JPH10260180A

JPH10260180A - 血液凝固促進剤及び血液検査用容器

Info

Publication number: JPH10260180A
Application number: JP9068123A
Authority: JP
Inventors: Ryusuke Okamoto; 隆介岡本; Hideo Anraku; 秀雄安楽
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1997-03-21
Filing date: 1997-03-21
Publication date: 1998-09-29
Anticipated expiration: 2017-03-21
Also published as: JP3247070B2

Abstract

(57)【要約】【課題】血液を短時間で凝固させる血液凝固促進剤、及
びそれをもちいた血液検査用容器を提供する。【解決手段】ペプチド鎖のＡｒｇと任意のアミノ酸残基
との結合及び／又はＬｙｓと任意のアミノ酸残基との結
合を加水分解しうる加水分解酵素、並びにアマニ油吸油
量が２０〜４０ｍｌ／１００ｇ、ＢＥＴ比表面積が５０
００〜３００００ｃｍ²／ｇ、比抵抗値が１×１０¹⁰Ω
・ｃｍ以下の無機物とからなることを特徴とする血液凝
固促進剤。これが内部に、好ましくは分離された形態で
収容された血液検査用容器。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血清生化学検査及
び血清免疫学検査等の臨床検査分野において用いられる
血液検査用容器及びそれを用いた血液検査方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】病気の予防や診断の目的で血液検査が一
般に行われているが、血液検査の多くは血清生化学検
査、血清免疫学検査、血球検査等の血清検査である。そ
の検査に要する血清は、通常、血液検査用容器に採取し
た血液を凝固させた後、遠心分離によって比重の異なる
血餅から分離し、ピペットを用いて、あるいはデカンテ
ーションにより採取している。被験者から採取した血液
が凝固するには比較的長時間を必要とし、結果を知るた
めに再来院しなければならなかったり、特に緊急に検査
を実施する必要のある場合には問題となる。血液の採取
に用いられる血液検査用容器は、従来から、ガラス製や
ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレ
ン、ポリエチレンテレフタレート等の合成樹脂製のもの
が使用されているが、最も短いとされるガラス製容器で
４０〜６０分を必要とし、合成樹脂製容器では４時間以
上かかってしまう。そこで、従来より血液凝固を短時間
で行える凝固剤の検討がなされてきた。

【０００３】血液の凝固は血液凝固第ＸII因子の活性化
により開始し、その後数多くの反応段階を経て、最終的
にフィブリノーゲンがフィブリンに転化する複雑な経路
を有することがわかっている。特開平５−１５７７４７
号公報には、血液の凝固を促進する成分として、血液凝
固反応系の最終段階であるフィブリノーゲンがフィブリ
ンへ転化する反応を促進するトロンビンや蛇毒酵素等の
酵素系薬剤を用いることが記載されている。ところで、
近年、検査機器の進歩に伴って、より迅速な検査が望ま
れている。従来は採血後、検査結果が得られるまでに２
日以上を必要とするのが通常であったが、診察の待ち時
間の３０〜６０分程度の間に採血、検査をし、結果が得
られることが望まれている。その理由は診察に際して重
要な情報が得られるだけでなく、早期により有効な治療
を行なえるからである。上記公報の方法によると、合成
樹脂製容器を用いた場合、凝固時間は大幅に短縮される
が、５分程度で大部分が凝固するものの、実際に完全に
凝固するには１０分程度必要である。上記の目的のため
には、５分以内で完全に血液を凝固させる必要がある。
血液が完全に凝固しないうちに遠心分離を行なうと、遠
心分離の間に凝固反応が進行し、生成したフィブリンが
血清中に残ってしまい、血清がゲル化して検査用容器か
ら取り出すことができず、検査に供することができなく
なる。従って、その後の遠心分離操作を入れると１０分
以内で血清検体を得ることは不可能である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記問題点を
解決するものであり、その目的は、血液を短時間で凝固
させる血液凝固促進剤、及びそれをもちいた血液検査用
容器を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の血液凝固促進剤
は、加水分解酵素と無機物とからなる。

【０００６】上記加水分解酵素はプロテアーゼであり、
ペプチド鎖において、Ａｒｇと任意のアミノ酸残基との
結合及び／又はＬｙｓと任意のアミノ酸残基との結合を
加水分解しうるものが用いられる。

