DE69433776T2

DE69433776T2 - Reagenz und verfahren für seine anwendung

Info

Publication number: DE69433776T2
Application number: DE69433776T
Authority: DE
Inventors: W. Michael ALDERINK; R. Paul FISHER; M. Henry GRAGE; M. Sarmishtha MISHRA
Original assignee: Roche Diagnostics Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Priority date: 1993-08-31
Filing date: 1994-08-31
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2014-09-01
Also published as: EP0717838A1; JP3470973B2; DE69433776D1; EP0717838B1; JPH09502521A; ES2220914T3; EP0717838A4; WO1995006868A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Reagenzzusammensetzungen für die Anwendung in Koagulations- oder Gerinnungszeitassays.
2. Stand der Technik
Koagulationsassays haben eine Akzeptanz als wichtiges Werkzeug bei der Handhabung von Patienten, die mit Antikoagulanzien behandelt werden, erreicht. Bei diesen Assays wird eine Probe des Gesamtbluts oder des Plasmas im Hinblick auf die Gerinnungszeit oder Koagulationszeit als ein Hinweis auf die Reaktion des Patienten auf eine spezielle Dosis des Antikoagulanz untersucht.
Die Koagulations- oder Gerinnungszeitassays werden ebenfalls oftmals mit Blut oder Plasma von einem Patienten vor einem chirurgischen Eingriff durchgeführt, um das medizinische Fachpersonal mit Informationen über die Gerinnungszeit des Blut eines Patienten, der nicht notwendigerweise mit Antikoagulanzien zu behandeln ist, zur Verfügung zu stellen.
Die Industrie hat viele Anstrengungen darauf gerichtet, Koagulationszeitassays und Assayvorrichtungen, die relativ einfach zu verwenden und relativ billig zu kaufen und zu handhaben sind, auszugestalten und zu kommerzialisieren. Eine große Aufmerksamkeit ist Assayvorrichtungen gewidmet worden, die wegwerfbare Objektträger oder Einsätze verwenden. Die Objektträger oder Einsätze enthalten in der Regel Reagenzien für die Durchführung des Assays und stellen ebenfalls einen geeigneten Ort zur Verfügung, um eine Probe mit den Reagenzien reagieren zu lassen und die entstandene Reaktion als Teil des Assays beobachten zu können.
Eines dieser Koagulationszeitassayüberwachungsgeräte ändert die Fließrate der Teilchen in einer Probe als Hinweis auf die Koagulationszeitpunkt. In diesen Assayvorrichtungen wird eine Blut- oder Plasmaprobe durch die Kapillarwirkung durch einen Pfad in einem Einsatz bewegt, wo sie mit einem trocknen Koagulationsmittel, das Thromboplastin enthält, vermischt wird, und dann überwacht wird, um die Änderungen der Fließrate zu beobachten. Die Fließratenänderungen können beispielsweise überwacht werden, indem der Durchgang der Teilchen, wie Blutzellen, nach einem Strahl von parallel gelichtetem Licht, das über den Durchgang in dem Einsatz gerichtet ist, beobachtet wird.
Diese Assays und Assayvorrichtungen sind beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5,140,161, 4,963,498, 4,756,884, 5,164,598, 5,204,525 und 5,144,139 und in den Europäischen Patentpublikationen Nr. 0 397 424 A2 und 0 394 070 A1 beschrieben.
Ein anderer Typ eines Koagulations- oder Gerinnungszeitassays verwendet die Kapillarkräfte in einem Durchgang, um eine flüssige Blut- oder Plasmaprobe an eine Reaktionsstelle zu ziehen, wo sie gehalten wird. Die Probe macht ein trocknes Reagenz löslich, das sich ebenfalls im Kapillardurchgang und/oder an der Reaktionsstelle befindet. Das Reagenz enthält Thrombo-plastin, das die Gerinnung der Probe initiiert und magnetisierbare Teilchen. Die Teilchen werden in der Flüssigkeit an der Reaktionsstelle durch Schalten zwischen externen Magnetfeldern oszilliert, die an einem Winkel zueinander orientiert sind, um ein oszillierendes Magnetfeld, das die Teilchen beeinflusst, aufzubauen. Mit dem Fortschreiten der Gerinnung wird die Teilchenoszillation gehindert. Veränderungen der Oszillation der Teilchen ergeben ein nachweisbares Signal, das mit der Gerinnungszeit der Probe korreliert werden kann.
Diese Assays, die nachfolgend der Einfachheit halber als oszillierende Teilchenassays bezeichnet werden und Einsätze für die Anwendung in diese Assays sind beispielsweise in den US-Patenten Nrn. 4,849,340 und 5,110, 727 und in den internationalen PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 92/01065 und WO 89/10788 beschrieben. Die US 5,110,727 beschreibt das Lufttrocknen eines Thromboplastinreagenz, das mit magnetisierbaren Teilchen in einem Kapillarraum kombiniert ist, wobei allerdings angegeben ist, dass eine Gefriertrocknung bevorzugt ist.
