JP2024001024A - 配列特異性およびｄｎａ－結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ - Google Patents

配列特異性およびｄｎａ－結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ Download PDF

Info

Publication number
JP2024001024A
JP2024001024A JP2023148314A JP2023148314A JP2024001024A JP 2024001024 A JP2024001024 A JP 2024001024A JP 2023148314 A JP2023148314 A JP 2023148314A JP 2023148314 A JP2023148314 A JP 2023148314A JP 2024001024 A JP2024001024 A JP 2024001024A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
meganuclease
group
changed
sense strand
modification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023148314A
Other languages
English (en)
Inventor
ヒーリンガ，オム，ダブリュ．
Homme W Hellinga
スミス，ジェームス，ジェファーソン
James Jefferson Smith
ジャンツ，ディルク
Derek Jantz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Duke University
Original Assignee
Duke University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37963286&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2024001024(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Duke University filed Critical Duke University
Publication of JP2024001024A publication Critical patent/JP2024001024A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/905—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

【課題】野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼを用いて、真核細胞において遺伝子治療によりヒトの疾患を治療する方法を提供する。【解決手段】組み換えメガヌクレアーゼは、特定の配列のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対し少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、前記配列とは異なる特定の配列のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分部位に対して特異性を有し、排外的修飾ではない少なくとも一つの修飾を含む、方法による。【選択図】なし

Description

本発明は、分子生物学および組み換え核酸工学の分野に関する。特に、本発明は、ＤＮ
Ａ認識配列特異性及び／又は親和度が変更された、合理的に設計された、非天然のメガヌ
クレアーゼに関する。さらに、本発明は、そのようなメガヌクレアーゼの生産法、および
、そのようなメガヌクレアーゼによる、組み換え核酸および生物の生産法に関する。
（関連出願）本出願は、２００５年１０月１８日出願の米国特許仮出願第６０／７２７
，５１２号の優先権の利益を主張する。なお、この引用出願の全開示を、参照することに
より本出願に含める。
（政府援助）本発明は、アメリカ合衆国国立衛生研究所、国立医科学研究所からの研究補
助金２Ｒ０１－ＧＭ－０４９８７１２、５Ｆ３２－ＧＭ０７２３２２、および５ ＤＰ１
ＯＤ０００１２２によって一部援助された。したがって、米国政府も、本発明において
若干の権利を保有する場合がある。
ゲノム工学は、あるゲノムの内部に、特定の遺伝子配列を、挿入し、欠失し、置換し、
および、その他のやり方で操作することを可能とする能力を要求するが、多くの治療的お
よび生物工学的応用を有する。ゲノム修飾のための効果的手段の開発は、これまでずっと
、遺伝子治療、農工学、および合成生物学における主要目標となっている（ＰＯＲＴＥＵ
Ｓ ＥＴ ＡＬ．（２００５），ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．２３；９６７－７３；
ＴＺＦＩＲＡ ＥＴ ＡＬ．（２００５），ＴＲＥＮＤＳ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．２３
：５６７－９；ＭＣＤＡＮＩＥＬ ＥＴ ＡＬ．（２００５），ＣＵＲＲ．ＯＰＩＮ．Ｂ
ＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．１６：４７６－８３）。ＤＮＡ配列を挿入又は修飾するための一般
的方法は、ゲノム標的に対して相同な配列によって側接される、トランスジェニックＤＮ
Ａ配列を導入すること、および、所望の相同組み換え事象を選択またはスクリーニングす
ることを含む。トランスジェニックＤＮＡによる組み換えはめったに起こらないが、標的
部位のゲノムＤＮＡにおける２本鎖切断によって刺激することが可能である。従来から、
ＤＮＡ２本鎖切断部を作るために、例えば、放射線照射および化学的処理を含めた数多く
の方法が用いられている。これらの方法は、効率的に組み換えを刺激することが可能では
あるけれども、二本鎖切断部は、ゲノムの中にランダムに挿入され、それらは、突然変異
誘発性および毒性が高い可能性がある。現在、染色体バックグランドにある特定の部位に
対し遺伝子修飾を照準することはできていないため、思い通りのゲノム加工に対する大き
な障害となっている。
この目標を達成するための一つの方法は、ゲノム内の単一部位にしか存在しないほど十
分に大きい配列に対し特異性を持つヌクレアーゼを用いて、標的配座に二本鎖切断部を設
けてその部位における相同組み換えを刺激することである（例えば、ＰＯＲＴＥＵＳ Ｅ
Ｔ ＡＬ．（２００５），ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．２３：９６７－７３を参照）
。この戦略の有効性は、ＦＯＫＩ制限酵素の、加工されたジンクフィンガーＤＮＡ－結合
ドメインと、非特異的ヌクレアーゼドメインとの間のキメラ融合を用いて、各種の生物体
において明らかにされている（ＰＯＲＴＥＵＳ（２００６），ＭＯＬ ＴＨＥＲ １３：
４３８－４６；ＷＲＩＧＨＴ ＥＴ ＡＬ．（２００５），ＰＬＡＮＴ Ｊ．４４：６９
３－７０５；ＵＲＮＯＶ ＥＴ ＡＬ．（２００５），ＮＡＴＵＲＥ ４３５：６４６－
５１）。これらの人工的ジンクフィンガーヌクレアーゼは、部位特異的組み換えを刺激す
るけれども、これらのヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインの調整低調に由来する、非
特異的な、残留切断活性を保持するので、不要の部位を切断することがしばしばある（Ｓ
ＭＩＴＨ ＥＴ ＡＬ．（２０００），ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２８：３
３６１－９）。これらの不要な切断は、処置生物体において、突然変異および毒性を引き
起こす可能性がある（ＰＯＲＴＥＵＳ ＥＴ ＡＬ．（２００５），ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥ
ＣＨＮＯＬ．２３：９６７－７３）。
植物および菌類のゲノムの中に一般的に認められる、１５－４０塩基対切断部位を認識
する、１群の天然ヌクレアーゼは、比較的毒性の低い、ゲノム加工代替品を提供する可能
性がある。このような「メガヌクレアーゼ」または「ホーミング・エンドヌクレアーゼ」
は、多くの場合、寄生的ＤＮＡ要素、例えば、グループ１自己スプライシングイントロン
およびインテインとコンタクトされる。これらのヌクレアーゼは、自然状態で、宿主ゲノ
ムの特異的位置における相同的組み換えまたは遺伝子挿入を促進する。これを、細胞のＤ
ＮＡ－修復機構を招集する、染色体において二本鎖切断を生産することによって行う（Ｓ
ＴＯＤＤＡＲＤ（２００６），ＲＥＶ．ＢＩＯＰＨＹＳ．３８：４９－９５）。一般に、
メガヌクレアーゼは、４つのファミリーに分けられる。すなわち、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧフ
ァミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、ＨＩＳ－ＣＹＳボックスファミリー、およびＨＮ
Ｈファミリーである。これらのファミリーは、触媒活性および認識配列に影響を及ぼす、
構造的モチーフによって特徴づけられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメン
バーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ保存モチーフの、１または２コピーを持つことによって特徴
づけられる（ＣＨＥＶＡＬＩＥＲ ＥＴ ＡＬ．（２００１），ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩ
ＤＳ ＲＥＳ．２９（１８）：３７５７－３７７４を参照）。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチー
フの単一コピーを持つＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、ホモダイマーを形成する
が、一方、２コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを持つメンバーは、モノマーであるこ
とが判明した。同様に、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリーメンバーは、７０－１００残基長のＧ
ＩＹ－ＹＩＧモジュールを持ち、その内二つは活性のために必要な、四つの不変残基を持
つ、４から５個の保存配列モチーフを含む（ＶＡＮ ＲＯＥＹ ＥＴ ＡＬ．（２００２
），ＮＡＴＵＲＥ ＳＴＲＵＣＴ．ＢＩＯＬ．９：８０６－８１１を参照）。ＨＩＳ－Ｃ
ＹＳボックス・メガヌクレアーゼは、数百のアミノ酸残基を含む領域に分散する、高度に
保存された、ヒスチジンおよびシステインの連続列によって特徴づけられる（ＣＨＥＶＡ
ＬＩＥＲ ＥＴ ＡＬ．（２００１），ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２９（１
８）：３７５７－３７７４を参照）。ＮＨＮファミリーの場合は、そのメンバーは、２対
の、アスパラギン残基によって囲まれる保存ヒスチジンを含むモチーフによって定義され
る（ＣＨＥＶＡＬＩＥＲ ＥＴ ＡＬ．（２００１），ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ Ｒ
ＥＳ．２９（１８）：３７５７－３７７４を参照）。メガヌクレアーゼのこの４ファミリ
ーは、構造保存部位に関してＤＮＡ認識配列の特異性及び触媒活性が互いに大きく異なっ
ている。
主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーから得られる、天然のメガヌクレアーゼは、これま
で、植物、酵母、ショウジョウバエ、哺乳類細胞及びマウスにおいて部位特異的なゲノム
修飾に有効に使用されているが、この方法は、このメガヌクレアーゼ認識配列を保存する
相同配列か（ＭＯＮＮＡＴ ＥＴ ＡＬ．（１９９９），ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹ
Ｓ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．２５５：８８－９３）又は認識配列を導入したあらかじめ加
工されたゲノム（ＲＯＵＥＴ ＥＴ ＡＬ．（１９９４），ＭＯＬ．ＣＥＬＬ ＢＩＯＬ
．１４：８０９６－１０６；ＣＨＩＬＴＯＮ ＥＴ ＡＬ．（２００３），ＰＬＡＮＴ
ＰＨＹＳＩＯＬ．１３３：９５６－６５；ＰＵＣＨＴＡ ＥＴ ＡＬ．（１９９６），Ｐ
ＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ９３：５０５５－６０；ＲＯＮＧ ＥＴ
ＡＬ．（２００２），ＧＥＮＥＳ ＤＥＶ．１６：１５６８－８１；ＧＯＵＢＬＥ Ｅ
Ｔ ＡＬ．（２００６），Ｊ．ＧＥＮＥ ＭＥＤ．８（５）：６１６－６２２）の修飾に
限定される。
ヌクレアーゼ刺激による遺伝子修飾の体系的実施は、ゲノムの既存部位に対する標的Ｄ
ＮＡ中断部に向けて照準させた特異性を持つ加工酵素の使用が必要となる。したがって、
医学的又は生物工学的関連部位において遺伝子修飾を促進するようにメガヌクレアーゼを
適応させることについては大きな関心が寄せられている（ＰＯＲＴＥＵＳ ＥＴ ＡＬ．
（２００５），ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．２３：９６７－７３；ＳＵＳＳＭＡＮ
ＥＴ ＡＬ．（２００４），Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．３４２：３１－４１；ＥＰＩＮＡＴ
ＥＴ ＡＬ．（２００３），ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．３１：２９５２－
６２）。
ＣＨＬＡＭＹＤＯＭＯＮＡＳＲＥＩＮＨＡＲＤＴＩＩから得られたメガヌクレアーゼＩ
－ＣＲＥＩは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーの一員であり、葉緑体染色体の中の２２塩
基対認識配列を認識・切断し、かつ、メガヌクレアーゼ再設計の好個の標的となっている
。この野生型酵素は、各モノマーが、全体認識配列における９塩基対に対して直接接触す
る、ホモダイマーである。この認識配列の単一位置において（ＳＵＳＳＭＡＮ ＥＴ Ａ
Ｌ．（２００４），Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．３４２：３１－４１；ＣＨＡＭＥＳ ＥＴ
ＡＬ．（２００５），ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．３３：Ｅ１７８；ＳＥＬＩ
ＧＭＡＮ ＥＴ ＡＬ．（２００２），ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．３０：３
８７０－９）、あるいは、比較的最近では、認識配列の中の３位置において（ＡＲＲＮＯ
ＵＬＤ ＥＴ ＡＬ．（２００６），Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．３５５：４４３－５８）、
塩基選択性を変えるＩ－ＣＲＥＩにおける突然変異を特定するために、遺伝子選択技術が
用いられている。Ｉ－ＣＲＥＩタンパク－ＤＮＡインターフェイスは、ＤＮＡ塩基に直接
接触する９個のアミノ酸と、修飾されたインターフェイスにおいて接触を形成する可能性
のある、少なくともさらに５個の残基を含む。このインターフェイスのサイズは、切断部
位を大きく変更された酵素を選択するために構築された配列ライブラリーにおいても十分
に抽出されることがほとんどないと思われるほど複雑な組み合わせを提示する。
ゲノムの正確な修飾を促進するヌクレアーゼについては、依然として需要がある。さら
に、特定の遺伝子座位における遺伝子配列の操作を可能とする、あらかじめ指定された、
合理的に設計された認識配列を有するヌクレアーゼを生成する技術、および、正確な配列
修飾を持つ生物体を遺伝学的に加工するために、そのようなヌクレアーゼを利用する技術
に対しては、依然として需要がある。
本発明は、メガヌクレアーゼＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーの同定及び特徴解明に基づ
く。メガヌクレアーゼが２本鎖ＤＮＡ認識配列とコンタクトする際、ＤＮＡ塩基およびＤ
ＮＡバックボーンに結合し、そうすることによって、該酵素の特異性および活性に影響を
及ぼす。この発見は、以下に詳細に説明するように、メガヌクレアーゼの認識配列特異性
及び／又はＤＮＡ結合親和性を変えることが可能なアミノ酸置換を特定するため及び天然
のメガヌクレアーゼが認識しない所望のＤＮＡ配列を認識することが可能なメガヌクレア
ーゼを合理的に設計し、開発するために用いられた。本発明はさらに、遺伝子治療、病原
体感染の治療及び診断と研究におけるインビトロ応用のために、生物体ゲノム内の少数座
位において所望の遺伝子配列の組み換えを実現するために、このようなメガヌクレアーゼ
を使用する方法を提供する。
したがって、ある実施態様では、本発明は、野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに比
べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対し変更特異性を持つ組み換えメガヌクレアー
ゼを提供する。この実施態様におけるメガヌクレアーゼは、配列番号１の野生型Ｉ－ＣＲ
ＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する
ポリペプチドを含むが、該組み換えメガヌクレアーゼは、配列番号２、配列番号３、配列
番号４及び配列番号５から選ばれる、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半分部
位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分部位に対して特異性を持ち、かつ、この組
み換えメガヌクレアーゼは、従来技術に認められる排外的修飾ではない、表５に掲げられ
る少なくとも一つの修飾を含む。
別の実施態様では、本発明は、野生型Ｉ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくと
も一つの認識配列半分部位に対し変更特異性を持つ組み換えメガヌクレアーゼを提供する
。この実施態様におけるメガヌクレアーゼは、配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアー
ゼの残基６－１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含む
が、該組み換えメガヌクレアーゼは、配列番号７および配列番号８から選ばれる、Ｉ－Ｍ
ＳＯＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる、認識配列
半分部位に対して特異性を持ち、かつ、該組み換えメガヌクレアーゼは、従来技術に認め
られる排外的修飾ではない、表７に掲げられる少なくとも一つの修飾を含む。
別の実施態様では、本発明は、野生型Ｉ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼと比べ、認識配列
に対し変更特異性を持つ組み換えメガヌクレアーゼを提供する。この実施態様におけるメ
ガヌクレアーゼは、配列番号９のＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼの残基３－１８６に対し
て少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含むが、この組み換えメガヌク
レアーゼは、配列番号１０および配列番号１１のＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼ認識配列
と少なくとも１塩基対異なる認識配列に対して特異性を持ち、かつ、この組み換えメガヌ
クレアーゼは、従来技術に認められる排外的修飾ではない、表９に掲げられる少なくとも
一つの修飾を含む。
別の実施態様では、本発明は、野生型Ｉ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくと
も一つの認識配列半分部位に対し変更特異性を持つ組み換えメガヌクレアーゼを提供する
。この実施態様におけるメガヌクレアーゼは、配列番号１２のＩ－ＣＥＵＩメガヌクレア
ーゼの残基５－２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含
むが、該組み換えメガヌクレアーゼは、配列番号１３および配列番号１４から選ばれるＩ
－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半分部位と少なくとも１塩基対異なる認識配列
半分部位に対して特異性を持ち、かつ、この組み換えメガヌクレアーゼは、従来技術に認
められる排外的修飾ではない、表１１に掲げられる少なくとも一つの修飾を含む。
本発明のメガヌクレアーゼは、認識配列内の１、２又は３以上の位置において組み換え