【０００７】上記加水分解酵素としては、例えば、トリ
プシン、トロンビン、蛇毒トロンビン様酵素等のセリン
プロテアーゼ；カテプシンＢ、フィシン等のチオールプ
ロテアーゼ；キニナーゼＩ等の金属プロテアーゼなどが
挙げられ、特にセリンプロテアーゼが好適に用いられ
る。上記加水分解酵素の量は、少なくなると血液凝固の
時間が長くなったり凝固が不完全になることがあり、多
くなると検査値に悪影響を及ぼす恐れがあるので、血液
１ｍｌあたり０．１〜１００単位が好ましく、０．５〜
５０単位がより好ましい。

【０００８】上記無機物は、血液と接触した際に血液凝
固因子の活性化を促し、また血小板の凝集を促す作用を
有する。しかしながら上記無機物が血液凝固促進作用を
効果的に発揮するには、アマニ油吸油量、ＢＥＴ比表面
積値及び比抵抗値が特定の範囲内のものでなければなら
ない。アマニ油吸油量及びＢＥＴ比表面積値は、無機物
の表面積の程度を表し、また表面積は無機物の有する表
面孔隙の程度と関連するので、吸油量及び比表面積によ
って表面孔隙の程度を知ることができる。血液凝固に際
しては、第ＸII因子、すなわち接触因子が活性化される
が、このためには異物表面上に第ＸII因子、プレカリク
レイン、高分子キニノーゲンの３種類の物質が錯体を形
成して吸着されることが必要であり、これらの１つ又は
２つが欠けた状態での吸着は活性化に至らないとされて
いる。

【０００９】ところで、血液凝固促進作用を期待して無
機物を使用した場合に、表面積が非常に大きなものであ
ると、無機物の表面上には錯体を形成しない状態での第
ＸII因子、プレカリクレイン、高分子キニノーゲンの割
合が高まることになり、言い換えると第ＸII因子の活性
化に必要な三者の錯体形成割合は減少することになり、
かえって血液凝固促進作用が低下することになる。また
逆に無機物の表面積が小さすぎると、凝固因子の吸着の
確率が小さくなり、血液凝固促進作用を期待することが
できなくなる。従って、本発明に用いられる無機物は、
アマニ油吸油量が２０〜４０ｍｌ／１００ｇ、ＢＥＴ比
表面積が５０００〜３００００ｃｍ²／ｇの範囲の表面
積を有する。

【００１０】上記アマニ油吸油量はＪＩＳＫ−５１０
１に準拠して測定される値を示す。また上記ＢＥＴ比表
面積は、無機物の表面に吸着される気体の吸着量、その
時の平衡圧、吸着ガスの飽和蒸気圧から単分子層として
表面を覆いきる気体量を求め、これに吸着気体分子の平
均断面積を乗じて算出された値を指すものであり、吸着
気体としては、窒素ガス、酸素ガス、アルゴンガス、メ
タンガス等が使用される。この方法によれば、アマニ油
吸油量の測定によっては測定できない細孔を含めた表面
積値が測定される。また、比抵抗値は、電気伝導度の逆
数であり、常温における値である。吸着性無機物に対す
る比抵抗値は、タンパク質と吸着性無機物との間の電位
分布の整合性を保持し、タンパク質のコンフォメーショ
ンの変化を防止することに寄与すると推測される。本発
明に用いられる無機物の比抵抗値は、１×１０¹⁰Ω・ｃ
ｍ以下、好ましくは５×１０⁴Ω・ｃｍである。

【００１１】上記無機物としては、吸着剤として使用さ
れていたような無機物、例えば、ガラス、シリカ、カオ
リン、セライト、ベントナイト等の水不溶性の無機質微
粉末が挙げられる。また上記無機物の粒径は、５０μｍ
以下が好ましく、平均粒径が１０μｍ以下のものを用い
るのがより好ましい。特に血液凝固時間を短縮させるの
に有効な無機物はシリカであり、とりわけ無定形成分を
２０重量％以上含有する多孔性のシリカが優れた効果を
発揮する。上記無機物の量は、少なくなると血液凝固の
時間が長くなったり凝固が不完全になることがあり、多
くなると検査値に悪影響を及ぼす恐れがあるので、血液
１ｍｌあたり１×１０^-6〜１×１０^-3ｇが好ましく、１
×１０^-5〜１×１０^-4がより好ましい。

【００１２】本発明において、上記加水分解酵素と無機
物は混合されて血液凝固促進剤とされてもいいし、それ
ぞれが担体に担持されるなどして分離されており、使用
時に併用される形態とされていてもよい。担体に担持さ
せる方法としては、上記血液凝固促進剤の水溶液又は水
分散液をスプレーにより塗布したり、水溶液又は分散液
に浸漬して塗布することにより担持させることができ
る。

