JP2866803B2

JP2866803B2 - 採血管用二経路凝血促進剤

Info

Publication number: JP2866803B2
Application number: JP6132098A
Authority: JP
Inventors: アーウィン・エイ・ヴォグラー; ジェーン・シー・グレイパー
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1993-06-14
Filing date: 1994-06-14
Publication date: 1999-03-08
Anticipated expiration: 2014-03-08
Also published as: EP0628816A1; BR9402388A; CA2124764C; AU6347094A; DE69414915T2; DE69414915D1; JPH0720123A; CA2124764A1; US5464776A; EP0628816B1; AU668039B2; US5378431A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は採血に関し、さらに詳し
くは、凝血を促進する採血管用添加剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液サンプルは、通常、たとえばガラス
製バキュテイナー（ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ）（商標名）
管（ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー）の
ような排気した管に採取される。両端針の一端を患者の
静脈へ挿入する。次いで、針の他端でバキュテイナー
（商標名）管の開口端をカバーする隔壁を穿刺し、これ
により管における減圧で針を介して血液サンプルを管へ
引き込む。この技術を用いると、複数のサンプルを皮膚
の一回の針穿刺で採取することができる。プラスチック
管もまた採血に提案されている。プラスチックは多くの
長所があり、たとえばガラス管より壊れにくく、輸送時
に重量が少なくそして焼却により簡単に廃棄される。

【０００３】排気した管で集められた血液は臨床検査の
前にしばしば凝血しなければならない。できるだけ迅速
で完全に密な血液凝固が形成され遠心分離により血清層
から凝血のきれいな分離を促進することが望ましい。こ
の結末を達成するために、プラスチックおよびガラス採
血管の両方ともしばしば凝血活性化物質を使用する。

【０００４】刺激される血液凝固カスケードの部分にし
たがって当該技術で分類される二つのタイプの活性化物
質が通常使用される。粒状活性化物質は内因性経路の接
触活性化として知られている凝血活性化の一般的生化学
的メカニズムに関与する。全血液は内因性経路により凝
血を起こさせるための必要な因子を全て含む。内因性経
路による凝血活性化は表面積に依存するものであり、す
なわち完全な血液凝固を形成するために必要な時間は血
液の容積と比較して活性化物質表面上の単位面積当たり
の活性化表面部位の総数に因る。微細に分割した粒状活
性化物質によりもたらされる一層大きな表面積は、凝血
時間を短くする。粒状活性化物質は実際市販の採血管の
全てに使用され、そして血液学的遠心分離で血清からき
れいに分離する密に架橋された凝血を導く。しかしなが
ら、凝血形成は、比較的ゆっくりで、遠心分離の前に約
３０−６０分を必要とする。商業的に使用されている代
表的粒状活性化物質は繊維に含浸されたシリカ、小さな
プラスチックカップ中のシリカ粒子、またはポリビニル
ピロリドン（ＰＶＰ）中の管壁へ施されたシリケート粒
子である。血液がシリケート−ＰＶＰ含有管へ入る場
合、ＰＶＰは溶け、血清へ入り、シリケート粒子が放出
される。

【０００５】凝血活性化物質の第二のタイプは、外因性
経路として当該技術で知られている凝血カスケードの異
なった部分を介して凝血を起こさせる。外因性システム
は、全血液に普通は存在しない物質の存在に頼るもので
ある。活性化は本質的に生化学的であり、濃度に依存す
る。凝血活性化速度は非常に高く、１０−２０分で凝血
を形成するが、しかし外因性経路から得られる凝血は本
質的にゼラチン状であり、血清からきれいには分離しな
い。外因性経路活性化物質を用いると、血清品質がしば
しば悪く、鋭敏な臨床試験の要求に合致しないことがあ
る。さらに、外から添加される血液可溶性たんぱく質活
性化物質による血清の汚染が望ましくない。

