JP5777081B2 - ヘテロプラスミー細胞をホモプラスミー化する方法 - Google Patents

Description

本発明は、変異ミトコンドリアゲノムＤＮＡの細胞内における存在比率を変化させる方法に関する。また、本発明は、該方法を使用して細胞をホモプラスミー化する方法に関する。

真核生物の細胞には、そのミトコンドリア内に、数百から数千単位のミトコンドリアＤＮＡ（以下、ｍｔＤＮＡと記載する）が存在する。健常なヒトｍｔＤＮＡは、生まれつき、全身を構成する個々の細胞において単一の遺伝子型、言い換えると、全て同じ塩基配列をもつ。この状態をホモプラスミーという。これまでにミトコンドリア病として、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群（Mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes：ＭＥＬＡＳ）、慢性進行性外眼筋麻痺症候群（ＣＰＥＯ）、Ｒａｇｇｅｄ−ｒｅｄ ｆｉｂｅｒを伴うミオクローヌスてんかん＝福原病（ＭＥＲＲＦ），Ｌｅｉｇｈ（リー）脳症、ミトコンドリアＤＮＡ異常による肥大型心筋症、Ｌｅｂｅｒ（レーベル）病、Ｐｅａｒｓｏｎ病などが知られており、いずれも根治療法のない疾患である。これらのミトコンドリア病のうちの多くは、変異したｍｔＤＮＡが正常ｍｔＤＮＡと細胞内で共存した状態で存在し、（この状態をヘテロプラスミーという）、変異ｍｔＤＮＡが高い比率で存在するときに病気が惹起されることが知られている。
変異ｍｔＤＮＡを持つ者は、誕生時は正常であるが、成長の過程で、変異ｍｔＤＮＡの比率がある閾値を越えると臨床症状を発現する。例えば、ＭＥＬＡＳ患者や心筋症患者ではｍｔＤＮＡの３２４３位に、ＭＥＲＲＦ患者は８３４４位に、ＣＰＥＯやＰｅａｒｓｏｎ病ではｍｔＤＮＡの大きな欠失が報告されている（非特許文献１）。さらに、Ａ３２４３Ｇ置換変異ｍｔＤＮＡは、糖尿病の原因にもなることが明らかにされた。
以上のような変異ｍｔＤＮＡに起因する疾患は、いずれも重篤な症状を引き起こすものであるが、現在までのところ、有効な治療方法がないため、治療法の早期確立が強く望まれている。

変異ｍｔＤＮＡと正常ｍｔＤＮＡの両者を含むヘテロプラスミーの細胞を、正常なｍｔＤＮＡのみを持つホモプラスミーの細胞へ変換することができれば、ミトコンドリア病の治療等に対する大きな手掛かりを与えることができる。これまでに、発明者らは、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で、相同ＤＮＡ組換え開始機構と共通な機構で誘導される特殊な型のｍｔＤＮＡ複製（ローリングサークル型ＤＮＡ複製）（非特許文献２及び３）をごく軽度の酸化ストレスが誘導すること（非特許文献４）、及び、このローリングサークル型のｍｔＤＮＡ複製によって、ヘテロプラスミーな細胞が、ホモプラスミー化することを既に明らかにしている（非特許文献５及び非特許文献６）。
一方、ヒト細胞を含む哺乳類細胞のｍｔＤＮＡ複製は、θ型であるとの報告（非特許文献７）がある他、組換えと複製が協働したＴ４ファージ型の複製を行う可能性を示唆する報告などがあり（非特許文献８）、現在のところ、そのメカニズムの詳細は混沌としており明らかにされていない。しかしながら、ローリングサークル型のｍｔＤＮＡ複製ではないというのが定説となっている（非特許文献９及び非特許文献１０）。

