JP4702361B2 - ピリジル非芳香族含窒素ヘテロ環−１−カルボン酸エステル誘導体 - Google Patents

ピリジル非芳香族含窒素ヘテロ環−１−カルボン酸エステル誘導体 Download PDF

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Description

本発明は、医薬特に、脂肪酸アミド加水分解酵素(以下FAAH)阻害活性を有する頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤であるピリジル 非芳香族含窒素ヘテロ環−１−カルボン酸エステル誘導体又はその製薬学的に許容される塩に関する。また、本発明はFAAHの活性を阻害する物質である頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤をスクリーニングする方法、及び本発明のスクリーニング方法により得られた物質又は脂肪酸アミド加水分解酵素の活性を阻害する物質を含有する頻尿・尿失禁治療用、過活動膀胱治療用及び/又は疼痛治療用医薬組成物に関する。
脂肪酸アミド加水分解酵素(Fatty acid amide hydrolase;FAAH)は、エンドカンナビノイドを加水分解することで、その活性を消失させることが知られている(非特許文献1-4参照)。エンドカンナビノイド(endocannabinoid)とは、カンナビノイド受容体に作用して生理作用を発揮する生体内物質の総称である。代表的なエンドカンナビノイドとしてアナンダミド、パルミトイルエタノールアミド、オレアミド、2-アラキドン酸グリセロールがあり、FAAHによって加水分解を受け活性が消失することが知られている。また、大麻（マリファナ）の活性成分であると考えられているΔ9-テトラヒドロカンナビノールは、カンナビノイド受容体を活性化することが知られている（非特許文献5参照）。
哺乳動物にはこれまで２種類のカンナビノイド受容体CB1、CB2が知られている。CB1は中枢及び末梢神経系に発現しており、その活性化により精神作用及び鎮痛作用等が惹起される。CB2は免疫系組織に発現し、その活性化により抗炎症作用及び鎮痛(炎症性)作用等が惹起される。
一方、ラット膀胱炎モデルにおいて、カンナビノイド受容体作動薬は膀胱容量及び排尿閾値を増大させること(非特許文献６及び非特許文献７)、また、カンナビノイド受容体作動薬を動物に投与した場合に観察される幻覚、妄想、頻脈、起立性低血圧等の副作用が、FAAH阻害剤を投与した場合には観察されないこと(非特許文献８)から、FAAH阻害剤は頻尿・尿失禁治療薬、過活動膀胱治療薬及び/又は疼痛治療薬として期待される。
FAAH阻害活性を有する化合物としては、鎮痛剤、抗不安薬、抗てんかん薬、抗鬱剤、制吐剤、循環器疾患治療剤又は緑内障治療剤になりうる化合物が知られている［芳香環若しくはフェニル置換脂肪族炭化水素カルバミン酸 C1-4アルキル若しくは多環式芳香環エステル誘導体(特許文献1)及びシクロヘキシルカルバミン酸 フェニルエステル(特許文献２)］。また、FAAH阻害活性を有する化合物であるジオキサン−２−アルキルカルバメート誘導体が多数の羅列した疾患の一態様として尿失禁の治療薬が記載されている（特許文献３）。しかしながら、特許文献３には頻尿・尿失禁治療薬及び/又は過活動膀胱治療効果を裏付ける実験成績はなく示唆もない。また、ピリジル 非芳香族含窒素ヘテロ環−１−カルボン酸エステルとしては、４−アミノピリジル ピペリジンー１−カルボキシレートがアセチルコリンエステラーゼ阻害剤として記載されている（非特許文献９）が、当該化合物がＦＡＡＨ阻害剤及び頻尿・尿失禁治療薬及び/又は過活動膀胱治療薬であることについては記載されていない。
国際公開パンフレットWO2003/065989号 国際公開パンフレットWO2004/033422号 特開2003-192659号 「プロスタグランディンズ・ロイコトリエンズ・アンド・エッセンシャル・ファティ・アシッズ（Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids）」、（英国）、2002年、第66巻、p.143-160 「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー(British Journal of Pharmacology)」、(英国）、2004年、第141巻、p.253-262 「ネイチャー（Nature）」、（英国）、1996年、第384巻、p.83-87 「バイオケミカル・ファーマコロジー（Biochemical Pharmacology）」、(米国）、2001年、第62巻、p.517-526 「カレント・メディシナル・ケミストリー（Current Medicinal Chemistry）」、（米国）、1999年、第6巻、p.635-664 「ザ・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（The Journal of Neuroscience）」、2002年、第22巻、p.7147-7153 「ペイン（Pain）」、1998年、第76巻、p.189-199 「ネイチャー・メディシン（Nature Medicine）」、（英国）、2003年、第9巻、p.76-81 「ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（Journal of Pharmaceutical Science）」、1992年、第81巻、p380-385
本発明の課題は、大麻様の副作用や常用性の懸念がないか又は軽減された頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤を提供することにある。またFAAHの活性を阻害する物質である頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤をスクリーニングする方法、及び本発明のスクリーニング方法により得られた物質又は脂肪酸アミド加水分解酵素の活性を阻害する物質を含有する頻尿・尿失禁治療用、過活動膀胱治療用及び/又は疼痛治療用医薬組成物を提供することにある。
本発明者らは、FAAH阻害活性を有する化合物を創製すべく鋭意検討を行った結果、新規なピリジル 含窒素ヘテロ環−１−カルボン酸エステル誘導体を見出した。
また、本発明者らは、シクロフォスファミド（Cyclophosphamide）により誘発した頻尿ラットに対し、FAAH阻害活性を有する化合物を投与すると、有効膀胱容量が増加することを初めて見出し、更に、FAAH阻害活性を有する化合物が疼痛モデルラットにおいて優れた改善作用を示すことも見出したことから、FAAH阻害剤を選択することによる頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤のスクリーニング方法を提供し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
[1] 一般式（Ｉ）に示されるピリジル 非芳香族含窒素ヘテロ環−１−カルボン酸エステル誘導体及びその製薬学的に許容される塩、
Figure 0004702361
 ［式（I）中の記号は以下の意味を示す。
HET1：５乃至７員非芳香族含窒素ヘテロ環、
R1、R2、及びR3：同一又は異なって、
（１）Ｈ、
（２）ＯＨ、
（３）エステル化されていてもよいカルボキシル、
（４）シアノ、
（５）低級アルキル-CO−、
（６）オキソ（＝O）、
（７）式［R101−(O)m１］m2−[HOで置換されていてもよいALK1]−(O)n１−、
(m１及びn１；同一又は異なって、０又は１、m2；１から５、
ALK1：低級アルキレン、低級アルケニレン、又は低級アルキニレン、
R101：(i)Ｈ、
(ii)(a)H2N−、(b)ハロ、(c)シアノ、(d)エステル化されていてもよいカルボキシル、(e)基R1011aR1012aN−CO−、(f)HET2、(g)ハロ、シアノ、ＯＨ、低級アルキル−Ｏ−若しくは低級アルキルで置換されていてもよいAr1a、
Ar1a：アリール、
(h)低級アルキル、(j)ＯＨ、(k) Ar1a又はハロ−Ar1aで置換されていてもよい低級アルキル-O-、（ｌ）ハロ、Ar1aもしくはHETAr1aで置換されていてもよいHET2-CO-、
HET2：含窒素ヘテロ環、
HETAr1a：含窒素ヘテロアリール、
(s) HET2-CONR1011a−、 (t)H2NCONH−および(u)エステル化されてもよいカルボキシル−ALK2aからなる群より選択された一以上の置換基で置換されていてもよいAr1a、
ALK2a：低級アルキル又は低級アルケニル、
(iii)基R1011aR1012aN若しくはAr1aで置換されていてもよいALK2a、
R1011a、及びR1012a：同一又は異なって、
(a)Ｈ、(b) cALK、
cALK：シクロアルキル、
(c)ハロ、cALK、OH、低級アルキル−Ｏ−若しくはAr1aで置換されていてもよいALK2a、若しくは、(d)ハロで置換されていてもよいAr1a−SO2−、
(iv)（a）Ar1a若しくはハロ−Ar1aで置換されていてもよいALK2a、(b) Ar1a、(c)低級アルキルで置換されていてもよいHETAr1a、(d) Ar1a−ＣＯ−若しくはハロ−Ar1a−ＣＯ−からなる群より選択された一以上の置換基で置換されていてもよいHET2、
(v) ALK2aで置換されていてもよいcALK、
又は、
(vi)エステル化されていてもよいカルボキシル、
（ここにおいて、m2が２から５の場合は、［R101−(O)m１］は同一であっても異なっていてもよい。）、
（８）基R102−ALK1−N(R103)−CO−、
(R102：(i)H、
(ii)cALK、
(iii)HETAr1a、又は、
(iv)(a)HO、(b)ALK2a−O−、(c)cALK−ALK1−O−、(d)cALK−Ar1a−ALK1−O−および(e)Ar1a−ALK1−O−からなる群より選択された一以上の置換基で置換されていてもよいAr1a、
R103：(i)Ｈ、
(ii)cALK、
(iii)(a) HET2、(b)Ar1aおよび(c)ハロ−Ar1aからなる群より選択された一以上の置換基で置換されていてもよいALK2a、
(iv) HETAr1a、又は、
(v)(a) cALK、(b)H2N、 (c)基R1011aR1012aN−CO− 若しくは(d)ALK2aからなる群より選択された一以上の置換基で置換されていてもよいAr1a−[CO]m１)、
（９）基R104aR105aN−[CO]m１−ALK1−、
（R104a及びR105a：同一又は異なって、基R103）
（１０）基R106−ALK3−L1−、
(R106：(i)基R101−(O)m1−、
(ii) 基R104R105N−、
(iii)基ALK2a−CONH−、又は、
(iv)基Ar1a−CONH−、
ALK3：低級アルキレン、低級アルケニレン又はシクロアルキレン、
L1：-C(=O)-、又は-SO2-）
（１１）Ar1aで置換されていてもよいALK2a−CONH−、
（１２）ハロで置換されたAr1a、
（１３）基［R107−(O)m１］m2−Ar2−(O)n１−、
(Ar2：アリーレン、
R107：(i)Ｈ、
(ii)ハロ、
(iii)(a)HO、(b)cALK、(c)HET2、(d)ハロ、低級アルキル、低級アルキル−Ｏ−、基R1011aR1012aN−[CO]p−、シアノ若しくはエステル化されていてもよいカルボキシルで置換されていてもよいAr1a、(e)エステル化されていてもよいカルボキシル、(f)基R1011aR1012aN−[CO]p−で置換されていてもよいHET2−[CO]p−および(g)基R1011aR1012aN−[CO]p−からなる群より選択された一以上の置換基で置換されていてもよいALK2a、
p：０又は１、
(iv)基R1011aR1012aN−[CO]p−、又は、
(v) 基R1011aR1012aN−[CO]p−Ar1a、
また、ここにおいて、m2が２から５の場合は、［R107−(O)m１］は同一であっても異なっていてもよく、更に基［R107−(O)m１］m2がメチレンジオキシを意味し環を形成していてもよい。）、
（１４）基［R107−(O)m１］m2−Ar2−N(R103) −CO−、
（ここにおいて、m2が２から５の場合は、［R107−(O)m１］は同一であっても異なっていてもよい。）、
（１５）基［R1011aR1012aN−[CO]m１］m2−Ar2−(O)n１−、
（ここにおいて、m2が２から５の場合は、［R1011aR1012aN−[CO]m１］は同一であっても異なっていてもよい。）、
（１６）基［R108］m2−Ar2−L2−、
[R108：(i)Ｈ、
(ii)ハロ、
(iii)ＨＯ、
(iv)cALK−O−、
(v)基R109−ALK1−(O)m１−
(R109：(a)H、(b) cALK、(c)(1’)ハロ、(2’)シアノ、(3’)N2O、(4’)ハロで置換されていてもよいALK2a、(5’)HO、(6’)ハロで置換されていてもよいALK2a-O-、(7’)エステル化されていてもよいカルボキシル、若しくは(8’)基R104R105Nからなる群より選択された一以上の置換基で置換されていてもよいAr1a、(d)HETAr1a、又は(e)基R104R105N−[CO]m１−、)、
(vi)基R1013R1014N−又は、
R1013、R1014：同一又は異なって、(i)Ｈ、(ii)ALK2a、(iii)cALK-ALK1-、又は(iv)（１’）ハロ、(2’)シアノ、(3’)ハロで置換されていてもよいALK2a、(4’)ハロで置換されていてもよいALK2a-O-からなる群より選択された一以上の置換基で置換されていてもよいAr1a−ALK1−、
(vii)低級アルキルで置換されていてもよいHET2−(O)m１−、
L2：−CO−、又は−S(O)q−、
q：０、１、又は２、
また、ここにおいて、m2が２から５の場合は、［R108］は同一であっても異なっていてもよい。]、
（１７）基［R101］m2−Ar2−CONH−、
（ここにおいて、m2が２から５の場合は、［R101］は同一であっても異なっていてもよい。）、
（１８）基［R111］m2−HETAr2−(Ｏ)m１−、
(R111：(i)H、(ii)ハロ、(iii)オキソ(=O)、又は(iv)基R103a−(O)ｎ１−、
R103a：(i)Ｈ、
(ii)cALK、
(iii)(a) HET2若しくは(b)Ar1a、(c) cALKおよび(d)ハロ−Ar1aからなる群より選択された一以上の置換基で置換されていてもよいALK2a、
(iv) HETAr1a、又は
(v)(a) cALK、（ｂ）H2Nおよび(c)基R1011aR1012aN−CO−からなる群より選択された一以上の置換基で置換されていてもよいAr1a、
HETAr2：含窒素ヘテロアリーレン、
また、ここにおいて、m2が２から５の場合は、［R111］は同一であっても異なっていてもよい。)、
（１９）式［R112］m2−HETAr2−N(R103)−CO−、
(R112：(i)H、
(ii)cALK、
(iii)ALK2a、又は、
(iv)(a)ハロ、(b)HO、(c)ALK2a−O−および(d)Ar1a−ALK1−O−からなる群より選択された一以上の置換基で置換されていてもよいAr1a、
また、ここにおいて、m2が２から５の場合は、［R112］は同一であっても異なっていてもよい。)、
（２０）式［R108］m2−HETAr2−L2−、
（ここにおいて、m2が２から５の場合は、［R108］は同一であっても異なっていてもよい。）、
但し、R1、R2及びR3の何れか一つの基が基［R111］m2−HETAr2−(Ｏ)m１−中のm1が０の場合、残りのR1、R2及びR3の基はＨ、
R4、R5、R6、及びR7：同一又は異なって、
（１）H、
（２）ハロ、
（３）エステル化されていてもよいカルボキシル、
（４）ＨＯ、
（５）基R113−ALK4−(O)ｍ３−、
（ALK4：低級アルキレン、低級アルケニレン、又は低級アルキニレン、
ｍ３：０又は１、
R113：((i)Ｈ、
(ii)ＨＯ、
(iii)エステル化されていてもよいカルボキシルで置換されていてもよい低級アルキル−Ｏ−、
(iv)エステル化されていてもよいカルボキシル、
(v)低級アルキル−ＣＯ−Ｏ−、又は、
(vi) 基R104bR105bN−[CO]ｍ３−（R104b及びR105b：同一又は異なって、基R103）
）、
（６）R114R115N(R114、及びR115：同一又は異なって、(i)H、又は(ii)基R104bR105bNで置換されていてもよいALK2b、
ALK2b：低級アルキル又は低級アルケニル)、
（７）基R116−(ALK4)ｎ2−N(R117) −CO−、
(ｎ２：０又は１、
R116：(i)H、
(ii)HO、
(iii)低級アルキル-O-、
(iv)エステル化されていてもよいカルボキシル、
(v)基R104bR105bN−[CO]ｍ３−、
(vi) (a)HO若しくは(b)ALK2b-O-で置換されていてもよいAr1b、
Ar1b：アリール、
(vii) 基R104bR105bN−[CO]ｍ３−若しくはエステル化されていてもよいカルボキシルで置換されていてもよいHET3、
HET3：含窒素ヘテロ環、
(viii)基R104R105N−[CO]ｍ３−で置換されていてもよいAr1b、又は、
(ix)SO3H）、
R117：(i)Ｈ、又は(ii)Ar1bで置換されていてもよいALK2b)、
（８）エステル化されていてもよいカルボキシルおよび基R1011bR1012bN−[(CO)]ｍ３−からなる群より選択された一以上の置換基で置換されていてもよいAr1b、
R1011b、及びR1012b：同一又は異なって、
(i)Ｈ、
(ii) cALK、
(iii)ハロ、cALK、OH、低級アルキル−Ｏ−若しくはAr1bで置換されていてもよいALK2b、又は、
(iv)ハロで置換されていてもよいAr1b−SO2−、
（９）エステル化されていてもよいカルボキシルで置換されていてもよいHET3、
（１０）ALK2bおよび基R104bR105bN−[CO]ｍ３−からなる群より選択された一以上の置換基で置換されていてもよいHET3−CO−、又は、
(11)シアノ。但し、４−アミノピリジン−３−イル ピペリジン−１−カルボキシレートを除く。以下同様。］、
[2] 一般式(II)で示される[1]記載の化合物、
Figure 0004702361
 ［式（II）中、R1〜R7は[1]と同じ意味を示し、ＴはＣＨ2、ＮＨ、ＮＨＣＨ2、又はＯを示す。ここにおいて、R1〜R3でＴの水素が置換されている場合も含む。以下同様。］、
[3] Ｒ1〜Ｒ3が、同一又は異なって、基［R101−(O)m１］m2−[HOで置換されていてもよいALK1]−(O)n１−、基R102−ALK1−N(R103)−CO−、基R106−ALK3−L1−、基［R107−(O)m１］m2−Ar2−(O)n１−、基［R107−(O)m１］m2−Ar2−N(R103)−CO−、又は基［R108］m2−Ar2−L2−である[2]記載の化合物、
[4] 一般式（ＩII）で示されるピリジル 非芳香族含窒素ヘテロ環−１−カルボン酸エステル誘導体及びその製薬学的に許容される塩、
Figure 0004702361
 [式（III）中の記号は以下の意味を示す。
Ａ環：ベンゼン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロヘプタン環、
又は５〜７員含窒素ヘテロ環、
Ｌ：単結合、低級アルキレン、低級アルケニレン、-Ｎ（Ｒ15）-Ｃ（＝Ｏ）-、-Ｃ（＝Ｏ）-Ｎ（Ｒ15）-、
-（低級アルケニレン）-Ｃ（＝Ｏ）-、-Ｏ-、又は-Ｃ（＝Ｏ）-、
Ｒ15：Ｈ、又は低級アルキル、
Ｘ：ＣＨ、又はＮ、
Ｒ8〜Ｒ10：同一又は異なって、
下記Ｇ群から選択される基、
下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよいアリール、
下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよい含窒素ヘテロアリール、
Ｒ16-（低級アルキレン）-Ｏ-、Ｒ16-（低級アルキレン）-Ｎ（Ｒ15）-、
又はＲ17Ｒ18Ｎ-Ｃ（＝Ｏ）-、
Ｒ16：下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよいアリール、
下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよい含窒素ヘテロアリール、又は３〜８員シクロアルキル、
Ｒ17及びＲ18：同一又は異なって、Ｈ、低級アルキル、又は３〜８員シクロアルキル、
（更に、Ｒ17及びＲ18は、結合しているＮ原子と一体となって、３〜８員含窒素ヘテロ環を形成してもよい。）、
Ｇ群：Ｈ、ハロ、-ＣＮ、-ＣＦ3、低級アルキル、又は-O-低級アルキル、
Ｒ11：Ｈ、低級アルキル、又はオキソ（＝Ｏ）、
Ｒ12〜Ｒ14：同一又は異なって、Ｈ、低級アルキル、-Ｃ（＝Ｏ）-Ｏ-（低級アルキル）、-ＣＯ2Ｈ、
又は-ＣＯＮＨ2 ]、
[5] Ａ環がベンゼン環、シクロヘキサン環、ピペリジン環、又はピペラジン環である[4]記載の化合物、
[6] Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13がＨである[5]記載の化合物、
[7] 一般式（ＩV）で示されるピリジル 非芳香族含窒素ヘテロ環−１−カルボン酸エステル誘導体及びその製薬学的に許容される塩、
Figure 0004702361
 [式（IV）中の記号は以下の意味を示す。
Ａ1環：ベンゼン環、ピペリジン環、又はピペラジン環、
Ｌ1：低級アルキレン、低級アルケニレン、-Ｎ（Ｒ15）-Ｃ（＝Ｏ）-、又は-Ｏ-、
Ｒ15：Ｈ、又は低級アルキル、
Ｒ19： 下記Ｇ群から選択される基、
下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよい含窒素ヘテロアリール、
Ｒ16-（低級アルキレン）-Ｏ-、又はＲ17Ｒ18Ｎ-Ｃ（＝Ｏ）-、
Ｒ16：下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよいアリール、
下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよい含窒素ヘテロアリール、又は３〜８員シクロアルキル、
Ｒ17及びＲ18：同一又は異なって、Ｈ、又は低級アルキル、
（更に、Ｒ17、Ｒ18は、結合しているＮ原子と一体となって、５又は６員含窒素ヘテロ環を形成してもよい。）、
Ｇ群：Ｈ、ハロ、-ＣＮ、-ＣＦ3、低級アルキル、又は-O-低級アルキル、
Ｒ20：Ｈ、-Ｃ（＝Ｏ）-Ｏ-（低級アルキル）、-ＣＯ2Ｈ、又は-ＣＯＮＨ2 ]、
[8] 一般式（V）で示されるピリジル 非芳香族含窒素ヘテロ環−１−カルボン酸エステル誘導体及びその製薬学的に許容される塩、
Figure 0004702361
 [式（V）中の記号は以下の意味を示す。
Ｌ2：低級アルキレン、低級アルケニレン、又は-（低級アルケニレン）-Ｃ（＝Ｏ）-、
Ｒ21： Ｈ、ハロ、-ＣＮ、-ＣＦ3、低級アルキル、又は-O-低級アルキル、
Ｒ22：Ｈ、-Ｃ（＝Ｏ）-Ｏ-（低級アルキル）、-ＣＯ2Ｈ、又は-ＣＯＮＨ2 ]、
[9] ピリジン-3-イル 4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-カルボキシレート、
5-{[(4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ニコチン酸、
5-({[4-(2-フェニルエチル)ピペリジン-1-イル]カルボニル}オキシ)ニコチン酸、
5-[({4-[4-(2-シクロヘキシルエトキシ)フェノキシ]ピペリジン-1-イル}カルボニル)オキシ] ニコチン酸、
5-[({4-[(E)-2-フェニルビニル]ピペリジン-1-イル}カルボニル)オキシ] ニコチン酸、
5-{[(4-{3-[1-(6-メチルピリジン-2-イル)ピペリジン-4-イル]プロピル}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ニコチン酸、
5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-{2-[3-(アミノカルボニル)フェニル]エチル}ピペリジン-1-カルボキシレート、
5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-(2-{3-[(ジメチルアミノ)カルボニル]フェニル}エチル)ピペリジン-1-カルボキシレート、
5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-{2-[3-(ピペリジン-1-イルカルボニル)フェニル]エチル}ピペリジン-1-カルボキシレート、
5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-{2-[3-(ピロリジン-1-イルカルボニル)フェニル]エチル}ピペリジン-1-カルボキシレート、
ピリジン-3-イル 4-[(2E)-3-フェニルプロパ-2-エノイル]ピペラジン-1-カルボキシレート、
ピリジン-3-イル 4-(アニリノカルボニル)ピペリジン-1-カルボキシレート、
5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-(2-フェニルエチル)ピペリジン-1-カルボキシレート、
ピリジン-3-イル 4-(2-フェニルエチル)ピペラジン-1-カルボキシレート、
5-(メトキシカルボニル)ピリジン-3-イル 4-(2-フェニルエチル)ピペラジン-1-カルボキシレート、
5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-[2-(3-フルオロフェニル)エチル]ピペリジン-1-カルボキシレート、
5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-[2-(3-シアノフェニル)エチル]ピペリジン-1-カルボキシレート、
からなる群から選択される[1]記載の化合物、
[10] [1]記載の化合物を有効成分とする医薬組成物、
[11] FAAH阻害剤である[10]記載の医薬組成物、
[12] 頻尿・尿失禁及び/又は過活動膀胱の治療薬である[10]記載の医薬組成物、
[13] 疼痛の治療薬である[10]記載の医薬組成物、
[14] FAAH阻害剤、頻尿・尿失禁及び/又は過活動膀胱の治療薬の製造のための、[1]記載の化合物の使用、
[15] FAAH阻害剤、疼痛の治療薬の製造のための、[1]記載の化合物の使用、
[16] [1]記載の化合物の治療有効量を患者に投与することを含む、頻尿・尿失禁及び/又は過活動膀胱の治療方法、
[17] [1]記載の化合物の治療有効量を患者に投与することを含む、疼痛の治療方法、
