DE69414915T2

DE69414915T2 - Partikel zur Verbesserung der Gerinnung in einem Blutentnahmeröhrchen durch Aktivieren zweier Reaktionswege, Blutentnahmeanordnung und Verfahren zur Herstellung der Partikel

Info

Publication number: DE69414915T2
Application number: DE69414915T
Authority: DE
Inventors: Jane C. Durham Nc 27707 Graper; Erwin A. Newhill Nc 27562 Vogler
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1993-06-14
Filing date: 1994-06-03
Publication date: 1999-05-27
Anticipated expiration: 2014-06-04
Also published as: JPH0720123A; JP2866803B2; AU668039B2; CA2124764A1; AU6347094A; US5378431A; EP0628816B1; BR9402388A; DE69414915D1; CA2124764C; US5464776A; EP0628816A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. ANWENDUNGSGEBIET DER ERFINDUNG. Diese Erfindung betrifft die Blutentnahme, und sie betrifft insbesondere einen Zusatz für ein Abnahmeröhrchen, der die Blutgerinnung verstärkt.
2. HINTERGRUND. Blutproben werden routinemäßig in Vakuumröhrchen, wie die Glasröhrchen Vacutainer" (Becton, Dickinson and Company), entnommen. Ein Ende einer doppelendigen Nadel wird in die Vene eines Patienten eingeführt. Das andere Ende der Nadel durchsticht dann eine Membran, die das offene Ende des Vacutainer"-Röhrchens bedeckt, so daß das Vakuum in dem Röhrchen die Blutprobe durch die Nadel in das Röhrchen zieht. Bei Anwendung dieser Methode kann eine Vielzahl von Proben unter Nutzung eines einzigen Nadelstichs durch die Haut entnommen werden. Vorgeschlagen wurden auch Plastikröhrchen für die Blutentnahme. Plastik bietet eine Reihe von Vorteilen, wie geringeren Bruch als Glasröhrchen, geringeres Gewicht beim Versand und leichtere Beseitigung durch Einäscherung.
Blut, das in Vakuumröhrchen entnommen wird, muß oft vor der klinischen Untersuchung zur Gerinnung gebracht werden. Wünschenswert ist es, so schnell und vollständig wie möglich einen dichten Blutkuchen zu bilden, um die saubere Trennung des Kuchens von der Serumlage durch Zentrifugieren zu erleichtern. Um dieses Ziel zu erreichen, wird sowohl bei Plastik- als auch bei Glas-Blutabnahmeröhrchen häufig ein Gerinnungsaktivator eingesetzt.
Herkömmlicherweise werden zwei Typen von Aktivatoren, die in Fachkreisen nach dem Abschnitt der stimulierten Blutkoagulationskaskade klassifiziert werden, eingesetzt. Partikulat-Aktivatoren haben einen gemeinsamen biochemischen Mechanismus der Gerinnungsaktivierung, der als Kontaktaktivierung des intrinsischen Reaktionsweges bekannt ist. Das Blut als Ganzes enthält alle notwendigen Faktoren, um die Gerinnung durch den intrinsischen Reaktionsweg auszulösen. Die Gerinnungsaktivierung durch den intrinsischen Reaktionsweg ist von der wirksamen Oberfläche abhängig, d. h., die zur Bildung eines vollständigen Blutkuchens erforderliche Zeit ist von der Gesamtzahl der aktivierenden Oberflächenstellen je Flächeneinheit auf der Aktivatoroberfläche im Verhältnis zum Blutvolumen abhängig. Eine größere Oberfläche, die durch fein verteilte Partikulataktivatoren bereitgestellt wird, führt zu kürzeren Gerinnungszeiten. Partikulataktivatoren werden bei praktisch allen handelsüblichen Blutabnahmeröhrchen eingesetzt und ergeben dichte, vernetzte Kuchen, die sich in einer hämatologischen Zentrifuge sauber vom Serum trennen lassen. Die Kuchenbildung ist jedoch verhältnismäßig langsam, und es werden etwa 30 bis 60 Minuten vor dem Zentrifugieren gebraucht. Typische Partikulataktivatoren, die üblicherweise eingesetzt werden, sind in Gewebe imprägnierte Silika, Silikapartikel in kleinen Plastikbechern oder Silikatpartikel, die in Polyvinylpyrrolidon (PUP) auf die Röhrchenwand aufgebracht werden. Wenn Blut in ein Röhrchen gelangt, das Silikat-PVP enthält, löst sich das PVP auf, tritt in das Serum ein, und die Silikatpartikel werden freigesetzt.