健常なヒトに由来する細胞は、一般に、正常ｍｔＤＮＡのホモプラスミーである。正常女性から採取した卵細胞を調べるとｍｔＤＮＡの欠失が存在するという報告があり（非特許論文１１）、それが正しいとすると受精卵が発生・分化するまでの過程でホモプラスミー化されると考えられる。しかしながら、そのホモプラスミー化の機構は全く不明とされている。また、上述したように、ヒトを含む哺乳類細胞中のｍｔＤＮＡの複製メカニズムは出芽酵母のそれとは異なるものであることから、出芽酵母のホモプラスミー化の機構から哺乳類細胞のｍｔＤＮＡのホモプラスミー化の機構を予測することは容易なことではない。
そこで、ミトコンドリア病の根治療法を開発するためにも、哺乳類細胞ｍｔＤＮＡのホモプラスミー化のメカニズムについて、さらなる研究の進捗が待たれる状況である。

Ｗａｌｌａｃｅ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．，３９，３５９−４０７，２００５ Ｌｉｎｇ及びＳｈｉｂａｔａ，ＥＭＢＯ Ｊ．，２１，４７３０−４７４０，２００２ Ｌｉｎｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２７，１１３３−１１４５，２００７ Ｈｏｒｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３７，７４９−７６１，２００９ Ｌｉｎｇ及びＳｈｉｂａｔａ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１５，３１０−３２２，２００４ Ｓｈｉｂａｔａ及びＬｉｎｇ，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ，７，１７−２３，２００７ Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６０，１４６６−１４７２，１９６８ Ｐｏｈｊｏｉｓｍａｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４，２１４４６−２１４５７，２００９ Ｂｏｇｅｎｈａｎｇｅｎ及びＣｌａｙｔｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２８，３５７−３６０，２００３ Ｂｏｇｅｎｈａｎｇｅｎ及びＣｌａｙｔｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２８，４０４−４０５，２００３ Ｃｈｅｎら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，.５７,２３９?２４７，１９９５

以上の状況を踏まえ、本発明は、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率を変化させる方法の提供を目的とする。
また、本発明は、上記方法を使用して細胞をホモプラスミー化する方法の提供を目的とする。
さらに、本発明は、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率が変化した細胞、及びホモプラスミー細胞の提供を目的とする。

本発明者らは、真核細胞に活性酸素種（ＲＯＳ：Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ）を接触させることで、意外にも、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率を変化させることができ、さらに、正常な配列を有するｍｔＤＮＡのホモプラスミー細胞を調製することができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の以下の（１）〜（１２）である。
（１）真核細胞に活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種を接触させ、該細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率を変化させる方法。
（２）前記活性酸素種が、一重項酸素、スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素又はヒドロキシラジカルからなるグループより選択される１又は複数の組合せである上記（１）に記載の方法。
（３）前記活性酸素種を細胞内に発生させる化学種が、過酸化水素、塩化鉄（ＩＩ）、アロキサン又はアンチマイシンからなるグループより選択される１又は複数の組合せである上記（１）に記載の方法。
（４）前記活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種が、過酸化水素である上記（２）又は（３）に記載の方法。
（５）前記真核細胞に活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種を接触させる時間が、１０分〜１時間である上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法。
（６）細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率を５％以下に変化させることを特徴とする上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法。
（７）上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法を用いて、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率を変化させた細胞を調製する方法。
（８）上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法を用いて、ホモプラスミー細胞を調製する方法。
（９）前記ホモプラスミー細胞が、正常なｍｔＤＮＡからなることを特徴とする上記（８）に記載の方法。
（１０）上記（７）乃至（９）のいずれかに記載の方法により調製される細胞。
（１１）上記（１０）に記載の細胞から調製したｉＰＳ細胞。
（１２）上記（１０）に記載の細胞から、ｉＰＳ細胞を介さずに調製した、該細胞とは異なる細胞型を有する細胞。

本発明によれば、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率を変化させることができる。さらに、本発明によれば、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率が変化した細胞、あるいは、ホモプラスミー細胞（例えば、正常なｍｔＤＮＡからなるホモプラスミー細胞）を提供することができる。

