SE537053C2 - Förfarande för framställning av monolitkolonner - Google Patents

Abstract

Ett förfarande för framställning av en separationskapillärkolonn, ellerseparationskanal i en mikrotillverkad anordning, som innefattar stegen att:tillhandhålla en ofylld kapillärkolonn av kvartsglas, eller kanal i en mikrotillverkadanordning, etsa kolonnens eller kanalens inneryta med ett etsningsmedel,silanisera kolonnens eller kanalens innervägg med ett silaniseringsmedel, fyllakolonnen med en polymerisationslösning innefattande monomerer, minst enporogen och en polymerisationsinitiator, och polymerisera blandningen för att bildaen styv monolitisk polymerplugg i kolonnen eller kanalen. Förfarandetkännetecknas av att monomererna innefattar en blandning av divinylbensen somhuvudmonomer och isodecylakrylat, och att porogenen eller porogenerna innefattarisobutanol, samt att kapillärkolonnen, eller kanalen i en mikrotillverkad anordning, företrädesvis har en innerdiameter av ca 0,05 mm eller mindre.

Description

35 537 053 vanligtvis kan med användning av kolonner med 0,075 mm ID flödet av rörlig fas minskas till några hundra nanoliter per minut.

Som andra forskare visat är det till och med möjligt att skala ned vätskekromatografin ytterligare för att uppnå tillräckligt känslig LC-MS-analys. På grund av svårigheten att fylla ett mycket smalt kapillärrör med partiklar är emellertid kommersiellt tillgängliga packade kolonner ännu så länge tekniskt begränsade till 0,075 mm ID. Teoretiskt sett finns det inga sådana begränsningar och svårigheter förknippade med framställning av monolitkolonner.

I en monolitkolonn föreligger separationsmediet i en form som kan jämföras med en enda stor ”partikel” som inte innehåller interpartikulära hålrum, med andra ord ett kontinuerligt medium. Som resultat måste hela den rörliga fasen strömma genom den stationära fasen. Detta konvektiva flöde accelererar massöverföringen i hög grad. I motsats till diffusion, som är den typiska drivkraften för massöverföringen inuti porerna hos partikelformiga stationära faser under kromatografiprocesser, medger konvektivt flöde genom porerna en betydande ökning i separationshastighet.

På grund av fördelarna som de ger jämfört med packade kolonner har utvecklingen av kontinuerliga separationsmedia tilldragit sig avsevärd uppmärksamhet under senare år. I princip har två typer av monolitiska material använts, det första baserat på modifierad silikagel och det andra på organiska polymerer. Medan de kontinuerliga silikagelmedierna krymper under polymerisationsprocessen, vilket gör det svårt att framställa praktiskt användbara silikagelbaserade monolitkolonner med små innerdiametrar, märks emellertid inte dessa svårigheter vid framställning av monolitkolonner genom in situ-polymerisation av lämpliga organiska monomerer i kapillärer av kvartsglas med så små innerdiametrar som 0,1 mm.

Polymerisationsblandningen kan framställas med användning av ett vitt urval av monomerer, vilket ger ett nästan obegränsat val av både matris och ytkemier för variation av retention och separationsselektivitet. Monolitkolonner av akrylamid, polystyren och metakrylat kan nämnas som ofta använda exempel. Man tillsätter vanligtvis en porogen eller ett porogent lösningsmedel för att styra porositeten hos den resulterande monoliten. l0 15 20 25 35 537 053 Ett stort antal polymermonolitkolonner, inklusive kapillärkolonner med liten ID, och metoder för deras framställning har tidigare beskrivits på teknikområdet.

WO 2007/ 149498 A2 beskriver en separationskapillärkolonn, eller separationskanal i en mikrotillverkad anordning, framställd genom sampolymerisation in situ av en funktionell monomer och en tvärbindande monomer, som ökar polymermatrisens hållfasthet. Styrenbaserade monomerer, som styren och divinylbensen eller met/ akrylsyrabaserade monomerer, som butyl- eller stearylmetakrylat och etylenglykoldimetakrylat, är föredragna. Ett polärt porogent lösningsmedel (eller en polär porogen), som etanol, metanol, propanol eller acetonitril, används vid reaktionen. Kolonner kan framställas på ett robust sätt med mycket liten ID, t.ex. 5-15 pm, vilket gör dem lämpliga för användning vid LC/ MS-proteomisk analys.

WO 2004/ 064974 A2 beskriver ett sätt att framställa ett monolitiskt separationsmedium för vätskekromatografi (LC) i ultrananoskala för användning i kapillärkolonner, eller kanaleri mikrotillverkade anordningar (mikrochip), och kapillärer framställda med metoden. Anbringande av ett måttligt övertryck på bägge ändarna av kapillären under polymerisationsprocessen för monoliten medger framställning av monolitiska kapillärkolonner med mycket liten ID, t.ex. 25 pm och mindre, med ökade massöverföringsegenskaper och låga baktryck, samt utmärkt reproducerbarhet för retentionstider från kolonn till kolonn. I en föredragen utföringsform valdes styren som monomer, tetrahydrofuran (TI-IF) och n-oktanol valdes som inerta porogener, och divinylbensen (DVB) utgjorde tvärbindare.

Azobisisobutyronitril (AIBN) tjänstgjorde som radikalinitiator. Andra lämpliga tvärbindningsbara monomerer innefattar metakrylater.

US 7,473,367 B2 beskriver ett sätt att tillverka en monolitisk kromatografikolonn genom att man i en kammare tillsätter en polymerisationsblandning som innehåller en porogen och polymeriserar polymerisationsblandningen i kammaren för att bilda en monolitisk polymerplugg i form av en kromatografikolonn, varvid åtminstone en del av polymeriseringen utförs genom anbringande av ett tillräckligt tryck på polymerisatíonsblandningen för att förhindra väggkanalöppningar i den polymeriserade monolitiska polymerpluggen och medan polymerisations- 10 15 20 25 30 537 053 blandningen värms vid en reglerad förhöjd temperatur. Exempel på media för omvänd fas-kromatografi är baserade på poly(styren-co-divinylbensen), polyßteaiylmetakrylat-co-divinylbensen) eller poly(butylmetakrylat-co- etylenglykoldímetakrylat).

Liknande monolitiska kolonner och förfaranden för att framställa dem beskrivs i WO 2006/017620 A2 och US 2010/0038298 Al. Ändå finns mycket få monolitiska produkter kommersiellt tillgängliga, och dessas ID är vanligtvis 0,1 mm eller större. Det är svårt att framställa monolitiska kolonner med liten ID, eftersom polymerisationsprocessen och förbeläggningen av kapillärröret verkar vara beroende av kapillärens ID. Vad som förfaller vara en perfekt fungerande lösning i vialer och till och med i kapillärrör med 0,1 mm ID därför kanske inte fungerar alls med kapillärer med en ID på 0,05 mm och mindre.