【００１３】血液を凝固させるには、例えば、容器中に
採取した血液に上記本発明の血液凝固促進剤を加えても
よいが、本発明２の血液検査用容器は、予め上記血液凝
固促進剤が有底の管状容器の内部に収容されている。上
記管状容器の素材としては、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポ
リメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル等の熱
可塑性樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、
エポキシ−アクリレート樹脂等の熱硬化性樹脂、酢酸セ
ルロース、プロピオン酸セルロース、エチルセルロー
ス、エチルキチン等の変性天然樹脂、ソーダ石灰ガラ
ス、リンケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のケイ酸塩
ガラス、石英ガラスなどのガラス、及びこれらを主成分
とするもののいずれもが用いられる。上記管状容器は、
識別のために外面の一部が着色されていてもよく、また
採血量を計量するための目盛りが設けられていてもよ
い。

【００１４】本発明２において、上記血液凝固促進剤の
加水分解酵素と無機物が管状容器の内部に収容される際
には、両者の混合物として収容されてもよいが、加水分
解酵素が無機物に吸着され、血液中に十分に拡散しない
ことにより凝固促進作用が低下しないように、分離され
た形態で収容されるのが好ましい。本発明２において上
記分離された形態とは、例えば、容器内面に一方が積層
された後、他方が積層されているもの；一方が管状容器
内面に積層され、他方が担体に担持されて収容されてい
るもの；両者が別々に担体に担持されて収容されている
もの；容器内面の一部に一方が積層され、他の部分に他
方が積層されているもの等が挙げられる。ここで、一方
が積層された後、他方が積層されているものとは、最初
に積層されるものと次に積層されるものが必ずしも完全
に二層となっている必要はない。これらのうち、製造の
際の効率、検査時に血液を導入し混和する際の血液凝固
促進剤の分散のしやすさ等の点から、容器内面に一方が
積層された後、他方が積層されているもの、一方が管状
容器内面に積層され、他方が担体に担持されて収容され
ているものがより好ましい。

【００１５】上記担体は、血餅と同等以上の比重がない
と、血液を凝固させた後の遠心分離操作の後、血清中に
浮遊する恐れがあり、その場合には血清を容器から採取
しにくくなるため、比重は１．０８以上である。担体の
形状は、球状、円柱状、板状、円盤状等特に限定されな
いが、加水分解酵素又は吸着性無機物の塗布や容器への
収容のしやすさの点から、直径１〜７ｍｍの略球状が好
ましい。また担体の素材としては、血液検査用容器の素
材として挙げられたものを同様に用いることができる。
上記加水分解酵素及び／又は吸着性無機物を容器内面に
積層させる方法としては、これらの水溶液又は水分散液
を容器内面に塗布した後、乾燥させる方法が挙げられ
る。両者を別々に積層する際には、一方の水分散液を容
器内面に塗布した後、乾燥させ、次いで他方を同様に塗
布、乾燥させることにより積層する。水溶液又は水分散
液を容器内面に塗布する方法としては、水溶液又は分散
液をスプレーにより塗布したり、水溶液又は分散液に浸
漬して塗布することができる。また担体に担持させる方
法としては、これらの水溶液又は水分散液をスプレーに
より塗布したり、水溶液又は分散液に浸漬して塗布する
ことにより担持させることができる。

【００１６】本発明２の血液検査用容器には、さらに血
餅付着防止成分が収容されてもよい。これにより血液が
凝固した後の血餅成分が容器内面に付着することを防止
でき、遠心分離時に血餅の移動が制限されることがな
く、血餅と血清を良好に分離できる。上記血餅付着防止
成分としては、水に対して難溶又は不溶の親水性物質を
用いることができ、例えば、脂肪族変性シリコーンオイ
ル（例えばジメチルポリシロキサン等）、芳香族変性シ
リコーンオイル（例えばメチルフェニルポリシロキサン
等）、部分ケン化ポリビニルアルコール、ビニルピロリ
ドン−酢酸ビニル共重合体などが挙げられる。このうち
変性シリコーンオイルを用いる場合は、これらが無機物
の表面を覆うことによる血液凝固促進性能の低下を防ぐ
ために、さらに水溶性物質を添加することが好ましい。
上記水溶性物質としては、例えば、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。