[18] (1)(a) 配列番号2、配列番号4、配列番号6、若しくは配列番号8で表されるアミノ酸配列、(b) 配列番号2、配列番号4、配列番号6、若しくは配列番号8で表されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列、(c) 配列番号2、配列番号4、配列番号6、若しくは配列番号8で表されるアミノ酸配列との相同性が70%以上であるアミノ酸配列、或いは(d) 配列番号1、配列番号3、配列番号5、若しくは配列番号7で表されるポリヌクレオチド又はその相補配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされるアミノ酸配列における全部若しくは少なくとも膜貫通領域を含むアミノ末端領域を除いたアミノ酸配列を含み、しかも基質を加水分解することができるポリペプチドに試験物質を接触させる工程、(2)前記ポリペプチドの活性の変化を分析する工程、並びに(3)前記ポリペプチドの活性を阻害する物質を選択する工程を含む、頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤をスクリーニングする方法、
（ここでFAAH若しくは機能的FAAHに接触させる「基質」とは、FAAH若しくは機能的FAAHにより加水分解されるエンドカンナビノイドであれば、いずれのものも用いることが可能である。具体的にはアナンダミド、パルミトイルエタノールアミド、2-アラキドン酸グリセロール、オレアミドなどを基質として用いることができる。また、これらの基質を3Hや14Cなどで標識したもの、若しくは標識したものと未標識のものの混合物を用いることができる。以下同様）、
[19] (1)(a) 配列番号2、配列番号4、配列番号6、若しくは配列番号8で表されるアミノ酸配列、(b) 配列番号2、配列番号4、配列番号6、若しくは配列番号8で表されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列、(c) 配列番号2、配列番号4、配列番号6、若しくは配列番号8で表されるアミノ酸配列との相同性が70%以上であるアミノ酸配列、或いは(d) 配列番号1、配列番号3、配列番号5、若しくは配列番号7で表されるポリヌクレオチド又はその相補配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされるアミノ酸配列における全部若しくは少なくとも膜貫通領域を含むアミノ末端領域を除いたアミノ酸配列を含み、しかも基質を加水分解することができるポリペプチドと、試験物質とを、前記ポリペプチドの基質存在下で接触させる工程、(2)該基質から加水分解産物への変換量を測定する工程、並びに(3)該基質の加水分解を阻害する物質を選択する工程を含む、頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤をスクリーニングする方法、
[20] (1)(a) 配列番号2、配列番号4、配列番号6、若しくは配列番号8で表されるアミノ酸配列、(b) 配列番号2、配列番号4、配列番号6、若しくは配列番号8で表されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列、(c) 配列番号2、配列番号4、配列番号6、若しくは配列番号8で表されるアミノ酸配列との相同性が70%以上であるアミノ酸配列、或いは(d) 配列番号1、配列番号3、配列番号5、若しくは配列番号7で表されるポリヌクレオチド又はその相補配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされるアミノ酸配列における全部若しくは少なくとも膜貫通領域を含むアミノ末端領域を除いたアミノ酸配列を含み、しかも基質を加水分解することができるポリペプチドを発現している細胞若しくは組織、又は該細胞若しくは該組織の溶解液若しくは破砕液と、試験物質とを、前記ポリペプチドの基質存在下で接触させる工程、(2)該基質から加水分解産物への変換量を測定する工程、並びに(3)該基質の加水分解を阻害する物質を選択する工程を含む、頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤をスクリーニングする方法、
[21] (1)脂肪酸アミド加水分解酵素に試験物質を接触させる工程、(2)前記酵素の活性の変化を分析する工程、及び(3)前記酵素の活性を阻害する物質を選択する工程を含む、頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤をスクリーニングする方法、
に関する。
本発明化合物は、実施例438から実施例442の薬理試験において、例えば表６４で示された代表的な化合物で優れたFAAH阻害作用を有すること、実施例441で示された代表的な化合物は頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療薬として有用であること、及び実施例442で示された代表的な化合物は疼痛治療薬として有用であることが確認された。また、本発明化合物は水溶液中での安定性が高く、医薬品として優れた性質を有している。
特許文献２に記載の発明は鎮痛剤、抗不安薬、抗てんかん薬、抗鬱剤、制吐剤、循環器疾患治療剤又は緑内障治療剤に有用であるのに比し、本発明は特許文献２とは異なる頻尿・尿失禁治療剤及び／又は過活動膀胱治療剤に有用であることを見出されたものである。さらに、本発明化合物は優れたFAAH阻害作用を有するため、（１）精神神経疾患（不安・鬱・癲癇等）、（２）脳傷害，神経変性疾患（頭部外傷・脳虚血・認知症（痴呆）等）、（３）免疫，炎症性疾患、（４）嘔吐、（５）摂食障害、（６）過敏性腸症候群・潰瘍性大腸炎、（７）高血圧、（８）緑内障、又は（９）睡眠障害の治療薬として有用である。また、大麻様の副作用や常用性の懸念がないか軽減された化合物である。
更に本発明スクリーニング方法により、大麻様の副作用や常用性の懸念のないか軽減された頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤をFAAHの活性の制御に基づいてスクリーニングすることができる。上記スクリーニング方法により得られた物質やFAAHの活性を阻害する物質は有用な頻尿・尿失禁治療用、過活動膀胱治療用及び/又は疼痛治療用医薬組成物とすることができる。
以下に本発明を詳細に説明する。
以下、本発明化合物につき詳細に説明する。
［定義等］
本明細書の構造式の定義において、特に断わらない限り「低級」なる用語は炭素数が１〜６個の直鎖又は分岐状の炭素鎖を意味する。
「低級アルキル」とは、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル等であり、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルである。
「低級アルケニル」とは、少なくとも１つの二重結合を有する脂肪族炭化水素基を意味し、例えば、ビニル、プロペニル、アリル、イソプロペニル、１，３−ブタジエニル、ヘキセニル等である。
「シクロアルキル」とは、炭素数が３〜１４個の１〜３環系脂肪族飽和炭化水素環基を意味し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロヘプチル、ビシクロオクチル、トリシクロドデカニル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル等が挙げられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルである。
「アリール」とは、炭素数が６〜１４個の１〜３環系芳香族炭化水素環基を意味し、さらに、フェニルにシクロアルキルが縮合していてもよい。例えば、フェニル、インデニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、インダニル、テトラヒドロナフチル等が挙げられ、好ましくは、フェニル、ナフチルである。
「ヘテロ環」とは、Ｎ、Ｓ及びＯから選択されるヘテロ原子を１〜４個含有する４〜１６員の、単環式、２環式又は３環式の飽和又は不飽和環である。このヘテロ環基は架橋又はスピロを有していてもよい。不飽和環には芳香族の環（ヘテロアリール）や非芳香族の環を含む。単環式としては、アゼチジニル、オキセタニル、ピロリジニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリジニル、ピペラジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリダジニル、オキサジアゾリル、テトラゾリルが、二環式としては、インドリル、イソインドリル、３、４−メチレンジオキシフェニル、３、４−エチレンジオキシフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、キノリル、イソキノリル、１，２，３，４−テトラヒドロキノリル、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリル、デカヒドロイソキノリル、キノキサリニル等が、３環式としては、カルバゾリル、アクリジニル、フェノチアジニル等が挙げられる。架橋ヘテロ環基としては、キヌクリジニル、２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプチル、８−アザビシクロ［３．２．１］オクチル、７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル等が挙げられる。スピロ式へテロ環基としては、１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカニル等が挙げられる。
「含窒素ヘテロアリール」とは、上記へテロ環基のうち窒素原子を１〜３個有する、４員〜１０員芳香族の１〜２環系含窒素ヘテロアリールを意味し、例えば、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリル、イソインドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル等が挙げられ、好ましくは、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジル、ベンズイミダゾリル、キノリルである。
「含窒素飽和ヘテロ環基」とは、上記へテロ環基のうち窒素原子を１〜３個有する、３員〜１０員の１又は２環系含窒素ヘテロシクロアルキルを意味し、例えば、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、ヘキサヒドロアゼピニル、１，４−ジアゼピニル、１，４−オキサゼピニル、キヌクリジニル、２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプチル、アザビシクロオクチル（例えば、アザビシクロ［３．２．１］オクチル）、ジアザビシクロオクチル、アザビシクロノニル、アザビシクロデカニル、１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカニル等が挙げられ、好ましくは、ピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、ヘキサヒドロアゼピニル、１，４−ジアゼピニル、１，４−オキサゼピニル、キヌクリジニル、２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプチル、アザビシクロ［３．２．１］オクチルである。
「含窒素ヘテロ環」とは、上記含窒素ヘテロアリール、上記含窒素飽和ヘテロ環基、又は含窒素ヘテロアリールと含窒素ヘテロシクロアルキルとが縮合した基を意味し、好ましくは、ピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、ヘキサヒドロアゼピニル、アザビシクロ［３．２．１］オクチル、１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカニル、イミダゾリル、ピリジル、キノリルである。
「非芳香族含窒素ヘテロ環」とは、上記含窒素ヘテロ環基のうち含窒素ヘテロアリールを除く含窒素飽和ヘテロ環基及び不飽和含窒素ヘテロ環基を意味する。好ましくは５乃至７員の非芳香族含窒素ヘテロ環基が好ましい、
「低級アルキレン」、「低級アルケニレン」、「シクロアルキレン」、「アリーレン」及び「含窒素ヘテロアリーレン」とは、上記低級アルキル、低級アルケニル、シクロアルキル、アリール及び含窒素ヘテロアリールの任意の水素原子を１個除いた２価基である。
「エステル化されたカルボキシル」とは低級アルキル−O−CO−、アリール−低級アルキル−O−CO−、又はＨ2Ｎ−ＣＯ−アリール−低級アルキル−O−CO−である。
「ハロ」とはハロゲン基を意味し、具体的にはフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードが挙げられ、好ましくは、フルオロ、クロロである。
また、「置換されていてもよい」とは、「置換されていない」、あるいは「同一又は異なる１〜５個の置換基で置換されている」ことを意味する。
本発明化合物（Ｉ）は、置換基の種類によっては光学異性体（光学活性体、ジアステレオマー等）又は幾何異性体が存在する。従って本発明化合物（Ｉ）には、これらの光学異性体又は幾何異性体の混合物や単離されたものも含まれる。
また、本発明化合物（Ｉ）は酸付加塩又は塩基との塩のような製薬学的に許容される塩を形成することができる。例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマール酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、炭酸、ピクリン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩；ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基や、メチルアミン、エチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、リジン、オルニチン等の有機塩基との塩を挙げることができる。さらに、本発明化合物（Ｉ）又はその製薬学的に許容されるその塩は水和物、エタノール等の溶媒和物や結晶多形を形成することができる。
さらに、本発明化合物（Ｉ）には、生体内において代謝されて本発明化合物（Ｉ）又はその製薬学的に許容される塩に変換される化合物、いわゆるプロドラッグもすべて含まれる。本発明化合物（Ｉ）のプロドラッグを形成する基としては、Prog. Med. 5:2157-2161(1985)に記載されている基や、広川書店１９９０年刊「医薬品の開発」第７巻分子設計１６３〜１９８頁に記載されている基が挙げられる。具体的には、加水分解、加溶媒分解により、又は生理学的条件の下で本発明における１級アミン又は２級アミン、ＨＯ−、ＨＯ−ＣＯ−等に変換できる基であり、ＨＯ−のプロドラッグとしては、例えば、置換されてもよい低級アルキル−ＣＯ−Ｏ−、置換されてもよいアリール−ＣＯ−Ｏ−、置換されてもよいヘテロアリール−ＣＯ−Ｏ−、ＲＯ−ＣＯ−置換されてもよい低級アルキレン−ＣＯ−Ｏ−（ＲはＨ−又は低級アルキルを示す。以下同様）、ＲＯ−ＣＯ−置換されてもよい低級アルケニレン−ＣＯ−Ｏ−、ＲＯ−ＣＯ−低級アルキレン−Ｏ−低級アルキレン−ＣＯ−Ｏ−、ＲＯ−ＣＯ−ＣＯ−Ｏ−、ＲＯＳ（＝Ｏ）2−置換されてもよい低級アルケニレン−ＣＯ−Ｏ−、フタリジル−Ｏ−、５−メチル−１，３−ジオキソレン−２−オン−４−イル−メチルオキシ等が挙げられる。
本明細書における「頻尿」とは、排尿回数が正常範囲を越えて増加した状態のことをいう。また前記「尿失禁」とは、社会的、衛生的に問題となる不随意の尿漏出状態のことをいう。
本明細書における「過活動膀胱」とは、頻尿及び尿意切迫感といった自覚症状によって診断される症候群のことをいう（「ニューロウロロジー・アンド・ウロダイナミクス（Neurourology and Urodynamics）」、（米国）、2002年、第21巻、p.167-178）。その発症原因として神経障害（例えば神経因性膀胱、脳梗塞に起因するもの）、下部尿路閉塞（例えば前立腺肥大）、加齢などがあり、これらに共通する発症メカニズムとして、カプサイシン感受性求心性神経の活動亢進が考えられている。
頻尿・尿失禁、尿意切迫感などの症状を改善することにより、過活動膀胱を治療することができる。それは、例えば抗コリン薬である塩酸オキシブチニン（日本標準商品分類番号87259；アベンティス ファーマ株式会社）が過活動膀胱の患者に１日3回、一回2〜3 mg投与し頻尿、尿失禁、尿意切迫感などの症状を改善することで過活動膀胱を治療できることからも明らかである。
頻尿・尿失禁治療効果及び/又は過活動膀胱治療効果があることの確認は、当業者に公知の方法、あるいはそれを改良した方法を用いることにより実施することができる。例えば、ラット、モルモット、イヌ等にシクロフォスファミド（CPA）を50〜200 mg投与することにより誘発する病態モデルが当分野においては非常によく用いられる（Ozawaら、The Journal of Urology、第162巻、第2211-2216頁、1999年；Boucherら、The Journal of Urology、第164巻、第203-208頁、2000年）。このモデルは出血性膀胱炎に伴う病態モデルであるが、この頻尿発症機序にカプサイシン感受性求心性神経が関与することから、本モデルは神経因性膀胱を含む各種過活動膀胱に即した病態モデルであると考えられる（Carlo Alberto Maggiら、Journal of the Autonomic Nervous System、第38巻、第201-208頁、1992年）。頻尿状態は有効膀胱容量の減少により確認することができる。この病態モデル動物に対し、有効用量の医薬組成物を経口、腹腔内又は静脈内投与で、単回又は反復投与することにより、有効膀胱容量の増加をもって頻尿・尿失禁治療効果及び/又は過活動膀胱治療効果を確認することができる。
また、本明細書における「疼痛」とは、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、炎症性疼痛等の総称であり、このうち「神経因性疼痛」とは、末梢又は中枢神経機能異常による疼痛を意味し、糖尿病性神経障害の疼痛、癌性疼痛、三叉神経痛、幻肢痛、帯状疱疹後疼痛、又は視床痛等が挙げられる。神経因性疼痛の臨床における主要な症状は、締め付けるような痛み、焼き付けるような痛み、痛覚過敏及び異痛症（アロディニア）等である。
一般的な鎮痛剤である非ステロイド抗炎症薬及びモルヒネ等の麻薬性鎮痛薬は、神経因性疼痛に対して効果が弱いことが知られている。医療現場においては、ガバペンチン等の抗癲癇薬やメキシレチン等の抗不整脈薬が疼痛緩和に利用されるが、その鎮痛効果も充分ではない。
神経因性疼痛治療効果があることの確認は、当業者に公知の方法、あるいはそれを改良した方法を用いることにより実施することができる。例えば、Kim and Chungの方法（Pain、第50巻、第355-363頁、1992年）を一部改変して作成したL5/L6脊髄神経結紮ラットにおいて、触刺激に対する顕著な反応閾値低下（アロディニア）の化合物による改善作用を評価することをもって、神経因性疼痛治療効果を確認することができる。
なお、本発明化合物には、頻尿・尿失禁、過活動膀胱に有効である化合物、疼痛、特に神経因性疼痛に有効である化合物、及びその両者に有効である化合物が含まれる。
［製造法］
本発明化合物及びその製薬学的に許容される塩は、その基本骨格あるいは置換基の種類に基づく特徴を利用し、種々の公知の合成法を適用して製造することができる。
その際,官能基の種類によっては、当該官能基を原料乃至中間体の段階で適当な保護基(容易に当該官能基に転化可能な基)に置き換えておくことが製造技術上効果的な場合がある。このような官能基としては、例えばアミノ基、水酸基又はカルボキシル基等であり、それらの保護基としては、例えばグリーン(Greene)及びウッツ(Wuts)著「Protective Groups in Organic Synthesis(第2版)」に記載の保護基を挙げることができ、これらを反応条件に応じて適宜選択して用いればよい。
このような方法では,当該保護基を導入して反応を行った後、必要に応じて保護基を除去することにより、所望の化合物を得ることができる。
以下、本発明化合物又はその中間体の代表的な製造法を説明する。
(以下の文章中の記号は次の通りである。
DMF: N,N-ジメチルホルムアミド;DMSO:ジメチルスルホキシド;THF:テトラヒドロフラン;TFA:トリフルオロ酢酸;Tol:トルエン;EtOAc:酢酸エチル;DCE:1,2-ジクロロエタン;TEA:トリエチルアミン)
以下に本発明化合物の代表的な製造法について説明するが、これらの製造法に限定されるものではない。
また、本発明化合物中に同様な置換基が当該製造法の反応式中以外の位置に存在している場合は置換基修飾反応により、容易に本発明に包含される化合物を製造できる。
第一製造法(カルバメート化反応)
Figure 0004702361
（式中、Ｘは、本反応において有利な脱離基を意味する。以下同様。）
本反応は、一般式（VＩ）で示されるケトン誘導体とその反応対応量の一般式（VＩＩ）で示されるヒドロキシピリジン誘導体とを反応に不活性な溶媒中、冷却下又は室温下乃至加温下攪拌してエステル化することにより行われる。脱離基Ｘとしては、例えば、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、フェノキシ基、イミダゾリル基等を包含する。不活性溶媒としては、例えばDMF、ジメチルアセトアミド、THF、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエトキシエタン、ベンゼン、Tol又はキシレン等やこれらの混合溶媒が挙げられる。本反応を促進させるために、塩基（例えばナトリウム、水素化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド等）を添加するのが好ましい。
第二製造法(カルバメート化反応）
Figure 0004702361
本反応は一般式（ＶIII）で示される含窒素ヘテロ環化合物とその反応対応量の一般式（ＩX）で示されるピリジン誘導体とを前記反応に不活性な溶媒中、冷却下又は室温乃至加温下攪拌することにより行われる。本反応を促進させるために塩基（例えばナトリウム、水素化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ＴＥＡ、ピリジン等）を添加するのが好ましい。

第三製造法(加水分解反応)
カルボキシル基を有する本発明化合物(I-3)は、エステル化されたカルボキシ基を有する化合物を、加水分解反応により、例えばグリーン(Greene)及びウッツ(Wuts)著「Protective Groups in Organic Synthesis(第2版)」に記載の脱保護反応に準じて行うことができる。
Figure 0004702361
（式中、基ROCO-はエステル化されたカルボキシル基を意味する。以下同様）
第四製造法(アミド化反応)
Figure 0004702361
化合物I-3又はR1がカルボン酸の場合はアミンと、R1がアミンの場合はカルボン酸と種々のアミド化合物が製造できる。含窒素ヘテロ環がピペリジンの場合、カルボン酸若しくはスルホン酸化合物又はそれらの反応性誘導体を使用することにより、種々のアミド化合物が製造できる。反応は縮合剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（WSC）、1,1'-カルボニルビス-1H-イミダゾール（CDI）等）、場合によっては、更に添加剤（例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド（HONSu）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、ジメチルアミノピリジン（DMAP）等）の存在下行うことができる。カルボン酸若しくはスルホン酸化合物の反応性誘導体としては、酸ハライド、酸無水物、活性エステル等が使用できる。反応は、例えば日本化学会編「実験化学講座(第４版)」22巻（1992年）（丸善）等に記載の方法により行うこともできる。
第五製造法(カップリング反応)
Figure 0004702361
（式中の記号は以下の意味を示す。 Ｘはハロゲンあるいは−Ｏ−ＳＯ2ＣＦ3を意味し、Ｙは−Ｂ（ＯＨ）2、ジアルキルホウ素、ジアルコキシホウ素あるいはトリアルキルスズを意味する。また、Ｘ が−Ｂ（ＯＨ）2、ジアルキルホウ素、ジアルコキシホウ素あるいはトリアルキルスズを意味し、Ｙがハロゲンあるいは−Ｏ−ＳＯ2ＣＦ3 を意味しても良い。）
化合物（I-6）と化合物（Ｉ-7）の組み合わせからなる２つの芳香環を、好ましくは遷移金属触媒及び適当な添加剤の存在下反応させ、ビアリール化合物（Ｉ-8）を合成する反応である。代表的な方法としては、丸善１９９１年刊「実験科学講座」第２５巻有機合成ＶＩＩ ３５３〜３６６項、３９６〜４２７項に記載されている方法が挙げられる。遷移金属触媒としては、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム等種々のパラジウム錯体や、ジブロモビス（トリフェニルホスフィン）ニッケルなどの種々のニッケル錯体等を好適に用いることができる。添加剤としてはトリフェニルホスフィン、炭酸ナトリウム、亜鉛等を好適に用いることができるが、適用する方法に応じ適宜選択するのが好ましい。
通常、前記反応は、溶媒中において、室温〜加熱下行われる。また、ここに記載の反応以外でも、ビアリール構造を形成する反応、例えば、適当な遷移金属触媒存在下におけるハロゲン化アリール化合物とアリールグリニャール試薬との反応等を好適に用いることが可能である。
(原料化合物の製造法)
本発明化合物を製造するための原料化合物は既知化合物を所望により、前記製造法記載の反応,あるいは、当業者にとって自明の反応(J.March著,ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY(John WILEY & SONS(1992))(例えば,アシル化、アルキル化、ウレア化、酸化、還元(好ましくはCOMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS 8 REDUCTION (Pergamon Press)(1991))、ハロゲン化反応等)に付すことにより製造できる。
製法（i）
光延反応
原料化合物(X)は、一般式(XI)及び(XII)で表されるアルコールを光延反応に付すことにより合成できる。本反応は、化合物(XI)と(XII)とを、等量から過剰量のトリフェニルホスフィン及びアゾジカルボン酸ジエチル存在下、第一製造法に記載の不活性な溶媒中、冷却下乃至加熱下攪拌しながら行われる。
