JP4316374B2 - 乾燥止血組成物およびそれらの調製のための方法 - Google Patents

Description

（１．発明の分野）
本発明は、一般的に、コラーゲンおよびコラーゲン由来の組成物、ならびにそれらの調製のための方法に関する。詳細には、本発明は、増大した速度で水を吸収し得る、乾燥架橋ゼラチンまたは他のコラーゲンまたはコラーゲン由来組成物を生成するための方法に関する。

本出願の譲り受け人であるＦｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．は、商品名ＦｌｏＳｅａｌ（登録商標）の下、止血組成物を製造している。このＦｌｏＳｅａｌ（登録商標）製品は、２つのシリンジを備えるパッケージにおいて利用可能である。第１のシリンジは、緩衝溶液で予め水和されている架橋ウシゼラチンの顆粒で満たされている。ゼラチンヒドロゲルは、約８５％（ｗ／ｗ）の水を含み、そして流動可能なヒドロゲルの形態である。手術室での使用の直前に、生理食塩水中のトロンビンは、ゼラチンヒドロゲルと混合される。このトロンビンは、生理食塩水中で調製され、そして第２のシリンジの中に吸い上げられ、そしてこのシリンジは、互いに接続されて、トロンビンとゼラチンの混合を可能にする。

ゼラチンヒドロゲルの顆粒とトロンビンの得られた混合物は、出血部位に適用される場合、非常に有効な止血シーラントであることが見出されている。代表的には、このシーラントは、シーラントが混合されたシリンジを通じて、出血部位に適用される。血液は、ヒドロゲルの顆粒の得られたベッドを通じて濾過され、そしてトロンビンは、血液中でフィブリノーゲンと反応して、ゼラチンの周りにフィブリン血餅を形成して、出血部位を塞ぐ。

非常に有効ではあるが、現在のＦｌｏＳｅａｌ（登録商標）製品は、制限された保存期間を有する。ゼラチンの安定性は、パッケージ化したヒドロゲルの加水分解により低下すると考えられている。可能な加水分解による分解を制限するために、ＦｌｏＳｅａｌ（登録商標）製品は、通常、保温パッケージング中で出荷される。

これらの理由のため、コラーゲン、ゼラチン、または他のコラーゲン由来ヒドロゲルと、トロンビン含有水溶液とを合わせた型の改良された止血シーリング組成物を提供することが望ましい。詳細には、加水分解による分解に対して耐性であり、従って、より長い保存期間を有する形態のこのような組成物を提供することが望ましい。現在のＦｌｏＳｅａｌ（登録商標）製品に匹敵する止血活性およびより長い保存寿命の両方を有する、改良された処方物を提供することが特に望ましい。このような組成物は、これらが、引き続いての使用のために迅速に再水和され得る場合、最も有益であり、代表的には、その結果、これらは、シリンジを通じて押出され得る。これらの目的の少なくともいくつかは、本明細書中以下に記載される発明により達成される。

（２．背景技術の記載）
Ｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能であるＦｌｏＳｅａｌ（登録商標）製品は、Ｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．が資金を出している、１９９９年９月に公に出された、Ｈｏｏｄら、Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｔｏｐｉｃａｌ Ｈｅｍｏｓｔａｔ ＦｌｏＳｅａｌ^ＴＭ、Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙの要約に記載されている。ＦｌｏＳｅａｌ（登録商標）製品をカバーする特許としては、米国特許第６，０６３，０６１号および同第６，０６６，３２５号が挙げられる。コラーゲン、ゼラチン、または他のコラーゲン由来成分とＦｌｏＳｅａｌ^ＴＭ製品のトロンビン成分とを混合し送達するのに適したデュアルシリンジシステムは、米国特許第５，９０８，０５４号に記載される。これらの特許参考文献の各々の全体の開示は、本明細書中で参考として援用される。

（発明の簡単な要旨）
本発明は、改良された止血シーリング組成物、このような改良された組成物を調製するための方法、および改良された組成物を含むキットを提供する。これらの方法および組成物は、出血部位（外科的出血部位、外傷性出血部位などを含む）での止血を提供するために特に有用である。組成物の例示的使用は、血管カテーテル処置のための血管穿通の上をたどって組織をシーリングする際の使用であり得る。