Ett syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarande för framställning av en förbättrad monolitisk kolonn som kan ha en ID mindre än 0,05 mm och som utan olägenhet kan användas för känsliga separationer av peptider och andra småmolekyler.

Sammanfattning av uppfinningen Det ovannämnda syftet uppnås med förfarandet enligt föreliggande uppfinning som ger en kapillärkolonn eller kanal i en mikrotillverkad anordning, som företrädesvis har liten innerdiameter med en homogen monolitisk struktur inuti och som kan användas för känslig separation av peptider och andra småmolekyler.

Enligt föreliggande uppfinning har detta uppnåtts genom noggrann optimering av det totala polymerisationsförfarandet.

Närmare bestämt är föreliggande uppfinning framtagen för framställning av monolitiska kolonner (eller kanaler) med en ID som företrädesvis är mindre än 0,05 mm och är baserad på selektiv användning av (i) en specifik kombinaton av monomerer, nämligen divinylbensen (DVB) och íso-decylakrylat (IDA), (ii) en specifik makroporogen eller makroporogenblandning, nämligen isobutanol eller 10 15 20 25 537 053 isobutanol/oktanol-blandning, och, företrädesvis, en ”mild” procedur för silanisering av kapillärkolonnens (eller kanalens) väggar.

En aspekt av föreliggande uppfinning avser därför ett förfarande för framställning av en separationskapillärkolonn, eller separationskanal i en mikrotillverkad anordning, som innefattar stegen att: tillhandhålla en ofylld kapillärkolonn av kvartsglas, eller kanal i en mikrotillverkad anordning, etsa kolonnens eller kanalens inneryta med ett etsningsmedel, silanisera kolonnens eller kanalens innervägg med ett silaniseringsmedel, fylla kolonnen med en polymerisationslösning innefattande monomerer, minst en porogen och en polymerisationsinitiator, polymerisera blandningen för att bilda en styv monolitisk polymerplugg i kolonnen eller kanalen, och vanligtvis tvätta den styva monolitiska polymerplugg som bildats inuti kolonnen eller kanalen för att avlägsna alla kvarvarande oreagerade komponenter, varvid förfarandet kännetecknas av att monomererna innefattar en blandning av divinylbensen som huvudmonomer och isodecylakrylat, och att porogenen eller porogenerna innefattar isobutanol.

I en föredragen utföringsform av uppfinningen ligger volymförhållandet mellan isodecylakrylat och divinylbensen i området från ca 1:6 till ca 1:40, företrädesvis från ca 1:10 till ca 1:20.

I en annan föredragen utföringsform av uppfinningen är porogenen eller porogenerna valda bland isobutanol och en blandning av isobutanol och oktanol.

I en ytterligare fördragen utföringsform av uppfinningen har kapillärkolonnen, eller kanalen i en mikrotillverkad anordning, en innerdiameter (ID) av ca 0,05 mm eller mindre.

Andra föredragna utföringsformer anges i underkraven.

En annan aspekt av föreliggande uppfinning avser en kapillärkolonn, eller kanal i en mikrotillverkad anordning, som kan erhållas med förfarandet. lO 15 20 25 30 537 053 Ytterligare en aspekt av föreliggande uppfinning avser användning av en polymermonolitkolonn, eller kanal i en mikrotillverkad anordning, som kan erhållas eller framställas med förfarandet. Ännu en aspekt av föreliggande uppfinning avser en polymerisationskomposition, som innefattar divinylbensen, isodecylakrylat och porogener i förutbestämda förhållanden.

I det följande kommer uppfinningen att beskrivas utförligare, varvid hänvisning görs till de bifogade ritningarna.

Kort beskrivning av ritningama Figur l är ett principschema för en internt tillverkad experimentell uppställning för fyllning av kapillärkolonner med vätska vid framställning av polymermonoliter enligt uppfinningen.

Figur 2 är ett principschema för en kromatografisk instrumentuppställning med ett kort stycke polymermonolit med 0,05 mm ID använd som trap-kolonn för att möjliggöra injicering vid hög llödeshastighet för att förkorta provinjektionstiden.

Figur 3 visar två kromatogram A och B för bastoppsintensitet (”base peak intensity” - BPI), erhållna vid separation av tryptiska peptider från prov från cerebrospinalvätska (CSF) på A: en kommersiell kolonn, Acquity nanoUPLC (Waters, USA); och B: en polymermonolitkolonn framställd med förfarandet enligt uppfinningen.

Figur 4 är ett motsvarande BPI-kromatogram som kromatogram B i Figur 3 av tryptiska peptider från CSF på en 600 mm lång polymermonolitkolonn med 0,05 mm ID, framställd med förfarandet enligt uppfinningen, med användning av ett kort stycke polymermonolit med 0,05 mm ID som trap-kolonn (som visas i Figur 2) för att förkorta injektionstiden. l0 15 20 25 30 537 053 Figur 5 visar jonkromatogram för separation av två enkelladdade specier med m/ z 416,2 separerade på A: en kommersiell kolonn, Acquity nanoUPLC (Waters, USA); och B: en polymermonolitkolonn framställd med förfarandet enligt uppfinningen.

Figur 6 visar kromatogram för separation av en enkelladdad specie med m/ z 613,8 separerad på A: en kommersiell kolonn, Acquity nanoUPLC (Waters, USA); och B: en polymermonolitkolonn framställd med förfarandet enligt uppfinningen.

Figur 7 visar kromatogram för separation av ett stort antal procyanidiner från fruktextrakt på en 600 mm lång polymermonolitkolonn med 0,05 mm ID, framställd med förfarandet enligt uppfinningen, med användning av en uppställning med trap- kolonn.

Figur 8 visar bastoppsintensitetskromatogram (BPI-kromatogram) för tryptiska peptider från CSF på en 600 mm lång polymermonolitkolonn med 0,03 mm ID, framställd med förfarandet enligt uppfinningen, vid en flödeshastighet för den rörliga fasen om A) 100 nl / min, och B) 200 nl / min.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Som nämnts ovan avser föreliggande uppfinning ett förfarande för framställning av en monolitisk kapillärkolonn, eller kanal i en mikrotillverkad anordning, som är kapabel till ytterst känslig separation i nanoskala av peptider och andra småmolekyler, och som företrädesvis har liten innerdiameter (ID) om 0,05 mm eller mindre.

