JP4304229B2 - 細胞の運命を変化させる方法 - Google Patents
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Description
一般に本発明は、細胞を所望の細胞型に変える方法、およびこのように再プログラムされた細胞を、疾患の治療または予防を目的として哺乳類に投与する方法を特徴とする。
本発明の目的は、細胞の特徴または機能を変える方法を提供することである。
発明者らは、細胞または細胞の遺伝的材料を再プログラム用培地(例えば細胞抽出物)に曝露する、新しい再プログラム法を開発した。ここで言う再プログラム処理とは、ドナー細胞に特異的な遺伝子群の発現を低下させたり除去したりすること、または他の細胞型に特異的な遺伝子群の発現を上昇させることを意味する。例えば発明者らは、刺激T細胞抽出物中で休止期T細胞、B細胞、または線維芽細胞の核をインキュベートすると、T細胞特異的転写因子が抽出物から核内へ移行することを既に報告している。また休止期T細胞、線維芽細胞、内皮細胞(HUVEC)、分化上皮細胞(HeLa)、およびニューロン前駆細胞(NT2)の核の再プログラムにより、核で通常抑制されているIL-2遺伝子の発現が誘導された。休止期T細胞および線維芽細胞の核が再プログラムされると、IL-2遺伝子の過剰なアセチル化、および染色質リモデリング複合体の核内結合も誘導された。したがって抽出物などの再プログラム用培地を使用することで、再プログラム用培地の調製に使用される細胞の発現プロファイルに似せるように、ドナー細胞の遺伝的材料の発現プロファイルを変化させることができる。
細胞を再プログラムする以下の方法では、核を間期細胞から単離し、間期用再プログラム用培地(例えば間期細胞抽出物)中で、再プログラム用培地に由来する因子の核への付加、または核からの因子の除去を可能とする条件下でインキュベートする。好ましくは核は、インキュベーション中に膜に結合した状態で留まる。再プログラムされた核を、次に再プログラム用培地から単離し、レシピエントの細胞もしくは細胞質体に導入する。
好ましくは、再プログラムされた細胞が投与される被験者の細胞をドナー核の供給源として使用する。一方で、同じ種の他の細胞、または異なる種もしくは属の細胞を使用することができる。数百万個もの核を、培養中に同期させた細胞集団、または非同期細胞集団から単離することができる。このような細胞集団は、天然の状態で同期させたり化学的に同期させたりすることができる。好ましくは、集団中の少なくとも40%、60%、80%、90%、または100%の細胞を、標準的な手順で、細胞周期(G0、G1、S、またはG2など)の一つもしくは複数の相の間期で停止させる。
間期培養細胞を標準的な方法で回収し、10 mlの円錐管中で500×gで4℃で10分間遠心して洗浄する。この細胞は好ましくは、レシピエントの細胞または細胞質体になることが望まれる所望の細胞型である。上清を捨て、細胞のペレットを総容積50 mlの冷PBSに再懸濁する。細胞を500×gで4℃で10分間遠心する。この洗浄段階を繰返し、細胞ペレットを約20倍容の氷冷間期用細胞溶解用緩衝液(20 mM Hepes、pH 8.2、5 mM MgCl2、1 mM DTT、10 μM アプロチニン、10 μM ロイペプチン、10 μM ペプスタチンA、10 μM ダイズトリプシンインヒビター、100 μM PMSF、また任意選択で20 μg/ml サイトカラシンB)に再懸濁する。細胞を800×gで4℃で10分間遠心して沈降させる。上清を捨て、細胞ペレットをわずか1倍容の間期細胞用溶解緩用衝液中に慎重に再懸濁する。この細胞を氷上で1時間インキュベートして細胞を膨潤させる。この細胞を、先端超音波処理装置を用いた超音波処理により、またはガラス製のモルタルおよび内筒を用いたダウンスホモジナイザーで溶解させる。細胞溶解は、少なくとも90%の細胞および核が溶解するまで続ける(溶解程度は位相差顕微鏡で評価できる)。少なくとも90%の細胞および核を溶解するのに要する超音波処理時間は、抽出物の調製に使用される細胞の種類によって変動する。
単離直後の精製核、または解凍後の精製核のいずれかを、上記セクションに記載された再プログラム用培地に、4,000〜5,000 核/μlの濃度になるように再懸濁する。ATP産生系(1 mM ATP、10 mM クレアチンリン酸、25 μg/ml クレアチンキナーゼ)、および100 μMのGTPを間期抽出物に添加して、外因性の核による核成分の活発な取込みを促す。この反応物は30℃で最長2時間インキュベートする。特定の核成分の取込みは、図3Aおよび図6A示されるように、核の免疫蛍光解析でモニタリングすることができる。