組成物は、迅速に再水和するように調製されている乾燥架橋ゼラチン粉末を含む。このゼラチン粉末は、米国特許第６，０６３，０６１号および同第６，０６６，３２５号（これらの開示の全体は、以前に、参考として援用されている）に記載されるように、好ましくは、比較的大きな粒子（これはまた、フラグメントまたはサブユニットといわれる）を含む。好ましい粒子サイズは、１５０μｍ〜７５０μｍの範囲であるが、この好ましい範囲外の粒子サイズは、多くの状況における用途を見出し得る。乾燥組成物はまた、水性の再水和媒体に曝露される場合、有意な「平衡膨潤」を表す。好ましくは、膨潤は、４００％〜１０００％の範囲内であるが、上記の参考特許に示されるように、この範囲外であってもよい。「平衡膨潤」は、完全に水和され、従って、完全に膨潤された場合のゼラチンヒドロゲル粉末の重量から、ゼラチンヒドロゲル粉末の乾燥重量を減算することにより決定され得る。次いで、この差異は、乾燥重量で除算され、そして１００を乗算して、膨潤の測定値を得る。この乾燥重量は、実質的に全ての残余の水分を除去するのに十分な時間で、上昇した温度（例えば、１２０℃で２時間）に材料を曝露した後に測定されるべきである。材料の平衡水和は、含水量が一定になるのに十分な時間（代表的には、室温で１８〜２４時間）、適切な再水和媒体（例えば、生理食塩水）の中に乾燥材料を浸漬することにより、達成され得る。

本発明の乾燥架橋ゼラチン粉末は、通常、いくらかの残余の水分を有するが、所望の安定性および延長された保存寿命を達成するために十分に乾燥している。代表的には、乾燥組成物は、２０重量％（ｗ／ｗ）以下の水分含有量、好ましくは５重量％〜１５重量％の範囲内の水分含有量を有する。乾燥を維持するために、組成物は、本発明のキットと関連してより詳細に記載されるように、代表的には、水分の浸入を防ぐのに適した様式でパッケージングされる。

本発明の１つの特定の局面では、組成物は、２０％（ｗ／ｗ）以下の含水量を有する架橋ゼラチン粉末を含み、ここで、この粉末は、再水和補助剤の存在下で、再水和補助剤なしで調製された類似の粉末の再水和速度よりも、少なくとも５％高い水性再水和速度を有するように架橋される。この「再水和速度」は、本明細書中で、３０秒以内に、１ｇの粉末（乾燥重量ベース）により吸収される、水溶液（代表的には、０．９％（ｗ／ｗ）生理食塩水）の量（ｇｍ／ｇｍで表される）を意味すことを定義される。この速度を測定するための特定の技術は、本明細書中以後の実験の節に記載される。本発明の好ましい組成物は、少なくとも３ｇｍ／ｇｍ、好ましくは、少なくとも３．５ｇｍ／ｇｍ、および頻繁に３．７５ｇｍ／ｇｍ以上の再水和速度を有する。再水和補助剤なしに調製された類似の粉末の再水和速度は、代表的には、３未満であり、そして再水和速度におけるパーセンテージの増加は、通常、少なくとも５％であり、好ましくは、少なくとも１０％であり、そしてより好ましくは、２５％以上である。

改善された再水和速度を有する本発明の乾燥架橋ゼラチン粉末は、好ましくは、特定の再水和補助剤の存在下で粉末を調製することにより得られる。このような再水和補助剤は、粉末の調製の間存在するが、通常、最終生成物からは除去される。例えば、約２０％の総固体含有量で存在する再水和補助剤は、代表的には、最終生成物の１％未満、頻繁に、０．５重量％未満に減少される。例示的な再水和補助剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（好ましくは、約１０００の分子量を有する）；ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（好ましくは、約５０，０００の平均分子量を有する）；およびデキストラン（好ましくは、約４０，０００の平均分子量を有する）が挙げられる。本発明の組成物を調整する場合、少なくとも２つのこれらの再水和補助剤を用いることことが好ましく、そして３つ全てを用いることがさらに特に好ましい。

従って、本発明の方法は、再水和補助剤と結合した非架橋ゼラチンの水溶液を提供することを包含する。非架橋ゼラチンは、代表的には、５％（ｗ／ｗ）〜１５％（ｗ／ｗ）で水溶液中に存在し、そして再水和補助剤は、代表的には、水溶液中のゼラチンの重量ベースで５％〜３０％（ｗ／ｗ）存在する。好ましくは、再水和補助剤は、ゼラチンの重量ベースで２．５％〜２０％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ、１．２５％〜２０％（ｗ／ｗ）のＰＶＰ、および１．２５％〜２０％（ｗ／ｗ）のデキストランを含む。