Innan uppfinningen beskrivs närmare, ges i det följande en allmän beskrivning av monolitkolonner och deras framställning.

Monolitisk polymerkolonn En monolitisk kromatografisk stationär fas består av ett enda stycke av höggradigt poröst material som inte innehåller interpartikulära hålrum som är typiska för packade kromatografiska bäddar. De flesta av porerna inuti monoliten är öppna och bildar ett nätverk av kanaler som är förbundna med varandra. 10 15 20 25 30 537 053 För att framställa en monolitisk kapíllärkolonn, eller kanal i ett mikrofluidikchip, av organisk polymer fyller man vanligtvis en kvartsglaskapillär med en polymerisationsblandning som innehåller lämpliga mängder av en monomer, en tvärbindande monomer, en initiator för polymerisation och en blandning av porogena lösningsmedel. Kapillären är tillsluten i bägge ändarna, och polymerisationen initieras genom uppvärmning eller med ultraviolett (UV) strålning.

Vanligtvis används en dinitril- eller azo-initiator, som AIBN, som sönderdelas vid uppvärmning så att fria radikaler bildas. Medan monomeren i polymerisations- blandningen styr polariteten hos det slutliga monolitiska materialet, bestämmer tvärbindningsmedlet och det porogena lösningsmedlet porstorleksfördelningen.

I motsats till vanlig suspensionspolymerisation fortgår syntesen av monolitiska kolonner i orört tillstånd. I närvaro av porogena lösningsmedel börjar polymerkårnorna fällas ut ur blandningen som resultat av både tvärbindningsprocessen och polymerens olöslighet i lösningsmedelsblandningen. Så småningom bildas ett monolitiskt system med en porvolymfraktion som ungefärligen motsvarar volymfraktionen av porogenerna.

Porernas storlek och morfologi beror av flera faktorer, däribland polymerisationstemperaturen, polymerisationskinetiken och porogenernas löslighet för den resulterande polymeren. Lösningsmedel med god lösningsförmåga för polymeren gfnnar bildning av mikro- och mesoporer, medan makroporer genereras med lösningsmedel som endast i liten utsträckning interagerar med polymeren.

För att förankra den monolitiska polymerkroppen till kvartsglasväggen är det nödvändigt att etsa och silanisera kapillärröret eller kanalen innan polymerisationsblandningen införs. Annars riskerar kolonnen att trängas ut vid höga anbringningstryck för den rörliga fasen. Silanisering utförs typiskt med y- trimetoxisilylpropylmetakrylat (VMAPS) efter behandling av innerväggen med vattenhaltig natriumhydroxidlösning.

Uppfinníngen Enligt föreliggande uppfinning gör noggrann optimering av det totala polymerisationsförfarande som beskrivits i stora drag ovan det möjligt att framställa 10 15 20 25 30 537 053 polymermonolitkolonner med en ID av 0,05 eller mindre, såsom 0,03 eller 0,02 mm, med ökad känslighet så att separation av även små peptider och andra molekyler medges. Förfarandet enligt uppfinningen är emellertid inte begränsat till sådana monolitkolonner av nanoskaltyp utan omfattar även framställning av monolitkolonner med större diameter, innefattande kolonneri preparativ skala som vanligtvis har så stora innerdiametrar som 10- 100 mm ID (varvid gjutningen av porösa monolitstrukturer i dessa kolonner sannolikt är billigare än fyllning med partiklar) .

Förfarandet enligt uppfinningen är baserat på fyllning av kolonnen med en polymerisationsblandning som innehåller divinylbensen (DVB) som huvudmonomer ikombination med en mindre mängd isodecylakrylat som sammonomer, och isobutanol, eller en blandning av isobutanol och oktanol, som makroporogen, företrädesvis efter silanisering av kapillärkolonnens vägg med en relativt ”mild” procedur, allt vid förutbestämda betingelser. Därigenom kan en homogen monolitisk struktur med känsliga separationsegenskaper framställas.

Ett exempel på hur det uppfinningsmässiga förfarandet kan utföras kommer nu att beskrivas: Framställning av en monolitisk polvmerkolonn Uppställning för uätskefyllning För att fylla vätskor i kvartsglaskapillärer används med fördel en uppställning av den typ som illustreras i Figur 1 och som kommer att beskrivas närmare i den Experimentella delen. I korthet innefattar uppställningen en internt tillverkad koppling av högtrycksförbindningar från SwagelokTM, varvid en Teflon-ferrul används för att fästa ett 10 mm glasrör som innehåller vätskan och en PEEK-hylsa [0,38 mm ID) används för tätning av kapillären. Tryck (0,2-6 bar; 20-600 kPa) anbringas med kväveflöde från sidan med användning av en T-koppling. Denna uppställning är mer robust och reproducerbar än användning av glasvialer med ett septum för tätning av kapillären som vanligtvis utnyttjas.

Kvartsglaskapillärrör med innerdiameter 0,05 mm och ytterdiameter 0,36 mm kapas till föredragen längd, t.ex. 1000 mm. Behandlingen och silaniseringen av 10 15 20 25 30 537 053 kvartsglaskapillärens vägg är beskriven i litteraturen, men är avsevärt modifierad enligt föreliggande uppfinning såsom beskrivs nedan.

Silarulserirtgsförfarande 1 . Fyllning av kapillären med 2M NaOH och nedsänkning av kapillären i varmt vatten, vanligtvis vid ca 65 °C i ca 5 min. 2. Sköljning med vatten till neutralt pH, därefter sköljning med aceton. 3. Fyllning av kapillären med 10% y-(trimetoxisilyl)propylmetakrylat (VMAPS) i xylen och nedsänkning av kapillären i varmt vatten, vanligtvis vid ca 65 “C i ca 7 min. 4. Sköljning med aceton.

Fästande av vinylgrupper på innerväggen medger att monoliten stadigt fästs vid kapillären och hindrar på så sätt utdrivning av monoliten av den rörliga fasen med högt tryck som krävs för vätskekromatograñsk analys.

Polyrnerisationsförfarande Efter silaniseringen fylls kapillären med en polymerisationslösning som innehåller: 1. Monomerer (divinylbensen (DVB) och isodecylakrylat (IDA)) 2. Porogener (oktanol, isobutanol och kloroform eller tetrahydrofuran) 3. Initiator (2,2 '-azobisisobutyronitril (AIBN), lauroylperoxid eller bensoylperoxid).