メガヌクレアーゼの配列特異性に影響を及ぼすために、本出願に開示される修飾の内の一
つ、二つ又は三つ以上を含むことが可能である。メガヌクレアーゼは、本出願に開示され
る新規修飾のみを含んでもよいし又は本出願に開示される新規修飾を従来技術で認められ
る修飾と組み合わせて含んでもよい。しかしながら、特異的に排除されるものは、従来技
術の修飾のみを含む組み換えメガヌクレアーゼである。
他の側面から考えると、本発明は、２本鎖ＤＮＡに対する配列特異的ではない結合親和
度を変更させた組み換えメガヌクレアーゼを提供する。これは、２本鎖ＤＮＡ認識配列の
バックボーンに接触する、メガヌクレアーゼ残基を修飾することによって実現される。こ
の修飾は、結合親和度を増大又は低減するため、酵素の全体活性を増大又は低減すること
が可能である。さらに、結合および活性の上昇／低下は、配列特異性における低下／上昇
を引き起こすことが認められた。したがって、本発明は、ＤＮＡ－結合親和度を変えるこ
とによって配列特異性を全体的に変えるための手段を提供する。
したがって、ある実施態様では、本発明は、野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼと比
べ、２本鎖ＤＮＡに対する結合親和度を変更させた組み換えメガヌクレアーゼを提供する
。この発明におけるメガヌクレアーゼは、配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの
残基２－１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含むが、
ＤＮＡ結合親和度は、（１）（Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ若しくはＲによるＥ８０、Ｄ
１３７、Ｉ８１、Ｌ１１２、Ｐ２９、Ｖ６４若しくはＹ６６の置換、又は（Ｂ）Ｋ若しく
はＲによるＴ４６、Ｔ１４０若しくはＴ１４３の置換から選ばれる一つの置換に対応する
少なくとも一つの修飾によって上昇するか、又は、逆に、（２）（Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、
Ｔ、Ｄ若しくはＥによるＫ３４、Ｋ４８、Ｒ５１、Ｋ８２、Ｋ１１６若しくはＫ１３９の
置換、又は（Ｂ）Ｄ若しくはＥによるＩ８１、Ｌ１１２、Ｐ２９、Ｖ６４、Ｙ６６、Ｔ４
６、Ｔ１４０若しくはＴ１４３の置換から選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つ
の修飾によって低下する。
別の実施態様では、本発明は、野生型Ｉ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼに比べ、２本鎖Ｄ
ＮＡに対する結合親和度を変更させた組み換えメガヌクレアーゼを提供する。この発明に
おけるメガヌクレアーゼは、配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの残基６－１６
０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含むが、ＤＮＡ結合親
和度は、（１）（Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ若しくはＲによるＥ１４７、Ｉ８５、Ｇ８
６若しくはＹ１１８の置換、又は（Ｂ）Ｋ若しくはＲによるＱ４１、Ｎ７０、Ｓ８７、Ｔ
８８、Ｈ８９、Ｑ１２２、Ｑ１３９、Ｓ１５０若しくはＮ１５２の置換から選ばれる一つ
の置換に対応する少なくとも一つの修飾によって上昇するか、又は、逆に、（２）（Ａ）
Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ若しくはＥによるＫ３６、Ｒ５１、Ｋ１２３、Ｋ１４３若しくは
Ｒ１４４の置換、又は（Ｂ）Ｄ若しくはＥによるＩ８５、Ｇ８６、Ｙ１１８、Ｑ４１、Ｎ
７０、Ｓ８７、Ｔ８８、Ｈ８９、Ｑ１２２、Ｑ１３９、Ｓ１５０若しくはＮ１５２の置換
から選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾によって低下する。
別の実施態様では、本発明は、野生型Ｉ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼに比べ、２本鎖Ｄ
ＮＡに対する結合親和度を変更させた組み換えメガヌクレアーゼを提供する。この発明に
おけるメガヌクレアーゼは、配列番号９のＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼの残基３－１８
６に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含むが、ＤＮＡ結合親
和度は、（１）（Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ若しくはＲによるＤ２０１、Ｌ１９、Ｌ８
０、Ｌ９２、Ｙ１５１、Ｙ１８８、Ｉ１９１、Ｙ１９９若しくはＹ２２２の置換、又は（
Ｂ）Ｋ若しくはＲによるＮ１５、Ｎ１７、Ｓ８１、Ｈ８４、Ｎ９４、Ｎ１２０、Ｔ１５６
、Ｎ１５７、Ｓ１５９、Ｎ１６３、Ｑ１６５、Ｓ１６６，Ｎ１９４若しくはＳ２０２の置
換から選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾によって上昇するか、又は、
逆に、（２）（Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ若しくはＥによるＫ２０、Ｋ２３、Ｋ６３、
Ｋ１２２、Ｋ１４８、Ｋ１５３、Ｋ１９０、Ｋ１９３、Ｋ１９５若しくはＫ２２３の置換
、又は（Ｂ）Ｄ若しくはＥによるＬ１９、Ｌ８０、Ｌ９２、Ｙ１５１、Ｙ１８８、Ｉ１９
１、Ｙ１９９、Ｙ２２２、Ｎ１５、Ｎ１７、Ｓ８１、Ｈ８４、Ｎ９４、Ｎ１２０、Ｔ１５
６、Ｎ１５７、Ｓ１５９、Ｎ１６３、Ｑ１６５、Ｓ１６６、Ｎ１９４若しくはＳ２０２の
置換から選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾によって低下する。
別の実施態様では、本発明は、野生型Ｉ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼに比べ、２本鎖Ｄ
ＮＡに対する結合親和度を変更させた組み換えメガヌクレアーゼを提供する。この発明に
おけるメガヌクレアーゼは、配列番号１２のＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの残基５－２
１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含むが、ＤＮＡ結合
親和度は、（１）（Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ若しくはＲによるＤ２５若しくはＤ１２
８の置換、又は（Ｂ）Ｋ若しくはＲによるＳ６８、Ｎ７０、Ｈ９４、Ｓ１１７、Ｎ１２０
、Ｎ１２９若しくはＨ１７２の置換から選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの
修飾によって上昇するか、又は、逆に、（２）（Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ若しくはＥ
によるＫ２１、Ｋ２８、Ｋ３１、Ｒ１１２、Ｒ１１４若しくはＲ１３０の置換、又は（Ｂ
）Ｄ若しくはＥによるＳ６８、Ｎ７０、Ｈ９４、Ｓ１１７、Ｎ１２０、Ｎ１２９若しくは
Ｈ１７２の置換から選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾によって低下す
る。
本発明のメガヌクレアーゼは、ＤＮＡ－結合親和度に影響を及ぼすために、本出願に開
示される、バックボーン接触残基の修飾の内、一つ、二つ又は三つ以上を含むことが可能
である。さらに、ＤＮＡ－結合親和度に影響を及ぼすこれらの修飾は、認識配列内部の特
定位置における組み換えメガヌクレアーゼの配列特異性を変える、前述の塩基接触残基の
新規修飾の内の一つ以上と組み合わせてもよいし、前述の従来技術の修飾と組み合わせて
もよいし、新規修飾と従来技術の修飾との組み合わせと組み合わせてもよい。特に、バッ
クボーン接触修飾および塩基接触修飾を組み合わせることによって、組み換えメガヌクレ
アーゼを、所望の特異性および活性を持つように合理的に設計することが可能である。例
えば、塩基接触残基に対する設計変更に由来する親和度の損失を逆転するＤＮＡ－結合親
和度の増加を設計することが可能であり、配列特異性を減少させ酵素に対する認識配列の
組を広げる親和度減少を設計することも可能である。
他の側面から考えると、本発明は、ホモ又はヘテロダイマー形成に対する親和度を変更
させた合理的設計メガヌクレアーゼモノマーを提供する。ダイマー形成に対する親和度は
、同じモノマー（すなわち、ホモダイマー形成）によって又は異なるモノマー（すなわち
、ヘテロダイマー形成）、例えば、参照野生型メガヌクレアーゼによって測定することが
可能である。これらの組み換えメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼダイマーにおける
モノマー間のタンパク質とタンパク質との境界面に存在するアミノ酸残基に対する修飾を
有する。これらの修飾は、ヘテロダイマー形成の促進及び非パリンドローム認識配列を持
つメガヌクレアーゼの創製に使用することが可能である。
したがって、他の実施態様では、本発明は、参照メガヌクレアーゼモノマーによるダイ
マー形成に対する親和度を変更させた組み換えメガヌクレアーゼを提供する。この実施態
様では、組み換えモノマーは、配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１
５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含むが、ダイマー形
成に対する親和度は、（Ａ）Ｄ若しくはＥによるＫ７、Ｋ５７若しくはＫ９６の置換、又
は（Ｂ）Ｋ若しくはＲによるＥ８若しくはＥ６１の置換から選ばれる置換に対応する少な
くとも一つの修飾によって変えられる。このような組み換えモノマーに基づき、本発明は
さらに、（１）配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対して少
なくとも８５％の配列類似性を有する第１ポリペプチドであって、ダイマー形成に対する
親和度が、（Ａ）Ｄ若しくはＥによるＫ７、Ｋ５７若しくはＫ９６の置換から選ばれる置
換に対応する少なくとも一つの修飾によって変えられる第１ポリペプチド、及び（２）配
列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対して少なくとも８５％の
配列類似性を有する第２ポリペプチドであって、ダイマー形成に対する親和度が、（Ｂ）
Ｋ若しくはＲによるＥ８若しくはＥ６１の置換から選ばれる置換に対応する少なくとも一
つの修飾によって変えられる第２ポリペプチドを含む組み換えメガヌクレアーゼ・ヘテロ
ダイマーを提供する。
他の実施態様では、本発明は、参照メガヌクレアーゼモノマーによるダイマー形成に対
する親和度を変更させた組み換えメガヌクレアーゼモノマーを提供する。この実施態様で
は、組み換えモノマーは、配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの残基６－１６０
に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含むが、ダイマー形成に
対する親和度は、（Ａ）Ｄ若しくはＥによるＲ３０２の置換、又は（Ｂ）Ｋ若しくはＲに
よるＤ２０、Ｅ１１若しくはＱ６４の置換から選ばれる置換に対応する少なくとも一つの
修飾によって変えられる。このような組み換えモノマーに基づき、本発明はさらに、（１
）配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの残基６－１６０に対して少なくとも８５
％の配列類似性を有する第１ポリペプチドであって、ダイマー形成に対する親和度が、（
Ａ）Ｄ若しくはＥによるＲ３０２の置換から選ばれる置換に対応する少なくとも一つの修
飾によって変えられる第１ポリペプチド、及び（２）配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌク
レアーゼの残基６－１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第２ポリペプ
チドであって、ダイマー形成に対する親和度が、（Ｂ）Ｋ若しくはＲによるＤ２０、Ｅ１
１若しくはＱ６４の置換から選ばれる置換に対応する少なくとも一つの修飾によって変え
られる第２ポリペプチドを含む組み換えメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーを提供する。
他の実施態様では、本発明は、参照メガヌクレアーゼモノマーによるダイマー形成に対
する親和度を変更させた組み換えメガヌクレアーゼモノマーを提供する。この実施態様で
は、組み換えモノマーは、配列番号１２のＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの残基５－２１
１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含むが、ダイマー形成
に対する親和度は、（Ａ）ＤまたはＥによるＲ９３の置換、又は（Ｂ）ＫまたはＲによる
Ｅ１５２の置換から選ばれる置換に対応する少なく共一つの修飾によって変えられる。こ
のような組み換えモノマーに基づき、本発明はさらに、（１）配列番号１２のＩ－ＣＥＵ
Ｉメガヌクレアーゼの残基５－２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第
１ポリペプチドであって、ダイマー形成に対する親和度が、（Ａ）ＤまたはＥによるＲ９
３の置換から選ばれる置換に対応する少なくとも一つの修飾によって変えられる第１ポリ
ペプチド、及び（２）配列番号１２のＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの残基５－２１１に
対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第２ポリペプチドであって、ダイマー形成
に対する親和度が、（Ｂ）ＫまたはＲによるＥ１５２の置換から選ばれる置換に対応する
少なくとも一つの修飾によって変えられる第２ポリペプチドを含む組み換えメガヌクレア
ーゼ・ヘテロダイマーを提供する。
ダイマー形成に対する親和度を変更させた、組み換えメガヌクレアーゼモノマー又はヘ
テロダイマーはさらに、前述の塩基接触残基の修飾の内の一つ、二つまたは三つ以上；前
述のバックボーン接触残基の修飾の内の一つ、二つまたは三つ以上、又は両者の組み合わ
せを含むことが可能である。したがって、例えば、モノマーの塩基接触部は、配列特異性
を変えるように修飾することが可能であり、モノマーのバックボーン接触部は、ＤＮＡ結
合親和度を変えるように修飾することが可能であり、タンパク質とタンパク質との境界面
は、ダイマー形成に影響を及ぼすように修飾することが可能である。このような組み換え
モノマーは、同様に修飾されたモノマーと組み合わせて、所望の配列特異性および活性を
有する合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーを生産することが可能である。
他の側面から考えると、本発明は、本発明において記載され可能とされた合理設計メガ
ヌクレアーゼのために使用される各種方法を提供する。これらの方法は、遺伝学的に修飾
された細胞および生物体を生産すること、病気を遺伝子治療によって治療すること、病原
体感染を治療すること及び診断学と研究用とのインビトロ応用のために組み換えメガヌク
レアーゼを使用することを含む。
したがって、この側面では、本発明は、染色体に挿入された興味の外因性配列を含む遺
伝学的に修飾された真核細胞を生産するための方法であって、これを、該細胞を、（Ｉ）
本発明のメガヌクレアーゼをコードする第１核酸配列、及び（ＩＩ）前記興味の配列を含
む第２核酸配列によってトランスフェクトすることによって実現する方法を提供する。そ
の際、メガヌクレアーゼは、染色体の中に切断部位を生産し、興味の配列は、相同組み換
え又は非相同的末端接合によって、染色体中の切断部位にに挿入される。
それとは別に、他の側面では、本発明は、染色体に挿入された興味の外来配列を含む遺
伝学的に修飾された真核細胞を生産するための方法であって、この細胞に本発明のメガヌ
クレアーゼタンパクを挿入すること及びこの細胞を興味の配列を含む核酸によってトラン
スフェクトすることによって実現する方法を提供する。その際、メガヌクレアーゼは、染
色体の中に切断部位を生産し、興味の配列は、相同組み換え又は非相同的末端接合によっ
て、切断部位において染色体の中に挿入される。
他の側面では、本発明は、染色体中の標的配列を破壊することによって遺伝学的に修飾
された真核細胞を生産するための方法であって、この細胞を本発明のメガヌクレアーゼタ
ンパクをコードする核酸によってトランスフェクトすることによって実現する方法を提供
する。その際、メガヌクレアーゼは、染色体の中に切断部位を生産し、標的配列は切断部
位における非相同的末端接合によって破壊される。
他の側面では、本発明は、遺伝学的に修飾された生物体を生産するための方法であって
、前述の方法に従って遺伝学的に修飾された真核細胞を生産し、かつ、この遺伝学的に修
飾された真核細胞を育成して遺伝学的に修飾された生物体を生産することによって実現す
る方法を提供する。これらの実施態様では、真核細胞は、配偶子、接合子、胚盤胞細胞、
胚幹細胞及びプロトプラスト細胞から選ぶことが可能である。
他の側面では、本発明は、真核生物において遺伝子治療によって疾患を治療するための
方法であって、この真核生物の少なくとも一つの細胞を、（Ｉ）本発明のメガヌクレアー
ゼをコードする第１核酸配列、及び（ＩＩ）興味の配列を含む第２核酸配列によってトラ
ンスフェクトすることによって実現する方法を提供する。その際、メガヌクレアーゼは、
染色体の中に切断部位を生産し、興味の配列は、相同組み換え又は非相同的末端接合によ
って染色体の中に挿入され、興味の配列の挿入は、疾患に対する遺伝子治療をもたらす。
それとは別に、他の側面では、本発明は、真核生物において遺伝子治療によって疾患を
治療するための方法であって、この真核生物の少なくとも一つの細胞の中に本発明のメガ
ヌクレアーゼを導入すること及びこの細胞を、興味の配列を含む核酸によってトランスフ
ェクトすることによって実現する方法を提供する。その際、メガヌクレアーゼは、染色体
の中に切断部位を生産し、興味の配列は、相同組み換え、または非相同的末端接合によっ
て切断部位において染色体の中に挿入され、興味の配列の挿入は、該疾患に対する遺伝子
治療をもたらす。
他の側面では、本発明は、真核生物において、該真核生物の染色体における標的配列を
破壊する遺伝子治療によって疾患を治療するための方法であって、この真核生物の少なく
とも一つの細胞を、本発明のメガヌクレアーゼをコードする核酸によってトランスフェク
トすることによって実現する方法を提供する。その際、メガヌクレアーゼは、染色体の中
に切断部位を生産し、標的配列は、相同組み換え又は非相同的末端接合によって破壊され
、該標的配列の破壊が、該疾患に対する遺伝子治療をもたらす。
別の局面では、本発明は、真核細胞宿主において、ウィルス性または前核細胞性病原体
感染を治療するための方法であって、この病原体のゲノムにおける標的配列を破壊するこ
とによって実現する方法を提供する。その際、メガヌクレアーゼは、染色体の中に切断部
位を生産し、標的配列は、（１）切断部位における非相同的末端接合によって、又は（２
）第２核酸との相同組み換えによって破壊され、かつ、標的配列の破壊は、この感染に対
する治療をもたらす。
さらに一般的に、他の側面では、本発明は、認識配列の少なくとも一つの塩基位置に対
する特異性を変更させた組み換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法であって、（
１）参照メガヌクレアーゼ－ＤＮＡ複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定すること
、（２）該塩基位置において塩基接触面を形成するアミノ酸残基を特定すること、（３）
接触面の少なくとも第１残基のβ－炭素と、該塩基位置における少なくとも第１塩基との
間の距離を決めること及び（４）（Ａ）第１塩基から６オングストローム未満の距離にあ
る第１残基については、Ｇ、Ｃ、Ｔ若しくはＡの内の適切なもののメンバーである基１及
び／又は基２の置換を選択すること；又は（Ｂ）前記第１塩基から６オングストロームよ
り遠い位置にある第１残基については、Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＡの内の適切なもののメンバーで
ある基２及び／又は基３の置換を選択することによって、所望の変化を促進するアミノ酸
置換を特定することによって実現する方法を提供する。なお、上述したそれぞれの基は、
後述するように定義する。この方法は、同じ塩基に対する別の接触残基ついても、同じ位
置における他の塩基に対する接触残基についても、さらに、別の位置についても繰り返し
てよい。
さらに、他の側面では、本発明は、ＤＮＡ－結合親和度を増大させた組み換えメガヌク
レアーゼを合理的に設計する方法であって、（１）基準メガヌクレアーゼ－ＤＮＡ複合体
の三次元構造の少なくとも一部を決定すること、（２）バックボーン接触面を形成するア