次いで、再水和補助剤と共に非架橋ゼラチンは、ヒドロゲルを形成するのに適した任意の様式で架橋される。例えば、ポリマー分子は、２つ以上のポリマー分子鎖に共有結合する二官能性架橋剤または多官能性架橋剤を用いて架橋され得る。例示的二官能性架橋剤としては、アルデヒド、エポキシ、スクシンイミド、カルボジイミド、マレイミド、アジド、カルボネート、イソシアネート、ジビニルスルホン、アルコール、アミン、イミデート、アンヒドライド、ハライド、シラン、ジアゾアセテート、アジリジンなどが挙げられる。あるいは、架橋は、酸化剤およびポリマー上の側鎖または部分を活性化して、その結果、これらが他の側鎖または部分と反応して架橋結合を形成し得る、他の薬剤（過ヨウ素酸）を用いて達成され得る。架橋のさらなる方法としては、ポリマーを放射線（例えば、γ線）に曝露して、ポリマー鎖を活性化して架橋反応を可能にすることが挙げられる。脱水熱（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ）架橋法もまた適切である。ゼラチン分子を架橋するために好ましい方法は、以下に記載される。

架橋されたゼラチンを生成するための例示的方法は以下の通りである。ゼラチンを得、そして水溶液中に懸濁して、代表的には、１重量％〜７０重量％、通常、３重量％〜１０重量％の固体含有量を有する、非架橋ヒドロゲルを形成する。ゼラチンは、代表的には、グルタルアルデヒド（例えば、０．０１％〜０．０５％ｗ／ｗ、水性緩衝液中で０℃〜１５℃で一晩）、過ヨウ素酸ナトリウム（例えば、０．０５Ｍ、０℃〜１５℃で４８時間維持）、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（「ＥＤＣ」）（例えば、０．５％〜１．５％ｗ／ｗ、室温で一晩）のいずれかへの曝露によってか、あるいは約０．３〜３メガラドのガンマ線照射または電子線照射によって、架橋される。あるいは、ゼラチン粒子は、１重量％〜７０重量％、通常、３重量％〜１０重量％の固体含有量で、アルコール（好ましくは、メチルアルコールまたはエチルアルコール）中に懸濁され得、そして架橋剤、代表的には、グルタルアルデヒド（例えば、０．０１％〜０．１％ ｗ／ｗ、室温で一晩）への曝露により架橋され得る。アルデヒドの場合、ｐＨは、約６〜１１、好ましくは、７〜１０に保持すべきである。グルタルアルデヒドを用いる架橋の場合、架橋は、引き続いての還元により（例えば、水素化ホウ素ナトリウムでの処理により）安定化され得うる、Ｓｃｈｉｆｆ塩基を介して形成される。架橋の後、得られた顆粒は、水で洗浄され得、そして必要に応じて、アルコールでリンスされ得、そして乾燥され得る。次いで、得られた乾燥粉末は、本明細書中以下により詳細に記載されるように、本発明のアプリケーターへと充填され得る。

架橋の後、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）の再水和補助剤が、得られたヒドロゲルから除去される。通常、再水和補助剤は、ヒドロゲルの濾過、次いで、得られたフィルターケークの洗浄により除去される。このような濾過／洗浄工程は、所望のレベルまで生成物を洗浄し、そして、元々存在する、再水和補助剤の少なくとも５０％を除去するため、好ましくは、再水和補助剤の少なくとも９０％（ｗ／ｗ）を除去するために、１回以上繰り返され得る。

濾過の後、ゼラチンは、代表的には、生成された最終のフィルターケークを乾燥することにより、乾燥される。次いで、この乾燥したフィルターケークは、破壊または粉砕されて、上に示す所望の範囲内の粒子サイズを有する架橋粉末を生成し得る。

本発明に従うキットは、上記のように、本発明の乾燥架橋ゼラチン粉末を保持する第１の容器を含む。キットは、水性再水和媒体、代表的には、生理食塩水、またはゼラチンが再水和される場合にゼラチンと混合されることが意図されるトロンビンを含む他の水溶液を保持する、第２の容器をさらに含む。これらの容器は、任意の形態であり得るが、好ましくは、乾燥ゼラチンと再水和媒体との混合を可能にするシリンジの形態である。