Efter fyllningen försluts utloppet med ett gummistycke, varigenom det föredragna trycket på insidan bibehålls. Därefter nedsänks kapillären i varmt vatten (65-70 °C) i 30- 120 min för att sätta igång den värmeinducerade polymerisationen. Alla parametrar optimeras och regleras mycket noggrant. Efter polymerisationen kan sköljning av den monolitiska kolonnen ske med användning av ett acetonitrilflöde vid högt tryck. Därefter kan man använda kolonnen för peptidseparationer i nanoskala genom vätskekromatografi, företrädesvis med detektion genom masspektrometri (MS).

Silanserings- och polymerisationsstegen kommer nu att beskrivas mer fullständigt. 10 10 15 20 25 30 35 537 053 Sílanisering Som nämnts ovan är det nödvändigt att förankra den monolitiska strukturen vid kvartsinnerväggen för att förhindra utdrivning vid tillförsel av den rörliga fasen vid högt tryck. Detta åstadkoms genom etsning/ silanisering av kapillärrörets innervägg.

I föreliggande uppfinning är etsnings- och silaniseringsförfarandet betydligt förbättrat för att hålla kvartsglasväggen aktiverad men ändå slät, för att förhindra polymerisation av silaniseringsmedlet, y-trimetoxisilylpropyl-metakrylat, (VMAPS), och slutligen för att förhindra polymerisation med ett tjockt skikt nära väggen.

Istället för hög temperatur (120 °C) och lång tid (2 tim), som vanligtvis används, utnyttjar uppfinningsförfarandet ca 40-70 °C, t.ex. 65 °C, och ca 2-15 minuter, t.ex. ca 5 minuter eller kortare, för att etsa med vattenhaltig 2M NaOH istället för konventionellt använd IM NaOH. Detta förhindrar Oacceptabel uppruggning av väggen. Spolning av kapillären görs typiskt med vatten och aceton.

Silanisering utförs med en lösning om ca 1-20 volym-%, företrädesvis ca 10 volym- % yMAPS löst i xylen, men utan tillsats av någon inhibitor för fria radikaler (DPPH) som vanligtvis har använts tidigare inom tekniken. Silaniseringsreaktionen utförs vid ca 60-70 °C, företrädesvis vid ca 65 °C, i ca 2-15 minuter, t.ex. ca 7 minuter.

Detta är i motsats till 120 °C och 6 timmar som vanligtvis används vid sílanisering enligt känd teknik. Spolning görs med aceton.

Detta förhindrar polymerisation av VMAPS och medger mer kontrollerad och begränsad silanisering. Det förhindrar även att den porösa monolistiska polymerstrukturen bildar ett tjockt skikt vid väggen, och den bildas således med en liknande morfologi vid väggen som i den återstående delen av monolíten. Nog så viktigt är emellertid att detta milda silaniseringsförfarande fortfarande är tillräckligt för att effektivt förankra monolíten. Detta bevisades av att monolíten inte drevs ut ur kapillären ens vid anbringande av ett tryck om 10.000 psi (68950 kPa).

Polyznerísation Som nämnts ovan använder man vanligtvist fri-radikalpolymerisation med användning av AIBN som termisk initiator för att framställa porösa polymermonoliter. 11 10 15 20 30 537 053 Divinylbensen (DVB) finns lätt tillgängligt som industrikemikalie med 80 % renhet (som även innehåller ca 19 % etylvinylbensen) och har tidigare använts för framställning av polymermonoliter för vätskekromatografiska separationer. Om inte annat anges, avser termen DVB som den används här denna DVB av teknisk kvalitet med 80 % renhet.

De flesta rapporterade arbeten med porösa monolitiska polymerkolonner använder en monomerkoncentration, som typiskt innefattar DVB och styren, på nästan 40 volym-%. I föreliggande uppfinning är det genom att använda huvudsakligen DVB i polymerisationsblandningen möjligt att sänka den totala monomerkoncentrationen till ca 30-35 volym-% eller till och med lägre.

Initialt fick man vid användning av en sådan låg DVB-koncentration utfällning och inhomogen polymerbildning när man studerade polymerisationen i víaler. Detta resulterade även i tomrum och inhomogen monolitstruktur inuti kapillären.

Följaktligen undersökte man olika porogener för att åstadkomma en mer homogen polymerisation.

När endast oktanol användes som makroporogen, observerades utfällning och inhomogen polymerisation. Vid tillsats av isobutanol till polymerisations- blandningen observerades en grumligare och homogenare polymerisation i vialerna.

Detta var oväntat, eftersom isobutanol teoretiskt inte är något bra lösningsmedel för polydivinylbensen. En möjlig förklaring är att isobutanol håller polymeren i dispersion, vilket tillåter de aggregerade polymerklustren att bildas fritt i lösning utan för tidig utfällning. Koncentrationen av och förhållandet mellan oktanol och isobutanol kan användas för att anpassa monolitens morfologi och makroporositet.

Vanligtvis används en blandning av 20-40 volym-%, företrädesvis 25-35 volym-% oktanol och 20-40 volym-%, företrädesvis 25-35 volym-% isobutanol. Isopropanol och cyklohexanol kan eventuellt också ingå som makroporogener.

Vanligtvis används en mikroporogen i form av antingen kloroform, tetrahydrofuran eller xylen i en koncentration av ca 1-10 volym-%, speciellt 5-10 volym-%t. 12 10 15 20 25 30 35 537 053 Det är känt från litteraturen att koncentrationen av mikroporogenen kan användas för reglering av monolitens mesoporositet. Enligt föreliggande uppfinning fann man att tillsats av en andra monomer, isodecylakrylat (IDA), var verksam för att reglera monolitens porositet. Utan isodecylakrylat observerades stora makroporer, och monoliten var inte väl lämpad för separation av peptider. Genom tillsats av endast en mindre mängd isodecylakrylat, såsom 1-5 volym-%, omfattande ca 1:10 eller så jämfört med DVB-koncentrationen, minskades porstorleken betydligt.

Följaktligen är isodecylakrylat en kritisk mikroporogen i föreliggande uppfinning.

Det bör noteras att DVB själv är en vätska och kan verka som mikroporogen.

Dessutom kommer sampolymerisation av DVB med isodecylakrylat att införa alkylkedjor på polymerytan, vilket bidrar till att separationen av peptider förbättras.

Det förväntas att DVB reagerar snabbare än isodecylakrylat och således skapar det mesta av den tvärbundna inre strukturen, medan isodecylakrylat kan finnas mer närvarande vid ytan.

En viktig iakttagelse som gjorts är att användning av högre koncentrationer isodecylakrylat ledde till polymerisation med mer partikelbildning, dvs en suspension av gel eller partiklar eller löst gummi, som liknade lim istället för den önskade monolitiska strukturen. Följaktligen verkar det som att isodecylakrylat är verksamt för att förändra monolitens morfologi på att annat sätt än andra mikroporogener, såsom tetrahydrofuran eller kloroform.