Figure 0004702361
（式中の記号は以下の通りである。
U：アミノ基の保護基、
ALK3：HOで置換されていてもよいALK1、以下同様。）
製法(ii)
置換反応
本反応はアルキル化反応である。1級アミン、2級アミン、アルコール、チオール、1級アミド及び2級アミド等とその反応対応量の脱離基を有する化合物とを、反応に不活性な溶媒中、等量または一方を過剰量用いて冷却下乃至加熱下攪拌しながら行われる。塩基(例えば炭酸カリウム、炭酸ナトリウム及び炭酸セシウム等の無機塩基又はTEA及びジイソプロピルエチルアミン等の有機塩基、カリウムtert-ブトキシド及びナトリウムtert-ブトキシド等の金属アルコキシド又は水素化ナトリウム及び水素化リチウム等)、添加剤(ヨウ化テトラ-n-ブチルアンモニウム、ヨウ化カリウム又はヨウ化ナトリウム等)の存在下に反応させるのが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。
上述の反応に不活性な溶媒としては、例えばジクロロメタン、DCE、クロロホルム、ベンゼン、Tol、キシレン、エーテル、THF、ジオキサン、EtOAc、エタノール、メタノール、2-プロパノール、アセトニトリル、DMF、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルイミダゾリジノン、DMSO、アセトン、メチルエチルケトン又は水等やこれらの均一系及び不均一系混合溶媒が挙げられるが、種々の反応条件に応じて適宜選択される。
Figure 0004702361
［上記式中の記号は以下の通りである。
Q：O、S、又はNH
Z：脱離基（例えばCl、Br、I、又はOMｓ、等）］
製法(iii)
本製造法は、一般式(XVI)で表されるアルデヒド又はケトン及び一般式(XVII)で表されるWittig試薬若しくはHorner-Emmons試薬とを反応させることにより化合物(XVIII)を製造する方法である。
本反応は、等量から過剰量の塩基(例えばTEA及びジイソプロピルエチルアミン等の有機塩基又は炭酸カリウム、炭酸ナトリウム及び炭酸セシウム等の無機塩基)存在下、化合物(XVI)及び化合物(XVII)を前記の不活性な溶媒中、等量またはいずれかを過剰量用いて、冷却下乃至加熱下攪拌しながら行われる。添加剤(ヨウ化テトラ-n-ブチルアンモニウム又はヨウ化カリウム等)の存在下に反応させるのが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。
Figure 0004702361
Z1：Wittig試薬又はHorner-Emmons試薬に用いられる基（ホスホニウム塩又は亜リン酸ジエステル等
n：０又は１）
[1]本発明のスクリーニング方法
脂肪酸アミド加水分解酵素（fatty acid amide hydrolase;以下FAAHと称する)には、アナンダミド、パルミトイルエタノールアミド，オレアミド、及び/若しくは2-アラキドン酸グリセロールを加水分解する活性を有する酵素が含まれ、同じ分子種として同定されるものである限り、いずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト（GenBankアクセッション番号NM_001441)、マウス（GenBankアクセッション番号NM_010173)、ラット（GenBankアクセッション番号NM_024132)、ブタ（GenBankアクセッション番号AB027132）、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコ、ハムスター、リス、クマ、シカ、サルなど哺乳動物由来のものが含まれる。また、天然のポリペプチドに限定されず、人工的に製造した変異体も含まれる。
（a）配列番号2、配列番号4、配列番号6、若しくは配列番号8で表されるアミノ酸配列における全部若しくは少なくとも膜貫通領域を含むアミノ末端領域を除いたアミノ酸配列を含み、しかもアナンダミド、パルミトイルエタノールアミド、オレアミド、及び/若しくは2-アラキドン酸グリセロールを加水分解することができるポリペプチド；
（b）配列番号2、配列番号4、配列番号6、若しくは配列番号8で表されるアミノ酸配列において、1〜10個、好ましくは１〜7個、更に好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列における全部若しくは少なくとも膜貫通領域を含むアミノ末端領域を除いたアミノ酸配列を含み、しかもアナンダミド、パルミトイルエタノールアミド、オレアミド、及び/若しくは2-アラキドン酸グリセロールを加水分解することができるポリペプチド;
（c）配列番号2、配列番号4、配列番号6、若しくは配列番号8で表されるアミノ酸配列との相同性が70％以上、好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列における全部若しくは膜貫通領域を含むアミノ末端領域を除いたアミノ酸配列を含み、しかもアナンダミド、パルミトイルエタノールアミド、オレアミド、及び/若しくは2-アラキドン酸グリセロールを加水分解することができるポリペプチド;
（d）配列番号1、配列番号3、配列番号5、若しくは配列番号7で表されるポリヌクレオチド又はその相補配列に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされるアミノ酸配列における全部若しくは少なくとも膜貫通領域を含むアミノ末端領域を除いたアミノ酸配列を含み、しかもアナンダミド、パルミトイルエタノールアミド、オレアミド、及び/若しくは2-アラキドン酸グリセロールを加水分解することができるポリペプチド;
について、（a）〜(d)を総称して、以下では「機能的FAAH」と称する。
なお、本明細書における前記「膜貫通領域を含むアミノ末端領域」とは、アミノ末端にある細胞外領域と、細胞外領域と細胞内領域に挟まれた細胞膜に埋め込まれている膜貫通領域を含むアミノ末端領域をいう。膜貫通領域がどこに存在するかは膜蛋白構造予測プログラムTMpred、PSORT、SOSUIなどを用いて、アミノ酸配列から予測することができる。「膜貫通領域を含むアミノ末端領域」は、具体的には、例えば配列番号2の第1番目から第30番目、配列番号6の第1番目から第29番目で表される領域である。配列番号6の第1番目から第29番目で表される領域を除いた配列番号6の第30番目から579番目のアミノ酸で表されるポリペプチドも、前記領域を除いていないポリペプチドと同等の酵素活性を有することが知られている（Matthewら、Biochemistry、第37巻、第15177-15187頁、1998年）。
本明細書における前記「相同性」とは、Clustal V program (HigginsとSharp、Gene、第73巻、第237-244頁、1998年；Thompsonら、Nucleic Acid Res.、第22巻、第4673-7680頁、1994年）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Identitiesを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Pairwise Alignment Parametersとして
K tuple 1
Gap Penalty 3
Window 5
Diagonals Saved 5
本明細書における前記「ストリンジェントな条件」でのハイブリダイゼ−ションとは、非特異的な結合が起こらない条件を意味し、具体的には、例えばハイブリダイゼーションを50% ホルムアミド、5×SSC（0.75 M NaCl、0.075 M クエン酸ナトリウム、pH 7)、5×デンハルト溶液（0.1% フィコール400、0.1% ポリビニルピロリドン、0.1% BSA）、変形サケ精子DNA（50 g/ml）、0.1% SDS、及び10% 硫酸デキストランよりなる溶液中で、37〜42℃の温度条件下、約12〜18時間行い、洗浄溶液（0.2×SSC、0.1% SDS）で必要に応じて予備洗浄を行った後、50〜60℃の温度条件下で洗浄するハイブリダイゼーションをいう。
本明細書における前記「アナンダミド、パルミトイルエタノールアミド、オレアミド、及び／若しくは2-アラキドン酸グリセロールを加水分解する」とは、具体的には、実施例1〜4に記載の方法により、pH 7〜9の緩衝液中で4℃〜37℃で30分間〜90分間の加水分解反応により、アナンダミド（N-arachidonoyl ethanolamine）をアラキドン酸（arachidonic acid）とエタノールアミン（ethanolamine）に、パルミトイルエタノールアミド（N-palmitoyl ethanolamine）をパルミチン酸（palmitic acid）とエタノールアミンに、オレアミド（Cis-9,10-octadecenoamide）をオレイン酸（oleic acid）とアンモニアに、2-アラキドン酸グリセロール（2-arachidonoyl glycerol）をアラキドン酸とグリセロール（glycerol）に分解する反応をいう。
本発明のスクリーニング方法には、(1) FAAH若しくは機能的FAAHに試験物質を接触させる工程、(2) FAAH若しくは機能的FAAHの活性の変化を分析する工程、(3) FAAH若しくは機能的FAAHの活性を阻害する物質を選択する工程により、頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤をスクリーニングする方法が含まれる。
(1) FAAH若しくは機能的FAAHに試験物質を接触させる工程
FAAH若しくは機能的FAAHに試験物質を接触させるには、
a) FAAH若しくは機能的FAAHを発現している細胞若しくは組織
b) FAAH若しくは機能的FAAHをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された形質転換体
c) a)若しくはb)の溶解液若しくは破砕液
d) c)より精製したFAAH若しくは機能的FAAHの精製物
のいずれかに試験物質を添加して一定時間インキュベートしてもよく、或いは
e) 試験物質を投与した実験動物の組織破砕液又は血液を用いてもよい。
a) FAAH若しくは機能的FAAHを発現している細胞若しくは組織
FAAH若しくは機能的FAAHを発現している細胞としては、具体的には、神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、マクロファージ、血小板、マスト細胞、単球、樹状細胞、肝細胞、腎細胞、腸細胞、膵細胞、子宮細胞、胎盤細胞、膀胱細胞、前立腺細胞、角化細胞、及び筋細胞が挙げられる。これらの細胞は、FAAH若しくは機能的FAAHを発現している限り、いずれの種由来のものであってもよく、例えば、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコ、ハムスター、リス、クマ、シカ、サル由来のものなど哺乳動物由来の細胞を用いることができる。
細胞には樹立された細胞株を用いてもよく、動物の組織から剥離し、又は単離した細胞を用いてもよい。樹立された細胞株としては、ヒト膀胱上皮癌由来細胞株5637細胞、ヒト前立腺癌由来細胞株PC-3細胞、ラット好塩基球性白血病細胞株RBL-2H3細胞、ラット神経芽細胞腫株N18TG2細胞、ラット神経膠腫細胞株C6細胞、ラットマクロファージ細胞株J774細胞、ラット副腎髄質由来親クロム性細胞腫株PC-12細胞、ヒト単球様細胞株U937細胞、ヒト乳癌細胞株MCF-7細胞、ヒト乳癌細胞株EFM-19細胞、ヒト大腸癌由来細胞株CaCo-2細胞（以上の細胞株はいずれもAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手可能）、ヒト表皮角化細胞株HaCaT細胞、及びヒト神経芽細胞種株CHP100細胞を用いることができる。好ましくはヒト膀胱上皮癌由来細胞株5637細胞やラット好塩基球性白血病細胞株RBL-2H3細胞を用いることができる。
FAAH若しくは機能的FAAHを発現している組織としては、具体的には、脳、膀胱、前立腺、腎臓、肝臓、精巣、筋肉、血管、膵臓、消化管、肺、子宮、胎盤、皮膚、リンパ球、血小板、マクロファージ、単球、マスト細胞、及び前立腺が挙げられる。好ましくは脳、肝臓、単球を用いることができる。これらの組織はFAAH若しくは機能的FAAHを発現している限り、いずれの種由来のものであってもよく、例えば、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコ、ハムスター、リス、クマ、シカ、サル由来のものなど哺乳動物由来の組織を用いることができる。
細胞及び組織にFAAH若しくは機能的FAAHが発現しているか否かを調べるには、細胞若しくは組織の抽出液を用い、検討対象のポリペプチドを検出できる抗体を使用したウエスタンブロッティング、又は検討対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に検出するプライマーを使用したPCR（Polymerase Chain Reaction）などにより確認することができる。或いは、細胞若しくは組織の溶解液若しくは破砕液をアナンダミド、パルミトイルエタノールアミド、オレアミド、及び/若しくは2-アラキドン酸グリセロールなどの基質と、pH 7〜9の緩衝液中で4℃〜37℃で30分間〜90分間反応させ、これらの基質が加水分解されるか否かを調べることにより確認することができる。
b) FAAH若しくは機能的FAAHをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された形質転換体
FAAH若しくは機能的FAAHをコードするポリヌクレオチドは、既知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに設計し合成したプライマーやプローブを用いて、PCR法やハイブリダイゼーションによるスクリーニングにより、cDNAライブラリーから単離できる。
単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当な発現ベクターに組み込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞に形質移入することができるようになり、宿主細胞において形質移入したポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現させることが可能である。発現ベクターには、宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターを用いることができる他、宿主細胞に応じて適宜選択したベクタープラスミドに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入したものを用いることができる。また組み込んだポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが発現する際にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)やFlag、Hisなどのタグが融合された状態で発現するように特定の配列を導入した発現ベクターを用いることもできる。数種類のポリヌクレオチドで同時に一つの細胞を形質転換する場合は、数種類のポリヌクレオチドが一つの発現ベクターに含まれるように構成してもよく、または各々別々の発現ベクターに含まれるように構成してもよい。或いは、このような構成が染色体DNAに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。
所望のポリヌクレオチドを導入した発現ベクターは、DEAE-デキストラン法（Luthmanら、Nucleic Acids Res.、第11巻、第1295-1308頁、1983年）、リン酸カルシウム-DNA共沈殿法（Grahamら、Virology、第52巻、第456-457頁、1973年）、市販のトランスフェクション試薬であるLipofectamine 2000（Invitrogen社）やFuGENE 6（Roche Molecular Biochemicals社）を用いた方法、及び電気パルス穿孔法（Neumannら、EMBO J.、第1巻、第841-845頁、1982年）等により宿主細胞に取り込ませ、形質転換させることができる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合は、大腸菌をHanahanの方法（Hanahanら、Mol. Biol.、第166巻、第557-580頁、1983年）に従い、CaCl2、MgCl2、又はRbClを共存させてコンピテント細胞に調製し、所望のポリヌクレオチドを導入した発現ベクターを加えることで形質転換させることができる。
c) 前記a)、b)の溶解液若しくは破砕液
細胞の破砕液は、細胞を緩衝液で数回洗浄した後、緩衝液中で摩砕型ホモジナイザーなどを用いて均一になるまで破砕することにより作製できる。組織破砕液は、組織重量の5〜10倍容の氷冷した緩衝液を加え、氷中で摩砕型ホモジナイザーにより均一な溶液になるまで摩砕し、さらに数秒間、超音波破砕することにより作製できる。前記緩衝液としては、Tris緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA）やHepes緩衝液（1 mM EDTA、100 mM NaCl、12.5 mM Hepes、pH 8.0）などを用いることができる。例えば、実施例２６５及び実施例２６６の試験法が挙げられる。 FAAH若しくは機能的FAAHをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された大腸菌の溶解液は、大腸菌を遠心分離により回収し、溶菌緩衝液（例えば、20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、500 mM NaCl、10% Glycerol、0.2 mM EDTA、0.5 mM DTT、10 mM Imidazole、1% n-Octyl-β-D-glucopyranoside）にて溶解することで作製できる。
d) 前記c)より精製したFAAH若しくは機能的FAAHの精製物
FAAH若しくは機能的FAAHの精製物は、a) FAAH若しくは機能的FAAHを発現している細胞若しくは組織、又はb) FAAH若しくは機能的FAAHをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された形質転換体の溶解液若しくは破砕液から、アフィニティークロマトグラフィー、電気クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び分配クロマトグラフィーなどを用いた一般的な方法により精製することができる。
具体的には、FAAH若しくは機能的FAAHを発現している細胞若しくは組織をスクロースを含む溶媒中でホモジネートした後、遠心分離、超高速遠心分離することで、マイクロソーム画分を取得し、Triton-Xを含む溶媒で溶解した後、更に遠心分離することで沈殿物を除いた蛋白質溶解液を高速蛋白液体クロマトグラフィー（FPLC）システム（Pharmacia社）で処理することで、精製することができる（Uedaら、J. Biol. Chem.、第270巻、第23823-23827頁、1995年）。
或いは、Hisタグを融合させたFAAH若しくは機能的FAAHを発現するように形質転換された大腸菌を溶菌緩衝液で溶解し、超音波処理を行った後、遠心分離（例えば、10000×gで20分間）し、得られた上清を溶菌緩衝液にて予め平衡化したHisタグに高い結合力を有するレジンと低温で12時間以上混合し、レジンを洗浄した後、レジンからHisタグを融合させたFAAH若しくは機能的FAAHを溶出させることで、精製することができる。
上記の細胞若しくは組織、上記のように作製した細胞若しくは組織の溶解液若しくは破砕液、又はFAAH若しくは機能的FAAHの精製物に試験物質を接触させるには、それらに試験物質を添加又は非添加して一定時間インキュベートする方法がある。具体的には試験物質をその試験物質の溶解性に応じて適宜選択した蒸留水、ジメチルスルホキシド（DMSO）などの溶解液を用いて溶解し、前記の細胞若しくは組織、それらの溶解液若しくは破砕液、又はFAAH若しくは機能的FAAHの精製物に、0.003 nM〜10 μMになるように添加し、細胞若しくは組織の場合はCO2インキュベーター内で37℃で30〜60分間、それ以外の場合は4℃〜37℃で30〜90分間、インキュベートさせることにより、試験物質と接触させることができる。
e) 試験物質を投与した実験動物の組織破砕液又は血液
実験動物に試験物質を投与することによっても、当該実験動物の組織又は血液にあるFAAH若しくは機能的FAAHに試験物質を接触させることができる。実験動物には、例えばマウス、ラット、イヌなどの哺乳動物を用いることができる。これらの実験動物に試験物質を投与するには、試験物質をその試験物質の性質に応じて通常用いられる担体である生理食塩水やジメチルホルムアミド溶液、10% メチルセルロース溶液などに懸濁、溶解し、例えば経口投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与することができる。投与後組織を摘出し、それらの組織を上記c)に記載の方法により破砕し、組織破砕液を作製することができる。具体的には、例えば、9週齢のラットに試験物質を1〜3 mg/kgで経口投与し、30分後に摘出した脳、肝臓、単球などの組織から組織破砕液を作製することができる。或いは、13〜18ヶ月齢のイヌに試験物質を0.3〜3 mg/kgで静脈内投与し、30分後に摘出した脳、肝臓、単球などの組織から組織破砕液を作製することができる。より具体的には、例えば、実施例26７に記載の方法により組織破砕液を作製することができる。また血液は上記の試験物質を投与した実験動物の心臓や下大動脈などから採取することができる。
(2) FAAH若しくは機能的FAAHの活性の変化を分析する工程
FAAH若しくは機能的FAAHの活性の変化を分析するには、試験物質の接触の有無によるFAAH若しくは機能的FAAHの酵素活性の変化を測定する方法がある。FAAH若しくは機能的FAAHの酵素活性は、FAAH若しくは機能的FAAHに基質を一定時間接触させ、その基質の分解産物の量を測ることにより測定することができる。或いは、実験動物の組織や血液中に含まれるFAAHの生体内基質であるエンドカンナビノイドの量を測ることにより測定することができる。
試験物質依存的な酵素活性の変化を分析するには、試験物質存在下、非存在下でFAAH若しくは機能的FAAHと基質を一定時間接触させ、試験物質非存在下での基質の分解産物の量に対する試験物質存在下での基質の分解産物の量の比を求めることにより分析することができる。
或いは、あらかじめ試験物質と接触させたFAAH若しくは機能的FAAH及び試験物質と接触させなかったFAAH若しくは機能的FAAHに基質を一定時間接触させ、試験物質と接触させなかったFAAH若しくは機能的FAAHによる基質の分解産物の量に対する、あらかじめ試験物質と接触させたFAAH若しくは機能的FAAHによる基質の分解産物の量の比を求めることによっても、試験物質依存的な酵素活性の変化を測定することができる。
更には、実験動物に試験物質を投与する前後の組織又は血液中のエンドカンナビノイドの量を測定し、試験物質投与前のエンドカンナビノイド量に対する試験物質投与後のエンドカンナビノイド量の比を求めることによって、或いは試験物質を投与、非投与の実験動物の組織又は血液中のエンドカンナビノイドの量を測定し、試験物質非投与の実験動物の組織又は血液中のエンドカンナビノイドの量に対する試験物質を投与した実験動物の組織又は血液中のエンドカンナビノイドの量の比を求めることによっても、試験物質依存的な酵素活性の変化を測定することができる。
FAAH若しくは機能的FAAHと基質は、FAAH若しくは機能的FAAHの状態に応じて、以下の条件下で接触させることができる。
前記(1)a)、b)の細胞、組織に発現しているFAAH若しくは機能的FAAHを基質と接触させるには、pH 7〜9の緩衝液中の培養細胞若しくは組織に、前記基質を添加し、CO2インキュベーター内で37℃若しくは室温で好ましくは30〜60分間反応させる方法がある。反応の停止は当該細胞若しくは当該組織を氷上に移し急冷することにより、FAAH阻害剤を十分な濃度で接触させることにより、又はクロロホルムとメタノールの1:1（容量比）溶液を加えることにより行うことができる。これらの細胞、組織を前記(1)c)に記載の方法により、溶解、破砕し、溶解液若しくは破砕液を作製することができる。
前記(1)c)、e)の細胞、組織の溶解液若しくは破砕液中のFAAH若しくは機能的FAAHと基質とを接触させるには、pH 7〜9の緩衝液で、好ましくは蛋白質濃度を10〜100 μg/mlに希釈した溶解液、破砕液に前記基質を添加し、4℃〜37℃の温度条件下、反応させる方法がある。反応時間は添加した酵素量、基質量及び反応温度等の条件に応じて、適宜設定することができる。例えば、室温で反応させる場合には、反応時間を30〜90分間で行うことができる。
前記(1)d)のFAAH若しくは機能的FAAHの精製物を基質と接触させるには、pH 7〜9の緩衝液を用いて希釈した溶解液若しくは破砕液に前記基質を添加し、4℃〜37℃の温度条件下、反応させる方法がある。反応時間は添加した酵素量、基質量及び反応温度等の条件に応じて、適宜設定することができる。例えば、室温で反応させる場合には、反応時間を30〜90分間で行うことができる。
基質の分解産物の量を測定するには、上記の酵素反応液中の未反応の基質と分解産物を分離し、分解産物の量を測定すればよい。未反応基質と分解産物を分離するには、分解産物であるエタノールアミン等が水溶性であることを利用して、例えば、酵素反応液に2倍量のクロロホルムとメタノールの1:1（容量比）溶液を加え撹拌した後、遠心分離することで、上層の水/エタノール層に含まれる分解産物と、下層のクロロホルム層に含まれる未反応基質とに分離することができる。または吸水性のない液体シンチレーションカクテル剤と混合することにより、脂溶性の未反応放射性基質をカクテル剤に取り込ませ、分解産物と未反応基質を分離することができる。或いは、薄層クロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーなどにより、未反応基質と分解産物を分離することができる。
基質に3Hや14Cなどで標識したもの、若しくは標識したものと未標識のものの混合物を用いている場合は、分解産物の量又は未反応基質の量を液体シンチレーションカウンターを用いて測定したり、或いはイメージングプレートにX線潜像として記録させ、イメージングプレート読みとり装置により測定することができる。