Anstrengungen, Koagulationsassayvorrichtungen unter Verwendung von Einsätzen mit Kapillarräumen mit teilchenförmigen Indikatorreagenzien zu kommerzialisieren, weisen normalerweise die Gefriertrocknung von mindestens einigen der Reagenzien an gewünschten Orten in den Kapillarräumen auf. Die Gefriertrocknung ist in der Vergangenheit bevorzugt worden, weil die Wärme der Lufttrocknung dazu neigt, das Thromboplastinreagenz zu denaturieren, was die Verwendung großer Mengen während des Herstellungsverfahrens erfor-dert, um Assayvorrichtungen mit einer geeigneten Menge an verbleibenden aktiven Reagenz herzustellen, und weil die gefriergetrockneten Materialien schnell während des Assays wieder löslich gemacht werden. Diese Anstren-gungen waren bisher technisch erfolgreich, und obwohl festgestellt worden ist, dass die Gefriertrocknung relativ langsam, komplex und teuer ist, eignet sie sich eher für die diskontinuierliche Arbeitsweise als für die kontinuierliche Hochdurchsatzverarbeitung, so dass die kommerzielle Attraktivität dieser Assays reduziert ist. Es gab einen Bedarf hinsichtlich einer Innovation, bei der unerwünschte Komplikationen und relativ hohe Ausgaben für das Gefriertrocknen vermieden werden und die das Lufttrocknen von Reagenzien für die Verwendung in oszillierenden Teilchenkoagulations-assays attraktiver macht.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Nachteile des Standes der Technik, insbesondere die Gefriertrocknung von Reagenzien in einen Kapillarraum während der Herstellung, zu überwinden.
Es ist ebenfalls Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine lufttrocknende Reagenzlösung zu stellen und diese zu einer stabilen, trocknen Reagenzbeschichtung auf der Oberfläche einer Reagenzvorrichtung zu bilden.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine beschichtete, luftgetrocknete Reagenzzusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die die Löslichkeit von gefriergetrockneten Reagenzien simuliert.
Es ist eine weitere, andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Koagulationsassaysvorrichtungen mit einem kontinuierlichen Verfahren herzustellen.
Es ist ebenfalls Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Träger für Reagenzien, der in Assay verwendet wird und beschichtbar ist und leicht löslich gemacht werden kann, herzustellen.
Diese und andere Aufgaben werden durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass lufttrocknende, leicht lösliche Reagenzzusammensetzungen, die als Beschichtungen auf üblicherweise verwendeten Materialien, wie Kunststoffen, zu trocknen sind und die so leicht wie gefriergetrocknete Materialien wieder löslich gemacht werden können, hergestellt werden können, indem die aktiven Reagenzkompo-nenten mit einer neuen Trägermischung aus löslichen Kohlenhydraten mit höheren und niedrigen Molekulargewichten kombiniert werden. Die Kohlenhydrate mit dem höheren Molekulargewicht im Träger sind derart ausgewählt, dass der Zusammensetzung Beschichtungseigenschaften verliehen werden, um der Aggregation von Reagenzteilchen in der Lösung während der Herstellung zu widerstehen und die Wiedersolubilisierung der Reagenzschicht während der Assaydurchführung zu optimieren. Das Kohlenhydrat mit dem geringern Molekulargewicht im Träger ist derart ausgewählt, dass es die Löslichkeit der getrockneten Reagenzzusammensetzung beim Kontakt mit einer flüssigen Probe erhöht.
Die vorliegende Erfindung basiert ebenfalls auf der Entdeckung, dass ein System aus diesen Reagenzien, das als separate Schichten im Kapillarraum einer Oszillationsteilchenreagenzvorrichtung aufgetragen ist, die Herstellungsprobleme der Vergangenheit im Hinblick auf den Verlust der Thromboplastinaktivität während der Wärmetrocknung und die Notwendigkeit, eine Gefriertrocknungsstufe anzuwenden und den diskontinuierlichen Prozess, der bei der Gefriertrocknung inhärent ist, verhindern kann.
In einem Aspekt ist die vorliegende Erfindung die Reagenzzusammensetzung.
In einem weiteren Aspekt ist die Erfindung ein System aus Reagenzzusammensetzungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend detaillierter und mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben.
1 zeigt eine schematische Perspektivansicht einer erfindungsgemäßen Assayvorrichtung, die für die Durchführung von Gerinnungszeitassays geeignet ist.
2 zeigt schematisch einen Querschnitt einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung der 1 entlang der Linie 2–2.
3 zeigt schematisch einen Querschnitt einer anderen Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Kapillarvorrichtung.
Detaillierte Beschreibung
Diese Erfindung stellt ein Trägermaterial für Reagenzien zur Verfügung. Die Reagenzien können solche sein, die für Assays geeignet sind. Allerdings sollen die Trägermaterialien dieser Erfindung einen breiten Anwendungs-bereich, wo immer es erwünscht ist, einen beschichtbaren Träger zu haben, der leicht wieder löslich ist, aufweisen.
Diese Erfindung stellt ebenfalls Reagenzzusammensetzungen zur Verfügung, die für Koagulations(Gerinnungszeit)assays nützlich sind. Diese Zusammensetzungen sind insbesondere in Assayvorrichtungen nützlich, worin eine flüssige Blut- oder Plasmaprobe durch die Kapillarwirkung in einen Einsatz transportiert wird, der das Reagenz enthält und worin der Assay durchgeführt wird, wobei die Reagenzzusammensetzungen ebenfalls für die Durchführung von Koagulationsassays in Küvetten, auf Objektträgern und in Laborschüsseln geeignet sind.