本発明によって調製された正常なｍｔＤＮＡからなるホモプラスミー細胞から調製したｉＰＳ細胞は、ミトコンドリア病やミトコンドリア糖尿病において機能障害を呈する各組織の再生に用いることができる。あるいは、本発明によって調製した正常なｍｔＤＮＡからなるホモプラスミー細胞からｉＰＳ細胞を介さずに特定の組織細胞に分化させた分化細胞も組織再生に使用することができる。
従って、本発明は、変異ｍｔＤＮＡに起因する疾患の治療のための組織材料の提供において極めて有効である。

また、本発明によって調製されるホモプラスミー細胞は、ヘテロプラスミー化する素因を有する細胞であったことから、本発明で調製したホモプラスミー細胞は、ヘテロプラスミー化の機構を解明するための有効なツールとしての利用価値が高い。つまり、本発明によって調製されるホモプラスミー細胞は、ｍｔＤＮＡの突然変異に起因する疾患の発症機序を明らかにするために利用することができる。

さらに、本発明によれば、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率を増加させることも可能である。従って、変異ｍｔＤＮＡの存在比率が検出限界以下であるような場合、僅かに存在する突然変異ＤＮＡを本発明の方法によって増幅することで、ｍｔＤＮＡの突然変異に起因する疾患の素因の有無を予め確認することが可能となる。

図１は、Ａ３２４３Ｇ置換変異ｍｔＤＮＡを保有するＭＥＬＡＳ患者由来初代培養細胞のヘテロプラスミー状態を解析した結果である。下図は、各細胞クローンから得られるｍｔＤＮＡ３２４３位付近の断片をＡｐａＩ処理し、アガロース電気泳動を行った結果を示す。上図は、下図から各細胞クローンに存在するＡ３２４３Ｇ置換変異比率を数値化したグラフである。２９４ｂｐのバンドは、正常ｍｔＤＮＡに由来し、１８２ｂｐ及び１１２ｂｐバンドは、Ａ３２４３Ｇ置換変異ｍｔＤＮＡに由来する（下図）。上図の縦軸は、Ａ３２４３Ｇ置換変異の比率（％）を示し、横軸は、下図のクローン（ｃｌｏｎｅ）番号に対応する。また、下図にＭＥＬＡＳ ｂｕｌｋとは、クローン化する前のＭＥＬＡＳ細胞に関し、Ａ３２４３Ｇ置換変異の存在比率を解析した結果を示す。 図２は、過酸化水素処理を行ったヘテロプラスミー細胞のヘテロプラスミー状態を解析した結果である。細胞を過酸化水素で処理した後、図１と同様に解析を行った。 図３は、過酸化水素処理によるホモプラスミー化の結果を示す。過酸化水素を処理しない場合には（左図）、変異ｍｔＤＮＡの比率は狭い範囲に分布するが、過酸化水素で処理を行った場合（右図）、変異ｍｔＤＮＡの比率は２つの山に分布した。この２つの山への分離は、正常型または変異型ｍｔＤＮＡそれぞれのホモプラスミーへの移行を示す。その一部は、ほぼすべて正常なｍｔＤＮＡだけのホモプラスミー細胞を担っていた。なお、変異ｍｔＤＮＡだけのホモプラスミーは致死的と考えられているので、この解析結果からは排除されている。

本発明の実施形態の１つは、真核細胞に活性酸素種、又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種を接触させ、該細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率を変化させる方法である。
本発明で使用される真核細胞は、特に限定はされないが、例えば、哺乳類細胞であり、中でも、ヒト及び非ヒト動物由来の細胞である。そのような細胞として、例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなどに由来する細胞を例示することができ、特に好ましくは、ヒト由来の細胞である。また、本発明で使用する真核細胞は、ｍｔＤＮＡに変異を有する細胞であるか、又は、ｍｔＤＮＡに変異を有する事が疑われる細胞が特に好ましい。

