこめ容器８８及び圧縮ピストン１１２は、モノリシック・ポリマー材料を閉じこめる。化学反応が進行するにつれて、このモノリシック・ポリマー材料の容積は減少し、転移機構２５は閉じこめ容器８８内にさらに移動する。O-リング１００とo-リング１１０との間にトラップされた空気は、バレル１２２内の空気逃し開口部６０３を通して逃すことができる。このようにして反応体材料の圧縮によって、モノリシック・ポリマー材料の不都合なボイドの形成を回避して、使用時にカラムの性能を低下させるだろう、モノリシック・ポリマー材料とカラム１０２２との間のウォール効果を取り除く。
反応が進行してモノリシック・ポリマー材料容積が減少するに連れて、圧縮ピストンはカラム１０２２の近くへ移動する。重合の終わり頃には、支持カラー１０４はバレル１２２でショルダー６０８と接触し、転移機構２５の前進運動を停止する。新しく形成したモノリシック・ポリマー材料の破壊は、この作用によって回避される。この位置で、圧縮ピストン１１２の平滑面１１０１は殆どカラム端部にあり、モノリシック・ポリマー材料は、材料の中に不都合なボイドを含むこともなく、材料とカラム１０２２との間にウォール効果ももつことなく、カラム１０２２を充填する。レンチフラット１０２３と６０４を使用することによって、ポリマー装置２８は、アセンブリとしてカラム１０２２から切り離される。次いで、両端にクロマトグラフィー接続金具を据え付ける。
図４には、ガラスカラムケーシング９２２、ピストンヘッドアセンブリ４０１、置換ピストン４０と閉じこめプラグ９２３とをもつ重合装置２８の態様と似た重合装置２８Aのもう一つの態様の断面図が示されている。幾つかの分析的化学用途では、湿潤表面は金属成分を含んではならない。この好ましい態様の説明ではガラスカラム９２２とプラスチック部品について述べるので、これらに限定されないが、許容可能な機械的特性を提供するたとえばガラス、セラミックまたはプラスチックなどの任意の非金属材料を使用することができる。さらに、本発明のディスカッションでは適切な流体圧力供給源によって提供される圧力について言及しているが、これらに限定されないが、バネ、おもりまたは機械的手段を含む圧縮を提供する別の手段も容易に使用することができよう。
ピストンヘッドアセンブリ４０１は、カラムに組み立てられ且つ組み込まれたピストン７６、o-リング３８及び中間部分５０を含む。置換ピストン４０とo-リング６４からなるプランジャーアセンブリ２０は、くぼみ９２が油圧シリンダー部分２１の流体入り口部分３３から離れているように、油圧シリンダー部分２１に組み立てられ且つ組み込まれている。このプランジャーアセンブリ３０は置換チャンバ６０内に完全に押し込まれる。
次いで油圧シリンダー部分２１とプランジャーアセンブリ３０をカラム９２２にはめ込む。適切なツールを使用して、環状ショルダー４２が置換ピストン４０に接触するまで、ピストンアセンブリ４０１を油圧シリンダー部分２１に押込み、小さな直径のネック４８はくぼみ４２に組み込む。
カラム９２２に反応体を充填し、閉じこめプラグ９２３をカラム９２２の開放端部に挿入する。次いで閉じこめキャップ９２４をカラム９２２の端部にはめ込み、閉じこめプラグ９２３をカラム９２２にしっかりと保持する。この態様では閉じこめプラグ９２３とカラム９２２との間をぴったりと適合させたが、これらに限定されないが前面シールまたは放射状シールをつくるo-リングなどの別の方法も容易に使用することができる。
次いで流体入り口部分３３を通して流体圧力供給源を適用する。流体は、油圧シリンダー部分２１、置換ピストン４０及びo-リング６４によって置換チャンバ６０に含まれる。次いで組み立てられた成分を温度制御した環境２７に設置する。この態様に関しては、熱的に制御した水浴を使用するが、反応温度を制御する任意の適切な方法を使用することができる。
そのような流体圧力を適用すると、流体入り口部分３３から置換ピストン４０を移動させる。置換ピストン４０のこの動きが中間部分４０の環状ショルダー４２に力を適用して、次いでこれがピストン７６を通してカラム９２２内のモノリシック・ポリマー材料に圧力を適用する。
反応体の化学薬品が重合するに連れて、容積が減少する。モノリシック・ポリマー材料に圧力を制御適用すると、モノリシック・ポリマー材料内の不都合なボイド形成と、カラム９２２の壁とモノリシック・ポリマー材料との間のウォール効果とが防止される。反応が進行するに連れて、ピストン７６はカラム９２２内にさらに移動して、容積減少を置換する。ピストンの平滑面７４はモノリシック・ポリマー材料に均一面を作り、その最終用途で分析流体に一貫した境界面を提供し、且つピストン７６の表面にモノリシック・ポリマー材料が付着しないようにする。
反応の最後近くには、環状ショルダー４２はカラム９２２の端部に接触し、中間部分５０がさらにカラム９２２に移動しないようにする。これによって、ボイド及びウォール効果が除去された後で、モノリシック・ポリマー材料の破壊が回避される。この環状ショルダー４２は、ピストンが移動できる距離も限定し、これによって、カラム内の得られたモノリシック・ポリマー材料の多孔率及びサイズを制御することができる。
重合が完了した後、油圧シリンダー部分２１を置換ピストン４０とそのo-リング６４と一緒にカラム９２２から取り出す。次いで、閉じこめキャップ９２４と閉じこめプラグ９２３を外し、最後にピストンヘッドアセンブリ４０１を外す。次いでクロマトグラフィー接続金具を両端に取り付ける。
反応体の化学薬品表面に直接圧縮ガスを直接適用することによって、反応体化学薬品に圧縮を提供することもできる。そのような方法は、得られたモノリシック・ポリマー材料の表面が平滑でも一様でもなく、特定のカラムフォーマットが選択されたときに、モノリシック・ポリマー材料のボデーよりももっと多孔質になるかもしれないため、上記方法よりも良くないと考えられる。他のカラムフォーマットでは、ガスの直接適用がより適切かもしれない。高い分解能の分離を達成するためにはポリマーロッドの端部を切り落とすことが必要である。図５において、不規則な表面積とそれほどではないにせよ、粒子の小球のより積み重なった平板様構造により、細孔はないが、大きな表面積をもつそれらの間にチャネルをもつ粒子の小球を示すために、9,000倍に拡大した、120psi油圧下、カラムケーシング内で重合した強カチオン交換器の走査電子顕微鏡（SEM）写真を示す。この表面積を覆う突起をもつ粒子の粗な表面積は、付着による成長を示す兆候である。
図６には、圧力の適用によって膨潤と収縮の問題が回避された、カラム内で分離したタンパク質に由来するピークをもつクロマトグラムを示す。このピークは特有であり、比較的良い分解能である。この特定のクロマトグラムは、一つの溶媒として0.01MTris緩衝液pH7.6ともう一つの溶媒として1M塩化ナトリウムを、５分で０〜50パーセント第二の溶媒にする勾配液として使用して、コンアルブミン(conalbumin)、オボアルブミン(ovalbumin)及びトリプシン阻害剤のタンパク質サンプルで流速３ml/分で勾配溶離したものである。背圧はこのカラムでは１平方インチ当たり250ポンドであるが、そのような補正のないカラムでは、同じ勾配液でももっと高い背圧をもつと予想される。
図７には、三つのプラグを示すが、左側の一つは重合の間に圧力を用いて製造したもので、右側の二つは圧力を用いずに重合したものである。図７には、カラムの形成の間に収縮によって生じたカラム表面に形成した不連続点(discontinuity)が示されている。予想できない間隔で比較的大きな開口部の形状でカラム内部に同様の不連続点がある。これらの形状は、この不連続点が除去できることも示しており、結果としてクロマトグラフィー実験の間に、同一組成及び同一サイズのカラムでは優れた再現性と優れた分解能が得られる。
図８には、揚水システム１２１、カラム及び検出アレイ１４１、コレクタシステム１１７、コントローラ１１９及びパージシステム１２３をもつ予備液体クロマトグラフィーシステム(preparatory liquid chromatographic system)のブロック図が示されている。カラム及び検出器アレイ１４１は、その中に透過可能なプラグを含む複数のカラムを含む。このプラグは、サイズ補正型ポリマープラグであるのが好ましい。揚水システム１２１は、コントローラ１１９の制御下でカラムと検出器アレイ１４１に溶媒を供給する。パージシステム１２３はポンプアレイ１３５と連通して、ポンプと、ポンプの間のラインと、クロマトグラフィー実験の間にカラムをパージする。ポンプアレイ１３５は、カラム及び検出器アレイ１４１に溶媒を供給し、そこからコントローラ１１９の制御下でコレクタシステム１１７に流出液を流す。コントローラ１１９は、カラム及び検出器アレイ１４１で検出器から溶質のバンドを示すシグナルを受容し、当業界で公知の方法でフラクションコレクタシステム１１７を活性化する。適切なフラクションコレクタシステムは、Isco、Inc.,4700 Superior Street、Lincoln、NE 68504製のFOXY７ 200フラクションコレクタである。
ポンプアレイ１３５に溶媒を供給するために、揚水システム１２１は、その第一及び第二のものがそれぞれ１３１及び１３３と示される複数の溶媒リザーバ及びマニホールド、ポンプアレイ１３５及びモーター１３７を含み、これはコントローラ１１９の制御下で駆動されてポンプのアレイ１３５を操作する。コントローラ１１９はポンプアレイ１３５のバルブも制御して、モーターがポンプアレイ１３５の往復ポンプのピストンを作動して、同時にアレイの複数のポンプから溶媒をくみ出し、且つ１３１及び１３３などの溶媒リザーバ及びマニホールドから溶媒をくみ上げるにつれて、溶媒の流れと勾配液の形成とを制御する。
好ましい態様では、往復ピストンのポンプアレイを使用するが、往復であろうと無かろうと、ピストンタイプであろうと無かろうと、任意のタイプのポンプが適切である。当業界及び当業者には非常に多くの種々のポンプ及びポンプ原理が公知であり、そのような任意の公知のポンプまたは揚水原理は、殆どの場合、日常的な工業技術で本明細書に開示の本発明に適応させることができる。図１の態様では二種類の溶媒が開示されているが、たった一種類の溶媒を使用することができ、また二種を超える溶媒を使用することができる。
流出液を処理するために、コレクタシステム１１７は溶質を集めるためのフラクションコレクタ１４１、マニホールド１４３及びマニホールド１４３からの廃棄物を取り扱うための廃棄物保管所１４５を含む。一つ以上のフラクションコレクタはカラム及び検出器アレイ１４３と連通して、マニホールドを使うかまたは使用せずにカラムから溶質を受容する。マニホールドを使用して二つ以上のカラムからの溶質を混合して、一つの容器に一緒に貯めてもよいし、またそれぞれのカラムはそれぞれの容器に溶質を貯めてもよいし、またカラムの幾つかはそれぞれ対応する容器に溶質を貯め、他は同じ容器で溶質を混合してもよい。マニホールド１４３はカラム及び検出器アレイ１４１と連通してそれぞれのカラムからの流出液を導水し、これを廃棄物保管所１４５に貯める。
図８のシステムは似たようなタスクにそれぞれ含まれるカラムのアレイを含んでおり、一つのタスクを実行するそれぞれのカラムは、できるだけそのタスクを実行する他のカラムの全てと似た特性をもつのが望ましいので、カラムの再現性は特に重要である。従って、互いに密接に関連するサンプルの分離を実施する際に協同するような任意の群のカラムが実質的に好都合であり、本発明の透過可能なポリマーカラムは特別な用途をもつ。
プラグのボデーに大きな開口部も側壁に開口部ももたない分離媒体としてポリマープラグを有するカラムまたは他のデバイスを製造するために、重合装置の一態様では、重合の間に重合混合物を含むように適合させた温度制御した反応チャンバと、前記温度制御した反応チャンバの前記重合混合物に圧力を適用するための手段を含む。この重合混合物は、モノマー、ポリマー及びポロゲンを含む。好ましい態様では、圧力を適用するための手段は、移動可能な部材で圧力を適用するための手段である。この重合混合物は、架橋剤及び架橋性モノマーを含む。剛性、容量及び分離効率的開口部の分布は、架橋剤の量、モノマー及び圧力によって制御する。
重合は、オーブンの場合には溶媒の損失を回避するために、または水浴反応チャンバの場合には混合物の水による希釈若しくは汚染を回避するために、閉鎖容器中で実施する。収縮によって形成した真空と平衡をとるために、イオン交換カラムの場合には混合物などの幾つかの混合物の重合の間に圧力を適用する。重合後にポリマープラグを洗浄してポロゲンを除去する。幾つかのポリマーの場合、プラグが逆相プラグなどの場合には水溶液を適用する場合、洗浄の間またはクロマトグラフィー実験の間にプラグは膨潤傾向をもつことがある。
混合物をその成分に分離するためには、上記の如く透過可能なポリマープラグを形成する。手頃な通常の筒状シリンダー、キャピラリー管またはマイクロチップまたは任意の寸法若しくは形状をもつ慣用の液体クロマトグラフィーカラムを含む、任意のサイズまたは形状のカラムに形成することができる。サンプルはプラグと並行に配置し、サンプルの成分は、それらがプラグを通って移動するに連れて互いに分離される。
たとえば、液体クロマトグラフィーによってサンプル中のタンパク質の混合物からタンパク質を分離するためには、カラムをプラグとして形成し、ポロゲンを使用して適所で重合する。使用前に収縮を補正する。サンプルをカラムに注入し、カラム内に溶媒を流し、これによって成分がプラグ内を移動するにつれてサンプルはその成分に分離される。一態様において、複数のサンプルが高い再現性で、分離カラムで同時に分離される。
分離プロセスで使用されるクロマトグラフィーカラムの一態様では、内部ケーシング壁を備えるクロマトグラフィーケーシングをもち、ケーシング壁内に透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグを有する。このプラグは、重合前に重合混合物中にポロゲンによってポリマー中に形成され、重合の間に圧力によって少なくとも部分的にサイズが制御された、制御されたサイズであってもよい分離効率的開口部をもつポリマーである。透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグは、平滑壁をもち、且つ透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグ内に実質的に細孔をもたない。好ましい態様では、このプラグはビニルポリマーから形成されるが、尿素ホルムアルデヒドまたはシリカなど他のものから形成されていてもよい。水性溶媒との膨潤を軽減させるために疎水性基または容量を増加させるために親水性基などの表面基を含むことができる。
重合混合物中の成分及び種々のプラグの成分の割合の幾つかの例は例示的である。たとえば、チャネル開口部を含まない弱イオン交換器透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグは、主としてメタクリレートポリマーから形成される。好都合には、この透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグは、１：１〜７：３、好ましくは３：２の重量比でグリシジルメタクリレートとエチレンジメタクリレートとのポリマーから主として形成される。
強アニオン交換器は、0.8〜1.2の範囲の値対2.8〜3.2の範囲の値の比、好ましくは１：３の比で主成分としてグリシジルメタクリレート(GMA)とエチレンジビニルメタクリレート(EDMA)を含む。好ましい態様では重合溶液は、0.4グラムのGMA、0.5グラムの2-(アクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムメチルサルフェート、1.2グラムのEDMA、1.5グラムの1,4-ブタンジオール、1.35グラムのプロパノール、0.15グラムの水及び0.02グラムのAIBNを含む。
弱カチオン交換器は、メチルメタクリレート(MMA)、GMA及びEDMAを、4.5〜5.5の範囲のMMAの値：0.8〜1.2の範囲のGMAの値：11〜13の範囲のEDMAの値、好ましくは５：１：１２の比の重合溶液を含んでいた。この重合溶液は、0.2グラムのAA、0.5グラムのメチルメタクリレート(MMA)、0.1グラムのGMA、1.2グラムのEDMA、2.55グラムのドデカノール、0.45グラムのシクロヘキサノール及び0.02グラムのAIBNを含む。重合後、このカラムを60℃で５M(モル)水酸化ナトリウムNaOH中の0.25Mナトリウムクロロアセテート中で６時間、加水分解する。
他の例としては、
(1)１：１〜２：１の範囲の重量比のグリシジルメタクリレート及びエチレンジメタクリレート；または
(2)３：１〜９：１の範囲の比のジビニルベンゼン及びスチレン；または
(3)４：１の範囲の比のジビニルベンゼン及びベンゼンであるか、若しくはジビニルベンゼンは35〜80重量パーセントの範囲、好ましくはジビニルベンゼン64重量パーセントであり；または
(4)それぞれ８：２：１５の比のジビニルベンゼン、スチレン及びポロゲン；または
(5)開始剤と混合したジビニルベンゼン７〜９単位：スチレン1.5〜2.5単位：ドデカノール１３〜１７単位の範囲の割合のジビニルベンゼン、スチレン及びドデカノール；または
(6)開始剤と混合してそれぞれ８：２：１５の範囲のジビニルベンゼン、スチレン及びドデカノール；または
(7)開始剤と混合してそれぞれ７〜９：1.5〜2.5：９〜１３：2.5〜3.5の割合のジビニルベンゼン、スチレン、ドデカノール及びトルエン；または
(8)開始剤と混合してそれぞれ８：２：１１：３の割合で混合したジビニルベンゼン、スチレン、ドデカノール及びトルエン；または
(8)開始剤と混合して0.5〜0.7：0.3〜0.5：１〜２：0.1〜2.5の割合のグリシジルメタクリレート、エチレンジメタクリレート、シクロヘキサノール及びドデカノール；または
(9)それぞれ0.6：0.4：1.325：0.175の割合のグリシジルメタクリレート、エチレンジメタクリレート、シクロヘキサノール及びドデカノールがある。
通常、目的の用途に関して分離効率的開口部をもつモノリシック・ポリマー担体を製造するプロセスは、以下の段階を含むことができる：
(1)選択された製法で重合混合物を調整し；
(2)本発明の態様でカラムと称されることがある、所望の形状及びサイズの容器に前記混合物を設置し；
(3)加圧接続金具または融接シーリング(non-pressure sealing)でカラムを封止し；
(4)選択された圧力下若しくは加圧せずに、制御された温度で加熱浴若しくはオーブン中、前記重合混合物を重合し；
(5)前記加熱浴若しくはオーブンからカラムを取り出して、所望の機能用に選択若しくは特別に設計した接続金具を適用し；
(6)好ましくはプログラム化フローにより選択された溶媒でカラムからポロゲンと可溶性物質とを洗浄し；
(7)態様によっては、配合した変性溶液(formulated modification solution)をくみ上げて相互作用させるための所望の官能基を得；
(8)制御条件下で加熱浴若しくはオーブン中で、特別な変性を実施し；
(9)好ましくはプログラム化フローで前記カラムから変性溶液を洗浄し；
(10)高分解能の所望の条件下で使用するために前記カラムを安定化、組み立て及び調整し；
(11)目的の用途でサンプル分離によって前記カラムをキャラクタリゼーションし；
(12)選択された貯蔵溶液で前記カラムの液体を置換する。ステップ７〜９は、使用すべき媒体の官能基に依存して任意選択または反復的である。ステップ１から５は変形して、２または複数の段階重合プロセスで繰り返す。
本発明の幾つかの態様では、重合混合物は、単数または複数の(1)モノマー；(2)ポロゲン；(3)開始剤または触媒；及び／または(4)添加剤または充填剤(任意選択)を含む。重合混合物は、カラムに充填または注入する前に、15分以上ヘリウム、または真空、またはその両方の組み合わせによって脱気することができる。この脱気の目的は、混合物中の酸素を取り除くことである。酸素は、様々な状況で阻害剤または開始剤として作用して、重合の予測不可能な挙動を引き起こすことがあり、これはカラムの分解能及び再現性に弊害をもたらす。
上記プロセスの適切なモノマーは、当業界で公知の一、二及び多官能性モノマーを含み、中間体として現場で生成してもよい、ビニルまたはヒドロキシルシリカ官能基を含むモノマーが好ましい。典型的なモノビニルモノマーとしては、スチレン並びに、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、スルホン酸、カルボン酸、ニトロ基及びｃ４、ｃ８、ｃ１２及びｃ１８などの種々のアルキル鎖、または重合の前後でこれらの官能基を製造するために使用し得るその保護化型を含み；アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルピロリドン、ビニルアセテート、アクリル酸、メタクリル酸、ビニルスルホン酸、及びこれらの化合物を現場で製造するのに使用できるこれらの誘導体またはこれらの基がある。これらのモノマーの混合物も使用することができる。ヒドロキシル基、ビニル基、アルキル基をもつシロキサン類またはその誘導体及びその混合物も好ましい。一官能性モノマーの量は、本発明の態様の全モノマーの２%〜60%を変動する。これらは媒体のタイプに依存して、大きく変動する。