Die Reagenzzusammensetzungen dieser Erfindung können so formuliert sein, dass sie sowohl für Fließratenänderungsassays als auch für Assays mit oszillierenden magnetisierbaren Teilchen, wie oben beschrieben, geeignet sind, obwohl sie in erster Linie für die Verwendung in einem Assay des Typs mit oszillierenden magnetisierbaren Teilchen entwickelt worden sind. Es ist ohne weiteres für den Fachmann auf dem Gebiet von Assays und Assayvorrichtungen ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung auch auf Assays und Assayvorrichtungen anwendbar ist, die nicht dafür verwendet werden, die Gerinnungszeit zu bestimmen. Die vorliegende Erfindung kann in jedem Assay verwendet werden, bei dem ein Reagenz, das eine Zusammensetzung enthält, auf einer Oberfläche durch Trocknen aufgetragen wird, wonach diese dann später in Lösung gebracht wird, indem sie mit einer Testprobe in Kontakt gebracht wird. Diese anderen Ausführungsformen sollen innerhalb des Umfangs der anliegenden Ansprüche liegen, obwohl die folgende Beschreibung sich auf die Anwendung der Erfindung in Koagulationsassays auf den Typ mit oszillierenden Teilchen konzentriert.
Diese Zusammensetzungen werden zunächst als wässrige Lösungen ausgebildet, die dann an der Luft an ihrem Ort während der Herstellung der Assayvorrichtungen getrocknet werden können. In einer solchen Lösung sind das Thromboplastin und die Indikatorreagenzien (magnetisierbare Teilchen), die in Koagulationsassays verwendet werden, in einer wässrigen Lösung mit einem Träger aus einem löslichen Kohlenhydratmaterial mit sowohl höheren als auch niedrigen Molekulargewichten vermischt. Das Kohlenhydratmaterial ist derart ausgewählt, dass es einen Anteil mit höheren Molekulargewicht aufweist, um der Lösung bei ihrer Trocknung Beschichtungseigenschaften zu verleihen. Wenn das Reagenz ebenfalls teilchenförmiges Material, wie magnetisierbare Teilchen, umfasst, ist die Kohlenhydratfraktion mit höherem Molekulargewicht derart gewählt, dass sie verhindert, dass das teilchenförmige Material während des Herstellungsverfahrens aggregiert.
Die Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht ist derart gewählt, um die Eigenschaft des Trägers, durch eine flüssige Probe löslich gemacht zu werden, zu verbessern, wobei allerdings nicht die Fähigkeit der Fraktion mit höherem Molekulargewicht unterdrückt wird, die Aggregation zu verhindern.
Viele Kombinationen von Kohlenhydraten mit hohem und niedrigem Molekulargewicht sind als Träger in dieser Erfindung geeignet. Gute Ergebnisse sind erhalten worden, wenn die Kohlenhydratmischung eine Mischung aus Sacchariden ist. In einer besonders geeigneten Ausführungsform stellen die Kohlenhydrate mit hohem Molekulargewicht agglomerierte Maissirup-Feststoffe dar, während die Kohlenhydrate mit niedrigem Molekulargewicht Disaccharide, wie Saccharose, darstellen. Die bevorzugten agglomerierten Maissirupfeststoffe haben folgendes Kohlenhydratprofil: Monosaccharide 2,3 %, Disaccharide 7,5 %, Trisaccharide 9,1 %, Tetrasaccharide 6,8 % und Pentasaccharide und größer (Saccharide, die größer als Pentasaccharide sind) 74,4 %. Bevorzugt werden Disaccharide und agglomerierten Maissirupteststoffe in eine wässrige Reagenzlösung in Mengen von etwa 4 g, jeweils auf 100 g Gesamtlösung, gegeben.
Das Gewichtsverhältnis von Disacchariden zu Kohlenhydraten mit höherem Molekulargewicht im Träger kann variieren. Wenn es zu wenig Disaccharid gibt, geht die Reagenzschicht schlechter in Lösung beim Kontakt mit einer flüssigen Probe. Wenn der Anteil an Disaccharid zu groß ist, trocknet die Lösung nicht zu einer geeigneten Beschichtung aus und die magnetisierbaren Teilchen können agglutinieren.
Ein bevorzugtes Gewichtsverhältnis von Disaccharid zu Pentasaccharid und größer ist experimentell auf etwa 1 : 0,75 bestimmt worden, und es kann erreicht werden, indem in einer wässrigen Lösung im Wesentlichen gleiche Teile von Saccharose und von kommerziell erhältlichen agglutinierten Maissirupfeststoffen vermischt werden.
Die löslichen Kohlenhydratmaterialien mit der gewünschten Mischung der Molekulargewichte stellt ein Trägermaterial zur Verfügung, das auf Oberflächen aufgetragen werden kann und ohne weiteres beim Kontakt mit einer flüssigen Probe, wie Blut oder Plasma, wieder löslich ist. Das Trägermaterial kann mit Reagenzien vermischt sein, um die Reagenzzusammensetzungen zu erhalten.