（特定の実施形態の説明）
以下の実施例は、限定目的ではなく、例示目的ために与えられる。

（実施例１：ゼラチン粉末の調製）
ウシ真皮のストリップを、室温で１時間、１Ｍ〜２Ｍの濃度の水酸化ナトリウム溶液に懸濁し、リン酸で中和し、そしてリンスした。次いで、処理したストリップを、脱イオン水に再懸濁し、ｐＨ７〜８に調整し、そして７０℃に加熱した。ホモジナイザーを用いて、ストリップのサイズをさらに小さくした。７０℃にて１時間後、この真皮は、ゼラチンへとほとんど溶解された。真皮の量を、得られたゼラチン溶液の固体含有量が約３〜１０％（ｗ／ｗ）、代表的には、７〜１０％となるように選択した。溶液を、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）をコーティングした金属トレイ上で薄層としてキャストし、乾燥し、そして粉砕して、ゼラチン粉末を形成した。

（実施例２：「改良されたゼラチン粉末」の調製）
再水和補助剤（表１）を、５００ｍＬの５０℃の脱イオン水に溶解し、次いで、実施例１のように調製した、ある量のウシ由来ゼラチン粉末を、この溶液に加えた。溶液中のゼラチンの最終濃度は、約８％（ｗ／ｗ、バルクのゼラチン粉末ベース）となるように選択し、そして溶液中の再水和補助剤の総量を、実施例９〜４４（表１および２）のように選択した。ゼラチンが溶解した後、この溶液をＴｅｆｌｏｎ（登録商標）をコーティングした金属トレイへと注ぎ、そして乾燥した。乾燥したゲルシートを、粉砕して、「改良されたゼラチン粉末」を形成した。

あるいは、ウシ真皮のストリップを、室温で１時間１Ｍ〜２Ｍの濃度の水酸化ナトリウム中に懸濁し、リン酸で中和し、そしてリンスした。次いで、処理したストリップを、脱イオン水に再懸濁し、ｐＨ７〜８に調整し、そして７０℃に加熱した。ホモジナイザーを用いて、ストリップのサイズをさらに小さくした。７０℃にて１時間後、この真皮は、ゼラチンへとほとんど溶解された。真皮の量を、得られたゼラチン溶液の固体含有量が約３〜１０％（ｗ／ｗ）、代表的には、７〜１０％となるように選択した。再水和補助剤の量を実施例９〜４４（表１および２）のように選択し、次いで、このゼラチン溶液に、溶液形態かまたは少量の水に溶解させてかのいずれかで加えた。溶液を、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）をコーティングした金属トレイ上で薄層へとキャストし、乾燥し、そして粉砕して、「改良したゼラチン粉末」を形成した。改良したゼラチンについてのいくつかの処方の例を、表１および２に与える。

（実施例３：「改良されたゼラチン粉末」からの架橋ゼラチン粉末形態の調製）
６００ｍＬの０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ９．２±０．２）を、１２℃未満の温度に冷却した。０．３２ｍＬのグルタルアルデヒド（２５％）を緩衝溶液に加え、次いで、２０ｇの改良したゼラチン粉末を加え、４０００ｐｐｍ（グルタルアルデヒド 対 改良したゼラチン、バルク重量ベース）のグルタルアルデヒド濃度を得た。このゼラチンを、攪拌子と共に、グルタルアルデヒド溶液中に再懸濁した。各懸濁液のｐＨを、９．２±０．２の範囲に調整し、次いで、１９時間にわたって、９〜１２℃の温度および９．２±２のｐＨで維持した。

懸濁液を濾過し、そしてフィルターケークを、脱イオン水でフィルターケークを完全に覆うことにより、脱イオン水で３回洗浄し、次いで、減圧して、ケークを通してリンス水を吸引させた。このフィルターケークを、各リンスの間、漏斗に置いた。

０．２ｇのＮａＢＨ４を、ビーカー中、６００ｍＬの２５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、０．２中に溶解した。上記のフィルターケークを室温（約２２℃）で３時間ＮａＢＨ４溶液に懸濁し、次いで、濾過して液体を除去した。