再プログラムされた核を、核用緩衝液中で4℃で調製した1 M ショ糖クッションを用いて1,000×gで10〜30分遠心する。核を500 μlの冷核用緩衝液に再懸濁し、1,000×gで4℃で10分間心して洗浄する。核を核用緩衝液中で再懸濁し、レシピエントの細胞の細胞質もしくは細胞質体に核を輸送するまで氷上に置く。
好ましくは、レシピエント細胞に含まれるDNAの一部もしくは全体を除去するか、または不活性化する。レシピエント細胞のDNAを破壊もしくは除去することで、細胞の遺伝的材料が、再プログラムされた細胞の特徴および機能に寄与しなくなる。細胞の核を破壊する方法の一つでは紫外光を照射する(Gurdon、「Methods in Cell Biology、Xenopus Laevis:Practical Uses in cell and Molecular Biology」、KayおよびPeng編、Academic Press、California、第36巻:299〜309、1991)。あるいは、核を任意の標準的な手法で外科的に除去することができる(例えばMcGrathおよびSolter、Science 220:1300〜1319、1983を参照)。一つの可能な方法では、ニードルを細胞内に刺し、核をニードル内の空間に吸引する。次にニードルを、形質膜を破裂することなく細胞から除くことができる(米国特許第4,994,384号および第5,057,420号)。
核を所望の細胞型、または他の任意の細胞型のレシピエントの細胞または細胞質体に、微量注入法や電気融合法などの標準的な方法で導入する(例えば米国特許第4,997,384号および第5,945,577号を参照)。再構成された細胞を培養物中に戻し、回復させ、分裂させ、また再プログラム経路にしたがって分化させる。再プログラムされた細胞の遺伝子発現は、標準的なノーザン解析でモニタリングすることでmRNA分子、好ましくはドナー細胞、レシピエント細胞、または所望の細胞型に特異的なmRNA分子の発現を測定することができる(Ausubelら、前出)。特異的なmRNA分子の発現は、対象となるmRNA分子に特異的に結合するように作製されたプライマーを用いた標準的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)アッセイ法でも検出できる。あるいは複数の細胞特異的mRNA分子の発現は、cDNAアレイを用いた標準的なDNAチップ技術でモニタリングすることができる(Marrackら、Current Opinion in Immunology 12、206〜209、2000;Harkin、Oncologist. 5:501〜507、2000;Pelizzariら、Nucleic Acids Res. 2;28(22):4577〜4581、2000;Marx、Science 289 (5485):1670〜1672、2000)。この細胞をドナー細胞、レシピエント細胞、またはレシピエント細胞質体の細胞型に特異的な遺伝子群の発現低下について解析することができる。また細胞を、所望の細胞型に特異的な遺伝子群の発現上昇について評価することができる。幹細胞を産生する再プログラムの指標となるmRNA分子の例には、H-19、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、GCTM-2、Oct-4、Genesis、GCNF、GDF-3、およびTDGF-1などがある。神経細胞に特異的なmRNA分子には、NGF、NF-H、NeuN、NSE、およびCD11bなどがあるがこれらに限定されない。脂肪細胞の細胞運命への変換を解析する際には、レプチン、PPARλ1、PPARλ2、SREBP1C、IR、およびTNFαなどのmRNA分子の発現をモニタリングするとよい。IGF-1およびIRは、インスリン産生細胞の指標となる。また、このような細胞は、標準的なウエスタン解析もしくは免疫蛍光解析で特定のタンパク質の発現について解析することができる(Ausubelら、前出)。
細胞を再プログラムする別の方法では、核を間期細胞から単離し、有糸分裂抽出物中、界面活性剤および塩溶液中、またはプロテインキナーゼ溶液中でインキュベートして、核エンベロープの崩壊および染色質塊の形成を誘導する。インキュベーションによって、染色質塊から因子群が放出される。あるいは染色質塊は、有糸分裂細胞から単離することができる。好ましくは染色質塊は次に間期用再プログラム用抽出物中でインキュベートして、核膜の形成、および所望の因子の抽出物から休止期の核への付加を促進させる。再プログラムされた核を次に抽出物から単離し、所望の細胞型もしくは他の任意の細胞型のレシピエントの細胞または細胞質体に導入する。