Die erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzungen werden hergestellt, indem die aktiven Reagenzbestandteile in einer wässrigen Lösung des Trägers vermischt werden und getrocknet werden.
Es ist in experimentellen Arbeiten gezeigt worden, dass der Bereich von Disacchariden und agglomerierten Maissirupfeststoffen etwas je nach bevorzugter Ausführungsform variieren kann, wobei allerdings immer noch Lösungen hergestellt werden, die in geeignete Reagenzzusammensetzungen getrocknet werden können. Beispielsweise kann das Disaccharid in eine wässrige Lösung, die ebenfalls Thromboplastin und/oder magnetisierbare Teilchen in einem Bereich von etwa 2 bis etwa 6 g pro 100 g Gesamtlösung oder -suspension enthält, gegeben werden. Konzentrationen der Disaccharide von weniger als etwa 2 g pro 100 g Gesamtlösung oder Gesamtsuspension führen zu Reagenzschichten, bei der die Solubilisierung während der Inkubation mit einer flüssigen Probe unerwünscht langsam sind, während Konzentrationen von mehr als etwa 6 g pro 100 g Gesamtlösung Reagenzkompo-sitionen herstellen, die anfangen, ihre Beschichtungseigenschaften zu verlieren.
Die Saccharide mit einem höherem Molekulargewicht (agglomerierte Mais-sirupfeststoffe) können in eine wässrige Lösung in einem Konzentra-tionsbereich von etwa 1 bis etwa 6 g pro 100 g Gesamtlösung gegeben werden, wobei sie immer noch geeignete Beschichtungen aus der Reagenzzusammen-setzung produzieren. Allerdings resultieren Konzentrationen von unterhalb etwa 1 g pro 100 g Gesamtlösung in Reagenzschichten, die nicht mehr die gewünschten Beschichtungseigenschaften aufweisen, und Konzentrationen von oberhalb etwa 6 g pro 100 g Gesamtlösung führen zu Reagenzzusammensetzungsbeschichtungen, die nur unerwünscht langsam in Lösung beim Kontakt mit einer flüssigen Probe zurückgehen.
Die in der bevorzugten Ausführungsform verwendeten Maissirupfeststoffe sind von Grain Processing Corporation, Muscatine, Iowa erhältlich und werden unter dem Handelsnamen Maltrin QO (tm) M600 verkauft. Die Disaccharide sind bevorzugt Saccharose.
Wenn die Reagenzien für Koagulationsassays vom Typ oszillierender magnetisierbarer Teilchen hergestellt werden, werden die magnetisierbaren Teilchen in die wässrige Lösung in einer Menge hinzugefügt, die ausreicht, ein Signal zu ergeben, das als Reaktion auf das oszillierende Magnetfeld während der Durchführung eines Assays nachgewiesen werden kann. Es ist festgestellt worden, dass der Konzentrationsbereich der magnetisierbaren Teilchen, der geeignet ist, in einem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 2,0 g auf 100 g Gesamtmaterialien liegt, bevor die Suspension auf eine Vorrichtungsoberfläche aufgetragen und getrocknet wird.
Konzentrationen von magnetisierbaren Teilchen von weniger als etwa 0,1 g auf 100 g Gesamtsuspension neigen dazu, dass sie nicht in der endgültigen Reagenzschicht in ausreichender Dichte vorhanden sind, um ein nachweisbares Signal zu zeigen. Obwohl die experimentelle Arbeit gezeigt hat, dass etwa 2,0 g magnetisierbare Teilchen auf 100 g Gesamtsuspension Reagenzschichten, die korrekt in einem Koagulationsassay funktionieren, produzieren, keine Signalverbesserung für Konzentrationen im Überschuss von 0,6 g auf 100 g Wasser verzeichnen, ist 0,6 g die bevorzugte Konzentration.
Wie im U.S.-Patent 5,110,727 beschrieben ist, funktioniert eine Vielzahl magnetisierbarer Teilchen in dem Koagulationsassay vom Typ oszillierender magnetisierbarer Teilchen. Ein bevorzugtes Teilchen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist Fe₃O₄ mit einer Teilchengröße von etwa 0,3 Mikron. Andere für die vorliegende Erfindung geeignete Teilchen sind in dieser Publikation beschrieben, die für den Fachmann erhältlich ist und vorliegend nicht wiederholt wird.
Das Thromboplastinreagenz kann in der Reagenzzusammensetzung oder in dem System aus Reagenzzusammensetzungen in jeder Konzentration vorhanden sein, die ausreicht, um eine Gerinnungskaskade in der Probe zu initiieren. Typischerweise beträgt diese etwa 4,8 bis 5,0 mg (gemessen als Gesamt-protein)/ml der wässrigen Lösung vor dem Trocknen, obwohl auch geeignete Ergebnisse mit Reagenzzusammensetzungen erhalten worden sind, die aus Lösungen mit so wenig wie 3,2 mg/ml und so groß wie 6 mg/ml getrocknet sind (wo auch immer die Konzentrationen von Thromboplastin oder Verhältnisse von Thromboplastin und anderen Elementen in der Spezifikation und in den anliegenden Ansprüchen erwähnt sind, ist immer das Thromboplastin als Gesamtprotein zu verstehen).