ミノ酸接触残基を特定すること、（３）（Ａ）陰性荷電若しくは疎水性側鎖を持つ接触残
基について、非荷電／極性若しくは陽性荷電側鎖を持つ置換を選択すること；又は（Ｂ）
非荷電／極性側鎖を持つ接触残基について、陽性荷電側鎖を持つ置換を選択することによ
って、ＤＮＡ－結合親和度を増大させるアミノ酸置換を特定すること、によって実現する
方法を提供する。逆に、本発明は、ＤＮＡ－結合親和度を減少させた組み換えメガヌクレ
アーゼを合理的に設計する方法であって、これを、（１）基準メガヌクレアーゼ－ＤＮＡ
複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定すること、（２）バックボーン接触面を形成
するアミノ酸接触残基を特定すること、（３）（Ａ）陽性荷電側鎖を持つ接触残基につい
て、非荷電／極性若しくは陰性荷電側鎖を持つ置換を選択すること、又は（Ｂ）疎水性及
び非荷電／極性側鎖を持つ接触残基について、陰性荷電側鎖を持つ置換を選択することに
よって、ＤＮＡ－結合親和度を減少させるアミノ酸置換を特定することよって実現する方
法を提供する。
本発明の、上記、およびその他の側面および実施態様は、本発明の下記の詳細な説明に
基づき当業者には明白であろう。
１．１序論
本発明は、一部は、メガヌクレアーゼが２本鎖ＤＮＡ認識配列とコンタクトする際、Ｄ
ＮＡ塩基と特異的接触を形成し、かつ、ＤＮＡバックボーンと非特異的接触を形成し、そ
うすることによって、該酵素の認識配列特異性およびＤＮＡ－結合親和度に影響を及ぼす
、メガヌクレアーゼＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーにおける特異的アミノ酸残基の特定お
よび特徴解明に基づく。この発見は、以下に詳細に説明するように、メガヌクレアーゼの
特異性及び／又は親和性を変えることが可能な、メガヌクレアーゼにおけるアミノ酸置換
を特定するため及び天然のメガヌクレアーゼが認識しない所望のＤＮＡ配列を認識するこ
とが可能であり、及び／又は、天然のメガヌクレアーゼに比べて特異性及び／又は親和度
が増大または減少させたメガヌクレアーゼを合理的に設計し、開発するために用いられた
。さらに、ＤＮＡ－結合親和度は、酵素活性の外に、配列特異性にも影響を及ぼすので、
本発明は、天然メガヌクレアーゼに比べ活性を変更させた、合理的設計メガヌクレアーゼ
を提供する。さらに、本発明は、ダイマーを形成するためにコンタクトされたモノマー間
のインターフェイスにおける残基が、ヘテロダイマー形成を促進するように修飾された合
理設計メガヌクレアーゼを提供する。最後に、本発明は、組み換え細胞および生物体の生
産における使用ばかりでなく、本出願に開示されるように、遺伝子療法、抗病原体、抗癌
及びインビトロ応用における合理設計メガヌクレアーゼの使用を提供する。
一般的出来事として、本発明は、（１）２本鎖ＤＮＡ認識配列中の個々の塩基に対する
配列特異的結合、又は（２）２本鎖ＤＮＡ分子のフォスフォジエステルバックボーンに対
する非特異的結合による、メガヌクレアーゼ内の複数部位において変更アミノ酸残基を含
む、合理設計ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを生成するための方法を提供する。し
かしながら、酵素活性は、ＤＮＡ－結合親和度と相関するのであるから、ＤＮＡ認識配列
に対する結合に与るアミノ酸を変えることは、２本鎖ＤＮＡに対する全体的結合親和度を
増大又は減少することになり、特異的塩基対相互作用を介するメガヌクレアーゼの特異性
ばかりでなく、メガヌクレアーゼの活性も変える可能性がある。同様に、ＤＮＡバックボ
ーンに対する結合によるアミノ酸を変えることは、２本鎖ＤＮＡに対する全体的結合親和
度を増大又は減少することによって、酵素の活性ばかりでなく、認識配列に対する結合の
特異性又は縮重の程度を変える可能性がある。
下記に詳述するように、メガヌクレアーゼの合理的設計法は、ＤＮＡ認識／結合による
アミノ酸を特定すること及び適切なアミノ酸変化を選択するために一連の規則を適用する
ことを含む。この規則は、メガヌクレアーゼの配列特異性に関して、メガヌクレアーゼの
アミノ酸側鎖とＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖における塩基の間とのメガヌクレア
ーゼ－ＤＮＡ複合体距離に関する互いの立体位置、アミノ酸側鎖とＤＮＡ塩基との相対位
置及び非共有的化学的相互作用を考慮に含んでいる。
最後に、ホモダイマーとしてＤＮＡに結合する天然メガヌクレアーゼの大部分は、擬似
、又は完全パリンドロームの認識配列を認識する。長々としたパリンドロームはめったに
ないと予想されるので、ゲノムの興味の配列部位でパリンドロームに遭遇する確率はきわ
めて低い。したがって、これらの酵素を、ゲノムの興味の配列部位を認識するように再設
計しなければならないとすると、異なる半分部位を認識する二つの酵素モノマーにおいて
、ヘテロダイマー形成されると非パリンドローム的ハイブリッド認識配列を切断すること
が可能な二つの酵素モノマーを設計することが必要である。それゆえ、ある側面では、本
発明は、少なくとも一つのアミノ酸位置で異なる二つのモノマーをダイマー化して、ヘテ
ロダイマーを形成して得られる合理設計メガヌクレアーゼを提供する。ある場合、両モノ
マーは、非パリンドローム的認識配列を認識するヘテロダイマーを形成するように合理的
設計される。二つの異なるモノマーから成る混合物は、最大三つの活性形メガヌクレアー
ゼダイマー、二つのホモダイマー及びヘテロダイマーをもたらす。それに加えて、または
それとは別に、ある場合、ホモダイマーまたはヘテロダイマー形成の確率を増すか、また
は減らすために、モノマー同士が相互作用を持ってダイマーを形成する境界面においてア
ミノ酸残基が変えられる。
したがって、一つの側面では、本発明は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼにおい
て、酵素の特異性及び／又は活性を変えるアミノ酸変化を含むＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌ
クレアーゼの合理的設計法を提供する。他の側面では、本発明は、これらの方法によって
もたらされる合理設計メガヌクレアーゼを提供する。他の側面では、本発明は、生物体ゲ
ノム内部の所望のＤＮＡ配列または遺伝子座が、ＤＮＡ配列の挿入、欠失、置換、または
その他の操作によって修飾される、組み換え核酸および生物体を生産するために、このよ
うな合理設計メガヌクレアーゼを使用する方法を提供する。さ他の側面では、本発明は、
病原体または癌細胞において、病原体特異的又は癌特異的認識配列を有する合理設計メガ
ヌクレアーゼを用いて、この病原体または癌細胞の生存率を下げるための方法を提供する
。
１．２ 参照および定義
本出願において参照される特許および科学文献は、当業者にとって利用可能な知識を確
定する。本出願において引用される、公刊された米国特許、承認済みの出願、出版された
外国特許、および、ＧＥＮＢＡＮＫのデータベース配列を含む参照資料は、参照により、
あたかも、それぞれが、特異的、個別的に、参照によって含まれるのと同程度に、本出願
に含まれる。
本出願で用いる「メガヌクレアーゼ」という用語は、１２塩基対よりも大きい認識配列
で２本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。天然のメガヌクレアーゼはモノマ
ー（例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ）又はダイマー（例えば、Ｉ－ＣｒｅＩ）であることが可能で
ある。本出願で用いるメガヌクレアーゼという用語は、モノマー・メガヌクレアーゼ、ダ
イマー・メガヌクレアーゼ、または、コンタクトしてダイマー形メガヌクレアーゼを形成
するモノマーを指す。「ホーミング・エンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレ
アーゼ」という用語と同義である。
本出願で用いる「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」という用語は、天然ではダイ
マー形である単一のＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むメガヌクレアーゼ、又は天然では
モノマー形である二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むメガヌクレアーゼを指す。本
出願で用いる「モノＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」という用語は、単一のＬＡＧ
ＬＩＤＡＤＧモチーフを含むメガヌクレアーゼを指し、本出願で用いる「ジＬＡＧＬＩＤ
ＡＤＧメガヌクレアーゼ」という用語は、二つを区別することが必要な場合には、二つの
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むメガヌクレアーゼを指す。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチー
フを含むジＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの二つの構造ドメインは、それぞれ、Ｌ
ＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと呼ぶことが可能である。
本出願で用いる「合理的に設計された」という用語は、非天然及び／又は遺伝子工学的
に加工されたことを意味する。本発明の合理的設計メガヌクレアーゼは、野生型又は天然
のメガヌクレアーゼとアミノ酸配列または一次構造において異なり、さらに、二次、三次
又は四次構造において異なる場合がある。加えて、本発明の合理設計メガヌクレアーゼは
、認識配列の特異性及び／又は活性においても、野生型又は天然メガヌクレアーゼと異な
る。
タンパク質に関して本出願で用いる「組み換え」という用語は、タンパク質をコードす
る核酸に対し遺伝子工学技術を適用した結果アミノ酸配列が変化すること、及びこのタン
パク質を発現する細胞又は生物体が得られることを意味する。核酸に関して「組み換え」
という用語は、遺伝子工学技術を適用した結果、核酸配列が変化することを意味する。遺
伝子工学技術としては、これらにっ限定されるものではないが、ＰＣＲ、トランスフェク
ション、形質転換及びその他の遺伝子転移技術等のＤＮＡクローニング技術、相同組み換
え、部位特異的変異処理及び遺伝子融合が含まれる。この定義によれば、天然のタンパク
と同じアミノ酸配列を持つが、異種宿主におけるクローニング及び発現によって生産され
るタンパク質は、「組み換え」とは見なされない。
組み換えタンパクに関して本出願で用いられる「修飾」という用語は、基準配列（例え
ば、野生型）と比べた場合の、組み換え配列におけるアミノ酸残基の、どのようなもので
あれ、挿入、欠失又は置換を含む意味である。
本出願で用いる「遺伝学的に修飾された」という用語は、そのゲノムＤＮＡ配列が、組
み換え技術によって意図的に修飾されたゲノムＤＮＡ配列を有する細胞、生物体又は祖先
を指す。本出願で用いる「遺伝学的に修飾された」という用語は、「トランスジェニック
」という用語を含む。
本出願で用いる「野生型」という用語は、どのようなものであれ、、メガヌクレアーゼ
の全ての天然形を指す。「野生型」という用語は、天然における酵素の最も一般的な変異
を意味するものではなく、自然で見られるいかなる変異も意味する。野生型メガヌクレア
ーゼは、組み換え又は非天然メガヌクレアーゼと区別される。
本出願で用いる「認識配列半分部位」又は単に「半分部位」は、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡ
ＤＧメガヌクレアーゼのモノマー又はジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの一つの
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットによって認識される２本鎖ＤＮＡ分子間の核酸配列を意
味する。
本出願で用いる「認識配列」という用語は、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアー
ゼダイマー又はジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼモノマーによって結合され、切
断される一対の半分部位を指す。この二つの半分部位は、この酵素によって特異的に認識
されない塩基対によって隔てられてもよいし、隔てられなくともよい。Ｉ－ＣＲＥＩ、Ｉ
－ＭＳＯＩ及びＩ－ＣＥＵＩの場合、各モノマーの認識配列半分部位は９塩基対の幅を持
ち、この二つの半分部位は、特異的には認識されないが実際の切断部位である塩基対（４
塩基対のオーバーハングを有する）によって分割されている。したがって、Ｉ－ＣＲＥＩ
、Ｉ－ＭＳＯＩ及びＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼダイマーの結合認識配列は、通常、４
塩基対切断部位に側接する二つの９塩基対を含む２２塩基対の幅を持つ。各半分部位の塩
基対は－９から－１と表示され、－９位は切断部位からもっとも遠位であり、－１位はＮ
１－Ｎ４と表示される４個の中央塩基対に隣接する。－９から－１へと向かう方向（すな
わち、切断部位に向かう方向）において５′から３′に方向づけられる各半分部位鎖は、
「センス」鎖と表示され、反対鎖は、「アンチセンス鎖」と表示される。ただし、いずれ
の鎖もタンパクをコードしない。したがって、図１（Ａ）に示すように、一方の半分部位
の「センス」鎖は、他方の半分部位のアンチセンス鎖である。ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメ
ガヌクレアーゼモノマーであるＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼの場合、認識配列は約１８
ＢＰの非パリンドローム配列であり、特異的には認識されない中央塩基対は無い。通例に
従って、２本鎖の一方は「センス」鎖と呼ばれ、他方は「アンチセンス」鎖と呼ばれるが
、いずれの鎖もタンパクをコードしない。
本出願で用いる「特異性」という用語は、メガヌクレアーゼが認識配列と呼ばれる特定
の塩基対配列又は特定の一組の認識配列においてのみ、２本鎖ＤＮＡ分子を認識し切断す
る能力を意味する。この一組の認識配列は、いくつかの保存位置または配列モチーフを共
有するが、これらは１又は２以上の位置で縮重する場合がある。高い特異性を有するメガ
ヌクレアーゼは、たった一つ又はきわめて少数の認識配列の切断が可能である。特異性は
実施例１に記載される切断アッセイで決めることが可能である。本出願で用いる場合、メ
ガヌクレアーゼは、基準メガヌクレアーゼ（例えば、野生型）によって結合及び切断され
ない認識配列に結合し、切断する場合、又は、認識配列の切断速度が、基準メガヌクレア
ーゼに比べて、統計的に有意な値（Ｐ<０．０５）だけ上昇又は降下した場合に、特異性
が「変更された」ことになる。
本出願で用いる「縮重」という用語は、「特異性」の反対を意味する。高縮重したメガ
ヌクレアーゼは、非常に多岐にわたる認識配列を切断することができる。メガヌクレアー
ゼは単一の、複数の又は全てのの箇所の半分部位内に配列縮重を有することができる。こ
のような配列縮重は、（Ｉ）メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインにおける任意のアミ
ノ酸が、認識配列内の１又は２以上の位置で任意の塩基と接触できないこと、（ＩＩ）メ
ガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインにおける１又は２以上のアミノ酸が、識配列内の１
又は２以上の位置で１以上の塩基と特異的にコンタクトできること、及び／又は（ＩＩＩ
）活性に十分なほど、非特異的ＤＮＡ結合親和性を持つこと、からもたらされる可能性が
ある。「完全な」縮重位置は任意の４塩基で占められてもよく、半分部位内では”Ｎ”で
表示することができる。「部分的な」縮重位置は、４塩基の内の任意の２又は３塩基で占
められてもよい。（例えば、プリン（ＰＵ）か、ピリミジン（ＰＹ）で占められるが、Ｇ
には占められない）。
メガヌクレアーゼに関して本出願で使用される場合、「ＤＮＡ－結合親和度」又は「結
合親和度」は、メガヌクレアーゼが基準ＤＮＡ分子（例えば、認識配列又は任意の配列）
と非共有的に結合する傾向を意味する。結合親和度は、解離定数ＫＤによって測定される
（例えば、ＷＴ認識配列に対するＩ－ＣＲＥＩのＫＤは約０．１ＮＭである）。本出願で
用いる場合、基準認識配列に対する組み換えメガヌクレアーゼのＫＤが、基準メガヌクレ
アーゼに比べて、統計的に有意な値（Ｐ<０．０５）だけ増加又は減少した場合に、結合
親和度を「変更させた」ことになる。
メガヌクレアーゼモノマーに関して本出願で用いる場合、「ダイマー形成に対する親和
度」という用語は、メガヌクレアーゼモノマーが、基準メガヌクレアーゼモノマーと非共
有的に結合する傾向を意味する。ダイマー形成に対する親和度は、例えば、基準野生型メ
ガヌクレアーゼのような同じモノマー（すなわち、ホモダイマー形成）又は異なるモノマ
ー（すなわち、ヘテロダイマー形成）で測定することができる。結合親和度は、解離定数
ＫＤによって測定される。本出願で用いる場合、基準認識配列に対する組み換えメガヌク
レアーゼのＫＤが、基準メガヌクレアーゼに比べて、統計的に有意な値（Ｐ＜０．０５）
だけ増加又は減少した場合に、結合親和度を「変更させた」ことになる。
本出願で用いる「パリンドローム的」という用語は、同じ半分部位の逆方向反復を含む
認識配列を指す。しかしながら、この場合、パリンドローム配列は酵素にコンタクトされ
ない四つの中央塩基対に関してパリンドローム的である必要はない。ダイマー形メガヌク
レアーゼの場合、パリンドロームＤＮＡ配列は二つのモノマーが同じ半分部位にコンタク
トするホモダイマーによって認識される。
本出願で用いる「擬似パリンドローム的」という用語は、非同一又は不完全なパリンド
ローム的半分部位の逆方向反復を含む認識配列を指す。この場合、擬似パリンドローム配
列は、四つの中央塩基対に関してパリンドローム的である必要はなく、二つの半分部位の
間のパリンドローム配列からもはずれることが可能である。擬似パリンドロームＤＮＡ配
列は、二つの同一の酵素モノマーが、異なる半分部位にコンタクトする、野生型ホモダイ
マー形メガヌクレアーゼによって認識される天然ＤＮＡ部位において典型的に見られる。
本出願で用いる「非パリンドローム的」という用語は、メガヌクレアーゼの、二つの、
無関係の半分部位から構成される認識配列を指す。この場合、非パリンドローム配列は、
四つの中央塩基対に対しても、二つのモノマー半分部位に対しても、パリンドローム的で
ある必要はない。非パリンドロームＤＮＡ配列は、ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレア
ーゼ、高縮重モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（例えば、Ｉ－ＣｅｕＩ）、非
同一半分配列を認識するモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼのヘテロダイマーの
いずれかによって認識される。
本出願で用いる「活性」という用語は、本発明のメガヌクレアーゼが、特定の認識配列
を切断する速度を指す。このような活性は、２本鎖ＤＮＡのフォスフォジエステル結合の
加水分解に関する測定可能な酵素反応である。ある特定のＤＮＡ基質に作用するメガヌク
レアーゼの活性は、その特定のＤＮＡ基質に対するメガヌクレアーゼの親和力又は結合力
に影響され、ＤＮＡとの配列特異的相互作用及び非配列特異的相互作用によって影響され
る。
本出願で用いる「相同組み換え」という用語は、２本鎖ＤＮＡ切断が、修復鋳型として
相同ＤＮＡ配列を用いて修復される、天然の、細胞プロセスを指す（例えば、ＣＡＨＩＬ
Ｌ ＥＴ ＡＬ．（２００６），ＦＯＮＴ．ＢＩＯＳＣＩ．１１：１９５８－１９７６を
参照）。相同のＤＮＡ配列は、内因性の染色体配列であってもよいし、細胞に輸送された
外来性の核酸であってもよい。したがって、ある実施態様では、合理設計メガヌクレアー
ゼは、標的配列内の認識配列を切断するために使用され、標的配列に対して相同な又はほ
ぼ同様の配列類似性を持つ外来性の核酸が細胞に輸送されて、相同性組み換えによる修復
のための鋳型として使用される。したがって、標的配列とは著明に異なっていてもよい外
来性のＤＮＡ配列が、染色体配列に組み込まれる。相同組み換えプロセスは、主に真核生
物において起こる。本出願では、「相同性」という用語は「配列類似性」と等価的に用い
られ、出自又は系統関係による同一性を要求することを意図するものではない。
本出願で用いる「非相同的末端接合」という用語は、２本鎖ＤＮＡ切断が、２本の非相
同的ＤＮＡセグメントの直接的接合によって修復される、天然の細胞プロセスを指す（例
えば、ＣＡＨＩＬＬ ＥＴ ＡＬ．．（２００６），ＦＲＯＮＴ．ＢＩＯＳＣＩ．１１：
１９５８－１９７６）。非相同的末端接合によるＤＮＡ修復は、間違いを起こしやすく、
修復部位において鋳型と対応しないＤＮＡ配列の付加又は除去をもたらすことが多い。し
たがって、ある実施態様では、（例えば、塩基挿入、塩基欠失又はフレームシフト突然変
異を行うことによって）非相同的末端接合によって遺伝子を破壊し、標的配列内のメガヌ