有糸分裂細胞質(MS15)抽出物、もしくは有糸分裂細胞質ゾル(MS200)抽出物は、間期IS15抽出物またはIS200抽出物に対する上述の手順で調製することができる(ただし有糸分裂細胞を間期細胞の代わりに使用し、10 mM EDTAを細胞溶解用緩衝液に添加する)。望ましいならば、この抽出物は、実施例1に記載したように核因子群をさらに加えて強化することができる。有糸分裂細胞を単離する場合は、0.5〜1 μg/mlのノコダゾール中で17〜20時間インキュベートすることで体細胞を有糸分裂中に同期させ、上述したように激しく浸透することで有糸分裂細胞を剥離させる。剥離したG1期ダブレットは捨てるか、または剥離した細胞の大部分(80%をこえる)を含む有糸分裂細胞とともに残してもよい。回収した剥離細胞を、10 mlの円錐管中で500×gで4℃で10分間遠心する。
MS15抽出物またはMS200抽出物のアリコートを氷上で解凍する。ATP産生系(0.6 μl)およびGTPを20 μlの抽出物に添加し、ボルテックスミキサーで混合する。最終濃度は、1 mM ATP、10 mM クレアチンリン酸、25 μg/ml クレアチンキナーゼ、および100 μM GTPとなる。
あるいは、凝縮していない染色質塊、または部分的にしか凝縮していない染色質塊は、核マトリックスタンパク質NuMAに対する抗体と単離核のプレローディング後に、上述の手順で形成される場合がある(Steenら、J.Cell Biol. 149、531〜536、2000)。この手順により、ドナー核の周囲の核膜を解離させることで、核成分を染色質から除去できるが、抗NuMA抗体が添加されることで凝縮段階は抑制される。染色体の凝縮を妨げると、染色体を有糸分裂抽出物中でインキュベーション中に、染色体が切断されて失われるリスクが低下する場合がある。
凝縮しない染色質塊、または部分的に凝縮した染色質塊は、界面活性剤またはプロテインキナーゼに曝露することで形成される場合もある。界面活性剤は、核内の染色体に結合していない状態、または緩く結合した状態の核成分を可溶化するために使用することが可能であり、結果として核エンベロープが除去される。この手順では、精製された細胞核(2,000〜10,000 核/μl)を、0.1〜0.5%のTriton X-100もしくはNP-40などの界面活性剤を添加した核用緩衝液中でインキュベートする。核エンベロープの除去を促進するために、NaClなどの塩類を追加的に緩衝液に約0.1 M、0.15 M、0.25 M、0.5 M、0.75 M、もしくは1 Mの濃度になるように添加する。穏やかに振盪しながら氷上で30〜60分間インキュベートした後、スイング式ローターを用いて1,000×gで10〜30分間(総容量を考慮して調節する)遠心して核を沈降させる。ペレット状の核を0.5〜1 mlの核用緩衝液に再懸濁し、上述の手順で沈降させる。この洗浄処理を2回繰返して行い、界面活性剤および余分な塩類を完全に除去するようにする。
凝縮した染色質塊、部分的に凝縮した染色質塊、もしくは凝縮していない染色質塊を含む抽出物もしくは溶液を、核用緩衝液を溶媒として作製した等量の1 M ショ糖溶液下に置く。染色質塊を、スイング式ローターを用いて、1,000×gで4℃で10〜30分間(試料容積に応じて調節)遠心して沈降させる。上清を捨て、ペレット状の染色質塊を0.1〜1.0 mlの核用緩衝液中にピペッティング操作により慎重に再懸濁し、1,000×gで10〜30分遠心する。上清を捨て、ペレット状の染色質塊を核用緩衝液中に再懸濁し、使用するまで氷上で保存する。
有糸分裂抽出物、界面活性剤および塩溶液、またはプロテインキナーゼ溶液に核を曝露することで染色質塊を得る代わりに、有糸分裂中に同期させた細胞を溶解して、上述の手順で細胞溶解物を遠心して染色質塊を得ることができる。
MS2000有糸分裂抽出物の調製中で200,000×gの遠心で得たペレットを、有糸分裂の膜小胞の供給源として使用する。このペレットを膜洗浄用緩衝液(250 mM ショ糖、50 mM KCl、2.5 mM MgCl2、50 mM Hepes、pH 7.5、1 mM DTT、1 mM ATP、10 μM アプロチニン、10 μM ロイペプチン、10 μM ペプスタチンA、10 μM ダイズトリプシンインヒビター、および100 μM PMSF)に再懸濁し、100,000×gで30分間遠心し、小分けして液体窒素で凍結して-80℃で保存する。