Die Konzentrationen der Komponenten in der getrockneten Reagenzschicht kann beträchtlich variieren, wobei sie immer noch im Umfang der Erfindung liegen. Es ist durch experimentelle Daten bestimmt worden, dass, wenn alle Komponenten eine Koagulationsassays in einer einzigen Reagenzzusammensetzung enthalten sind, wie in 3 gezeigt ist, das bevorzugte Gewichtsverhältnis von Saccharose: agglomerierten Maissirupfeststoffen: magnetisierbaren Teilchen: Thromboplastin 120 : 120 : 18 : 1 beträgt. Allerdings können geeignete Zusammensetzungen Gewichtsverhältnisse von Saccharose und agglomerierten Maissirupfeststoffen von etwa 105 bis etwa 160; Gewichtsverhältnisse magnetisierbarer Teilchen von etwa 12 bis etwa 24 und Gewichtsverhältnisse von Thromboplastin von etwa 0,64 bis etwa 1,2 umfassen. Diese Verhältnisse beziehen sich auf die relativen Konzentrationen, bezogen auf das Gewicht der Reagenzien in den oben beschriebenen Lösungen und auf die Gründe im Hinblick auf die geeigneten Bereiche, die ebenfalls oben erwähnt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wie diese, die in 2 gezeigt ist, werden die Reagenzien, die für einen Koagulationsassay notwendig sind, im Kapillarraum einer Vorrichtung mit oszillierenden Teilchen als ein System auf separaten Schichten, wie in 2 gezeigt ist, vorgesehen. In dieser Ausführungsform werden die magnetisierbaren Teilchen einer ersten Reagenzschicht 6 gehalten, die normalerweise im Wesentlichen die Gesamtheit einer Oberfläche des Kapillarraums bedeckt, während das Thromboplastinreagenz in einer zweiten Reagenzschicht 7 gehalten wird, die normalerweise nur die Stelle bedeckt, an der eine Koagulationsreaktion überwacht wird.
In dieser bevorzugten Ausführungsform weist die Reagenzschicht mit den magnetisierbaren Teilchen 6 eine Konzentration der Teilchen, der Kohlenhydrate mit niedrigem Molekulargewicht und der Kohlenhydrate mit hohem Molekulargewicht auf, die im Wesentlichen ähnlich derjenigen ist, die oben für eine Einzelschicht-Reagenzzusammensetzung beschrieben wurde. Die bevorzugte Konzentration dieser Komponenten in der Reagenzlösung vor dem Trocknen in einer Reagenzzusammensetzung beträgt etwa 0,6 g Teilchen für jeweils 100 g Gesamtsuspension und etwa 4 g jeweils Disaccharid und Pentasaccharid und höhere (Saccharide) für jeweils 100 g Wasser. In der getrockneten Reagenzzusammensetzung beträgt das Gewichtsverhältnis von Saccharose: agglomerierten Maissirupfeststoffen und magnetisierbaren Teilchen 6,66 : 6,66 : 1. Experimentelle Daten haben gezeigt, dass geeignete Ergebnisse erwartet werden können, wenn die Gewichtsverhältnisse von Saccharose und agglomerierten Maissirupfeststoffen etwa 6 bis etwa 9 beträgt, während das Gewichtsverhältnis der magnetisierbaren Teilchen in einem Bereich von etwa 0,66 bis etwa 1,33 liegt.
Der zweite Teil des Systems der Reagenzschichten in der bevorzugten Ausführungsform ist die Thromboplastinreagenzschicht 7. Sie kann auf einer separaten Oberfläche des Innenraums des Kapillarraums in der Assayvorrichtung aufgetragen sein, oder sie kann auf einem ausgewählten Ort auf der ersten Reagenzschicht aufgetragen sein.
Wie oben beschrieben wurde, kann das Thromboplastin in jeder Konzentration vorhanden sein, die eine Koagulationsreaktion, die für den Assay geeignet ist, initiiert. Die experimentelle Analyse hat gezeigt, dass die bevorzugte Konzentration (gemessen als Gesamtprotein) in der Lösung zur Bildung der zweiten Schicht in einem Bereich von etwa 4,8 bis 5,0 mg/ml Reagenzlösung liegt. Diese Konzentration wird erreicht, indem etwa 100 ml eines Thromboplastin enthaltenden Extrakts aus Kaninchengehirnpulver mit etwa 2,96 g jeweils Disaccharid und Pentasaccharid und höher, wie oben beschrieben wurde, vermischt werden, um eine Reagenzlösung zu bilden, wonach dann die Lösung an der Stelle luftgetrocknet wird.
Das bevorzugte Gewichtsverhältnis von Saccharose : agglutinierten Maissirupfeststoffen : Thromboplastin (Gesamtprotein) in der zweiten Schicht ist zu 6 : 6 : 1 bestimmt worden. Ein geeigneter Bereich von Gewichtsverhältnissen ist allerdings durch experimentelle Daten dahingehend bestimmt worden, dass er von etwa 4 bis etwa 9 für Saccharose und die agglutinierten Maissirupfeststoffe und von etwa 0,64 bis etwa 1,2 für das Thromboplasmin liegt.
Die Bereiche von geeigneten Gewichtsverhältnissen der Komponenten in beiden Schichten entspricht den geeigneten Bereichen von Komponenten in den oben beschriebenen Lösungen und den Gründen für die Grenzen dieser Bereiche.