通常、二または多官能性モノマーは、ベンゼン、ナフタレン、ピリジン、アルキルエチレングリコールまたはそのオリゴ型(oligo)などの橋架部分をもつジまたは多ビニル含有モノマーが好ましい。これらのポリビニル化合物の例としては、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、アルキレンジアクリレート、ジメタクリレート、ジアクリルアミド及びジメタクリルアミド、ジビニルピリジン、エチレングリコールジメタクリレート及びジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート及びアクリレート、ペンタエリスリトールジ-、トリ-またはテトラメタクリレート及びアクリレート、トリメチルプロパントリメタクリレート及びアクリレート、並びにこれらの化合物の混合物が挙げられる。現場で製造されることが多いジ、トリ及びテトラヒドロキシ基をもつシロキサン類も本発明で好ましい。多官能性モノマーの典型的な量は、本発明の態様では40%〜80%である。
開始剤は、アゾ化合物、過酸化物などの当業界で公知の開始剤をすべて含む。典型的な開始剤の例としては、アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル、2,2’-アゾビス(イソブチルアミド)デハイドレート、2,2’-アゾビス(2-アミジノプロパン)ジヒドロクロリドがある。開始剤の典型的な量は、本発明の態様では全モノマーの0.5%〜２%である。シロキサンを使用する場合には、酸などの触媒を開始剤の代わりに使用する。触媒の量は、重合混合物１リットル当たりミリモル〜モルである。重合混合物に開始剤を配合しない重合への他のアプローチも当業界では公知であり、放射線照射を使用してポリマーを形成することができる。
ポロゲンは、重合後に除去して分離効率的開口部構造体を生成し得る任意の材料または化合物である。使用し得る典型的なポロゲンは、有機溶媒、水、オリゴマー、ポリマー、分解可能なまたは可溶性ポリマーである。有機溶媒の数例としては、アルコール類、エステル類、エーテル類、脂肪族及び芳香族炭化水素、ケトン類、ジ、トリ、テトラエチレングリコール類、ブタンジオール類、グリセロール類またはこれらの溶媒の組み合わせがある。ポロゲンの選択は、必要な分離効率的開口部サイズ及び分離効率的開口部分布に依存する。
幾つかの態様では、均質溶液を形成するためにモノマー及び開始剤と混合可能であるが、形成したポリマーに対しては溶媒和能が低い、単一のポロゲン性溶媒またはその組み合わせを選択する。重合は通常、開始剤により開始する。オリゴマーの形成後、架橋ポリマーまたは核を形成し、ポリマーまたは核を連続して成長させる。これらのポリマー鎖及び核は、ポロゲン性溶媒の溶媒和によって割り当てられたサイズで溶媒から沈殿する。これらのポリマー鎖及び核は、最初に溶媒中に懸濁し、衝突及び架橋によって小さな粒子を形成する。この小さな粒子はポロゲン及びモノマーによって膨潤し、重合及び他の核または粒子との凝集の両方によって成長し続ける。大きな粒子は衝突によって凝集し、架橋によって適所に保持される。ポリマー及び核の沈殿の時間及び速度は、これらの粒子の中で形成した粒子、凝集物またはクラスターのサイズ並びに分離効率的な開口部サイズ、並びに分離効率的な開口部分布に大きく影響する。
非常に貧溶媒とかなりの良溶媒の組み合わせは、溶液中のポリマーの溶解性または膨潤能(swellability)をよく調節し、これによって所望の多孔率及び分離効率的開口部分布をもたらすことが知見された。大きな分離効率的な開口部の生成が最も重要なので、貧溶媒の選択はより重要である。大きな分離効率的開口部を生成した後、分離効率的開口部のサイズを小さくするのに良い溶媒またはかなり良い溶媒を選択するのは容易である。ヒドロキシル基または多ヒドロキシル基を含むアルコール類または中性化合物は、ポリスチレン類、ポリメタクリレート類、ポリアクリレート類、ポリアクリルアミド類及びポリメタクリルアミド類で製造した媒体の貧溶媒のよい選択であることが知見された。種々の鎖長及びヒドロキシル基数のアルコール類を使用して、溶解性または溶媒和能は容易に調整することができる。トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ホルムアルデヒド、アセトアミド、DMSOなどの多くの慣用の良溶媒からポリマー用の良溶媒を選択することができる。ポロゲンの典型的な量は、本発明の態様では20%〜80%を変動し、40%〜60%がより好ましい。
本発明で使用する添加剤または充填剤は、媒体に特異的な所望の特徴を加えることのできるような材料である。分離効率的開口部をもつポリマーの一つの重要な特徴は、ポリマーの剛性である。重合後に、不溶性剛性ポリマー粒子、シリカ粒子または他の無機粒子を重合混合物に添加して、分離効率的開口部をもつポリマーを強化することができる。非常に多くのまたは多量の分離効率的開口部をもつポリマーは、通常、優れた強度も強靱性ももたない。これらは大体の場合、脆弱である。剛性粒子は、ポリマーに対して組織(framework)として機能することができる。もう一つの態様では、大きなカラムの分解能及び大きな直径のカラムの製造の間の熱転移問題は、重合混合物に非常に単分散の無孔質粒子を添加することによって軽減される。低い背圧で高い流速を可能にするために、高速分取クロマトグラフィーまたは接触ベッドでは大きな直径のカラムが必要とされることが非常に多い。
分離効率的開口部をもつポリマーの態様では、単分散の大きな無孔質粒子またはビーズを密な充填に近いパターンできっちりと充填する。重合混合物を大きなビーズの隙間に充填し、この空間で重合させる。フローパターン及びカラム効率は、密に充填した単分散ビーズによって改善される。大きな単分散ビーズは大きなカラムの支持材料であるので、非常に多くのまたは多量の分離効率的開口部をもつ材料は、剛性の低い媒体が崩壊するおそれなく、大きな直径のカラムに製造することができる。多数または多量の分離効率的開口部であるが、ポリマーの強靱な構造により、高い流速を達成することができる。
もう一つの態様では、充填剤として分離効率的開口部をもつポリマーを配合する二段階または多段階重合を使用して、大きなカラムの製造における熱放散問題を防止する。本発明の一態様では、同一重合混合物から製造した分離効率的開口部をもつ多数の細い(thin)カラムを充填剤として使用して、大きなカラムを現場で製造する間の熱放散問題を軽減する。本発明のもう一つの態様では、同一目的に関してポリマーロッドを充填剤として使用する。本発明の一態様では、充填剤材料は、大きな無孔質シリカビーズである。
ポリマー、モノマー、開始剤、ポロゲン、添加剤及び重合温度は、カラムの特徴を改善するために選択し、重合の間に圧力を使用して重合の態様でまたは他のプロセスで使用することができる。本プロセスの側面の幾つかは、シリカモノリスを形成する重縮合反応及びゾルゲルプロセスなどのフリーラジカル反応以外の重合反応で形成したモノマー及びポリマーに適用することができる。
本発明の一態様のカラムハードウェアは、筒状、円錐形、長方形及び多角形またはこれらの管のアセンブリを含む種々の形状をもつ、クロマトグラフィーカラムとして使用すべき剛性管を含む。管は、金属、ガラス、シリカ、プラスチックまたは他のポリマー、より好ましくはステンレススチールまたはガラスを含む、当業界で公知の任意の慣用の材料から製造することができる。この管の内径は、直径、厚さ、幅または深さでマイクロメートルからメートルを変動し得る。透過可能な固体材料は、分離モード、より具体的には軸方向または正流クロマトグラフィーまたは放射状流クロマトグラフィーに依存して、管の中を軸方向にまたは放射状に通すことによってサンプルの分離を実施する管の全断面積に広がることができる[Lee、W-Cら、“Radial Flow Affinity Chromatography for Trypsin Purification”，Protein Purification(本)、ACS Symposium Series 427、第８章、American Chemical Society、Washington，D.C.,1990年]。重合の間に重合溶液が接触するカラムまたはモールドの内壁は、非反応性であってもよく、またはプラグの表面への接着性を高めるように処理することができる。管は、他の装置、より具体的にはクロマトグラフィー装置と接続するために、当業界で公知の任意の使用可能な接続金具を含むことができる。
本発明の態様では、モノリシック透過可能な固体ポリマーは、キャピラリー管に形成することができ、たとえば150ミクロンの内径のキャピラリー管を挙げることができる。もう一つの非常に重要な態様では、モノリシック透過可能な剛性材料は、多くは加圧下で、取り外し可能な80mm内径のTeflon(登録商標)封止環に形成し、封止する。この環及びカラムは、低コスト、信頼性のある、高容量、高分解能、高速、容易に置換可能な、交換クロマトグラフィーカラムとして販売することができる。もう一つの態様において、管の直径は10mmである。もう一つの態様では、管の直径は4.6mmであり、材料はステンレススチールである。本発明のもう一つの態様では、カラムとしてプラスチック・シリンジ・バレルを使用する。もう一つの態様では、金属容器、封止板及び多くの筒状穴をもつインサートを含むモールド中に、モノリシックマトリックスを形成する。インサートの厚さは１〜10mmを変動する。モールドは、シリカまたは剛性ポリマーで製造したプレート上に複数のチャネルまたは溝をもつミクロデバイスであってもよい。モノリシック材料は任意のサイズ及び形状で形成することができ、たとえば場合により底部に小さな溶出部分をもち、当該媒体を含む複数のウェルをもつミクロタイタープレート（micro-titer plate）などの具体的に設計されたミクロサイズのデバイスに適合させることができる。これらのデバイスで設計された形及びサイズまたは用途には、限界がない。
重合混合物は、重合すべき製品の最終用途に依存して所望の形状及びサイズのカラムに充填または注入して、固体担体として使用するために分離効率的開口部をもつプラグを形成する。好都合には、重合は、クロマトグラフィーカラム、接触ベッド、抽出チャンバなどのプラグを使用すべきカラム中で実施する。本発明の一態様では、重合の間に重合混合物に正圧を加えて凝集物の粒径を制御し、且つ重合の間の容積収縮を補正(相殺)する。凝集物の粒径は、加圧しなかった重合由来のものよりもより均質且つ大きいことが知見された。重合の間の容積収縮は、正の空気圧またはピストンを正圧で移動させることによって相殺される。
より具体的には、重合混合物を好ましい態様ではカラムに、または他の適切なモールドに適用する。このカラムまたはモールドの中で重合を開始する。重合をオーブン中で実施する場合には、カラムまたはモールドを十分に封止してポロゲンまたはモノマーの蒸発による予定外の損失を回避し、また重合を水浴中で実施する場合には、汚染または希釈を回避する。重合の間、重合溶液に圧力を適用する。好ましくは、この圧力は大気圧より上のレベルに保持し、凝集物のサイズ及びポリマー中のその分散を制御し、且つ収縮によるポリマー壁表面及び媒体内部のボイドの形成を回避し、且つ重合が完了するまでカラムの壁から媒体が分離して隙間または壁チャネルを通って流路が形成しないようにする。収縮に適応させるために大気圧にカラムを保持すると、あらゆる場合にボイドの形成を回避するが、再現性が低い。圧力供給源は、ガス圧、非混和性液体由来の圧力、空気圧、スプリント力(sprint force)または油圧によって駆動したピストンであってもよい。
本発明の一態様では、任意の数の加圧モールド(管)を、一つの水浴中の一定または制御温度に維持し、同様に一つの(たとえば窒素、水など)マニホールドから加圧する。これによって生産の均一性及び速度の両方が上昇する。
本発明のもう一つの態様では、選択した圧力を高圧窒素によって重合混合物に及ぼす。本発明の別の態様では、選択した圧力を、図２、３または４に示された加圧デバイスによって重合の間に重合混合物に及ぼす。カラムは一端で封止し、重合混合物をこのカラムに充填する。もう一つの端部は、図２、３または４に示されたデバイスによって封止する。カラムを含む重合治具の全アセンブリは、図２、３または４に示されている。シリンジポンプからの油圧によって駆動された平滑なTeflonプラグのピストンで、重合物に圧力を適用する。この重合混合物を、Teflonプラグ及びo-リングによってカラムに封止する。一定の正圧を重合混合物に適用すると、実際の圧力は油圧と摩擦との差である。重合の間、ピストンは、モノマーがポリマーに転換するにつれてカラム内を移動して、ポリマーの収縮によって発生したボイドを相殺する。これによって、この収縮によって封止されたカラム内に発生した全ての陰圧及び空隙を防ぎ、カラム効率を改善する。
収縮はあらゆる方向にあると考えられる。得られたボイドは、AIBNによって生じた窒素ガスまたはカラム内の陰圧で溶媒蒸気によっておそらく占められている。ボイドは、ポリマー壁上の大きな不規則なへこみまたは、全ポリマー表面に拡散している小さな不規則なへこみであってもよい。ボイドはポリマー内部にも分散し、結果として分散効率的開口部のサイズ分散の非均質性を招く。これらの不規則なボイド及び隙間は、カラムのウォール効果またはゾーン拡散を招く。これらはカラム効率に悪影響を与え、カラムの分解能を低下させる。これらのボイド及び隙間は、生産の同一バッチで代わる代わる、または生産のバッチからバッチへカラム性能の低い再現性をももたらす。
本発明の一態様では、選択された圧力を重合混合物に及ぼして、凝集物のサイズ及び分離効率的開口部サイズ分布を制御する。粒径は、重合の間に重合混合物の圧力変化に伴って変化する。高圧では粒径は大きい。正圧下では、重合の間のポリマーの収縮は、圧力の方向でのみ発生する。これによって、ポリマー内部のボイド及び／またはカラム壁に隣接する壁表面上のボイド/隙間の形成を防ぐことができる。
重合プロセスの間、モノマーがポリマーにどんどん転換するにつれて、モノマー濃度は低下し続ける。架橋ポリマーは、溶液から沈殿し、互いに凝集して大きな粒子またはクラスターを形成する。これらの粒子は沈殿し、ビニル基をもつ活性ポリマー鎖などの架橋剤によって互いに結合する。これらの相互連絡した粒子はカラム底部に沈殿し、これによってカラムの上部ではモノマー濃度が低くなる。
分離効率的開口部サイズは、全モノマー濃度及びその比によって大きく影響を受ける。非均質な分離効率的開口部サイズ勾配が重力方向に沿って形成し、これがゾーン拡散を招く。粒径は重合圧力によって一部制御されるので、分離効率的開口部のサイズの勾配は、重合の間の圧力を調節することによって補正することができる。一態様では、直線的に増加させた圧力を重合の間に重合混合物に及ぼす。もう一つの好ましい態様では、段階勾配圧力(step pressure gradient)を重合の間に重合混合物に及ぼす。圧力の上昇/下降速度及びパターンを選択して、全重合プロセスの間の凝集物の粒径及びその分布を制御する。分離効率的開口部サイズ分布の線形勾配(linear gradient)が望ましい場合、種々の速度及び種々の最大圧力で、重合の間、圧力を変動させることによって達成することもできる。
重合温度は、開始剤の選択に依存する。AIBN及び過酸化ベンゾイルを使用する場合、典型的な温度範囲は50℃〜90℃である。加熱供給源は、当業界で公知の任意のものであってよい。好ましい方法は、温度制御した加熱浴またはオーブンである。反応時間は、開始剤及び反応温度の選択に依存して、0.5〜48時間である。本発明の一態様では、重合は、温度制御した水浴中、60℃で20時間実施する。
光感受性開始剤を使用する場合には、IR、UV-可視またはX-線などの放射線照射を重合用の供給源として使用する。一態様では、反応は開始剤の熱活性化により開始する。もう一つの態様では、化学開始剤を任意に使用して、X-線などのエネルギー的照射の適用によって反応を開始させる。X-線を使用する場合、開始剤は、重合温度より十分高い温度で熱的に活性化するように選択しなければならない。他方、X-線照射下では開始剤は、活性化を受容するために反応素材に望ましい所定の領域の温度で活性化する。開始剤は、活性化時間及び解離の温度がモノマー単独の場合よりもかなり低いようにも選択する。活性な開始剤(フリーラジカル)の生成は、X-線強度によってのみ制御される。X-線強度は制御可能であるので、反応速度は制御可能であり、「暴走」も過熱もしない。さらに、開始剤は、X-線照射のときに活性化を受容するために反応素材に望ましい領域の温度で活性化するように選択することができる。
一態様において、X-線は、重合用のエネルギー供給源として使用する。X-線光子のエネルギーは、種々の厚さまたは断面のポリマーの製造で変動する。小さな直径のポリマーロッドの製造用には低エネルギーX-線を使用し、大きな直径のポリマーロッドの製造用には、高エネルギーX-線または低エネルギーX-線に長時間暴露することができる。好ましい態様では、重合温度は、X-線のオン/オフを切り替えることによって制御する。X-線を切断すると、フリーラジカルの寿命は通常、約１秒なので、重合は数秒以内に急速に停止する。
一態様では、光開始剤を使用して、エネルギー供給源としてX-線を使用して重合を開始する。光開始剤は、通常、γ-線、X-線、UV、可視及びIR感受性光開始剤を含むポリマー業界での光重合で使用する光開始剤である。光開始剤としては、アゾ化合物、たとえばアゾビスイソブチロニトリル、過酸化物、たとえばジフェニル(2,4,6-トリメチルベンゾイル)ホスフィンオキシド、ケトン類、たとえばフェナントレンキノン、2-クロロチオキサンテン-9-オン、4,4’-ビス(ジメチルアミノ)ベンゾフェノン、4,4’-ビス(ジエチルアミノ)ベンゾフェノン、4,4’-ビス(ジメチルアミノ)ベゼボフェノン(bezebophenone)、2-クロロチオキサンテン-9-オン、ベンジルジメチルケタール、有機金属錯体が挙げられる。これらの光開始剤としては、カチオン及びフリーラジカル重合の両方で使用されるものが挙げられる。一態様において、AIBNは光開始剤として使用する。もう一つの態様では、フェナントレンキノンを光開始剤として使用する。
一態様において、X-線増感剤またはシンチレーターを光開始剤と組み合わせて使用する。使用し得るシンチレーターとしては、従来の発光材料全てが挙げられる。シンチレーターとしては、ターフェニル、クォーターフェニル(quarter phenyl)、ナフタレン、アントラセンなどのベンゼン環を含む化合物、複素環を含む化合物、カルボニル基をもつ化合物、二つ以上のルロロフォア(lurorophor)をもつ化合物、有機金属化合物並びに、ZnTe、ZnSe、ZnS、CsI、Gd2O2S及びCaWO4等の無機化合物が挙げられる。幾つかの態様では、シンチレーターとして、2,5-ジフェニルオキサゾール(PPO)、2-フェニル-5-(4-ビフェニルイル)1,3,4-オキサジアゾール(PBD)、2-(1-ナフチル)-5-フェニルオキサゾール(a-NPOを使用する。一態様において、ターフェニルをシンチレーターとして使用する。別の態様では、シンチレーターとしてZnSeを使用する。シンチレーターと光開始剤との組合せを使用する開始機構は、多段階開始プロセスであると考えられる。最初に、X-線が溶媒分子を活性化して、電子的に励起された溶媒分子を形成する。この励起された溶媒分子は迅速にその励起エネルギーをシンチレーターに転送して、電子的に励起したシンチレーターを形成する。次いで、シンチレーターの励起状態は、光子を放出することによって基底状態に緩和する。放出された光子は光開始剤によって吸収されて、活性フリーラジカルを形成する。このフリー開始剤フリーラジカルはモノマーのビニル官能基と接触して、重合プロセスを開始する。このプロセスは以下のように表現される。
Figure 0004721702
X-線照射重合は、ポリスチレン、ポリテトラヒドロフランなどのホモポリマー、エポキシまたは他の架橋材料などの樹脂及び、カラム、膜または任意の他のハウジングの材料の形状の分離媒体などの多孔質ポリマー担体の製造に使用することができる。本方法は、任意の形状の成形品の製造に使用することができる。一態様では、エネルギー源としてX-線放射を使用して、ポリスチレンを製造する。ポリスチレンは、狭い開口部をもちシリンダーの形状のガラスバイアルのモールドで製造する。溶液重合及びバルク重合の両方を使用して、ホモポリスチレン材料を製造する。もう一つの態様では、ポリグリシジルメタクリレート樹脂は、同一方法を使用して製造する。もう一つの態様では、多孔質ポリ(スチレン-コ-ジビニルベンゼン)を製造する。もう一つの態様では、多孔質ポリ(グリシジルメタクリレート-コ-エチレングリコールジメタクリレート)ポリマー担体を製造する。