クレアーゼ認識配列中に二本鎖切断点を作るために、合理設計メガヌクレアーゼを用いる
ことも可能である。他の実施態様では、標的配列に対する相同性を欠如するか又は標的配
列に対する実質的配列類似性を欠如する外来性の核酸が、非相同的末端接合によって、メ
ガヌクレアーゼ刺激２本鎖ＤＮＡ切断部位で取り込まれてもよい（例えば、ＳＡＬＯＭＯ
Ｎ，ＥＴ ＡＬ．（１９９８），ＥＭＢＯ Ｊ．１７：６０８６－６０９５を参照）。非
相同的末端接合プロセスは、真核生物でも、細菌のような原核生物でも起こる。
本出願で用いる「興味の配列」という用語は、メガヌクレアーゼタンパクを用いてゲノ
ムへ挿入するか又はゲノムＤＮＡ配列を置換するのに使用することが可能な核酸配列であ
って、タンパク、ＲＮＡ又は調整エレメント（例えば、エンハンサー、サイレンサー、ま
たはプロモーター配列）のどれをコードするかにはよらない任意の核酸配列を意味する。
興味の配列は、興味の配列から発現されるタンパク質又はＲＮＡの標識化を可能とする非
相同的なＤＮＡ配列を有することも可能である。例えば、以下のものに限定さるものでは
ないが、タンパク質は、エピトープ（例えば、Ｃ－ＭＹＣ、ＦＬＡＧ）、または他のリガ
ンド（例えば、ポリ－ＨＩＳ）を含むタグによって標識することが可能である。更に、興
味の配列は、従来技術で周知の技術に従って融合タンパクをコードしてもよい（例えば、
ＡＵＳＵＢＥＬ ＥＴ ＡＬ．， 「分子生物学における最近のプロトコール（“ＣＵＲ
ＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，”）」、
ＷＩＬＥＹ １９９９）。ある実施態様では、隣接配列は、組み換えメガヌクレアーゼに
よって切断され、ゲノム組み替え配列の中に興味の配列の適切な挿入される。
したがって、この側接配列は切断され、該組み換えメガヌクレアーゼによって切断され
るゲノム認識配列の中に、興味の配列を適正に挿入することを可能となる。ある実施態様
では、興味の配列の全ては、ゲノム中の標的配列と相同であるか又は標的配列と実質的に
配列類似性を有しており、相同組み換えによって、標的配列が興味の配列によって効果的
に置換される。他の実施態様では、興味の配列は、標的配列と相同性を有するか又は実質
的配列類似性を有するＤＮＡ配列によって側接され、相同組み換えによってゲノム内の標
的配列座位において興味の配列が挿入される。ある実施態様では、興味の配列は、メガヌ
クレアーゼ認識配列における突然変異又は他の修飾を除いては、標的配列とほぼ同一であ
り、そのため、メガヌクレアーゼは、標的配列が興味の配列によって修飾された後に、標
的配列を切断することができない。
アミノ酸配列及び核酸配列に関して本出願で用いる場合、「類似性パーセント」及び「
配列類似性」という用語は、アライメントされたアミノ酸残基又はヌクレオチド間の類似
性を最大にするようにアライメントされた配列に基づく２つの配列の類似度の測定値を意
味する。そしてこれは、アライメント配列中のギャップ及びギャップの数、核酸又は残基
の総数、同一又は類似する核酸又は残基の数の関数による。一般的なパラメータを用いて
配列類似性を決めるために、様々のアルゴリスムおよびコンピュータプログラムの利用が
可能である。本出願では、配列類似度は、アミノ酸配列の場合はＢＬＡＳＴＰプログラム
を用い、核酸配列の場合はＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて算出される。両方とも、ＮＡ
ＴＩＯＮＡＬ ＣＥＮＴＥＲ ＦＯＲ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＩＮＦＯＲＭＡＴ
ＩＯＮ（ＷＷＷ．ＮＣＢＩ．ＮＬＭ．ＮＩＨ．ＧＯＶ／）を通じて使用可能であり、例え
ば、ＡＬＴＳＣＨＵＬ ＥＴ ＡＬ．（１９９０）， Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２１５：
４０３－４１０；ＧＩＳＨ ＡＮＤ ＳＴＡＴＥＳ（１９９３）， ＮＡＴＵＲＥ ＧＥ
ＮＥＴ．３：２６６－２７２；ＭＡＤＤＥＮ ＥＴ ＡＬ．（１９９６），ＭＥＴＨ．Ｅ
ＮＺＹＭＯＬ．２６６：１３１－１４１；ＡＬＴＳＣＨＵＬ ＥＴ ＡＬ．（１９９７）
，ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２５：３３８９－３４０２）；ＺＨＡＮＧ Ｅ
Ｔ ＡＬ．（２０００） Ｊ．ＣＯＭＰＵＴ．ＢＩＯＬ．７（１－２）：２０３－１４に
記載される。本出願では、二つのアミノ酸配列の類似パーセントは、ＢＬＡＳＴＰアルゴ
リスムにおける下記のパラメータに基づくスコアである。単語サイズ＝３；ギャップ開放
ペナルティー＝－１１；ギャップ延長ペナルティー＝－１；及びスコアリングマトリック
ス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。本出願では、二つの核酸配列の類似パーセントは、ＢＬＡ
ＳＴＮアルゴリスムにおける下記のパラメータに基づくスコアである。単語サイズ＝１１
；ギャップ開放ペナルティー＝－５；ギャップ延長ペナルティー=－２；マッチ評価＝１
；及びミスマッチペナルティー＝－３である。
二つのタンパク質又はアミノ酸配列の修飾に関して本出願で用いる場合、「対応する」
という用語は、（例えば、ＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて）二つのタンパク質を一般的
な方法で配列アライメントしたとき、第１のタンパク質の修飾が、第２のタンパク質の修
飾と同じアミノ酸残基の置換であること、及び第１のタンパク質における修飾のアミノ酸
位置が、第２のタンパク質の修飾のアミノ酸位置に対応する又は揃うことを意味する。し
たがって、もし残基ＸとＹとが配列アライメントで互いに対応するものでれば、ＸとＹの
配列番号が異なるものであっても、第１のタンパク質における残基“Ａ”がアミノ酸“Ａ
”に修飾されることは、残基“Ｙ”がアミノ酸“Ａ”に修飾されることと対応する。
本出願では、ある変数に対する数値範囲は、その範囲内であれば、任意の数値に等しい
変数を用いて本発明が実行可能であることを意図する。したがって、本来的に不連続な変
数である場合、この変数は、その数値範囲の両端を含む任意の整数に等しくなることが可
能である。同様に、本来的に連続的な変数である場合、この変数は、その数値範囲の両端
を含む任意の実数に等しくなることが可能である。例えば、ただしこれらに限定されるも
のではないが、０と２の間の値を持つと記載される変数は、もしこの変数が本来的に不連
続である場合は、０、１又は２を取ることが可能であり、もしこの変数が本来的に連続的
である場合は、数値０．０、０．１、０．０１、０．００１又は≧０及び≦２の実数の任
意の実数を取ることができる。
本出願では、特に別段の指定が無い限り、「又は」という単語は、「及び／又は」とい
う包括的意味で使われ、「又は／どちらか」という排除的意味では使われない。
２．１ 配列特異性を変更させた合理的設計メガヌクレアーゼ
本発明の一様態では、組み換えＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメガヌクレアーゼを合
理的に設計する方法が提供される。この様態では、先ず、半分部位の各位置における塩基
指向性を変えることが可能なアミノ酸置換を予測することによって、組み換えメガヌクレ
アーゼを合理的に設計する。これらの置換は、個別に又は組み合わせて、実験的にその有
効性が検証され、所望の切断特異性を持つメガヌクレアーゼを生産する。
本発明によれば、塩基指向性において所望の変化をもたらすアミノ酸置換は、メガヌク
レアーゼのＤＮＡ認識配列及びＤＮＡフォスフォジエステルバックボーンの核酸塩基との
接触に参加が可能な基準メガヌクレアーゼ（例えば、野生型メガヌクレアーゼ又は非天然
の基準メガヌクレアーゼ）のアミノ酸側鎖及びそれら接触部の空間的、化学的性質を決め
ることによって予測される。これらのアミノ酸としては、基準ＤＮＡ半分部位との接触に
与る側鎖が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。一般に、この決定には、メガヌ
クレアーゼと、その２本鎖ＤＮＡ認識配列との間の複合体の構造に関する知識、又はきわ
めて類似性の高い複合体の構造（例えば、同じメガヌクレアーゼと、別のＤＮＡ認識配列
との間の複合体構造、又はメガヌクレアーゼの対立遺伝子変種または系統的変種と、その
ＤＮＡ認識配列との間の複合体構造）に関する知識が必要である。
原子座標データとして記載される、ポリペプチド又は２個以上のポリペプチドから成る
複合体の三次元構造は、いくつかの方法で獲得することが可能である。例えば、タンパク
質の構造の決定は、以下のものに限定されるものではないが、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ及び質
量分析を含む技術を用いて実行することが可能である。もう一つの方法は、興味のメガヌ
クレアーゼ又は関連ヌクレアーゼの、既存の構造座標のデータベースを分析することであ
る。このような構造データは、多くの場合、三次元座標形式のデータベースから入手する
ことが可能である。多くの場合、このデータは、オンラインデータベースを通じて（例え
ば、ＷＷＷ．ＲＣＳＢ．ＯＲＧ／ＰＤＢにおいてＲＣＳＢ ＰＲＯＴＥＩＮ ＤＡＴＡ
ＢＡＮＫへ）アクセスすることが可能である。
構造情報は、タンパク質またはタンパク質複合体の、規則的な、二次元又は三次元アレ
イ（例えば、結晶）によって得られる。例えば、Ｘ線又は電子の回折パターンを分析する
ことによって実験的に得ることが可能である。回折データを空間における三次元原子座標
に変換するためには、コンピュータ法が使用される。例えば、Ｘ線結晶学の分野は、メガ
ヌクレアーゼを含めた、多くのタンパク質－ＤＮＡ複合体の三次元構造情報の生成のため
に使用されている（例えば、ＣＨＥＶＡＬＩＥＲ ＥＴ ＡＬ．（２００１），ＮＵＣＬ
ＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２９（１８）：３７５７－３７７４を参照）。
溶液中の分子の原子間距離の決定には、核磁気共鳴（ＮＭＲ）も用いられている。コン
ピュータ法と組み合わせた多次元ＮＭＲ法は、増大するサイズのポリペプチドの原子座標
の決定に成功した（例えば、ＴＺＡＫＯＳ ＥＴ ＡＬ．（２００６），ＡＮＮＵ．ＲＥ
Ｖ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＢＩＯＭＯＬ．ＳＴＲＵＣＴ．３５：１２－４２を参照）。
それとは別に、タンパク質／ＤＮＡの既知の一次構造及び利用可能であれば、二次、三
次、及び／又は四次構造のほか、アミノ酸側鎖、核酸塩基及び結合性相互作用に関する既
知の物理化学的性質に基づいたアルゴリスムを適用することによって、コンピュータモデ
ルを使用することも可能である。このような方法は、任意に、繰り返し法又は実験的に誘
導された制限を含むことも可能である。このようなコンピュータソフトウェアの一例とし
て、ＡＤＡＭＳ ＥＴ ＡＬ．（１９９９），ＡＣＴＡ ＣＲＹＳＴＡＬＬＯＧＲ．Ｄ．
ＢＩＯＬ．ＣＲＹＳＴＡＬＬＯＧＲ．５５（ＰＴ １）：１８１－９０によって記載され
るＣＮＳプログラムがある。他にも、タンパク質の構造におけるアミノ酸の空間配置及び
タンパクのアミノ酸側鎖と各種標的分子との相互作用を予測する、様々のコンピュータプ
ログラムが開発されている（例えば、米国特許第６，９８８，０４１号を参照）。
したがって、本発明のある実施態様では、ＤＮＡ核酸塩基と特異的に相互作用を持ち、
及び／又は、非特異的フォスフォジエステルバックボーン相互作用を促進する、特異的ア
ミノ酸残基を特定するために、コンピュータモデルが使用される。例えば、可能なメガヌ
クレアーゼ－ＤＮＡ相互作用の全体に関するコンピュータモデルを、例えば、以下に限定
されるものではないが、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（登録商標）２．０（ＡＶＡＴＡＲ ＳＯＦ
ＴＷＡＲＥ ＡＢ，ＳＴＯＣＫＨＯＬＭ，ＳＷＥＤＥＮ）、グラフィックディスプレイＯ
（ＪＯＮＥＳ ＥＴ ＡＬ．（１９９１），ＡＣＴＡ ＣＲＹＳＴＡＬＬＯＧＲＡＰＨＹ
，Ａ４７：１１０）、グラフィックディスプレイ・プログラムＧＲＡＳＰ（登録商標）（
ＮＩＣＨＯＬＬＳ ＥＴ ＡＬ．（１９９１），ＰＲＯＴＥＩＮＳ，ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ
，ＦＵＮＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣＳ １１（４）：２８１ＦＦ）、グラフィ
ックディスプレイ・プログラムＩＮＳＩＧＴ（登録商標）（ＴＳＩ，ＩＮＣ．，ＳＨＯＲ
ＥＶＩＥＷ、ミネソタ州）を含む、適切なソフトウェアプログラムを用いて生産すること
が可能である。タンパク質－ＤＮＡ複合体の、三次元構造描画を生産し、視認し、かつ操
作するために好適なコンピュータハードウェアは市販されており、従来技術で周知である
（例えば、ＳＩＬＩＣＯＮ ＧＲＡＰＨＩＣＳ ＷＯＲＫＳＴＡＴＩＯＮ，ＳＩＬＩＣＯ
Ｎ ＧＲＡＰＨＩＣＳ，ＩＮＣ．，ＭＯＵＮＴＡＩＮＶＩＥＷ、カリフォルニア州）。
具体的に述べると、メガヌクレアーゼと、その２本鎖ＤＮＡ認識配列との間の相互作用
は、従来技術で既知の方法を用いて分解することが可能である。例えば、そのために結晶
が生産される、複数成分の複合体構造の三次元構造の描画、またはモデルは、分子置換、
またはＳＩＲ／ＭＩＲ（ＳＩＮＧＬＥ／ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＩＳＯＭＯＲＰＨＯＵＳ Ｒ
ＥＰＬＡＣＥＭＥＮＴ）（例えば、ＢＲＵＮＧＥＲ（１９９７），ＭＥＴＨ．ＥＮＺＹＭ
．２７６：５５８－５８０；ＮＡＶＡＺＡ ＡＮＤ ＳＡＬＵＤＩＪＩＡＮ（１９９７）
，ＭＡＴＨ．ＥＮＺＹＭ．２７６：５８１－５９４；ＴＯＮＧ ＡＮＤ ＲＯＳＳＭＡＮ
Ｎ（１９９７），ＭＥＴＨ．ＥＮＺＹＭ．２７６：５９４－６１１；およびＢＥＮＴＬＥ
Ｙ（１９９７），ＭＥＴＨ．ＥＮＺＹＭ．２７６：６１１－６１９を参照）を含む技術を
用いて決めることが可能であり、例えば、ＡＭＯＲＥ／ＭＯＳＦＬＭ（ＮＡＶＡＺＡ（１
９９４），ＡＣＴＡ ＣＲＹＳＴ．Ａ５０：１５７－１６３；ＣＣＰ４（１９９４），Ａ
ＣＴＡ ＣＲＹＳＴ．Ｄ５０：７６０－７６３）、または、ＸＰＬＯＲ（ＢＲＵＥＮＧＥ
Ｒ ＥＴ ＡＬ．（１９９２），Ｘ－ＰＬＯＲ ＶＥＲＳＩＯＮ ３．１．Ａ．ＳＹＳＴ
ＥＭ ＦＯＲ Ｘ－ＲＡＹ ＣＲＹＳＴＡＬＬＯＧＲＡＰＨＹ ＡＮＤ ＮＭＲ，ＹＡＬ
Ｅ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ，ＮＥＷ ＨＡＶＥＮ、コネチカット州）などの
ソフトウェアを用いて実行することが可能である。
タンパク質の構造及び可能なメガヌクレアーゼ－ＤＮＡ相互作用の決定は、酵素活性お
よび特異性に影響を及ぼすために変えることが可能なアミノ酸に関する合理的選択を可能
にする。決定は、アミノ酸側鎖の、特定の塩基又はＤＮＡフォスフォジエステルバックボ
ーンとの相互作用に関するいくつかの因子に基づく。適切なアミノ酸置換を決めるために
使用される化学的相互作用としては、以下に限定されるものではないが、ファンデルワー
ルス力、立体障害、イオン結合、水素結合及び疎水性相互作用が挙げられる。メガヌクレ
アーゼと、可能な認識配列半分部位中のある特定の塩基との特定の相互作用を優先するか
、又は忌避するアミノ酸置換が選択される。この選択は、その認識配列に対する特異性を
、かつ、ある程度は、全体的結合親和度および活性を増すようにあるいは減らすように行
われる。さらに、全体活性の増加又は減少のために、かつ、ある程度は、特異性を下げる
か又は上げるかするために、２本鎖ＤＮＡのフォスフォジエステルバックボーンに対する
結合性を増すか又は下げるアミノ酸置換を選択することが可能である。
したがって、特定の実施態様では、メガヌクレアーゼ－ＤＮＡ複合体の三次元構造が決
定され、ＤＮＡ認識配列半分部位における各塩基対について「接触面」が定義される。あ
る実施態様では、接触面は、その残基が、野生型メガヌクレアーゼ－ＤＮＡ複合体におい
て塩基接触を実行するか否かとは無関係に、ペアのいずれかの塩基における大溝水素結合
ドナーまたはアクセプターから９．０オングストローム未満のβ－炭素を有する、酵素中
のアミノ酸を含む。別の実施態様では、残基が、野生型メガヌクレアーゼ－ＤＮＡ複合体
において接触を行わない場合、この残基を排除することが可能であり、又は考慮される残
基の数または名称を変えようとする設計者の意図に基づいて残基を含めること、又は排除
することが可能である。後述の一実施例では、野生型Ｉ－ＣＲＥＩ半分部位の塩基位置－
２、－７、－８及び－９において、接触面は、野生型酵素－ＤＮＡ複合体において実際に
相互作用を持つアミノ酸位置に限定された。しかしながら、位置－１、－３、－４、－５
及び－６では、接触面は、野生型接触には与らないが、異なるアミノ酸によって置換され
た場合、塩基に接触する可能性のある、さらに新たなアミノ酸位置を含むように定義され
た。
認識配列半分部位は、通常、ＤＮＡの１本鎖のみに関して表されるが、メガヌクレアー
ゼは、２本鎖ＤＮＡの大溝に結合し、両鎖の核酸塩基と接触することに注意しなければな
らない。さらに、「センス」および「アンチセンス」鎖という表示は、メガヌクレアーゼ
の結合と認識に関しては完全にその場まかせである。ある位置における配列特異性は、塩
基対の一方のメンバーとの相互作用か又は塩基対の両方のメンバーとの相互作用の組み合
わせのどちらかによって実現される。したがって、例えば、位置Ｘにおいて、該位置Ｘで
はＡ塩基は「センス」鎖上にあり、Ｔ塩基が「アンチセンス」鎖上にある、Ａ／Ｔ塩基対
の存在を優先するためには、位置Ｘにおいてセンス鎖に接触できるほど十分に近接し、か
つＡの存在を好む残基が選択されるか、及び／又は、位置Ｘにおいてアンチセンス鎖に接
触できるほど十分に近接し、かつＴの存在を好む残基が選択される。本発明によれば、残
基のβ－炭素が、関連塩基の最近接原子の９オングストローム以内にある場合、その残基
は十分に近接すると考慮される。
したがって、例えば、ＤＮＡセンス鎖の９オングストローム以内ではあるが、アンチセ
ンス鎖から９オングストロームより大きく離れるβ－炭素を持つアミノ酸は、センス鎖に
対してのみ相互作用を持つ可能性があると考慮される。同様に、ＤＮＡアンチセンス鎖の
９オングストローム以内ではあるが、センス鎖から９オングストロームより大きく離れる
β－炭素を持つアミノ酸は、アンチセンス鎖に対してのみ相互作用を持つ可能性があると
考慮される。両方のＤＮＡ鎖の９オングストローム以内にβ－炭素を持つアミノ酸は、ど
ちらの鎖とも相互作用を持つ可能性があると考慮される。
各接触面について、可能なアミノ酸置換について、４種のＤＮＡ塩基の内の一つ以上に
対し好んで相互作用を持とうとする能力を予測し、その予測能力に基づいてアミノ酸置換
が選択される。この選択プロセスは、二つの主要基準に基づく。（Ｉ）異なる核酸塩基と
の立体相互作用に影響を及ぼすアミノ酸側鎖のサイズ、及び（ＩＩ）異なる核酸塩基との
静電気的及び結合的相互作用に影響を及ぼすアミノ酸側鎖の化学的性質である。
側鎖のサイズに関しては、接触面におけるアミノ酸のβ－炭素が、塩基から６オングス
トローム未満の距離にある場合には、比較的短い及び／又は比較的小さい側鎖を持つアミ
ノ酸を選択することが可能であり、接触面におけるアミノ酸のβ－炭素が、塩基から６オ
ングストロームより遠い距離にある場合には、比較的長い及び／又は比較的大きい側鎖を
持つアミノ酸を選択することが可能である。サイズが中間のアミノ酸側鎖は、接触面にお
けるアミノ酸β－炭素が、塩基から５～８オングストロームである場合に選択することが
可能である。
比較的短く、比較的小さい側鎖を持つアミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、
セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、
イソロイシン（Ｉ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）及びプロリン（Ｐ）を
含む１群に割り当てられる。しかしながら、プロリンは、比較的屈曲性が低いので、比較
的頻繁な使用が期待されない。さらに、グリシンは、ペプチドバックボーンに不要な屈曲
性を導入するため、かつ、きわめてサイズが小さいために、より大きな残基を置換した場
合、効果的接触が得られる確率が低いと考えられるために、比較的頻繁な使用が期待され
ない。一方、グリシンは、ある場合、縮重位置を増進するために使用することが可能であ
る。比較的中間的長さ及びサイズの側鎖を持つアミノ酸は、リシン（Ｋ）、メチオニン（
Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびグルタミン（Ｑ）を含む２群に割
り当てられる。比較的長い、及び／又は比較的大きい側鎖を持つアミノ酸は、リシン（Ｋ
）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）
、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）を含む３群に割り当てられる。しかしな
がら、トリプトファンは、比較的屈曲性が低いので、比較的頻繁な使用が期待されない。
さらに、リシン、アルギニン、およびメチオニン側鎖の屈曲性によって、これらのアミノ