ここで、活性酸素種とは、酸素が化学的に活性になった化学種のことであり、当業者によって通常理解されるものとして定義されるものを全て含むものである。活性酸素種の例として、特に限定せずに、いくつか挙げるとすれば、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素、一酸化窒素、二酸化窒素、オゾン、過酸化脂質などが挙げられるが、細胞に対して障害を与えない化学種の種類か量、または、与えたとしてもその障害を別途軽減する手段を取り得る化学種を選択することが好ましい。好ましい活性酸素種としては、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素などである。また、活性酸素種を細胞内に発生させる化学種とは、該化学種が細胞内に侵入後、細胞内において、該化学種に応じた化学反応の後、該細胞内に活性酸素種を発生させる化学種のことである。活性酸素種を細胞内に発生させる化学種とは、例えば、塩化鉄（ＩＩ）（ＦｅＣｌ_２）、アロキサン、アンチマイシンなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
また、真核細胞に、活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種を「接触」させるとは、活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種が目的の細胞内へ侵入できるように、該細胞が生育している培地中などに該活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種を存在させ、該細胞と該活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種が接触可能となるように処理することである。細胞と接触させる活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種は、１種でも複数種でもよく、また、活性酸素種と活性酸素種を細胞内に発生させる化学種を組み合わせて培地に添加してもよい。

活性酸素種の量は、５０μＭ〜４００μＭの濃度範囲で過酸化水素を培地に添加することによって、細胞内に侵入又は発生する活性酸素種の量に準じることが好ましい。培地中に存在する活性酸素種の量は、当業者であれば適宜測定することが可能であり、例えば、市販の蛍光プローブ（ＣＭ−Ｈ_２ＤＣＦＤＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて測定することができる。例えば、過酸化水素を培地中に添加する場合、用いる細胞にダメージを与えない量の添加が必要であるが、このような量は当業者であれば予め予備的な実験を行うことで容易に算定することができる。過酸化水素を活性酸素種として用いる場合、過酸化水素の培地中の濃度としては、例えば、５０μＭ〜４００μＭ、より好ましくは７０μＭ〜３００μＭ、さらに好ましくは、９０μＭ〜２００μＭ、特に好ましくは、１００μＭ程度である。
活性酸素種を細胞内に発生させる化学種を培地中に添加する場合、限定はしないが、例えば、塩化鉄（ＩＩ）（ＦｅＣｌ_２）（培地中に添加する濃度としては、例えば、１〜３０μＭ、好ましくは、５μＭ〜２０μＭ、より好ましくは、１０μＭ程度）、アロキサン（培地中に添加する濃度としては、例えば、１〜３０ｍＭ、好ましくは、５ｍＭ〜２０ｍＭ、より好ましくは、１０ｍＭ程度）、アンチマイシン（培地中に添加する濃度としては、例えば、１０〜５００μＭ、好ましくは、５０μＭ〜３００μＭ、より好ましくは、１００μＭ〜２５０μＭ、さらに好ましくは、２００μＭ程度）などの化学種を培地中に添加することができる。活性酸素種を細胞内に発生させる化学種を培地中に添加する場合、当該化学種の添加量についても、細胞に対するダメージを予め調べることで容易に確認することができる。

活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種を細胞に接触させる時間としては、例えば、活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種（例えば、塩化鉄（ＩＩ）、アロキサン、アンチマイシンなど）を細胞の培地中に存在させる処理時間として算定することができる。この処理時間は、使用する細胞にダメージを与えない時間であって、かつ、該細胞を活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種で処理するのに効果的な時間である。用いる活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種によって異なるが、例えば、限定はしないが、１分〜２時間、あるいは、５分〜１．５時間、好ましくは、１０分〜１時間、より好ましくは３０分程度である。