Es ist für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich, dass Filmbildner, Verarbeitungshilfen und andere Bestandteile in den Reagenzzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten sein können, solange sie nicht das Leistungsvermögen des Reagenz in einem Assay stören.
Zurückkommend inbesondere auf die Zeichnungen, zeigt 1 eine Assayvorrichtung 1, die für den Koagulationsassay vom Typ oszillierende Teilchen geeignet ist und detaillierter in den U.S.-Patenten Nr. 4,849,340 und 5,110,727, die bereits oben erwähnt wurden, beschrieben ist. Eine flüssige Probe, wie Blut oder Plasma, wird auf eine Probenöffnung 1 aufgetragen, wo sie durch die Kapillarkräfte in den Kapillardurchgang 3 gezogen wird und an die Assaystelle 4 bewegt wird, die ebenfalls ein Kapillarraum ist. Die Assaystelle 4 ist der Ort, an dem die Oszillation der magnetisierbaren Teilchen während des Assays überwacht werden.
Der Kapillardurchgang 3 und die Assaystelle 4 befinden sich im Inneren der Vorrichtung 1, und sie werden durch gestrichelte Linien angegeben. Eine Belüftungsöffnung 5 ist zur Atmosphäre offen und verhindert, dass ein Aufbau von Luftdruck gegen den Kapillarfluss eines flüssigen Reagenz im Kapillardurchgang wirkt.
Eine innere Oberfläche des Kapillarraums ist mit einer ersten Reagenzschicht 6 beschichtet. Die erste Reagenzschicht 6 umfasst magnetisierbare Teilchen, die in einer wässrigen Lösung von Kohlenhydraten mit sowohl höheren als auch niedrigen Molekulargewichten dispergiert worden sind und dann an der Stelle in den Kapillarräumen 3 und 4 der Vorrichtung 1 luftgetrocknet worden sind. Die erste Reagenzschicht 6 ist bereits oben detaillierter beschrieben worden.
Die zweite Reagenzschicht 7 ist auf der Reagenzschicht 6 im Wesentlichen an der Assaystelle 4 angeordnet. Die Reagenzschicht 7 wird hergestellt, indem eine Mischung aus Kohlenhydraten mit sowohl höheren als auch niedrigen Molekulargewichten in ein wässriges Thromboplastinreagenz unter Bildung einer Lösung gegeben wird, wonach dann die Lösung an der Stelle getrocknet wird. Eine detailliertere Beschreibung der Reagenzschicht 7 ist bereits oben erfolgt.
Die in 2 gezeigte Konstruktion ist eine bevorzugte Ausführungsform. Es ist für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich, dass die erste Reagenzschicht 6 auf jeder Oberfläche des Innenraums der Kapillarräume 3 und 4 angeordnet sein kann, solange wie die magnetisierbaren Teilchen an der Reaktionsstelle 4 vorgesehen sind, wenn die Schicht 6 durch eine flüssige Probe wieder löslich gemacht wird. In ähnlicher Weise kann die zweite Reagenzschicht 7 ebenfalls irgendwo innerhalb der Kapillarräume 3 und 4 angeordnet sein, obwohl es weniger erwünscht ist, die Schicht 7 im Kapillarraum 3 anzuordnen ist, was den Start der Koagulation beeinträchtigt, bevor er in entsprechender Weise an der Reaktionsstelle 4 überwacht werden kann.
Im Betrieb wird die flüssige Probe auf die Öffnung 2 aufgetragen und durch die Kapillarwirkung durch den Kapillarraum 3 zur Reaktionsstelle 4 gezogen, wo sie durch die Kapillarkräfte gehalten wird. Wenn sich die flüssige Probe durch die Kapillarräume 3 und 4 bewegt, dann macht sie die Reagenzschichten 6 und 7 wieder löslich, so dass die in der Schicht 6 gehaltenen magneti-sierbaren Teilchen frei sind, um als Reaktion auf ein oszillierendes Magnetfeld zu oszillieren, und so dass das in der Reagenzschicht 7 gehaltene Thromboplasmin beginnt, die Koagulation der Probe zu bewirken. Die Oszillation der magnetisieren Teilchen kann dann überwacht werden, um die Gerinnungszeit zu bestimmen, was detaillierter in den US-Patenten Nrn. 4,849,340 und 5,110,727 beschrieben ist.
2 zeigt einen vergrößerten schematischen Querschnittsbereich der Vorrichtung 1 von 1 entlang den Linien 2–2 von 1. Die Reagenzschicht 6 ist auf die obere Oberfläche 8 der Vorrichtung 1 aufgetragen. Die Schicht 6 enthält magnetisierbare Teilchen 9, die in einer trockenen Mischung aus Kohlenhydraten mit sowohl hohem als auch niedrigem Molekulargewicht 10 suspendiert sind. Die Schicht 7 in dieser speziellen Ausführungsform ist auf der Schicht 6 aufgetragen. Wie oben beschrieben wurde, umfasst die Schicht 7 eine Mischung aus Kohlenhydraten mit sowohl hohem als auch niedrigem Molekulargewicht mit Thromboplasmin in einer Menge, die ausreichend ist, um eine Koagulationskaskade in einer Blut- oder Serumprobe, die in den Kapillarraum an die Reaktionsstelle 4 gezogen wurde, zu beginnen.