X-線は、マイクロメートルからメートルの断面をもつ多孔質モノリシック・ポリマー担体、及び同様に粒子状ポリマー担体の製造に使用することができる。X-線照射重合を使用して、キャピラリー及びミクロポア分析カラム、慣用の分析カラム、分取及びプロセスカラムなどのモノリシック液体クロマトグラフィーカラムを製造する。一態様では、内径1cmのガラスカラム内で多孔質モノリシック担体を製造する。カラムは、SEM、ポロシメトリー及びクロマトグラフィーによりキャラクタリゼーションする。ガラスハウジング内のポリ(スチレン-コ-ジビニルベンゼン)モノリシックカラムは、ペプチドの優れた分離を示す。X-線は、材料に深さ方向にも浸透することができる。有機及び無機ポリマーのいずれもX-線またはγ-線を使用して製造することができる。高エネルギーX-線及びγ-線は、材料に非常に深く進行することができる。そのような深い深度が必要な場合、重合していない混合物をX-線ビームに設置し、全体の、時間平均放射が、重合するボデー内で十分に均一であるように選択した方法で回転且つ平行移動させることができる。クロマトグラフィーフローの所定の方向に並んだ放射線は、放射線ビームの吸光度のため、ベッドでは顕著なクロマトグラフィー非均一性を生じない。軸方向の非均一性は、放射方向の非均一性のように必ずしも性能を劣化させるとは限らない。一態様では、低エネルギーX-線を使用して、直径3.5cmのガラスカラム内で多孔質モノリシック担体を製造した。もう一つの態様では、直径88mmのポリマーカラムハウジング内でモノリシック担体を製造する。重合温度は、X-線光子の強度及びエネルギーを制御することにより、並びに反応混合物の少なくとも一方の側のウォータージャケットによって制御する。好ましくはそのような水冷式は、熱勾配を回避するためにカラムを放射方向ではなくその軸方向に冷却するので、非均質になってしまう。流路が全て、クロマトグラフィーフローの方向に同じ非均質性となるため、分離の際に効果がない。この大きな直径のカラムの中心の重合温度は、全重合プロセスの間に、カラムの端部での重合温度と殆ど同一である。モノマーの転換率は、重合４日後に達成される。
X-線照射重合は、熱重合と組み合わせることができる。重合速度及び多孔率は、重合速度によって制御することができ、これは、X-線のエネルギー及び強度、並びに重合温度によって制御することができる。放射線照射重合プロセスの経済及び安全性を考慮して、大きな直径のモノリシック・ポリマー担体の製造には、低エネルギー及び強度のX-線を使用するのが好ましい。3.5cm直径のカラムで48時間の重合後のモノマーの転換率は、70%を超える。重合速度をスピードアップし且つ短時間で転換率を完遂するためには、開始剤に対応する所望の温度での熱重合を利用する。一態様では、X-線照射、続いてX-線照射重合の後70℃における熱重合によって、多孔質ポリ(スチレン-コ-ジビニルベンゼン)を製造する。ポリマーの多孔率は、モノマー組成、X-線強度及びエネルギー、開始剤とシンチレーターの組み合わせの選択、並びにX-線照射重合及び熱重合の両方における重合温度によって制御することができる。重合プロセスで使用するポロゲン性溶媒は、先に記載の純然たる熱重合で使用したものと同一である。液体クロマトグラフィー用途に優れたポリマー担体が得られる。
ホモポリマー、スラブ型ポリマー樹脂及び多孔質ポリマー表面コーティングを含むが、本発明のポリマー材料を含まない、ポリマーの製造については紫外線及び可視光照射が利用されてきた。UV及び可視光のいずれも、薄い、固体の透明材料を透過することができる。紫外線及び可視光は、膜などの薄い、透明な材料の製造に使用されてきた。材料の厚さが厚い場合には、多孔質ポリマーの均質性がより問題となってくる。これは、多孔質固体材料を通る光の散乱及び減衰のためである。固体材料内を伝播し得る光の深度は、材料の官能基及び屈折率に直ちに依存する。二相から製造されたアクリル酸の乾燥多孔質カラムについて考えてみると、アクリル樹脂の屈折率は約1.5で、空気の屈折率は1.00である。これは光を完全に散乱するので、この材料は、チョークのように白く不透明に見える。今までのこれらの明らかな差によって、重合にはUVも可視光も利用されてこなかった。本特許出願では、高い均質性をもつ上記材料を含むポリマー材料の製造に紫外線及び可視光を使用する方法を開示する。本特許出願は、インチ厚の大きいポリマー材料を製造する方法も提供する。
本発明では、選択された光の波長で目的のポリマー樹脂と非常に似ているかまたは同一の屈折率の溶媒を、重合用に選択する。選択された波長の光は、クリスチャンセン効果により重合の間にポリマー内を移動することができ、ここで目的の多孔質樹脂は、かなり半透明または透明になる。細孔は溶媒で一杯なので、特定の波長範囲の光は透明性を示す。好ましくは、ポリマー固体及び溶媒の両方における屈折率が非常に近い単色光を重合用に選択する。熱ではなく光により活性化された活性剤を光開始剤と一緒に使用する。白色光を使用する場合には、透過光は、ポリマー固体及び溶媒または溶媒の組み合わせにおける光の屈折率が非常に近い特定の波長に対応する。光開始剤を、ポリマーと溶媒の近透明波長範囲の光を吸収し、且つこれによって活性化させるように選択する。開始剤はこの波長範囲を吸収する。好ましくは、光開始剤が活性化されたら、元の発色団にはないフラグメントに崩壊する。そのようなフラグメントは選択された光の波長範囲には吸収をもたない。光線が光開始性分子中の発色団によって吸収されると、表面で局所的に重合がおきる。発色団がこの反応を切り抜けたら、これらはそこで次の放射線が次の光開始剤分子を活性化しないようにして、元の表面に重合を制限する。従って、光はより深くポリマー混合物内を移動することができ、光の透過は増加する。この効果は漂白効果(Bleaching Effect)として公知である。この観点において優れた光開始剤は、2,4,6-トリメチルベンゾイルジフェニルホスフィンオキシドであることが知見された。この漂白効果とクリスチャンセン効果は、光開始またはe-線照射によって、非常に厚い層または深い、多孔質ポリマーの製造で相乗作用をもつ。後者の場合、X-線が溶媒を励起させ、次いでこれは二次エネルギーを所謂「増感剤」に伝え、次いでこれが蛍光を発して開始剤を活性化する。X-線によって励起させるときに溶媒もそれ自体蛍光を発生する場合、さらに相乗作用が存在することも知見することができる。しかしながら、X-線重合に関しては、増感剤としてp-ターフェニルを使用することが多い。使用される蛍光を発生する溶媒(fluorescing solvent)としては、多くのアリール化合物、たとえばトルエン、o-、m-若しくはp-キシレン、または1,2,3(若しくは他の異性体)メシチレン(mestylene)が挙げられる。一態様では、ポロゲン性溶媒としてo-キシレンを使用する通常の溶液重合によって、ホモ-ポリ（グリシジルメタクリレート）を製造する。O-キシレン、モノマー及び特にポリマーの屈折率は近い。溶液中に得られたポリマーは、白色光が少し散乱するため、透明に近いが少し半透明である。
ターゲットポリマーの屈折率を測定する。ターゲットポリマーの屈折率に近い屈折率をもつ良溶媒及び貧溶媒の両方を選択する。溶媒比を調節することによって、溶媒混合物の屈折率は、ポリマーと殆ど同じになるだろう。従って、溶媒によって膨潤したポリマー内の光の透過は最大に到達することができる。一態様において、多孔質ポリメタクリレートベースのモノリスは、溶媒の組み合わせを使用することによって製造する。
得られた透過可能なポリマーは、二つ以上の適切な構造をもつことができる。一つは目的とする用途に望ましい分離効率的開口部のサイズ分布をもつ。通常、少なくとも一方向において300nm未満の小さな分離開口部を含み、これは分離用に大きな表面積と、大部分の移動相が通過するのに500nmを超えるような大きな分離開口部を提供する。好ましくは大きな分離効率的開口部のサイズは中及び低圧分離媒体に関しては２〜５ミクロンであり、高及び中圧分離に関しては0.6〜２ミクロンである。分離効率的開口部のサイズ分布及び不規則な形状のサイズ分布は、ポロゲンのタイプ及び量、モノマー、開始剤、並びに重合温度、時間及び圧力によって制御することができる。一態様において、モノマーは所望の官能基をもつだけでなく、重合反応速度論及びポリマー構造を変化させることによってカラム効率の改善を助長するように選択し、これによってより理想的な分離効率的開口部サイズ分布になる。モノマーの比は、同一目的に関して選択する。所望の分離効率的開口部サイズ分布の生成について注意深く研究した後で、ポロゲンのタイプ及び量を選択する。重合の間の圧力の使用及び選択は、所望の分離効率的開口部サイズ分布の生成と、カラム全体における分離効率的開口部サイズ分布の均質性にとって特に重要である。これは、慣用の封止または開放重合で発生した不規則なボイド及び壁チャネルの形成も回避する。
ミクロポアの形成は、重合の間に圧力を使用すること、並びに他の重合条件及び試薬を注意深く調整することによって大きく減少または防止することができる。分離効率的開口部をもつこのポリマーの走査電子顕微鏡(SEM)研究から、このポリマー粒子モルフォロジーがサンゴの幾つかの形状に似ていることが知見される。サンゴ様ポリマー(coral-like polymer)は、付着(accretion)によって明らかに成長した内部連絡した波形(corrugated)粒子から形成される。これらの粒子の内部は、無孔質である。表面は非常に波形であり、種々のサイズの開口部をもつ非常に多数の小さな開口の浅い溝を含む。ポリマーの一つのSEM研究では、粒子は深度が浅い開口部をもつコア-シェル構造である。個々の粒子におけるこれらの独特の波形ポリマー構造及び通し細孔をもたないコア-シェル粒子構造は、粒子またはビーズ内部に多数のミクロポア及びメソポアを含む慣用のマクロポーラス媒体における物質移動問題(mass transfer problem)を回避すると同時に、通常の無孔質分離媒体と比較してモノリスの容量を大きく改善する。これらの構造は、文献に開示された通し細孔(through pore)をもつ所謂「潅流ビーズ：perfusion bead」またはモノリスとも大きく異なる。内力(internal force)がポリマーを膨潤させたり膨張させたりするとき、圧力を適用することによって、または膨張に対して容積を保持することによって調整した幾つかのカラム中の粒子凝集物は、通常、粒子の凝集した実質的に丸い凝集物ではなく、積み重なった平坦または入れ子(nested)構造になる。
本発明のモノリスは、これらの問題点を回避しつつ、無孔質粒子充填の高い分解能とマクロポーラス充填の高い容量との好都合な点を組み合わせる。これらの波形粒子は、モノマー及び活性オリゴマーによって膨潤且つ取り込まれるポリマー核の付着、及び他のポリマー核と融合によって成長することができる。これらの粒子は互いに凝集し、架橋によって強化される。この構造は、理論モデルに従うゾーン拡散の主な理由の一つである、粒子内部の細孔及びミクロポア中のサンプル粒子の捕捉(trapping)を防ぐことによってカラム効率を大きく改善する。粒子、凝集物または塊(クラスター)のサイズは、より均質であるように微細調整することができ、分離効率的開口部サイズ分布を改良して、先に記載した他の因子の選択と圧力を注意深く制御することの組み合わせによって、高い分解能の分離を与えることができる。
液体クロマトグラフィーにおいてより親水性の化合物を十分に分離するには、出発移動相を、有機溶媒を使用しない100%水にしなければならないことが多い。このタイプの分離は、非常に疎水性である純粋なスチレン/ジビニルベンゼン、ポリメタクリレート類並びに、C4、C8、C12及びC18を含むそれらの誘導体をベースとする逆相媒体では満足に実施することができない。ポリマーは、低有機溶媒含有量の水性移動相では収縮する。この収縮はカラムの壁とポリマー媒体との間に空隙(void space)を作り、これはクロマトグラフィーにおける所謂「壁チャネリング：wall channeling」を導く。結果として、サンプルと移動相は媒体を迂回して、媒体の代わりに壁のチャネルを通る。サンプルは保持されないか、一部しか保持されないので、それぞれの純粋なサンプルに複数のピークが出る。
一態様では、ウォール効果は、媒体の中に純粋な水または塩溶液を通し、続いて壁とポリマー媒体との間の空隙が封止されるまで、ピストン接続金具で媒体を圧縮することによって、最初に媒体を最大収縮させることによって回避する。ピストンは、ナット接続金具によって適所に保持される。この接続金具は図３及び図４に示す。壁のボイドの収縮及び封止は、最初にカラムの背圧を下げ、次いで上げることによってモニターすることができる。このプロセスにより分離プロセスの間の「壁チャネリング」形成を回避する。一態様では、ポリマーを純粋な水中で収縮させ、PEEKピストン接続金具で圧縮する。本発明のもう一つの態様では、ポリマーを１モル/lのNaCl溶液中で収縮させ、PEEKピストン接続金具で圧縮する。
非常に極性の高い環境では、線状ポリマー鎖及びポリマー表面のC4、C8、C12及びC18の鎖は崩壊して、サンプル分子と媒体の表面との間の相互作用が弱くなる。また、媒体と移動相との極性が大きく異なるため、ベッドは移動相では殆ど湿潤しない。サンプルと固定相との間の物質移動及び相互作用は非常に低いので、カラム効率と分解能は低くなる。これらの「壁チャネリング」の問題は、サンプル保持と分離の所望の疎水性を維持しつつ、ポリマーマトリックスの親水性を高めることによって軽減される。
ポリマーマトリックスは、ポリマーの繰り返し単位にヒドロキシル、アミド、カルボアミドまたは親水性部分などの親水性官能基を含む。ポリマーは、ポリマーマトリックスの親水性により、水で湿潤且つ膨潤することができる。ポリマー媒体の表面は、逆相クロマトグラフィーでの疎水性相互作用のために非常に疎水性のポリスチレン鎖、またはC4、C8、C12及びC18鎖も含む。水中でのポリマーの収縮は、軽減または完全に回避され、壁チャネリングの問題も解決する。親水性は、親水性部分を含むモノマーの直接共重合または、親水性部分を配合するためにポリマーを変性させることによって改善することができる。
本発明の一態様では、「壁チャネリング」及び水中の疎水性基の相互作用の崩壊を回避するために、親水性のヒドロキシエチルメタクリレートをスチレン及びジビニルベンゼンと共重合させる。本発明の一態様では、ステアリルアクリルアミドを、ステアリルメタクリレート及びエチレングリコールジメタクリレートと共重合させる。親水性モノマーを添加すると、逆相カラムでのタンパク質変性も軽減することができる。好ましい一態様では、アクリロニトリルをスチレン及びジビニルベンゼンと共重合させる。このポリマーは、親水性モノマーの親水性度が高くなるに連れて益々膨潤する。親水性部分を含むポリマーで構築した逆相分離媒体は、水性溶液及び非水性溶液の両方で膨潤するだろう。これによって水性移動相での逆相分離媒体の利用可能性が増大する。
現場重合を使用して、任意のサイズ及び形状のカラムを製造することができる。一態様において、内径75μmの筒型のキャピラリーカラムを製造した。もう一つの態様では、4.6mmIDのカラムを製造した。もう一つの態様では、88mmIDのカラムを製造した。もう一つの態様では、断面100μm〜700μmの正方形のキャピラリーカラムを製造した。もう一つの態様では、3mm厚さ及び内径1cmのポリマーディスクを製造した。もう一つの態様では、外径1cm及び内径4.6mmのドーナツ型モノリスを製造した。もう一つの態様では、内径100μmの溝をもつマイクロチップカラムを製造した。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(hydrophobic interaction chromatography)は、穏和な疎水性をもつ非常に親水性の分離媒体を必要とする。疎水性炭素鎖またはポリマー鎖を少なくしてマトリックスの親水性度をさらに高めると、逆相媒体を疎水性相互作用媒体に調整することができる。
順相クロマトグラフィーは、その表面が親水性官能基で完全に被覆された、親水性媒体を必要とする。従来法では、ポリ(グリシジルメタクリレート-コ-エチレングリコールジメタクリレート)中のエポキシ基の加水分解を使用して、順相分離媒体を得ていた。順相分離媒体は、ヒドロキシル及びアミドなどの親水性官能基を含む親水性モノマーの現場直接重合により製造する。一態様では、ヒドロキシメチルメタクリレートを、EDMA等の架橋剤と一緒に共重合して、順相媒体を得る。本発明の一態様では、カラムハードウェアは、ガラス繊維で強化したポリプロピレンバレルである。
従来法に従って製造した逆相モノリシック媒体は、非常に容量が低く、分離の間に圧縮する。液体クロマトグラフィー媒体の充填容量と媒体の剛性は、媒体の架橋密度を上昇させることによって高める。架橋密度(crosslinking density)は、ポリ(スチレン-コ-ジビニルベンゼン)モノリス中、ジビニルベンゼンなどの多量の架橋剤を使用することによって高める。一態様では、全モノマー中、ジビニルベンゼン100%(80%純度。残りは殆どエチルスチレンである。これは市販されているなかで最も純度の高いグレードである)を使用できる。容量は、従来法で製造したモノリスの６倍である。加圧重合下で製造した高容量モノリスは、高分解能並びに高容量をもつ。本発明の一態様では、全モノマー中90%のジビニルベンゼン(80%純度)を使用する。もう一つの態様では、全モノマー中80%のジビニルベンゼン(80%純度)を使用する。
媒体の剛性及び分解能を改善するもう一つの方法は、カラムの全ポリマー密度を高めることによる。全ポリマー含有量は、混合物中の全モノマー含有量を増加させることによって高められる。重合混合物中の全モノマー含有量を増加させることによって、カラムの分解能も同様に改善される。分離効率的開口部サイズ及びその分布は、重合混合物中の全モノマー濃度によって大きく影響を受ける。本発明の一態様では、全モノマーの46重量%を使用して媒体の剛性及び分解能を改善する。
従来法で製造したモノリシック媒体は、分解能が低く、分離速度が遅く、剛性が低く且つ非常に低容量である。従来法のモノリシック・ポリメタクリレートベースの弱アニオン交換器は、ポリ(グリシジルメタクリレート-コ-エチレングリコールジメタクリレート)をニートのジエチルアミンで変性することによって製造した。これは水中で大きく膨潤し、高い流速では使用することができない。この媒体は非常に剛性が低く、且つ６cm/分を超えた流速では安定ではない。実験の間、カラムの背圧は上昇し続ける。親水性媒体の剛性を改善する二つの方法を提供する。
第一に、媒体の剛性は、ポリマーマトリックスの架橋密度を上昇させることによって改善することができる。低い架橋密度では、多くの非架橋線状ポリマー鎖は、水で溶媒和して、溶媒に伸張している。ポリマーマトリックスは、この高度な溶媒和のため膨張する。ポリマー内でのポリマーマトリックスの膨張によって、分離効率的開口部のサイズと、内部接続した粒子の間の間隙が狭まる。多孔率も低下する。これらにより背圧が高くなる。高度に溶媒和した多孔質ポリマーは、軟質ゲルの特徴をもつ。加圧下、この軟質ポリマーは、容易に圧縮することができ、高圧をもたらす。圧力が増加するとさらに媒体を圧縮して、さらに高圧になるだろう。圧力増加及び圧縮のサイクルは、従来法のモノリスでは高速分離の用途に有用にはならない。
架橋密度を増加させると、膨潤可能な線状ポリマー鎖は短くなり、膨潤は軽減する。分離効率的開口部をもつポリマーは、より剛性になる。分離効率的開口部をもつ構造は水性溶媒中で保持される。多孔率及び大きな分離効率的開口部サイズは、高度に架橋したポリマーマトリックスで得ることができ、これによって圧縮及び圧力上昇の不利なサイクルなく高い流速を使用することができる。高速分離は、高い流速を使用することによって達成することができる。
本発明の一態様では、イオン交換器の架橋密度は、70%架橋剤、エチレングリコールジメタクリレート(EDMA)を使用することによって大きく改善される。好ましい態様では、EDMAの量は50%である。もう一つの好ましい態様では、EDMAの量は60%である。EDMAはイオン交換基を含むそのコポリマーよりもずっと疎水性である。EDMAの量を増やすことによって、ポリマーマトリックスの親水性度は低下する。これによって、膨潤が減少して、剛性が改善する。これは、水性相中でのポリマーの高い剛性が非常に望ましいとき、親水性架橋剤の代わりにより疎水性の架橋剤を使用する追加の好都合な点である。