望ましいならば、凝縮した状態の染色質塊から、部分的に凝縮した状態の染色質塊から、または脱凝縮状態の染色質塊から、後述する手順で核を再形成させることができる。染色体の周囲の核膜の再形成は、再形成された核をレシピエントの細胞もしくは細胞質体の一部としての輸送を可能とする再形成に使用される抽出物に由来する因子群を封入することができる。染色質塊を1 M ショ糖クッションを通して沈降させて回収し、間期抽出物中に4,000〜5,000 染色質塊/μlの濃度となるように再懸濁する。好ましくは間期抽出物は、所望の細胞型の細胞から上述の手順で作製する。この抽出物に、上述の手順で調製した膜小胞を添加し、核エンベロープの形成に必用な膜を得る。この膜を1 μlの解凍された膜/10 μlの抽出物の濃度になるように添加し、ボルテックスミキサーで混合する。ATP産生系(2 mM ATP、20 mM クレアチンリン酸、50 μg/ml クレアチンキナーゼ)、および100 μM GTPを間期抽出物に添加し、染色質の脱凝縮、核膜小胞と染色質との結合、および完全な核膜を形成する小胞融合を促進する。この反応物を30℃で最長2時間インキュベートし、核の再形成を位相差顕微鏡でモニタリングする。
再プログラムされた核を、核用緩衝液で調製した1 Mのショ糖クッション通して4℃で1,000×gで10〜30分間遠心する。この核を、500 μlの冷核用緩衝液に再懸濁し、4℃で1,000×gで10分間遠心して沈降させて洗浄する。次に核を核用緩衝液に再懸濁し、レシピエントの細胞の細胞質もしくは細胞質体に核を輸送するまで氷上に置く。
染色質塊から形成された染色質塊または核を、レシピエントの細胞または細胞質体に標準的な方法で導入し、上述の手順で遺伝子発現をモニタリングする。
細胞は、核もしくは染色質塊を細胞から単離する必要なく再プログラムすることができる。この方法では、間期細胞または有糸分裂細胞を浸透化した後に、間期または有糸分裂用の再プログラム用抽出物中で、抽出物と細胞間における因子群の交換を可能とする条件下でインキュベートする。間期の抽出物を使用する場合は、細胞の核は膜に結合した状態で留まる。また有糸分裂の抽出物を使用する場合は、核エンベロープの崩壊および染色質の凝縮が生じることがある。この抽出物中におけるインキュベーションによって核が再プログラムされた後に、形質膜は好ましくは再び閉じられ、抽出物に由来する所望の因子を含む完全な再プログラムされた細胞が形成される。望ましいならば、抽出物は実施例1に記載されているように、さらに核因子群を添加することで強化することができる。
上記の手順で再プログラムされる細胞は、非同期細胞、およびG0期、G1期、S期、G2期、またはM期に同期した細胞、またはこれらの周期の組み合わせに同期した細胞を含む。細胞は、ジギトニンまたはストレプトリシンOによる浸透化処理などの任意の標準的な方法で浸透化状態となる。簡単に説明すると、細胞を標準的な手順で回収してPBSで洗浄する。ジギトニンで浸透化する場合は、細胞を約0.001〜0.1%の濃度でジギトニンを含む培地に再懸濁し、氷上で10分間インキュベートする。ストレプトリシンOで浸透化する場合は、細胞をストレプトリシンO溶液(例えばMaghazachiら、1997、およびその参考文献を参照)中で室温で15〜30分間かけてインキュベートする。いずれかのインキュベーションの後、細胞を400×gで10分間遠心して洗浄する。この洗浄過程を、PBSに再懸濁して沈降させて2回繰返す。細胞は、使用するまでPBS中で室温で保持する。あるいは細胞を、実施例6に記載されているようにカバーガラス上に置いて浸透化することで、細胞の取り扱いを可能な限り少なくして、細胞の遠心過程をスキップすることで細胞の生存能を最大化することができる。好ましくは、後述するように細胞を再プログラム処理用の間期抽出物または有糸分裂抽出物に直ちに添加する。
間期抽出物または有糸分裂抽出物を上述の手順で、好ましくは、浸透化細胞となることが望まれる細胞型の細胞を用いて調製する。浸透化細胞を、再プログラム用抽出物中に約100〜1,000細胞/μlの濃度となるように懸濁する。ATP産生系およびGTPを上述したように抽出物に添加し、反応物を30〜37℃で最長2時間インキュベートして、抽出物から細胞内への因子の移行、および核への活発な取込み、または因子と染色体との結合を促進する。再プログラムされた細胞を800×gで遠心し、再懸濁して洗浄し、PBS中で400×gで遠心する。この細胞を、20〜30%のウシ胎児血清(FCS)を含む培地に再懸濁し、通常の細胞培養インキュベーター内で37℃で1〜3時間インキュベートすることで細胞膜を再び閉じることができる。次に細胞を通常の温培地(10% FCS)で洗浄し、標準的な培養条件でさらに培養する。