FR-A-2157471 legt die Verwendung von entweder Körnchen, die mit Substanzen beschichtet sind, von denen bekannt ist, daß sie die Blutgerinnung verstärken, oder Polymerkörnchen, die von diesen nach außen vorstehende Glasfasern zur Verstärkung der Gerinnungsbildung haben, in Blutabnahmeröhrchen offen.
US-A-4257886 legt eine Spritze offen, die eine die Blutgerinnung aktivierende Oberfläche und eine hydrophobe Oberfläche hat.
Der zweite Typ von Gerinnungsaktivatoren löst die Gerinnung über einen anderen Teil der Koagulationskaskade aus, der in Fachkreisen als der extrinsische Reaktionsweg bekannt ist. Das extrinsische System stützt sich auf das Vorhandensein einer Substanz, die normalerweise nicht im Blut als Ganzem vorhanden ist. Die Aktivierung ist vom Charakter her biochemisch und ist von der Konzentration abhängig. Die Aktivierungsraten der Gerinnung sind sehr hoch, was in 10 bis 20 Minuten zu einer Kuchenbildung führt, aber die aus dem extrinsischen Reaktionsweg resultierenden Kuchen sind von Natur aus gallertartig und trennen sich nicht sauber vom Serum. Bei extrinsischen Reaktionsweg-Aktivatoren ist die Serumqualität oft schlecht und wird u. U. den Erfordernissen einer empfindlichen klinischen Analyse nicht gerecht. Außerdem ist die Kontamination des Serums durch von außen zugesetzte blutlösliche Proteinaktivatoren nicht wünschenswert.
In Fachkreisen besteht die Forderung nach einem gerinnungsaktivierenden Zusatz für ein Blutabnahmeröhrchen, der schnell einen dichten Kuchen ergibt, der sich sauber vom Serum löst, ohne das Serum durch lösliche Chemikalien zu kontaminieren, welche die Blutanalyse beeinträchtigen können. Die vorliegende Erfindung ist auf die Erfüllung dieser Forderung gerichtet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Blutabnahmevorrichtung schließt ein Blutabnahmebehältnis ein, das vorzugsweise mit einer durchstechbaren Membran bedeckt und luftleer gemacht ist. In dem Behältnis befindet sich ein Verstärker für die Koagulationsgeschwindigkeit, der sowohl den intrinsischen als auch den extrinsischen Blutkoagulationsweg aktiviert. Der bevorzugte Verstärker ist ein Glaspartikel, das einen Oberflächenbereich aus natürlichem, nichtmodifizierten Glas hat, das den intrinsischen Koagulationsweg aktiviert. Auf einem zweiten Oberflächenbereich des Partikels ist ein Aktivator für den extrinsischen Reaktionsweg immobilisiert, vorzugsweise auf einem Plastiküberzug. Nach einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Verstärkers der Koagulationsgeschwindigkeit bereitgestellt. Der Aktivator des extrinsischen Reaktionsweges wird auf der Oberfläche einer hohlen Glas-Mikrokugel immobilisiert. Die beschichtete Mikrokugel kann mit einer nichtmodifizierten Glas-Mikrokugel kombiniert werden, deren natürliche Glasoberfläche den intrinsischen Reaktionsweg aktiviert. Bei einem bevorzugten Verfahren wird die beschichtete Mikrokugel zerkleinert, um die nichtmodifizierte innere Glasoberfläche freizulegen und ein Partikel bereitzustellen, das sowohl beschichtete als auch unbeschichtete Oberflächen hat.
Folglich ist die Blutabnahmevorrichtung der Erfindung durch die Aktivierung sowohl des intrinsischen als auch des extrinsischen Reaktionsweges ideal für die Entnahme von Blutproben geeignet, aus denen durch Zentrifugieren eine klare Serumlage, frei von Fremdpartikulatmaterial oder löslichen Aktivatoren, hergestellt werden soll.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht der Blutabnahmevorrichtung der Erfindung;
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines bevorzugten Aktivators der Erfindung, und