第二に、ポリマー分離媒体の剛性及びカラム効率は、本発明の制御変性によっていずれも改善される。グリシジルメタクリレート(GMA)は、イオン交換官能基を含むように変性させる前は疎水性である。従来技術のモノリシック弱アニオン交換器(WAX)のGMAは、ニートのジメチルアミンと60℃で３時間の反応によって変性する。ニートのジエチルアミンはポリマーを膨潤させ、ポリマー粒子内に拡散してGMAエポキシド基に近づく。この変性反応は、ポリマーの分離効率的開口部表面上のGMA部分だけでなく、ポリマーマトリックス内のGMA部分も変性する。イオン交換官能基を含む親水性部分は、変性後は、分離効率的開口部の内部及び外部の両方の疎水性幹(backbone)と混じり合う。この非選択的変性によって、幾つかの疎水性幹は分離効率的開口部の表面に暴露したまま、全ポリマーマトリックスを広範囲にわたって水に膨潤させることができる。分離開口部の表面上の疎水性パッチによって、イオン交換クロマトグラフィーによる分離の間に二次的な疎水性相互作用が生じ、これによってゾーン拡大(zone-broadening)がもたらされる。
ポリマー粒子の表面上のGMAを制御変性することによって、水中で粒子の内部部分をより疎水性にし、且つより膨潤しないように保持することができる。表面GMAを変性した後、粒子表面はずっと親水性になり、水分子を引きつける。これらのより疎水性の幹は、ポリマー粒子の内部部分に引き込んで粒子のより疎水性コアに留まり、クロマトグラフィー分離の間に非常に極性の緩衝液の環境から遠ざかる。これによって、親水性イオン交換器をもつ表面の被覆が増大し、ゾーン拡大が二次的な疎水性相互作用しないようにできる。制御表面変性は、低温で水性溶液中、接触変性反応(catalyzed modification reaction)によって実施する。触媒は、現場で光子を生成し得る試薬または酸であるのが好ましい。
本発明の好ましい態様では、ジアルキルアミン塩酸塩を触媒として使用する。この酸溶液は非常に極性で、疎水性ポリマーを膨潤させる傾向は低い。このイオン性触媒は、非常に疎水性の内部マトリックスに拡散する代わりに、溶液中にとどまる傾向がある。低い反応温度によってポリマーの膨潤性が低下する。ジエチルアミンはポリマーマトリックスに拡散するが、低温におけるジエチルアミンとGMAとの反応は非常にゆっくりで僅かである。本発明の一態様では、前記ジアルキルアミン塩酸塩触媒は、ジエチルアミン塩酸塩である。本発明のもう一つの態様では、触媒はトリメチルアミン塩酸塩である。本発明の一態様では、反応温度は25℃である。本発明のもう一つの態様では、変性温度は30℃である。
モノリシック弱カチオン交換器の合成の従来プロセスは、膜、ビーズ及びゲルをベースとしており、モノリシックカラムの現場製造プロセスではこれらのいずれも使用することができない。弱カチオン交換器の７つの製造法を以下に記載する。これらの方法の全ての変性反応は、選択された温度でカラム内に連続して変性溶液をくみ上げることにより実施するか、試薬をカラム内部に封止し、試薬をカラム内にくみ上げた後に加熱浴またはオーブン中で加熱する。
第一の方法は、ポリ(グリシジルメタクリレート-コ-エチレングリコールジメタクリレート)(PGMAEDMA)とクロロアセテート塩との二段階変性である。文献では、ナトリウムクロロアセテートを使用して、ヒドロキシエチルメタクリレートベースの材料を変性してカルボン酸基を得ていた。モノリスの変性に上記反応を利用するために、GMA中のエポキシド環を1M H2SO4水溶液を使用する加水分解により最初に開環して、ヒドロキシル基を得る。第二段階では、クロロアセテートはポリマー中でヒドロキシル基と結合して、カルボン酸基をポリマーに付ける。この反応は、水酸化ナトリウムなどの強塩基によって触媒作用をうける。反応温度は40〜80℃であり、好ましくは50〜70℃である。反応時間は１〜24時間、好ましくは６時間未満である。本発明の一態様では、この変性反応は、モノリシックカラム内に５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を60℃で２時間くみ上げることによって実施する。カラム効率は良いがこの媒体の容量は理想的ではない。容量は、長い反応及び高い反応温度によって増加させることができる。しかしながら、ポリマー中のエステルの副反応の加水分解反応によって、分離媒体は柔軟になる。架橋剤EDMAも同様に加水分解されるので、架橋密度が低下する。
第二の方法は、試薬としてグリコール酸を使用してカルボン酸官能基を得るためのポリマー中のGMAの一段階変性である。グリコール酸は40〜90℃で１〜24時間、PGMEDMAと反応させる。この反応は、グリコール酸自体が触媒なので、自己触媒作用化反応(self catalyzed reaction)である。この反応は、トリフルオロ酢酸(TFA)などの他の強酸によって触媒作用させることができる。この反応は簡単であるが、並行する副反応により弱カチオン交換器の容量は低い。エポキシド環は副反応として加水分解により開環することができる。この反応を避けるために、非水性溶媒を使用する。好ましくは、プロトンを含む溶媒を使用する。本発明の一態様では、TFA触媒を含有する蟻酸中のグリコール酸溶液を、カラムを通して80℃で３時間くみ上げる。
第三の方法は、PGMEDMAのグリコール酸とクロロアセテートの両方による二重変性である。この二重変性反応には幾つかの好都合な点がある。第一に、これらを全て水溶液中で実施することができる。第二に、両方の反応段階により所望の生成物が得られる。第三に、第一段階の副反応により、第二段階の変性に望ましい官能基が導かれる。第四に、マトリックスの剛性を保持する幹の加水分解を回避しつつ、同一または高い容量を得るために一つの反応よりも二重変性反応の条件はより穏和である。本発明の一態様では、第一の反応は、触媒としてTFAを含有するグリコール酸水溶液中で実施し、第二の反応は、NaOH水溶液によるクロロアセテートの置換反応である。
第四の方法は、グリコール酸とクロロアセテートとのワンポット(one-pot)反応である。二重の連続的反応の代わりに、両方の試薬を反応の間に一緒に溶液に入れる。グリコール酸との反応は、酸触媒作用の代わりに塩基触媒作用による。水中のグリコール酸による塩基触媒作用の開環反応の反応性が低いため、この反応は、第三の方法の好都合な点を有するが容量は低い。
第五の方法は、アクリレートまたはメタクリレートの加水分解反応である。このエステル基の加水分解によって、カルボン酸官能基が導かれる。PGMEDMA膜またはビーズの直接加水分解は当業界で公知である。しかしながら、得られた媒体は、優れた容量も分離性ももっていなかった。本出願人の研究において、分解能及び容量のいずれもが、親水性及び疎水性のアクリレートまたはメタクリレートをハイブリッド化することによって大きく改善できることが知見される。水分子がアクリレートの親水性部分によって粒子の表面に拡散し、且つ表面をよく湿潤させることができるので、この加水分解反応はずっと効率的である。この反応は、TFAまたはNaOH水溶液などの酸及び塩基の両方によって触媒作用を受けることができる。本発明の一態様では、ポリ(メチルメタクリレート-コ-ヒドロキシルエチルメタクリレート-コ-エチレングリコールジメタクリレート)を製造し、加水分解して弱カチオン交換器を得る。本発明のもう一つの態様では、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート-コ-エチレングリコールジメタクリレート)を加水分解する。本発明の一態様では、PGMEDMAを最初に酸により、そして第二段階で塩基により加水分解する。この方法で得られた弱カチオン交換器は、幹の架橋剤の加水分解により柔軟である。
第六の方法は、アクリル酸またはメタクリル酸の直接共重合である。酸の直接共重合により、一段階で弱カチオン交換器がもたらされる。この方法は製造法を大いに簡略化する。弱イオン交換器の容量は、変性法よりも比較的高いが、それでもまだ理想的ではない。酸性モノマー対架橋性モノマーの比は２%〜30%、好ましくは５%〜15%である。酸モノマーの含有量が高くなるほど、容量が多くなるが、媒体は柔軟になる。この直接重合法は、モノリシック膜、カラム、チップ、管または当業界で任意のフォーマットの製造に適用可能である。
第七の方法は、直接共重合と制御変性との組合せである。本発明では、この組み合わせによって媒体の剛性を維持しつつ、高い容量がもたらされることが知見された。得られた媒体は、高い流速を使用して高処理量の分離に使用することができる。多量の酸を含有する媒体の柔軟性により、アクリル酸またはメタクリル酸の直接重合による優れた容量は限界に達する。酸性モノマーはランダムに重合して、これらのマトリックスの中に分散する。これらの酸は緩衝液中で酸に転換され、水性移動相で媒体は大きく膨潤する。また、炭素鎖及びエステルからなる疎水性幹は表面に暴露されて、イオン交換クロマトグラフィー分離の間に二次的な疎水性相互作用を受ける。これによってゾーン拡大及びテーリング(tailing)が生じる。この疎水性表面を、容量を維持しつつ親水性になるようにさらに変性することができる。制御変性によって、媒体の柔軟性を回避しつつ媒体の容量及び親水性を改善する。変性媒体にわたって表面の変性だけでなく粒子内部にも変性をもたらすだろう。弱アニオン交換器の製造で述べたように、粒子内部の変性によって、分離効率的開口部をブロックする大規模な膨潤または、圧力上昇及び圧縮の不利なサイクルを導くモルフォロジーの変化をもたらす。本発明の一態様において、弱カチオン交換器は、第一段階でアクリル酸、メチルメタクリレート(MMA)及びEDMAの共重合、続いて第二段階でメチルメタクリレートの加水分解によって製造する。MMAの加水分解は塩基により触媒作用を受け、NaOHとの反応後にアクリル酸の転換生成物である、非常に親水性のアクリレート塩の存在によって加速される。
直接重合と変性とを組み合わせるこの方法論は、同時に多くの官能基とマトリックスの剛性とが必要な全ての親水性ポリマー担体の製造に適用可能である。モノリシック管若しくはカラム、モノリシック膜、モノリシックキャピラリー及びチップ、または種々のフォーマットの任意の他のモノリス、並びにポリマー粒子、ゲル、膜若しくはポリマー分離媒体の任意の他のタイプの製造で適用可能である。特に、モノリシック膜の分解能及び容量は、本方法によって改善することができる。この改善は、オフラインプロセスの現場プロセスによって達成することができる。直接重合によって得られたモノリスまたはビーズは、充填したカラム若しくは膜に反応溶液をくみ上げ、または変性溶液にこれらを浸漬することによって変性することができる。ビーズは変性溶液中に懸濁させることができる。この方法論を使用することによって、本出願人は高容量の強アニオン交換器(strong anion exchanger：SAX)及び強カチオン交換器(strong cation exchanger：SCX)を開発した。
モノリシック強アニオン交換器を製造するための従来プロセスは、膜、ビーズ及びゲルをベースとしており、モノリシック強アニオン交換器カラムの製造には適用できない。モノリシック強アニオン交換器カラムの現場製造の三つの方法について、以下に記載する。
方法１は、剛性の高いポリマーと表面の制御変性との組合せである。PGMEDMAとトリメチルアミン塩酸塩による変性を使用して、膜とビーズベースの強アニオン交換器を得た。この反応をモノリシック強アニオン交換器の製造に使用すると、得られた媒体は柔軟で高速分離には使用できない。この剛性は、本発明のモノリシック弱アニオン交換器の製造のように二つの方法：高い架橋密度及び制御変性反応によって改善される。
SAX用の塩基性ポリマーは、架橋性モノマー対官能性モノマーの高い割合を使用して高密度となるように配合される。架橋剤の量は、ポリマー中の全モノマーの50%を超えて増加させる。本発明の一態様では、全モノマー中60%のEDMAを使用する。ポロゲン及びこれらの比は、比較的低圧で最適分解能を提供するように選択する。
制御変性は、PGMEDMAの接触アミノ化(catalyzed amination)によって実施する。触媒は当業界で公知の任意の塩基であってよい。本発明の一態様では、触媒としてトリメチルアミンを使用する。触媒の量は、溶液の１%〜50%、好ましくは10%〜30%である。反応温度は、10〜60℃であり、好ましくは20〜50℃である。反応時間は、10分〜24時間、好ましくは１〜４時間である。選択した接触反応によって粒子の内側の部分にとどまらず粒子の表面を変性し、これによって高い流速で媒体を使用することができる。本発明の一態様では、本反応を40℃で３時間実施する。
方法２は、四級アミンを含むモノマー、または現場で四級アミンを生成し得るそれらの中間体の直接共重合である。本発明の一態様では、四級アミンを含む官能性モノマーは、2-(アクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムメチルサルフェート(ATMS)である。このポリマーは高い架橋密度を有する。全モノマーにおける架橋性モノマーの比は、50%〜70%である。本発明の一態様では、60%EDMAを使用する。ATMSの量は２%〜20%であり、好ましくは５%〜15%である。残りのモノマーを補う第三のモノマーは、HEMAなどの親水性モノマーであるのが好ましいが、疎水性モノマーも同様に使用し得る。
方法３は、方法２と１で示された直接重合と制御表面変性との組み合わせである。方法１により得られた強アニオン交換器は剛性で且つ高い分解能を有する。しかしながら、これは理想的ではない容量という難点がある。方法２は、容量を改善するが十分ではなく、分解能が低いという難点がある。直接重合と制御表面変性とを組み合わせることによって容量を二倍にし、且つ分解能及び回収率を改善する。表面が親水性のタンパク質の穏和な(benign)基で完全に覆われているので、タンパク質の回収率は改善される。タンパク質の低い回収率の主な理由である、二次的な疎水性相互作用は最小化される。ポロゲンは、所望の流速を提供するように研究且つ選択する。本発明の好ましい一態様では、ブタンジオール、プロパノール及び水の組み合わせをポロゲンとして使用する。重合混合物及び条件は、所望の流速で最適分解能を提供するように計画する。
モノリシック強カチオン交換器を製造する従来プロセスは、膜、ビーズ及びゲルをベースとしており、モノリシック強カチオン交換器カラムの現場製造には振り替え可能ではない。モノリシック強カチオン交換器カラムの現場製造のための三つの方法について以下に記載する。
方法１は、有機溶媒に溶解性の強塩基によって触媒作用を受けたPGMEDMAのブタンスルトン(sultone)またはプロパンスルトンによる変性である。触媒としてNaOH溶液を使用するPGMEDMAのプロパンスルトンによる変性を使用して、膜またはビーズベースの強カチオン交換器を製造していた。この反応は、プロパンスルトンがNaOH水溶液に可溶性ではないので、二相反応である。この二相反応混合物は、変性を実施するのにカラム内にくみ上げることができない。この変性反応を実施するために幾つかのアプローチがとられてきた。アプローチ１は、第一段階でカリウムt-ブトキシドなどの強塩基による媒体の活性化、続くブタンスルトンによる求核性開環反応からなる二段階の変性反応である。ブタンスルトンは液体であるが、プロパンスルトンは室温で固体であるので、ブタンスルトンが好ましい。カリウムt-ブトキシドはそのナトリウム対イオンよりも溶解性が高いので、好ましい。この溶媒は、ジメチルスルホン(DMSO)などの試薬に対する良溶媒である。この変性反応は、現場変性用にカラム内にくみ上げるために均質でなければならない。アプローチ２は、活性化と変性段階の両方からなるワンポット反応である。強塩基及びブタンスルトンの両方を強溶媒に溶解する。この溶液をカラムに連続してくみ上げるか、選択した温度で数時間封止する。反応温度は80〜120℃であるのが好ましい。本発明の一態様では、90℃を使用する。本発明のもう一つの態様では、120℃を使用する。
方法２は、強カチオン交換基を含むモノマーの直接重合である。本発明の好ましい態様では、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸(AMPS)を、スルホン基を含有する官能性モノマーとして使用する。AMPSの量は２%〜20%であり、５%〜15%が好ましい。このポリマーの容量は、第一の方法と比較して大きく改善される。重合混合物は、所望の流速で最適分解能を提供するように計画する。
方法３は、直接重合と制御変性との組み合わせである。本発明の一態様では、AMPSをGMA及びEDMAと共重合する。このポリマーを、方法１に記載の如く制御変性によりさらに変性する。容量及び分解能のいずれもが、方法１及び２と比較して改善される。EDMAの量は好ましくは50%〜70%である。AMPSの量は好ましくは２%〜15%である。モノマーの残余はGMAである。本発明のもう一つの態様では、AMPSをHEMA及びEDMAと共重合する。ポロゲンは、所望の流速を提供するように研究且つ選択する。重合混合物及び条件は、高い分解能及び高速クロマトグラフィーを提供するように改善する。
現場重合法によって効率的なクロマトグラフィー分離用の大きな直径のモノリシックカラムを製造することは、発熱反応によって形成したポリマーの熱隔離効果(heat isolating effect)のため、非常に難しい問題であった。この熱伝達は、カラムハードウェアの材料に依存してモノリスの中心とモノリスの表面の間の最短距離(本書にて半径と定義)が８mm未満である限り、重合温度の非均質性を防ぐのに十分に早い。
重合熱の問題が少ない、大きな直径のモノリシックカラムを製造するために、多段階重合法を使用する。各重合段階で得られたポリマーモノリスは、重合用のモールドが優れた熱伝達物質で製造されていれば、８mm以下の半径を有する。これは最初に８mm未満の半径のカラムを製造し、第二段階の重合用に充填剤としてこれらを使用することによって達成され、ここで前記充填剤とカラム壁との間の重合溶液の半径も８mm未満であり、充填剤の間の距離は２mm未満である。本研究において、２mm未満の充填剤の間の重合溶液の厚さは、重合温度の変化に大して影響しないことが知見される。複数の細いポリマーカラムを大きな直径のカラムに充填し、第二段階の重合混合物で充填する。このカラムを通常の接続金具または重合の間に加圧できる接続金具で封止する。次いでこの大きな直径のカラムを温度制御した加熱浴またはオーブンに設置して、第二段階の重合を実施する。
この細いカラムは、加圧または非加圧重合を用いる上記プロセスにより製造する。第一段階の重合で製造した細いモノリシックカラムは、洗浄もさらに変性することもなく貯蔵するのが好ましい。第二段階用の重合混合物は、媒体のタイプに依存して、第一段階の重合の重合混合物と同一または異なる。８mm未満の半径の細いカラムは、中実ロッド(solid rod)、ディスク、８mm未満のシリンダー壁厚をもつ中空管、または膜であってもよい。上記細いカラムの形状は、丸、正方形、三角形などの当業界で公知の任意の形状であってよい。充填剤は、本明細書の充填剤材料のセクションで記載した他の粒子であってもよい。
本発明の一態様では、５mmの半径をもつ多数の細いカラムを使用する。本発明の好ましい一態様では、50mm×10mmI.D.のモノリシック・ポリマー・ロッドを充填剤として使用する。本発明の好ましいもう一つの態様では、10mm×34mmI.D.のサイズのモノリシック・ポリマー・ロッドを充填剤として使用する。本発明の好ましいもう一つの態様では、種々の内径及び外径のモノリシック・ポリマー・シリンダーを充填剤として使用する。
カラムの性能は、先に記載の本発明によって改善することができる。一つの方法は、圧力を任意に使用して、分離媒体を製造するためにポロゲン性溶媒の正しい組み合わせを選択することである。正しい極性とポリマーの溶媒和能(solventing power)をもつ溶媒を選択することによって、カラムの分離効率に影響を及ぼし得るミクロポアも小さな細孔(small pore)も持たない多孔質ポリマー担体を得ることができる。重合の間に圧力を使用すると、媒体の均一性をさらに改良し且つミクロポアの形成を回避できる。一態様において、内径320μmのキャピラリーカラムは、クロロシクロヘキサン及び1-デカノールを含む溶媒の組み合わせを用いて製造して、120psiの圧力を任意に使用して、サンプルの物質移動が少なくなる、ミクロポアも小さな細孔も含まないモノリシック多孔質ポリマー担体を生成する。もう一つの態様では、1-エチルヘキサン酸と鉱油を含む溶媒の組み合わせを使用して、圧力を任意に使用してミクロポアを含まないモノリシック多孔質材料を製造した。