【００１７】血餅が容器内面に付着するのを防ぐために
は、血餅付着防止成分は容器内面に直接接し、かつ内面
全体を覆っている必要がある。従って、血液凝固促進剤
を収容する際に、あらかじめ容器内面に均一に塗布され
ているか、もしくは内面に塗布する血液凝固促進剤の溶
液又は分散液と混合された後、ともに塗布されてもよ
い。加水分解酵素と無機物とが分離された形態で収容さ
れる場合は、最初に塗布する血液凝固促進剤の溶液又は
分散液と混合し、容器内面に塗布される。さらにもう一
方の血液凝固促進剤の溶液又は分散液にも混合し、容器
内面又は担体に塗布されてもよい。

【００１８】本発明２の血液検査用容器には、さらに血
清分離剤が収容されてもよい。血清分離剤は、あらかじ
め容器底部に収容され、採血後の遠心分離により血餅と
血清の間に移動し、隔壁を形成することにより血清が分
離される。上記血清分離剤はチクソトロピー性を有する
ゲル状物であり、例えば、常温で流動性を有する合成樹
脂などに、チクソトロピー性付与剤、比重調整剤、及び
粘度調整剤などの添加剤を添加し混合することにより得
られる。上記合成樹脂としては、例えば、ジシクロペン
タジエンのオリゴマー等、上記チクソトロピー性付与剤
としては、例えば、ソルビトールと芳香族アルデヒドと
の縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンブ
ロック共重合体等、上記比重調整剤としては、例えば、
シリカ等、及び上記粘度調整剤としては、例えば、フタ
ル酸エステル等が、それぞれ挙げられる。

【００１９】本発明２の血液検査用容器は、通常の血液
検査用容器のほか、真空採血管としても使用できる。こ
の真空採血管は、通常のガラスもしくは合成樹脂製採血
管内部に上記血液凝固促進剤を収容し、排気して、ブチ
ルゴム製等の密封性の優れた栓で密封することにより調
製される。

【００２０】

【発明の実施の形態】次に、本発明の実施例を説明す
る。実施例及び比較例において、試薬、容器等として以
下のものを用いた。・加水分解酵素トロンビン（商品名：トロンビン持
田、持田製薬社製）・無機物微粉末シリカ（商品名：イムシルＡ２５、イ
リノイケミカル社製）アマニ油吸油量３０ml/100g 、ＢＥＴ比表面積１２
０００cm² 比抵抗値２．５×１０⁴Ω・cm ・血餅付着防止剤ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重
合体（モル比６：４）（商品名：ルビスコール６４、Ｂ
ＡＳＦ社製）・管状容器ポリエチレンテレフタレート製内容積１
０ｍｌ（16φ×100 mm）（積水化学工業社製）・担体ポリスチレン製球状成形体平均粒径３ｍｍ
（積水化学工業社製）

【００２１】（実施例１）ビニルピロリドン−酢酸ビニ
ル共重合体の０．５重量％水溶液に、トロンビン１００
００単位を溶解し、さらに微粉末シリカ０．０７８ｇを
均一に分散させて全量を３．１２５ｇとした。この液の
０．０２５ｇを、管状容器の内面に均一にスプレーし、
風乾して血液検査用容器を作製した。この容器に血液を
８ｍｌ採取した時の、トロンビンの量は血液１ｍｌあた
り１０単位、微粉末シリカの量は血液１ｍｌあたり７．
８×１０^-5ｇとなる。健常人の血液８ｍｌを上記血液検
査用容器に採取し、採取終了時点から血液が凝固するの
に要した時間を測定した。凝固の判定は、血液検査用容
器を傾けても血液の上面が動かず、さらに逆さに保って
も血液が流れ出ない時点とした。次いで凝固した血液を
２５℃、１３００Ｇ（２５００ｒｐｍ）で５分間遠心分
離し、分離された血清中のフィブリンの有無を目視観察
した。以上の結果を表１に示す。

【００２２】（実施例２）ビニルピロリドン−酢酸ビニ
ル共重合体の０．５重量％水溶液に、微粉末シリカ０．
２５ｇを均一に分散させて全量を１０ｇとした。この液
の０．０２５ｇを、管状容器の内面に均一にスプレー
し、風乾した。次いでビニルピロリドン−酢酸ビニル共
重合体の０．５重量％水溶液に、トロンビン１００００
単位を溶解し全量を３．１２５ｇとした。この液の０．
０２５ｇを、上記微粉末シリカがスプレーされた管状容
器の内面に均一にスプレーし、風乾して血液検査用容器
を作製した。この容器に血液を８ｍｌ採取した時のトロ
ンビンの量及び微粉末シリカの量は実施例１と同じであ
る。以下実施例１と同様にして凝固時間の測定とフィブ
リンの有無の目視観察を行なった。結果を表１に示す。