本実施態様における「変異ｍｔＤＮＡ」とは、正常な配列とは異なる配列を持つｍｔＤＮＡのことである。１つのｍｔＤＮＡ当たりに存在する変異箇所は、１又は複数であり、好ましくは、１〜３箇所、より好ましくは、１箇所である。また、変異ｍｔＤＮＡ上の「変異」は、特に限定されるものではなく、正常な配列とは異なる変異の全てを含むものであるが、特に好ましくは、何らかの疾患の原因となる変異である（例えば、ｍｔＤＮＡ上の３２４３位（ＭＥＬＡＳの原因変異）、８３４４位（ＭＥＲＲＦの原因変異）における置換変異など。詳細は非特許文献１を参照のこと）。
細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率の変化は、増加又は減少のいずれであってもよい。例えば、疾患原因となる変異ｍｔＤＮＡの存在比率が通常の方法では検出できない程度に低い場合、本発明を使用して、その存在比率を増加させることで、該疾患の素因の有無を判定することも可能である。従って、本発明には、検出限界以下のｍｔＤＮＡ変異に起因する疾患の罹患可能性を判定する方法も含まれる。
また、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率を可能な限り減少させると、ホモプラスミー細胞（後述する）の調製が可能である。
細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率の変化は、例えば、変異の有無によって切断感受性が異なる制限酵素を利用して、簡便に判定することが可能である（例えば、Goto et al., Nature, 348, 651-653, 1990などを参照のこと）。その他、対立遺伝子特異的ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法、インベーダー法、次世代シークエンサーを用いた解析法などの方法も利用可能である。
本発明によって変化した「細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率」は、その存在比率を減少させる場合、減少した変異ｍｔＤＮＡの存在比率は、例えば３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下、最も好ましくは０％である。また、その存在比率を増加させる場合、増加した変異ｍｔＤＮＡの存在比率は、例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、好ましくは７０％以上、８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。

本発明の他の実施態様は、真核細胞に活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種を接触させ、その結果調製される「細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率が所望の割合に変化した細胞」、あるいは、「ホモプラスミーな細胞」である。
ホモプラスミーとは、ｍｔＤＮＡの塩基配列が細胞レベル又は個体レベルで均一な状態のことである。これに対して、ｍｔＤＮＡの塩基配列が細胞レベル又は個体レベルで均一な状態でないことをヘテロプラスミーという。例えば、ある細胞（又は個体）に含まれるｍｔＤＮＡの塩基配列が全てのミトコンドリアゲノムコピーにおいて均一である場合、該細胞（又は個体）は「ホモプラスミーの細胞（又は個体）」である。本明細書においては、正常な遺伝子配列を均一に含む細胞（又は個体）については、特に、「正常なホモプラスミー細胞（又は個体）」、あるいは、「正常なｍｔＤＮＡからなるホモプラスミー細胞（又は個体）」などと記載する。さらに、本明細書においては、ｍｔＤＮＡ上に存在する特定の変異に着目して、該変異箇所の塩基配列が細胞レベル又は個体レベルで均一な場合は、該特定の変異に関しホモプラスミーな状態と称する。
また、本明細書において、ホモプラスミーとは、同一の塩基配列を持つｍｔＤＮＡコピーの細胞内比率が、９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上（変異ｍｔＤＮＡが１％以下）の状態のことである。

細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率が所望の割合に変化した細胞、又はホモプラスミー細胞の選択及び調製は、当業者において周知の方法により行うことができる。例えば、活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種で処理した細胞から、適当な方法（例えば、限界希釈など）によりシングルコロニーを形成させ、得られたシングルコロニーに由来する細胞クローンから、ＤＮＡサンプルを調製する。調製したＤＮＡサンプル中に存在するｍｔＤＮＡ変異の細胞内存在比率を確認することにより、所望の存在比率となっている細胞クローンを選択することができる。ここで、正常なホモプラスミー細胞を選択する場合、解糖系を阻害する適当な薬剤（例えば、フッ化ナトリウム、ヨード酢酸など）の存在下で選択を行うと、さらに容易に正常なホモプラスミー細胞を選択することができる。
「細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率が所望の割合に変化した細胞」には、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率が増加した細胞及び減少した細胞のいずれも含まれるものである。例えば、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率が減少した細胞とは、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率が、例えば３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下、最も好ましくは０％の細胞である。また、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率が増加した細胞とは、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率が、例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、好ましくは７０％以上、８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の細胞である。