【０００６】血液分析を妨害するかもしれない可溶性化
学薬品を用いて血清を汚染することなく血清からきれい
に分離する密度の高い凝血を迅速に提供する採血管用の
凝血活性化添加剤に対し当該技術において必要性があ
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】採血アッセンブリー
は、好ましくは穿刺可能な隔壁でカバーされそして排気
された採血容器を含む。容器は内因性および外因性凝血
経路の両方を活性化する凝血速度促進剤を有する。好ま
しい促進剤は内因性凝血経路を活性化する天然の未変性
ガラスの表面を有するガラス粒子である。粒子の第二の
表面は好ましくはプラスチック皮膜上に固定された外因
性経路の活性化物質を有する。本発明の別の見地におい
て、凝血速度促進剤を調製する方法が提供される。外因
性経路の活性化物質は中空ガラス微小球の表面に固定さ
れる。被覆微小球は未変性ガラス微小球と合わせて、そ
の天然ガラス表面が内因性経路を活性化する。好ましい
方法において、被覆された微小球を砕いて、未変性の内
側ガラス表面を露出させそして被覆および未被覆表面の
両方を有する粒子を提供する。

【０００８】したがって、本発明の採血アッセンブリー
は、内因性および外因性凝血経路の両方の活性化を提供
する外来性粒子または可溶性活性化物質を含まないきれ
いな血清層が遠心分離により生じる血液サンプルの採取
に申し分なく適する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は多くの異なった
形態の実施態様により満足されるが、ここに本発明の詳
細な好ましい実施態様を記載し、この記載は本発明の原
則の例示として考えるべきもので、本発明が説明しそし
て記載した実施態様に限定されるものでないことは理解
されるであろう。本発明の範囲は添付の請求の範囲およ
びそれらの等価物により決められるであろう。本発明の
採血アッセンブリーはその中に本発明の二経路活性化物
質を有するいずれかの容器を含む。容器はそれぞれ閉止
端および開口端を画成する連続した底壁および側壁を有
する。底壁および側壁は一緒になって内壁表面を画成す
る。適当な容器はたとえばビン、バイアル、フラスコ等
好ましくは管である。本発明はそれゆえ好ましい管につ
いて記載する。

【００１０】管は好ましくは開口端の上の穿刺可能な隔
壁と組み合わされ、排気されている。採血用の排気され
た管は当該技術で標準的であり、たとえばバキュテイナ
ー（商標名）ブランドの管（ベクトン、ディキンソン
アンドカンパニー）である。

【００１１】図１は本発明の管である。管１０は閉止端
１４を画成するする底壁１２と開口端１８を画成する側
壁１６を有する。底壁１２と側壁１６は連続しており一
緒になって内壁表面２０を画成する。複数の二経路活性
化粒子２２（図２に詳細を記載）を管１０に入れる。管
１０の開口端１８は穿刺可能な隔壁２４でカバーされて
いる。

【００１２】管はガラスまたは好ましくはプラスチック
である。好適なプラスチックはポリ塩化ビニル、ポリプ
ロピレン（ＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥ
Ｔ）および好ましくはポリスチレン（ＰＳ）である。

【００１３】本発明は外因性経路の活性化物質のいずれ
か、たとえばエラグ酸、または好ましくはたんぱく質、
最も好ましくはトロンビン、ヘパリナーゼおよびフィブ
リノーゲンを意図する。本発明の一実施態様において、
管の内壁表面自体が促進剤として働く。すなわち、管が
ガラスの場合、天然ガラス表面の区域は内因性経路を活
性化し外因性経路の活性化物質は第二の表面に固定され
る。通常の方法のいずれかを使用して外来性活性化物質
を固定してもよい。一つの方法において、活性化物質は
ガラス表面で極性官能基と共有結合される。別の方法に
おいて、ポリマーの皮膜を第二の表面好ましくは管の底
部へ施し、そして活性化物質をその上へ吸着させた。凝
血および吸着の手法は当業者によく知られており、本発
明のこの見地の十分な理解のためにこれ以上の詳細は必
要ない。