基質に未標識のものを用いている場合は、高速液体クロマトグラフィーで205 nmの吸光度をモニターすることにより、分解産物量又は未反応基質の量を測定することができる（Langら、Anal. Biochem.、第238巻、第40-45頁、1996年）。
未反応基質の量を測定した場合、反応前に添加した基質の量から未反応基質の量を差し引くことで、分解産物の量を求めることができる。またFAAH若しくは機能的FAAHの基質の分解産物量から、FAAH若しくは機能的FAAHを含まない緩衝液のみを添加して測定した基質の分解産物量をコントロールとして差し引くことで、FAAH若しくは機能的FAAHによる正味の基質の分解産物量を求めることができる。
組織破砕液中のエンドカンナビノイドの量は、例えば採取した組織をクロロホルムとメタノールと50 mM Tris（pH 8.0）の2:1:1（容量比）溶液中で破砕し、有機層（クロロホルム層）に含まれるエンドカンナビノイドを液体クロマトグラフィー−同位体希釈質量分析（isotope dilution mass spectrometry）により測定することができる（Cravattら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第98巻、第9371-9376頁、2001年）。
血液中のエンドカンナビノイドの量は、例えば以下のように測定することができる。採取した血液から血漿を分離し、血漿に含まれるタンパク質を等量のアセトン（-20℃）を加え遠心することにより除く。窒素ガスを吹き付けることによりアセトンを蒸発させた後、メタノールとクロロホルムの1:2（容量比）溶液を加え、有機層（クロロホルム層）に含まれるエンドカンナビノイドを液体クロマトグラフィー−同位体希釈質量分析により測定することができる（Giuffridaら、Eur. J. Pharmacol.、第408巻、第161-168頁、2000年）。
(3) FAAH若しくは機能的FAAHの活性を阻害する物質を選択する工程
FAAH若しくは機能的FAAHの活性を阻害する物質を選択するには、FAAH若しくは機能的FAAHに試験物質を接触させることにより、試験物質を接触させなかった場合と比較して、基質の分解産物量を減少させるような物質を選択すればよい。
具体的には、FAAH若しくは機能的FAAHに試験物質を接触させた場合、試験物質を接触させなかった場合と比較して、基質の分解産物量が好ましくは1/2倍以下に減少するような物質、すなわち頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤をスクリーニングすることができる。
また、FAAH若しくは機能的FAAHに各種濃度の試験物質を接触させ、試験物質を接触させなかった場合の基質の分解産物量を100%としたときの、各濃度の試験物質を接触させた場合の基質の分解産物量の相対値（%）を求め、又は試験物質を接触させなかった場合の基質の分解産物量を100%とし、既存のFAAH阻害物質を十分な濃度、時間でFAAH若しくは機能的FAAHに接触させた場合の基質の分解産物量を0%としたときの、各濃度の試験物質を接触させた場合の基質の分解産物量の相対値（%）を求め、基質の分解産物量の相対値（%）を縦軸に、試験物質の濃度を横軸として表した阻害曲線で、分解産物量の相対値が50%となる試験物質の濃度（IC50値）を算出し、IC50値が好ましくは1 μM以下、より好ましくは100 nM以下である物質、すなわち頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤をスクリーニングすることができる。例えば実施例438から実施例440の試験が挙げられる。
或いは、実験動物に投与することにより組織若しくは血液中のエンドカンナビノイドの量を投与前と比較して又は非投与の実験動物と比較して、好ましくは1.5倍に増加させるような試験物質を選択することによっても、FAAH若しくは機能的FAAHの活性を阻害する物質、すなわち頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤をスクリーニングすることができる。
[2] 試験物質
本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Terrettら、J. Steele. Tetrahedron、第51巻、第8135-8173頁、1995年）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的、又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
[3] 頻尿・尿失禁治療用、過活動膀胱治療用及び/又は疼痛治療用医薬組成物
本発明の医薬組成物における有効成分としては、FAAH若しくは機能的FAAHを活性を阻害する物質を用いることができ、前記阻害物質は、例えば本発明のスクリーニング方法により選択することができる。
本発明の医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法で得られた物質を有効成分とする医薬組成物に限定されず、FAAH若しくは機能的FAAHの活性を阻害する物質を有効成分とする頻尿・尿失禁治療用、過活動膀胱治療用及び/又は疼痛治療用医薬組成物であれば全て包含され、好ましくは頻尿・尿失禁治療用、過活動膀胱治療用及び/又は疼痛治療用医薬組成物である。
なお、頻尿・尿失禁治療効果、過活動膀胱治療効果及び/又は神経因性疼痛治療効果があることの確認は、前記の通りである。
FAAH若しくは機能的FAAHの活性を阻害する物質である、例えば、DNA、蛋白質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる薬理学上許容される担体、賦形剤、及び/又はその他の添加剤を用いて、医薬組成物として調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が望ましい。
経口投与のための固体組成物においては、1又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口投与のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート80等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重60kgとして）において、1日につき約0.1〜100 mg、好ましくは0.1〜50 mgである。非経口投与の場合、注射剤の形では、1日につき0.01〜50 mg、好ましくは0.01〜10 mgである。
以下,実施例に基づき本発明を更に詳細に説明する。本発明化合物は下記実施例に記載の化合物に限定されるものではない。また原料化合物の製法を参考例に示す。本発明化合物の一部は原料化合物である場合もあり、便宜上、参考例として製法を示したものもある。また、参考例で得られた化合物の化学構造式及び物理化学的性状を表１〜１５に示す。実施例で得られた化合物の化学構造式を表１６〜表３４に、その物理化学的性状を表３５〜６３に示す。さらに表６５〜
７３に本発明の別の化合物の構造を示す。これらは、上記の製造法や下記の参考例・実施例に記載の方法若しくは当業者にとって自明である方法、又はこれらの変法を用いることによって容易に製造することができる。
また、市販のキットを用いる場合には市販品の指示書に従っても実施可能である。
なお、明細書中の略号は,以下の通りである。
Rex:参考例;Ex:実施例;Str:構造式;DAT:物理化学的性状; 1H-NMR δ(ppm), solvent ：核磁気共鳴スペクトル；実施例化合物の物理化学データ中のＤＭＳＯ：ＤＭＳＯ-d6；MS m/z:質量分析値；Com：化合物；NC：シアノ；Ph:フェニル;Me:メチル;diMe:ジメチル;Et:エチル;Pr:プロピル;iPr:イソプロピル;Bu：ブチル；tBu：tert-ブチル；iBu:イソブチル;Pen:ペンチル;Hex：ヘキシル；Hep：ヘプチル；Oct：オクチル；cPr:シクロプロピル;cPen：シクロペンチル；cHex：シクロヘキシル；cHep：シクロヘプチル；cOct：シクロオクチル；Ac:アセチル;Cl:クロロ;diCl:ジクロロ;CN:シアノ;F:フルオロ;diF:ジフルオロ;FPh：フルオロフェニル；NCPh：シアノフェニル；diFPh：ジフルオロフェニル；O2N:ニトロ;MeO:メトキシ;diMeO:ジメトキシ;Br:ブロモ;diBr:ジブロモ;BrPh：ブロモフェニル； F3C:トリフルオロメチル;AcO:アセトキシ;MeOCO又はCOOMe:メトキシカルボニル;tBuOCO又はＣＯＯtBu：tert-ブトキシカルボニル；HO：ヒドロキシ；HOPh：ヒドロキシフェニル； H2N:アミノ;PhCONH:ベンゾイルアミノ;EtCONH:エチルカルボニルアミノ;Me2N:ジメチルアミノ；Et2N:ジエチルアミノ; BIP２：２−ビフェニル; BIP３：３−ビフェニル; BIP４：４−ビフェニル; BIP５：５−ビフェニル; BIP６：６−ビフェニル; Thiop２:チオフェン−２−イル; Thiop３:チオフェン−３−イル; Thiop４:チオフェン−４−イル; Thiop５:チオフェン−５−イル; PYRR1：ピロリジン−１−イル；PYRR２：ピロリジン−２−イル；PYRR３：ピロリジン−３−イル；PYRR４：ピロリジン−４−イル；PYRR５：ピロリジン−５−イル；Py2:ピリジン−２−イル;Py3:ピリジン-3-イル;Py4:ピリジン-4-イル;Py5:ピリジン-5-イル;IM１:イミダゾール−１−イル;IM２:イミダゾール−２−イル;IM３:イミダゾール−３−イル;IM４:イミダゾール−４−イル;BenzIM１：ベンズイミダゾール−１−イル；BenzIM２：ベンズイミダゾール−２−イル；BenzIM３：ベンズイミダゾール−３−イル；BenzIM４：ベンズイミダゾール−４−イル；BenzIM５：ベンズイミダゾール−５−イル；BenzIM６：ベンズイミダゾール−６−イル；Pyrazi１:ピラジン−１−イル; Pyrazi２:ピラジン−２−イル; Pyrazi３:ピラジン−３−イル; Pyrazi４:ピラジン−４−イル; Pyrazi５:ピラジン−５−イル; Pyrazi６:ピラジン−６−イル;PIPE１:ピペリジン−１−イル;PIPE２:ピペリジン−２−イル;PIPE３:ピペリジン−３−イル;PIPE４:ピペリジン−４−イル;PIPE５:ピペリジン−５−イル;PIPE６:ピペリジン−６−イル;PIPERA：ピペラジン; PIPERA１：ピペラジン−１−イル; PIPERA２：ピペラジン−２−イル; PIPERA３：ピペラジン−３−イル; PIPERA４：ピペラジン−４−イル; PIPERA５：ピペラジン−５−イル; Pyrazo１:ピラゾール−１−イル; Pyrazo２:ピラゾール−２−イル; Pyrazo３:ピラゾール−３−イル; Pyrazo４:ピラゾール−４−イル; Pyrazo５:ピラゾール−５−イル;Mo:モルホリン; Mo２:モルホリン−２−イル; Mo３:モルホリン−３−イル; Mo４:モルホリン−４−イル; Mo５:モルホリン−５−イル;Azep：アゼピン；Azep１：アゼピン−１−イル；Azep２：アゼピン−２−イル；Azep３：アゼピン−３−イル；Azep４：アゼピン−４−イル；Thiaz２:チアゾール−２−イル；Thiaz３:チアゾール−３−イル；Thiaz４:チアゾール−４−イル；Thiaz５:チアゾール−５−イル; QUI1:キノリン−１−イル; QUI２:キノリン−２−イル; QUI３:キノリン−３−イル; QUI４:キノリン−４−イル; QUI５:キノリン−５−イル; QUI６:キノリン−６−イル; QUI７:キノリン−７−イル; QUI８:キノリン−８−イル; ISOQUI２：イソキノリン−２−イル；ISOQUI３：イソキノリン−３−イル；ISOQUI４：イソキノリン−４−イル；ISOQUI５：イソキノリン−５−イル；ISOQUI６：イソキノリン−６−イル；ISOQUI７：イソキノリン−７−イル；ISOQUI８：イソキノリン−８−イル；NAPH1：ナフタレン−１−イル；NAPH２：ナフタレン−２−イル；NAPH３：ナフタレン−３−イル；NAPH４：ナフタレン−４−イル；NAPH５：ナフタレン−５−イル； TEA:トリエチルアミン; Sal:付加塩; HCl:塩酸塩; oxal:シュウ酸塩; fum：フマル酸塩；p-tol：p−トルエンスルホン酸塩
参考例１
tert-ブチル-4-(ヒドロキシメチル)ピペリジン-1-カルボキシレート（1.57g）とトリフェニルホスフィン（1.70g）を含むTHF（15ml）溶液中に、フェノール（471mg）とジエチルアゾジカルボキシレート（2.83g、40%Tol溶液）を含むTHF（10ml）溶液を0℃にて滴下し、室温にて24時間攪拌した。反応溶液に水（40 ml）を加え、EtOAcで抽出し、有機層を1M水酸化ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝4：1（V/V））で精製して、無色油状物（1.14g）を得た。得られた化合物をEtOAcに溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（9.6ml）を加え、室温にて５時間攪拌し、無色粉末の4-(フェノキシメチル)ピペリジン 塩酸塩（680mg）を得た。
参考例１と同様にして参考例2〜27の化合物を得た。
参考例 28
3-ブロモベンズアミド（3.0g）と(3-ヒドロキシフェニル)ボロン酸（2.27g）を含むジメトキシエタン（50ml）溶液中に、水（10ml）、炭酸ナトリウム（4.76g）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（866mg）を順次添加した後、60℃にて24時間加熱した。反応溶液を冷却後、EtOAcにて希釈し、有機層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；EtOAc）で精製して、淡黄色粉末（2.74g）を得た。得られた化合物を用いて、参考例１と同様にして参考例 28の化合物を得た。
参考例 29
tert-ブチル-4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシレート（12g）とトリフェニルホスフィン（16g）を含むTHF（80ml）溶液中に、4-(ベンジルオキシ)フェノール（8.0g）とジエチルアゾジカルボキシレート（26ml、40%Tol溶液）を含むTHF（80ml）溶液を0℃にて滴下し、室温にて24時間攪拌した。反応溶液に水（40 ml）を加え、EtOAcで抽出し、有機層を1M水酸化ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝8：1（V/V））で精製して、無色油状物（12.4g）を得た。
得られた化合物（5.18g）を含むエタノール（100ml）溶液に10%パラジウム−カーボン（触媒量）を添加し、水素ガス雰囲気下、常温常圧にて16時間攪拌した。触媒を濾去し、得られた濾液を減圧濃縮して、淡褐色固体（4.0g）を得た。
得られた化合物（4.0g）を含むアセトニトリル（100ml）溶液に、1-(ブロモメチル)-3-フルオロベンゼン（2.5ml）と炭酸カリウム（2.8g）を添加し、80℃にて22時間加熱した。固形物を濾去後、得られた濾液を減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝8：1（V/V））で精製して、無色固体（5.15g）を得た。
得られた化合物（5.15g）をEtOAc（20ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（20ml）を加え、室温にて５時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残留物を水に溶解させ、1M水酸化ナトリウム水溶液にて中和し、得られてくる固体を乾燥して、4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン（3.70g）を得た。
参考例 29と同様にして、参考例 30〜36の化合物を得た。
参考例 37
tert-ブチル-4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシレート（4.6g）、トリフェニルホスフィン（6.1g）、6-クロロ-2-ピリジノール（2.0g）を含むTHF（30ml）溶液中に、ジエチルアゾジカルボキシレート（11ml、40%Tol溶液）を0℃にて滴下し、室温にて24時間攪拌した。反応溶液に水を加え、EtOAcで抽出し、有機層を1M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝10：1（V/V））で精製して、tert -ブチル4-[(6-クロロ-2-ピリジニル)オキシ]-1-ピペリジンカルボキシレート（3.8g）を得た。
tert -ブチル4-[(6-クロロ-2-ピリジニル)オキシ]-1-ピペリジンカルボキシレート（500mg）を含むDMF（5ml）溶液に、(3-フルオロフェニル)メタノール（220mg）とカリウム-tert-ブトキシドを（200mg）を添加し、100℃で30分加熱後、さらに(3-フルオロフェニル)メタノール（220mg）とカリウム- tert -ブトキシドを（200mg）を加え110℃で30分加熱した。反応溶液に水を加え、EtOAcで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝10：1（V/V））で精製して、白色固体（420mg）を得た。
得られた化合物（400mg）をEtOAc（5ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（3ml）を加え、室温にて終夜攪拌した。析出した固体を濾取し、EtOAcで洗浄後、減圧下乾燥し2-[(3-フルオロベンジル)オキシ]-6-(4-ピペリジンオキシ)ピリジン塩酸塩（310mg）を得た。
参考例 37と同様にして、参考例 38の化合物を得た。
参考例 39
4-[(6-クロロ-2-ピリジニル)オキシ]-1-ピペリジンカルボン酸tert-ブチル（500mg）と[3-(アミノカルボニル)フェニル]ボロン酸（320mg）を含むTol（10ml）溶液中に、水（4ml）、炭酸ナトリウム（610mg）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（110mg）を順次添加した後、100℃にて終夜加熱した。反応溶液を冷却後、EtOAcにて希釈し、有機層を無水炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝1：2（V/V））で精製して、淡黄色粉末（590mg）を得た。
得られた化合物（590mg）をEtOAc（5ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（5ml）を加え、室温にて終夜攪拌した。析出した固体を濾取し、EtOAcで洗浄後、減圧下乾燥し3-[6-(4-ピペリジニルオキシ)-2-ピリジニル]ベンズアミド塩酸塩（440mg）を得た。
参考例 40
tert-ブチル-4-(2-ヒドロキシエチル)ピペリジン-1-カルボキシレート（5.0g）を含む塩化メチレン（80ml）溶液中に、ＴＥＡ（4.6ml）とメタンスルホニルクロライド（2.0ml）を0℃にて滴下し、室温にて3時間攪拌した。反応溶液に炭酸水素ナトリウム水溶液とメタノールを加え、室温にて30分間攪拌した。クロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝10：1（V/V））で精製して、無色固体（6.1g）を得た。
得られた化合物（2.0g）とフェニルプロパノール（1.3g）を含むDMF（80ml）溶液中に、水素化ナトリウム（541mg、60% in oil）を0℃にて添加し、100℃にて20時間加熱した。反応溶液を冷却後、水を加え、EtOAcにて抽出した。1M塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝20：1（V/V））で精製して、黄色油状物（1.96g）を得た。
得られた化合物（1.96g）をEtOAc（5ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（10ml）を加え、室温にて2時間攪拌した。得られてくる固体を濾取、乾燥して、4-[2-(3-フェニルプロポキシ)エチル]ピペリジン塩酸塩（1.55g）を得た。
参考例 41
tert-ブチル-4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシレート（3.02g）を含むTHF（40ml）溶液中に、ＴＥＡ（2.30ml）とメタンスルホニルクロライド（1.22ml）を0℃にて滴下し、室温にて1時間攪拌した。反応溶液にEtOAc（50ml）と水（50ml）を加え、有機層を5%クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、淡橙色油状物を得た。得られた油状物をDMA（25ml）に溶解させ、炭酸セシウム（5.38g）と4-スルファニルフェノール（1.89g）を添加し、50℃にて2時間加熱した。反応溶液を冷却後、水を加え、EtOAcにて抽出した。有機層を1M塩酸水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝4：1（V/V））で精製して、無色粉末のtert-ブチル-4-[(4-ヒドロキシフェニル)スルファニル]ピペリジン-1-カルボキシレート（3.40g）を得た。
tert-ブチル-4-[(4-ヒドロキシフェニル)スルファニル]ピペリジン-1-カルボキシレート（1.00g）を含むアセトニトリル（15ml）溶液に、1-(ブロモメチル)-3-フルオロベンゼン（0.436ml）と炭酸カリウム（670mg）を添加し、80℃にて2時間加熱した。反応溶液を冷却後、飽和食塩水を加え、クロロホルムにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧留去して得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝8：1（V/V））で精製して、無色粉末のtert-ブチル-4-({4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}スルファニル)ピペリジン-1-カルボキシレート（1.50g）を得た。
tert-ブチル-4-({4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}スルファニル)ピペリジン-1-カルボキシレート（501mg）をEtOAc（5ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（3ml）を加え、室温にて3時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残留物を水に溶解させ、1M水酸化ナトリウム水溶液にて中和し、クロロホルムにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧留去して、4-({4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}スルファニル)ピペリジン（328mg）を得た。
参考例 41と同様にして参考例 42を得た。
参考例 43
参考例 41の方法で得られたtert-ブチル-4-({4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}スルファニル)ピペリジン-1-カルボキシレート（1.50g）を含むクロロホルム（20ml）溶液に、mCPBA（1.64g）を0℃にて添加し、室温にて17時間攪拌した。固形物を濾過後、濾液に10%硫酸ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムにて抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝2：1（V/V））で精製して、無色粉末（1.58g）を得た。得られた粉末（1.56g）をEtOAc（10ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（8ml）を加え、室温にて2時間攪拌した後、固形物を濾取し、EtOAcにて洗浄して、無色粉末の4-({4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}スルフォニル)ピペリジン塩酸塩（1.13g）を得た。
参考例 43と同様にして参考例 44〜46を得た。
参考例 47
シクロヘキシルメタノールとトリフェニルホスフィン（629mg）を含むTHF（5ml）溶液中に参考例 41の方法で得られたtert-ブチル-4-[(4-ヒドロキシフェニル)スルファニル]ピペリジン-1-カルボキシレート（495mg）とジエチルアゾジカルボキシレート（1.04g、40%Tol溶液）を含むTHF（5ml）溶液を0℃にて滴下し、室温にて24時間攪拌した。反応溶液に水（40 ml）を加え、EtOAcで抽出し、有機層を1M水酸化ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝9：1（V/V））で精製して、淡黄色油状物のtert-ブチル‐4-{[4-(シクロヘキシルメトキシ)フェニル]スルフォニル}ピペリジン-1-カルボキシレート（744mg）を得た。
得られたtert-ブチル‐4-{[4-(シクロヘキシルメトキシ)フェニル]スルフォニル}ピペリジン-1-カルボキシレート（635mg）をEtOAc（7ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（3.6ml）を加え、室温にて6時間攪拌した後、固形物を濾取し、EtOAcにて洗浄して、無色粉末の4-{[4-(シクロヘキシルメトキシ)フェニル]スルフォニル}ピペリジン塩酸塩（485mg）を得た。
参考例 47と同様にして参考例 48を得た。
参考例 49
tert-ブチル-4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシレート（1.5g）を含むTHF（40ml）溶液中に、水素化ナトリウム（355mg、60% in oil）とベンジルブロミド（1.0ml）を添加し、60℃にて13時間加熱した。反応溶液を冷却後、水を加え、EtOAcにて抽出した。1M塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝10：1（V/V））で精製して、無色油状物（1.91g）を得た。