次いで、フィルターケークを、室温（約２２℃）にて３０分間、６００ｍＬの緩衝溶液中に懸濁し、そして再度濾過した。緩衝液を、リン酸ナトリウム（二塩基性無水物および一塩基性一水和物）およびアスコルビン酸ナトリウムから構成した。上記の手順を、適切な割合の塩 対 ゼラチンが存在して、再構築の際に所望の緩衝液組成を形成することを確実にするために二回繰り返した。フィルターケークを乾燥し、Ｗａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｅｒで粉砕し、「架橋ゼラチン粉末」を得た。

この方法をまた用いて、改良されたゼラチン粉末（すなわち、再水和補助剤を調製の間に添加したゼラチン）から架橋ゼラチン粉末を調製した。

（実施例４：架橋ゼラチン粉末からの照射した生成物の調製）
実施例２のように調製した、約８００ｍｇ（バルク重量）の架橋ゼラチン粉末を、数本の５ｃｃシリンジの各々に入れた。粉末を含有するシリンジを、周囲温度でγ照射を用いて滅菌した。

（実施例５：止血剤としての生成物の使用）
約０．８ｇの照射した架橋ゼラチン粉末を含む生成物のシリンジを、改良したゼラチン粉末から調製した。改良したゼラチン粉末を、実施例２のように調製した。改良したゼラチンを、実施例３および４のように、さらに架橋および照射した。生成物を、１ｍｌあたり約１０００単位のウシトロンビンを含む、４ｍＬの生理食塩水と混合した。混合を、雌−雌 直通型（ｆｅｍａｌｅ−ｆｅｍａｌｅ ｓｔｒａｉｇｈｔ−ｔｈｒｏｕｇｈ）Ｌｕｅｒコネクタで連結した２つのシリンジの間を行き来させることにより達成した。シリンジ中の粉末は、この粉末がトロンビン溶液と混合されたときに、水和されてヒドロゲルの顆粒を形成する。

正方形の損傷（約１ｃｍ×１ｃｍ×０．２ｃｍの深さ）を、家畜グレードのブタの肝臓に作製した。このブタは、ヘパリンを用いて抗凝固処置がなされており、その結果、活性凝固時間（ＡＣＴ）が基準値の３〜５倍であり、そしてこの損傷は処置の前にとめどなく出血していた。混合の開始から約３０秒後、約２ｍＬの水和した粉末を、シリンジからこの損傷上に押出し、そして２分間圧迫しながら所定の位置に保持した。圧迫をやめた後、処置した損傷を、適用の３分後、１０分後、および５０分後での出血について観察した。３分および１０分の観察では、処置した損傷からの出血は見られなかった。１０分の観察の後、処置した損傷を生理食塩水で洗浄した。過剰な材料が除去される一方で、再出血は観察されなかった。適用の５０分後、損傷を再度観察したが、出血は見られなかった。

（実施例６：粉末の再水和速度の決定）
粉末の「再水和速度」を、以下のように測定した。５ｃｃのシリンジに充填した粉末を、３０秒間Ｌｕｅｒフィッティングで連結した２つのシリンジの間の通過によって、ある容量の水溶液を含むシリンジと混合した。水溶液の容積を、３０秒以内に吸収されると予想される容積よりも多くなるように選択した。代表的には、０．８ｇ（バルク重量）を３ｍＬの０．９％塩化ナトリウム溶液と混合した。次いで、得られた混合物を、迅速に濾過して、任意の吸収されない液体を除去した。濾過した湿った材料を計量し、次いで、１２０℃のオーブンで２時間乾燥し、そして再び計量した。この測定は、湿った材料から除去された水の総量および乾燥粉末の重量を与えた。次いで、粉末により吸収された水の量を、元々粉末中に存在した残余の水分について小さな補正を行った後に計算した。「再水和速度」を、その３０秒の間隔で、１ｇの粉末の乾燥重量あたりの吸収された生理食塩水溶液の質量として与えた。

以下の計算において、バルク粉末「Ｓ」の画分固体を、１２０℃で２時間、バルク粉末を乾燥することにより独立して測定し、そして乾燥の前後で粉末の重量を計量した。Ｓの値は、以下により与えられる：

再水和速度計算：
Ａ：パンおよびろ紙の初期重量
Ｂ：パン、ろ紙、および水和した粉末の重量
Ｃ：パン、ろ紙、およびオーブンで乾燥した後のサンプルの重量
Ｓ：シリンジ中の元々のバルク粉末の画分固体
Ｍ：混合の間の１グラムの粉末（乾燥重量）あたりの吸収された生理食塩水のグラム（「吸収率」）