【００２３】（実施例３）ビニルピロリドン−酢酸ビニ
ル共重合体の０．５重量％水溶液に、微粉末シリカ０．
２５ｇを均一に分散させて全量を１０ｇとした。この液
の０．０２５ｇを、管状容器の内面に均一にスプレー
し、風乾した。次いでビニルピロリドン−酢酸ビニル共
重合体の０．５重量％水溶液に、トロンビン１００００
単位を溶解し全量を３．１２５ｇとした。この液の０．
０２５ｇを、球状成形体１０個に均一にスプレーし、風
乾した。この球状成形体を、上記微粉末シリカがスプレ
ーされた管状容器内部に収容し、血液検査用容器を作製
した。この容器に血液を８ｍｌ採取した時のトロンビン
の量及び微粉末シリカの量は実施例１と同じである。以
下実施例１と同様にして凝固時間の測定とフィブリンの
有無の目視観察を行なった。結果を表１に示す。

【００２４】（実施例４）実施例２のトロンビンの量１
００００単位を５０００単位、微粉末シリカの量０．２
５ｇを０．１２ｇとしたこと以外は実施例２と同様にし
て血液検査用容器を作製した。この容器に血液を８ｍｌ
採取した時の、トロンビンの量は血液１ｍｌあたり５単
位、微粉末シリカの量は血液１ｍｌあたり３．８×１０
^-5ｇとなる。以下実施例１と同様にして凝固時間の測定
とフィブリンの有無の目視観察を行なった。結果を表１
に示す。

【００２５】（比較例１）ビニルピロリドン−酢酸ビニ
ル共重合体の０．５重量％水溶液に、微粉末シリカ０．
２５ｇを均一に分散させて全量を１０ｇとした。この液
の０．０２５ｇを、管状容器の内面に均一にスプレー
し、風乾して血液検査用容器を作製した。この容器に血
液を８ｍｌ採取した時の微粉末シリカの量は、血液１ｍ
ｌあたり７．８×１０^-5ｇとなる。以下実施例１と同様
にして凝固時間の測定とフィブリンの有無の目視観察を
行なった。結果を表１に示す。

【００２６】（比較例２）ビニルピロリドン−酢酸ビニ
ル共重合体の０．５重量％水溶液に、トロンビン１００
００単位を溶解し全量を３．１２５ｇとした。この液の
０．０２５ｇを、管状容器の内面に均一にスプレーし、
風乾して血液検査用容器を作製した。この容器に血液を
８ｍｌ採取した時のトロンビンの量は、血液１ｍｌあた
り１０単位となる。以下実施例１と同様にして凝固時間
の測定とフィブリンの有無の目視観察を行なった。結果
を表１に示す。

【００２７】

【表１】

【００２８】

【発明の効果】本発明の血液凝固促進剤及び血液検査用
容器は、上述の通りであり、加水分解酵素と特定の無機
物を併用することにより、血液を短時間のうちに凝固さ
せることができる。さらに、凝固状態が安定に保たれ、
血清と血餅との分離が容易となるため、分離採取された
血清中にフィブリンや血餅成分が混在することもない。
血餅成分の収縮度合いも十分であるため、血清収率も高
い。また加水分解酵素と無機物が分離された形態とされ
ているため、血液凝固促進剤の安定性を保ち、血液凝固
能が低下することがない。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ペプチド鎖のＡｒｇと任意のアミノ酸残基
との結合及び／又はＬｙｓと任意のアミノ酸残基との結
合を加水分解しうる加水分解酵素、並びにアマニ油吸油
量が２０〜４０ｍｌ／１００ｇ、ＢＥＴ比表面積が５０
００〜３００００ｃｍ²／ｇ、比抵抗値が１×１０¹⁰Ω
・ｃｍ以下の無機物とからなることを特徴とする血液凝
固促進剤。
【請求項２】請求項１記載の血液凝固促進剤が、有底の
管状容器の内部に収容されていることを特徴とする血液
検査用容器。
【請求項３】請求項１記載の加水分解酵素と無機物が、
有底の管状容器の内部に分離された形態で収容されてい
ることを特徴とする請求項２記載の血液検査用容器。
【請求項４】請求項１記載の加水分解酵素と無機物の、
一方が管状容器内面に積層された後、他方が管状容器内
面に積層された形態とされていることを特徴とする請求
項３記載の血液検査用容器。
【請求項５】請求項１記載の加水分解酵素と無機物の、
一方が管状容器内面に積層され、他方が比重１．０８以
上の担体に担持されて収容されていることを特徴とする
請求項３記載の血液検査用容器。