【００１４】管がプラスチックの場合、内壁表面、好ま
しくは底部での内壁表面が、好ましくは前記のようにプ
ラスチックにおけるたんぱく質活性化物質の吸着によ
り、その上に固定した外因性活性化物質を有する。第二
の内壁表面は化学的に変性され、内因性経路の活性化物
質として作用する。好適な試薬は、クロム酸および硫酸
であり、これによりポリマー構造が酸で攻撃され、内因
性経路を活性化する極性基を導入する。本発明の好まし
い実施態様において、凝血促進剤は内因性および外因性
凝血経路の両方を活性化する管における粒子である。粒
子は内因性凝血経路の活性化物質として作用する天然
（未変性）ガラスの表面を有するガラス粒子である。ガ
ラス粒子の第二の表面はその上に固定した外因性凝血経
路の活性化物質を有する。粒子はいずれの形でもよく、
たとえばビーズ、カバースリップ等である。最も好まし
い粒子は中空ガラス微小球である。市販の好適な微小球
は、ミネソタ州、ミネアポリスの３Ｍ社により商標名ス
コッチライト（ＳＣＯＴＣＨＬＩＴＥ）で市販されてい
るものである。この製品は約０．７ｍ² 表面積／ｇを有
する。

【００１５】外因性活性化物質でガラス微小球を被覆す
ることは、ガラス管の内壁表面を被覆することについて
前述した通常の方法のいずれかにより行われうる。好ま
しい方法は実施例ＩＩＢに記載のように、ポリマーの被
覆を含む。外因性活性化物質は濃度約１−１０、好まし
くは約５mg／ｍ² 表面積でガラスまたはプラスチック表
面に固定される。外因性凝血経路の固定化活性化物質を
その上に有するガラス微小球を未変性微小球と合わせこ
れにより被覆または未被覆粒子の混合物がそれぞれ外因
性および内因性凝血経路を活性化する。被覆および未被
覆粒子を二経路の活性化のいずれかの比を得るのに望ま
れるいずれかの割合で合わせる。好ましくは比は約２０
／８０〜８０／２０、最も好ましくは約５０／５０であ
る。

【００１６】これに代わりそして好ましくは、被覆され
た微小球を粉砕し、これにより微小球の内壁表面の天然
未変性ガラス表面を暴露し、そして内因性および外因性
活性化表面の表面積の比を５０／５０にする。微小球は
簡単に粉砕し、粉砕は乳鉢および乳棒において都合よく
行われる。粉砕した粒子の大きさは重大ではなく、製造
段階で調節されて所望の粒子サイズ範囲を得る。粉砕さ
れた粒子は内表面および外表面の両方の約０．９ｍ² 表
面積／ｇを有する。

【００１７】コロイド状または浮遊する未粉砕粒子はい
ずれも浮選により簡単に除去される。

【００１８】図２は本発明の粉砕微小球およびその製造
手段を示す。図２において、先に記載した要素と実質的
に同じかまたは類似である構成要素には同じ参照番号に
続いて接尾辞を付ける。ガラス微小球３０は外壁表面３
２および内壁表面３４を有する。微小球３０は外壁表面
３２上にプラスチックの皮膜３６を塗布することにより
変性され、ガラス内壁表面３４ａおよびプラスチック外
壁表面３８を有する被覆微小球３０ａを得る。微小球３
０ａを次いでさらに変性し、ガラス内壁表面３４ｂ、外
壁表面３８ｂを有するプラスチック皮膜３６ｂおよび表
面３８ｂ上に固定した外因性経路活性化物質４０を得
る。微小球３０ｂを次いで粉砕して、内因性凝固経路を
活性化するガラスガラス内壁表面３４ｃ、プラスチック
外壁表面３８ｃおよび表面３８ｃに固定した外因性経路
活性化物質４０ｃを有する複数の二経路活性化粒子２２
を得る。