X-線、UV-可視光を使用して、キャピラリーの性能を大きく改善することができる。X-線は低エネルギーで強度損失もなく材料を貫通することができる。X-線は殆ど強度損失なくキャピラリーを貫通することができる。増感剤またはシンチレーターは、効率的に溶媒によって転送されたX-線を吸収し、溶液中に均質に蛍光または燐光を放出することができる。均質な蛍光及び燐光は開始剤によって吸収されて、重合溶液中で均質に重合を開始することができる。これによって、モノリシック分離媒体及び粒子を含む多孔質ポリマー担体の多孔質構造の均質性が導かれる。これによってモノリシックキャピラリーのカラム効率が大きく改善する。X-線をエネルギー供給源として使用する低温重合により、より低い重合温度によって重合速度が遅くなる。X-線の強度及びエネルギーを微調整することによって、所望の重合速度とし、均質分離媒体を形成することができる。重合の間に正しい溶媒和能及び圧力でX-線、シンチレーター/増感剤、溶媒を使用することによって、非常に優れた性能をもたらすサンプル分子と似たサイズの、ミクロポアも小さな細孔も含まない分離媒体を形成することができる。一態様において、キャピラリーカラムは、エネルギー供給源としてX-線を使用して製造した。もう一つの態様では、マイクロチップカラムをエネルギー供給源としてX-線で製造した。
ポリマーに非常に近い屈折率をもつ溶媒を正しく選択することによって、光が、クリスチャンセン効果として知られ、且つ先に記載した光の強度の損失が少ないキャピラリー内を移動させることができる。漂白効果を持つ開始剤を使用することによって、殆ど強度の損失なく、UV-可視光はキャピラリー内を移動させることができる。光は重合溶液中で均質である。均質な光の吸収によって、重合が均一に開始され、これはクリスチャンセン効果及び漂白効果を考慮することなく、加熱またはUV-可視光により開始された重合によって促進された開始とは異なる。これによって、溶液中で均質重合が形成される。結果として、より均質な多孔質構造体が形成することができる。これによって、キャピラリーカラムがもっと優れた性能になる。上記方法と、優れた溶媒和能の溶媒、加圧重合との組み合わせによって、カラム性能に影響を与えずにミクロポアも小さな細孔も含まない均質媒体を形成することができる。一態様では、キャピラリーカラムはUV-可視光を使用して製造した。もう一つの態様では、マイクロチップカラムをUV-可視光を使用して製造した。
実施例
以下の実施例における変数の他の多くの値は、予測し得る結果と共に本記載から選択することができ、以下の非限定的な実施例は、本発明を説明するものである。
概要
通常、以下の実施例におけるそれぞれのタイプの媒体の製造は、主な三つの段階を含む。これらは、(1)ポリマーマトリックスの製造；(2)所望の官能基を含有するためのポリマーマトリックスの変性；及び(3)媒体のキャラクタリゼーションである。
最初に、主な製造段階は幾つかのサブステップを含む。これらは以下の通りである。(1a)モノマーのタイプ及び量、ポロゲン並びに開始剤を変動させることによる、重合混合物の配合；(1b)真空及びヘリウムパージによる重合混合物の脱気；(1c)キャップまたはストッパーで封止したカラムの一端をもつことが多い、モールドとしてチュービングの材料と種々の直径の空のカラムとのアセンブリ；(1d)カラムに重合混合物を充填する；(1e)重合の間圧力を加えるためにキャップまたは特別に設計した接続金具でモールドのもう一端を封止；(1f)ガラスカラムを使用する際に一端でモールド中の溶液を予熱し、油圧、空気圧または機械圧を含む種々の圧力供給源を使用して選択した圧力を適用する；(1g)選択された温度で、温度制御した加熱浴またはオーブン中にモールドを設置する；(1h)種々の時間で重合する；(1i)重合後に加熱浴からカラムを取り出し、その中に洗浄液をくみ上げるためにカラム接続金具と封止キャップまたは圧力デバイスを置き換える；(1j)有機溶媒及び／または水でカラムを洗浄する。
第二に、変性プロセスは以下の段階を含む。(2a)種々のタイプ及び量の反応体及び触媒と変性反応混合物とを配合する；(2b)カラムを通して５を超えるベッド容積の変性溶液をくみ上げ、カラムを封止するか、または連続してさらに溶液をくみ上げる；(2c)種々の温度及び時間、温度制御した加熱浴中で変性反応を実施する；(2d)有機溶媒及び水でカラムを洗浄する。
このカラムは、液体クロマトグラフィー分離、ポロシメトリー、BET表面積測定、走査電子顕微鏡、UV分光法及び目視観測を含む種々の方法によりキャラクタリゼーションする。液体クロマトグラフィーによるキャラクタリゼーションとしては、種々の速度における種々の分離モードが挙げられる。通常使用されるデバイス、プロセス及び方法は、以下の具体的な実施例に記載する。
重合溶液の脱気
重合混合物は、超音波脱ガス器を使用して、水流吸引器により発生させた真空で５分間、脱気する。その後、この溶液を最小20分間パージする。
安定化及び調整方法
変性反応後の洗浄段階の後、イオン交換器カラムを安定化及び調節手順にかけた。この強アニオン交換器のガラスカラム(100×10mmI.D.)に関する安定化及び調節手順は、以下の通りである。pH7.6における0.01mol/l Tris.HCl緩衝液の流速は、１分で０ml/分から20ml/分に線形増加させて、0.5分間保持した。圧縮液は、２分間の勾配液によって同一緩衝液中１mol/lのNaClに変化させ、0.5分間保持した。PEEKでライニングしたステンレススチールカラムの安定化及び調整手順は、20ml/分の代わりに最大流速が５ml/分であった以外には、上記と同一である。他のイオン交換カラムの手順は、許容された最大流速に依存する。
キャラクタリゼーション手順
１．液体クロマトグラフィー(LC)分離によるキャラクタリゼーション
1a．LCキャラクタリゼーション方法１：タンパク質及びペプチドの液体クロマトグラフィー分離
移動相：
移動相A（または緩衝液A）；
アニオン交換クロマトグラフィー：0.01M Tris.HCl(pH7.6)；
カチオン交換クロマトグラフィー：0.01Mリン酸ナトリウム(pH7.0)；
逆相クロマトグラフィー：水中0.15%トリフルオロ酢酸(TFA)；
移動相B（または緩衝液B）；
イオン交換クロマトグラフィー：緩衝液A中の1M NaCl；
逆相クロマトグラフィー：アセトニトリル(ACN)中の0.15%TFAクロマトグラフィー
サンプル：
アニオン交換クロマトグラフィー：
0.6mg/mlミオグロビン、１mg/mlコンアルブミン、及び１mg/mlオボアルブミン及び１mg/mlトリプシン阻害剤。
カチオン交換クロマトグラフィー：
１mg/mlコンアルブミン、１mg/mlオボアルブミン及び１mg/mlトリプシン阻害剤。
タンパク質用の逆相クロマトグラフィー：
1.5mg/mlリボヌクレアーゼA、0.5mg/mlチトクロームC、1.5mg/mlBSA、0.9mg/mlカルボニックアンヒドラーゼ、1.5mg/mlオボアルブミン。
ペプチド用の逆相クロマトグラフィー：
33？g/mlMet-エンケファリン、Let-エンケファリン、アンギオテンシンII、フィサレミン、サブスタンスP。
サンプル分離：
15ml目盛り付プラスチックサンプル管中に緩衝液８mlを充填する。タンパク質サンプルの適当量を秤量し、このサンプル管内に設置した。この管をキャップで封止し、全てのタンパク質が溶解するまで、ゆっくりと管を回転させた。サンプル管の10mlの印に到達するまで、さらに緩衝液を添加した。
以下の手順に従って、タンパク質分離によりカラムをキャラクタリゼーションした。カラムをIsco2350 Two Pump Systemに取り付けた。ポンプAは0.01mol/lのTris.HCl緩衝液(緩衝液A)を含み、ポンプBは緩衝液A中の１mol/lのNaCl(緩衝液B)を含んでいた。使用前に、移動相を20分以上ヘリウムパージして脱気した。UV検出器をタンパク質分離用に感度0.05及び波長280nmに設定した(ペプチド分離用には214nm)。サンプル注入容積は20マイクロリットルであった。4.6mmI.D.カラムに関しては、最初にカラムを20ベッド容積の緩衝液Bで洗浄し、緩衝液A15ベッド容積で３ml/分で調整した(10mmI.D.に関しては10ml/分)。分離は、4.6mmI.D.カラムに関しては流速３ml/分で及び10mmI.D.カラムに関しては流速10ml/分で、緩衝液B０〜50%の勾配液20ベッド容積で実施した。
1b.LCキャラクタリゼーション方法２：結合能力の測定
イオン交換樹脂の結合能力を前端分析(frontal analysis)で測定した。カラムを緩衝液B20ベッド容積で清浄し、緩衝液A15ベッド容積で調整した。このカラムを緩衝液A中の５mg/mlBSAまたはリゾチーム溶液(アニオン交換器及び逆相に関してはBSA、カチオン交換器に関してはリゾチーム)をカラム内に、溶離液の吸収が増加しなくなるまでくみ上げることによってサンプルタンパク質で飽和させ、続いて100%緩衝液Aで非吸着タンパク質を清浄した。カラムに結合したタンパク質を緩衝液０〜50%の勾配液20ベッド容積で溶離した。溶離したタンパク質をサンプルバイアル中に集め、タンパク質濃度を280nmにおいてUV分光器により測定した。カラムの全結合能力は、集めたタンパク質の濃度に集めた容積をかけることによって計算した。
1c.LCキャラクタリゼーション方法３：疎水性相互作用クロマトグラフィー
このカラムは、タンパク質の疎水性相互作用クロマトグラフィーによりキャラクタリゼーションした。リボヌクレアーゼ、チトクロームC、リゾチーム、ウシ血清アルブミン及びカルボニックアンヒドラーゼ(0.01M Tris.HCl緩衝溶液、pH7.0で１、0.3、0.2、１及び0.5mg/ml)を含むタンパク質の混合物を、0.01mol/lTris.HCl緩衝液(pH7.6)〜同一緩衝液の15分の勾配液で流速１ml/分で分離した。
1d.LCキャラクタリゼーション方法４：沈殿-再溶解クロマトグラフィーによるポリマーの分子量測定
沈殿/再溶解クロマトグラフィー(Precipitation/Redissolution Chromatography)を使用して、ポリマーの分子量測定に関してキャラクタリゼーション方法６を使用した。７種類のポリマー標準(Mp：12,900、20,650、34,500、50,400、96,000、214,500、982,000)を、流速2.6ml/分で、メタノール中15%〜80%THFの６分間の勾配液により分離した。ポリマー標準をメタノール中50%THFに、全濃度56mg/mlで溶解した。注入容積は20Flであった。
1e.ヌクレオチドのLC分離
Pd(A)12-18のサンプル(水中2.4mg/ml)を、流速１ml/分で緩衝液A中の緩衝液B30%〜60%(A=20%アセトニトリルであり、80%20mmol/lリン酸ナトリウム；B=A中の１mol/lNaCl)勾配液により分離した。
1f.アニオン交換器を使用するヌクレオチドのLC分離
AMP、ADP及びATP(それぞれ水中0.4、0.8、0.8mg/ml)のサンプルを、LCキャラクタリゼーション方法１で特定したように緩衝液A中の緩衝液B０〜50%の勾配液で分離した。
番号付け実施例
実施例１
重合溶液は以下のようにして製造した。20mlのサンプルバイアルに、1.2gのグリシジルメタクリレート(GMA)、0.80gのエチレンジメタクリレート(EDMA)(重合混合物１)及び0.02gの2,2=アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)を秤量し、これが均質溶液を形成するまで混合物を静かに振盪した。この溶液に2.55gのシクロヘキサノール（CHOH）及び0.45gのドデカノール(DODOH)を秤量し、均質になるまで振盪した。この重合混合物を脱気手順のごとく脱気した。
その一端が図４に示されている加圧デバイスで封止されている、空のステンレススチールカラム(4.6mm内径及び50mm長さ)に、このカラムが満杯になるまでこの溶液を充填した。図４に示されているカラムの元のキャップである、ステンレススチールキャップに含まれているPEEK-キャップを使用して、カラムのもう一端を封止した。図３のデバイスをシリンジポンプに接続した。水を媒体として使用して、120psiの圧力を発生させた。カラム内には空気はなかった。このカラムを真っ直ぐに60？Cの水浴に設置し、20時間保持した。重合後、カラムを水浴から取り出し、室温に冷却した。
圧力を開放した後、図３のデバイスをシリンジポンプから外した。図３のデバイスを開け、カラムから取り出した。白色ポリマーはカラムの外に延びていた。ポリマーの長さは、カラム及び図３のデバイスの内部の重合溶液の高さよりも約２mm短いことが判明した。ポリマーの伸張部分をカミソリの刃で取り除いた。次いでカラムを元のHPLCカラム接続金具で取り付けた。カラムをHPLCポンプに接続し、0.5ml/分で、45？Cで20分間、アセトニトリルで洗浄した。
カラムの一端の接続金具を外して、もう一端までカラム内に10ml/分でアセトニトリルをくみ上げることによって媒体をカラムから押し出した。ポリマー媒体の壁表面は平滑であった。ポリマー端部は平坦であった。
実施例１の比較形
重合溶液は以下のようにして製造した。20mlのサンプルバイアルに、1.2gのグリシジルメタクリレート(GMA)、0.80gのエチレンジメタクリレート(EDMA)(重合混合物１)及び0.02gの2,2=アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)を秤量し、これが均質溶液を形成するまで混合物を静かに振盪した。この溶液に2.55gのシクロヘキサノール（CHOH）及び0.45gのドデカノール(DODOH)を秤量し、均質になるまで振盪した。この重合混合物を上記脱気手順の如く脱気した。
その一端がカラムの元のキャップであるステンレススチール・スクリューキャップに含まれるPEEK-プラグでシールした、空のステンレススチールカラム(4.6mm内径及び50mm長さ)に、カラムが満杯になるまで上記溶液を充填した。PEEK-キャップをカラム上部に注意深く設置し、もう一つのスクリューキャップで封止した。カラム内には空気は保持すべきではない。このカラムを真っ直ぐに60？Cの水浴に設置し、20時間保持した。重合後、カラムを水浴から取り出し、室温に冷却した。
PEEK-プラグを外し、白色ポリマーがカラム内に観察された。次いでこのカラムに元のHPLCカラム接続金具を取り付けた。カラムをHPLCポンプに接続し、0.5ml/分で20分間、テトラヒドロフラン(THF)で洗浄した。
カラムの一端の接続金具を取り外し、もう一端までカラム内に10ml/分でアセトニトリル(ACN)をくみ上げることによって媒体をカラムから押し出した。ポリマー媒体の壁表面には多くの小さな不規則な傷があった。
種々のモノマーを使用して、他のカラムを製造した。ポリマーロッドの壁表面には、不規則なボイドが知見された。これらのロッドの二つと、加圧下で製造した一つのロッドの写真を撮り、図７に示す。
実施例１の代替形
官能性モノマーと架橋剤との種々の割合及び組み合わせを使用して、種々の重合混合物を使用した以外には、実施例１の手順に従った。使用した官能性モノマーとしては、グリシジルメタクリレート(GMA)、2-ヒドロエチルメタクリレート(HEMA)、メチルメタクリレート（MMA）、2-(アクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムメチルサルフェート(ATMS)、アクリル酸(AA)、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸(AMPS)、ステアリルメタクリレート(SMA)、ラウリルメタクリレート(LMA)、ブチルメタクリレート(BMA)、スチレン(ST)及び4-エチルスチレン(EST)が挙げられる。使用した架橋性モノマ(架橋剤)としては、エチレングリコールジメタクリレート(EDMA)、ジビニルベンゼン(DVB)が挙げられる。官能性モノマー、架橋性モノマー及びポロゲンの種々の割合を使用した。ポロゲンとしては、種々のアルコール類、たとえばシクロヘキサノール、ドデカノール、デカノール、1-ヘキサデカノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、メタノール、1,4-ブタンジオール及び他のもの、たとえばトルエン、N,N-ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、1,2-ジメトキシエタン、1,2-ジクロロエタン、ジメチルフタレート、2,2,4-トリメチルペンタン、1,4-ジオキサン、2-メチルオキシエタノール、1,4-ブタンジオール、m-キシレン、ジイソブチルフタレート、テトラ(エチレングリコール)ジメチルエーテル、テトラ(エチレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)（F.W.1000）、ポリ(プロピレングリコール)モノブチルエーテル（F.W.340、1000、2500）が挙げられる。使用した開始剤としては、2,2-プライム-アゾビスブチロニトリル(AIBN)及び過酸化ベンゾイルが挙げられる。
モノマー及びポロゲンの組合せのそれぞれについて、カラムを製造し、試験し、キャラクタリゼーションした。
幾つかの圧力条件下で、それぞれの重合混合物で幾つかのカラムを製造した。圧力条件としては、(1)重合の間にカラムを大気圧に開放する；(2)重合の間カラムを封止する；(3)ガスとして窒素を使用して重合混合物に直接適用したガスでカラムに圧力を適用する；(4)ゴム、プラスチック及び金属ピストンをそれぞれ重合混合物と接触させ、バネ、油圧、ガス圧のいずれかによって加圧するか、またはバネなどの機械力を使用するときに上記若しくは変性デバイスを使用してピストンを下向きに通す。
結果は、以下のようであった。(1)大気圧が存在する場合には、カラムの表面に高い割合で不連続点があった。カラム効率及び分解能には再現性が無かった。(2)カラムを封止した加圧条件に関しては、カラム表面には高い割合で不連続点があり、カラム効率及び分解能には再現性がなかった。(3)ガス圧を加えたカラムに関しては、カラムの上端表面は柔軟で不規則であったが、壁表面は平滑であった。分離クロマトグラフィーの再現性は良かった。圧力を適用しない場合よりも溶出ピークはシャープであった。(4)ピストンを使用した時には、再現性は非常に高く、上記で使用した全ての方法よりも分解能が良かった。
実施例２
以下の重合溶液：2.0ｇのGMA、2.5gの2-(アクリロイルオキシエチル)トリメチルアンモニウムメチルサルフェート(ATMS、80%)、6.0gのEDMA、7.5gの1,4-ブタンジオール、6.75gのプロパノール、0.75gの水及び0.1gのAIBNを使用して、実施例１の通りに重合溶液を製造した。
その一端を図４に示した加圧デバイスで封止した空のガラスカラム(10mm内径及び100mm長さ)に、カラムが満杯になるまでこの溶液を充填した。図４に示されたPEEKスクリューキャップに含まれるTEFLON-プラグを使用して、カラムのもう一端を封止した。図４のデバイスをシリンジポンプに接続した。カラム内に空気は無かった。このカラムを真っ直ぐに60？Cの水浴に設置し、15分間保持した。次いでこのカラムに媒体として水を使用するシリンジポンプで120psiを適用し、20時間保持した。重合後、カラムを水浴から取り出し、室温に冷却した。
圧力を開放した後、図４のデバイスをシリンジポンプから外した。図４のデバイスを開放し、カラムから注意深く取り出した。ポリマーロッドの高さは、カラム内部の重合溶液の高さよりも４mm短いことが判明した。次いでこのカラムに元のHPLCカラム接続金具を取り付けた。カラムをHPLCポンプに接続し、45？C、２ml/分で20分間、アセトニトリルで洗浄した。
カラムの一端の接続金具を取り外し、もう一端までカラム内に10ml/分でアセトニトリル(ACN)をくみ上げることによって媒体をカラムから押し出した。ポリマー媒体の壁表面は平滑であることが判明した。ポリマーの上部は平坦であった。
実施例２の代替形
圧力及び圧力の適用方法を変えて、実施例２の方法に従った。重合の間、種々の一定圧力を使用した。使用した圧力は、80psi、150psi、180psi、200psi、240psi及び300psiであった。これらのカラムの背圧は異なっていた。ポリマー構造の走査電子顕微鏡調査から、これらのポリマーの粒径も異なっていることが判明した。
重合の間、重合混合物に段階的に勾配をつけた圧力を適用した。勾配は以下のようであった：10psiから４psi/分で５分間上昇、２psi/分で10分間上昇、１psi/分で20分間上昇、0.8psi/分で30分間上昇、次いで180psiまで１時間で上昇。最終圧力180psiを重合の間、20時間保持した。
重合の初期段階で、反応物を加圧するために、15psi〜180psiに２時間で線形勾配を使用した。残りの重合の間、180psiをさらに18時間保持した。
これらの全てのカラムは、トリメチルアミン水溶液(50%容積)中の0.45g/mlのトリメチルアミン塩酸塩の５ml溶液をくみ上げることによって変性した。このカラムを封止し、水浴中、40℃で３時間加熱した。変性直後、これらのカラムを水20ベッド容積で洗浄した。これらのカラムを上記の如くベッド安定化及び調整にかけた。これらをイオン交換器に関する上記LCキャラクタリゼーション方法でキャラクタリゼーションした。これらのカラムの背圧、粒径及び分離分解能は、加圧方法で全て異なっていた。
種々の重合時間も使用した。重合時間を20時間の代わりに44時間にした以外には、実施例２の如くカラムを製造した。