酸は、長い距離または中間距離からの塩基接触が可能となるために、それらが、２群と３
群の両群に含められることを保証する。これらの群をさらに、下記に表１として示す。
側鎖の化学的性質に関しては、種々のアミノ酸が、種々の核酸塩基との相互作用の可能
性について評価されており（例えば、ファンデルワールス力、イオン結合、水素結合及び
疎水性相互作用）、２本鎖ＤＮＡ認識配列半分部位中の特定位置における特定塩基と、メ
ガヌクレアーゼとの特異的相互作用を好むか又は忌避する残基が選択される。ある場合に
は、一つ以上の、完全な又は部分的な縮重位置を持つ半分部位を創出することが望ましい
場合がある。そのような場合、二つ以上の塩基の存在を好む残基又は一つ以上の塩基を忌
避する残基を選んでもよい。例えば、部分的に縮重された塩基認識は、センス又はアンチ
センス位置においてピリミジンを立体的に妨げることによって実現することが可能である
。
グアニン（Ｇ）塩基の認識は、該塩基のＮ７およびＯ６に対して水素結合を形成する塩
基性側鎖を持つアミノ酸を用いて実現される。シトシン（Ｃ）の特異性は、Ｃ以外の全て
の塩基の上に存在する、大溝の電気的陰性基との相互作用を持ちたがらない、陰性荷電側
鎖によって付与される。チミン（Ｔ）の認識は、疎水性側鎖と、塩基の上の大溝メチル基
との間の疎水性およびファンデルワールス相互作用を用いて合理的に設計される。最後に
、アデニン（Ａ）塩基は、該塩基のＮ７およびＮ６に対する一対の水素結合を介して、Ａ
ＳＮおよびＧＬＮのカルボキサミド側鎖、またはＴＹＲのヒロドキシル側鎖を用いて認識
される。最終として、ＨＩＳは、Ｎ７に対して水素結合を供与することによって、プリン
塩基（ＡまたはＧ）に対して特異性を付与するために使用することが可能である。この、
ＤＮＡ認識に関する単純な規則を用いて、そこでは、ある特定の塩基対位置において、塩
基の内の一つが、または両方が合理的設計接触を通じて認識される、そのような接触面を
予測することが可能である。
したがって、種々の核酸塩基との結合性相互作用及び接触を行う位置において好む塩基
に基づいて、各アミノ酸残基を、それが好む種々の塩基（すなわち、Ｇ、Ｃ、Ｔ、または
Ａ）に対応する一つ以上の異なる群に割り当てることが可能である。このようにして、Ｇ
群は、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、およびヒスチジン（Ｈ）を含み；Ｃ群は、アス
パラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）を含み；Ｔ群は、アラニン（Ａ）、バリン（
Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、システイン（Ｃ）、トレオニン（Ｔ）、メ
チオニン（Ｍ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）を含み；かつ、Ａ群は、アスパラギン（
Ｎ）、グルタミン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、およびヒスチジン（Ｈ）を含む。なお、ヒス
チジンは、Ｇ群とＡ群の両群に現れること；セリン（Ｓ）は、どの群にも含まれないが、
縮重位置を好むものとして使用してもよいこと；および、プロリン、グリシン、およびト
リプトファンは、主に立体的配慮のためにどの特定の群にも含まれないことに注意された
い。これらの群も下記に表２として示す。
したがって、本発明によれば、任意の位置Ｘにおいて、メガヌクレアーゼの認識配列半
分部位に所望の変化を実行するために、（１）野生型、または参照メガヌクレアーゼ－Ｄ
ＮＡ複合体の三次元構造の少なくとも関連部分及び位置Ｘにおける接触面を定めるアミノ
酸残基側鎖を決定すること；（２）接触面を含む少なくとも一つの残基のβ－炭素及び位
置Ｘにおける塩基対の少なくとも一つの塩基との間の距離を決定すること；（３）所望の
変化を促進するために、（Ａ）塩基から６オングストローム未満の距離にある残基につい
ては、Ｇ群、Ｃ群、Ｔ群又はＡ群の内の適切な一つの群のメンバーである１群及び／又は
２群から残基を選ぶこと、及び／又は、（Ｂ）塩基から６オングストロームより遠い距離
にある残基については、Ｇ群、Ｃ群、Ｔ群又はＡ群の内の適切な一つの群のメンバーであ
る２群及び／又は３群から残基を選ぶこと、である。接触面を含む、一つを超えるこのよ
うな残基を、分析および修飾のために選ぶことが可能であり、ある実施態様では、このよ
うな各残基が分析され複数の残基が修飾される。同様に、接触面に含まれる残基のβ－炭
素と、位置Ｘにおける塩基対の二つの塩基のそれぞれとの間の距離を測定することが可能
であり、もしもその残基が両方の塩基の９オングストローム以内にある場合、該塩基対の
二つの塩基に影響を及ぼすために異なる置換を実行することが可能である（例えば、一方
の鎖の近位塩基に影響を及ぼすために１群の残基、又は他方の鎖の遠位塩基に影響を及ぼ
すために３群の残基）。それとは別に、ペアの両塩基と相互作用を持つことが可能な残基
置換の組み合わせは、特異性に影響を及ぼすことが可能である（例えば、アンチセンス鎖
に接触するＡ群の残基と組み合わせたセンス鎖に接触するＴ群の残基はＴ／Ａを選択する
）。最後に、残基の複数の候補修飾は、経験的に（例えば、組み換えメガヌクレアーゼを
生産し、その配列認識を調べることによって）、又はコンピュータ的に（例えば、修飾さ
れた酵素のメガヌクレアーゼ－ＤＮＡ複合体のコンピュータモデル化によって）その有効
性を検証して、複数候補の中から選択することが可能である。
野生型又は基準ヌクレアーゼの、一つ以上の所望のアミノ酸修飾が選択されたならば、
合理設計メガヌクレアーゼは、従来技術で周知の組み換え法および技術によって生産する
ことが可能である。ある実施態様では、特異的配列修飾を創製するために、非ランダムな
、部位指向性突然変異誘発技術が用いられる。非ランダム突然変異誘発技術の非限定的例
としては、重複プライマーＰＣＲ（例えば、ＷＡＮＧ ＥＴ ＡＬ．（２００６），ＮＵ
ＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．３４（２）：５１７－５２７を参照）、部位指向性突
然変異誘発（例えば、米国特許第７，０４１，８１４号を参照）、カセット突然変異誘発
（例えば、米国特許第７，０４１，８１４号参照）、および、ＰＲＯＭＥＧＡ ＢＩＯＳ
ＣＩＥＮＣＥＳ，ＩＮＣ．（ＳＡＮ ＬＵＩＳ ＯＢＩＳＰＯ、カリフォルニア州）から
市販されるＡＬＴＥＲＥＤ ＳＩＴＥＳ（Ｒ） ＩＩ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ ＳＹＳ
ＴＥＭ ＫＩＴ用のメーカーのプロトコールが挙げられる。
合理設計メガヌクレアーゼによる、特異的ＤＮＡ配列の認識及び切断は、当業者の既知
の任意の方法によって定量することが可能である（例えば、米国特許出願公開第２００６
／００７８５５２号を参照）。ある実施態様では、メガヌクレアーゼ切断の定量は、イン
ビトロ切断アッセイによって定量される。このようなアッセイは、定量されるメガヌクレ
アーゼの意図される認識配列を含むポリヌクレオチド基質のインビトロ切断を用いるが、
ある実施態様では、片方又は両方の半分部位の一つ以上の塩基が、別の塩基に変えられた
、意図された認識配列の変種を含むポリヌクレオチド基質のインビトロ切断を用いる。通
常、ポリヌクレオチド基質は、合成され、ベクターにクローンされた標的部位を含む２本
鎖ＤＮＡ分子である。ポリヌクレオチド基質は、直線状であっても、円形であってもよい
が、通常、唯一の認識配列を含む。メガヌクレアーゼは、適切な条件下で、ポリヌクレオ
チド基質とインキュベートされ、得られたポリヌクレオチドは、切断産物を特定するため
に、既知の方法で分析される（例えば、電気泳動又はクロマトグラフィー）。直線状２本
鎖ＤＮＡ基質において単一の認識配列がある場合には、メガヌクレアーゼ活性は、二つの
バンドの出現及び最初の全長の基質バンドの消失によって検出される。一実施態様では、
メガヌクレアーゼ活性は、例えば、ＷＡＮＧ ＥＴ ＡＬ．（１９９７），ＮＵＣＬＥＩ
Ｃ ＡＣＩＤ ＲＥＳ．，２５：３７６７－３７７６に記載される通りに定量することが
可能である。
他の実施態様では、メガヌクレアーゼの切断パターンは、インビボ切断アッセイによっ
て定量される（例えば、米国特許出願公開第２００６／００７８５５２号）。特定の実施
態様では、このインビボ試験は、単一鎖アニーリング組み換え試験（ＳＳＡ）である。こ
の種の試験は当業者には既知である（ＲＵＤＩＮ ＥＴ ＡＬ．（１９８９），ＧＥＮＥ
ＴＩＣＳ １２２：５１９－５３４；ＦＩＳＨＭＡＮ－ＬＯＢＥＬＬ ＥＴ ＡＬ．（１
９９２），ＳＣＩＥＮＣＥ ２５８：４８０－４）。
当業者には明らかなように、ＤＮＡ認識および結合に関与するドメイン以外の、メガヌ
クレアーゼ酵素のドメインに対し、活性を完全に消失させることなく、さらに新たなアミ
ノ酸置換、挿入又は欠失を行うことが可能である。置換は、構造的または機能的に束縛さ
れた位置における、類似のアミノ酸残基の保存的置換であってもよく、又は構造的または
機能的に比較的に束縛されない位置における非保存的置換であってもよい。このような置
換、挿入又は欠失は、当業者によって、不当な努力を要することなく、通例の実験操作に
よって特定することが可能である。したがって、ある実施態様では、本発明の組み換えメ
ガヌクレアーゼは、基準メガヌクレアーゼの配列に対し、８５％から９９％の間の任意の
パーセント（例えば、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、
９９％）の配列類似性を持つタンパクを含む。各野生型Ｉ－ＣＲＥＩ、Ｉ－ＭＳＯＩ、Ｉ
－ＳＣＥＩ、およびＩ－ＣＥＵＩタンパクに関して、多くのＮ－末端およびＣ－末端配列
は、Ｘ線結晶実験でははっきりと見ることができない。これは、これらの位置が、構造的
又は機能的に束縛されていないことを示唆する。それゆえ、これらの残基は、配列類似性
の計算から排除することが可能であり、下記の基準メガヌクレアーゼ配列を使用すること
が可能である。Ｉ－ＣＲＥＩについては配列番号１の残基２－１５３；Ｉ－ＭＳＯＩにつ
いては配列番号６の残基６－１６０；Ｉ－ＳＣＥＩについては配列番号９の残基３－１８
６；Ｉ－ＣＥＵＩについては配列番号１２の残基５－２１１である。
２．２ ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー・メガヌクレアーゼ
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ・ファミリーは、多様な系統群の宿主生物体由来
の２００を超えるメンバーから構成される。このファミリーのメンバーは全て、特異的Ｄ
ＮＡ配列の切断に与る他の構造的モチーフと共に、高度に保存されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧ
モチーフの１個又は２個の複製を有する。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの１つの複製有す
る酵素（すなわち、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ）はダイマーとして機能
し、一方、このモチーフの２つの複製を有する酵素（すなわち、ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ
メガヌクレアーゼ）はモノマーとして機能する。
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーメンバーは全て、比較的長い配列（＞１２ＢＰ）を認識
、切断し、４個のヌクレオチドの、３′オーバーハングを残す。これらの酵素はさらに、
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧの外に、タンパク－ＤＮＡインターフェイスにおいて、逆平行β鎖の
類似配置を含むいくつかの構造的モチーフを共有する。これらの保存された構造モチーフ
内のアミノ酸がＤＮＡ塩基と相互作用を持ち、認識配列特異性を付与する。ファミリーの
いくつかのメンバー（例えば、Ｉ－ＣＲＥＩ、Ｉ－ＭＳＯＩ、Ｉ－ＳＣＥＩ及びＩ－ＣＥ
ＵＩ
）の間に全体構造の類似性が見られることは、Ｘ線結晶学によって明らかにされている。
したがって、このファミリーのメンバーは、この構造モチーフ内部の特定のアミノ酸につ
いて修飾し、該酵素の全体活性又は配列特異性を変えることが可能であり、かつ、対応す
る修飾は、他のファミリーメンバーにおいても類似の結果をもたらすことが当然期待され
る。概論については、ＣＨＥＶＡＬＩＥＲＥＴ ＡＬ． （２００１）， ＮＵＣＬＥＩＣ
ＡＣＩＤ ＲＥＳ． ２９（１８）:３７５７－３７７４）を参照されたい。
２．２．１ Ｉ－ＣＲＥＩから得られるメガヌクレアーゼ
１側面において、本発明は、ＣＨＬＡＭＹＤＯＭＯＮＡＳ ＲＥＩＮＨＡＲＤＴＩＩの
Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づく、又はこのメガヌクレアーゼから得られた合理的
設計メガヌクレアーゼに関する。Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列は
、ＧＥＮＢＡＮＫアクセス＃ＰＯ５７２５に対応する、配列番号１に示される。結晶構造
ＰＤＢ＃１ＢＰ７における野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの、二つの、認識配列半
分部位を下記の表３に示す。
この天然の認識配列は、中央の４塩基の外側においても、完全にはパリンドローム的で
はないことに注意されたい。なお、二つの認識配列半分部位がそれぞれのセンス鎖に太字
で示される。
野生型Ｉ－ＣＲＥＩはさらに、下記の表４に示すように、（中央のＮ１－Ｎ４塩基を除
き）完全にパリンドロームである配列も認識し、切断する。
配列番号４及び配列番号５のパリンドローム配列は、野生型Ｉ－ＣＲＥＩにとってより
優れた基質であると考えられる。なぜなら、この酵素は、天然のＤＮＡ配列よりもより高
い親和度の下にこの部位に結合し、より効率的に該部位を切断するからである。下記の開
示のために、かつ、特に本出願において提示する実験結果との関連において、野生型Ｉ－
ＣＲＥＩによって切断されるこのパリンドローム配列を”ＷＴ”と呼ぶことにする（例え
ば、図２（Ａ）参照）。二つの、認識配列半分部位が、それぞれのセンス鎖に太字で示さ
れる。
図１（Ａ）は、野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼ・ホモダイマーの、２本鎖ＤＮＡ
認識配列との相互作用を描く。図１（Ｂ）は、野生型酵素の半分部位と野生型認識配列の
－４位置におけるこの酵素のアミノ酸残基と塩基との間の特異的相互作用を示し、図１（
Ｃ）～図１（Ｅ）は、半分部位の－４位置における特異性を変更させた、本発明の、三つ
の合理設計メガヌクレアーゼの、一半分部位の－４位置における、酵素のアミノ酸残基と
塩基との間の特異的相互作用を示す。
したがって、半分部位の任意の、指定の塩基位置における塩基に対する好みは、本出願
に開示される方法を用いて、他の三つの塩基のそれぞれに合理的に変えることが可能であ
る。第一に、指定の塩基位置における野生型認識面が決められる（例えば、メガヌクレア
ーゼ－ＤＮＡ複合体共結晶構造を分析することによって、又はメガヌクレアーゼ－ＤＮＡ
複合体のコンピュータモデル化によって）。第二に、指定の塩基位置における、周辺アミ
ノ酸位置のβ－炭素と、各ＤＮＡ鎖における核酸塩基の間の距離に基づいて、既存の及び
可能な接触残基が決められる。例えば、ただしこれらに限定されないが、図１（Ａ）に示
すように－４位置における、Ｉ－ＣＲＥＩ野生型メガヌクレアーゼ－ＤＮＡ接触残基は、
位置２６のグルタミンを含み、これはアンチセンスＤＮＡ鎖のＡ塩基と水素結合する。さ
らに、残基７７が、ＤＮＡアンチセンス鎖の－４塩基に接触し得る可能性を持つことが特
定された。残基２６のβ－炭素は、アンチセンスＤＮＡ鎖のＡ塩基のＮ７から５．９Å離
れており、残基７７のβ－炭素は、センス鎖のＴのＣ５メチルから７．１５オングストロ
ーム離れている。この距離及び本出願に記載される塩基化学規則によれば、センス鎖をＣ
とすると、位置７７のグルタミン酸と水素結合することが可能であり、アンチセンス鎖を
Ｇとすると、位置２６のグルタミンと結合することが可能である（野生型Ｉ－ＣＲＥＩ結
晶構造に観察されるように、水分子を介して）（図１（Ｃ）を参照）。センス鎖をＧとす
ると、位置７７のアルギニンと水素結合することが可能であり、アンチセンス鎖をＣとす
ると、位置２６のグルタミン酸と水素結合することが可能である（図１（Ｄ）を参照）。
センス鎖をＡとすると、位置７７のグルタミンと水素結合することが可能であり、アンチ
センス鎖をＴとすると、位置２６のアラニンと疎水性接触を形成することが可能である（
図１（Ｅ）を参照）。もしも塩基の特異的接触が位置７７によって与えられるとすると、
野生型接触Ｑ２６を置換し（例えば、セリン残基によって）、その特異性に対する影響を
低下、または除去することが可能である。それとは別に、位置２６および７７における相
補的突然変異を組み合わせて、特定の塩基対を指定することが可能である（例えば、Ａ２
６は、アンチセンス鎖においてＴを指定し、Ｑ７７は、センス鎖においてＡを指定する（
図１（Ｅ））。これらの予言された残基置換は、全て、実験的にその有効性が実証された
。
したがって、本発明によれば、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに
対する、ある確定数のアミノ酸置換が特定された。これらは、単独で又は組み合わせて用
いられて、ＤＮＡ認識配列半分部位内の個別の塩基において特異性を変更された組み換え
メガヌクレアーゼを、したがって、野生型酵素とは異なる半分部位を持つ合理設計メガヌ
クレアーゼをもたらすことが可能である。Ｉ－ＣＲＥＩのアミノ酸修飾及びそれによって
もたらされる、認識配列半分部位特異性における変化を、表５に示す。
太字入力は、野生型接触残基であり、本出願で使用される「修飾」を構成しない。
星印は、その残基が、アンチセンス鎖の塩基に接触することを示す。
２．２．２． Ｉ－ＭＳＯＬＩから得られるメガヌクレアーゼ
他の側面では、本発明は、ＭＯＮＯＭＡＳＴＩＸ ＳＰ．のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレア
ーゼに基づく、又はこのヌクレアーゼから得られた合理設計メガヌクレアーゼに関する。
Ｉ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫアクセス＃ＡＡ
Ｌ３４３８７に対応し、配列番号６に示される。結晶構造ＰＤＢ＃１Ｍ５Ｘにおける野生
型Ｉ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの、二つの認識配列半分部位を下記の表６に示す。
認識配列は、中央の４塩基の外側においても、完全にはパリンドローム的ではないこと
に注意されたい。二つの認識配列半分部位が、それぞれのセンス鎖に太字で示される。
本発明によれば、Ｉ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する、ある
確定数のアミノ酸置換が特定された。これらは、単独で又は組み合わせて用いられて、Ｄ
ＮＡ認識配列半分部位内の個別の塩基において特異性を変更された組み換えメガヌクレア
ーゼを、したがって、野生型酵素とは異なる半分部位を持つ合理設計メガヌクレアーゼを
もたらすことが可能である。Ｉ－ＭＳＯＩのアミノ酸修飾、および、予測される、認識配
列半分部位特異性における変化を、表７に示す。
太字は、野生型接触残基を表し、本出願で使用される「修飾」を構成しない。
星印は、その残基がアンチセンス鎖の塩基に接触することを示す。
２．２．３． Ｉ－ＳＣＥＩから得られるメガヌクレアーゼ
他の側面では、本発明は、ＳＡＣＣＨＡＲＯＭＹＣＥＳＣＥＲＥＶＩＳＩＡＥのＩ－Ｓ
ＣＥＩメガヌクレアーゼに基づく、又はこのヌクレアーゼから得られた合理設計メガヌク
レアーゼに関する。Ｉ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡ
ＮＫアクセス＃ＣＡＡ０９８４３に対応し、配列番号９に示される。結晶構造ＰＤＢ＃１
Ｒ７Ｍにおける野生型Ｉ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼの、認識配列を下記の表８に示す。
認識配列は、非パリンドローム的であり、かつ、半分部位を分ける四つの塩基対がない
ことに注意されたい。
本発明によれば、Ｉ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する、ある
確定数のアミノ酸置換が特定された。これらは、単独で又は組み合わせて用いられて、Ｄ
ＮＡ認識配列内の個別の塩基において特異性を変更された組み換えメガヌクレアーゼ、つ
まり、野生型酵素とは異なる認識配列を持つ合理設計メガヌクレアーゼをもたらすことが
可能である。Ｉ－ＳＣＥＩのアミノ酸修飾及び予測される認識配列特異性における変化を
、表９に示す。
太字入力は、野生型接触残基を表し、本出願で使用される「修飾」を構成しない。星印
は、その残基が、アンチセンス鎖の塩基に接触することを示す。
２．２．４ Ｉ－ＣＥＵＩから得られるメガヌクレアーゼ
他の側面では、本発明は、ＣＨＬＡＭＹＤＯＭＯＮＡＳＥＵＧＡＭＥＴＯＳのＩ－ＣＥ
ＵＩメガヌクレアーゼに基づく、又はこのヌクレアーゼから得られた合理設計メガヌクレ