Obwohl dieses nicht gezeigt ist, sollte es für den Fachmann selbstverständlich sein, dass die Schicht 7 ebenso auf der unteren Oberfläche 11 des Kapillarraums 4 oder sogar zwischen der Schicht 6 und der Oberfläche 8 angeordnet sein kann.
3 zeigt einen schematischen Querschnitt einer alternativen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. In dieser Ausführungsform sind das Thromboplasmin und die magnetisierbaren Teilchen 9 zusammen in einer einzigen Reagenzschicht 12 suspendiert, die auf der oberen Oberfläche 8 der Vorrichtung 1 aufgetragen ist.
Obwohl die Ausführungsform von 3 innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt, und sie sich ebenfalls als geeignet erwiesen hat, ist sie aus folgenden zwei Hauptgründen nicht bevorzugt. Einer besteht darin, dass die Schicht aus einer Reagenzschicht mit Thromboplasmin über den gesamten Kapillarraum (3 und 4 in 1) zu einer unerwünscht frühen Aktivierung der Koagulationskaskade in der Probe führt, bevor die Probe die Assaystelle 4 erreicht hat. Die Überwachung der Oszillation der Teilchen ergibt die genauesten Ergebnisse, wenn die Oszillation vom Beginn des Koagulationsereignisses beobachtet wird.
Ein zweiter Grund besteht darin, dass die Ausführungsform von 2 bevorzugt ist, weil die Reagenzschichten nacheinander aufgetragen werden können und bei verschiedenen Temperaturen getrocknet werden können, was schließlich weniger Thromboplastinmaterial erfordert. Das Thromboplastin-reagenz ist bei hohen Temperaturen empfindlich, was eine Motivation in der Vergangenheit gewesen ist, die Reagenzmaterialien für Koagulationsassays gefrierzutrocknen. Das Lufttrocknen einer Reagenzschicht, wie diese, die in 3 gezeigt ist, erfordert relativ hohe Ausgangskonzentrationen von Thromboplasmin, weil etwas davon in der Hitze, die für das Trocknen der Reagenzschicht 12 erforderlich ist, an Aktivität verliert.
Die Assayvorrichtungen der 1 und 2 werden in einem kontinuierlichen Prozess hergestellt, indem zunächst ein Abstandsstück an einer flexiblen Kunststoffverstärkung vorgesehen wird. Die Verstärkung 8 dient als Oberfläche 8 in den 2 und 3. Das Abstandsstück enthält einen Ausschnitt, der im Wesentlichen der Form der Kapillarräume 3 und 4 in 1 entspricht. Die oben beschriebene Reagenzsuspension mit den magnetischen Teilchen wird in den Ausschnitt gegeben und mit Hitze bei etwa 85°C bis zur Trocknung luftgetrocknet. Bei einem Ausschnitt durchschnittlicher Größe für die Verwendung in einer Koagulationsvorrichtung werden etwa 30 μl der Suspension, die die magnetischen Teilchen enthält, dispergiert und unter Bildung der Schicht 6 getrocknet. Danach wird eine kleine Menge, normaler-weise etwa 2 μl, einer Thromboplastin enthalten Lösung oben auf die Schicht 6 gegeben und für etwa die Hälfte der Gesamttrocknungszeit der ersten Schicht 6 bei Temperaturen unterhalb von etwa 55°C zur Bildung der Schicht 7 luftgetrocknet. Nach dem Trocknen weisen die Schichten 6 und 7 normaler-weise eine Gesamtdicke von zwischen 10 und 20 Mikron auf. Nachdem die Thromboplastinlösung aufgetragen und getrocknet worden ist, bildet man die Öffnungen 2 und 5 in der Verstärkung, und es wird eine Bedeckung über den Abstandshalter angeordnet, um einen Kapillarraum, der die Reagenzschichten enthält, auszubilden.
Die Ausführungsform von 3 wurde in ähnlicher Weise hergestellt, allerdings nur mit einem Auftragungsschritt für die kombinierte Lösung aus den Bestandteilen und mit einem einzigen Trocknungsschritt.
Es sollte für den Fachmann ersichtlich sein, dass das Herstellungsverfahren Prozesshilfen, wie oberflächenaktive Stoffe und Coronabehandlungen, umfassen kann, um die Beschichtung des Reagenz auf der Oberfläche zu fördern.
BEISPIELE
Beispiel 1
Die Schicht 6 von 2 wurde wie folgt hergestellt: Es wurden in 92 g Wasser 4 g jeweils Saccharose und agglomerierte Maissirupfeststoffe (M-600) gelöst. Es wurde in der erhaltenen Lösung feinteiliges Fe₃O₄ durch heftiges Vermischen suspendiert. Das heftige Vermischen wurde beibehalten als 30 μl dieser Dispension in einen vorgeformten Becher gegeben wurden. Diese abgetrennte Suspension wurde bei 65°C für etwa 10 Minuten getrocknet.