（実施例７：粉末生成物のいくつかのバッチについての再水和速度および物理的特性の決定）
表１および２は、粉末生成物のいくつかのバッチについてそれらで実行される再水和速度測定の結果を示す（実施例９〜２３）。これらは、実施例１、２、３、および４による方法を使用して作製した。実施例９および１７を除いて、これらは、種々の割合のゼラチンおよび以下の再水和補助剤を用いて作製された改変ゼラチンから調製した：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、平均分子量１０００；ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、「ｋ−３０」と指定、約５０，０００の平均分子量に対応する；およびデキストラン、平均分子量４０，０００。

種々の異なる組合せのゼラチンおよび再水和補助剤の使用が、再水和補助剤を添加しなかったゼラチンから作製される粉末生成物よりも多い、３０秒での粉末１ｇ当たりの生理食塩水溶液を吸収する粉末生成物を生じ得ることが分かる。改変ゼラチン中において、８０：１０：５：５のバルク重量比のゼラチン、ＰＥＧ、ＰＶＰおよびデキストランの組合せ（実施例１０）が、非改変ゼラチンから作製された粉末生成物よりも、約３３％多い、３０秒での１ｇ当たりの生理食塩溶液を吸収する粉末生成物を生成することも分かる。

表１はまた、粉末生成物ロットについて決定された他の物理的特性についての値を与える。「％固体」は、残留水分を追い出すための２時間の１２０℃での乾燥の前後で粉末を秤量することによって決定された。「ＤＳＣピーク温度」とは、１℃〜７０℃で実施された示差走査熱量測定のサーモグラムにピークが示される温度をいう。「平衡膨潤」は、粉末を過剰の生理食塩溶液中で少なくとも１８時間室温で懸濁させることによって決定された。水和粉末は、その「平衡湿潤重量」を決定するために秤量され、そして１２０℃で２時間乾燥され、そしてその「乾燥重量」を決定するために再秤量された。平衡膨潤は、以下によって与えられる：

。

「平均粒径」についての値は、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ粒径分析計で光散乱によって測定した。

表１に提示されるデータから、再水和補助剤の適切な使用が、他の物理的特性を有意に変化させることなく粉末生成物の再水和速度を変化させ得ることが明らかである。

（実施例８：改変ゼラチン粉末および架橋粉末における、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、およびデキストランレベルの測定）
約５０ｍｇの改変ゼラチンまたは２５０ｍｇの架橋照射粉末生成物を、１０ｍＬの脱イオン水中に懸濁させ、そして３時間６５℃に加熱した。次いで、サンプルを、１５分間２０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた上清を、０．４５μｍ Ｇｅｌｍａｎ Ａｃｒｏｄｉｓｃフィルタを通して濾過し、最初の１ｍＬを捨てた。次いで、得られたサンプルを、３つの異なる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法によってアッセイして、サンプル中のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、およびデキストランを定量した。ＰＥＧについて、１００μＬのサンプルを、移動相として脱イオン水を使用して、ガードカラムおよびプレフィルタを伴うＷａｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ １２０カラム（７．８×３００ｍｍ）上に、注入した。屈折率検出計を使用して、溶出物をモニターした。ＰＶＰについて、１００μＬのサンプルを、移動相として、メタノールおよび水性リン酸ナトリウムの勾配を使用して、ガードカラムおよびプレフィルタを伴うＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｇｓｏｒｂ Ｃ１８ ５μｍカラム（４．６×１５０ｍｍ）上に注入した。紫外線吸光度検出器を使用して、溶出物をモニターした。デキストランについて、１００μＬのサンプルを、移動相として９０：１０の比の０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）およびアセトニトリルを使用して、ガードカラムおよびプレフィルタを伴うＷａｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｌｉｎｅａｒカラム（７．８×３００ｍｍ）上に注入した。屈折率検出計を使用して、溶出物をモニターした。全てのカラムを分析のために４０℃まで加熱した。定量化の限界は、ＰＥＧおよびＰＶＰについて約０．１％（ｗ／ｗサンプル）、デキストランについて０．２％（ｗ／ｗサンプル）であった。