得られた化合物（1.8g）をEtOAc（5ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（15ml）を加え、室温にて3時間攪拌した。反応溶液をイソプロピルエーテルにて希釈し、得られてくる固体を濾取、乾燥して、4-(ベンジルオキシ)ピペリジン塩酸塩（1.32g）を得た。
参考例 49と同様にして、参考例 50〜53の化合物を得た。
参考例 54
(3-フルオロフェニル)メタノール（730mg）、トリフェニルホスフィン（1.5g）、6-クロロ-3-ピリジノール（500mg）を含むTHF（10ml）溶液中に、ジエチルアゾジカルボキシレート（2.6ml、40%Tol溶液）を0℃にて滴下し、室温にて24時間攪拌した。反応溶液をEtOAcで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝8：1（V/V））で精製して、白色固体（810mg）を得た。
得られた白色個体（800mg）を含むDMF（10ml）溶液に、tert-ブチル-4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシレート（1.0g）とカリウム-tert-ブトキシドを（570mg）を加え130℃で1時間加熱した後、カリウム-tert-ブトキシドを（400mg）を加え130℃でさらに1時間加熱した。反応溶液を室温にまで冷却後、EtOAcで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝7：1（V/V））で精製して、白色固体（350mg）を得た。
得られた化合物（345mg）をEtOAc（3ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（2ml）を加え、室温にて終夜攪拌した。析出した固体を濾取し、EtOAcで洗浄後、減圧下乾燥し6-[(3-フルオロベンジル)オキシ]-2-(4-ピペリジンオキシ)ピリジン塩酸塩（260mg）を得た。
参考例 55
[1-(tert-ブトキシカルボニル)ピペリジン-4-イル]酢酸(0.60g)をジメチルホルムアミド(12ml)に溶解させ、1-[3‐(ジメチルアミノ)プロピル]‐3‐エチルカルボジイミド塩酸塩(0.89g)、1‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.50g）および、ベンジルアミン(0.40g)を加え、室温にて15時間かきまぜた。反応溶液に水を加えてさらに1時間かきまぜたのち、EtOAcと炭酸水素ナトリウム溶液を加えて分液し、有機層を0.5M 塩酸、飽和食塩水にて順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝１：2（V/V））で精製して、無色粉末(0.69ｇ)を得た。
得られた化合物(0.69g)をEtOAc（10ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（2.2ml）を加え、室温にて20時間攪拌した。反応溶液を濃縮乾固し、N-ベンジル-2-ピペリジン-4-イルアセトアミド塩酸塩(0.62g)を得た。
参考例 56
りん酸（7ml）と五酸化二りん（14g）を150℃にて30分間加熱した中に、N-メチルベンゼン-1,2-ジアミン（1.3g）と4-ピペリジン-4-イルブタノイック酸塩酸塩（1.5g）を添加し、120℃にて3時間加熱した。反応溶液を水中に注ぎ、水酸化ナトリウム水溶液にて中和後、クロロホルムにて抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：アンモニア水＝10：1：0.1（V/V））で精製して、1-メチル-2-(3-ピペリジン-4-イルプロピル)-1H-ベンズイミダゾール（1.61g）を得た。
参考例 57及び参考例 58
[4-(メトキシカルボニル)ベンジル](トリフェニル)ホスホニウム ブロミド（7.51g）を含むTHF（30ml）溶液中に、カリウムtert-ブトキシド（1.72g）を0℃にて添加し、1時間攪拌した。反応溶液中に、4-フォルミルピペリジン-1-カルボン酸 tert-ブチルエステル（Beilstein Registry No.7704210、2.96g）を含むTHF（20ml）溶液を0℃にて滴下し、14時間攪拌した。反応溶液に水を加え、EtOAcにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝9：1（V/V））で精製して、黄色油状物（3.77g）を得た。
得られた化合物（3.75g）をメタノール（20ml）とTHF（10ml）に溶解させ、1M水酸化ナトリウム水溶液（16.3ml）を添加し、50℃にて4時間加熱した。反応溶液を冷却後、溶媒を減圧留去した。1M塩酸塩を加えて酸性にして析出してくる固形物を濾取し、水で洗浄して、淡褐色粉末（2.82g）を得た。
得られた化合物（2.80g）を含むDMF（30ml）溶液中に、塩化アンモニウム（2.26g）、1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(3.24g)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（1.14g）、ＴＥＡ（5.88ml）を添加し、室温にて32時間攪拌した。反応溶液に水を加え、析出してくる固形物を濾取し、水で洗浄して、淡褐色粉末（2.61g）を得た。
得られた化合物（2.58g）をEtOAc（15ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（15ml）を加え、室温にて8時間攪拌した。得られてくる固体を濾取し、EtOAcで洗浄後、乾燥して、4-[(E)-2-ピペリジン-4-イルビニル]ベンズアミド塩酸塩（1.92g）を得た(参考例 57)
4-[(E)-2-ピペリジン-4-イルビニル]ベンズアミド塩酸塩（800mg）を含むメタノール（15ml）−水（5ml）溶液に、10%パラジウム−カーボン（触媒量）を添加し、水素ガス雰囲気下、常温常圧にて4時間攪拌した。触媒を濾去し、得られた濾液を減圧濃縮した。得られた固体物をエタノール−アセトニトリルから再結晶し、4-(2-ピペリジン-4-イルエチル)ベンズアミド塩酸塩（451mg）を得た(参考例 58)。
参考例 59
tert-ブチル4-(4-アミノフェノキシ)-1-ピペリジンカルボキシレート（2.0g：Beilstein Registry No. 9262581）、シクロヘキサンカルボアルデヒド(770mg)、酢酸1.25gを含むジクロロメタン（30ml）溶液中に、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（2.2g）を0℃で加え、室温にて2時間攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた固形物をEtOAcヘキサンで再結晶し、淡褐色結晶（2.0g）を得た。
得られた結晶（970mg）、37%ホルムアルデヒド水溶液（0.94ml）、酢酸0.75gを含むジクロロメタン（20ml）溶液に、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（1.1g）を0℃で加え、室温にて2時間攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた油状物をEtOAc（15ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（5ml）を加え、室温にて終夜攪拌した。析出した固体を濾取し、EtOAcで洗浄後、減圧下乾燥しN-(シクロヘキシルメチル)-N-メチル-4-(4-ピペリジニルオキシ)アニリン２塩酸塩（820mg）を得た。
参考例 60
ベンジル3-ヨードフェニルエーテル(1.1g)、tert-ブチル1-ピペラジンカルボキシレート（640mg）、ナトリウムtert-ブトキシド（500mg）、2-ビフェニリル（ジシクロヘキシル）ホスフィン（70mg）を含むTol（10ml）溶液中に、アルゴン気流下トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(95mg)を加え、80℃にて1時間加熱した。反応溶液を冷却後、EtOAcにて希釈し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝5：1（V/V））で精製して、褐色固体（950mg）を得た。
得られた固体（940mg）をEtOAc（5ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（5ml）を加え、室温にて終夜攪拌した。析出した固体を濾取し、EtOAcで洗浄後、減圧下乾燥し1-[3-(ベンジルオキシ)フェニル]ピペラジン２塩酸塩（840mg）を得た。
参考例 61
4-(ベンジルオキシ)-2-クロロフェノール（1.7g：Beilstein Registry No. 6582932）、トリフェニルホスフィン（2.8g）、tert-ブチル-4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシレート（2.1g）を含むTHF（60ml）溶液中に、ジエチルアゾジカルボキシレート（4.8ml、40%Tol溶液）を0℃にて滴下し、室温にて24時間攪拌した。反応溶液をEtOAcで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝5：1（V/V））で精製して、白色固体（2.3g）を得た。
得られた化合物（1.0g）をEtOAc（10ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（10ml）を加え、室温にて終夜攪拌した。析出した固体を濾取し、EtOAcで洗浄後、減圧下乾燥し4-[4-(ベンジルオキシ)-2-クロロフェノキシ]ピペリジン塩酸塩（690mg）を得た。
参考例 62
４-ヒドロキシベンゼンスルホン酸 ナトリウム塩(1.00g)のDMF(5ml)溶液中に、チオニルクロライド(10ml)を滴下した後、65℃で3時間過熱した。反応溶液を冷却後、Tol(10ml)を加え、溶媒を減圧留去した後、水を加え、クロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去することにより、無色固体(587mg)を得た。
1-tert-ブトキシカルボニルピペリジン(672mg)とピリジン(0.58ml)を含むアセトニトリル(10ml)溶液に、０℃で先ほど得られた化合物(579mg)のアセトニトリル(10ml)溶液を添加し、室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、Tol(10ml)を加え共沸した後、水を加え、EtOAcで抽出し、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去することにより、無色固体(0.41g)を得た。
得られた化合物(0.41g)および1-(ブロモメチル)-3-フルオロベンゼン(340mg)を含むアセトニトリル(20ml)溶液に、炭酸カリウム(248mg)を添加し、80℃で3時間過熱した。固形物を濾去後、得られた濾液を減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝5：1（V/V））で精製して、無色固体（469mg）を得た。
得られた化合物(460mg)をEtOAc(5ml)とTHF(5ml)の混合溶液に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（20ml）を加え、70℃にて3時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残留物を水に溶解させ、1M水酸化ナトリウム水溶液にて中和し、得られてくる固体を乾燥して、4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]ベンゼンスルホニル}ピペラジン（304mg）を得た。
参考例 63
4-(ベンジルオキシ)-3-クロロフェノール（1.2g：Beilstein Registry No. 5527577）、トリフェニルホスフィン（1.9g）、tert-ブチル-4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシレート（1.5g）を含むTHF（30ml）溶液中に、ジエチルアゾジカルボキシレート（3.3ml、40%Tol溶液）を0℃にて滴下し、室温にて24時間攪拌した。反応溶液をEtOAcで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝5：1（V/V））で精製して、白色固体（1.7g）を得た。
得られた化合物（1.6g）をEtOAc（20ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（15ml）を加え、室温にて終夜攪拌した。析出した固体を濾取し、EtOAcで洗浄後、減圧下乾燥し4-[4-(ベンジルオキシ)-3-クロロフェノキシ]ピペリジン塩酸塩（1.3g）を得た。
参考例 64
tert-ブチル4-(4-アミノフェノキシ)-1-ピペリジンカルボキシレート（4.0g：Beilstein Registry No. 9262581）を含むピリジン（30ml）溶液中に、3-フルオロベンゼンスルホニルクロリド（3.2g）を0℃で加え、室温にて終夜攪拌した。溶媒を減圧留去後、クロロホルムで希釈し、有機層を10%クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝60：1（V/V））で精製して、白色固形物（5.3g）を得た。
得られた化合物（700mg）を含むアセトニトリル（10ml）溶液に、炭酸カリウム（280mg）、ヨウ化メチル（0.28ml）を加え、50℃にて3時間攪拌した。反応溶液をEtOAcで希釈し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝3：1（V/V））で精製して、無色油状物（700mg）を得た。
得られた油状物（700mg）をEtOAc（10ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（5ml）を加え、室温にて終夜攪拌した。析出した固体を濾取し、EtOAcで洗浄後、減圧下乾燥し3-フルオロ-N-メチル-N-[4-(4-ピペリジニルオキシ)フェニル]ベンゼンスルホンアミド塩酸塩（480mg）を得た。
参考例 65
1-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-4-(tert-ブトキシカルボニル)-2-ピペリジンカルボン酸（1.0g）を含むDMF（10ml）溶液に1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(630mg)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（440mg）を加え室温で1時間攪拌後、濃アンモニア水(2ml)を加え室温で3時間攪拌した。反応溶液に水を加え、析出した固体を濾取し、水で洗浄後、減圧下乾燥し、無色固形物（870mg）を得た。
得られた固形物（860mg）をEtOAc（10ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（5ml）を加え、室温にて終夜攪拌した。析出した固体を濾取し、EtOAcで洗浄後、減圧下乾燥しベンジル2-(アミノカルボニル)-1-ピペラジンカルボキシレート塩酸塩（700mg）を得た。
参考例 66
メチル 4-(ヒドロキシメチル)ベンゾエートを含むアセトニトリル（20ml）溶液中に、ピリジン（1.62ml）と4-ニトロフェニル クロリドカルボネート（2.22g）を0℃にて添加し、室温にて2時間攪拌した。反応溶液に5%クエン酸水溶液を加え、EtOAcにて抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝4：1（V/V））で精製して、淡褐色粉末（2.39g）を得た。
得られた化合物（2.37g）を含むアセトニトリル（30ml）溶液中に、tert-ブチル-ピペリジン-1-カルボキシレート（1.47g）を添加し、室温にて8時間攪拌した。反応溶液をEtOAcで希釈し、0.5M水酸化ナトリウム水溶液にて洗浄した。有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝2：1（V/V））で精製して、無色固体（3.32g）を得た。
得られた化合物（3.30g）を含むTHF（30ml）溶液中に、メタノール（0.34ml）と1M水酸化ナトリウム水溶液（8.52ml）を加え、室温にて26時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、残留物に1M塩酸水溶液を加え、クロロホルムにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残留物をヘキサン−EtOAcより再結晶し、無色粉末（2.37g）を得た。
得られた化合物（729mg）を含むDMF（10ml）溶液中に、塩化アンモニウム（321mg）、1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩767mg)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（270mg）、ＴＥＡ（0.83ml）を添加し、室温にて3時間攪拌した。反応溶液に水を加え、析出してくる固形物を濾取し、水で洗浄して、淡褐色粉末（722mg）を得た。
得られた化合物（700mg）をEtOAc（6ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（4.8ml）を加え、室温にて3時間攪拌した。得られてくる固体を濾取し、EtOAcで洗浄後、乾燥して、4-(アミノカルボニル)ベンジル ピペリジン-1-カルボキシレート塩酸塩（541mg）を得た。
参考例 67
シクロヘキシルメタノール(510mg)とトリフェニルホスフィン（1.18g）を含むTHF（5ml）溶液中に、4-ヒドロキシ安息香酸メチル（460mg）とジエチルアゾジカルボキシレート（0.71ml）を含むTHF（5ml）溶液を0℃にて滴下し、室温にて24時間攪拌した。反応溶液に1M水酸化ナトリウム水溶液（40 ml）を加えEtOAcで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝4：1（V/V））で精製して、無色固形物（930mg）を得た。
得られた化合物（920mg）を含むメタノール（5ml）-THF(3ml)溶液に1M水酸化ナトリウム水溶液(4.4ml)を加え、50℃で6時間攪拌した。室温にまで冷却後、EtOAc（40ml）、水（30ml）を加え攪拌後、有機層を1M水酸化ナトリウム水溶液で抽出した。水層を合わせ、濃塩酸を用いてpHを1とした後、水層をクロロホルムを用いて抽出後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をヘキサン‐EtOAcで再結晶し、4-(シクロヘキシルメトキシ)安息香酸（600mg）を得た。
得られた化合物(370mg)、tert-ブチル1-ピペラジンカルボキシレート(350mg)を含むDMF（10ml）溶液に1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(359mg)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（254mg）を加え室温で12時間攪拌した。反応溶液に水を加え、析出した固体を濾取し、水で洗浄後、減圧下乾燥し、無色固形物（610mg）を得た。
得られた化合物（600mg）をEtOAc（6ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（4ml）を加え、室温にて終夜攪拌した。析出した固体を濾取し、EtOAcで洗浄後、減圧下乾燥し1-[4-(シクロヘキシルメトキシ)ベンゾイル]ピペラジン塩酸塩（580mg）を得た。
参考例 67と同様にして、参考例 68〜72の化合物を得た。
参考例 73
2M ジメチルアミン−THF溶液（11.6ml）に、-70℃で1.59M ノルマルブチルリチウム-THF溶液(14.6ml)を添加し、10分間攪拌した。0℃まで昇温し、3-クロロ-5-ヒドロキシピリジン(1.00g)を添加し、室温で一晩攪拌した。エタノール(15ml)を加えた後、溶媒を減圧留去した。残留物に水を加え、クロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝10：1（V/V））で精製して、3-ジメチルアミノ-5-ヒドロキシピリジン(176mg)を得た。
参考例 74
3-ベンジロキシ-5-ブロモピリジン(400mg)とモルホリン(158mg)を含むTol(10ml)溶液に、トリスジベンジリデンアセトンジパラジウム(21mg)、２，２‘−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル(124mg)、ナトリウム tert-ブトキシド(160mg)を順次添加した後、85℃にて4時間加熱した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝20：1（V/V））で精製して、無色油状物(372mg)を得た。
得られた化合物（370mg）を含むエタノール（20ml）溶液に10%パラジウム−カーボン（触媒量）を添加し、水素ガス雰囲気下、常温常圧にて1.5時間攪拌した。触媒を濾去し、得られた濾液を減圧濃縮して、5-ヒドロキシ-3-モルフォリニルピリジン（248mg）を得た。
参考例74と同様にして、参考例75〜76の化合物を得た。
参考例 77
5-(ベンゼンスルホニルオキシ)-2-(ブロモメチル)ピリジン（Beilstein Registry No.7430370、800mg）を含むメタノール（20ml）溶液中に、ナトリウムメトキシド（393mg）を添加し、室温にて4時間攪拌した。反応溶液に水を加え、EtOAcにて抽出し、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；EtOAc）で精製して、6-(メトキシメチル)ピリジン-3-オール（200mg）を得た。
参考例 78
3-ベンジロキシ-5-アミノピリジン(250mg)のTHF(10ml)溶液に、ＴＥＡ(0.21ml)、ジ-tert-ブチルジカルボネート(463mg)を順次添加した後、60℃にて3時間加熱した。溶媒を減圧留去後、水を加え、EtOAcで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝1：1（V/V））で精製して、無色固体（153mg）を得た。
得られた化合物（240mg）を含むエタノール（20ml）溶液に10%パラジウム−カーボン（触媒量）を添加し、水素ガス雰囲気下、常温常圧にて1.5時間攪拌した。触媒を濾去し、得られた濾液を減圧濃縮して、tert-ブチル (5-ヒドロキシピリジン-3-イル)カルバメート（167mg）を得た。
参考例 79
メチル ジエチルホスフォノアセテート(732mg)のTHF(10ml)溶液に、0℃で水素化ナトリウム(60% オイル混合物、139mg)のTHF(10ml)溶液を加え、15分間攪拌した後、5-(ベンジロキシ)ニコチンアルデヒド(495mg)を添加し、常温で4時間攪拌した。反応溶液に水を加え、EtOAcで抽出し、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して、無色固体（680mg）を得た。
得られた化合物（330mg）を含むエタノール（20ml）溶液に10%パラジウム−カーボン（触媒量）を添加し、水素ガス雰囲気下、常温常圧にて2時間攪拌した。触媒を濾去し、得られた濾液を減圧濃縮して、メチル 3-(5-ヒドロキシピリジン-3-イル)プロパノエート（150mg）を得た。
参考例 80
リチウムアルミニウムハイドライド(1.49g)のTHF(100ml)に、-78度でメチル 5-(ベンジロキシ)ニコチノエート(3.52g)のTHF(30ml)溶液を加え、15分間攪拌した後、常温で2時間攪拌した。反応溶液を0度に冷却後、に水(1.49ml)、15% 水酸化ナトリウム水溶液(1.49ml)、水(4.47ml)を順次添加した。固形物を濾去後、得られた濾液を減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝10：1（V/V））で精製して、無色固体（1.41g）を得た。
得られた化合物（450mg）を含むベンゼン（20ml）溶液に、tert-ブチルブロモアセテート(609mg)、テトラブチルアンモニウム ハイドロゲンスルフェート(35mg)、50%水酸化ナトリウム水溶液(2ml)を順次添加し、室温で一晩攪拌した。1M 塩酸水溶液で中和し、EtOAcで抽出し、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝6：4（V/V））で精製して、無色油状物（576mg）を得た。
得られた化合物（570mg）を含むエタノール（20ml）溶液に10%パラジウム−カーボン（触媒量）を添加し、水素ガス雰囲気下、常温常圧にて1時間攪拌した。触媒を濾去し、得られた濾液を減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝15：1（V/V））で精製して、tert-ブチル [(5-ヒドロキシピリジン-3-イル)メトキシ]アセテート（400mg）を得た。
参考例 81
メチル （2E）-3-[5-(ベンジロキシ）ピリジン-3-イル]アクリレート(300mg)を含むＴＦＡ（10ml）溶液に、ペンタメチルベンゼン(826mg)を添加し、60℃にて一晩攪拌した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝10：1（V/V））で精製して、tert-ブチル (5-ヒドロキシピリジン-3-イル)アセテート（180mg）を得た。
参考例 82
メチル3-ヒドロキニコチノエート(1.50g)のTHF(60ml)溶液中に、ジイソプロピルエチルアミン(2.05ml)、メトキシメチルクロライド(0.89ml)を順次添加した後、室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧留去後、水を加え、クロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して、無色油状物（2.01g）を得た。