En annan intressant aspekt av användning av isodecylakrylat är den exceptionellt låga glasomvandlingstemperaturen (-60 °C) för ren isodecylakrylat-homopolymer jämfört med andra akrylater. Detta skulle antyda att isodecylakrylat inför en gummiliknande sampolymerisation genom att minska kedjestyvheten i den totala polymerstrukturen. En liten mängd isodecylakrylat i polymeren ger således sannolikt extra hällfasthet och stabilitet åt monoliten genom en så kallad gummiseggörande process. Gummiseggöming gör polymeren mindre skör när den belastas och är således gynnsam för att undvika att monoliten bryts sönder när kapillären böjs.

En typisk polymerisationskomposition för användning i föreliggande uppfinning innefattar (viktprocent, vikt/vikt): 13 10 15 20 25 30 35 537 053 DVB 20-40%, företrädesvis 30-40% Isodecylakrylat 1 - 1 5%, företrädesvis 1 -5% Isobutanol 20-40%, företrädesvis 25-3 5% Oktanol 20-40%, företrädesvis 25-3 5% Kloroform 1 -1 5% (Samma procentintervall gäller på volymbasis (volym / volym), utom för kloroform där intervallet är 1-10 volym-%. ) Till kompositionen ovan sätts AIBN till en koncentration av O,l5-l,5 vikt-%, och ett förhållande mellan AIBN och monomerer om 0,5-5 vikt-%.

Betingelserna för fyllning och polymerisation av en porös polymermonolit inom begränsningarna för en mycket smal kvartsglaskapillär är inte triviala. Förfarandet enligt föreliggande uppfinning använder, som nämnts ovan, ett förhöjt tryck för att fylla kapillären med polymerisationsblandningen, företrädesvis med användning av en specialanordning som kort beskrivits ovan (under rubriken 'Uppställning för uätskefyllningñ konstruerad för detta ändamål och som kommer att beskrivas närmare i den Experimentella delen nedan. Det optimala valet av tryck för polymerisationen blir givetvis en följd av polymerisationsblandningens viskositet.

En annan viktig iakttagelse var möjligheten att kapillärkrafter och statisk elektricitet inverkade på polymerisationsblandningen. Vid högre tryck observerades dropprepulsion vid kapillärens utlopp, dvs droppar drogs uppåt på utsidan, vilket visade på laddningsöverföring till polymerisationsvätskan som strömmade genom den silaniserade kapillären. Genom ökning av viskositeten eller användning av ett lägre tryck vid fyllningen minskade repulsionen. Det förväntades att fasseparation också kunde äga rum under fyllningen på grund av att kapillärkrafter verkade på vätskan.

Följaktligen förefaller den tid som krävs för att fylla kapillären homogent vara av betydelse. Vanligtvis kan minst 30 minuter, och i vissa fall 60- 120 minuter, användas för att fylla kapillären för att säkerställa ett homogent innehåll på insidan. Det kan också vara lämpligt att fylla kapillären när den är nedsänkt i ett varmt vattenbad för att skynda på framställningsprocessen. Tiden, temperaturen, 14 10 15 20 25 30 537 053 trycket och även knackning eller skakning av kapillären under fyllningen identiñerades som viktiga parametrar vid förfarandet enligt föreliggande uppfinning för att säkerställa homogen och bubbelfn' fyllning före polymerisation. Det är även viktigt att undvika att olöst initiator, bitar av kvartsglas eller annat skräp kommer in i kapillären.

Fyllningstrycket varierar med kapillärkolonnens innerdiameter. Medan till exempel 2 bar (200 kPa) kan användas för att fylla ett 50 pm kapillärrör, kan 4 bar (400 kPa) krävas för ett 30 pm rör, och 5 bar (500 kPa) för ett 20 pm rör.

Efter fyllning och tillslutning av kapillärens utlopp kan trycket ökas ytterligare innan polymerisationen sätts igång genom ökad temperatur. Vanligtvis utförs polymerisationen genom nedsänkning av endast den fyllda kapillären i varmt vatten (60-80 °C), företrädesvis vid en temperatur av 65-69 °C, och ett tryck från ca 1 bar (100 kPa) till ca 10 bar (1000 kPa).

Som nämnts ovan är den framställda polymermonoliten inte bunden till inneslutning i kvartsglaskapillärer utan kan även införlivas i andra typer av anordningar för separation i nanoskala, såsom chip-baserade system.

I det följande kommer uppfinningen att belysas ytterligare med nägra ej begränsande utföringsexempel.

EXPERIMENTELL DEL Egperimentell uppställning För att fylla vätskor i kvartsglaskapillärer använde man en uppställning som illustreras i Figur 1. I denna uppställning är en kapillärspiral av kvartsglas 1 fast vid ett reagensglasrör 2, här 100 x 10 mm ytterdiameter, som innehåller vätska 3, via en internt tillverkad koppling av SwagelokTM högtrycksförbindningar. Mer exakt är röret 2 fäst vid ett SwagelokfM 10 mm till l / 8” skarvdon 4 och fäst med en 10 mm ferrul av TeflonTM. Detta skarvdon 4 är i sin tur via en rörledning 5 med 1 /8” ytterdiameter av rostfritt stål fäst vid en SWagelokTM T-koppling 6. Den sistnämnda är fäst vid och tätar kvartsglaskapillären 1 med 0,36 mm ytterdiameter via ett SwagelokTM 1/ 8” till 1/ 16” skarvdon, till vilket en hylsa av PEEK med 1/ 16” 15 10 15 20 25 30 537 053 ytterdiameter och 0,38 mm innerdiameter är ansluten med en l / 16” ferrul av PEEK (visas inte). En ledning 7 ansluter T-kopplingen 6 till en källa för komprimerad kvävgas (visas inte) via en stopp~ och utloppsventil 8 genom vilken kvävetryck på 0 till 10 bar (0 till 1000 kPa) kan anbringas. I det illustrerade fallet är kvartsglaskapillären 1 tillsluten med en gummipropp 9 och nedsänkt i ett termostaterat vattenbad 10.