たった一つの圧力供給源で10チャンネルマニホールドを使用して並行して10個のカラムを製造した。製造したカラムは、個々の製造プロセスよりも再現性が良かった。
ポリマーモルフォロジーと粒子の内部構造を走査電子顕微鏡(SEM)で調査した。これらの粒子の内部構造は、当業界で公知の他のモノリシック媒体のように多孔性ではなく、無孔性であることが知見された。
実施例３
以下の溶液：17.5gのDVB、19.8gのテトラ(エチレングリコール)、10.2gのテトラ(エチレングリコール)ジメチルエーテル、及び0.18gのAIBNで実施例１及び２の如く二つのカラムを製造した。アセトニトリルで洗浄後、カラムを流速16ml/分で20ベッド容積の水でさらに洗浄した。手動で両端に配置したピストンをカラム内に圧縮した。このカラムを、0.15%トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルで洗浄し、LCキャラクタリゼーション方法１a及び１ｂによりキャラクタリゼーションした。両方のタンパク質及びペプチド分離に関するこれらのカラムの分解能は、比較例で製造したカラムより大きく改善された。容量は５倍以上高かった。これらのカラムの背圧は低かった。0.15%TFAを含有する100%の水で出発する移動相勾配液で、高い分解能を達成した。これらのカラムではウォール効果は見られなかった。水性相におけるウォール効果のため、比較例のカラムでは、タンパク質とペプチドがカラムから前溶出(pre-elute)した。
実施例３の比較型
以下の試薬：３mlスチレン、２mlジビニルベンゼン、7.5mlドデカノール及び0.5gAIBNを使用して、実施例１の比較例の如く重合溶液を製造した。このカラムを、LCキャラクタリゼーション1a及び１bに記載の逆相タンパク質及びペプチド分離法によりキャラクタリゼーションした。
実施例３の代替形
ポロゲンの種々の組み合わせ、種々の炭素鎖長を含む種々のモノマー、全モノマー含有量の種々の量、種々の開始剤及び種々の収縮溶媒(shrinkage solvent)を使用して、実施例３に従った。
使用したポロゲンとしては、C１〜C12を含むアルコール類、N,N-ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、1,2-ジメトキシエタン、1,2-ジクロロエタン、ジメチルフタレート、2,2,4-トリメチルペンタン、1,4-ジオキサン、2-メチルオキシエタノール、1,4-ブタンジオール、トルエン、m-キシレン、ジイソブチルフタレート、テトラ(エチレングリコール)ジメチルエーテル、テトラ(エチレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)(F.W.1000)、ポリ(プロピレングリコール)モノブチルエーテル(F.W.340、1000、2500)を含んでいた。これらの溶媒の幾つかの組み合わせによって、高い分解能のカラムももたらされる。アルコール類及びこれらの組み合わせは、高い分解能を提供しつつ、低い背圧で移動相を流すための大きなチャネルを提供することができる。分解能は、同様に他の優れた溶媒を用いて微調整することができる。
使用したモノマーは、上記ポロゲンの組合せと一緒にブチルメタクリレート及びステアリルメタクリレートを含んでいた。一つのカラムは、以下の重合溶液：7gSMA、10.5gDVB、19.5gエタノール、13.0gブタノール及び0.18gAIBNを使用して製造した。もう一つのカラムは、以下の重合溶液：７ｇラウリルメタクリレート(LMA)、1gHEMA、１２ｇEDMA、30gドデカノール、及び0.2gAIBNを使用して製造した。もう一つのカラムは、以下の重合溶液：７gブチルメタクリレート(BMA)、１gHEMA、12gEDMA、３g水、16.5gプロパノール、10.5g1,4-ブタンジオール及び0.2gAIBNを使用して製造した。種々の炭素鎖長を含むこれらのモノマーの組み合わせによって、種々の疎水性度及び相互作用を提供するので、種々の疎水性度及び特性をもつサンプルに関して高い分解能及び回収率を提供する。たとえば、ブチルメタクリレートベースの媒体は、より疎水性のタンパク質の分離で使用し、ステアリルメタクリレートベースの媒体は、より親水性のタンパク質、ペプチドまたはオリゴヌクレオチド分離で使用する。
モノマー対架橋剤の種々の割合を使用して、選択性及び分解能も調整した。以下の重合溶液：1.05gSMA、0.7gDVB、3.25gエタノール及び0.018gAIBNを使用して一つのカラムを製造した。
種々の開始剤も使用した。以下の重合溶液：10mlジビニルベンゼン(80%純度)、30mlドデカノール、10mlスチレン及び0.20g過酸化ベンゾイルを使用してカラムを製造した。
種々の重合時間も使用した。重合時間が20時間の代わりに44時間であった以外には、実施例３のごとくカラムを製造した。
種々の極性溶媒を使用して、圧縮前にポリマーを収縮させた。カラムを実施例３の如く製造し、水洗浄後、１M NaClの20ベッド容積で洗浄した。塩洗浄の後、手動配置したピストンをカラム内に圧縮した。出発移動相として0.1M NaH2PO4(pH4.0)を使用すると、カラムはウォール効果を示さなかった。
これらの実験は、種々の洗浄溶液及び、プラグを重合した後に水溶液の存在下で任意に圧力を使用して種々の触媒、並びに種々の圧力を使用して繰り返した。それぞれの場合において、圧力を適用しないと、外壁に不連続点があり、キャラクタリゼーションの際には、再現性がなく、クロマトグラムのピークは、水溶液で洗浄することによって膨潤させた後に圧力を適用しなかった場合にはそれほどはっきりしなかった。
60psi(１平方インチ当たりのポンド)及び120psi及び600psiの低圧と高圧の両方の多くの圧力でテストを実施したが、結果は良かった。必要な圧力の量は、カラムの直径及び特定の重合混合物で変動すると考えられるが、全ての場合で非常に低い圧力で十分な結果を得ることができた。圧力の上限は、カラム壁及び接続金具の強度である。
圧力の量は孔径にも影響を与えるので、圧力は、所望の孔径、分布及びカラムの再現性と一緒に選択すべきである。
実施例４
以下の溶液：９ｇのグリシジルメタクリレート、９ｇのエチレンジメタクリレート、0.18g、21.6gのシクロヘキサノール及び6.3gのドデカノールを使用して実施例２のごとくカラムを製造した。ポリマーの長さは、カラム内部の重合溶液の高さよりも約７mm短いことが知見された。次いでカラムに元のカラムの接続金具を取り付けた。このカラムをHPLCポンプに接続し、45？C、４ml/分で20分間、アセトニトリルで洗浄した。このカラムを以下のようにさらに変性した。
570mgトリメチルアミン塩酸塩、24mlジメチルアミン及び６ml水を含む溶液をこれらのカラムに、２ml/分の流速で18分間くみ上げた。次いでこれらのカラムを30？Cの水浴に３時間設置した。それぞれのカラムを100ml水で洗浄した。さらにカラムを４ml/分で30分間、0.01mol/lTris.HCl緩衝液pH7.6で洗浄した。このカラムを安定化及び調整方法により安定化且つ調整した。洗浄後、元のカラム接続金具由来のピストンを完全に圧縮した。カラムの背圧は、この緩衝液中、10ml/分で約360psiであった。このカラムを上記LCキャラクタリゼーション方法によりキャラクタリゼーションした。
実施例５
1gスチレン、1gジビニルベンゼン(DVB)(80%ジビニルベンゼンと20%エチルスチレンEST)、３gドデカノール及び0.02gAIBNを混合することによって、重合溶液を製造した。
この溶液を20分間、N2パージすることによって脱気し、ステンレスチールカラム(50×4.6mmI.D.)に充填し、その一端はカラム接続金具由来のスクリューキャップ内側で、PEEKプラグで封止した。カラムのもう一端は、もう一つのPEEKプラグで封止した。これを70℃の水浴中で、24時間重合した。このカラムに元のカラム接続金具を取り付け、流速１ml/分で、THFで10分間洗浄してから、タンパク質の分離に使用した。このカラムの背圧は、流速10ml/分で約230psiであった。アセトニトリル10ml/分におけるポリマーの圧縮は約2.9mmであった。このカラムを、LCキャラクタリゼーション方法１a及び１ｂのように、逆相タンパク質及びペプチド分離に使用した。
実施例５の代替形
高い総モノマー含有量で実施例５の通りにもう一つのカラムを製造した。重合溶液は、1.2gスチレン、1.2gジビニルベンゼン及び2.6gドデカノール及び0.024gAIBNを含んでいた。このカラムの背圧はアセトニトリル10ml/分で220psiであり、ポリマーの圧縮はたったの0.9mmであった。総モノマー含有量が高いと、カラムをそれほど圧縮可能にしない。
22mm、15mm、10mm、８mm、2.1mm、１mm、542?m、及び320?mを含む種々の直径のカラムを実施例の如く製造した。10mm×2.1mmI.D.のサイズの短いカラムも製造した。これらのカラムは、LCキャラクタリゼーション方法によるが、カラムの直径に対応した同一流速で、逆相タンパク質分離でキャラクタリゼーションした。現場重合法は、種々の直径のカラムに適用可能である。充填段階がないので、小さな直径のカラムまたはミクロ流体(microfluid)チャネルに特に有用である。
実施例６
実施例５に従ってもう一つのカラムを製造した。
このカラムは、ピストンを含む元のカラム接続金具を取り付け、１ml/分の流束で10分間、アセトニトリル洗浄した。このカラムをさらに水で10分間洗浄した。両端のピストンをカラム内に圧縮した。このカラムをLCキャラクタリゼーション方法によりキャラクタリゼーションした。圧縮後にピストンにより水中へのポリマーの圧縮及びこのピストンによる保持によって、水中のポリマーの収縮により生じるウォール効果を防止した。
実施例６の代替形
以下の溶液：1.8gジビニルベンゼン、0.2gスチレン、2.3375gドデカノール、0.6625gトルエン、0.02gAIBN及び3.0gドデカノールを使用して実施例５の如くもう一つのカラムを製造した。全ての試薬はアスピレーターを使用して５分間脱気し、その後ヘリウムを20分間パージしてから秤量した。重合溶液をステンレススチールカラム(50×4.6mm.I.D.)に充填し、その一端をスクリューキャップ内に含まれているPEEKプラグで封止した。カラムのもう一端はもう一つのPEEKプラグで封止した。これを66℃の水浴中、24時間重合した。このカラムにピストンを含む元のカラム接続金具を取り付け、流速１ml/分で10分間、アセトニトリルで洗浄した。このカラムをさらに水で10分間洗浄した。両端のピストンをカラム内に圧縮した。このカラムをLCキャラクタリゼーション方法によりキャラクタリゼーションした。架橋剤の含有量が高いと、圧縮性が改善した。この型のカラムは、実施例６に従って製造した幾つかの他のカラムよりも３倍以上の容量を有する。
もう一つのカラムは、以下の重合溶液：10mlジビニルベンゼン(80%純度)、10mlスチレン及び0.20g過酸化ベンゾイルで製造した。
この重合溶液をN2で20分間パージした。これをステンレススチールカラム(50×4.6mm.I.D.)に充填し、その一端をスクリューキャップ内に含まれているPEEKプラグで封止した。カラムのもう一端はもう一つのPEEKプラグで封止した。これを70？Cの水浴中、24時間重合した。このカラムに元のカラム接続金具を取り付け、流速１ml/分で10分間、テトラヒドロフランで洗浄した。これをLCキャラクタリゼーション方法に記載の如く逆相タンパク質及びペプチド分離によりキャラクタリゼーションした。種々の開始剤、たとえばベンゾイルも、モノリシック媒体の製造で効果的である。
小さなサイズ(50×2.0mmI.D.)のステンレススチールカラム及びPEEKカラム(50×4.6mmI.D.)を製造し、上記実施例のようにキャラクタリゼーションにかけた。
実施例７
以下の溶液：ジビニルベンゼン、0.2gヒドロキシエチルメタクリレート及び0.02gAIBNを使用して実施例６のようにカラムを製造した。これを70？Cの水浴中、24時間重合した。このカラムを、ピストンを含む元のカラム接続金具で取り付けた。これを１ml/分の流速で10分間、アセトニトリルで洗浄し、さらに水、次いで0.01mol/lTris.HCl緩衝液(pH7.6)中の0.5mol/lNaClで洗浄した。このカラムをLCキャラクタリゼーション方法の如く、逆相タンパク質分離によりキャラクタリゼーションした。
実施例７の代替形
ヒドロキシエチルメタクリレート及びジビニルベンゼンの重量を0.4gと1.6gに変更した以外には、上記手順に従ってカラムを製造し、キャラクタリゼーションした。
ヒドロキシエチルメタクリレート及びジビニルベンゼンの重量を１g及び1gに変更した以外には、上記手順に従ってもう一つのカラムを製造し、キャラクタリゼーションした。
以下の重合溶液：1.8gジビニルベンゼン、0.16gスチレン、0.04gヒドロキシエチルメタクリレート、及び0.02gAIBNで、実施例７の如く、もう一つのカラムを製造した。重合後に、このカラムにピストンを含む元のカラム接続金具を取り付けた。これを流速１ml/分で10分間、アセトニトリル洗浄し、さらに水、次いで0.01mol/lTris.HCl緩衝液(pH7.6)中の0.5mol/lNaClで洗浄した。このカラムをピストンで圧縮し、LCキャラクタリゼーション方法のようにタンパク質及びペプチドの逆相分離によりキャラクタリゼーションした。
実施例８
空のシリンジバレル(70×12mmi.d.、Redisepバレル、Combiflash chromatography、Isco,Inc.4700 Superior Street，Lincoln,NE68504)を一端で封止し、N2で20分間脱気した後、以下の重合溶液：1.6gヒドロキシエチルメタクリレート、6.4gジビニルベンゼン、89mgAIBN、12gドデカノールで充填した。バレルのチップを塞いだニードルで封止した。このバレルを70？Cの水浴中、24時間加熱した。これをHPLCカラムに接続し、流速１ml/分、THFで30分間洗浄した。次いで、これをフェノール性化合物の順相及び逆相分離の両方に関して使用した。
実施例９
以下のようにして重合溶液を製造した。１ｇのヒドロキシエチルメタクリレート、１ｇのエチレンジメタクリレート及び0.02gのAIBNを20mlのサンプルバイアルに秤量し、均質溶液を形成するまで、静かに振盪した。１ｇのシクロヘキサノールと２ｇのドデカノールをこの溶液に秤量し、均質になるまで振盪した。全ての試薬は、５分間アスピレーターを使用する真空によって脱気し、ヘリウムで20分間パージしてから秤量した。
その一端が図４のデバイスによって封止されている空のステンレススチールカラム(4.6mmI.D.及び50mm長さ)を、カラムがいっぱいになるまでこの溶液で充填した。カラムの元のキャップである、ステンレススチール・スクリュー・キャップに含まれるPEEK-プラグを使用して、カラムのもう一端を封止した。図４のデバイスをシリンジポンプに接続した。水を媒体として使用して、120psiの圧力を発生させた。カラム内に空気を保持すべきではない。このカラムを60？Cの水浴に真っ直ぐに設置し、20時間保持した。重合後、カラムを水浴から取り出し、室温に冷却した。このカラムをHPLCポンプに接続し、乾燥THF(モレキュラーシーブにより乾燥)で0.5ml/分で20分間洗浄した。このカラムは、薬剤の順相分離に使用した。
実施例９の代替形
以下の重合溶液：0.5gGMA、0.5gHEMA、１ｇEDMA、1.8gシクロヘキサノール、1.2gドデカノール、0.02gAIBNを使用して、実施例９の如くカラムを製造した。
このカラムを流速0.5ml/分で、20分でTHF洗浄した後、水洗した。水中の1.0ml/l硫酸10mlをカラムにくみ上げた。このカラムをカラムプラグで封止し、80？Cの水浴中に３時間設置した。変性反応後、これらを20mlの水で洗浄し、さらに乾燥THFで洗浄してから、順相分離でキャラクタリゼーションした。
以下の重合溶液：１ｇグリシジルメタクリレート、１ｇエチレンジメタクリレート、2.4gシクロヘキサノール、0.6gドデカノール、0.02gAIBNを使用して、もう一つのカラムを製造した。
流速0.5ml/分で20分間、THF洗浄した後、カラムを水洗した。水中1.0mol/lの硫酸10mlをカラム内にくみ上げた。このカラムをカラムプラグでシールし、80？Cの水浴中に３時間設置した。変性反応後にこれらを20mlの水で洗浄し、乾燥THFでさらに洗浄してから、順相分離でキャラクタリゼーションした。
実施例１０
以下の重合溶液：0.7gラウリルメタクリレート(LMA)、0.1gHEMA、0.2gEDMA、３gドデカノール及び0.02gAIBNを使用して、実施例３の如くステンレススチールカラム(50×4.6mmI.D.)を製造した。
実施例１０の代替形
以下の重合溶液：0.8gラウリルメタクリレート(LMA)、1.2gEDMA、３gドデカノール及び0.02gAIBNを使用してカラムを製造した。比SMA/DVB=10/90にするために、以下の重合溶液：0.175gステアリルメタクリレート(SMA)、1.575gDVB(80%純度)、3.25g1-ヘキサデカノール及び0.018mgAIBNを使用してもう一つのカラムを製造した。40/60のSMA/DVB比を提供するために、以下の重合溶液：0.7gSMA、1.05gDVB、3.25gオクタノール及び0.018gAIBNを使用して、もう一つのカラムを製造した。
60/40のSMA/DVB比を提供するために、1.05gSMA、0.7gDVB、3.25gエタノール及び0.018gAIBNを含有する重合溶液を使用して、もう一つのカラムを製造した。
40/60のSMA/DVB比を提供するために、0.7SMA、1.05gDVB、1.95gエタノール、1.30gブタノール及び0.018gAIBNを含有する重合溶液を使用して、もう一つのカラムを製造した。
テトラデカノール、デカノール、オクタノール、ヘキサノール、ブタノール、プロパノール、エタノール及びメタノール並びにその組み合わせをポロゲン性溶媒として他のカラムを製造した。
40/60のSMA/DVB比を提供するために、以下の重合溶液：0.7SMA、1.05gDVB、2.925gエタノール、0.33gメタノール、0.33gイソプロパノール及び0.018gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
40/60のSMA/DVB比を提供するために、以下の重合溶液：0.7SMA、1.05gDVB、2.6gエタノール、0.33gメタノール、0.33gプロパノール、0.33gブタノール及び0.018gAIBNを使用して、上記のごときもう一つのカラムを製造した。
40/60のSMA/DVB比を提供するために、以下の重合溶液：0.7SMA、1.05gDVB、2.762gエタノール、0.33gメタノール、0.33gプロパノール、0.33gブタノール、0.33gヘキサノール及び0.018gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
40/60のSMA/DVB比を提供するために、以下の重合溶液：0.7SMA、1.05gDVB、2.435gエタノール、0.33gメタノール、0.33gプロパノール、0.33gブタノール、0.33gヘキサノール、0.33gオクタノール及び0.018gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
以下の重合溶液：1.05gDVB、3.08gエタノール、0.0.16gエチルエステル及び0.018gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。このカラムを実施例１０の如く、ペプチド分離に使用して、40/60SMA/DVB比を提供した。
以下の重合溶液：1.75gDVB、3.25gドデカノール及び0.018gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。このカラムを実施例１０の第一の型のごとくペプチド分離用に使用した。C1〜C12を含有するアルコールの一連のカラムを上記の如く製造し、ペプチド分離に関してキャラクタリゼーションした。
ドデカノールの代わりに以下のポロゲン類：イソプロパノール、N,N-ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、1,2-ジメトキシエタン、1,2-ジクロロエタン、ジメチルフタレート、2,2,4-トリメチルペンタン、1,4-ジオキサン、2-メチルオキシエタノール、1,4-ブタンジオール、トルエン、m-キシレン、ジイソブチルフタレート、テトラ(エチレングリコール)ジメチルエーテル、テトラ(エチレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)(F.W.1000)、ポリ(プロピレングリコール)モノブチルエーテル(F.W.340、1000、2500)を使用して、上記の如く一連のカラムを製造した。