リチウムアルミニウムハイドライド(838mg)のTHF(50ml)に、-78度で得られた化合物(1.98g)のTHF(20ml)溶液を加え、30分間攪拌した後、常温で2時間攪拌した。反応溶液を0度に冷却後、に水(0.84ml)、15% 水酸化ナトリウム水溶液(0.84ml)、水(2.52ml)を順次添加した。固形物を濾去後、得られた濾液を減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；EtOAc）で精製して、無色油状物（838g）を得た。
得られた化合物(828mg)を含むピリジン(10ml)溶液に、無水酢酸(1.39ml)を添加し、室温で1.5時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、Tol(10ml)を加え共沸し、無色油状物（1.01g）を得た。
得られた化合物(1.01g)を含むジオキサン(10ml)溶液に、4M塩化水素-ジオキサン溶液（3.58ml）を加え、室温にて１時間攪拌した。溶媒を減圧留去して、(5-ヒドロキシピリジン-3-イル)メチル アセテート 塩酸塩（973mg）を得た。
参考例95
3-シアノベンジルブロミド（2.0g）のTol（50ml）溶液にトリフェニルホスフィン（2.8g）を加え80℃で5時間攪拌した。室温に冷却後、析出した結晶を濾過し、Tolで洗浄した。減圧下乾燥させ、(3-シアノベンジル)(トリフェニル)ホスホニウムブロミド(3.4g)を得た。
(3-シアノベンジル)(トリフェニル)ホスホニウムブロミド(1.6g)、tert-ブチル 4-ホルミル-1-ピペリジンカルボキシレート(0.75g)のDMF(20ml)溶液に氷冷下水素化ナトリウム（60%油状物、141mg）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液をEtOAcで希釈し、水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc=6:1（V/V）で精製し、油状物を得た。 得られた油状物のEtOAc（30ml）溶液に10%パラジウム-炭素(100mg)を加え水素気流下2時間攪拌した。触媒をセライトを用いて除去し、溶媒を濃縮し、油状物を得た。得られた油状物をEtOAc(10ml)に溶解させ、4M塩酸-EtOAc溶液（5ml）を加え室温で6時間攪拌後濃縮した。得られた固体をエーテルで洗浄後、減圧下乾燥させ、3-[2-(4-ピペリジニル)エチル]ベンゾニトリル塩酸塩(506mg)を得た。
参考例95と同様にして、参考例96〜101の化合物を得た。
参考例102
3-ブロモメチル安息香酸メチル（50.0g）のTol（400ml）溶液にトリフェニルホスフィン（85.8g）を加え、80℃で10時間攪拌した。室温に冷却後、析出した結晶を濾過し、Tolで洗浄した。減圧下乾燥させ、(3-メトキシカルボニルベンジル)(トリフェニル)ホスホニウムブロミド（107.6g）を得た。
(3-メトキシカルボニルベンジル)(トリフェニル)ホスホニウムブロミド（84.6g）のDMF（250ml）溶液に、氷冷下カリウムtert-ブトキシド（22.5g）を加え、室温で30分攪拌後、tert-ブチル 4-ホルミル-1-ピペリジンカルボキシレート（30.6g）のDMF（50ml）溶液を氷冷下で加え、室温で終夜攪拌した。反応液に酢酸（11.5ml）を加え、室温で1時間攪拌後、EtOAcで希釈し、水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc=7:1（V/V）で精製した。残渣をEtOAcに溶かし、活性炭を加え、室温で2時間攪拌した。セライトを用いて活性炭を除去し、溶媒を減圧留去し、無色油状物を得た。
得られた油状物のEtOAc（400ml）溶液に10%パラジウム-炭素（4.58g）を加え水素気流下2時間攪拌した。触媒をセライトを用いて除去し、溶媒を濃縮し、tert-ブチル 4-{2-[3-(メトキシカルボニル)フェニル]エチル}-1-ピペリジンカルボキシレート（45.4g）を得た。
参考例102と同様にして、参考例103の化合物を得た。
参考例104
tert-ブチル 4-{2-[3-(メトキシカルボニル)フェニル]エチル}-1-ピペリジンカルボキシレート（45.4g）のTHF（200ml）、メタノール（50ml）混合溶液に、1M水酸化ナトリウム水溶液（196ml）を加え、60℃で2時間攪拌した。有機溶媒を減圧留去し、氷冷下残渣に0.5M塩酸（400ml）を加えた。反応液をEtOAcで希釈し、水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、3-{2-[1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-ピペリジニル]エチル}安息香酸（43.5g）を得た。
参考例104と同様にして、参考例105の化合物を得た。
参考例106
3-{2-[1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-ピペリジニル]エチル}安息香酸（17.8g）をDMF（200ml）に溶解させ、1-[3‐(ジメチルアミノ)プロピル]‐3‐エチルカルボジイミド塩酸塩(15.4g)、1‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（10.8g）を加え、室温にて2時間攪拌した。反応液に塩化アンモニウム（8.57g）、ＴＥＡ（22.3ml）を加え、室温にて終夜攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、析出した結晶を濾過し、乾燥させ、tert-ブチル 4-{2-[3-(アミノカルボニル)フェニル]エチル}-1-ピペリジンカルボキシレート（10.8g）を得た。
参考例106と同様にして、参考例107〜118の化合物を得た。
参考例119
4-[2-(4-{[(2-ヒドロキシエチル)アミノ]カルボニル}フェニル)エチル]ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル（280mg）、四臭化炭素（247mg）、2,6-ルチジン（103μl）をジクロロメタン（5.6ml）に溶解し、氷冷下トリフェニルホスフィン（195mg）を加えて室温で3時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝３：７（V/V）で精製し、4-{2-[4-(1-アジリジニルカルボニル)フェニル]エチル}-1-ピペリジンカルボン酸tert-ブチルエステル(136mg)を無色油状物として得た。
参考例120
tert-ブチル 4-{2-[3-(アミノカルボニル)フェニル]エチル}-1-ピペリジンカルボキシレート（13.8g）をEtOAc(200ml)に溶解させ、4M塩酸-EtOAc溶液（130ml）を加え室温で4時間攪拌後、濃縮した。得られた残渣にアセトニトリルを加えて加熱し、析出した結晶を濾取し、EtOAcで洗浄後、減圧下乾燥させ、3-[2-(4-ピペリジニル)エチル]ベンズアミド塩酸塩（11.2g）を得た。
参考例120と同様にして、参考例121〜139の化合物を得た。
参考例140
アルゴン気流下、tert-ブチル 4-[2-(3-ブロモフェニル)エチル]-1-ピペリジンカルボキシレート(0.50g)とフェニルボロン酸（0.20g）のTol(6ml)-水(2ml)溶液に、炭酸ナトリウム(0.43g)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(80mg)を加え、100℃で7時間加熱攪拌した。室温に戻し、EtOAcで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝10：1（V/V）で精製し、tert-ブチル 4-[2-(3-ビフェニル)エチル]-1-ピペリジンカルボキシレート (0.41g)を得た。
tert-ブチル 4-[2-(3-ビフェニル)エチル]-1-ピペリジンカルボキシレート (0.41g)のEtOAc(4ml)溶液に４M塩酸/EtOAc(1.5ml)を加え室温で終夜攪拌した。析出した結晶を濾取し、EtOAcヘキサンで洗浄後減圧下乾燥し、4-[2-(3-ビフェニル)エチル]ピペリジン塩酸塩(0.31g)を得た。
参考例140と同様にして、参考例141〜142の化合物を得た。
参考例143
4,4'-(1,3-プロパンジイル)ジピペリジン（5.0g）のジクロロメタン（50ml）溶液に氷冷下ジ-tert-ブチルジカーボネート(2.6g)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液をクロロホルムで希釈し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：濃アンモニア水=4:1:0.1（V/V））で精製しtert-ブチル 4-[3-(4-ピペリジニル)プロピル]-1-ピペリジンカルボキシレート（2.2g）を得た。
アルゴン雰囲気下、2-クロロ-6-メチルピリジン(0.56g)とtert-ブチル 4-[3-(4-ピペリジニル)プロピル]-1-ピペリジンカルボキシレート（1.1g）のTol(22ml)溶液に、ナトリウムtert-ブトキシド(0.52g)、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(100mg)、2-(ジシクロヘキシルホスフィノ)ビフェニル(76mg)を加え、100℃で１時間加熱攪拌した。室温に戻し、EtOAcで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝10：1（V/V））で精製し、tert-ブチル 4-{3-[1-(6-メチル-2-ピリジニル)-4-ピペリジル]プロピル}-1-ピペリジンカルボキシレート(1.3g)を得た。
tert-ブチル 4-{3-[1-(6-メチル-2-ピリジニル)-4-ピペリジニル]プロピル}-1-ピペリジンカルボキシレート(1.3g)のEtOAc（25ml）溶液に４M塩酸−EtOAc(10ml)を加え室温で終夜攪拌した。反応液を濃縮し、2-プロパノール-ジエチルエーテルを加え攪拌した。析出した固体を濾取した後、減圧下乾燥し、2-メチル-6-{4-[3-(4-ピペリジニル)プロピル]-1-ピペリジル}ピリジン ２塩酸塩(1.1g)を得た。
参考例143と同様にして、参考例144〜145の化合物を得た。
参考例146
tert-ブチル-4-(3-ヒドロキシプロピル)ピペリジン-1-カルボキシレート(8.00 g)およびＴＥＡ(4.8 mL)の塩化メチレン(200 mL)溶液にメタンスルホニルクロリド(2.7 mL)を0℃で滴下し、室温で終夜攪拌した。反応液を飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液；EtOAc：ヘキサン＝１：３（V/V）)により精製し、tert-ブチル 4-{3-[(メチルスルホニル)オキシ]プロピル}ピペリジン-1-カルボキシレート(10.1 g)を得た。
tert-ブチル 4-{3-[(メチルスルホニル)オキシ]プロピル}ピペリジン-1-カルボキシレート(1.00g)、1-ピペラジン-1-イルイソキノリン2塩酸塩(980 mg)、炭酸セシウム(1.02 g)およびヨウ化ナトリウム(467 mg)のDMI(20 mL)懸濁液を140℃で1時間かくはんした。反応液にEtOAcを加え、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥して溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液；ヘキサン：EtOAc=1:1（V/V）)により精製し、tert-ブチル 4-[3-(4-イソキノリン-1-イルピペラジン-1-イル)プロピル]ピペリジン-1-カルボキシレート(1.07 g)を淡黄色油状物質として得た。
tert-ブチル 4-[3-(4-イソキノリン-1-イルピペラジン-1-イル)プロピル]ピペリジン-1-カルボキシレート(1.44 g)のEtOAc(15 mL)溶液に４Ｍ塩酸−EtOAc溶液(5.0 mL)を滴下し、終夜攪拌した。溶媒を留去した後、固体をEtOAcで洗浄し、濾取して1-[4-(3-ピペリジン-4-イルプロピル)ピペラジン-1-イル]イソキノリン2塩酸塩 (1.32 g)を白色固体として得た。
参考例146と同様にして、参考例154の化合物を得た。
参考例147
5-ヒドロキシニコチン酸メチル（5.3g）、ジイソプロピルエチルアミン（6.1ml）のジクロロメタン（100ml）溶液にクロロギ酸4-ニトロフェニル（7.0g）を加え、室温で1時間攪拌した。反応液を水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた固体をEtOAcヘキサンで洗浄後、減圧下乾燥させメチル 5-{[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}ニコチネート（8.4g）を得た。
参考例147と同様にして、参考例148の化合物を得た。
参考例151
3-{2-[1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-ピペリジニル]エチル}安息香酸(1.25 g)、1-[3‐(ジメチルアミノ)プロピル]‐3‐エチルカルボジイミド塩酸塩(863 mg)、1‐ヒドロキシベンゾトリアゾール(608 mg)のDMF(15 mL)溶液を室温で１時間攪拌した後、2-ブロモエチルアミン臭化水素酸塩(2.30 g)のＴＥＡ(1.6 mL)溶液を加えてさらに終夜攪拌した。反応液にEtOAcおよび飽和重曹水を加えて抽出し、飽和食塩水洗浄、無水硫酸マグネシウム乾燥した後、溶媒を留去してtert-ブチル 4-[2-(3-{[(2-ブロモエチル)アミノ]カルボニル}フェニル)エチル]ピペリジン-1-カルボキシレートの粗製物を得た。
tert-ブチル 4-[2-(3-{[(2-ブロモエチル)アミノ]カルボニル}フェニル)エチル]ピペリジン-1-カルボキシレート粗製物のEtOAc(15mL)溶液に４Ｍ塩酸-EtOAc溶液(5mL)を室温で加え、終夜かくはんした。溶媒を減圧で留去することによりN-(2-ブロモエチル)-3-(2-ピペリジン-4-イルエチル)ベンザミド塩酸塩(1.27 g)を白色固体として得た。
N-(2-ブロモエチル)-3-(2-ピペリジン-4-イルエチル)ベンザミド塩酸塩(1.20 g)、メチル 5-{[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}ニコチネートの(1.02 g)のアセトニトリル(30 mL)懸濁液にＴＥＡ(0.90 mL)を滴下し、室温で終夜攪拌した。反応溶媒を減圧留去した後、飽和重曹水を加え、EtOAcで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。これをろ過して溶媒を留去し、残渣を2回のシリカゲルカラムクロマトグラフィー(塩基性シリカ；溶出液；ヘキサン：EtOAc=１：２（V/V）。次いで中性シリカ；溶出液；クロロホルム：メタノール=１９：１（V/V）)により精製してメチル 5-[({4-[2-(3-{[(2-ブロモエチル)アミノ]カルボニル}フェニル)エチル]ピペリジン-1-イル}カルボニル)オキシ]ニコチネート(762 mg)を白色粉末として得た。
メチル 5-[({4-[2-(3-{[(2-ブロモエチル)アミノ]カルボニル}フェニル)エチル]ピペリジン-1-イル}カルボニル)オキシ]ニコチネート(750 mg)、炭酸カリウム(300 mg)、ヨウ化カリウム(361 mg)のDMF(10 mL)懸濁液を８０℃で１時間攪拌した。反応液を放冷後、EtOAcを加え、飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥して溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール=２０：１（V/V））で精製し、メチル 5-{[(4-{2-[3-(アジリジン-1-イルカルボニル)フェニル]エチル}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ニコチネート(630 mg)を無色油状物質として得た。
参考例152
3-{2-[1-( tert-ブトキシカルボニル)-4-ピペリジル]エチル}安息香酸（600mg）、ＴＥＡ(0.3ml)のTol溶液（10ｍｌ）に、氷冷下ジフェニルホスホリルアジド(540mg)を加え、室温で2時間攪拌した。反応溶液にEtOAcを加え飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、無色油状物（630mg）を得た。この油状物（400ml）のTol溶液(10ml)を110℃で1時間攪拌した。室温に戻し、30％アンモニア水溶液（0.2ml）を加え室温で15時間攪拌した。反応溶液にEtOAcを加え、１規定塩酸水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝95：5（V/V））で精製し、tert-ブチル 4-(2-{3-[(アミノカルボニル)アミノ]フェニル}エチル)-1-ピペリジンカルボキシレート（227mg）を得た。
tert-ブチル 4-(2-{3-[(アミノカルボニル)アミノ]フェニル}エチル)-1-ピペリジンカルボキシレート (227mg)のEtOAc(9ml)溶液に４M塩酸−EtOAc(4ml)を加え室温で3時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、1-{3-[2-(4-ピペリジル)エチル]フェニル}ウレア塩酸塩(185mg)を得た
1-{3-[2-(4-ピペリジニル)エチル]フェニル}ウレア塩酸塩(185mg)、ＴＥＡ（0.2ml）のアセトニトリル（5ml）溶液に、メチル 5-{[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}ニコチネート（228mg）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液をEtOAcで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール=10:1（V/V））で精製し、メチル 5-({[4-(2-{3-[(アミノカルボニル)アミノ]フェニル}エチル)-1-ピペリジル]カルボニル}オキシ) ニコチネート(183mg)を得た。
参考例152と同様にして、参考例153の化合物を得た。
参考例155
4-エチニルピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(12.5g)、ヨードベンゼン(12.8g)をTHF：TEA＝1：1（V/V）の混合溶媒（125ml）に溶解し、室温にてヨウ化銅(455mg)、パラジウムテトラキストリフェニルホスフフィン錯体(1.38g)を順次加えて、終夜室温で撹拌した。溶媒を留去し、EtOAcを加え、1M塩酸水溶液、水、飽和食塩水にて順次洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去して茶褐色油状物を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（抽出液；ヘキサン：EtOAc＝19：1（V/V））で精製し、4-（フェニルエチニル）ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(15.5g)を淡褐色油状物として得た。
4-（フェニルエチニル）ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル（7.0g）に4M塩化水素−EtOAc溶液（70ml）を加え、室温にて30分間撹拌した。溶媒を留去し、4-（フェニルエチニル）ピペリジン塩酸塩（5.4g）を白色粉末として得た。
実施例1
ピペリジン-1-カルボニルクロライド（745mg）を含むTHF（10ml）溶液中に、3-ヒドロキシピリジン（400mg）、ＴＥＡ（1.17ml）、DMAP（触媒量）を順次添加した後、60℃にて5時間加熱した。反応溶液を冷却後、水（3ml）を加え、EtOAcで抽出した。抽出液を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝１：１（V/V））で精製して、無色油状物を得た。得られた油状物質をエタノールに溶解させ、シュウ酸（378mg）のエタノール溶液を加えて処理し、無色粉末を得た。これをヘキサン−エタノールから再結晶し、（ピリジン-3-イル）ピペリジン-1-カルボキシレート シュウ酸塩（761mg）を得た。
実施例２
トリホスゲン（590mg）を含む塩化メチレン（25ml）溶液中に、3-ヒドロキシピリジン（568mg）、ピリジン（724μl）を含む塩化メチレン（20ml）溶液を滴下し、室温にて1時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残留物をピリジン（30ml）に溶解させ、参考例22にて得られた化合物（1.2g）を加え、70℃にて4時間加熱した。反応溶液を減圧下濃縮し、クロロホルムおよび炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝１：2（V/V））で精製して、無色粉末を得た。これをヘキサン−EtOAcから再結晶し、（ピリジン-3-イル）-4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-カルボキシレート（861mg）を得た。
実施例２と同様にして、実施例3〜118、389〜391、416、417と参考例83〜93の化合物を得た。
実施例119
トリホスゲン（1.48g）を含む塩化メチレン（30ml）溶液中に、3-ヒドロキシピリジン（1.43g）、ピリジン（1.46ml）を含む塩化メチレン（20ml）溶液を滴下し、室温にて1時間攪拌した。反応溶液にtert-ブチル1-ピペラジンカルボキシレート(2.0g)、ピリジン(0.97ml)を含む塩化メチレン（5ml）溶液を滴下後、ピリジン(20ml)を加え、70℃にて4時間加熱した。反応溶液を減圧下濃縮後、EtOAcで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物を塩基性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝4：1（V/V））で精製し、無色固体(3.0g)を得た。
得られた化合物（3.0g）をEtOAc（20ml）-2-プロパノール（10ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（10ml）を加え、室温にて終夜攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をEtOAcで洗浄後、減圧下乾燥し3-ピリジル1-ピペリジンカルボキシレート2塩酸塩(2.66g)を得た。
得られた化合物（190mg）、および参考例70を参考にシクロオクチルメタノールから合成した4-(シクロオクチルメトキシ)安息香酸(176mg)を含むDMF(5ml)溶液に
1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(150mg)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（110mg）、ジイソプロピルエチルアミン(0.23ml)を加え室温で終夜攪拌した。反応溶液をEtOAcで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をEtOAcヘキサンで再結晶し、3-ピリジル4-[4-(シクロオクチルメトキシ)ベンゾイル]-1-ピペラジンカルボキシレート(240mg)を得た。
実施例１19と同様にして、実施例120〜136の化合物を得た。
実施例137
6-クロロニコチノニトリル(1.0g)、3-クロロベンジルアルコール（1.0g）を含むDMF（10ml）溶液にカリウムtert-ブトキシド（810mg）を加え、室温で終夜攪拌した。反応溶液に水を加え析出した固体を濾取し、水、ヘキサンで順次洗浄後、減圧下乾燥し、褐色固体（1.3g）を得た。
得られた化合物（1.3g）を含むエタノール（10ml）溶液に5M水酸化ナトリウム水溶液(10ml)を加え、100℃で4時間攪拌した。室温にまで冷却後、1規定塩酸(56ml)を加え、析出した固体を濾取し、水で洗浄後、減圧下乾燥し、無色固体（0.82g）を得た。
得られた化合物（176mg）、3-ピリジル1-ピペラジンカルボキシレート2塩酸塩(166mg)を含むDMF(5ml)溶液に1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(150mg)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（110mg）、ジイソプロピルエチルアミン(0.23ml)を加え室温で終夜攪拌した。反応溶液をEtOAcで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物を塩基性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝1：2（V/V））で精製し、無色油状物(140mg)を得た。
得られた化合物(140mg)を含む2-プロパノール溶液にシュウ酸（35mg）を加え30分攪拌した。析出した固体を濾取し、2-プロパノール‐ヘキサンで洗浄後、減圧下乾燥し3-ピリジル4-({6-[(3-クロロベンジル)オキシ]-3-ピリジル}カルボニル)-1-ピペラジンカルボキシレート0.5シュウ酸塩(120mg)を得た。
実施例１37同様にして、実施例138の化合物を得た。
実施例139
4-ヒドロキシベンズアミド（686mg）を含むアセトニトリル(15ml)溶液に炭酸カリウム（1.04g）、ブロモEtOAc（0.610mｌ）を加え80℃にて2時間加熱した。反応溶液を冷却後、水（45ml）を加え、析出してくる固形物を濾取し、水で洗浄後乾燥して、淡褐色粉末のエチル [4-(アミノカルボニル)フェノキシ]アセテート（893mg）を得た。
得られた化合物（870mg）をTHF（10ml）に溶解させ、エタノール（0.274ml）と1M水酸化ナトリウム水溶液（4.68ml）を添加し、室温にて4時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮後、1M塩酸水溶液にて酸性にし、析出してくる固形物を濾取して乾燥し、淡褐色粉末の[4-(アミノカルボニル)フェノキシ]酢酸（714mg）を得た。