Beispiel 2
Die Schicht 7 von 2 wurde wie folgt hergestellt: Es wurden 0,5 g Thromboplastin (Gesamtprotein) aus lyophilisiertem Pulver mit 100 g Wasser vermischt. Es wurden 2,96 g jeweils Saccharose und agglomerierte Maissirupfeststoffe (M-600) unter Vermischen in der Lösung gelöst. Etwa 2 μl dieser Lösung wurden auf die in Beispiel 1 gebildete Schicht 6 gegeben und bei etwa 55°C für 5 Minuten getrocknet.
Beispiel 3
Die nach den Prozeduren der Beispiele 1 und 2 gebildete Struktur wurde in ein oszillierendes Magnetfeld gegeben und mit 10 μl einer Gesamtblutprobe aus einer Pipette in Kontakt gebracht und beobachtet, um zu bestimmen, wie schnell, nach Kontakt mit der flüssigen Probe, die magnetisierbaren Teilchen beginnen, in Reaktion auf das oszillierende Magnetfeld zu oszillieren. Es wurde festgestellt, dass die Teilchen im Wesentlichen gleichzeitig bei Kontakt mit der flüssigen Probe (innerhalb weniger als 5 Sekunden) anfingen zu oszillieren.
Die vorliegende Erfindung ist im Hinblick auf die obigen Lehren und die Zeichnung mit ausreichender Klarheit und Verständlichkeit beschrieben worden, um den Fachmann in die Lage zu versetzen, die Erfindung nachzuarbeiten und zu verwenden, um die beste Art und Weise zur Durchführung der Erfindung kundzutun und um diese von anderen Erfindungen und von dem, was alt ist, zu unterscheiden.

Claims

Schichtbildende, trockene Reagenzzusammensetzung, die umfaßt: (a) Thromboplastin (b) magnetisierbare Teilchen und (c) einen Träger, der eine Mischung aus löslichen Kohlenhydraten mit mindestens zwei verschiedenen Molekulargewichten umfaßt, die Pentasaccharide und höhere als Kohlenhydrate mit höherem Molekulargewicht und Disaccharide als Kohlenhydrate mit niedrigerem Molekulargewicht umfaßt.
Reagenz nach Anspruch 1, worin die Disaccharide Saccharose sind und die Pentasaccharide und höheren durch agglomerierte Maissirupfeststoffe zur Verfügung gestellt sind.
Reagenz nach Anspruch 2, worin das Gewichtsverhältnis von Saccharose agglomerierten Maissirupfeststoffen : magnetisierbaren Teilchen : Thromboplastin innerhalb eines Bereichs von 105–160 : 105–160 : 12-24 : 0,64 – 1,2 liegt.
Reagenz nach Anspruch 3, worin das Gewichtsverhältnis von Saccharose agglomerierten Maissirupfeststoffen magnetisierbaren Teilchen Thromboplastin 120 : 120 : 18 : 1 beträgt.
Schichtbildendes, trockenes Reagenzsystem, das das Reagenz von Anspruch 1 umfaßt, worin (a) eine erste trockene Reagenzschicht die Komponenten (b) und (c) nach Anspruch 1 enthält und (b) eine zweite trockene Reagenzschicht die Komponenten (a) und (c) nach Anspruch 1 enthält.
Reagenzsystem nach Anspruch 5, worin die Disaccharide Saccharose sind und die Pentasaccharide und höheren durch agglomerierte Maissirupfeststoffe zur Verfügung gestellt sind.
Reagenzsystem nach Anspruch 6, worin in der ersten Schicht das Gewichtsverhältnis von Saccharose : agglomerierten Maissirupfeststoffen magnetisierbaren Teilchen innerhalb eines Bereichs von 6–9 : 6–9 : 0,66 – 1,33 liegt.
Reagenzsystem nach Anspruch 7, worin das Gewichtsverhältnis von Saccharose: agglomerierten Maissirupfeststoffen: magnetisierbaren Teilchen etwa 6,66 : 6,66 1 beträgt.
Reagenzsystem nach Anspruch 6, worin in der zweiten Schicht das Gewichtsverhältnis von Saccharose : agglomerierten Maissirupfeststoffen Thromboplastin innerhalb eines Bereichs von 4–9 : 4–9 : 0,64–1,22 liegt.
Reagenzsystem nach Anspruch 9, worin das Gewichtsverhältnis von Saccharose: agglomerierten Maissirupfeststoffen: Thromboplastin etwa 6 : 6 : 1 beträgt.
Verfalren zur Durchführung eines Koagulationszeit-Assays mit einer Gesamtblutprobe oder Plasmaprobe, das aufweist: (a) in Kontakt bringen einer Gesamtblutprobe oder einer Plasmaprobe mit der trockenen Reagenzzusammensetzung von Anspruch 1 oder 5, wobei die Zusammensetzung durch die Probe solubilisiert wird und eine Reaktionslösung bildet; (b) Unterwerfen der Reaktionslösung einem oszillierenden magnetischen Feld und (c) Überwachen der Oszillierung der magnetisierbaren Teilchen in der Reaktionslösung als Antwort auf das oszillierende magnetische Feld als Indikation für die Koagulationszeit der Probe.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die Zusammensetzung auf die Reaktionsoberfläche in einem Kapillarraum, der die Probe in Kontakt mit der Zusammensetzung transportiert und hält, aufgetragen wird.