Framställning av polyrnermonolitkolonner 600 mm lång kolonn med 0,05 mm ID En 600 mm lång polymermonolitkolonn med 0,05 mm ID framställdes genom att man följde det förfarande som beskrivs nedan. v (Använd skyddsglasögon för personlig säkerhet) 0 Ungefär 940 mm längd av kvartsglaskapillär skärs till och förs in i PEEK- hylsan och trycks genom tryckförbindningarna. Insidan (glasrörssidan) inspekteras med mikroskop med avseende på skräp, och vid närvaro av sådant gör en ny tillskärning. 0 Reagensröret innehållande 2M NaOH fästs genom åtdragning av TeflonTM- ferrulen och kapillären sänks ned. Tryck anbringas (2 bar; 200 kPa) manometertryck), och efter 5 minuters spolning sänks kapillärspiralen ned i ett termostaterat vattenbad (65-68 °C) i 5 minuter, varvid flödet kan lämnas på. Kapillärspiralen lyfts sedan ur vattenbadet, tryckförbindningen ventileras och glasröret avlägsnas och byts mot ett rör som innehåller renat vatten (18 MOhm). Kapillären spolas i 5 minuter vid 2 bar (200 kPa), ventileras därefter och spolas likaledes med användning av glasröret med aceton i 5 minuter vid 2 bar (200 kPa). v Tryckförbindningen ventileras sedan och ett glasrör innehållande 10% yMAPS i xylen sätts fast. Kapillären spolas i 5 minuter vid 2 bar (200 kPa), och spiralkolonnen sänks ned i det termostaterade vattenbadet (65-68 °C) i 7 minuter, varvid flödet kan lämnas på. Kapillärspiralen lyfts ur vattenbadet, tryckförbindningen ventileras, och glasröret avlägsnas och byts mot ett rör som innehåller aceton. Kapillären spolas i 5 minuter vid 2 bar (200 kPa). 0 Polymerisationsblandningen framställs genom tillsats av 15,5 mg AIBN till ett glasrör, varefter 850 pl divinylbensen, 90 ul isodecylakrylat, 90 ul kloroform, 16 10 15 20 25 30 537 053 800 ul oktanol och 800 pl isobutanol tillsätts. Vägning mellan tillsatserna medger dokumentation av den exakta arbetssammansättningen. Glasröret blandas med vortexblandare i 1 minut, sonikeras i 5 minuter och blandas slutligen med vortexblandare i 1 minut. Man måste ge akt på att det inte finns skräp eller kvarvarande AIBN. 0 Tryckförbindningen ventileras sedan och glasröret innehållande polymerisationsblandningen sätts fast. Kapillären spolas i 5 minuter vid 2 bar (200 kPa) i rumstemperatur, och kapillärspiralen sänks ned i det termostaterade vattenbadet (68 °C) i 10 minuter för effektiv varmspolning (flödet lämnas på). Kapillärutloppet lyfts sedan ur vattenbadet och tillsluts säkert genom att man sticker in kapillären 4-5 mm i en gummikork eller ett septum. Hela kapillärspiralen sänks sedan ned i vattenbadet för att polymerisation ska äga rum under en tid av 40 minuter. Den erforderliga tiden för polymerisation har visat sig vara helt beroende av koncentrationen av AIBN. Som vägledning kan koncentrationer av AIBN relativt monomerer om 1,25, 1,75 eller 2 vikt-% kräva polymerisationstider på 80, 40 respektive 30 minuter. Detta samband kan emellertid ändras med variation i polymerisationsblandningen och temperaturen, med renheten för AIBN, med kvartsglaskapillärens ID eller med andra parametrar. o Efter polymerisationen tas kapillären upp ur vattenbadet, tryckförbindningen ventileras och kapillären kapas under nedsänkningsnivån. Ungefär 650 nm av kapillären ska vara polymeriserad. Denna kapillär fästs vid en 360 um högtrycksförbindning (IDEX) för kvartsglas med nanoflödesvätska tillförd från injektorn med en kvartsglaskapillär med 20 pm ínnerdiameter och 360 pm ytterdiameter. Polymermonolitkolonnen spolas med acetonitril i ca 30 minuter vid 6000 psi (41370 kPa), därefter i ca 30 min med användning av en flödeshastighet på 400 nl/ min. Polymermonoliten är sedan färdig att användas som vätskekromatografikolonn och kan kapas till en längd av 600 mm. En längd om 50 mm kan användas som trap-kolonn. 600 mm lång kolonn med 0,03 mm ID En 600 mm lång polymermonolitkolonn med 0,03 mm ID framställdes på samma sätt som beskrivits ovan för kolonnen med 0,05 mm ID men med ökat tryck i motsvarande grad från 2 till 4 bar (200 till 400 kPa) för alla operationer. 17 537 053 Med de ovan beskrivna förfarandena framställdes fem monolitiska polymerkolonner med användning av de sammansâttningar och betingelser som anges för Exempel 1 till 5 íTabel1 1 nedan, nämligen tre kolonner med 0,05 mm ID (Exempel 1-3), en kolonn med 0,03 mm ID (Exempel 4), och en kolonn med 0,02 mm ID (Exempel 5). 18 537 053 Pm o P mdm l mmm o.m mNNm vom NNd mmdN NmdN mn. w wmd mN_movN ß ñNmN moNm mm_m.vw mmdmm m. -mm m.mP Nm_Nm Nim Nim Niom Niom mmd mod mod md md ovm Nod m fw o P mdm i ämm ocw mNNm *md NNd mm.mN Nm_mN mn. F vmd mN.movN ß ñNmß moNm mmdï mmdmm m. _.mm m.m _.