Fig. 3 bis 7 sind grafische Darstellungen der Gerinnungszeit, verglichen mit dem Verhältnis des Volumens der Blutprobe zur wirksamen Oberfläche des Aktivators bei verschiedenen Ausführungsbeispielen der Erfindung.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Während diese Erfindung durch Ausführungsbeispiele in vielen verschiedenen Formen erfüllt wird, werden hier im Detail bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung mit der Maßgabe beschrieben, daß die vorliegende Offenlegung als exemplarisch für die Prinzipien der Erfindung zu betrachten ist und nicht beabsichtigt, die Erfindung auf die dargestellten und beschriebenen Ausführungsbeispiele zu begrenzen. Die Blutabnahmevorrichtung der Erfindung kann jedwedes Behältnis einschließen, in dem sich der Dual-Reaktionsweg-Aktivator der Erfindung befindet. Das Behältnis kann durchgängige Boden- und Seitenwände haben, die ein geschlossenes bzw. offenes Ende bilden. Die Bodenwand und die Seitenwand bilden zusammen eine Innenwandoberfläche. Geeignete Behältnisse sind beispielsweise Flaschen, Glasfläschchen, Kolben und ähnliches, vorzugsweise Röhrchen. Die Erfindung wird nachstehend in Begriffen des bevorzugten Röhrchens beschrieben.
Das Röhrchen kann vorzugsweise mit einer durchstechbaren Membran über dem offenen Ende kombiniert und es kann luftleer gemacht werden. Vakuumröhrchen für die Blutentnahme gehören zum Standard auf diesem Gebiet, beispielsweise Röhrchen der Marke Vacutainer" (Becton, Dickinson and Company).
Fig. 1 zeigt das Röhrchen der Erfindung. Das Röhrchen 10 hat eine Bodenwand 12, die ein geschlossenes Ende 14 bildet, und eine Seitenwand 16, die ein offenes Ende 18 bildet. Die Bodenwand 12 und die Seitenwand 16 sind durchgängig und bilden zusammen eine Innenwandoberfläche 20. In das Röhrchen 10 wird eine Vielzahl von Dual-Reaktionsweg- Aktivierungspartikeln 22 (die in Fig. 2 im Detail gezeigt werden) eingebracht. Das offene Ende 18 des Röhrchens 10 ist mit einer durchstechbaren Membran 24 bedeckt.
Das Röhrchen kann aus Glas oder vorzugsweise Plastik sein. Geeignete Plaste sind Polyvinylchlorid, Polypropylen (PP). Polyethylenterephthalat (PET) und vorzugsweise Polystyrol (PS).
Die Erfindung zieht jedweden Aktivator des extrinsischen Reaktionsweges in Betracht, wie Ellagsäure oder vorzugsweise ein Protein, am besten Thrombin, Heparinase und Fibrinogen.
Nach einem Aspekt der Erfindung ist der Koagulationsverstärker ein Partikel in einem Röhrchen, das sowohl den intrinsischen als auch den extrinsischen Koagulationsweg aktiviert. Das Partikel kann ein Glaspartikel mit einem Oberflächenbereich aus natürlichem (nichtmodifizierten) Glas sein, der als Aktivator des intrinsischen Koagulationsweges dient. Auf einem zweiten Oberflächenbereich des Glaspartikels kann ein Aktivator des extrinsischen Koagulationsweges immobilisiert sein. Das Partikel kann jede Form haben, wie Kugelchen, Deckgläschen und ähnliche. Am meisten bevorzugt wird ein Partikel in Form einer hohlen Glas-Mikrokugel. Eine geeignete Mikrokugel, die auf dem Markt erhältlich ist, ist das Produkt, das unter dem Markennamen Scotchlite" von der 3M Corporation. Minneapolis, MN, erhältlich ist. Dieses Produkt hat eine wirksame Oberfläche von etwa 0,7 m²/g.
Die Beschichtung der Glas-Mikrokugel mit dem extrinsischen Aktivator kann nach jedem der herkömmlichen Verfahren ausgeführt werden, die oben zur Beschichtung der Innenwandfläche des Glasröhrchens beschrieben worden sind. Ein bevorzugtes Verfahren schließt eine Polymerbeschichtung ein, wie das in Beispiel II B beschrieben wird. Der extrinsische Aktivator kann mit einer Konzentration von etwa 1 bis 10 mg/m², vorzugsweise etwa 5 mg/m², der Oberfläche auf der Glas- oder Plastikoberfläche immobilisiert werden. Die Glas-Mikrokugeln mit dem darauf befindlichen immobilisierten Aktivator des extrinsischen Koagulationsweges können mit nichtmodifizierten Mikrokugeln kombiniert werden, wodurch das Gemisch aus beschichteten und unbeschichteten Partikeln den extrinsischen bzw. den intrinsischen Koagulationsweg aktiviert. Die beschichteten und unbeschichteten Partikel können in jeder gewünschten Proportion kombiniert werden, um jedwedes Aktivierungsverhältnis der beiden Reaktionswege zu erhalten. Vorzugsweise kann das Verhältnis zwischen etwa 20/80 und 80/20, am besten etwa 50/50, betragen.