活性化T細胞抽出物を用いるこの再プログラム処理試験は、休止期T細胞と活性化T細胞との間に機能上の差があることを元にしている。T細胞抗原受容体-CD3 (TCR-CD3)複合体、およびCD28同時刺激受容体を刺激して、休止期の末梢血T細胞を抗原で活性化すると、染色質のリモデリング、および数多くの遺伝子の活性化が誘導される。このような遺伝子の一つがT細胞特異的成長因子であるインターロイキン-2 (IL-2)遺伝子である。IL-2の調節には、刺激依存性の活性化因子NFAT、NFκB、AP-1、構成的転写因子Oct-1、および分裂促進因子によって活性化されるプロテインキナーゼErkが関与する。
実施例4に示すように、刺激T細胞抽出物は、293T線維芽細胞におけるT細胞特異的転写因子の核内局在を高めた。線維芽細胞をT細胞に再プログラムする能力について以下に詳述する。
精製核に加えて、細胞全体を再プログラムする能力は後述する手順で証明した。カバーガラス上で成長させた293T線維芽細胞を、細菌毒素ストレプトリシンOで可逆的に浸透化し、入手が容易な刺激されたジャーカット細胞、またはニューロン前駆細胞の抽出物に曝露し、2 mM CaCl2で再び閉じ、また培養して増殖させた。T細胞への再プログラムは、再プログラムされた293T線維芽細胞における遺伝子発現の変化、T細胞特異的タンパク質の発現、およびT細胞特異的機能の誘導によって評価した。ニューロン抽出物に曝露した、再プログラムされた293T線維芽細胞は、ニューロンタンパク質の発現について解析を行った。
後述するように、胚幹細胞抽出物を用いて、浸透化されたマウス線維芽細胞を再プログラムした。同様の方法で、他の線維芽細胞(例えばヒトの皮膚線維芽細胞)などの他の細胞を再プログラムすることができる。
以上の説明から、さまざまな用途および条件に採用するため、本明細書に記載された本発明の変更および変形がなされる場合があることは明らかである。このような態様も特許請求の範囲に含まれる。
Claims (29)
- 遺伝子発現が変化した細胞の作製方法であって、
(a)浸透化第1体細胞を、第2体細胞由来の間期細胞抽出物または有糸分裂細胞抽出物と一緒にインキュベートし、これによって、第1体細胞に遺伝子発現の変化が生じるステップであって、第2体細胞が第1体細胞と異なる細胞であり、該浸透化第1体細胞がその形質膜もしくはその形質膜の一部に複数の孔を有する細胞である、上記ステップ、および
(b)遺伝子発現の変化が生じた細胞をインビトロでの培養によって増殖させるステップ
を含む前記方法。 - 前記遺伝子発現が変化した細胞を、該細胞の膜が再び閉じる条件下でインキュベートすることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記浸透化第1体細胞中で発現されない少なくとも5種のmRNAまたはタンパク質分子が、前記遺伝子発現が変化した細胞中で発現されることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
- 前記遺伝子発現が変化した細胞中で発現されない少なくとも5種のmRNAまたはタンパク質分子が、前記浸透化第1体細胞中で発現されることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
- 第2体細胞が、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、角質細胞、造血細胞、メラニン形成細胞、軟骨細胞、B細胞、ジャーカット細胞、T細胞、赤血球、マクロファージ、単球、線維芽細胞または筋細胞であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 第1体細胞を、界面活性剤または細菌毒素と一緒に完全細胞をインキュベートすることによって浸透化させることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌毒素がストレプトリシンO(Streptolysin O)であることを特徴とする、請求項6記載の方法。