アーゼに関する。Ｉ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮ
Ｋアクセス＃Ｐ３２７６１に対応し、配列番号１２に示される。結晶構造ＰＤＢ＃２ＥＸ
５における野生型Ｉ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの、二つの認識配列半分部位を下記に示
す。
Ｉ－ＣＥＵＩはホモダイマーであるにも拘わらず、Ｉ－ＣＥＵＩの認識インターフェイ
スにおける天然の縮重のために（ＳＰＩＥＧＥＬ ＥＴ ＡＬ．（２００６），ＳＴＲＵ
ＣＴＵＲＥ １４：８６９－８０）、認識配列は、中央の４塩基の外側においても、非パ
リンドローム的であることに注意されたい。二つの認識配列半分部位がそれぞれのセンス
鎖に太字で示される。
本発明によれば、Ｉ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する、ある
確定数のアミノ酸置換が特定された。これらは、単独で又は組み合わせて用いられて、Ｄ
ＮＡ認識配列半分部位内の個別の塩基において特異性を変更された組み換えメガヌクレア
ーゼを、したがって、野生型酵素とは異なる半分部位を持つ合理設計メガヌクレアーゼを
もたらすことが可能である。Ｉ－ＣＥＵＩのアミノ酸修飾及び予測される認識配列特異性
における変化を、表１１に示す。
太字入力は、野生型接触残基を表し、本出願で使用される「修飾」を構成しない。星印
は、その残基がアンチセンス鎖の塩基に接触することを示す。
２．２．５ 特異的に排除される組み換えメガヌクレアーゼ
本発明は、従来技術において記載され、別法によって開発された、いくつかの組み換え
メガヌクレアーゼを包含することを意図しない。これらの排除されたメガヌクレアーゼと
しては、ＡＲＮＯＵＬＤ ＥＴ ＡＬ．（２００６），Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．３５５：
４４３－５８；ＳＵＳＳＭＡＮ ＥＴ ＡＬ．（２００４），Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．３
４２：３１－４１；ＣＨＡＭＥＳ ＥＴ ＡＬ．（２００５），ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩ
ＤＳ ＲＥＳ．３３：Ｅ１７８；ＳＥＬＩＧＭＡＮ ＥＴ ＡＬ．（２００２），ＮＵＣ
ＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．３０：３８７０－９；およびＡＳＨＷＯＲＴＨ ＥＴ
ＡＬ．（２００６） ＮＡＴＵＲＥ ４４１（７０９３）：６５６－６５９によって記載
されるものが挙げられる。なお、上記の全開示を、Ｃ３３、Ｒ３３、Ａ４４、Ｈ３３、Ｋ
３２、Ｆ３３、Ｒ３２、Ａ２８、Ａ７０、Ｅ３３、Ｖ３３、Ａ２６及びＲ６６から選ばれ
る単一置換を持つ、Ｉ－ＣＲＥＩに基づく組み換えメガヌクレアーゼを含め、引用により
本出願に含める。さらに排除されるものは、Ａ６８／Ｎ７０／Ｎ７５及びＤ４４／Ｄ７０
／Ｎ７５から選ばれた３置換、Ｋ４４／Ｔ６８／Ｇ６０／Ｎ７５及びＲ４４／Ａ６８／Ｔ
７０／Ｎ７５から選ばれる４置換を持つＩ－ＣＲＥＩに基づく組み換えメガヌクレアーゼ
である。最後に、特に指定して排除されるものは、置換Ｌ２８及びＲ８３のペアを持つＩ
－ＭＳＯＩに基づく組み換えメガヌクレアーゼである。これらの置換又は置換の組み合わ
せは、本出願では「排除修飾」と呼ばれる。
２．２．６ 認識配列半分部位において複数変化を有するメガヌクレアーゼ
他の側面では、本発明は、ＤＮＡ認識配列半分部位の二つ以上の位置において半分部位
指向を変えるために、上の節２．２．１－２．２．４に記載した、二つ以上のアミノ酸置
換を組み合わせることによって得られる合理設計メガヌクレアーゼに関する。例えば、た
だしこれらに限定されるものではないが、さらに詳しく後述されるように、酵素ＤＪ１は
、修飾Ｒ３０／Ｅ３８（これは、位置－７においてＣを好む）、Ｒ４０（これは位置－６
においてＧを好む）、Ｒ４２（これは、位置－５においてＧを好む）及びＮ３２（これは
、位置－９において完全縮重を好む）を取り込むことによって、Ｉ－ＣＲＥＩから得られ
る。この合理設計ＤＪ１メガヌクレアーゼは、Ａ－７Ａ－６Ｃ－５に対する野生型の指向
性に比べ、ほぼ変わらない程度でＣ－７Ｇ－６Ｇ－５を認識し、位置－９におけるＡに対
する耐性を増大させる。
異なる塩基位置に影響を及ぼす残基置換を組み合わせることができる能力は、一部は、
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼのモジュラー性による。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ認識イ
ンターフェイスにおける塩基接触の大部分は、個々のアミノ酸側鎖によって形成され、イ
ンターフェイスは、隣接塩基と相互作用を持つ側鎖間の相互接続性、または水素結合ネッ
トワークから比較的自由である。これによって、一般に、一塩基位置と相互作用を持つ残
基を隣接塩基における側鎖同士の相互作用に影響を及ぼさずに操作することが可能になる
。さらに、上の２．２１－２．２．４節に掲げた突然変異の加重性は、これらの突然変異
を特定するために用いた本法の直接的結果である。この方法は、単一塩基と直接に相互作
用を持つ側鎖置換を予測する。一般に、側鎖間の相互接続、または水素結合ネットワーク
は、認識インターフェイス内の置換の独立性を維持するために回避される。
側鎖置換のある組み合わせは、完全に又は部分的に相互に不適合である。不適合ペア又
は組のアミノ酸を合理設計メガヌクレアーゼに組み込んだ場合、得られた酵素の触媒活性
は、低下するか又は排除される。通常、これらの不適合は、導入されたアミノ酸側鎖間の
立体干渉によるもので、活性は、この干渉を特定し、除去することで回復が可能である。
具体的には、大きな側鎖を持つ（例えば、２又は３群のアミノ酸）二つのアミノ酸が、メ
ガヌクレアーゼ構造において、互いに隣接するアミノ酸位置に組み込まれた場合（例えば
、Ｉ－ＣＲＥＩ由来のメガヌクレアーゼの場合、位置３２及び３３、２８及び４０、２８
及び４２、４２及び７７又は６８及び７７）、これら二つのアミノ酸は互いに干渉しあっ
て、酵素活性を下げる可能性が高い。この干渉は、一方の又は両方の不適合アミノ酸を、
より小さな側鎖を持つアミノ酸（例えば、１群または２群）で置換することによって排除
することが可能である。例えば、Ｉ－ＣＲＥＩ由来の合理設計メガヌクレアーゼでは、Ｋ
２８は、Ｒ４０とＲ４２の両方に干渉する。酵素活性を最大化するためには、Ｒ４０及び
Ｒ４２を、位置２８においてセリン又はアスパラギン酸と組み合わせることが可能である
。
本出願に記載のように特定される、アミノ酸置換の組み合わせを用いて、野生型メガヌ
クレアーゼ（又は以前に修飾されたメガヌクレアーゼ）の特異性を、元の認識配列から、
興味の核酸（例えば、ゲノム）中に存在する、所望の認識配列に合理的に変えることが可
能である。例えば、図２（Ａ）は、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼ認識配列ＷＴ（配列番
号４）の「センス」鎖の外に、それに対し合理的設計メガヌクレアーゼを創製したならば
有用であろうと考えられる、他の、いくつかの配列を示す。ＷＴ認識配列と所望の認識配
列との間で保存される塩基には陰影を施す。本発明によれば、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレア
ーゼに基づく組み換えメガヌクレアーゼは、これらの所望の認識配列のそれぞれについて
ばかりでなく、他の任意の認識配列についても、本出願に記載される適切なアミノ酸置換
によって、合理的に設計することが可能である。
３． ＤＮＡ結合親和度が変更された合理設計メガヌクレアーゼ
前述のように、本発明の組み換えメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合親和度は、ＤＮＡのフ
ォスフォジエステルバックボーンと接触面を形成するいくつかのアミノ酸を変えることに
よって修飾することが可能である。この接触面は、ＤＮＡバックボーンから９オングスト
ローム未満の距離のβ－炭素を持つ酵素のアミノ酸を、この残基が野生型メガヌクレアー
ゼ－ＤＮＡ複合体においてＤＮＡバックボーンと接触するかどうかとは無関係に含む。Ｄ
ＮＡ結合は、酵素活性に必要な前提条件であるから、ＤＮＡ結合親和度の上昇／低下は、
それぞれ、酵素活性の上昇／低下を起こすことが示されている。しかしながら、ＤＮＡ結
合親和度の上昇／低下はさらに、メガヌクレアーゼの配列特異性の低下／上昇を起こすこ
とが示されている。それゆえ、活性および特異性は両方とも、フォスフォジエステルバッ
クボーン接触を修飾することによって修飾することが可能である。
酵素活性の上昇／酵素の特異性の低下のためには、
（Ｉ）酵素とＤＮＡバックボーンの間の静電気的反発を取り除く。ある特定されたアミ
ノ酸が、陰性荷電のＤＮＡバックボーンに反発すると予想される、陰性に荷電した側鎖を
持つ場合（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、この反発は、アミノ酸を無荷電の
又は陽性荷電の側鎖で置換することによって除去することが可能である。ただし、この場
合、立体障害の作用には影響される。実験的に確かめられた例は、Ｉ－ＣＲＥＩにおける
グルタミン酸８０をグルタミンに突然変異させた場合である。
（ＩＩ）酵素とＤＮＡバックボーンの間に静電気的牽引相互作用を導入する。接触面の
位置のいずれかにおける、陽性荷電側鎖を持つアミノ酸（例えば、リシン又はアルギニン
）の導入は、立体干渉の作用には影響されるが、結合親和度を増すことが予想される。
（ＩＩＩ）酵素とＤＮＡバックボーンの間に水素結合を導入する。接触面のアミノ酸が
、適切な水素結合官能基を欠如するため、又はＤＮＡバックボーンと相互作用を持つには
、側鎖が短すぎるか長すぎるか、及び／又は、屈曲性が不足するという理由で水素結合を
造ることができない場合、適切な長さと屈曲性を持つ、水素結合を供与することが可能な
極性アミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アス
パラギン、リシン、システイン又はアルギニン）を導入することが可能である。ただし、
立体障害の作用には影響される。
具体的に、酵素活性の低下／酵素の特異性の上昇のためには、
（Ｉ）酵素とＤＮＡバックボーンの間に静電気的反発を導入する。接触面の位置のいず
れかにおいて、陰性に荷電した側鎖を持つアミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギ
ン酸）を導入することは、結合親和度を下げることが予想される。ただし、立体障害の作
用には影響される。
（ＩＩ）酵素とＤＮＡの間の静電気的牽引を取り除く。接触面のいずれかのアミノ酸が
、陰性に荷電したＤＮＡバックボーンと相互作用を持つ、陽性に荷電した側鎖を持つ場合
（例えば、リシン又はアルギニン）、この好ましい相互作用は、アミノ酸を無荷電の又は
陰性荷電の側鎖で置換することによって除去することが可能である。ただし、立体干渉の
作用には影響される。実験的に確かめられた例は、Ｉ－ＣＲＥＩにおけるリシン１１６を
アスパラギン酸に突然変異させた場合である。
（ＩＩＩ）酵素とＤＮＡバックボーンの間の水素結合を取り除く。接触面のいずれかの
アミノ酸が、ＤＮＡバックボーンと水素結合を造る場合、そのアミノ酸をその側鎖が適切
な官能基を持たないか又は必要な長さ／屈曲性を欠如するために、同様の水素結合を造る
とは予想されないアミノ酸に置換することが可能である。
例えば、Ｉ－ＣＲＥＩに基づくある組み換えメガヌクレアーゼにおいて、活性を上げる
ためにＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの位置８０におけるグルタミン酸が、リシン又はグ
ルタミンに変更される。別の実施態様では、Ｉ－ＣＲＥＩの位置６６のチロシンが、アル
ギニン又はリシンに変更される。これは、該メガヌクレアーゼの活性を上げる。さらに別
の実施態様では、Ｉ－ＣＲＥＩの位置３４におけるリシンをアスパラギン酸に、位置６６
におけるチロシンをアスパラギン酸に、及び／又は、位置１１６におけるリシンをアスパ
ラギン酸に変えることによって、酵素活性を低下させる。
組み換えメガヌクレアーゼの活性は、その組み換え酵素が、ある特定の認識配列に関し
て、無活性から極度に高い活性までの間の任意の活性レベルを持つように修飾することが
可能である。例えば、ＤＪ組み換えメガヌクレアーゼは、位置２６においてグルタミン酸
突然変異を抱えると活性を完全に失う。しかしながら、位置２６におけるグルタミン酸置
換と位置８０におけるグルタミン置換の組み合わせは、認識配列半分部位内の－４におけ
るグアニンに対し高度の特異性および活性を持つ組み換えメガヌクレアーゼを創製する（
図１（Ｄ）を参照）。
本発明によれば、フォスフォジエステルＤＮＡバックボーン近傍の各種位置におけるア
ミノ酸は、メガヌクレアーゼ活性および特異性の両方に同時に作用するように変えること
が可能である。この、酵素の特異性と活性の「調整」は、フォスフォジエステルバックボ
ーンに対し、アミノ酸によって造られる接触点の数を増すか又は減らすことによって達成
される。フォスフォジエステルバックボーンに対する種々の接触は、アミノ酸側鎖によっ
て促進することが可能である。ある実施態様では、イオン結合、塩橋、水素結合及び立体
障害は、アミノ酸側鎖の、フォスフォジエステルバックボーンに対するコンタクトに影響
を及ぼす。例えば、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの場合、位置１１６におけるリシンの
アスパラギン酸への変更によって、位置－８および－９における核酸塩基間の塩橋が取り
除かれ、これは酵素の切断速度は下げるが、特異性は上げる。
野生型Ｉ－ＣＲＥＩ（配列番号１）、Ｉ－ＭＳＯＩ（配列番号６）、Ｉ－ＳＣＥＩ（配
列番号９）、およびＩ－ＣＥＵＩ（配列番号１２）各メガヌクレアーゼの、バックボーン
接触面を形成する残基は、下表１２において特定される。
酵素の親和度を上げ、したがって、より活性を高め／特異性を下げるためには、
（１）対応する酵素において、陰性荷電（Ｄ又はＥ）、疎水性（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｙ）、又は無荷電／極性（Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ）のアミノ酸を、表１
２から選ぶ。
（２）アミノ酸が陰性荷電しているか又は疎水性である場合は、それを、無荷電／極性（
作用が小さい）又は陽性荷電（ＫまたはＲ、作用が大きい）となるように突然変異させる
。
（３）アミノ酸が無荷電／極性である場合、それを陽性荷電に突然変異させる。
酵素の親和度を下げ、したがって、より活性を下げ／特異性を上げるためには、
（１）対応する酵素において、陽性荷電（Ｋ又はＲ）、疎水性（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｙ）、又は無荷電／極性（Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ）のアミノ酸を、表１
２から選ぶ。
（２）アミノ酸が陽性荷電している場合は、それを、無荷電／極性（作用が小さい）又は
陰性荷電（作用が大きい）となるように突然変異させる。
（３）アミノ酸が疎水性又は無荷電である場合、それを陰性荷電に突然変異させる。
４． ヘテロダイマー・メガヌクレアーゼ
他の側面では、本発明は、二つのモノマーで、その一方は野生型で、その一方または両
方が、非天然形または組み換え形であるモノマーのコンタクトによって形成されるヘテロ
ダイマーであるメガヌクレアーゼを提供する。例えば、野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレア
ーゼは、通常、それぞれが、擬似パリンドローム認識配列において一つの半分部位に結合
する、二つのモノマーから構成されるホモダイマーである。ヘテロダイマー組み換えメガ
ヌクレアーゼは、異なる半分部位を認識する二つのメガヌクレアーゼを組み合わせること
によって、例えば、細胞において二つのメガヌクレアーアゼを共時発現することによって
、又は溶液中で二つのメガヌクレアーゼを混合することによって生産することが可能であ
る。二つのモノマーにおいて、それらのコンタクトによるダイマー形成に影響を及ぼす、
それぞれのアミノ酸を変えることによって、ヘテロダイマーの形成を、ホモダイマーの形
成よりも優先することが可能である。特定の実施態様では、二つのモノマーのインターフ
ェイスにおけるいくつかのアミノ酸が、第１モノマーでは、陰性荷電のアミノ酸（Ｄ又は
Ｅ）から陽性荷電のアミノ酸（Ｋ又はＲ）に変えられ、第２モノマーでは、陽性荷電のア
ミノ酸から陰性荷電のアミノ酸に変えられる（表１３参照）。例えば、Ｉ－ＣＲＥＩ由来
のメガヌクレアーゼの場合、位置７及び５７におけるリシンが、第１モノマーではグルタ
ミン酸に突然変異され、第２モノマーでは、位置８および６１におけるグルタミン酸がリ
シンに突然変異される。このプロセスの結果は、第１モノマーが、ダイマーインターフェ
イスにおいて過剰な陽性荷電残基を持ち、第２モノマーが、ダイマーインターフェイスに
おいて過剰な陰性荷電残基を持つ、一対のモノマーである。それゆえ、この第１及び第２
モノマーは、インターフェイスにおける変更アミノ酸の間の静電気的相互作用のために、
その同じモノマーペアよりも優先的にコンタクトする。
それとは別に、またはそれに加えて、二つのモノマーのインターフェイスにおけるいく
つかのアミノ酸は、立体的にホモダイマー形成を妨げるように変えることも可能である。
具体的には、一方のモノマーのダイマーインターフェイスのアミノ酸を、ホモダイマーを
立体的に阻止する比較的大きな又は嵩高な残基によって置換する。第２のモノマーのダイ
マーインターフェイスにおけるアミノ酸を、第１のモノマーの嵩高な残基を補正するため
に比較的小さな残基で置換し、ヘテロダイマーにおける衝突を取り除くことが可能である
し、または未修飾のままでもよい。
さらに他の実施態様では、イオン架橋又は水素結合を、ヘテロダイマー・インターフェ
イスの疎水性コアの中に埋没させることが可能である。具体的には、インターフェイスの
コアの一モノマーにおける疎水性残基は、陽性荷電残基によって置換することが可能であ
る。さらに、野生型ホモダイマーでは、第１モノマーにおいて置換された疎水性残基と相
互作用を持つ、第２モノマーの疎水性残基は、陰性荷電残基によって置換することが可能
である。したがって、この二つの置換残基は、イオン結語または水素結合を形成すること
が可能である。同時に、疎水性インターフェイスの中に埋没された満たされない電荷の静
電気的反発は、ホモダイマー形成を忌避する。
最後に、前述のように、ヘテロダイマーの各モノマーは、ＤＮＡ認識領域において、異
なるアミノ酸を置換されて、そのため、それぞれが異なるＤＮＡ半分部位を持ち、かつ、
組み合わされたダイマー形ＤＮＡ認識配列が非パリンドローム的となってもよい。
５． 組み換え細胞および生物体を生産する方法
本発明の側面はさらに、合理設計メガヌクレアーゼを用いた、組み換え、トランスジェ
ニック又は他のやり方で遺伝学的に修飾された細胞および生物体を生産する方法を提供す
る。したがって、ある実施態様では、相同組み換えによる興味の配列の正確な挿入（単数
又は複数）を可能とするために、細胞または生物体のゲノムＤＮＡの単一部位又は比較的
少数部位に、二本鎖切断点を特異的に引き起こすための、組み換えメガヌクレアーゼが開
発された。別の実施態様では、（Ａ）非相同的末端接合による興味の配列の稀な挿入（単
数又は複数）を可能とするために、又は（Ｂ）非相同的末端接合による標的配列の破壊を
可能とするために、細胞または生物体のゲノムＤＮＡの単一部位又は比較的少数部位に、
二本鎖切断点を特異的に引き起こすための、組み換えメガヌクレアーゼが開発された。興
味の配列の、相同的組み換え又は非相同的末端接合に関して本出願で用いる場合、「挿入
」という用語は、興味の配列が染色体の中に組み込まれるように、興味の配列が染色体に
コンタクトすることを意味する。相同組み換えの場合、挿入された配列は内因性配列を置
換し、そのため、元のＤＮＡは等しい長さではあるがヌクレオチド配列が変更された外因
性ＤＮＡによって置換される。それとは別に、挿入配列はそれが置換する配列よりもより
多数の又はより少数の塩基を含むことが可能である。
それゆえ、本発明のこの局面によれば、組み換え生物体としては、単子葉植物種、例え
ば、米、小麦、トウモロコシ（メイズ）並びにライ麦、及び双子葉植物種、例えば、豆類
（例えば、ソラマメ、大豆、レンズ豆、ピーナッツ、エンドウ豆）、アルファルファ、ク
ローバー、タバコ並びにＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ種が挙げられるが、これらに限定される
ものではない。さらに、組み換え生物体としては、動物、例えば、ヒト並びに非ヒト霊長
類、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、トカ
ゲ、魚類、及び昆虫類、例えば、ショウジョウバエ種が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。他の実施態様では、生物体は、真菌、たとえば、カンジダ、ニューロス
ボラ又はサッカロマイセスである。