Nm_Nm Nim Nim Niom Niom mmd mod mod md m.o ovm mod Q ov m ñßm I imm o.N mNNm vmd NNd mmdN NmdN mn. F vmd mN_movN ß F .Nmß moKm mod: mmdmm m. -mm m.mw Nm.Nm Nim Nim Niom Niom mmd mod mod md md owm mo.o m Fm mp ñmm l m._mm o.N mmdm ß ñm mmdF m fimN m PNN mNä mio mNd :N Fofimß Fmdß mn. FmN mmfißm wmdmm md- Niom mm.N mod Niom Niom m.o »od m_..o m.o md ovm mod N ä 9 Nä 1 <3 om ovän man :ä Saw Nää 8. F m2 Näää m 5 _.. 6 wøï Nää ämm. 8.9 ämm» man man mmšw mwä .ä 80.0 86 ä... ä... 03 å... _ 8:5 uëwcngfiäwrmëšom šå uåmæågam GL SäöaëwfiwcoääwzmEzoq 50 -massan :So Éczmäëocäë som :NE :oämzmëzog :oo usšà Q> Éšwäë. eššš .ä Hmšäš åäö. .än åm=@n_>=_>_u ä osšämâëëäm oääägq: oæšvš oš zwëxmïoønow. ä mcëuwmcmEëmm umzfiwâ: ^v=>>v=> .š 5.290: ä msåämcäëêmw ušäxwga: ïsšš .à öcflš ä Qsczämcäëëäm uäsšwaa: Acššš å özäänow. ä usczmmcwëëäw fišäxâu: cæšvš oš .ëwëocoë Emma: zm_< ä mc_czmmcwëëwä .äuwxwaqd cv=>>v=> oš zm_< __E_c°.>=._n°m_o~ä ä osczmmcwëëmm uäzwxwqa: 8.5 .mëåoqëox äuåëmm .Q .æzämoh så gå šcxm. än âm=mn_>=_>_u :s 22:53 8.5 fiflašäwuøm. E; _5588: 85 Eömoxåx š> :mëqad aå .ocsä :s uäeaå 85 öfšnnow. š> :månad aå zm_< ._s_=°s.=n°m_°ä :s äåä: ^_o>\_o> .ä äæmš Écxmfi .xöm cmmcwnšcš... uššmmcwëEmm umsmäna: ^_o>\_o> .ä fisbväsuouom. ä msšwwcäëëmm oäzšmaa: ^_o>\_o> .š 52902 ä mscnmmcäëëmw uäzäxwqa: ^_o>>o> .å _9320 ä msczmwcäëëwm uäswxwgad =o>>o> .ä Bcwïnow. ä Qsšmwšëëäm uäzääaq: så æ=_ä>._ xmeš .æw=%_>=_>.u .šw eä> 25 zæšuäïäuom. E>6> 85 Eörzov. E>_o> :å šexo e>a> 95 öäšnow. E>_o> êå v92 šå 9 .ä___qs_mä_mëä>v_ .öEEÉ ÉnEøxm _ flïmmfi. 19 10 15 25 30 35 537 053 Separationsförsök Separation av tryptiska peptiderfrán cerebrospinalvätska (CF S) En monolitisk polymerkolonn, framställd som beskrivits ovan med användning av en liknande komposition och betingelser som angivits för Exempel 2 i Tabell 1, applicerades för separation av peptider från tryptisk digerering av cerebrospinalvätska (CSF). Provet injicerades med användning av en loop-injektor (loop-storlek 2 ul) monterad som Standardutrustning på ett kommersiellt nano- UPLC-system (Waters, USA).

Injektion: 2 ul vid 400 nl/ min 0-19 min Flöde: 200 nl/ min 20-70 min Rörlig fas: A) O,1% myrsyra B) O, 1% myrsyrai acetonitril Gradient: 2% B 0-20 min 30% B 50 min 70% B 60 min Resultatet visas i Figur 3, kromatogram B.

Som jämförelse separerades samma prov även på en kommersiell 150 mm lång nanoAcquity-kolonn med 0,075 mm innerdiameter (Waters, USA), packad med 1,7 tim-partiklar. I detta fall användes en trap-kolonn för att snabba på injektionen, varför eluering av peptider skedde ca 20 minuter tidigare än med direkt injektion på polymermonoliten.

Injektion: 2 ul vid 10 ul/ min (trap-kolonn) Flöde: 300 nl/ min Rörlig fas: A) O,1% myrsyra B) O,1% myrsyra i acetonitril Gradient: 2% B 0-2 min 30% B 30 min 80% B 40 min Resultatet visas i Figur 3, kromatogram A. 20 10 l5 20 25 537 053 För att förkorta injektionstiden för separationen i kromatogram B i Figur 3 (ungefär 20 min), med användning av en högre flödeshastighet under provinjektionen, konstruerades en uppställning visad i Figur 2 som innehåller en trap-kolonn.

Här är en trap-kolonn av polymermonolit 20 i form av ett kort stycke av polymermonoliten med 0,05 mm ID anordnad som analytisk kolonn mellan injektorn 21 och den analytiska kapillärkolonnen 22 via en kapillär 23 (20 pm ID), en anslutning 29 och en T-koppling 24, som även är ansluten till ett utlopp 25 via en kapillär 26 (20 pm ID). Den analytiska kolonnen 22 är vidare via en nano- elektrospray-emitter 27 (Pico-Tip®) ansluten till en Q-TOF-masspektrometer.

Högspänning tillförs till vätskeflödet via en T-koppling 30. Utloppet 25 är anslutet till spill 28 vid injektionstidpunkten, 3-5 ul/ min (4000 - 6000 psi; 27580 - 41370 kPa), och pluggas efter injektionen för att leda flödet till den analytiska kolonnen 22.

Detta liknar standarduppställningen för de kommersiella Acquity nanoUPLC- kolonnerna (Waters, USA). Olika lågvolymförbindningar användes och dödvolymerna minimerades i varje punkt. De skurna ändarna av både transportkapillåren och polymermonolitkapíllären observerades med mikroskop före koppling.

Tryptiska peptider från CFS injicerades vid högt flöde på denna trap-kolonn och separerades vidare på den 600 mm långa polymermonoliten med 0,05 mm ID.

Eftersom den analytiska llödeshastigheten var så låg som 200 nl / min, torde tiden för gradienten att nå kolonnen vara ganska lång. Därför började man gradienten med användning av en högre flödeshastighet (400 nl/ min) i 9 min, vilket således placerade gradienten i uppehållsvolymen framför kolonnen innan flödeshastigheten 200 nl/ min ställdes in.

Injektion: 2 ul vid 3 111/ min i 5 min/ (trap-kolonn) Rörlig fas: O, 1% myrsyra B) 0,1% myrsyra i acetonitril Flöde 400 nl/ min 1-9 min 200 nl/min 10-50 min 21 10 15 20 25 30 537 053 Gradient: 2% B 0-1 min 8% B 8 min 10% B 10 min 30% B 30 min 80% B 40 min Resultatet visas i Figur 4.

Jämförelse av topprofiler För jämförelse av topprofiler upptogs jonkromatogram för olika peptidmassor. Figur 5 visar separation av två enkelladdade specier med m/ z 416,2 separerade på A) kommersiell Acquity nanoUPLC (Waters, USA), och på B) en polymermonolít framställd som beskrivits ovan. Figur 6 visar motsvarande separation av en enkelladdad specie med m/ z 613,8 separerad på A) Acquity nanoUPLC, och på B) polymermonolít framställd som beskrivits ovan.

Separation av procyanidiner Med användning av en 600 mm lång polymermonolitkolonn med 0,05 mm ID, framställd som beskrivits ovan, separerades ett urval av procyanidiner extraherade från frukter och detekterades med masspektrometri med användning av en uppställning med trap-kolonn. Resultatet illustreras i Figur 7.