Als Alternative und vorzugsweise können die beschichteten Mikrokugeln zerkleinert werden, wodurch die natürliche, nichtmodifizierte Glasoberfläche auf der Innenwandoberfläche der Mikrokugeln freigelegt wird und das Verhältnis der Oberflächenbereiche der intrinsischen und extrinsischen Aktivierungsflächen gleich 50/50 ist. Die Mikrokugeln lassen sich leicht zerkleinern, und das Zerkleinern kann praktischerweise mit Mörser und Stößel erfolgen. Die Größe der zerkleinerten Partikel ist nicht von kritischer Bedeutung und kann auf der Fertigungsstufe so gesteuert werden, daß man jeden gewünschten Bereich von Partikelgrößen erhält. Die zerkleinerten Partikel haben sowohl auf der Innen- als auch auf der Außenfläche eine wirksame Oberfläche von etwa 0,9 m²/g.
Jedwede kolloidalen oder schwimmenden, unzerkleinerten Partikel können leicht durch Flotation entfernt werden.
Fig. 2 veranschaulicht die zerkleinerten Mikrokugeln der Erfindung und das Verfahren zu ihrer Herstellung. In Fig. 2 werden Elemente, die im wesentlichen die gleichen oder ähnliche Elemente wie die oben beschriebenen sind, mit derselben Bezugszahl, gefolgt von einem Buchstabensuffix, bezeichnet. Eine Glas-Mikrokugel 30 hat eine Außenwandoberfläche 32 und einen Innenwandoberfläche 34. Die Mikrokugel 30 kann durch das Aufbringen eines Beschichtung 36 aus Plastik auf der Außenwandoberfläche 32 modifiziert werden, um eine beschichtete Mikrokugel 30a mit einer Glas-Innenwandoberfläche 34a und einer Plastik-Außenwandoberfläche 38 zu ergeben. Die Mikrokugel 30a kann dann weiter modifiziert werden, um eine Mikrokugel 30b mit einer Glas-Innenwandoberfläche 34b, einem Plastiküberzug 36b mit einer Außenwandoberfläche 38b und einem auf der Oberfläche 38b immobilisierten extrinsischen Reaktionsweg-Aktivator 40 zu ergeben. Die Mikrokugel 30b kann dann zerkleinert werden, um eine Vielzahl von Dual-Reaktionsweg-Aktivierungspartikeln 22 zu ergeben, die eine Glas-Innenwandoberfläche 34c, die den intrinsischen Koagulationsweg aktiviert, eine Plastik-Außenwandoberfläche 38c und einen auf der Oberfläche 38c immobilisierten extrinsischen Reaktionsweg-Aktivator 40c hat.
Viele Blutproben von Patienten enthalten ein Antikoagulans, wie Citronensäure, Heparin oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Im Einklang der Erfindung kann der Verstärker neben dem Aktivator für den extrinsischen Reaktionsweg einen Antagonisten für das Antikoagulans einschließen. Immobilisierte Heparinase oder Thrombin. Enzyme, die Heparin deaktivieren, können beide Rollen übernehmen. Die Ausführungsbeispiele der Erfindung, die eine Plastikschicht einschließen, stellen dahingehend eine duale klinische Funktionalität bereit, daß der Blutkuchen fest an der Plastikoberfläche haftet, nicht aber an dem Glas oder an chemisch modifizierten Plastikbereichen haftet. Wenn folglich eine Blutprobe, die in das Röhrchen der Erfindung entnommen worden ist, zentrifugiert wird, gerinnt das Blut an dem Glas oder dem chemisch modifizierten Plastikbereich und der Kuchen fließt, pelletiert und haftet an dem Plastikbereich. Über dem Kuchen bildet sich eine klare Serumlage, ohne Fibrinringe und -stränge oder Aktivatorpartikel, die im Serum in Suspension sind oder am oberen Bereich des Röhrchens haften. Die starke Haftung des Kuchens am Plastikbereich verhindert das erneute mechanische Mischen von Kuchen und Serum, wenn das zentrifugierte Röhrchen gehandhabt oder transportiert wird.