改変ゼラチンを、実施例２により調製した。この改変ゼラチンを、上記様式で、ＰＥＧ、ＰＶＰおよびデキストランについて分析した。結果は、ＰＥＧ、ＰＶＰ、およびデキストランが、それぞれ、１６％、８％、および３％（ｗ／ｗバルク）で存在したことを示した。改変ゼラチンを、引き続いて、架橋、水素化ホウ素ナトリウム処理および実施例３によるリンスに供して、架橋改変ゼラチン粉末を形成した。この粉末をＰＥＧ、ＰＶＰ、およびデキストランについて、上記の様式でＨＰＬＣにより分析し、３つの再水和補助剤のそれぞれの含有量が、定量の限界未満であることを見出した。

（実施例９：再水和補助剤なしで作製された粉末生成物）
未改変ゼラチン（すなわち、処理補助剤が添加されなかったゼラチン）を、実施例１のようにウシ真皮小片から調製し、そして実施例３に記載されるように架橋した。次いで、架橋未改変ゼラチンをシリンジ内に詰め、そして実施例４のようにγ線照射した。得られる生成物の物理的特性を、実施例６および７のように測定し、そして表１に与える。

（実施例１０〜２３：再水和補助剤を用いて作製された粉末生成物）
改変ゼラチンのバッチを、ゼラチン粉末または真皮小片から、そして１、２、または３種の再水和補助剤から実施例２のように調製した。表１は、使用されるバルクゼラチンおよび再水和補助剤の割合を与える。次いで、改変ゼラチンを、実施例３のように架橋させた。実施例１７を除いて、使用された再水和補助剤は、以下のリストからであった：平均分子量約１０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；平均分子量約５０，０００のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、「ｋ−３０」と指定；および平均分子量約４０，０００のデキストラン。実施例１７において、約４００の平均分子量ＰＥＧを使用した。次いで、架橋改変ゼラチンをシリンジに詰め、そして実施例４のようにγ線照射した。これらの調製物のそれぞれから得られた粉末生成物の物理的特性を、実施例６および７のように測定し、そして表１に与えた。実施例１０についての処方を用いて与えられたデータは、その処方に従って調製された９つのバッチの平均および標準偏差である。

（実施例２４〜４４：種々の再水和補助剤を用いて作製された粉末生成物）
改変ゼラチンのバッチを、ゼラチン粉末または真皮小片から、そして数種の再水和補助剤のうちの１つから、実施例２のように調製した。表２は、再水和補助剤に対するバルクゼラチン重量の比として、および改変ゼラチンを調製するために使用される全バルク溶質の割合として、各バッチにおいて使用される再水和補助剤の同一性および濃度を与える。次いで、改変ゼラチンを、実施例３のように架橋した。次いで、架橋改変ゼラチンを、シリンジに詰め、そして実施例４のようにγ照射した。これらの調製の各々から得られた粉末生成物の物理的特性を、実施例６および７のように測定した。そしてこれらを表２に与える。実施例９の処方についてにデータを、比較のために表２に提供する。

上記は、本発明の好ましい実施形態の完全な記載であるが、種々の代替、改変、および等価物が使用され得る。従って、上記記載は、本発明の範囲の制限としてとられるべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。

図１は、本発明の原理に従って構築されたキットを示す。

Claims (17)