本発明には、本発明の方法で調製される、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率が所望の割合に変化した細胞、あるいは、ホモプラスミー細胞から、異なる細胞型の細胞を調製する方法、及び該方法で調製される細胞も含まれる。
このような異なる細胞型の細胞を調製する方法としては、本発明で調製した細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率が所望の割合に変化した細胞、あるいは、ホモプラスミー細胞からｉＰＳ細胞を調製し、該ｉＰＳ細胞から所望の分化状態を有する所望の細胞型の細胞へ分化誘導する方法の他、ｉＰＳ細胞を介さずに直接所望の細胞型を有する細胞を調製する方法などがある。

ｉＰＳ細胞は、体細胞へ、分化多能性を付与する数種類の転写因子遺伝子、転写因子タンパク質、及び分化多能性を誘導する化合物等（以上、分化多能性因子と称する）を導入することにより、ＥＳ細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞である。分化多能性因子としては、すでに多くの因子が報告されており、限定はしないが、例えば、Ｏｃｔファミリー（例えば、Ｏｃｔ３／４）、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５及びＳＯＸ１７など）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２など）、ＭＹＣファミリー（例えば、ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣなど）、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８などを挙げることができる。ｉＰＳ細胞の樹立方法については、多くの文献が発行されているので、それらを参考にすることができる（例えば、Takahashi et al., Cell 2006,126:663-676;Okitaら,Nature 2007,448:313-317;Wernig et al., Nature 2007,448:318-324;Maherali et al., Cell Stem Cell 2007,1:55-70;Park et al., Nature 2007,451:141-146;Nakagawa et al., Nat Biotechnol 2008,26:101-106;Wernig et al., Cell Stem Cell 2008,10:10-12;Yu et al., Science 2007,318:1917-1920;Takahashi et al., Cell 2007,131:861-872;Stadtfeld et al., Science 2008 322:945-949などを参照のこと）。
本発明により調製されるホモプラスミー細胞に分化多能性因子をコードする遺伝子を導入し、前掲の文献を参照することで、ｉＰＳ細胞を樹立することができる。ここで樹立したｉＰＳ細胞から分化誘導した各種組織又は細胞は、ホモプラスミー細胞が由来する個体に移植する場合、組織不適合性の問題を解決することが可能で、ミトコンドリア病などの有効な治療材料として利用することができる。

また、ｉＰＳ細胞を介さずに直接所望の細胞型を有する細胞を調製する方法としては、例えば、特定の転写因子を細胞中で発現させ、該細胞を所望の細胞型の細胞に変換する方法が報告されている（Zhou et al., Nature 455, 627-633, 2008）。本報告においては、３種の遺伝子（Ｎｇｎ３，Ｐｄｘ１，Ｍａｆａ）を膵外分泌細胞中で発現させ、β細胞に変換する方法が開示されている。また、任意の浸透化した細胞を、所望の細胞型を有する細胞から調製した間期細胞抽出物又は有糸分列細胞抽出物と共にインキュベートし、該任意の細胞を所望の細胞型の細胞へ変換する方法が報告されている（特開２００９−１４２２７８）。このような方法を本発明によって調製される正常なホモプラスミー細胞に適用すれば、所望の細胞型を有し、かつ、ミトコンドリア病などの原因となる変異ｍｔＤＮＡを有さない細胞を調製することが可能である。このように調製される細胞は、ｍｔＤＮＡの突然変異によって障害を受けている組織への移植等が可能であり、変異ｍｔＤＮＡに起因する疾患の治療に利用することができる。
本発明のホモプラスミー細胞から調製される所望の細胞型を有する細胞は、治療等の目的に沿った如何なる細胞型の細胞であってもよいが、例えば、神経細胞、横紋筋細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、表皮細胞、角質細胞、造血細胞、メラニン形成細胞、軟骨細胞、網膜上皮細胞、β細胞、心筋細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、血液系細胞（赤血球、白血球、血小板など）、線維芽細胞などが好ましい。

本実施例においては、ミトコンドリア病の患者に由来するヘテロプラスミー細胞を例にとり、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率を変化させる方法を説明する。以下に示す実施例は、あくまでも本発明の一部を例示するものであり、本実施例に記述される以外の細胞、本実施例に記述される以外の活性酸素種などを使用した場合も、本発明の範囲に当然に含まれるものである。