BEISPIEL I

VORBEREITUNG VON RÖHRCHEN FÜR KOAGULATIONSUNTERSUCHUNGEN

An Blutplättchen armes Blutplasma (PPP) wurde durch Zelltrennung durch Zentrifugieren von mit Citrat versetztem Schweineblut (Environmental Diagnostics Inc.) hergestellt. Etwa 0,5 ml PPP wurden in Polystyrol-Teströhrchen (Becton Dickinson, 13 mm zu 75 mm) gegeben, die ein bekanntes Gewicht an Testaktivatoren enthielten, und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang in einem Wasserbad abgeglichen. Nach dem Abgleichen wurden 200 ul an 0,2 M CaCl&sub2; je ml PPP zugesetzt, um die Koagulation einzuleiten. Der Röhrcheninhalt wurde auf einem Labor-Umkehrmischer gemischt, und es wurde die Gerinnungszeit für jedes Röhrchen notiert. Geronnenes PPP wurde von nichtgeronnenem PPP unterschieden anhand eines offensichtlichen Übergangs von einem flüssigen Zustand in einen gallertartigen Zustand, bei dem durch Drehung kein Fließen ausgelöst werden konnte. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Gerinnungszeit gemessen.

BEISPIEL II

IMMOBILISIERUNG DER AKTIVATOREN DES EXTRINSISCHEN KOAGULATIONSWEGES

A. Von der 3M Corporation wurden auf dem Markt erhältliche hohle Glas-Mikrokugeln. Marke Scotchlite"(wirksame Oberfläche 0.7 m²/g, bestimmt durch Krypton-Gasadsorption. Porous Materials Inc., Ithaca, N. Y.), bezogen.
B. Die Oberflächen der hohlen Glaskugeln aus A wurden gegenüber einer Gerinnungsaktivierung passiviert durch eine 60 Minuten währende Silanbehandlung mit 2% Oktadecyltrichlorosilan, OTS (Hulls America), in Chloroform, in Lösungsmittel und Wasser gewaschen und dann luftgetrocknet, bevor sie in die Teströhrchen abgewogen wurden. Die OTS-behandelten Glaskugeln aus B wurden einer 1 mg/ml-Lösung von Rinderthrombin (Sigma) in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (Gibco) zugesetzt und eine Stunde lang auf einem Labor-Umkehrmischer gemischt. Die Glaskugeln mit dem darauf immobilisierten Thrombin wurden dreimal kräftig in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, um ungebundenes Thrombin zu entfernen, und luftgetrocknet, bevor sie in Teströhrchen abgewogen wurden. Die Gerinnungszeiten für die nichtmodifizierten Glaskugeln aus A (Aktivator des intrinsischen Reaktionsweges), die OTS-beschichteten Glaskugeln aus B und die Glaskugeln aus C, bei denen auf dem OTS-Überzug Thrombin (Aktivator des extrinsischen Reaktionsweges) immobilisiert worden war, wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in Fig. 3 gezeigt, in der die Gerinngungszeit im Vergleich zum Verhältnis der wirksamen Oberfläche der Kugeln zum Volumen an PPP dargestellt wird. Kurve A zeigt die Gerinnungsaktivierung auf dem intrinsischen Reaktionsweg des Koagulationsweges durch die unbehandelten Glaskugeln mit hoher Oberflächenenergie. Kurve B zeigt, daß die OTS-Beschichtung mit niedriger Oberflächenenergie die Kugeln so verändert hat, daß sie die Gerinnung im wesentlichen nicht aktivieren. Kurve C zeigt, daß das immobilisierte Thrombin eine etwa dreifache Senkung der Gerinnungszeit im Verhältnis zu den mit OTS-beschichteten Kugeln von B, die kein Thrombin aufweisen, verursacht. Man kann feststellen, daß die Gerinnungszeit bei einer geringen zugesetzten Menge an auf der Oberfläche immobilisierten Thrombin plötzlich auf einen Plateauwert der Gerinnungszeit von ungefäher 4 Minuten abfällt, was darauf schließen läßt, daß dieses immobilisierte Enzymsystem bei einem Oberflächen-Volumen-Verhältnis von annähernd 2 · 10&supmin;³ m²/ml substrat-begrenzt war. Im Gegensatz dazu wiesen die unbehandelten Glaskugeln eine mit dem zugesetzten Aktivator ständig abnehmende Gerinnungszeit auf.