- 第1体細胞または第2体細胞がヒト細胞であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記浸透化第1体細胞が間期細胞または有糸分裂細胞であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記浸透化第1体細胞または前記遺伝子発現が変化した細胞が未分化細胞であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記浸透化第1体細胞または前記遺伝子発現が変化した細胞が、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、角質細胞、造血細胞、メラニン形成細胞、軟骨細胞、B細胞、ジャーカット細胞、T細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞、筋細胞、胚幹細胞または成体幹細胞であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子発現の変化が、DNAメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、核ラミン、活性化因子、抑制因子、成長因子、ホルモンまたはサイトカインと関わることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子発現が変化した細胞の作製方法であって、
(a)浸透化哺乳動物体細胞を、幹細胞由来の間期細胞抽出物と一緒にインキュベートし、これによって、該哺乳動物体細胞に遺伝子発現の変化が生じるステップであって、該浸透化哺乳動物体細胞がその形質膜もしくはその形質膜の一部に複数の孔を有する細胞である、上記ステップ、および
(b)遺伝子発現の変化が生じた細胞をインビトロでの培養によって増殖させるステップ
を含む前記方法。 - 前記幹細胞が胚幹細胞であることを特徴とする、請求項13記載の方法。
- 前記幹細胞が、脳、血液、骨髄、膵臓または皮膚由来の成体幹細胞であることを特徴とする、請求項13または14記載の方法。
- 前記哺乳動物体細胞が線維芽細胞であることを特徴とする、請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳動物体細胞または前記幹細胞がヒト細胞であることを特徴とする、請求項13〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子発現が変化した細胞がアルカリホスファターゼを発現することを特徴とする、請求項13〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子発現が変化した細胞がOct4を発現することを特徴とする、請求項13〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子発現が変化した細胞が、胚幹細胞様コロニーを形成することを特徴とする、請求項13〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子発現が変化した細胞が、胚様体を形成することを特徴とする、請求項13〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子発現が変化した細胞を、該細胞の膜が再び閉じる条件下でインキュベートすることを特徴とする、請求項13〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳動物体細胞を、界面活性剤または細菌毒素と一緒に完全細胞をインキュベートすることによって浸透化させることを特徴とする、請求項13〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌毒素がストレプトリシンO(Streptolysin O)であることを特徴とする、請求項23記載の方法。
- 細胞を細胞機能の持続的な変化を促す条件下で培養することを特徴とする、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞を、抗原、インターロイキン、成長因子、サイトカイン、または他の細胞と共に培養することを特徴とする、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞をマトリックスの存在下で培養することを特徴とする、請求項25または26記載の方法。
- 細胞をマトリックス表面に結合させるまたはマトリックス内に封入することを特徴とする、請求項27記載の方法。
- マトリックスが、コラーゲンマトリックス、炭素繊維、ポリビニルアルコールスポンジ、アクリルアミドスポンジ、フィブリン-トロンビンゲル、ヒアルロン酸ベースの重合体、または、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸もしくはこれらの組み合わせを含む合成重合体マトリックスであることを特徴とする、請求項27または28記載の方法。
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