１．ヘテロプラスミー細胞の安定性の検証
ミトコンドリア病の１つであるＭＥＬＡＳの発症原因として、ｍｔＤＮＡのＡ３２４３Ｇ置換変異が確認されている。そこで、ＭＥＬＡＳ患者の骨格筋及び皮膚に由来する初代培養細胞（国立精神・神経センター、後藤雄一博士により調製された。以下、ＭＥＬＡＳ細胞と記載する）のｍｔＤＮＡに存在するＡ３２４３Ｇ置換変異のヘテロプラスミー状態について検討した。
ＭＥＬＡＳ細胞をＦＣＳ１０％含むＤＭＥＭの存在下、細胞密度が１×１０^５〜１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬとなるようにプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で３日間培養した。３日間の培養後、細胞密度が５×１０^５〜６×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達した後、１０^４〜１．２×１０^５倍に希釈してプレーティングを行い、さらに、１５日間培養を行った。１５日間の培養後、細胞のシングルコロニーをいくつか選択して、定法によりＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡサンプルを鋳型として、ｍｔＤＮＡの３２４３位付近を増幅するプライマーペアーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に対してＡｐａＩ処理を行った。ｍｔＤＮＡの３２４３位付近の配列は、正常な場合には、ＧＡＧＣＣＣ（下線が３２４３位に対応する）であるが、ＭＥＬＡＳ患者のｍｔＤＮＡでは突然変異によって、ＧＧＧＣＣＣ（下線が３２４３位に対応する）と変化し、ＡｐａＩ処理に対して感受性を示すようになる。従って、正常なｍｔＤＮＡに由来するＰＣＲ産物は、ＡｐａＩ認識配列を含まないため、ＡｐａＩ処理後も単一のＤＮＡバンド（本実施例においては、２９４ｂｐのバンド）のみが検出されるが、突然変異を含むｍｔＤＮＡに由来するＰＣＲ産物はＡｐａＩ感受性となる結果、ＡｐａＩによって切断された２本のバンド（本実施例においては、１８２ｂｐと１１２ｂｐのバンド）が検出されるようになる（図１の下図を参照）。従って、２９４ｂｐに対する１８２ｂｐ及び１１２ｂｐのバンドの比率を算定することによって、細胞のヘテロプラスミー状態を評価することが可能となる（本方法の詳細は、Goto et al., Nature, 348, 651-653, 1990を参照のこと）。
図１は、ＭＥＬＡＳ細胞株から得られるいくつかの細胞クローンについて、Ａ３２４３Ｇ置換変異の存在比率を検討した結果である。ＭＥＬＡＳ患者由来の細胞から得られた細胞クローンのヘテロプラスミー状態はいずれのクローンについても、３０％程度と安定していることが確認された（図１の上図）。

２．変異ｍｔＤＮＡの存在比率に対する活性酸素種処理の影響
次に、上記ＭＥＬＡＳ細胞に、活性酸素種として過酸化水素を接触させた場合、ヘテロプラスミー状態にどのような影響が生じるか検討した。
ＭＥＬＡＳ細胞（細胞密度；１×１０^５〜１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬ）の培地中に最終濃度１００μＭとなるように過酸化水素を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で３０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３日間培養した。３日間の培養後、細胞密度細胞密度が５×１０^５〜６×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達した後、１０^４〜１．２×１０^５倍に希釈してプレーティングを行い、さらに、１５日間培養を行った。１５日間の培養後、細胞のシングルコロニーをいくつか選択して、定法によりＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡサンプルに対して、ｍｔＤＮＡのＡ３２４３Ｇ置換変異の細胞内存在比率を上述と同様の方法で調べた。
図２は、過酸化水素処理後に得られた各細胞クローン中に存在するＡ３２４３Ｇの比率を調べた結果である。過酸化水素で処理を行うと、Ａ３２４３Ｇ置換変異がほぼ０％になる細胞クローン（例えば、クローン１６、２５など。図２の上図を参照のこと）を得ることができた。なお、Ａ３２４３Ｇ置換変異が０％である、正常なホモプラスミー細胞を選択する場合、フッ化ナトリウム（例えば、０．２μｇ／ｍＬ）やヨード酢酸（例えば、０．２μｇ／ｍＬ）などの解糖系を阻害する薬剤を添加すると、正常なホモプラスミー細胞の選択がさらに容易になる（図２の上図、“ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｃｌｏｎｅ”）。