BEISPIEL III

Bei diesem Beispiel wird die enzymatische Aktivität des immobilisierten Thrombins von Beispiel II durch den direkten Vergleich mit der Gerinnungsaktivität des löslichen Thrombins gemessen.
Fig. 4 zeigt die PPP-Gerinnungszeit, die bei unterschiedlichen Konzentrationen des löslichen Thrombins beobachtet wurde. Man kann feststellen, daß Fig. 4 der Kurve C von Fig. 3 ähnlich ist, insbesondere hinsichtlich des Erreichens einer Plateaugrenze in der Gerinnungszeit, die bei annähernd 4 Minuten beobachtet wird. Folglich sind 1 · 10&supmin;² mg/ml lösliches Thrombin (4-Minuten-Grenze aus Fig. 4) annähernd gleichwertig mit der enzymatischen Aktivität, die mit auf der Oberfläche immobilisierten Thrombin bei annähernd 1 · 10&supmin;³ m²/ml (geschätzt aus der Kurve C von Fig. 3) erreicht wird. Aus diesen Daten kann ermittelt werden, daß 1 · 10&supmin;² mg auf einer wirksamen Oberfläche von 2 · 10&supmin;³ m², oder etwa 5 mg/m², eine wirksame Beschichtung durch aktives Enzym auf den OTS-behandelten Glaskugeln ist.

BEISPIEL IV

Dieses Beispiel demonstriert, daß lösliches Thrombin dem Heparin entgegenwirkende Eigenschaften aufweist.
Wie in Beispiel I wurden Röhrchen vorbereitet, die unterschiedliche Konzentrationen an löslichem Heparin und verschiedene Konzentrationen an löslichem Thrombin enthielten. Aus Fig. 5 ist ersichtlich, daß zunehmende Konzentrationen des gerinnungsaktivierenden Thrombin notwendig sind, um PPP, das zunehmende Mengen an Heparin enthält, zur Gerinnung zu bringen.

BEISPIEL V

Dieses Beispiel demonstriert, daß das auf der Oberfläche immobilisierte Thrombin aus Beispiel II C eine dem Heparin entgegenwirkende Aktivität aufweist.
In Übereinstimmung mit Beispiel I wurden Röhrchen vorbereitet, die 0,175 Einheiten Heparin/ml PPP und verschiedene Mengen der Mikrokugeln aus Beispiel II B und II C enthielten. Die Gerinnungszeiten, die bei diesen Mikrokugeln beobachtet wurden, werden in Fig. 6 gezeigt. Kurve A ist eine Darstellung der Gerinnungszeit des durch die Kugeln von II B (ohne Thrombin) mit Heparin versetzten PPPs, die zeigt, daß mit Heparin versetztes PPP bei Fehlen von Thrombin nicht gerann. Kurve B zeigt, daß bei Vorhandensein von auf der Oberfläche immobilisiertem Thrombin (Beispiel II C) ein Oberflächen-Volumen- Verhältnis von mehr als 4,5 · 10&supmin;³ m²/ml erforderlich war, um eine Gerinnungszeit von annähernd 4 Minuten zu erreichen, während für PPP ohne den Zusatz von Heparin (siehe Kurve C von Fig. 3) nur 2 · 10&supmin;³ m²/ml erforderlich waren. Aus diesen Daten kann abgeleitet werden, daß etwa die Hälfte der Aktivität des immobilisierten Thrombins auf die Neutralisierung der Antikoagulans-Eigenschaften des Heparins gerichtet war.