ある実施態様では、本発明の方法は、成熟組み換え生物体になることが可能な又は遺伝
学的に修飾された生物体が、そのゲノムの中に興味の挿入配列を抱える子孫を出産するこ
とを可能とする。例えば、細胞、胚細胞又は幹細胞の中に興味の配列を導入することを含
む。
メガヌクレアーゼタンパクは、ゲノムＤＮＡを切断するために、細胞に輸送することが
可能であるが、これによって、従来技術で既知の様々な機序によって、その切断部位にお
いて、興味の配列による相同組み換え、または非相同末端接合が可能とされる。組み換え
メガヌクレアーゼタンパクは、例えば、マイクロインジェクション又はリポソームトラン
スフェクション（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＩＮＶＩＴＲＯＧ
ＥＮ ＣＯＲＰ．，ＣＡＲＬＳＢＡＤ、カリフォルニア州）を含む、ただしこれらに限定
されないが、技術によって細胞中に導入することが可能である。このリポソーム処方は、
標的細胞との脂質二重層融合を促進するのに用いることが可能であり、そのため、リポソ
ームの内容物又はその表面にコンタクトするタンパクの細胞内部への取り込みを可能にす
る。それとは別に、酵素は、適切な取り込みタンパク、例えば、ＨＩＶＴＡＴタンパクな
どに融合させて細胞の取り込みを指示するようにすることも可能である（例えば、ＨＵＤ
ＥＣＺ ＥＴ ＡＬ．（２００５），ＭＥＤ．ＲＥＳ．ＲＥＶ．２５：６７９－７３６を
参照）。
それとは別に、メガヌクレアーゼタンパクをコードする遺伝子配列は、従来技術で既知
の技術（例えば、ＡＵＳＵＢＥＬ ＥＴ ＡＬ．，「分子生物学における最近のプロトコ
ール（“ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧ
Ｙ，”）」、ＷＩＬＥＹ １９９９を参照されたい）を用いて、ベクターに挿入され、真
核細胞にトランスフェクトされる。興味の配列は、同じベクターによって、異なるベクタ
ーによって又は従来技術で既知の他の手段によって導入することが可能である。
ＤＮＡトランスフェクションの非限定的例としては、ウィルスベクター、プラスミド、
コスミド及びＹＡＣベクターが挙げられる。ＤＮＡ配列のトランスフェクションは、当業
者には既知の、様々の方法によって実現することが可能である。例えば、ＤＮＡ配列を細
胞に輸送するために、リポソームおよびイムノリポソームが用いられる（例えば、ＬＡＳ
ＩＣ ＥＴ ＡＬ．（１９９５），ＳＣＩＥＮＣＥ ２６７：１２７５－７６を参照）。
さらに、ベクターを細胞内に導入するためにウィルスを利用することが可能である（例え
ば、米国特許第７，０３７，４９２号を参照）。それとは別に、ベクターが裸のＤＮＡと
して導入されるようにトランスフェクション戦略を利用することも可能である（例えば、
ＲＵＩ ＥＴ ＡＬ．（２００２），ＬＩＦＥ ＳＣＩ．７１（１５）：１７７１－８を
参照）。
細胞内に核酸を輸送するための一般的方法としては、（１）化学的方法（ＧＲＡＨＡＭ
ＥＴ ＡＬ．（１９７３），ＶＩＲＯＬＯＧＹ ５４（２）：５３６－５３９；ＺＡＴ
ＬＯＵＫＡＬ ＥＴ ＡＬ．（１９９２），ＡＮＮ．Ｎ．Ｙ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．，６６
０：１３６－１５３）；（２）物理的方法、例えば、マイクロインジェクション（ＣＡＰ
ＥＣＣＨＩ（１９８０），ＣＥＬＬ２２（２）：４７９－４８８）、電気穿孔（ＷＯＮＧ
ＥＴ ＡＬ，（１９８２），ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ
．１０７（２）：５８４－５８７；ＦＲＯＭＭ ＥＴ ＡＬ，（１９８５），ＰＲＯＣ．
ＮＡＴ’Ｌ ＡＣＡＤ ＳＣＩ．ＵＳＡ ８２（１７）：５８２４－５８２８；米国特許
第５，３８４，２５３号）、および、弾丸注入法（ＪＯＨＮＳＴＯＮ ＥＴ ＡＬ，（１
９９４），ＭＥＴＨＯＤＳ ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．４３（Ａ）：３５３－３６５；ＦＹＮ
ＡＮ ＥＴ ＡＬ，（１９９３），ＰＲＯＣ．ＮＡＴ’Ｌ ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ
９０（２４）：１１４７８－１１４８２）など；（３）ウィルスベクター（ＣＬＡＰＰ（
１９９３），ＣＬＩＮ． ＰＥＲＩＮＡＴＯＬ．２０（１）：１５５－１６８；ＬＵ Ｅ
Ｔ ＡＬ，（１９９３），Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．１７８（６）：２０８９－２０９６；Ｅ
ＧＬＩＴＩＳ ＥＴ ＡＬ，（１９８８），ＡＶＤ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．ＢＩＯＬ．２４１
：１９－２７；ＥＧＬＩＴＩＳ ＥＴ ＡＬ．（１９８８），ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥ
Ｓ ６（７）：６０８－６１４）；および、（４）受容体介在性機構（ＣＵＲＩＥＬ Ｅ
Ｔ ＡＬ．（１９９１），ＰＲＯＣ．ＮＡＴ’Ｌ ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８８（１
９）：８８５０－８８５４；ＣＵＲＩＥＬ ＥＴ ＡＬ．（１９９２），ＨＵＭ．ＧＥＮ
．ＴＨＥＲ．３（２）：１４７－１５４；ＷＡＧＮＥＲ ＥＴ ＡＬ．（１９９２），Ｐ
ＲＯＣ．ＮＡＴ’Ｌ ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８９（１３）：６０９９－６１０３）
が挙げられる。
ある実施態様では、ゲノムに挿入された興味の配列を含む遺伝学的に修飾された植物が
生産される。ある実施態様では、組み換えメガヌクレアーゼに対応するＤＮＡ配列及びこ
のメガヌクレアーゼ認識配列及び／又は標的配列とほぼ同一の配列によって側接されても
側接されなくともよい興味の配列によって植物細胞をトランスフェクトし、遺伝学的に修
飾された植物が生産される。別の実施態様では、遺伝学的に修飾された植物は、組み換え
メガヌクレアーゼのみに対応するＤＮＡ配列によって植物細胞をトランスフェクトし、そ
れによる切断が非相同性末端接合を促進し、認識配列を含む標的配列を破壊することによ
って生産される。このような実施態様では、メガヌクレアーゼ配列は、宿主植物細胞にお
いてメガヌクレアーゼの発現を可能とする調整配列の調節下にある。これらの調整配列と
しては、構成的植物プロモーター、例えば、ＮＯＳプロモーター、化学的に誘発可能な遺
伝子プロモーター、例えば、デキサメタゾン誘発性プロモーター（例えば、ＧＲＥＭＩＬ
ＬＯＮ ＥＴ ＡＬ．（２００４），ＰＬＡＮＴ Ｊ．３７：２１８－２２８を参照）、
および、植物組織特異的プロモーター、例えば、ＬＧＣ１プロモーター（例えば、ＳＩＮ
ＧＨ ＥＴ ＡＬ．（２００３），ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．５４２：４７－５２を参照）が
挙げられるが、これらに限定されるものではない。
植物細胞の中にＤＮＡを導入するための適切な方法は、ＤＮＡを細胞内に導入すること
が可能であるならば、ほとんどどの方法であってもよく、例えば、ＡＧＲＯＢＡＣＴＥＲ
ＩＵＭ感染、プロトプラストのＰＥＧ－介在性形質転換（ＯＭＩＲＵＬＬＥＨ ＥＴ Ａ
Ｌ．（１９９３），ＰＬＡＮＴ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２１：４１５－
４２８）、ＤＥＳＩＣＣＡＴＩＯＮ／ＩＮＨＩＢＩＴＩＯＮ ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＤＮＡ
ＵＰＴＡＫＥ、電気穿孔、シリコンカーバイド線維による搖動、弾丸注入、または微小
弾丸発射などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
他の実施態様では、組み換えメガヌクレアーゼを用いて、遺伝学的に修飾された動物が
生産される。植物細胞の場合と同様、核酸配列を、胚細胞又は最終的にトランスジェニッ
ク生物体となる細胞の中に導入することが可能である。ある実施態様では、細胞は、受精
卵であり、外因性ＤＮＡ分子は、受精卵の前核の中に注入することが可能である。次に、
このマイクロインジェクションされた卵は、擬似妊娠の代理母の卵管に移送され、育成さ
れる。組み換えメガヌクレアーゼは、（例えば、３－フォスフォグリセレートキナーゼな
どの構成的プロモーターの調節下に）受精卵で発言され、ゲノムの一部位又は不連続な少
数部位における興味の配列の相同組み換えを促進する。それとは別に、ＧＯＳＳＬＥＲ
ＥＴ ＡＬ．（１９８６），ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８３：９
０６５ ９０６９に記載されるように、トランスジェニック動物生成のための組み換え胚
性幹（“ＥＳ”）細胞を利用することによって、遺伝学的に修飾された動物を入手するこ
とが可能である。
ある実施態様では、組み換え哺乳類発現ベクターは、核酸の組織特異的発現を、ある特
定の細胞タイプに優先的に向けて指示することが可能である。組織特異的調整要素は従来
技術で既知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的例としては、アルブミンプ
ロモーター（肝臓特異的、ＰＩＮＫＥＲＴ ＥＴ ＡＬ．（１９８７），ＧＥＮＥＳ Ｄ
ＥＶ．１：２６８－２７７）、リンパ系特異的プロモーター（ＣＡＬＡＭＥ ＡＮＤ Ｅ
ＡＴＯＮ（１９８８），ＡＤＶ．ＩＭＭＵＮＯＬ．４３：２３５－２７５）、特に、Ｔ細
胞受容体のプロモーター（ＷＩＮＯＴＯ ＡＮＤ ＢＡＬＴＩＭＯＲＥ（１９８９），Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）、および免疫グロブリンのプロモーター（ＢＡＮＥＲ
ＪＩＥＴ ＡＬ．（１９８３），ＣＥＬＬ ３３：７２９－７４０；ＱＵＥＥＮ ＡＮＤ
ＢＡＬＴＩＭＯＲＥ（１９８３），ＣＥＬＬ ３３：７４１－７４８）、ニューロン特
異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメント・プロモーター；ＢＡＹＮＥ ＡＮＤ
ＲＵＤＤＬＥ（１９８９），ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８６：
５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（ＥＤＬＵＮＤ ＥＴ ＡＬ．（１９８
５），ＳＣＩＥＮＣＥ ２３０：９１２－９１６）、および、乳腺特異的プロモーター（
例えば、ミルクフェイ・プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号、および欧州特
許公開ＥＰ０２６４１６６）が挙げられる。発達時の調整に与るプロモーター、例えば、
マウスのＨＯＸプロモーター（ＫＥＳＳＥＬ ＡＮＤ ＧＲＵＳＳ（１９９０），ＳＣＩ
ＥＮＣＥ ２４９：３７４－３７９）、および、α－フェトプロテイン・プロモーター（
ＣＡＭＰＥＳ ＡＮＤ ＴＩＬＧＨＭＡＮ（１９８９），ＧＥＮＥＳ ＤＥＶ．３：５３
７－５４６）なども含まれる。
ある実施態様では、合理設計メガヌクレアーゼは、発現レベルまたは局在を監視するた
めに、ペプチドエピトープ（例えば、ＨＡ、ＦＬＡＧ、またはＭＹＣエピトープ）によっ
て標識されてもよい。ある実施態様では、メガヌクレアーゼは、細胞内局在シグナル、例
えば、核局在シグナル（例えば、ＳＶ４０の核局在シグナル）又はクロロプラストもしく
はミトコンドリア局在シグナルに融合されてもよい。別の実施態様では、メガヌクレアー
ゼは、それを、細胞質に局在させる核輸出シグナルに融合されてもよい。さらに、メガヌ
クレアーゼは、無関係のタンパク質又はタンパクドメイン、例えば、ＤＮＡ－修復又は相
同組み換えを刺激するタンパク質（例えば、ＲＥＣＡ、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ
５４、ＲＡＤ５７又はＢＲＣＡ２）に融合されてもよい。
６． 遺伝子治療法
本発明の局面は、遺伝子治療のための、組み換えメガヌクレアーゼの使用を可能とする
。本出願で用いる「遺伝子治療」という用語は、その構造及び／又は機能において欠陥的
である遺伝子又は遺伝子調整配列と置換するために、患者の中に、少なくとも一つの遺伝
子の機能的コピー又は遺伝子調整配列、例えば、プロモーター、エンハンサー又はサイレ
ンサーを導入することを含む治療処置を意味する。さらに、「遺伝子治療」という用語は
、有害遺伝子または調整要素に対し、該遺伝子の発現を下げるか又は除去するために為さ
れる修飾を指すことが可能である。遺伝子治療は、先天性病態、患者の生涯に亘る特定の
遺伝子座位における突然変異または損傷による病態又は感染生物体による病態を治療する
ために実行することが可能である。
本発明のある局面では、機能不全遺伝子は、遺伝子発現に影響を及ぼすゲノム領域に、
外因性核酸配列を挿入することによって置換されるか、不能にさせられる。ある実施態様
では、組み換えメガヌクレアーゼは、病態を緩和するために、修飾すべきゲノム領域の特
定配列を標的とする。この配列は、エキソン、イントロン、プロモーター内の領域又は遺
伝子の機能不全発現を引き起こす、他の調整領域であってもよい。本出願で用いる「機能
不全発現」という用語は、遺伝子産物の生産が少なすぎる細胞又は遺伝子産物の生産が多
すぎる細胞又は異なる機能、例えば、必要機能の欠如又は必要以上の機能を持つ遺伝子産
物を生産する細胞による、遺伝子産物の異常な発現を意味する。
修飾領域に挿入される外因性核酸配列は、遺伝子を正常化する「修復」配列を提供する
ために使用することが可能である。遺伝子修復は、再生されるべき適正機能の実現を可能
とする遺伝子中に適正遺伝子配列を導入することによって実現される。これらの実施態様
では、挿入される核酸配列は、タンパクの全体コード配列であってもよいし又はある実施
態様では、修復されるべき領域のみを含む遺伝子断片であってもよい。他の実施態様では
、挿入される核酸配列は、異常発現または調整を引き起こす突然変異が修復されるように
、プロモーター配列または、その他の調整要素を含む。他の実施態様では、挿入される核
酸配列は、突然変異遺伝子には欠如する適切な翻訳終止コドンを含む。核酸配列はさらに
、適切な翻訳終止シグナルを欠如する組み換え遺伝子において翻訳を停止するための配列
を持つことが可能である。
それとは別に、核酸配列は、遺伝子の調整配列を破壊することによって又は遺伝子機能
を除去するサイレンサーを提供することによって、遺伝子機能を全く除去することが可能
である。ある実施態様では、外因性核酸配列は、遺伝子産物の発現を阻止するために翻訳
終止コドンを提供する。別の実施態様では、外因性核酸配列は、全長のＲＮＡ分子の発現
を阻止するために翻訳終止コドンを提供する。さらに別の実施態様では、遺伝子機能は、
非相同的末端接合を介して、塩基挿入、塩基欠失及び／又はフレームシフト突然変異を導
入することによって、メガヌクレアーゼによって直接破壊される。
多くの例において、病態の原因である標的細胞又は細胞集団に対し適切な遺伝子配列を
方向づけることが望ましい。治療薬の、このような標的指向は、健康な細胞が、治療薬に
よって標的とされることを防ぐ。これは、治療の効力を増し、一方では、治療が、健康な
細胞に及ぼす可能性のある、有害となる可能性のある作用を下げる。
興味の細胞に対する、組み換えメガヌクレアーゼ遺伝子及び挿入すべき興味の配列の輸
送は、様々の機構によって実現することが可能である。ある実施態様では、核酸は、ウィ
ルスの再生を阻止するように不活性化された特定のウィルス遺伝子を持つウィルスを介し
て細胞に輸送される。したがって、ウィルスは、標的細胞内に輸送され、維持されること
は可能であるが、標的細胞または組織の中で複製する能力は保持しないように変えられる
。ベクターのように活動するウィルスゲノムを生産ように、この変更ウィルスゲノムに、
一つ以上のＤＮＡ配列を挿入することが可能であるが、これらの配列は、宿主のゲノムの
中に導入されてその後発現されてもよいし、導入し発現されなくともよい。より具体的に
は、ある実施態様は、レトロウィルス、例えば、ただしこれらに限定されるものではない
が、ＭＦＧ又はＰＬＪベクターなどの採用を含む。ＭＦＧベクターは、単純化されたモロ
ニーマウス白血病ウィルスベクター（ＭＯＭＬＶ）であり、このベクターでは、複製欠損
とするために、ＰＯＬ及びＥＮＶタンパク質をコードするＤＮＡ配列は欠失される。ＰＬ
Ｊレトロウィルスベクターも、ＭＯＭＬＶの一形である（例えば、ＫＯＲＭＡＮ ＥＴ
ＡＬ．（１９８７）， ＰＲＯＣ．ＮＡＴ’Ｌ ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．，８４：２１５０－
２１５４）。別の実施態様では、組み換えアデノウィルス又はアデノ関連ウィルスを、輸
送ベクターとして使用することが可能である。
別の実施態様では、標的細胞に対する、組み換えメガヌクレアーゼタンパク質及び／又
は組み換えメガヌクレアーゼ遺伝子配列の輸送は、リポソームの使用によって実現される
。核酸及び／又はタンパク積載物を含むリポソームの生産は、従来技術で既知である（例
えば、ＬＡＳＩＣ ＥＴ ＡＬ．（１９９５），ＳＣＩＥＮＣＥ ２６７：１２７５－７
６）。イムノリポソームは、リポソームの中に、細胞関連抗原に対する抗体を含み、特定
の細胞タイプに対しメガヌクレアーゼのＤＮＡ配列、またはメガヌクレアーゼそのものを
輸送することが可能である（例えば、ＬＡＳＩＣ ＥＴ ＡＬ．（１９９５）， ＳＣＩ
ＥＮＣＥ ２６７：１２７５－７６；ＹＯＵＮＧ ＥＴ ＡＬ．（２００５），Ｊ．ＣＡ
ＬＩＦ．ＤＥＮＴ．ＡＳＳＯＣ．３３（１２）：９６７－７１；ＰＦＥＩＦＦＥＲ ＥＴ
ＡＬ．（２００６），Ｊ．ＶＡＳＣ．ＳＵＲＧ．４３（５）：１０２１－７を参照）。
リポソーム処方の生産および使用のための方法は、従来技術で周知である（例えば、米国
特許第６，３１６，０２４号、米国特許第６，３７９，６９９号、米国特許第６，３８７
，３９７号、米国特許第６，５１１，６７６号、および米国特許第６，５９３，３０８号
、およびそれらの中に引用される参考文献を参照）。ある実施態様では、リポソームは、
興味の配列の外、組み換えメガヌクレアーゼタンパク、または組み換えメガヌクレアーゼ
遺伝子配列を輸送するために使用される。
７． 病原体感染の治療法
本発明の局面はさらに、病原体による感染の治療法を提供する。病原性生物体としては
、ウィルス、例えば、ただしこれらに限定されるものではないが、単純ヘルペスウィルス
１、単純ヘルペスウィルス２、ヒト免疫不全ウィルス１、ヒト免疫不全ウィルス２、痘瘡
ウィルス、ポリオウィルス、エプスタインバーウィルスもしくはヒトパピローマウィルス
など、及び細菌生物体、例えば、これらに限定されるものではないが、ＢＡＣＩＬＬＵＳ
ＡＮＴＨＲＡＣＩＳ、ＨＡＥＭＯＰＨＩＬＵＳ種、ＰＮＥＵＭＯＣＯＣＣＵＳ種、ＳＴ
ＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ ＡＵＲＥＵＳ、ＳＴＲＥＰＴＯＣＯＣＣＵＳ種、メシシリン
耐性ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ ＡＵＲＥＵＳ及びＭＹＣＯＰＬＡＳＭＡ ＴＵＢＥ
ＲＣＵＬＯＳＩＳなどが挙げられる。病原生物体としてはさらに、真菌生物体、例えば、
ただしこれらに限定されるものではないが、ＣＡＮＤＩＤＡ、ＢＬＡＳＴＯＭＹＣＥＳ、
ＣＲＹＰＴＯＣＯＣＣＵＳ、およびＨＩＳＴＯＰＬＡＳＭＡ種などが挙げられる。
ある実施態様では、合理設計メガヌクレアーゼは、病原体ゲノム内の認識配列、例えば
、該病原体の増殖、生殖又は毒性にとって必須である、遺伝子または調整要素を標的とす
ることが可能である。ある実施態様では、認識配列は、細菌プラミド内にあってもよい。
病原体ゲノムの認識配列のメガヌクレアーゼ介在性切断は、非相同的末端接合を刺激する
ことによって、挿入、欠失又はフレームシフトの形で、標的必須遺伝子内の突然変異を刺
激することが可能である。それとは別に、細菌プラスミドの切断は、その上にコードされ
る任意の遺伝子、例えば、トキシン遺伝子（例えば、Ｂ．ＡＮＴＨＲＡＣＩＳ致死因子遺
伝子）又は抗生物質耐性遺伝子などと共にプラスミドの消失を招く可能性がある。前述の
ように、メガヌクレアーゼは、従来技術で一般的な技術を用いて、タンパク質又は核酸の
形で、感染患者、動物又は植物に輸送してよい。ある実施態様では、メガヌクレアーゼ遺
伝子は、病原体細菌類に輸送するために、バクテリオファージゲノムの中に組み込んでも
よい。
本発明の局面はさらに、ある形の癌の治療のための治療薬を提供する。ヒトのウィルス
は、多くの場合、腫瘍形成と関連するので（例えば、エプスタインバーウィルスと鼻咽頭
癌；ヒトパピローマウィルスと子宮頚部癌）、これらのウィルス性病原体の不活性化は、
癌の発達または進行を阻止することがある。それとは別に、合理設計メガヌクレアーゼに
よる、これらの腫瘍関連ウィルスのゲノムを標的とする、二本鎖切断点を用いて、ＤＮＡ
損傷反応経路を介してアポトーシスを誘発してもよい。このようにして、ウィルスゲノム
を抱える腫瘍細胞において選択的にアポトーシスを誘発することが可能となる場合がある
。
８． 遺伝子型分析法および病原体の特定
本発明の局面はさらに、インビトロ分子生物学研究および開発のためのツールを提供す
る。核酸、例えば、プラスミド、ＰＣＲ産物、ＢＡＣ配列、ＹＡＣ配列、ウィルス及び真
核および前核生物体由来のゲノム配列などの核酸の単離、クローニング及び操作のために