以下の重合溶液：1.75gDVB、2.925gイソプロパノール、0.325g1,4-ブタンジオール及び0.018gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
以下の重合溶液：1.75gDVB、2.275gイソプロパノール、0.975g2-メチルオキシエタノール及び0.018gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
以下の重合溶液：1.75gDVB、2.60gイソプロパノール、0.65ジメチルフタレート及び0.018gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
以下の重合溶液：1.75gDVB、2.7gテトラエチレングリコール、0.3gジエチレングリコール及び0.018gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
以下の重合溶液：1.75gDVB、2.7gテトラ(エチレングリコール)、0.3gグリセロール及び0.018gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
以下の重合溶液：1.75gDVB、1.98gテトラ(エチレングリコール)、1.02gテトラ(エチレングリコール)ジメチルエーテル及び0.018gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
以下の重合溶液：1.75gDVB、1.98gテトラ(エチレングリコール)、1.02gテトラ(エチレングリコール)ジメチルエーテル、及び0.018gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
実施例１１
1gメチルメタクリレート(MMA)、1gEDMA、1.8gシクロヘキサノール、1.2gドデカノール及び0.02gAIBNを含有する以下の重合溶液で、実施例１の如く、カラム(50×47.6mmI.D.、ステンレススチール、50mm長さ及び4.6mm内径)を製造した。これをHPLCポンプに接続し、THF及び水の順で、0.5ml/分で20分間洗浄した。
このカラムを以下のようにして加水分解にかけた。６mol/lNaOHの２mlを流速0.5ml/分でカラム内にくみ上げた。このカラムを二つのカラムプラグにより封止し、80？Cの水浴中に１時間設置した。これを流速0.5ml/分で、水20mlで洗浄し、LCキャラクタリゼーション方法に記載のタンパク質分離及び結合能力測定によりキャラクタリゼーションした。
実施例１１の代替形
以下の重合溶液：0.1gアクリル酸(AA)、0.9gメチルメタクリレート(MMA)、１ｇEDMA、３gドデカノール及び0.02gAIBNを使用して実施例１１の如くカラムを製造した。カラムの容量は、加水分解の前後で測定した。加水分解前の容量は、カラム１ml容積当たり約10mgリゾチームであった。加水分解後にはこれは約30mgであった。
以下の重合溶液：0.2gAA、0.8gMMA、１ｇEDMA、３gドデカノール及び0.02gAIBNを使用して、実施例１１の如くもう一つのカラムを製造した。カラムの容量は、キャラクタリゼーション方法１１の如く測定した。加水分解前の容量は、カラム１ml容積当たり約27mgリゾチームであった。加水分解後には、これは約50mgであった。
以下の重合溶液：0.3gAA、0.7gMMA、1gEDMA、３gドデカノール及び0.02gAIBNを使用して、実施例１１の如くもう一つのカラムを製造した。カラムの容量は、加水分解の前後で測定した。加水分解前の容量は、カラム１ml容積当たり約43mgリゾチームであった。加水分解後には、容量は60mgを超えていた。
以下の重合溶液：0.4gAA、0.6gMMA、１ｇEDMA、３gドデカノール及び0.02gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
以下の重合溶液：0.1gAA、0.9gtert-ブチルアクリレート、1gEDMA、３gドデカノール及び0.02gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
以下の重合溶液：0.3gAA、3gMMA、1.4gEDMA、３gドデカノール及び0.02gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
以下の重合溶液：0.2gAA、0.7gMMA、0.1gHEMA、１ｇEDMA、2.85gドデカノール、0.15gシクロヘキサノール及び0.02gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。以下の重合溶液：0.4gAA、1.6gDVB、３gドデカノール及び0.02gAIBNを使用して上記の如くもう一つのカラムを製造した。
以下の重合溶液：１gGMA、１ｇEDMA、2.4gシクロヘキサノール、0.6gドデカノール、0.02gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。このカラムを、実施例１１の如く塩基触媒化加水分解反応にかける前に、実施例９の代替形の如く、酸触媒化開環反応にかけた。
以下の重合溶液：0.5gGMA、0.5gHEMA、１ｇEDMA、1.8gシクロヘキサノール、1.2gドデカノール、0.02gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。
以下の重合溶液：0.2gAA、0.6gMMA、0.2gGMA、1gEDMA、３gドデカノール及び0.02gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。このカラムを上記のごとき塩基触媒化加水分解にかけるまえに、酸触媒化開環反応にかけた。これを以下の溶液：５MNaOH中の0.25Mナトリウムクロロアセテートで、60℃で６時間加水分解した。
以下の重合溶液：0.2gAA、0.5gMMA、0.1gGMA、1.2gEDMA、2.55gドデカノール、0.45gシクロヘキサノール及び0.02gAIBNを使用して、上記の如くもう一つのカラムを製造した。これを５MNaOH中の0.25Mナトリウムクロロアセテートで、60？Cで６時間加水分解した。
これら全てのカラムは、ベッド安定化及び圧縮方法にかけ、次いで上記のLCキャラクタリゼーション方法のように、タンパク質分離及び結合能力測定でキャラクタリゼーションした。
実施例１２
以下の重合溶液：3gGMA、３gEDMA、6.9gシクロヘキサノール、2.1gドデカノール及び0.06gAIBNを使用して、カラム(PEEKライニング・ステンレス・スチール、50×4.6mmI.D.)を実施例１の如く製造した。
このカラムを酸性条件下で、開環反応で最初に変性した。水中0.5M硫酸溶液５ベッド容積をこのカラム内にくみ上げた。カラムをシールし、50℃の水浴中、４時間加熱した。変性後、これを水20ベッド容積で洗浄した。
このカラムをさらにエーテル化反応で変性した。20gナトリウムクロロアセテート、20gNaOH及び64ml水を含有する溶液５ベッド容積をこのカラム内にくみ上げた。このカラムをカラムプラグで封止し、60℃の水浴中、2.5時間加熱した。これを安定化及び調整方法の如く水で洗浄し、安定化及び調整した。このカラムをLCキャラクタリゼーション方法の如くキャラクタリゼーションした。
実施例１２の代替形
種々の変性方法で実施例１２に従った。
実施例１２で製造したカラムを、以下の溶液：6mol/lグリコール酸、及び水中0.5MTFIを使用して３時間、開環反応によって変性させた。
もう一つのカラムを、上記開環反応と、5MNaOH溶液中、60℃で2.5時間の加水分解反応により変性させた。
もう一つのカラムは、最初に、40gグリコール酸、60mlの0.5Mトリフルオロ酢酸(TFA)を含有する溶液で２時間の開環反応により変性させた。これを20gClCH2COONa及び60mlの5MNaOHを含有する溶液で３時間さらに変性させた。
実施例１３
以下の溶液：12gAA、30gMMA、6gGMA、72gEDMA、27gシクロヘキサノール、153gドデカノール及び1.2gAIBNで実施例２の如く、30個のカラムを製造した。これらのカラムは、重合の間に120psi圧力を得るために、一つのシリンジポンプに接続させる三つのマニホールドを使用して同時に並行合成により製造した。重合後、ポリマーを以下の利用のために、シリンジピストン(約９mmi.d.)によりカラム外へ押し出した。
上記由来の一つのポリマーロッドをおよそ約８mmの直径より小さくなるように調整した。これを１cm厚さのディスクに切断した。これらのディスクをもう一つのカラムを製造するために第二段階の重合用の充填剤として使用した。1.8ml溶液をガラスカラム(100×10mmi.d.)に充填し、その一端は図３に示された加圧デバイスで封止した。６個のポリマーディスクを一つずつカラム内に充填した。これら全てのディスクは溶液で覆われていなければならない。テフロンストッパーを使用して、カラムのもう一端を封止した。この加圧デバイスはシリンジポンプに接続しており、これは一定の圧力モードで重合溶液に120psi圧力を与えるために使用した。このカラムを60℃の水浴中、20時間加熱した。重合後、カラムを水浴から取り出した。圧力を開放した後、加圧デバイスをシリンジポンプから外した。カラムがまだ温かいうちに、圧力デバイスを開放してカラムからゆっくりと取り出した。このカラムを流速１ml/分で20ベッド容積のアセトニトリル次いで水の順で洗浄した。これを安定化及び調整方法の如く安定化且つ調整した。このカラムは、5MNaOH中0.25mol/lナトリウムクロロアセテートで60℃で６時間変性した。これをLCキャラクタリゼーション方法でキャラクタリゼーションした。
実施例１３の代替形
もう一つのカラム(100mm×35mmI.D.、ガラス)を、充填剤としてポリマーロッドを使用して二段階重合法により製造した。このカラムを一端でTEFLONプラグでシールした。カラムのもう一端はN2タンクに接続した。120psiの圧力下、60℃で20時間重合を実施した。
実施例１４
以下の溶液：８gアクリル酸、20gメチルメタクリレート、４gグリシジルメタクリレート、48gエチレングリコールジメタクリレート、102gドデカノール、18gシクロヘキサノール及び0.8gAIBNを使用して、８つの短いポリマーロッド(10mm×34mmI.D.)を製造した。このポリマーロッドは120psiのN2圧力下で製造した。このロッドを、実施例１２の如く二段階重合反応を使用して大きな直径の長いカラムの製造用の充填剤として使用した。ガラスカラム(100mm×35mmI.D.)を短いカラムで充填し、上記と同一重合を実施した。カラムの一端をTEFLONプラグで封止し、もう一端をN2タンクに接続した。重合は、120psi圧力下、60℃で20時間実施した。このカラムを20ベッド容積のアセトニトリル及び水で洗浄した。以下の：5MNaOH中の0.25Mナトリウムクロロアセテートで、60？Cで６時間の加水分解反応にかけた。このカラムを上記のLCキャラクタリゼーション方法の如くキャラクタリゼーションした。
実施例１５
以下の溶液：4gGMA、４ｇEDMA、2.8gドデカノール、9.2gシクロヘキサノール及び0.08gAIBNを使用して、実施例１の如く、カラム(PEEKライニング・ステンレススチール、50mm×4.6mmI.D.)を製造した。
このカラムを最初に１MH2SO4溶液により、40℃で３時間加水分解した。加水分解後、DMSO中の５%ナトリウムt-ブトキシド溶液５ベッド容積をカラム内にくみ上げて活性化し、次いで水浴中、90℃で１時間加熱した。次いで、この活性化溶液20%と、ブタンスルトン80%を含む溶液で、80℃で20時間変性した。
実施例１５の代替形
ブタンスルトンの代わりにプロパンスルトンを使用した以外には、実施例１５の如くカラムを製造した。
変性及び活性化温度が油浴中で、90℃の代わりに120℃であった以外には、実施例１５の如くもう一つのカラムを製造した。
以下の溶液：４gHEMA、４gEDMA、9.4gドデカノール、2.6シクロヘキサノール及び0.08ｇAIBNを使用して、実施例１５の如くもう一つのカラムを製造した。これを実施例１５の如く変性した。
以下の溶液：0.55gGMA、1.2gEDMA、0.25g2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸(AMPS)、0.48gNaOH、0.5g水、1.86gプロパノール、0.64gブタンジオール及び0.02gAIBNを使用して、実施例１の如くもう一つのカラムを製造した。
上記の如くAMPSの直接共重合によりもう一つのカラムを製造したが、実施例１５に記載の変性方法でさらに変性させた。
これらの全てのカラムは、LCキャラクタリゼーション方法に記載の強カチオン交換タンパク質分離及び結合能力測定に従ってキャラクタリゼーションした。
実施例１６
以下の重合溶液：45mlテトラメトキシシラン、0.01mol/lの酢酸水溶液100ml、９g尿素及び11.5gポリ(エチレンオキシド)(MW10000)を使用して、実施例１の如くカラムを製造した。この溶液は、氷浴中でこの混合物を30分間撹拌することによって製造した。重合は、600psi圧力下のカラム中、40℃で24時間実施した。次いでカラムを流速0.5ml/分で20mlの水で洗浄し、次いで0.01mol/l水酸化アンモニウム水溶液５mlをくみ上げた。このカラムを封止し、120℃で３時間保持し、続いてエタノール洗浄した。
実施例１７
メチルエーテルヒドロキノンまたはtert-ブチルカテコールなどの阻害剤は、蒸留または順相クロマトグラフィーにより使用前にモノマーから除去した。
以下の重合溶液：240mg p-ターフェニル、800mgAIBN、16gスチレン及び16gジビニルベンゼン(80%)、26.4g鉱油、並びに21.6g2-エチルヘキサン酸を使用して、実施例１の如く、重合溶液を製造した。
その一端を図４に示した加圧デバイスで封止した、空のガラスカラム(10mm内径及び100mm長さ)に、カラムがいっぱいになるまでこの溶液を充填した。図４に示されたPEEKスクリューキャップに含まれるTEFLONプラグを使用してカラムのもう一端を封止した。重合物を600R/時間の容量のX-線に、72時間、X-線管電圧111kVで暴露させた。得られたカラムを70℃でさらに２時間加熱した。このカラムをヘキサン、続いてヘキサン/アセトン(50/50)、アセトン、アセトニトリルで、それぞれ20ベッド容積で洗浄した。
圧力を開放した後、図４のデバイスをシリンジポンプから外した。図４のデバイスを開け、注意深くカラムから取り出した。ポリマーロッドの高さは、カラム内部の重合溶液の高さより4mm短かった。次いでこのカラムを元のHPLCカラム接続金具に取り付けた。このカラムをHPLCポンプに接続し、45℃、２ml/分で20分間、アセトニトリル洗浄した。
製造したカラムを水20ベッド容積でさらに洗浄し、次いでボイド容積を除去するために、ピストンで圧縮した。次いでカラムを１aで記載したLCキャラクタリゼーション法を使用してキャラクタリゼーションした。このクロマトグラフを図９に示す。
実施例１７の代替形
以下の混合物：30gスチレン、30gジビニルベンゼン、38.05g鉱油及び22.18g2-エチルヘキサン酸、0.518gp-ターフェニル及び1.31gAIBNを使用して、ガラスカラム(35mm内径×100mm長さ)に実施例１７の如くもう一つのカラムを製造した。このカラムを20ベッド容積のアセトニトリル次いで水でそれぞれ洗浄した。これを、LCキャラクタリゼーション法1aを使用してキャラクタリゼーションした。分離を図９に示す。
もう一つのカラム実施例１７の如く製造した。その一端から接続金具を外し、媒体を、もう一端へカラム内に10ml/分でアセトニトリルをくみ上げることによってカラムから押し出した。分離媒体を、50℃で24時間、真空乾燥した後、SEM及び水銀ポロシメーターを使用するポロシメトリー研究にかけた。
もっと大きな直径のガラスカラム(35mmi.d.×100mm長さ)を使用して、実施例１７の如くもう一つのカラムを製造した。このカラムを、図４のデバイスの代わりにTEFLONスクリューキャップに含まれる二つのTEFLONプラグで封止した。ポリマーをカラムから押し出して、上記実施例の如く乾燥した。このポリマーをSEM及びポロシメトリー研究にかけた。
大きな直径のカラム(35mm×100mm)を使用するが、以下の重合溶液：240mgp-ターフェニル、800mgAIBN、3.2139ｇスチレン、28.8088gジビニルベンゼン(80%純度)、37.4060g1-ドデカノール、13.25gトルエンを使用して、上記実施例の如くもう一つのカラムを製造した。
大きな直径のカラム(35mm×100mm)を使用するが、以下の重合溶液：240mgp-ターフェニル及び800mgAIBNを32.0034gジビニルベンゼン(80%)のモノマー混合物に溶解して、上記実施例の如くもう一つのカラムを製造した。このモノマー混合物には、31.6926gテトラエチレングリコール、16.3224gテトラエチレングリコールジメチルエステルを添加した。
図１２〜１５に記載のポリマーハウジング内部で、上記実施例の如くもう一つのカラムを製造した。重合溶液は73.2gジビニルベンゼン、73.4gスチレン、85.2g鉱油、60.8g2-エチルヘキサン酸、0.882gp-ターフェニル及び2.94gAIBNを含む。カラムの中心の重合温度は、カラムの端部の重合温度と殆ど同じであった。４日間の110kVのX-線照射重合の後モノマーの転換率は殆ど完全であった。さらなる発熱は顕著に悪い作用をもたらさないので、完全な反応が熱的に達成される。
種々のシンチレーター、光開始剤、モノマー及びポロゲン性溶媒を使用して他の多くのカラムを製造した。使用したポロゲン性溶媒としては、他のアルカン、たとえばオクタン、アルコール類、たとえばメタノール、プロパノール及びシクロヘキサノール、エーテル類、たとえばテトラヒドロフラン、ジオキサン、オリゴマー類、たとえばテトラエチレングリコール、テトラエチレングリコールジメチルエーテルが挙げられる。使用する光開始剤としては、2-クロロチオキサンテン-9-オン、4,4-ビス(ジメチルアミノ)ベンゾフェノン、4,4’-ビス(ジエチルアミノ)ベンゾフェノン、フェナントレンキノン、ジフェニル(2,4,6-トリメチルベンゾイル)ホスフィンオキシド及びアゾビスイソブチロニトリル(AIBN)が挙げられる。使用したシンチレーターとしては、p-ターフェニル及びZnSeの他に、2,5-ジフェニルオキサゾール(PPO)、2-フェニル-5-(4-ビフェニルイル)1,3,4-オキサジアゾール(PBD)、2-(1-ナフチル)-5-フェニルオキサゾール(a-NPO)が挙げられる。使用するモノマーとしては、グリシジルメタクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、スチレン、ジビニルベンゼン、エチルスチレンの他にアクリロニトリル、ブチルメタクリレートが挙げられる。
図９において、直径10mm及び35mm並びに長さ65mmのカラム中でX-線照射により開始した重合によって製造したポリ(DVB-コ-St)モノリシックカラムにおける(1)Met-エンケファリン、(2)Leu-エンケファリン、(3)アンギオテンシン、(4)フィザレミン(Phyusalaemin)及び(5)サブスタンスPの混合物の二つの異なる直径のカラム；移動相：（A）0.15%(v/v)TFAを含む水；勾配液：A中の10〜40%のB、７ベッド容積、流速５ml/分カラム、３５I.D.カラムに関しては50ml/分；検出：UV、214nmにおける分離のクロマトグラフィーを示す。
図１０では、紫外線または可視光重合装置１５０の上面図が示されており、これは静止上部面１５２、回転上部面１５６、静止支持面１５２に接続され且つ回転表面１５６にピンで固定された支持部材１５７を含み、四つの蛍光ランプホルダー１５４A〜１５４Dを回転させる。可視光または紫外線蛍光ランプは、これらのホルダー内に挿入される。
図１１では、重合装置１６２を回転させるためにモーター１５９によって相互に回転される駆動部材１５６を示す重合装置１５０の側断面図の略図が示されている。四つのランプのうちの二つ１６６Dと１６６Bが示されており、これらはランプホルダー１５４Dと１５４Bと、長いランプ１６６Dと１６６Bの底部の対応するホルダーに据え付けられている。ピストン１６４を使用して、重合の間に１６２で重合混合物を加圧する。ファン１５８は、重合装置を冷却し易くし、カバー、側部及びランプ上の反射コーティングは容器１６２の導光壁(light conducting wall)に光を反射して戻す。このような配置によって、ランプ１６６A〜１６６Dは光を重合装置に与えて、重合反応を開始且つ制御する。比較的大きな直径のカラムの重合は、溶媒及び検体の流れの方向でカラムに沿った全ての場所で、最終プラグにおける放射方向の均一性を保持しつつ、実施することができる。光は温度勾配を制御するために所望通りにオン/オフすることができるので、重合は、均一性を制御された状態で光及び温度の組合せの元で実施することができる。