BEISPIEL VI

Dieses Beispiel demonstriert die Gerinnungsaktivität durch den Dual-Reaktionsweg- Gerinnungsverstärker der Erfindung, der durch das Zerkleinern von Glaskugeln mit auf der Oberfläche immobilisiertem Thrombin hergestellt wurde.
Die Glaskugeln mit immobilisiertem Thrombin aus Beispiel II C wurden unter Verwendung von Mörser und Stößel zerkleinert. Die zerkleinerten Kugeln wurden in einer Kochsalzlösung gewaschen, um ganze Kugeln und kolloidales Material/Partikel durch Flotation zu entfernen. Es wurde ermittelt, daß die wirksame Oberfläche des fertigen Produkts 0,9 m²/g betrug, wie im Beispiel II durch Krypton-Gasadsorption gemessen. Durch das Zerkleinern entstehen gleiche Oberflächenbereiche an immobilisiertem Thrombin (äußere Kugeloberfläche) und unbehandeltem Glas (innere Kugeloberfläche).
Die Gerinnungsaktivierung durch den Dual-Reaktionsweg-Gerinnungsaktivator wurde in PPP gemessen, das 0,175 Einheiten Heparin/ml enthielt, um den direkten Vergleich mit den Ergebnissen von Beispiel II C vornehmen zu können, die mit ganzen Glaskugeln mit auf der Oberfläche immobilisiertem Thrombin ermittelt worden sind. Kurve A von Fig. 7 gibt die Kurve B von Fig. 6 wieder, sie zeigt die Gerinnung des mit Heparin versetzten PPPs durch auf der Oberfläche von ganzen Kugeln immobilisiertes Thrombin und kann mit den Ergebnissen verglichen werden, die mit dem gleichen Aktivator in zerkleinerter Form (Kurve B von Fig. 7) gewonnen wurden. Man kann feststellen, daß auf der Grundlage eines äquivalenten Verhältnisses von wirksamer Oberfläche zu Volumen die Gerinnungsaktivierung der zerkleinerten Form größer als die der ganzen Kugel ist und eine zusätzliche Senkung der Gerinnungszeit auf Grund der Aktivierung des intrinsischen Reaktionsweges der Koagulationskaskade durch die natürliche Glasoberfläche darstellt, die freiliegt, wenn die Kugel zerkleinert wird.

Claims

1. Koagulationsverstärkender Zusatz für ein Blutabnahmebehältnis, der ein Partikel umfaßt, das eine Vielzahl von Oberflächenbereichen hat, wobei ein erster der Oberflächenbereiche den intrinsischen Koagulationsweg aktiviert und auf einem zweiten der Oberflächenbereiche ein Aktivator des extrinsischen Koagulationsweges immobilisiert worden ist.

2. Zusatz nach Anspruch 1, der außerdem eine Plastikschicht zwischen der zweiten Oberfläche und dem immobilisierten Aktivator umfaßt.

3. Blutabnahmevorrichtung, die folgende Komponenten umfaßt:

a) ein Blutabnahmebehältnis mit einem offenen Ende;

b) eine Membran über dem offenen Ende, wobei das Behältnis luftleer gemacht worden ist; und

c) den Zusatz aus Anspruch 1 innerhalb des Vakuumbehältnisses.

4. Verfahren zur Herstellung eines Zusatzes für ein Blutabnahmeröhrchen, der sowohl den intrinsischen als auch den extrinsischen Koagulationsweg aktiviert, das folgende Schritte umfaßt:

a) Beschichten der äußeren Oberfläche einer hohlen Glas-Mikrokugel mit Plastik:

b) Immobilisieren eines Aktivators des extrinsischen Koagulationsweges auf der Beschichtung, um eine Mikrokugel mit einer Oberfläche zu ergeben, die den extrinsischen Koagulationsweg aktiviert; und

c) Zerkleinern der Mikrokugel mit dem darauf immobilisierten Aktivator des extrinsischen Reaktionsweges, um die aus natürlichem Glas bestehende innere Oberfläche der Mikrokugel freizulegen.