実施例121の方法で得られた3-ピリジル1-ピペリジンカルボキシレート2塩酸塩（252mg）を含むDMF（5ml）溶液中に、ＴＥＡ（0.251ml）、1-[3‐(ジメチルアミノ)プロピル]‐3‐エチルカルボジイミド塩酸塩(259mg)、1‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（122mg）および、上述合成化合物[4-(アミノカルボニル)フェノキシ]酢酸（184mg）を加え、室温にて5時間攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムにて抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝95：5（V/V））で精製して得られた固体をEtOAcアセトニトリルで再結晶し、ピリジン-3-イル-4-{[4-(アミノカルボニル)フェノキシ]アセチル}ピペリジン-1-カルボキシレート(274mg)を得た。
実施例139と同様にして、実施例140〜141の化合物を得た。
実施例142
3-ピリジル1-ピペラジンカルボキシレート2塩酸塩(150mg)を含むジクロロメタン(5ml)溶液にＴＥＡ（0.23ml）、ベンゼンスルホニルクロリド（0.075mｌ）を加え室温で終夜攪拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム）で精製して得られた固体を2-プロパノールで再結晶し、3-ピリジル4-(フェニルスルホニル)-1-ピペラジンカルボキシレート(130mg)を得た。
実施例142と同様にして、実施例143の化合物を得た。
実施例144
3-ピリジル1-ピペラジンカルボキシレート2塩酸塩(150mg)を含むピリジン(3ml)溶液にクロロ蟻酸ベンジル(91mg)を加え室温で12時間攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、EtOAcで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、2-プロパノール(3ml)で希釈後、トルエンスルホン酸水和物(100mg)加え攪拌した。析出した結晶を濾過し、2-プロパノールで再結晶し、ベンジル3-ピリジル1,4-ピペラジンジカルボキシレートトシル酸塩(98mg)を得た。
実施例144と同様にして、実施例145〜146の化合物を得た。
実施例147
3-ピリジル4-[(4-ベンジルオキシ)ベンゾイル]-1-ピペラジンカルボキシレート(1.3g)を含むTHF（20ml）-2-プロパノール(20ml)溶液に10%パラジウム−カーボン（触媒量）を添加し、水素ガス雰囲気下、常温常圧にて12時間攪拌した。触媒を濾去し、濾液を減圧濃縮後、得られた固形物をEtOAcヘキサンで再結晶し3-ピリジル4-（4-ヒドロキシベンゾイル）-1-ピペラジンカルボキシレート（950mg）を得た。
3-クロロベンジルアルコール(200mg)とトリフェニルホスフィン（360mg）を含むTHF（5ml）溶液中に、3-ピリジル4-（4-ヒドロキシベンゾイル）-1-ピペラジンカルボキシレート(300mg)とジエチルアゾジカルボキシレート（0.62ml、40%Tol溶液）を含むTHF（5ml）溶液を0℃にて滴下し、室温にて3日間攪拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝95：5（V/V））で精製して得られた固形物を2-プロパノールを用いて再結晶し、3-ピリジル4-｛4-[(3-クロロベンゾイル)オキシ]ベンジル｝-1-ピペラジンカルボキシレート(260mg）を得た。
実施例147と同様にして、実施例148〜166の化合物を得た。
実施例167
3-ピリジル4-（4-ヒドロキシベンゾイル）-1-ピペラジンカルボキシレート（530mg）、メチル3-(ブロモメチル)ベンゾエート(450mg)を含むアセトニトリル（10ml）溶液に、炭酸カリウム（270mg）を加え、80℃にて1時間攪拌した。反応溶液に水を加え、EtOAcで抽出し、有機層を水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝1:4（V/V））で精製して、無色固形物（470mg）を得た。
得られた固形物（100mg）をEtOAcヘキサンで再結晶し、3-ピリジル4-(4-｛[3-(メトキシカルボニル)ベンジル]オキシ｝ベンゾイル)-1-ピペラジンカルボキシレート(88mg)を得た。
実施例168
4-エチル 1−ピリジン-3−イル ピペリジン-1,4-ジカルボキシレート(0.732g)をＴＨＦ(15ml)、エタノール(8.0ml)に溶解させ、氷冷下にて、1M水酸化ナトリウム水溶液(3.9ml)を滴下した。室温にて2時間かきまぜたのち、1M 塩酸（0.5ml）で中和した。反応液を減圧濃縮し、残留物にメタノールを加え、吸引ろ過にて析出した塩を除去した。ろ液を濃縮し、無色固体1-[(ピリジン-3-イルオキシ)カルボニル]ピペリジン-4-カルボン酸(0.727g)を得た。
得られた化合物(0.60g)をジメチルホルムアミド(10ml)に溶解させ、1-[3‐(ジメチルアミノ)プロピル]‐3‐エチルカルボジイミド塩酸塩(0.93g)、1‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.51g）および、シクロへキサンメチルアミン(0.43g)を加え、室温にて15時間かきまぜた。反応溶液に水を加えてさらに1時間かきまぜたのち、EtOAcと炭酸水素ナトリウム溶液を加えて分液し、有機層を0.5M 塩酸、飽和食塩水にて順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝１：4（V/V））で精製して、無色粉末(0.69ｇ)を得た。これをエタノール、ヘキサンから再結晶し、（ピリジン-3-イル）-4-{[(シクロヘキシルメチル)アミノ]カルボニル}ピペリジン-1-カルボキシレート（261mg）を得た。
実施例168と同様にして、実施例169〜192、383〜388と参考例94の化合物を得た。
実施例193
1-ベンジル2-メチル1,2-ピペラジンジカルボキシレート（660mg：Beilstein Registry No. 4236331）を含むピリジン（10ml）溶液に3-ピリジニルクロリドカルボネート(330mg)を加え、80℃で7時間攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮後、クロロホルムで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物を塩基性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝1：1（V/V））で精製し、無色油状物(700mg)を得た
得られた化合物（430mg）を含むTHF（5ml）溶液に1M水酸化ナトリウム水溶液(1.2ml)を加え、50℃で3時間攪拌した。1M水酸化ナトリウム水溶液(0.8ml)を加え50℃でさらに1時間加熱後、室温にまで冷却し、1規定塩酸(2ml)を加えた。反応溶液をEtOAcで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、析出した固体をEtOAcヘキサンで洗浄後、減圧下乾燥し1-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-4-[（3-ピリジルオキシ）カルボニル]-2-ピペラジンカルボン酸(140mg)を得た。
実施例193と同様にして、実施例194〜195の化合物を得た。
実施例196
ピリジン-3-イル 4-({[2-(メチルアミノ)フェニル]アミノ}カルボニル)ピペリジン-1-カルボキシレート(0.41g)を酢酸(10ml)に溶解させ、2時間加熱還流した。溶媒を留去したのち、メタノールとジエチルエーテルから再結晶し、（ピリジン-3-イル）-4-(1‐メチル‐１H‐ベンズイミダゾール‐2-イル)ピペリジン-1-カルボキシレート（307mg）を得た。
実施例197
ピリジン-3-イル 4-[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]ピペリジン-1-カルボキシレート（0.249g）をＴＨＦ(5.0ml)に溶解させ、氷冷下にて4M塩化水素−EtOAc溶液（2.10ml）を加え、室温にて24時間攪拌した。反応溶液を濃縮乾固し、ピリジン-3-イル 4-アミノピペリジン-1-カルボキシレート2塩酸塩(0.280g)を得た。
得られた化合物(0.28g)をジメチルホルムアミド(10ml)に溶解させ、1-[3‐(ジメチルアミノ)プロピル]‐3‐エチルカルボジイミド塩酸塩(0.28g)、1‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.16g）、ＴＥＡ(0.54ml)および、6-フェニルヘキサン酸(0.18g)を加え、室温にて15時間かきまぜた。反応溶液に水を加えてさらに1時間かきまぜたのち、EtOAcと炭酸水素ナトリウム溶液を加えて分液し、有機層を飽和食塩水にて洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；EtOAc）で精製して、無色粉末を得た。これをメタノール、ジエチルエーテルから再結晶し、（ピリジン-3-イル）-4-[(6-フェニルヘキサノイル)アミノ]ピペリジン-1-カルボキシレート（108mg）を得た。
実施例198
3-ピリジル4-[3-(ベンジルオキシ)フェノキシ]-1-ピペリジンカルボキシレート(4.0g)を含むTHF（75ml）-2-プロパノール(75ml)溶液に10%パラジウム−カーボン（触媒量）を添加し、水素ガス雰囲気下、常温常圧にて24時間攪拌した。触媒を濾去後、濾液を減圧濃縮し、得られた固形物をEtOAcヘキサンで洗浄後、減圧下乾燥し3-ピリジル4-（3-ヒドロキシフェノキシ）-1-ピペリジンカルボキシレート（2.2g）を得た。
実施例199
3-ピリジル4-[4-(ベンジルオキシ)フェノキシ]-1-ピペリジンカルボキシレート(3.7g)を含むTHF（75ml）-2-プロパノール(75ml)溶液に10%パラジウム−カーボン（触媒量）を添加し、水素ガス雰囲気下、常温常圧にて24時間攪拌した。触媒を濾去後、濾液を減圧濃縮し、得られた固形物をEtOAcヘキサンで洗浄後、減圧下乾燥し3-ピリジル4-（4-ヒドロキシフェノキシ）-1-ピペリジンカルボキシレート（2.4g）を得た。
実施例200
3-ピリジル4-（3-ヒドロキシフェノキシ）-1-ピペリジンカルボキシレート（160mg）、シクロヘキシルメタノール（87mg）、トリフェニルホスフィン（200m）を含むTHF（5ml）溶液中に、ジエチルアゾジカルボキシレート（0.35ml、40%Tol溶液）を0℃にて滴下し、室温にて24時間攪拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝1：1（V/V））で精製した。得られた油状物をEtOAc（5ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（1ml）を加え、室温にて攪拌した。溶媒を減圧下留去し、析出した固体をEtOAc2-プロパノールで洗浄後、減圧下乾燥し3-ピリジル4-[3-(シクロヘキシルメトキシ)フェノキシ]-1-ピペリジンカルボキシレート塩酸塩(94mg)を得た。
実施例200と同様にして、実施例201〜205の化合物を得た。
実施例206
3-ピリジル4-（4-ヒドロキシフェノキシ）-1-ピペリジンカルボキシレート（160mg）、3-クロロベンジルアルコール（110mg）、トリフェニルホスフィン（200m）を含むTHF（5ml）溶液中に、ジエチルアゾジカルボキシレート（0.35ml、40%Tol溶液）を0℃にて滴下し、室温にて24時間攪拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝1：3（V/V））で精製した。得られた油状物をEtOAc（5ml）に溶解させ、4M塩化水素−EtOAc溶液（1ml）を加え、室温にて攪拌した。溶媒を減圧下留去し、析出した固体をEtOAc2-プロパノールで再結晶し3-ピリジル4-｛4-[(3-クロロベンジル)オキシ]フェノキシ｝-1-ピペリジンカルボキシレート塩酸塩(45mg)を得た。
実施例206と同様にして、実施例207〜212の化合物を得た。
実施例213
メチル 5-[({4-[4-(ベンジロキシ)フェノキシ]ピペリジン-1-イル}カルボニル)オキシ]ニコチノエートを含むエタノール（100ml）溶液に10%パラジウム−カーボン（触媒量）を添加し、水素ガス雰囲気下、常温常圧にて一晩攪拌した。触媒を濾去し、得られた濾液を減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝15：1（V/V））で精製して、無色油状物（1.08g）を得た。
得られた化合物（450mg）および3-シクロヘキシル-1-プロパノール(315mg)を含むTHF（20ml）溶液に、2.2M ジエチル アゾジカルボキシレート(1.01ml)、トリフェニルホスフィン（581mg）を添加し、50℃にて22時間加熱した。反応溶液に水を加え、クロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝2：1（V/V））で精製して、メチル 5-[({4-[4-(3-シクロヘキシルプロポキシ)フェノキシ]ピペリジン-1-イル}カルボニル)オキシ]ニコチノエート（242mg）を得た。
実施例213と同様にして、実施例214〜216の化合物を得た。
実施例217
5-[({4-[4-(ベンジロキシ)フェノキシ]ピペリジン-1-イル}カルボニル)オキシ]ニコチン酸(200mg)を含むTHF（10ml）溶液に10%パラジウム−カーボン（触媒量）を添加し、水素ガス雰囲気下、常温常圧にて3時間攪拌した。触媒を濾去し、得られた濾液を減圧濃縮し、5-[({4-[4-(ヒドロキシ)フェノキシ]ピペリジン-1-イル}カルボニル)オキシ]ニコチン酸 シュウ酸塩（55mg）を得た。
実施例218
実施例２と同様の方法で得られた実施例29の化合物(4.0g)をＴＨＦ(30ml)、メタノール(15ml)に溶解させて、氷冷下1M水酸化ナトリウム水溶液(12ml)を滴下した。室温にて30分かきまぜたのち、氷冷にて1M 塩酸(12ml)で中和した。析出した無色固体をろ取し、5-{[(4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ニコチン酸(3.52g)を得た。
実施例218と同様により、実施例219〜224及び実施例226〜243の化合物を得た。
実施例225
トリホスゲン（1.56g）を含む塩化メチレン（50ml）溶液中に、5-ヒドロキシニコチン酸メチル（2.20g）とピリジン（4ml）を含む塩化メチレン（30ml）溶液を滴下し、室温にて1時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残留物をピリジン（50ml）に溶解させ、4-(2-フェニルエチル)ピペリジン塩酸塩（2.70g）を加え、80℃にて終夜加熱した。反応溶液を減圧下濃縮し、EtOAcおよび炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝１：1（V/V））で精製して、無色粉末を得た。これをヘキサン−EtOAcから再結晶し、メチル5-({[4-(2-フェニルエチル)ピペリジン-1-イル]カルボニル}オキシ)ニコチネート（3.95g）を得た。
メチル5-({[4-(2-フェニルエチル)ピペリジン-1-イル]カルボニル}オキシ)ニコチネート(3.95g)をＴＨＦ(32ml)、メタノール(16ml)に溶解させて、氷冷下1M水酸化ナトリウム水溶液(16ml)を滴下した。室温にて30分かきまぜたのち、氷冷にて1M塩酸(16ml)で中和した。析出した無色固体をろ取し、これをメタノール−水から再結晶して、5-({[4-(2-フェニルエチル)ピペリジン-1-イル]カルボニル}オキシ)ニコチン酸(3.70g)を得た。
実施例244
実施例219の化合物5-{[(4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ニコチン酸(0.50g)をDMF(8.0ml)に溶解させ、1-[3‐(ジメチルアミノ)プロピル]‐3‐エチルカルボジイミド塩酸塩(0.38g)、1‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.22g）および、グリシンtert-ブチルエステル(0.21g)を加え、室温にて15時間かきまぜた。反応溶液に水を加えてさらに1時間かきまぜたのち、EtOAcと炭酸水素ナトリウム溶液を加えて分液し、有機層を飽和食塩水にて洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液; ヘキサン：EtOAc＝１：1（V/V））で精製して、無色油状物(0.444g)を得た。
得られた化合物(0.444g)を塩化メチレン(5.0ml)に溶解させ、氷冷下、ＴＦＡ(1.15ml)を加えた。同温度にて24時間かきまぜたのち、反応液を濃縮し、黄色固体を得た。これをエタノールとジエチルエーテルから再結晶し、{[(5-{[(4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ピリジン-3-イル)カルボニル]アミノ}酢酸(348mg)を得た。
実施例244と同様のアミド化反応を利用して、実施例245〜257の化合物を得た。
実施例258
実施例54の化合物（400mg）と[3-(アミノカルボニル)フェニル]ボロン酸（176mg）を含むジメトキシエタン（12ml）溶液中に、水（4ml）、炭酸ナトリウム（337mg）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（115mg）を順次添加した後、80℃にて5時間加熱した。反応溶液を冷却後、EtOAcにて希釈し、有機層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc＝1：5（V/V））で精製して、5-[3-(アミノカルボニル)フェニル]ピリジン-3-イル-4-ベンジルピペリジン-1-カルボキシレート（205mg）を得た。
実施例258と同様にして、実施例259、265、266、399の化合物を得た。
実施例260
5-[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]ピリジン-3-イル 4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-カルボキシレート(174mg)を含むTHF(10ml)溶液に、4M塩化水素-ジオキサン溶液（1.8ml）を加え、60℃にて4時間攪拌した。溶媒を減圧留去して、5-アミノピペリジン-3-イル 4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピリジン-1-カルボキシレート 塩酸塩（74mg）を得た。
実施例261
5-[4-(エトキシカルボニル)ピペリジン-1-イル]ピリジン-3-イル 4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-カルボキシレート シュウ酸塩(240mg)を含むTHF(10ml)溶液に、1M 水酸化ナトリウム水溶液(3.24ml)を添加し、60℃にて5時間攪拌した。反応溶液に1M 塩酸水(3.24ml)を加えた後、溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝10：1（V/V））で精製した。得られた油状物をエタノール水に溶解させ、シュウ酸（24mg）を加え結晶化させて、1-(5-{[(4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ピリジン-3-イル)ピペリジン-4-カルボン酸 シュウ酸塩(93mg)を得た。
実施例262
5-[(2-tert-ブトキシ-2-オキソエトキシ)メチル]ピリジン-3-イル 4-{4-[(3-(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-カルボキシレート(333mg)を含む塩化メチレン(10m)溶液に、ＴＦＡ(1.0ml)を添加し、室温にて一晩攪拌した。溶媒を減圧留去して、[(5-{[(4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ピリジン-3-イル)メトキシ]酢酸(232mg)を得た。
実施例263
5-[(アセトキシ)メチル]ピリジン-3-イル 4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-カルボキシレート シュウ酸塩(1.10g)を含むTHF(20ml)溶液に、1M 水酸化ナトリウム水溶液(7.65ml)を添加し、65℃にて3時間攪拌した。反応液を、1M 塩酸水で中和し、クロロホルムで抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝12：1（V/V））で精製して、5-(ヒドロキシメチル) ピリジン-3-イル 4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-カルボキシレート(770mg)を得た。
実施例264
5-[(1E)-3-メトキシ-3-オキソプロペ-1-エン-1-イル]ピリジン-3-イル 4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-カルボキシレート(158mg)を含むTHF(5ml)溶液に、1M 水酸化ナトリウム水溶液(1.11ml)を添加し、60℃にて3時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝10：1（V/V））で精製して、(2E)-3-(5-{[(4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ピリジン-3-イル)アクリル酸(88mg)を得た。
実施例267
(a) 3-[2-(4-ピペリジル)エチル]ベンゾニトリル塩酸塩(475mg)、ＴＥＡ（0.58ml）のアセトニトリル（10ml）溶液に、メチル 5-{[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}ニコチネート（723mg）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液をEtOAcで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた残渣を、塩基性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc=1:1（V/V））に付し副生したニトロフェノールを除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc=3:2（V/V））で精製し、メチル 5-[({4-[2-(3-シアノフェニル)エチル]-1-ピペリジル}カルボニル)オキシ]ニコチネート(284mg)を得た。
(b) メチル 5-[({4-[2-(3-シアノフェニル)エチル]-1-ピペリジル}カルボニル)オキシ]ニコチネート(272mg)のTHF（5ml）-水（4ml）溶液に1M水酸化ナトリウム水溶液（0.69ml）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に1M塩酸（0.69ml）を加え、析出した結晶を濾取した。結晶を熱メタノール水溶液で洗浄後、乾燥させ5-[({4-[2-(3-シアノフェニル)エチル]-1-ピペリジル}カルボニル)オキシ]ニコチン酸(240mg)を得た。
実施例267の工程(a)と同様にして、参考例149〜150及び実施例268〜272、392、396、400、402、413、419、421、422の化合物を得た。
実施例267の工程(a)に続き工程(b)を行う方法と同様にして、実施例273〜317、393〜395、401、403、405、406、414、418の化合物を得た。
実施例318
5-[({4-[2-(3-シアノフェニル)エチル]-1-ピペリジル}カルボニル)オキシ]ニコチン酸(102mg)のDMF(3.0ml)溶液に1-[3‐(ジメチルアミノ)プロピル]‐3‐エチルカルボジイミド塩酸塩(62mg)、1‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（43mg）、塩化アンモニウム（43mg）、ＴＥＡ（0.038ml）を加え、室温にて終夜攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、析出した結晶を濾過し、乾燥させた。得られた結晶をEtOAcヘキサンで再結晶し、5-(アミノカルボニル)-3-ピリジル4-[2-(3-シアノフェニル)エチル]-1-ピペリジンカルボキシレート（81mg）を得た。
同様の方法を利用して、実施例319〜382、397、398、404、408〜412、415、420、423の化合物を得た。
実施例407
トリフェニル(ピリジン-4-イルメチル)ホスホニウムクロライド塩酸塩（4.75g）とtert-ブチル 4-ホルミルピペリジン-1-カルボキシレート（1.91g）のDMF（50ml）溶液に氷冷下、カリウムtert-ブトキシド（2.73g）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液をEtOAcで希釈し、水、飽和食塩水にて順次洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc=1：2（V/V））で精製し、白色固体（2.05g）を得た。
得られた固体（2.04g）をEtOAc（30ml）に溶解させ、10%パラジウム炭素（200mg）を加え、水素存在下室温で3時間攪拌した。触媒を濾去した後、溶媒を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：酢酸エチル=1：1（V/V））で精製して、tert-ブチル 4-[(E)-2-ピリジン-4-イルビニル]ピペリジン-1-カルボキシレート（1.70g）を白色固体として得た。
tert-ブチル 4-[(E)-2-ピリジン-4-イルビニル]ピペリジン-1-カルボキシレート（1.02g）のエタノール（25ml）溶液に、4M塩化水素−EtOAc溶液（0.88ml）、酸化白金（100mg）を加え、水素存在下（3.5atm）で24時間攪拌した。アルゴン置換した後、メタノールで希釈し、セライトを用いて濾過し、減圧濃縮した。析出してくる固体をEtOAc−ヘキサンで洗浄後、減圧下乾燥させ、tert-ブチル 4-(2-ピペリジン-4-イルエチル)ピペリジン-1-カルボキシレート塩酸塩（850mg）を白色固体として得た。