【００１９】多くの患者の血液サンプルは抗凝血物質、
たとえばクエン酸、ヘパリンまたはエチレンジアミンテ
トラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。本発明によれば、促進剤
は外因性経路に対する活性化物質の他に抗凝血物質に対
する拮抗剤を含む。固定化ヘパリナーゼまたはトロンビ
ン、ヘパリン不活化酵素は両方の役割を果たすであろ
う。プラスチック層を含む本発明の実施態様は、凝血物
が強くプラスチック表面に付着するがしかしガラスまた
は化学的に変性されたプラスチック部分には接着しない
二つの臨床的機能を提供する。すなわち、本発明の管に
採取された血液サンプルを遠心分離すると、血液がガラ
スまたは化学的に変性されたプラスチック部分で固ま
り、凝血物が流れ、ペレット化し、プラスチック部分に
接着する。きれいな血清層がフィブリン環およびストラ
ンドまたは血清中に懸濁したもしくは管の上部に接着し
た活性化粒子を含まない凝血物の上に形成される。凝血
物とプラスチック部分との強い接着は、遠心分離した管
を取り扱ったりまたは輸送する場合、凝血物および血清
の機械的再混合を防止する。

【００２０】

【実施例】

実施例Ｉ凝血研究のための管の調製血小板減少プラズマ（ＰＰＰ）を、クエン酸化豚血液
（エンバイアランメントダイアグノスティック（Ｅｎｖ
ｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社）
の遠心分離により細胞を分離することにより調製した。
ＰＰＰのほぼ０．５mlを既知の重量の試験活性化物質を
含むポリスチレン試験管（ベクトンディキンソン、１
３mm×７５mm）へ加え、水浴中で１５分間室温まで平衡
化した。平衡後、ＰＰＰ１ml当たり０．２ＭＣａＣｌ₂
２００μl を加え、凝血を開始する。管内容物を実験室
用反転ミキサー中で混合し、凝血時間を各管について記
載する。凝血したＰＰＰは、液体状態から回転時に管内
で流れないゼラチン状態への明らかな変化により、非凝
血ＰＰＰと区別された。この時点で、凝血時間を測定し
た。

【００２１】実施例ＩＩ外因性凝血経路の活性化物質の固定Ａ．化学的中空のガラス微小球は、３Ｍ社製のスコッチ
ライトブランド（ニューヨーク、イサカ、ポーラスマテ
リアルズ社のクリプトンガス吸着により測定されたよう
に表面積０．７ｍ^2/ｇ）から得られた。

【００２２】Ｂ．Ａの中空ガラス微小球の表面を、６０
分間クロロホルム中の２％オクタデシルトリクロロシラ
ン、ＯＴＳ（フルスアメリカ）、でシラン処理するこ
とにより凝血活性化に対し不動態化し、溶媒および水で
洗浄し、そして風乾してから秤量して試験管へ入れた。

【００２３】Ｃ．ＢのＯＴＳ処理化ガラス微小球へ牛ト
ロンビン（シグマ）の１mg／ml燐酸塩緩衝化塩水（ジブ
コ）溶液へ加え、実験室用反転ミキサー中で一時間混合
した。その上に固定化トロンビンを有するガラス微小球
を塩水中で正確に３回洗浄して未結合トロンビンを除去
しそして風乾してから秤量して試験管へ入れた。未変性
ガラス球Ａ（内因性経路の活性化物質）、ＯＴＳ被覆ガ
ラス球ＢおよびＯＴＳ皮膜上に固定したトロンビンを有
するガラス球Ｃ（外因性経路の活性化物質）について凝
血時間を記録した。この実験の結果を図３に示す。ここ
では凝血時間をＰＰＰの容量に対する球体の表面積の比
に対してプロットする。曲線Ａは、未処理表面高エネル
ギーガラス球による凝血経路の内因性経路の凝血活性化
を示す。曲線Ｂは低表面エネルギーＯＴＳ皮膜が球体を
ほとんど凝血活性化でなくなることを示す。曲線Ｃは、
固定化トロンビンがトロンビンのないＢのＯＴＳ被覆球
体と比較して凝血時間を約３倍短縮することを示す。凝
血時間は表面固定トロンビンの少量の添加で約４分間の
平坦凝血時間まで急勾配に短縮することを示し、このこ
とはこの固定化酵素系が表面対容量比２×１０^-3ｍ² ／
ml付近に制限する基質であることを示唆する。これと対
照的に、未処理ガラス球は活性化物質を添加すると凝血
時間が連続的に減少することを示唆する。