図１２では、放射線防止(radiation proof)キャビネット１７２、ドア１７４、上部ウィンドウ１７６、ホルダー１７８及び、１８２で反応混合物を含むための容器１８０をもつ、主としてX-線照射を用いる重合用の装置１７０の簡易化立面図を示す。幾つかの態様では、ピストン１８４を使用して、反応混合物１８２を加圧する。装置１７０では、γ線などのX-線または他の安定な放射線を使用して、安全で好都合な方法で重合容器での反応を制御することができる。
幾つかの態様では、他の態様と関連して上記方法で、反応混合物１８２に対して内側にピストンを移動させるために、導管１８６を通して空気を適用することによって、ピストン１８４を介して圧力を適用することができる。好ましい態様では、装置１７０は、ドアを備え、キャビネットに備えられて制御できるという点で、電子レンジに似た小さな使い勝手の良いX-線システムである。これは低レベルの電圧を使用し、大きなカラムに関して十分であるが低い透過率をもつため、キャビネットの横で安全に作業者によって操作することができる。上記プロセスは、光開始剤、発光性溶媒、またはポロゲン類、X-線増感剤及び／またはシンチレーターなどの重合を援助するための添加された物質を使用するため、本発明の重合に適切である。かくして、この装置は、図１０及び図１１のような重合及び他の装置のX-線制御を可能にするので、たとえばある点まで放射線によって重合を制御し、時間を短縮し、頭部の密集(head built-up)を避けるために、熱を利用して重合を終了させる。
図１３では、反応体の入り口開口部２００、冷却剤流体入り口２０３、冷却剤出口２０５、ケーシング２０４及びオーバーフロー出口２０２をもつ反応容器１８０の平面図を示す。この冷却剤は水であるのが好ましい。この上に圧力用に２１２で重合混合物に対してプラグ１８２（図１４）を移動させるために空気用に開口部２０６を準備する。反応混合物が容器１８０に設置され、プラグも同様に挿入できた後、熱電対を、開口部２００を通して準備することができる。この配置であると、所望により加圧下で反応混合物に放射線照射することができ、重合の開始及び制御のためにX-線を軸方向にかけることができる。水は冷却剤としてその中を流れるので、放射線と圧力の組み合わせによって、最終クロマトグラフィープラグまたは担体中での熱勾配を制御し且つ均一性を促進することができる。
図１４では、透明なX-線照射ウィンドウ１９２、冷却剤の水用のポート２０２、反応体用の開口部２００、熱電対２１５及びその伝導体２１８及びある配列のピン、２１２で反応混合物を加圧するためにプラグ１８２を移動させるための空気圧力開口部２０６、反応混合物を受容するための２１２における反応体ハウジング、容器１８０をカラムとして使用するときに、クロマトグラフィーの間に溶媒及び検体を分配させるための２１３における第一の分配プレート並びに、カラムが重合後に２１２にある場合、分離後に溶媒及び検体を受容するための第二の分配プレート２１５を示す、図１３の断面線１４−１４で取った断面図が示される。この配置によって、放射線はウィンドウ１９２を通過して反応体１８２の重合を制御する。
図１５には、X-線によって照射され、リザーバ１９０の流動水によって冷却されつつ、２１２で反応体を加圧するためにプラグ１８２に圧力を適用するピストン、空気空間２１０を示す図１３のライン１５−１５で取った重合容器１８０の断面図が示される。
上記記載から理解できるように、ポロゲンまたは溶媒を含むことができる重合混合物を、放射線制御下で多孔質プラグに重合する。この目的のために、重合を実施するために放射線によって生じる少なくとも一つの物質がある。物質の幾つかは、他の物質に影響を与え、続いて重合を開始または促進する放射線を放出することができる。この目的に関しては、放射線混合物は少なくとも一つのモノマー、少なくとも一つのポロゲンまたは溶媒、及び重合に影響を与える物質を含まねばならない。担体を製造するために、X-線をモノマーとだけ使用することができる。ポロゲンまたは溶媒が含まれる場合、担体は多孔質であってもよい。このX-線は特定の安全なタイプの放射線であり、ポリマー担体を製造するのに広範な用途をもつ。この照射線照射によって、重合を発生させ、または重合の開始若しくは重合の促進を生じさせるエネルギーをさらに放出する溶媒などの物質に照射することができる。
実施例１８
ホモポリマー、ポリマー樹脂及び多孔質ポリマー担体を、110kVのX-線照射を使用して製造した。このポリマーは、ガラスバイアル及びカラム中で製造した。スチレン中に１%AIBN及び0.1%p-テトラフェニルを含有する重合混合物を、脱気方法に記載の如く脱気し、１mlのガラスバイアルに充填した。このバイアルをスクリューキャップで封止した。バイアルを、111kV力を使用して600R/時間のx-線中に２日間暴露した。ガラスバイアルを破壊した後に、硬質バルクポリスチレンポリマーがバイアルの形状で得られた。
実施例１８の代替形
上記方法に従って、ホモポリグリシジルメタクリレートを製造した。
上記方法に従って、溶液重合法によりホモポリスチレンを製造した。１%AIBN及び0.1%p-ターフェニルを含有するトルエン中、50%スチレンを、600R/時間のX-線下で、２日間重合した。重合後にポリスチレンが得られた。
以下のスチレン対ジビニルベンゼン１：１の比を使用して、上記方法に従って、ポリ(スチレン-コ-ジビニルベンゼン)樹脂を製造した。この重合混合物は、0.9gスチレン、0.9gジビニルベンゼン、17mgAIBN、5.7mgp-ターフェニルを含む。重合後に、ポリマー樹脂が得られた。重合５時間後にゲル化が起きた。
ポリ(グリシジル-コ-エチレングリコールジメタクリレート)樹脂は、グリシジルメタクリレート(GMA)対エチレングリコールジメタクリレート(EDMA)の以下の１：１の比を使用して、上記方法に従って製造した。重合混合物は、0.9gGMA、0.9gEDMA、17mgAIBN、5.7mgp-ターフェニルを含む。重合後にポリマー樹脂が得られた。重合５時間後に、ゲル化が起きた。
グリシジルメタクリレート(GMA)対エチレングリコールジメタクリレート(EDMA)の以下の１：１の比を使用して、上記方法に従って、ポリ(グリシジル-コ-エチレングリコールジメタクリレート)多孔質担体を製造した。重合混合物は、0.45gGMA、0.46gEDMA、0.91gシクロヘキサノール、20mgAIBN、1.5mgt-ターフェニルを含む。重合後に多孔質ポリマーが得られた。重合６時間後に、ゲル化が起きた。
0.45gスチレン、0.45gジビニルベンゼン(80%純度)、0.91gシクロヘキサノール、20mgAIBN、6.5mgp-ターフェニルを含む重合混合物を使用して、上記方法に従って、ポリ(スチレン-コ-ジビニルベンゼン)多孔質担体を製造した。重合後に、多孔質ポリマーが得られた。重合4.5時間後に、ゲル化が起きた。
実施例１９
75μm、100μm、200μm、250μm、320μm、530μm及び700μmを含む種々の内径のシリカキャピラリーを、オーブン中、90℃で時間、１M水酸化ナトリウム溶液で変性した。次いでキャピラリーを脱イオン水とアセトン60カラム容積で洗浄した。このカラムに20分間窒素をパージすることによって乾燥した。キャピラリーチューブは、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)中、50%(v/v)3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート及び0.02%(w/v)ヒドロキノンを含有するシラン化(silanize)溶液で充填した。キャピラリーの両端を封止した後、これをオーブン中100℃で約10時間加熱し、続いてDMF及びアセトンで洗浄した。洗浄後に、キャピラリーを窒素パージにより乾燥した。
重合溶液は、表１に列記した成分組成で、実施例１に記載の如く製造した。
それぞれの変性キャピラリー(通常15〜20cm)を、上記重合溶液で充填した。キャピラリーの二つの端部をそれぞれ二つの1.8mLガラスバイアル中で封止し、これらも重合溶液で充填した。テフロン及びパラフィルムを使用して、バイアルのキャップを二重に封止した。それぞれのバイアルには約500μLの空隙が残され、キャピラリー端部は、バイアルの半分の高さに位置していた。２〜４つのカラムを、同一封止バイアルを使用して製造することができる。キャピラリーを、スタンドに上部バイアルをクランプすることによって、表１に列記した特定の温度で20時間、水浴中に垂直につり下げた。重合後、モノリシック・キャピラリー・カラムを約20カラム容積の有機溶媒、通常アセトニトリル、鉱油をポロゲンとして使用する場合には、時にはヘキサンを使用して洗浄した。
カラムを、流速３、５及び10μl/分でLCキャラクタリゼーション方法１に従ってキャラクタリゼーションした。優れた分解能が達成された。
Figure 0004721702
実施例１９の代替形
以下の重合溶液：40gBMA、2.6gEDMA、3.8g1-プロパノール、1.6g1,4-ブタンジオール、0.6g水及び0.04gAIBNを使用して、上記実施例の如くモノリシック・キャピラリー・カラムを製造した。重合は60℃で実施した。このカラムは、ミクロ分析液体クロマトグラフィーシステムでLCキャラクタリゼーション方法１aを使用してキャラクタリゼーションした。流速は５μl/分であった。タンパク質の優れた分離ができた。
他の多くのポリ(アクリレート)ベースのキャピラリーモノリスは、種々のBMA/EDMA比(1/3〜3/2)及び種々のポロゲン濃度(全反応混合物の34〜39重量%の1-プロパノール、20〜15重量%の1,4-ブタンジオール)により合成した。
以下の重合混合物：2.2gDVB、1.3gスチレン、0.9gアクリロニトリル、4.7g鉱油、0.8gトルエン及び0.044gAIBNを使用して、実施例１９のごとくもう一つのカラムを製造した。重合温度は75℃であった。このタイプの他の多くのカラムは、ポリマーマトリックス中０〜50%のアクリロニトリル含有量を変動させることによって製造した。このポリマーは高い疎水性度を示したが、タンパク質の保持力(retentativity)は異なっていた。以下の重合混合物：0.8gGMA、2.4gEDMA、0.8gATMS、3.1g1-プロパノール、2.6g1,4-ブタンジオール、0.3g水及び0.04gAIBNを使用して、実施例１９の如くもう一つのカラムを製造した。重合反応は、60℃で20時間実施した。重合後、カラムのポロゲン性溶媒をアセトニトリルで洗浄した。次いで、これらを、TMAと水の容積比１：２の混合物である変性溶液、次いで0.45g/mLTMA HClを充填した。この変性は、40℃で４時間実施した。
実施例２０
以下の混合物：3.2145gアクリル酸、8.0026gメチルメタクリレート、1.6064gグリシジルメタクリレート、19.2055gエチレングリコールジメタクリレート、43.8952g1-ドデカノール、9.0017gシクロヘキサノール、320mgジフェニル(2,4,6-トリメチル(ベンゾール)ホスフィンオキシドを使用して、実施例１の記載の如く重合溶液を製造した。この重合混合物に５分間、超音波をかけ、カラムに注ぎ、カラムの一端はTEFLONキャップで封止し、次いでこのカラムをもう一つのTEFLONキャップで封止した。重合物を通常の天井灯に７日間暴露した。カラムをアセトニトリル20ベッド容積、続いて水20ベッド容積で洗浄した。このカラムをクロマトグラフィーによりキャラクタリゼーションした。
実施例２０の代替形
以下の混合物：2.5074gグリシジルメタクリレート、2.5003gエチレングリコールジメタクリレート、7.5003gp-キシレン、及び58.2mgジフェニル(2,4,6-トリメチル（ベンゾール）ホスフィンオキシドを使用して、上記実施例の如く、サイズ10cm×１cmIDのガラスカラムを製造した。この重合混合物を通常の天井灯に24時間暴露した。同一重合をもう一つの２mlバイアル中で24時間実施した。モノマーの転換率は92%であった。
ホモポリグリシジルメタクリレートを、以下の重合混合物：10gGMA及び0.1gジフェニル(2,4,6トリメチル（ベンゾール）ホスフィンオキシドを使用してバイアル中で製造した。この溶液を通常の天井灯に24時間暴露した。ポリマーは、３時間後にゲル化した。非常に透明なポリマーが得られた。
以下の重合混合物：10gGMA、10gキシレン及び0.1gジフェニル(2,4,6トリメチル（ベンゾール）ホスフィンオキシドを使用して、バイアル中でホモポリ(グリシジルメタクリレート)を製造した。この溶液を通常の天井灯に24時間暴露した。ポリマーは３時間後にゲル化した。透明ポリマーが得られた。
上記記載から、本発明の新規モノリシック固体担体は、幾つかの好都合な点をもつことが理解できる。これらは、たとえば、以下の通りである：
(1)従来法よりも優れた方法でクロマトグラムを提供する；
(2)簡単且つ安価に製造することができる；
(3)従来法の分離よりも幾つかの分離に関しては高速を提供できるので、分離時間を短縮できる；
(4)従来法のプロセスよりも低い圧力で、幾つかの分離プロセスに関しては高い分解能の分離を提供する；
(5)カラムのコストを軽減することによって使い捨てカラムに高い分解能を提供することができる；
(6)多くの種々の形状のカラムが、たとえば環状クロマトグラフィー用の環状カラムなどが簡単に製造でき、且つモノリシック透過可能なポリマーチップを使用して質量分析法用並びにマイクロチップ及びキャピラリー用などの、任意の寸法、特に小さな寸法で簡単に製造できるようになる；
(7)小さな分子も大きな分子もいずれも迅速に分離する；
(8)中でも、抽出、クロマトグラフィー、電気泳動、超臨界流体クロマトグラフィー及び触媒用の固体担体、TLC及び集積CEC分離または化学反応などの多くのプロセス用の優れた分離媒体を提供することができる；
(9)特定の公知の透過可能なモノリシック分離媒体に優れた特徴を提供することができる；
(10)均質な分離効率的開口部サイズ分布をもつ大きな直径のカラムの製造用の新規アプローチを提供する；
(11)高い水性移動相にウォール効果をもつことなく、且つ優れたカラム効率で分離媒体を提供する；
(11)分離効率因子を改善する；及び
(12)逆相カラムにおける膨潤及び収縮問題を軽減する。
本発明の好ましい態様について詳細に記載してきたが、上記教示範囲内において本発明の種々の変形が可能である。従って、理解しておかなければならないことは、具体的に記載したもの以外の本発明は、付記請求の範囲の範囲内で実施できるということである。
図１は、本発明の態様に従ったクロマトグラフィーカラムを製造するためのプロセスの一態様の略図である。 図２は、重合の間にガラスカラムに圧力を適用するための治具のアセンブリである。 図３は、重合の間にステンレススチールカラムに圧力を適用するためのもう一つの治具のアセンブリである。 図４は、重合の間にガラスカラムに圧力を適用するためのさらにもう一つの治具のアセンブリである。 図５は、120psi油圧下での筒状カラム内部で重合させた強カチオン交換器の走査電子顕微鏡(SEM)写真である。 図６は、重合の間に圧力によって歪みが防止されたカラムを使用したタンパク質サンプル由来のピークを示すクロマトグラムである。 図７は、重合の間に圧力を使用して製造した左側の一つと、圧力を使用せずに重合した右側の二つの三つのカラムを示す写真である。 図８は、アレイで互いに似た再現可能な特徴をもつ、アレイのカラムを備えたクロマトグラフィーシステムのブロック図である。 図９は、中程度のエネルギー(110kEV)のX-線照射した重合で実施したクロマトグラフィー分離を示すクロマトグラムである。 図１０は、クロマトグラフィーカラム用のUVまたは可視光重合装置の平面図である。 図１１は、図１０の装置の側断面図である。 図１２は、クロマトグラフィーカラム用のx-線重合装置の略立面図である。 図１３は、図１２の装置の一部の平面図である。 図１４は、ライン14―14でとった図１２の装置の一部の横断面図である。 図１５は、図１３のライン15―15でとった横断面図である。

Claims (10)

  1. 液体クロマトグラフィーカラムであって、カラムケーシング及び液体サンプルを受容するように配置されたカラムケーシング内部に少なくとも一つの、液体が透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグを含み、前記少なくとも一つの透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグが、カラムケーシングの内面と直接接触した状態を形成することにより、モノリシック・ポリマー・プラグの収縮を原因とするモノリシック・ポリマープラグとカラムケーシングとの間のボイドが生じない液体クロマトグラフィーカラムであることを特徴とし、当該カラムを
    クロマトグラフィーカラムケーシングにポロゲンを含有する重合混合物を添加し；
    前記カラムケーシングと直接接触状態の前記カラムケーシングにおいて液体が透過可能なモノリシックポリマープラグを形成させるために最大３００ｐｓｉ（２．０７ＭＰａ）までの圧力下、４０℃〜８０℃の制御した温度でこの混合物を重合し、これによって、十分な圧力を適用して重合の間に前記プラグが、カラムケーシングの内面と直接接触した状態を形成することにより、モノリシック・ポリマー・プラグの収縮を原因とするモノリシック・ポリマープラグとカラムケーシングとの間のボイドが生じないようにし；そして
    ポリマープラグを洗浄してポロゲンを除去することにより製造する、前記液体クロマトグラフィーカラム。
  2. カラムがキャピラリーカラムである、請求項１に記載のクロマトグラフィーカラム。
  3. カラムがマイクロチップの一部である、請求項１に記載のクロマトグラフィーカラム。
  4. カラムケーシングがガラスである、請求項１〜３のいずれかに記載のクロマトグラフィーカラム。
  5. カラムケーシングがスチールである、請求項１〜３のいずれかに記載のクロマトグラフィーカラム。
  6. カラムケーシング及び液体サンプルを受容するように配置されたカラムケーシングの内面と直接接触した状態のカラムケーシング内部に少なくとも一つの、液体が透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグをもつ請求項１〜５のいずれかに記載のクロマトグラフィーカラムに液体サンプルを適用し、ここで、前記少なくとも一つの透過可能なモノリシック・ポリマー・プラグが、カラムの内面と直接接触した状態を形成することにより、モノリシック・ポリマー・プラグの収縮を原因とするモノリシック・ポリマープラグとカラムケーシングとの間のボイドが生じないようになっており、これによって液体サンプルをクロマトグラフィーカラム内でその成分に分離する
    各段階を含むクロマトグラフ分析法を実施する方法。
  7. モノリシック・クロマトグラフィー・カラムの製造方法であって、
    クロマトグラフィーカラムケーシングにポロゲンを含有する重合混合物を添加し；
    前記カラムケーシングと直接接触状態の前記カラムケーシングにおいて液体が透過可能なモノリシックポリマープラグを形成させるために最大３００ｐｓｉ（２．０７ＭＰａ）までの圧力下、４０℃〜８０℃の制御した温度でこの混合物を重合し、これによって、十分な圧力を適用して重合の間に前記プラグが、カラムケーシングの内面と直接接触した状態を形成することにより、モノリシック・ポリマー・プラグの収縮を原因とするモノリシック・ポリマープラグとカラムケーシングとの間のボイドが生じないようにし；そして
    ポリマープラグを洗浄してポロゲンを除去する、各段階を含む前記方法。
  8. モノリシック・クロマトグラフィー・カラムの製造方法であって、
    液体クロマトグラフィーカラムケーシングにポロゲンを含有する重合混合物を添加し；そして
    前記カラムケーシングにおいて液体が透過可能なモノリシックポリマープラグを形成させるために前記混合物に照射処理をしながら当該混合物を重合し、ここで、前記ポリマープラグが、前記カラムケーシングの内面と直接接触した状態を形成することにより、モノリシック・ポリマー・プラグの収縮を原因とするモノリシック・ポリマープラグとカラムケーシングとの間のボイドが生じないようにする
    各段階を含む前記方法。
  9. 前記照射をＸ線により行う、請求項８に記載の方法。
  10. Ｘ線を細長い混合物に軸方向に適用する、請求項９に記載の方法。
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