tert-ブチル 4-(2-ピペリジン-4-イルエチル)ピペリジン-1-カルボキシレート塩酸塩（1.13g）、2-クロロ-6-メチルピリジン（431mg）およびナトリウム-tert-ブトキシド（487mg）のトルエン（10ml）溶液に2−(ジシクロヘキシルホスフィノ)ビフェニル（71mg）および(1E,4E)-1,5-ジフェニル-1,4-ペンタジエン-3-オン-パラジウム（93mg）を加え、120℃で1時間攪拌した。反応液を放冷後、飽和炭酸ナトリウム水溶液を加え、EtOAcで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥して、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：EtOAc=10：1（V/V））により精製し、tert-ブチル 4-{2-[1-(6-メチルピリジン-2-イル)ピペリジン-4-イル]エチル}ピペリジン-1-カルボキシレート（660mg）を赤色油状物質として得た。
tert-ブチル 4-{2-[1-(6-メチルピリジン-2-イル)ピペリジン-4-イル]エチル}ピペリジン-1-カルボキシレート(650mg)のEtOAc（10ml）溶液に4M塩化水素−EtOAc溶液(2ml)を加え、室温で2日間攪拌した。反応液を濃縮し、2-メチル-6-[4-(2-ピペリジン-4-イルエチル)ピペリジン-1-イル]ピリジン ２塩酸塩（644mg）を黄色アモルファス状物として得た。
2-メチル-6-[4-(2-ピペリジン-4-イルエチル)ピペリジン-1-イル]ピリジン ２塩酸塩（520mg）、TEA（0.50ml）のアセトニトリル（10ml）溶液に、メチル 5-{[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}ニコチネート（505mg）を加え、室温で3時間攪拌した。反応液をEtOAcで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール=98：2（V/V））で精製し、メチル 5-{[(4-{2-[1-(6-メチルピリジン-2-イル)ピペリジン-4-イル]エチル}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ニコチネート（424mg）を得た。
メチル 5-{[(4-{2-[1-(6-メチルピリジン-2-イル)ピペリジン-4-イル]エチル}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ニコチネート（208mg）のTHF（5ml）溶液に1M水酸化ナトリウム水溶液（0.45ml）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を濃縮し、5-{[(4-{2-[1-(6-メチルピリジン-2-イル)ピペリジン-4-イル]エチル}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ニコチン酸 ナトリウム塩（158mg）を得た。
5-{[(4-{2-[1-(6-メチルピリジン-2-イル)ピペリジン-4-イル]エチル}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ニコチン酸 ナトリウム塩（210mg）のDMF（10ml）溶液中に1-[3‐(ジメチルアミノ)プロピル]‐3‐エチルカルボジイミド塩酸塩（103mg）、1‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（90mg）、塩化アンモニウム（119mg）を加え、室温にて終夜攪拌した。反応液をEtOAcで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をEtOAc−ヘキサンより再結晶し、5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-{2-[1-(6-メチルピリジン-2-イル)ピペリジン-4-イル]エチル}ピペリジン-1-カルボキシレート（150mg）を得た。
実施例438
ラット脳破砕液を用いたFAAH活性を阻害する物質のスクリーニング
(1)ラット脳破砕液の調製
10週齢のSD系雄性ラット（日本SLC社）をエーテル麻酔下にて断頭し、大脳を摘出し重量を測定した。重量の5倍容の氷冷した緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH7.4）、0.32 M Sucrose）を加え、氷中でホモジナイザーにより均一な懸濁液になるまで摩砕した。遠心分離(1500×g, 4℃, 15分間)後，その上清をさらに遠心分離（15000×g, 4℃, 20分間）し沈殿を得た．さらに超音波発生機（UR-20P；トミー精工社）により、5秒間、超音波破砕（Power dial 4）した。得られた破砕液の蛋白質濃度を色素結合法（プロテインアッセイCBB溶液；ナカライテスク社）により測定した。緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.1 mg/ml BSA、100 mM NaCl）を用いて、蛋白質の濃度が60 μg/mlになるようにラット脳破砕液を希釈し酵素液を調製した。
(2)FAAH活性を阻害する物質のスクリーニング
2 μCi/ml 放射標識アナンダミド（Anandamide [ethanolamine 1-3H]（American Radiolabeled Chemical社））、8 μM アナンダミド（フナコシ社）、50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.1 mg/ml BSA及び100 mM NaClよりなる基質液を調製した。1 nM〜100 μMになるようにDMSOに溶解した試験物質溶液を調製した．50 μlの酵素液に50 μlの上記基質液，1 μlの試験物質溶液を加え、１時間放置した。また、コントロールとしてはDMSOを試験物質溶液の代わりに添加した。これに200 μlのクロロホルムとメタノールの1:1（容量比）溶液を加え攪拌した。遠心分離（15000回転/分、2 分間）することにより、上層（水/メタノール層）に分解産物のエタノールアミン（ethanolamine 1-3H）が、下層（クロロホルム層）に未反応の放射標識アナンダミド（Anandamide [ethanolamine 1-3H]）が分離された。上層の30 μlを96ウェルの有機溶媒耐性白色マイクロプレート（PicoPlate-96；PerkinElmer社）に移し、150 μlのマイクロシンチ20（PerkinElmer社）を加えマイクロプレートシンチレーションカウンター（TopCountTM；Beckman社）にて測定した。コントロールと比較して測定値を減少させる物質を、FAAH活性を阻害する物質として選択した。
(3) FAAH活性阻害物質のIC50値の測定
化合物を1 nM〜100 μMになるようにDMSOに溶解して試験物質溶液を調製し、上記に記載の方法で、FAAH活性に及ぼす影響を調べた。コントロールとしてDMSOを用いた。各測定値より、酵素液の代わりに緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.1 mg/ml BSA、100 mM NaCl）を用いて反応させた場合の測定値を差し引いた。コントロールの測定値を100%としてIC50値を求めた。例えば実施例２、１５１、２２５、２２８、２７３、３２４、３２５及び３５９の化合物では、それぞれIC50値が、0.14nM、27 nM、0.37nM、0.19nM、0.65nM、0.54nM、2.5nM及び1.3nMであった。
以上の結果より、FAAH若しくは機能的FAAHを発現している組織破砕液に試験物質を接触させ、試験物質依存的なFAAH活性の変化を測定することにより、FAAH活性を阻害する物質、すなわち頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤をスクリーニングできることが示された。
実施例439
ヒト膀胱上皮癌由来細胞を用いたFAAH活性を阻害する物質のスクリーニング
(1) FAAH活性を阻害する物質のスクリーニング
ヒト膀胱上皮癌由来細胞株5637細胞（HTB-9；ATCC）を48ウェルの細胞培養プレートに1ウェルあたり1×105個、10%ウシ胎児血清（HyClone社）を含有するRPMI1640培地（Invitrogen社）を用いて播種した。37℃で12時間以上培養した後、細胞を1ウェルあたり400 μlの緩衝液（Hank’s Balanced Salt Solution、20 mM Hepes-NaOH（pH 7.4））で洗浄した。基質液（3 μCi/ml 放射標識アナンダミド（Anandamide [ethanolamine 1-3H]）、10 μMアナンダミドを含む前記緩衝液）にDMSOに溶解した試験物質を0.003 nM〜30 nMになるように添加した。コントロールとしてDMSOのみを添加した。上記細胞に1ウェルあたり100 μlの基質液を加え、CO2インキュベーター内で、37℃で30分間インキュベートした。その後、細胞培養プレートを氷上に移し、基質液を吸引除去し、1ウェルあたり75 μlの氷冷した細胞溶解用の溶液（0.5% TritonX-100、10 μMのFAAH阻害活性を有する化合物cyclohexylcarbamic acid 3'-carbamoylbiphenyl-3-yl ester（URB597；Cayman chemical社；Kathuriaら、Nature Med.、第9巻、第76-81頁、2003年）を含む前記緩衝液）を加え攪拌した。得られた細胞溶解液をウェルごとに1.5 ml容のサンプルチューブに移し、150 μlのクロロホルムとメタノールの1:1（容量比）溶液を加え攪拌した。遠心分離（15000 回転/分、2分間）すると、上層（水/メタノール層）に分解産物のエタノールアミン（ethanolamine 1-3H）が、下層（クロロホルム層）に未反応の放射標識アナンダミドが分離される。上層の25 μlを96ウェルの有機溶媒耐性白色マイクロプレート（PicoPlate-96；PerkinElmer社）に移し、150 μlのマイクロシンチ20（PerkinElmer社）を加えマイクロプレートシンチレーションカウンター（TopCountTM；Beckman社）にて測定した。コントロールと比較して測定値を減少させる物質を、FAAH活性を阻害する物質として選択した。
(2) FAAH活性阻害物質のIC50値の測定
DMSOに10 mMになるように溶解した化合物を0.003 nM〜30 nMになるように、基質液に加え、上記に記載の方法でFAAH活性に及ぼす影響を調べた。ネガティブコントロールとしてDMSOを、ポジティブコントロールとしてURB597を10 μMになるように基質液に添加し、ポジティブコントロールの測定値を0%、ネガティブコントロールの測定値を100%としてIC50値を求めた。試験結果を表６４に示す。
以上の結果より、代表的な本発明化合物において、優れたFAAH阻害活性を有することが確認できた。また、FAAH若しくは機能的FAAHを発現している細胞に試験物質を接触させ、試験物質依存的なFAAH活性の変化を測定することにより、FAAH活性を阻害する物質、すなわち頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛剤をスクリーニングできることが示された。
実施例440
試験物質を投与したラットの組織破砕液を用いたFAAH活性を阻害する物質のスクリーニング
(1) ラットへの投与、及び組織破砕液の調製
2匹の9週齢のWistar系雄性ラット（日本SLC社）に0.5% メチルセルロース（MC）溶液に懸濁した試験物質を1〜3 mg/kgで経口投与した。コントロールとして2匹のラットには0.5% MC溶液を経口投与した。30分後に、エーテル麻酔下にて下大動脈から血液を採取した。その後、断頭し、大脳を採取した。
採取した血液 3 mlを等量の生理食塩水で希釈し、遠心チューブ内の3 mlの血球分離剤（Nycoplep；AXIS-SHIELD社）の上に静かに重層した。遠心分離（400×g、20分間）し、単球層を採取した。得られた単球を生理食塩水で２回洗浄し、測定まで-20℃で凍結保存した。
採取したラット脳に、重量の5倍容の氷冷した緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0)、1 mM EDTA）を加え、氷中でホモジナイザーにより、均一な溶液になるまで摩砕した。さらに超音波発生機（UR-20P（Power dial 4)；トミー精工社）により、5秒間、超音波破砕した。前記の凍結保存した単球には、氷冷した緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA）を100 μl加え、超音波発生機（UR-20P(Power dial 4)；トミー精工社）により5秒間、超音波処理した。脳、 単球の破砕液について、色素結合法（プロテインアッセイCBB溶液；ナカライテスク社）により蛋白質濃度を測定した。脳、単球の破砕液を緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.1 mg/ml BSA、100 mM NaCl）を用いて、蛋白質濃度がそれぞれ80 μg/ml、400 μg/mlになるように希釈し酵素液とした。
(2) FAAHの活性の測定
50 μlの酵素液に50 μlの基質液（2 μCi/ml 放射標識アナンダミド（Anandamide [ethanolamine 1-3H]（American Radiolabeled Chemical社））、8 μM アナンダミド（フナコシ社）、50 mM Tris-HCl（pH8.0)、1 mM EDTA）を加え室温にて１時間反応させた。200 μlのクロロホルムとメタノールの1:1（容量比）溶液を加え攪拌した。遠心分離（12000×ｇ、2分間）により、上層（水/メタノール層）に分解産物のエタノールアミン（ethanolamine 1-3H）が、下層（クロロホルム層）に未反応の放射標識アナンダミド（Anandamide [ethanolamine 1-3H]）が分離された。上層の25 μlを96ウェルの有機溶媒耐性白色マイクロプレート（PicoPlate-96；PerkinElmer社）に移し、150 μlのマイクロシンチ20（PerkinElmer社）を加えマイクロプレートシンチレーションカウンター（TopCountTM；Beckman社）にて測定した。
試験物質を投与していないコントロールラットの脳、単球の破砕液におけるFAAH活性を100%とし、組織破砕液を含まない緩衝液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.1 mg/ml BSA、100 mM NaCl）のFAAH活性を0%とし、試験物質を投与したラット組織破砕液のFAAH活性の相対値（%）を求めた。FAAH活性の相対値を低下させる物質を、FAAH活性を阻害する物質として選択した。
以上の結果より、試験物質を実験動物に投与した後、摘出した組織の破砕液における試験物質依存的なFAAH活性の変化を測定することにより、FAAH活性を阻害する物質、すなわち頻尿・尿失禁治療剤、過活動膀胱治療剤及び/又は疼痛治療剤をスクリーニングできることが示された。
実施例441
シクロフォスファミド（CPA）誘発頻尿ラットに対する化合物の作用
化合物の膀胱刺激症状改善作用を病態モデルを用いて検討した。シクロフォスファミド（CPA）は全身投与により代謝物であるアクロレインに変換され、尿中から膀胱粘膜を傷害することが知られている。ラットにおいては、CPA投与により出血性膀胱炎に伴う膀胱痛あるいは頻尿状態が誘発されるため、これら症状に対する薬効評価が可能である。実験には9週齢のWistar系雌性ラット（チャールスリバー社）を用いた。CPA（100 mg/kg）を腹腔内投与し、その２日後に実験を行った。化合物を経口投与（p.o.)し15分後に、蒸留水（30 ml/kg）を強制的に経口投与した。ラットを代謝ケージに入れ、排尿重量を1時間連続的に測定した。総排尿量を総排尿回数で割ることにより、有効膀胱容量を算出した。その結果、溶媒である0.5% メチルセルロース（MC）投与群においては有効膀胱容量が減少し、頻尿状態が認められた。有効経口投与量は、実施例２、２１８及び２６１の化合物では３mg/kg、実施例２２５、２２８、２７３、３１３、３２４、３２５、及び３５９の化合物では１mg/kgであった。これらの化合物は減少した有効膀胱容量を増加させ、頻尿状態を改善した。
実施例442
L5/L6脊髄神経結紮ラット（神経因性疼痛モデル）における化合物の抗アロディニア効果
ペントバルビタール麻酔下において、雄性5-6週齢SDラットの左側のL5およびL6脊髄神経を絹糸で結紮する手術を施した。鎮痛作用の評価法はvon Frey hair testを採用した。すなわち、動物の後足裏を毛髪(hair)でつつき、足上げ反応を起こす最小の毛髪の強度を機械刺激に対する反応閾値(log gram)とした。動物の手術側足の反応閾値は手術後7日目から14日目の間においては顕著に低下している（アロディニアの状態にある）ことが予備検討により確認出来たため、試験化合物の抗アロディニア効果は手術後７日目から14日目の間の何れかの日に評価した。試験化合物評価前日に、試験化合物投与前反応閾値を測定した。試験化合物投与前反応閾値の群間の平均値の差および群内のばらつきが小さくなるよう動物を群分けした。試験化合物評価試験においては試験化合物投与後反応閾値を測定した。試験化合物は反応閾値測定の60分前に経口投与した。試験化合物の抗アロディニア作用の効力は、溶媒投与群の手術側足および非手術側足の反応閾値をそれぞれ0％および100％と定義して算出した。その結果、実施例126の化合物は10 mg/kg経口投与において74％の効力を示した。
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本発明化合物は、優れたFAAH阻害活性を有することから、FAAHが関与する疾患、特に頻尿・尿失禁、過活動膀胱及び/又は疼痛、特に神経因性疼痛の治療に有用である。
以下の配列表の配列番号1の数字見出し＜223＞に、発明者を掲記する。

Claims (12)

  1. 一般式（III）で示されるピリジル 非芳香族含窒素ヘテロ環−１−カルボン酸エステル誘導体又はその製薬学的に許容される塩。
    Figure 0004702361
    [式（III）中の記号は以下の意味を示す。
    Ａ環：ベンゼン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロヘプタン環、
    又は５〜７員含窒素ヘテロ環、
    Ｌ：単結合、低級アルキレン、低級アルケニレン、-Ｎ（Ｒ15）-Ｃ（＝Ｏ）-、-Ｃ（＝Ｏ）-Ｎ（Ｒ15）-、
    -（低級アルケニレン）-Ｃ（＝Ｏ）-、-Ｏ-、又は-Ｃ（＝Ｏ）-、
    Ｒ15：Ｈ、又は低級アルキル、
    Ｘ：ＣＨ、又はＮ、
    Ｒ8〜Ｒ10：同一又は異なって、
    下記Ｇ群から選択される基、
    下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよいアリール、
    下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよい含窒素ヘテロアリール、
    Ｒ16-（低級アルキレン）-Ｏ-、Ｒ16-（低級アルキレン）-Ｎ（Ｒ15）-、
    又はＲ17Ｒ18Ｎ-Ｃ（＝Ｏ）-、
    Ｒ16：下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよいアリール、
    下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよい含窒素ヘテロアリール、又は３〜８員シクロアルキル、
    Ｒ17及びＲ18：同一又は異なって、Ｈ、低級アルキル、又は３〜８員シクロアルキル、
    （更に、Ｒ17及びＲ18は、結合しているＮ原子と一体となって、３〜８員含窒素ヘテロ環を形成してもよい。）、
    Ｇ群：Ｈ、ハロ、-ＣＮ、-ＣＦ3、低級アルキル、又は-O-低級アルキル、
    Ｒ11：Ｈ、低級アルキル、又はオキソ（＝Ｏ）、
    Ｒ12〜Ｒ14：同一又は異なって、Ｈ、低級アルキル、-Ｃ（＝Ｏ）-Ｏ-（低級アルキル）、-ＣＯ2Ｈ、又は-ＣＯＮＨ2 ]
  2. Ａ環がベンゼン環、シクロヘキサン環、ピペリジン環、又はピペラジン環である請求項１記載の化合物又はその製薬学的に許容される塩。
  3. Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13がＨである請求項２記載の化合物又はその製薬学的に許容される塩。
  4. 一般式（ＩV）で示されるピリジル 非芳香族含窒素ヘテロ環−１−カルボン酸エステル誘導体又はその製薬学的に許容される塩。
    Figure 0004702361
    [式（IV）中の記号は以下の意味を示す。
    Ａ1環：ベンゼン環、ピペリジン環、又はピペラジン環、
    Ｌ1：低級アルキレン、低級アルケニレン、-Ｎ（Ｒ15）-Ｃ（＝Ｏ）-、又は-Ｏ-、
    Ｒ15：Ｈ、又は低級アルキル、
    Ｒ19： 下記Ｇ群から選択される基、
    下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよい含窒素ヘテロアリール、
    Ｒ16-（低級アルキレン）-Ｏ-、又はＲ17Ｒ18Ｎ-Ｃ（＝Ｏ）-、
    Ｒ16：下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよいアリール、
    下記Ｇ群から選択される同一又は異なる基で置換されていてもよい含窒素ヘテロアリール、又は３〜８員シクロアルキル、
    Ｒ17及びＲ18：同一又は異なって、Ｈ、又は低級アルキル、
    （更に、Ｒ17、Ｒ18は、結合しているＮ原子と一体となって、５又は６員含窒素ヘテロ環を形成してもよい。）、
    Ｇ群：Ｈ、ハロ、-ＣＮ、-ＣＦ3、低級アルキル、又は-O-低級アルキル、
    Ｒ20：Ｈ、-Ｃ（＝Ｏ）-Ｏ-（低級アルキル）、-ＣＯ2Ｈ、又は-ＣＯＮＨ2 ]
  5. 一般式（V）で示されるピリジル 非芳香族含窒素ヘテロ環−１−カルボン酸エステル誘導体又はその製薬学的に許容される塩。
    Figure 0004702361
    [式（V）中の記号は以下の意味を示す。
    Ｌ2：低級アルキレン、低級アルケニレン、又は-（低級アルケニレン）-Ｃ（＝Ｏ）-、
    Ｒ21： Ｈ、ハロ、-ＣＮ、-ＣＦ3、低級アルキル、又は-O-低級アルキル、
    Ｒ22：Ｈ、-Ｃ（＝Ｏ）-Ｏ-（低級アルキル）、-ＣＯ2Ｈ、又は-ＣＯＮＨ2 ]
  6. ピリジン-3-イル 4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-カルボキシレート、
    5-{[(4-{4-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェノキシ}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ニコチン酸、
    5-({[4-(2-フェニルエチル)ピペリジン-1-イル]カルボニル}オキシ)ニコチン酸、
    5-[({4-[4-(2-シクロヘキシルエトキシ)フェノキシ]ピペリジン-1-イル}カルボニル)オキシ] ニコチン酸、
    5-[({4-[(E)-2-フェニルビニル]ピペリジン-1-イル}カルボニル)オキシ] ニコチン酸、
    5-{[(4-{3-[1-(6-メチルピリジン-2-イル)ピペリジン-4-イル]プロピル}ピペリジン-1-イル)カルボニル]オキシ}ニコチン酸、
    5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-{2-[3-(アミノカルボニル)フェニル]エチル}ピペリジン-1-カルボキシレート、
    5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-(2-{3-[(ジメチルアミノ)カルボニル]フェニル}エチル)ピペリジン-1-カルボキシレート、
    5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-{2-[3-(ピペリジン-1-イルカルボニル)フェニル]エチル}ピペリジン-1-カルボキシレート、
    5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-{2-[3-(ピロリジン-1-イルカルボニル)フェニル]エチル}ピペリジン-1-カルボキシレート、
    ピリジン-3-イル 4-[(2E)-3-フェニルプロパ-2-エノイル]ピペラジン-1-カルボキシレート、
    ピリジン-3-イル 4-(アニリノカルボニル)ピペリジン-1-カルボキシレート、
    5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-(2-フェニルエチル)ピペリジン-1-カルボキシレート、
    ピリジン-3-イル 4-(2-フェニルエチル)ピペラジン-1-カルボキシレート、
    5-(メトキシカルボニル)ピリジン-3-イル 4-(2-フェニルエチル)ピペラジン-1-カルボキシレート、
    5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-[2-(3-フルオロフェニル)エチル]ピペリジン-1-カルボキシレート、及び
    5-(アミノカルボニル)ピリジン-3-イル 4-[2-(3-シアノフェニル)エチル]ピペリジン-1-カルボキシレートからなる群から選択される請求項１記載の化合物、又はその製薬学的に許容される塩。
  7. 請求項１記載の化合物又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物。
  8. FAAH阻害剤である請求項７記載の医薬組成物。
  9. 頻尿・尿失禁及び/又は過活動膀胱の治療薬である請求項７記載の医薬組成物。
  10. 疼痛の治療薬である請求項７記載の医薬組成物。
  11. FAAH阻害剤、頻尿・尿失禁及び/又は過活動膀胱の治療薬の製造のための、請求項１記載の化合物又はその製薬学的に許容される塩の使用。
  12. FAAH阻害剤、疼痛の治療薬の製造のための、請求項１記載の化合物又はその製薬学的に許容される塩の使用。
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