【００２４】実施例ＩＩＩ本実施例は可溶性トロンビンの凝血活性と直接比較する
ことにより実施例ＩＩの固定化トロンビンの酵素活性を
測定する。

【００２５】図４は異なった可溶性トロンビン濃度で観
察されるＰＰＰ凝血時間を示す。図４は図３の曲線Ｃ
と、特に４分近く観察された凝血時間における平坦限界
の達成の点で類似する。すなわち、１×１０^-2mg／mlの
可溶性トロンビン（図４からの４分限界）は、１×１０
^-3m²／ml（図３の曲線Ｃから計算）付近の表面固定トロ
ンビンで得られる酵素活性とだいたい等しい。このデー
タから、ＯＴＳ処理ガラス球において積まれた有効活性
酵素が２×１０^-3m²表面上に１×１０^-2mgである、すな
わち約５mg／m²であると計算される。

【００２６】実施例ＩＶ本実施例は可溶性トロンビンがヘパリン拮抗性を示すこ
とを説明する。

【００２７】管は、可溶性ヘパリンの異なった濃度そし
て可溶性トロンビンのさまざまな濃度を含み、実施例Ｉ
のように調製された。図５から、凝血活性トロンビンの
増加する濃度はヘパリンの増加する量を含むＰＰＰを凝
血するのに必要であることがわかる。

【００２８】実施例Ｖ本実施例は実施例ＩＩＣの表面固定トロンビンがヘパリ
ン拮抗活性を示すことを説明する。

【００２９】ＰＰＰ１ml当たりヘパリン０．１７５単位
と実施例ＩＩＢおよびＩＩＣの微小球のさまざまな量を
含む管を実施例Ｉにしたがって調製した。これらの微小
球で観察される凝血時間を図６に示す。曲線Ａは球ＩＩ
Ｂ（トロンビンなし）によるヘパリン化ＰＰＰの凝血時
間のプロットであり、ヘパリン化ＰＰＰがトロンビンの
不存在下に凝血しないことを示す。曲線Ｂは、表面固定
化トロンビンの存在下（実施例ＩＩＣ）に、４分近くの
凝血時間を得るのに４．５×１０^-3m²／ml以上の表面対
容量比が必要であり、一方ヘパリン無添加のＰＰＰにつ
いてはわずか２×１０^-3m²／mlが必要なだけであった
（図３の曲線Ｃ参照）。このデータから、ほぼ半分の固
定化トロンビン活性がヘパリン抗凝血特性の中和化に向
かうことが推定されうる。

【００３０】実施例ＶＩ本実施例は表面固定化トロンビンを有するガラス球を粉
砕することにより調製された本発明の二経路凝血促進剤
による凝血活性化を示す。

【００３１】実施例ＩＩＣの固定化トロンビンを有する
ガラス球を乳鉢と乳棒を用いて粉砕した。粉砕した球を
塩水溶液で洗浄して浮選により完全な球およびコロイダ
ル／プラスチックを除去した。最終製品の表面積を、実
施例ＩＩのようにクリプトンガス吸着により測定して
０．９m²／gmであることが測定された。粉砕は固定化ト
ロンビン(外側球面）および未処理ガラス(内側球面）の
表面積とを等しくさせる。

【００３２】二経路凝血促進剤による凝血活性化は、表
面固定化トロンビンを有する完全なガラス球で得られる
実施例IIＣの結果と直接比較するためにヘパリン０．１
７５単位／mlを含むＰＰＰにおいて測定された。図７の
曲線Ａは、完全な球における表面固定化トロンビンによ
りヘパリン化ＰＰＰの凝血を示す図６の曲線Ｂを再現
し、そして粉砕形（図７の曲線Ｂ）における同じ活性化
物質で得られる結果と比較する。粉砕形の凝血活性化は
等価表面積対容量比に基づく全球のそれより大きく、そ
して球を粉砕した場合、曝された天然ガラス表面による
凝血カスケードの内因性経路の活性化のために凝血時間
がさらに減少することを表していることがわかる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の採血アッセンブリーの透視図
である。