また、Ａ３２４３Ｇ置換変異の比率が、過酸化水素無処理の場合の３０％よりも上昇したクローンの存在も確認できた（例えば、クローン１５、２７、２９、３２、３４、３５、３６、３９など。図２の上図）。この結果は、細胞を活性酸素種で処理することにより、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率を増減させることができることを示唆するものである。そこで、この点について、さらに検討するために、過酸化水素で処理した細胞と処理していない細胞に由来する細胞クローンについて、Ａ３２４３Ｇ置換変異を持つｍｔＤＮＡの細胞内存在比率の分布を調べてみた。図３の左図は、過酸化水素処理を行わずに選択したＭＥＬＡＳ細胞由来の細胞クローンについて、Ａ３２４３Ｇ置換変異の存在率を調べた結果である。過酸化水素未処理の細胞クローンのＡ３２４３Ｇ置換変異の存在率は、２５％〜５０％程度の狭い範囲に分布していた。一方、過酸化水素で処理した細胞クローンに関しては、その置換変異の存在率が、０〜４０％の範囲と４０〜８０％の範囲に分かれて分布することが確認された。このことは、細胞の過酸化水素処理によって、Ａ３２４３Ｇ置換変異が、増加又は減少のいずれかの方向へと均一化していることを示すものである。
以上のことから、細胞の過酸化水素処理（活性酸素種による処理）は、細胞のホモプラスミー化を促進することが明らかとなった。

本発明によれば、細胞内の変異ｍｔＤＮＡの存在比率を変化させることができるため、例えば、疾患の原因となるｍｔＤＮＡの突然変異を含まない正常なｍｔＤＮＡだけのホモプラスミー細胞の作出が可能となる。ｍｔＤＮＡの突然変異に起因するミトコンドリア症の根治療法が現在見出されていない状況に鑑み、本発明は、再生医療の分野等において、該疾患の治療材料及び治療方法の開発に大きく貢献するものである。

Claims (11)

1. ｍｔＤＮＡに変異を有する哺乳類細胞に、活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種を接触させ、該細胞内の該変異を有するｍｔＤＮＡの存在比率を減少させる方法。
2. 前記活性酸素種が、一重項酸素、スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素又はヒドロキシラジカルからなるグループより選択される１又は複数の組合せである請求項１に記載の方法。
3. 前記活性酸素種を細胞内に発生させる化学種が、過酸化水素、塩化鉄（ＩＩ）、アロキサン又はアンチマイシンからなるグループより選択される１又は複数の組合せである請求項１に記載の方法。
4. 前記活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種が、過酸化水素である請求項２又は３に記載の方法。
5. 前記真核細胞に活性酸素種又は活性酸素種を細胞内に発生させる化学種を接触させる時間が、１０分〜１時間である請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
6. 細胞内に存在していた変異ｍｔＤＮＡの存在比率を５％以下に減少させることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
7. 請求項１乃至６のいずれかに記載の方法を用いて、細胞内に存在していた変異ｍｔＤＮＡの存在比率を減少させた細胞を調製する方法。
8. 請求項１乃至６のいずれかに記載の方法を用いて、ホモプラスミー細胞を調製する方法。
9. 前記ホモプラスミー細胞が、正常なｍｔＤＮＡからなることを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 請求項７乃至９のいずれかに記載の方法により調製される細胞から、ｉＰＳ細胞を調製する方法。
11. 請求項７乃至９のいずれかに記載の方法により調製される細胞から、ｉＰＳ細胞を介さずに、該細胞とは異なる細胞型を有する細胞を調製する方法。