Separation av tryptiska peptiderfrán cerebrospinalvätska (CSF) med 600 mm lång polymermonolitkolonn med 0, 03 mm ID Separation av CSF utfördes med en 600 mm lång polymermonolitkolonn med 0,03 mm ID, framställd som Exempel 4 i Tabell 1 ovan. Separation av samma prov av tryptiska peptider från CSF som ovan utfördes vid en flödeshastighet för rörlig fas om 100 nl/ min och 200 nl / min. Resultaten visas i kromatogram A respektive B i Figur 8.

Föreliggande uppfinning är inte begränsad till de ovan beskrivna föredragna utföringsformerna. Olika alternativ, modifieringar och ekvivalenter kan användas.

De ovan beskrivna utföringsformerna ska därför inte uppfattas som begränsande för uppfinningens omfattning, som definieras av de bifogade patentkraven. 22

Claims (19)

537 053 Patentkrav

1. Förfarande för framställning av en separationskapillärkolonn, eller separationskanal i en mikrotillverkad anordning, som innefattar stegen att: tillhandhålla en ofylld kapillärkolonn av kvartsglas, eller kanal i en mikrotillverkad anordning, etsa kolonnens eller kanalens inneryta med ett etsningsmedel, silanisera kolonnens eller kanalens innervägg med ett silaniseringsmedel, fylla kolonnen med en polymerisationslösning innefattande monomerer, minst en porogen och en polymerisationsinitiator, och polymerisera blandningen för att bilda en styv monolitisk polymerplugg i kolonnen eller kanalen, kännetecknat av att monomererna innefattar en blandning av divinylbensen som huvudmonomer och isodecylakrylat, och att nämnda minst en porogen innefattar isobutanol.

2. Förfarande enligt krav 1, där kapillärkolonnen, eller kanalen i en mikrotillverkad anordning, har en innerdiameter av ca 0,05 mm eller mindre.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, där förhållandet mellan isodecylakrylat och divinylbensen ligger i området från ca 1:6 till ca 1:40 (vol. /vol.), företrädesvis från ca 1:10 till ca 1:20 (vol./vol.).

4. Förfarande enligt krav 1, 2 eller 3, där nämnda minst en porogen är vald bland isobutanol och en blandning av isobutanol och oktanol.

5. Förfarande enligt något av kraven 1 till 4, där den totala monomerkoncentrationen i polymerisationslösningen ligger i området från ca 20 till ca 50 volym-%, företrädesvis från ca 30 till ca 40 volym-%.

6. Förfarande enligt något av kraven 1 till 5, där koncentrationen av isodecylakrylat i polymerisationslösningen ligger i intervallet från ca 1 till ca 15 volym-%, företrädesvis från ca 1 till ca 5 volym-%.

7. Förfarande enligt något av kraven 1 till 6, där porogenerna vidare innefattar minst en mikroporogen vald bland kloroform, tetrahydrofuran och Xylen. 23 537 053

8. Förfarande enligt något av kraven 1 till 7, där silaniseringen utförs vid en temperatur från ca 40 till ca 70 °C under från ca 2 till ca 15 minuter.

9. Förfarande enligt krav 8, där silaniseringsmedlet innefattar 1 till 20 volym-% y-(trimetoXisilyl)propylmetakrylat.

10. Förfarande enligt något av kraven 1 till 9, där etsningsmedlet är en vattenhaltig lösning av natriumhydroxid vid en koncentration av 0,5 till 2 M och etsningen utförs vid en temperatur från ca 40 till ca 70 °C.

11. 1 1. Förfarande enligt något av kraven 1 till 10, där polymerisationen utförs vid från ca 60 till ca 80 °C och ett övertryck från ca 1 till ca 10 bar (ca 100 till ca 1000 kPa).

12. Förfarande enligt krav ll, där polymerisationen utförs under ca 20 till ca 120 minuter.

13. Förfarande enligt något av kraven 1 till 12, där polymerisations- initiatorn är 2,2ïazobisisobutyronitril (AIBN) eller lauroylperoxid.

14. Separationskapillärkolonn, eller separationskanal i en mikrotillverkad anordning, som kan erhållas med ett förfarande som innefattar stegen att: tillhandhålla en ofylld kapillärkolonn av kvartsglas, eller kanal i en mikrotillverkad anordning, etsa kolonnens eller kanalens inneryta med ett etsningsmedel, silanisera kolonnens eller kanalens innervägg med ett silaniseringsmedel, fylla kolonnen med en polymerisationslösning innefattande monomerer, minst en porogen och en polymerisationsinitiator, och polymerisera blandningen för att bilda en styv monolitisk polymerplugg i kolonnen eller kanalen, varvid monomererna innefattar en blandning av divinylbensen som huvudmonomer och isodecylakrylat, och att nämnda minst en porogen innefattar isobutanol.

15. Separationskapillärkolonn, eller en mikrotillverkad anordning innefattande en eller flera kanaler, där kolonnen, eller minst en kanal i den mikrotillverkade anordningen, har fyllts med en monolitisk polymer med ett förfarande som innefattar stegen att: tillhandhålla en ofylld kapillärkolonn av kvartsglas, eller kanal i en mikrotillverkad anordning, etsa kolonnens eller kanalens 24 537 053 inneryta med ett etsningsmedel, silanisera kolonnens eller kanalens innervägg med ett silaniseringsmedel, fylla kolonnen med en polymerisationslösning innefattande monomerer, minst en porogen och en polymerisationsinitiator, och polymerisera blandningen för att bilda en styv monolitisk polymerplugg i kolonnen eller kanalen, varvid monomererna innefattar en blandning av divinylbensen som huvudmonomer och isodecylakrylat, och att nämnda minst en porogen innefattar isobutanol.

16. Användning av en separationskapillärkolonn, eller separationskanal i en mikrotillverkad anordning, enligt krav 14 eller 15 för peptidseparation i nanoskala.

17. Användning av en separationskapillärkolonn, eller separationskanal i en mikrotillverkad anordning, enligt krav 14 eller 15 för preparativ peptidseparation.

18. Polymerisationskomposition för användning i metoden enligt krav 1, innefattande: 20-40 volym-% divinylbensen, företrädesvis 30-40 volym-% , 1-15 volym-% isodecylakrylat, företrädesvis 1-5 volym-%, 20-40 volym-% isobutanol, företrädesvis 25-35 volym-%, 20-40 volym-% oktanol, företrädesvis 25-35 volym-%, l -10 volym-% kloroform.

19. Polymerisationskomposition enligt krav 18, som vidare innefattar 0,15- 1,5 vikt-% 2,2ïazobisisobutyronitril (AIBN). 25