1. 実質的乾燥架橋ゼラチン粉末を調製するための方法であって、該方法が、以下の工程：
   再水和補助剤と組み合わせた非架橋ゼラチンを含む水溶液を提供する、工程；
   該ゼラチンを架橋する、工程；
   該再水和補助剤の少なくとも５０％（ｗ／ｗ）を除去する、工程；ならびに
   該架橋ゼラチンを乾燥および粉砕して、２０％（ｗ／ｗ）未満の水分含有量を有する粉末を生成する、工程、
   を包含し、
   ここで、該再水和補助剤が、
   １０重量％のＰＥＧ−１０００、５重量％のＰＶＰ、および５重量％のデキストラン；
   １０重量％のＰＥＧ−１０００、および１０重量％のＰＶＰ；
   １０重量％のＰＶＰ、および１０重量％のデキストラン；
   １１重量％のＰＥＧ−１０００；
   ２０重量％のＰＥＧ−１０００；
   ６重量％のＰＶＰ；
   １１重量％のＰＶＰ；
   ２０重量％のＰＶＰ；
   ６重量％のデキストラン；および
   １４重量％のＰＥＧ−８０００、
   からなる群より選択される処方物を含む、
   方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記再水和補助剤が、
   １０重量％のＰＥＧ−１０００、５重量％のＰＶＰ、および５重量％のデキストラン；
   １０重量％のＰＥＧ−１０００、および１０重量％のＰＶＰ；
   ２０重量％のＰＥＧ−１０００；
   １１重量％のＰＶＰ；
   ２０重量％のＰＶＰ；および
   １４重量％のＰＥＧ−８０００、
   からなる群より選択される処方物を含む、
   方法。
3. 請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法であって、前記架橋する工程が、前記ゼラチン溶液に架橋剤を添加することを包含する、方法。
4. 請求項３に記載の方法であって、前記架橋剤が、グルタルアルデヒドを含む、方法。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、前記再水和補助剤の少なくとも５０％を除去する工程が、溶媒中の前記架橋した粉末の懸濁液を濾過し、フィルターケークを生成すること、および該フィルターケークを洗浄して、該再水和補助剤を除去することを包含する、方法。
6. 請求項５に記載の方法であって、前記フィルターケークを洗浄する工程が、前記ゼラチンに元々存在する前記再水和補助剤の少なくとも９０％（ｗ／ｗ）を除去する、方法。
7. 請求項５または６に記載の方法であって、前記乾燥する工程が、洗浄後に前記フィルターケークを乾燥することを包含し、ここで、該方法が、前記粉砕したフィルターケークを乾燥して、該乾燥粉砕ゼラチン粉末を生成する工程をさらに包含する、方法。
8. ２０％（ｗ／ｗ）以下の水分含有量を有する架橋ゼラチン粉末を含む組成物であって、該粉末が、再水和補助剤の存在下で架橋されており、その結果、該粉末が、該再水和補助剤なしで調製された類似の粉末の再水和速度よりも、少なくとも５％高い水性再水和速度を有し、
   ここで、該再水和補助剤が、
   １０重量％のＰＥＧ−１０００、５重量％のＰＶＰ、および５重量％のデキストラン；
   １０重量％のＰＥＧ−１０００、および１０重量％のＰＶＰ；
   １０重量％のＰＶＰ、および１０重量％のデキストラン；
   １１重量％のＰＥＧ−１０００；
   ２０重量％のＰＥＧ−１０００；
   ６重量％のＰＶＰ；
   １１重量％のＰＶＰ；
   ２０重量％のＰＶＰ；
   ６重量％のデキストラン；および
   １４重量％のＰＥＧ−８０００、
   からなる群より選択される処方物を含む、
   組成物。
9. 請求項８に記載の組成物であって、前記粉末が、前記再水和補助剤なしで調製された類似の粉末の再水和速度よりも、少なくとも１０％高い再水和速度を有し、該再水和補助剤が、
   １０重量％のＰＥＧ−１０００、５重量％のＰＶＰ、および５重量％のデキストラン；
   １０重量％のＰＥＧ−１０００、および１０重量％のＰＶＰ；
   ２０重量％のＰＥＧ−１０００；
   １１重量％のＰＶＰ；
   ２０重量％のＰＶＰ；および
   １４重量％のＰＥＧ−８０００、
   からなる群より選択される処方物を含む、
   組成物。
10. 請求項８〜９のいずれか一項に記載の組成物であって、前記粉末が、１５０μｍ〜７５０μｍの範囲の平均粒径を有する、組成物。
11. 請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物であって、前記粉末が、４００％〜１０００％の範囲の平衡膨潤を有する、組成物。
12. キットであって、以下：
    請求項８〜１１のいずれか一項に記載の架橋ゼラチン粉末を保持する、第１容器；おおび
    水性再水和媒体を保持する、第２容器、
    を備える、キット。
13. 請求項１２に記載のキットであって、前記第１容器が、シリンジである、キット。
14. 請求項１３に記載のキットであって、前記第２容器が、シリンジである、キット。
15. 請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のキットであって、前記水性再水和媒体が、トロンビンを含む、キット。
16. 請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のキットであって、前記架橋ゼラチン粉末および前記再水和媒体を組み合わせて、トロンビン含有フラグメント化ゼラチンヒドロゲルを生成し、そして該ヒドロゲルを創傷部位に適用するための方法を記載する、使用説明書をさらに備える、キット。
17. 請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のキットであって、前記第１容器および第２容器を保持するパッケージをさらに備える、キット。

Images