【図２】図２は、本発明の好ましくは活性化剤の製法の
模式図である。

【図３】図３は、本発明のさまざまな実施態様について
の血液サンプル量と活性化物質表面積との比に対する凝
血時間のプロットである。

【図４】図４は、本発明のさまざまな実施態様について
の血液サンプル量と活性化物質表面積との比に対する凝
血時間のプロットである。

【図５】図５は、本発明のさまざまな実施態様について
の血液サンプル量と活性化物質表面積との比に対する凝
血時間のプロットである。

【図６】図６は、本発明のさまざまな実施態様について
の血液サンプル量と活性化物質表面積との比に対する凝
血時間のプロットである。

【図７】図７は、本発明のさまざまな実施態様について
の血液サンプル量と活性化物質表面積との比に対する凝
血時間のプロットである。

【符号の説明】

１０管１２底壁１４閉止端１６側壁１８開口端２０内壁表面２２活性化物質２４穿刺可能な隔壁３０ガラス微小球３２外壁表面３４内壁表面３６プラスチック皮膜３８プラスチック外壁表面４０活性化物質

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アーウィン・エイ・ヴォグラーアメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27562，ニューヒル，ビーバー・クリーク・ロード，ルート１，ボックス 120 (72)発明者ジェーン・シー・グレイパーアメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27707，ダーラム，ウィンスロップ・コート 19 (56)参考文献特開昭57−157158（ＪＰ，Ａ) 特開昭58−195151（ＪＰ，Ａ) 特開昭58−158556（ＪＰ，Ａ) 特開昭55−132957（ＪＰ，Ａ) 特開昭53−28495（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】複数のガラス粒子を含み、前記粒子の第
一は天然ガラス表面が内因性凝血経路を活性化するよう
に未変性でありそして前記粒子の第二はその表面に固定
された外因性凝固経路の活性化物質を有するように変性
されている採血容器のための凝固促進添加物。
【請求項２】前記第二の粒子においてプラスチックの
皮膜をさらに含み、外因性凝固経路の前記活性化物質が
前記プラスチックの皮膜に固定している請求項１の添加
物。
【請求項３】複数の表面を有する粒子を含み、前記表
面の第一は内因性凝血経路を活性化しそして前記表面の
第二は外因性凝固経路の活性化物質をその上に固定して
いる採血容器のための凝固促進添加物。
【請求項４】前記第二の表面と前記固定化活性化物質
との間にプラスチック層をさらに含む請求項３の添加
物。
【請求項５】以下のもの：ａ）開口端を有する採血容器；ｂ）前記開口端上の隔壁、前記容器は排気されている；ｃ）前記排気された容器内の請求項１の添加物；からな
る採血アッセンブリー。
【請求項６】以下のもの：ａ）開口端を有する採血容器；ｂ）前記開口端上の隔壁、前記容器は排気されている；ｃ）前記排気された容器内の請求項３の添加物；からな
る採血アッセンブリー。
【請求項７】以下のもの：ａ）開口端および内壁表面を有する採血容器；ｂ）前記開口端上の隔壁、前記容器は排気されている；ｃ）内因性凝固経路を介して血液凝固を活性化する前記
内壁表面の第一の領域；ｄ）外因性凝固経路を介して血液凝固を活性化する前記
内壁表面の第二の領域；からなる採血アッセンブリー。
【請求項８】以下の工程：ａ）プラスチックで中空ガラス微小球の外側表面を被覆
し；ｂ）前記皮膜に外因性凝固経路の活性化物質を固定化し
て外因性凝固経路を活性化する表面を有する微小球を
得；ｃ）内因性凝固経路を活性化する未変性ガラスの表面を
提供する；ことからなる内因性および外因性凝固経路の
両方を活性化する採血管のための添加物を調製する方
法。
【請求項９】前記提供工程を、外因性経路の活性化物
質をその上に固定した前記微小球を未変性微小球と合わ
せることにより行う請求項８の方法。
【請求項１０】前記提供工程を、外因性経路の活性化
物質をその上に固定した前記微小球を粉砕して微小球の
天然ガラス内側表面を曝すことにより行う請求項８の方
法。