、部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を用いることは、従来技術で普通
のことである（例えば、ＡＵＳＵＢＥＬ ＥＴ ＡＬ．，「分子生物学における最近のプ
ロトコール（“ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩ
ＯＬＯＧＹ，”）」、ＷＩＬＥＹ １９９９を参照されたい）。したがって、ある実施態
様では、インビトロにおける核酸の操作に合理設計メガヌクレアーゼを使用してもよい。
例えば、同じＤＮＡ分子の中に一対の認識配列を認識する、合理設計メガヌクレアーゼは
、その後の操作、例えば、細菌プラスミド、ＢＡＣ又はＹＡＣへのコンタクトなどのため
の介在ＤＮＡセグメントを単離するのに使用することが可能である。
別の局面では、本発明は、病原遺伝子及び生物体特定用のツールを提供する。一実施態
様では、合理設計メガヌクレアーゼは、健康な対立遺伝子から病的対立遺伝子を区別する
ために、病気と相関する多型遺伝子領域において対応する認識部位を切断するために使用
することが可能である（例えば、ヒトのＣＦＴＲ遺伝子のΔＦ－５０８対立遺伝子を認識
する合理設計メガヌクレアーゼ、実施例４を参照）。この実施態様では、ヒトの患者、又
は他の生物体から単離されたＤＮＡ配列が、合理設計メガヌクレアーゼによって、場合に
よっては、追加の部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて消化され、得られたＤＮＡ断片
のパターンが、ゲル電気泳動、毛細管電気泳動、質量分析又はその他の従来技術で既知の
方法によって分析される。この断片化パターン及び具体的には合理設計メガヌクレアーゼ
による切断の有無は、ゲノム中に認識配列が存在するか否かを明らかにすることによって
該生物体の遺伝子型を示す。別の実施態様では、合理設計メガヌクレアーゼは、病原性ウ
ィルス、真菌、または細菌のゲノムにおける多型領域を標的とし、該生物体を特定するの
に使用される。この実施態様では、合理設計メガヌクレアーゼは、病原体に固有の認識配
列を切断するが（例えば、細菌における１６Ｓおよび２３ＳＲＲＮＡ遺伝子の間のスペー
サー領域；例えば、ＶＡＮ ＤＥＲ ＧＩＥＳＳＥＮ ＥＴ ＡＬ．（１９９４），ＭＩ
ＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ １４０：１１０３－１１０８を参照）、これを用いて、ゲノムの
エンドヌクレアーゼ消化及びそれに続く、電気泳動、質量分析、または、従来技術で既知
の、その他の方法による断片化パターンの分析に基づいて、他の、近縁生物体と区別する
ことが可能である。
９． 特注ＤＮＡ－結合ドメインの生産法
他の側面で、本発明は、エンドヌクレアーゼ切断活性を除去した合理設計ＤＮＡ－結合
タンパク質を提供する。合理設計メガヌクレアーゼの触媒活性の除去は、触媒に与るアミ
ノ酸を突然変異させることによって実行することが可能である（例えば、Ｉ－ＣＲＥＩに
おけるＱ４７のＥへの突然変異、ＣＨＥＶＡＬＩＥＲ ＥＴ ＡＬ．（２００１），ＢＩ
ＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，４３：１４０１５－１４０２６を参照）；Ｉ－ＳＣＥＩにおける
Ｄ４４またｈＤ１４５のＮへの突然変異；Ｉ－ＣＲＥＩにおけるＥ６６のＱへの突然変異
；Ｉ－ＭＳＯＩにおけるＤ２２のＮへの突然変異）。次に、この不活性化メガヌクレアー
ゼを別のタンパク質、例えば、ただしこれらに限定されるものではないが、転写アクチベ
ーター（例えば、ＧＡＬ４トランスアクチベーションドメイン、またはＶＰ１６トランス
アクチベーションドメイン）、転写リプレッサー（例えば、ＫＲＵＰＰＥＬタンパクのＫ
ＲＡＢドメイン）、ＤＮＡメチラーゼドメイン（例えば、Ｍ．ＣＶＩＰＩ、またはＭ．Ｓ
ＳＳＩ）、またはヒストンアセチルトランスフェラーゼ・ドメイン（例えば、ＨＤＡＣ１
、またはＨＤＡＣ２）などのエフェクタードメインに融合させることが可能である。もっ
とも著明なのとして加工されたジンクフィンガードメインがある、加工されたＤＮＡ結合
ドメイン及び、エフェクタードメインから成るキメラタンパクは、従来技術で既知である
（例えば、ＰＡＰＷＯＲＴＨ ＥＴ ＡＬ．（２００６），ＧＥＮＥ ３６６：２７－３
８参照）。
本発明は、下記の実施例によってさらに具体的に説明される。ただし、これらの実施例
を限定的なものと考えてはならない。当業者であれば、たかだか通例の実験操作を用いる
だけで、本出願に記載される特定物質および手順に対し数多くの等価物を認識し、確認す
ることが可能であろう。そのような等価物は、下記の実施例に先行する特許請求項の範囲
に含まれることが意図される。下記の実施例１－４は、Ｉ－ＣＲＥＩに基づく合理設計メ
ガヌクレアーゼを特異的に言及するが、その外、Ｉ－ＳＣＥＩ、Ｉ－ＭＳＯＩ、Ｉ－ＣＥ
ＵＩに基づく合理設計メガヌクレアーゼ及びその他のＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアー
ゼも、本出願に記載するように、同様に生産し、使用することが可能である。
ＨＩＶ－１ ＴＡＴ遺伝子を認識するメガヌクレアーゼの合理設計
１． メガヌクレアーゼの設計
一対のメガヌクレアーゼが、ＨＩＶ－１ ＴＡＴ遺伝子に認められるＤＮＡ部位５’－
ＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＧＴＣＡ－３’（配列番号１５）を認識し、切断
するように設計された。表５に従って、二つのメガヌクレアーゼ、ＴＡＴ１及びＴＡＴ２
が、下記の塩基接触部（非ＷＴ接触部は太字で表す）を用い、それぞれ、半分部位５’－
ＧＡＡＧＡＧＣＴＣ－３’（配列番号１６）、および５’－ＴＧＡＣＴＧＴＴＣ－３’（
配列番号１７）に結合するように設計された。
ＴＡＴ１：
ＴＡＴ２：
二つの酵素はクローンされ、大腸菌において発現され、下記に記載するように、対応す
るＤＮＡ認識配列に対する酵素活性について定量された。いずれの場合も、合理設計メガ
ヌクレアーゼは、不活性であることが認められた。次に、ＤＮＡバックボーンとの接触を
向上させるためＥ８０をＱに突然変異させた、それぞれの第２世代を生産した。この第２
世代ＴＡＴ２酵素は、その意図される認識配列に対し活性を持つことが認められたが、一
方、ＴＡＴ１酵素は不活性のままであった。野生型Ｉ－ＣＲＥＩとの共晶構造の肉眼検査
から、ＴＡＴ１は、Ｒ４０とＫ２８の間の立体障害のために不活性であることが示唆され
た。この衝突を緩和するため、Ｋ２８をより小さい側鎖を持つアミノ酸（Ａ、Ｓ、Ｔ又は
Ｃ）に突然変異させ、一方、Ｑ８０突然変異はそのまま維持させた、ＴＡＴ１変種を生産
した。これらの酵素をＥ．ＣＯＬＩにおいて生産し、定量したところ、Ｓ２８及びＴ２８
を有するＴＡＴ１変種は、共に、所望の認識配列に対して活性を持つが、一方、位置－７
において所望の塩基指向性を維持することが認められた。
２． 組み換えメガヌクレアーゼの構築
再設計Ｉ－ＣＲＥＩ酵素のための突然変異を、重複ＰＣＲ戦略において突然変異誘発性
プライマーを用いて導入した。一次ＰＣＲで生成されたＩ－ＣＲＥＩの組み換えＤＮＡ断
片を、二次ＰＣＲにおいて接合し、全長の組み換え核酸を生産した。組み換えＩ－ＣＲＥ
Ｉ構築体は全て、精製用遺伝子の３‘末端に、６個のヒスチジンタグを融合させたＰＥＴ
２１Ａベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ ＣＯＲＰ．，ＳＡＮ ＤＩＥＧＯ、カリフォルニア州
）にクローンした。核酸配列は全て、サンガーのジデオキシヌクレオチド配列決定法（Ｓ
ＡＮＧＥＲ ＥＴ ＡＬ．（１９７７），ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳ
Ａ．７４（１２）：５４６３－７を参照）を用いて確認した。
野生型Ｉ－ＣＲＥＩ及び全ての加工メガヌクレアーゼは、下記の方法を用いて発現し、
精製した。ＰＥＴ２１Ａベクターにクローンした構築体は、化学的にコンピテントとした
ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＬＹＳＳにおいて形質転換され、２００μＧ／ＭＬのカルバニシリ
ンを含む、２ Ｘ ＹＴプレートに撒いた。一晩育成の後、形質転換細菌コロニーを、プ
レートから掻き落とし、それを用いて５０ ＭＬ の２ＸＹＴブロスに接種した。細胞を
、波長６００ＮＭにおいて光学的濁度が０．９に達するまで、振とうしながら３７℃で育
成した。次に、育成温度を３７℃から２２℃に下げた。タンパク質の発現は、１ＭＭ Ｉ
ＰＴＧを添加することによって誘発し、細胞は、振とうしながら２時間半インキュベート
した。次に、１０分間６０００ Ｘ Ｇの遠心によって細胞をペレットとした。ペレット
を、１ＭＬの結合バッファー（２０ＭＭ ＴＲＩＳ－ＨＣＬ，ＰＨ８．０，５００ＭＭ
ＮＡＣＬ，１０ＭＭイミダゾール）において渦巻き攪拌によって再縣濁させた。次に、細
胞を、５０％電力における１２パルスの超音波処理によって破壊し、細胞砕片を、１５分
間１４，０００ Ｘ Ｇの遠心によってペレットとした。細胞上清を、４ＭＬの結合バッ
ファーで希釈し、２００μＬのニッケル充填金属キレート性セファローズカラム（ＰＨＡ
ＲＭＡＣＩＡ）に負荷した。
次いで、カラムを、４ＭＬの洗浄バッファー（２０ＭＭ ＴＲＩＳ ＨＣＬ，ＰＨ８．
０，５００ＭＭ ＮＡＣＬ，６０ＭＭイミダゾール）及び０．２ＭＬの溶出バッファー（
２０ＭＭ ＴＲＩＳ－ＨＣＬ，ＰＨ８．０，５００ＭＭ ＮＡＣＬ，４００ＭＭイミダゾ
ール）で洗浄した。メガヌクレアーゼ酵素は、さらに０．６ＭＬの溶出バッファーを添加
することによって溶出し、ＶＩＶＯＳＰＩＮディスポーザブル濃縮器（ＩＳＣ，ＩＮＣ．
，ＫＡＹＳＶＩＬＬＥ，ユタ州）を用いて５０－１３０μＬとなるまで濃縮した。酵素は
、ＺＥＢＡスピン脱塩カラム（ＰＩＥＲＣＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ．，
ＲＯＣＫＦＯＲＤ、イリノイ州）を用い、定量および保存のためにＳＡバッファー（２５
ＭＭ ＴＲＩＳ－ＨＣＬ，ＰＨ８．０，１００ＭＭ ＮＡＣＬ，５ＭＭ ＭＧＣＬ２，５
ＭＭ ＥＤＴＡ）と交換した。酵素濃度は、２３，５９０Ｍ－１ＣＭ－１の吸光係数を用
い２８０ＮＭにおける吸収によって決めた。次に、酵素の純度および分子量は、ＭＡＬＤ
Ｉ－ＴＯＦ質量分析によって確認した。
ヘテロダイマー酵素は、二つのタンパクを独立に精製し、それらをインビトロで混合す
ることによって又は大腸菌における二つのタンパクの縦列発現用人工オペロンを構築する
ことによって生産した。前者の場合、精製メガヌクレアーゼを、溶液中で１：１で混合し
、ＤＮＡ基質の添加２０分前に４２℃で予備インキュベーションした。後者の場合、二つ
の遺伝子を、ＮＤＥＩ／ＥＣＯＲＩ及びＥＣＯＲＩ／ＨＩＮＤＩＩＩを用いて順次ＰＥＴ
－２１Ａ発現ベクターにクローンした。１２塩基対の核酸スペーサー及びＰＥＴ２１ベク
ター由来のシャイン－デルガルノ配列が、人工オペロン中の第１及び第２遺伝子を隔てた
。
３． 切断アッセイ
前述のように精製した酵素は全て、メガヌクレアーゼの認識配列を含む、直線状の２本
鎖ＤＮＡ基質とインキュベーションすることによって活性について定量した。認識配列の
センス及びアンチセンスの両鎖に対応する合成オリゴヌクレオチドをアニールし、平滑末
端コンタクトによって、ＰＵＣ１９プラスミドのＳＭＡＩ部位にクローンした。このクロ
ーンされた結合部位の配列は、サンガーのジデオキシヌクレオチド配列決定法によって確
認した。プラスミド基質は、全て、メガヌクレアーゼ消化と同時に、ＸＭＮＩ、ＳＣＡＩ
、またはＢＰＭＩによって直線化された。この酵素消化物は、５μＬの０．０５μＭ Ｄ
ＮＡ基質、２．５μＬの５μＭ組み換えＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼ、９．５μＬのＳ
Ａバッファー及び０．５μＬのＸＭＮＩ、ＳＣＡＩ又はＢＰＭＩを含んでいた。消化物は
、３７℃で又はあるメガヌクレアーゼ酵素用として４２℃で、４時間インキュベートした
。消化は、０．３ＭＧ／ＭＬのプロテイナーゼＫ及び０．５％ＳＤＳを加えることによっ
て停止させ、３７℃で１時間インキュベートした。消化物を、１．５％アガロースにおい
て分析し、臭化エチジウム染色によって視像化した。
メガヌクレアーゼ半分部位の指向性を評価するために、合理設計メガヌクレアーゼを、
意図する半分部位の完全パリンドロームに対応する、一組のＤＮＡ基質のほか、この半分
部位における２７通りの可能な単一塩基対置換の内の一つとインキュベートした。
４． 認識配列－特異性
精製組み換えＴＡＴ１およびＴＡＴ２メガヌクレアーゼは、野生型メガヌクレアーゼ配
列とは異なるＤＮＡを認識した（図２（Ｂ））。野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼは
、ＷＴ認識配列を切断するが、ＴＡＴ１のために意図された配列、ＴＡＴ２のために意図
された配列のいずれも切断しない。同様に、ＴＡＴ１及びＴＡＴ２は、その意図された認
識配列は切断するが、野生型配列は切断しない。次に、これらのメガヌクレアーゼを、半
分部位指向性および全体特異性について評価した（図３）。野生型Ｉ－ＣＲＥＩは、その
天然の半分部位における単一塩基対置換についてきわめて耐性が高いことが認められた。
一方、ＴＡＴ１及びＴＡＴ２は、きわめて特異的で、ＴＡＴ１の場合は、位置－１、－２
、－３、－６及び－８において、ＴＡＴ２の場合は、位置－１、－２及び－６における塩
基置換に対して完全に耐性を持たなかった。
変更ＤＮＡ－結合親和度を持つメガヌクレアーゼの合理的設計
１． 親和度を上昇および活性を上昇させたメガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼＣＣＲ１およびＢＲＰ２を、それぞれ、半分部位５’－ＡＡＣＣＣＴ
ＣＴＣ－３’（配列番号１８）および５’－ＣＴＣＣＧＧＧＴＣ－３’（配列番号１９）
を切断するように設計した。これらの酵素を、実施例１の場合と同様、表１に従って生産
した。
ＣＣＲ１：
ＢＲＰ２：
両酵素を大腸菌において発現させ、精製し、実施例１と同様にして定量した。両第１世
代酵素は、天然の認識配列を持つ野生型Ｉ－ＣＲＥＩの速度よりも相当に低い速度で、そ
の意図された認識配列を切断することが認められた。活性におけるこの低下を緩和するた
めに、ＣＣＲ１およびＢＲＰ２のＤＮＡ－結合親和度を、両酵素においてＥ８０をＱに突
然変異させることによって上昇させた。これらの、ＣＣＲ１及びＢＲＰ２の第２世代バー
ジョンは、触媒速度をはっきりと上昇させて、その意図された認識配列を切断することが
認められた。
２． ＤＮＡ－結合親和度を低下させ、活性を低下させたが、特異性を上昇させたメガヌ
クレアーゼ
野生型Ｉ－ＣＲＥＩは、その半分部位に対する置換に対して高い耐性を持つことが認め
られている（図３（Ａ））。この酵素の特異性をさらに高めるための試みとして、通常、
ＤＮＡバックボーンのリン酸塩と塩橋を造る、酵素の位置１１６のリシンを、アスパラギ
ン酸に突然変異させてＤＮＡ－結合親和度を下げた。この合理設計酵素の、野生型認識配
列に対する切断は、はっきりと低下していたが、この組み換え酵素の特異性は、野生型よ
りも相当に高かった。Ｋ１１６Ｄ変種の半分部位の指向性を、実施例１と同様に評価した
ところ、この酵素は、位置－１、－２及び－３における天然半分部位からの逸脱に対して
は全く耐性を持たないことが認められ、半分部位の残りの６位置では、少なくとも部分的
な塩基指向性を示した（図３（Ｂ））。
合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー
１． 溶液の中で形成されたメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーによる非パリンドローム
ＤＮＡ部位の切断
二つのメガヌクレアーゼＬＡＭ１及びＬＡＭ２が、それぞれ、半分部位５’－ＴＧＣＧ
ＧＴＧＴＣ－３’（配列番号２０）及び５’－ＣＡＧＧＣＴＧＴＣ－３’（配列番号２１
）を切断するように設計された。これら二つの酵素から成るヘテロダイマーは、バクテリ
オファージλ Ｐ０５遺伝子に見られるＤＮＡ配列５’－ＴＧＣＧＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧ
ＡＣＡＧＣＣＴＧ－３’（配列番号２２）を認識することが予想された。
ＬＡＭ１：
ＬＡＭ２：
ＬＡＭ１及びＬＡＭ２は、実施例１に記載されるように、クローンし、大腸菌において
発現し、個別に精製した。次に、二つの酵素を１:１で混合し、４２℃で２０分インキュ
ベートし、二つの酵素が、サブユニットを交換し、再度平衡に達するのを可能とした。Ｌ
ＡＭ１ホモダイマー、ＬＡＭ２ホモダイマー及びＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロダイマーの混
合物と予想される、得られた酵素液を、ＬＡＭ１半分部位の完全パリンドローム、ＬＡＭ
２半分部位の完全パリンドローム及びバクテリオファージλゲノムに認められる非パリン
ドロームハイブリッド部位に対応する、３種の異なる認識配列と共にインキュベートした
。精製ＬＡＭ１酵素単独は、ＬＡＭ１パリンドローム部位を切断するが、ＬＡＭ２パリン
ドローム部位も、ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位も切断しない。同様に、精製ＬＡ
Ｍ２酵素単独は、ＬＡＭ２パリンドローム部位を切断するが、ＬＡＭ１部位も、ＬＡＭ１
／ＬＡＭ２ハイブリッド部位も切断しない。しかしながら、ＬＡＭ１及びＬＡＭ２の１：
１混合物は、３種全てのＤＮＡ部位を切断する。ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位の
切断は、二つの、異なる、再設計メガヌクレアーゼが溶液の中で混合されて、非パリンド
ローム的ＤＮＡ部位を切断することが可能なヘテロダイマー酵素を形成することが可能で
あることを示す。
２．共時発現によって形成されるメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーによる非パリンドロ
ームＤＮＡ部位の切断
前述のＬＡＭ１及びＬＡＭ２酵素をコードする遺伝子は、実施例１において記載したよ
うに、大腸菌における同時発現のためにオペロンの中に配置された。この共時発現酵素は
、実施例１と同様に精製され、かつ、酵素混合物は、前述の、三つの可能性のある認識配
列とインキュベートされた。この共時発現酵素は、ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位
を含む三つ全ての部位を切断することが認められたが、これは、二つの、異なる合理設計
メガヌクレアーゼが共時発現されて、非パリンドロームＤＮＡ部位を切断することが可能
なヘテロダイマー酵素を形成することを示す。
３．タンパク－タンパクインターフェイスを修飾されたメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマ
ーによる、非パリンドロームＤＮＡ部位の優先的切断
非パリンドロームＤＮＡ部位の切断を必要とする応用のために、異なる（パリンドロー
ム的）ＤＮＡ部位を認識し、切断するホモダイマーの形成を最小に留めながら、酵素ヘテ
ロダイマーの形成を増進することが望ましい。このために、位置７、５７及び９６におけ
るリシンがグルタミン酸に変更されたＬＡＭ１酵素の変種が生産された。次に、この酵素
を、位置８及び６１のグルタミン酸をリシンに変えたＬＡＭ２の変種と、前述と同様に共
時発現し、精製した。この場合、ＬＡＭ１ホモダイマーの形成は、一方のモノマーにおけ
るＥ７、Ｅ５７及びＥ９６と、他方のモノマーにおけるＥ８及びＥ６１の間における静電
気的反発によって低下すると予想された。同様に、ＬＡＭ２ホモダイマーの形成は、一方
のモノマーにおけるＫ７、Ｋ５７及びＫ９６と、他方のモノマーにおけるＫ８及びＫ６１
の間における静電気的反発によって低下すると予想された。逆に、ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘ
テロダイマーは、ＬＡＭ１におけるＥ７、Ｅ５７、およびＥ９６、およびＬＡＭにおける
Ｋ８及びＫ６１の間の静電気的牽引によって好まれることが予想された。インターフェイ
スが修飾されたこの二つのメガヌクレアーゼが、前述のように、共時発現され、定量され
ると、ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位が、二つのパリンドローム部位に対し優先的
に切断されることが認められた。これは、メガヌクレアーゼのタンパク－タンパクインタ
ーフェイスにおける置換が、ヘテロダイマーの優先的形成の駆動が可能であることを示す
。
生理的ＤＮＡ配列を切断する、追加のメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー
１．遺伝子治療に関連するＤＮＡ配列を切断するメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー
軟骨無形成症を引き起こす突然変異である、ヒトのＦＧＲ３遺伝子における配列５’－
ＣＴＧＧＧＡＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧ－３’（配列番号２３）を切断する、合
理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー（ＡＣＨ１／ＡＣＨ２）を生産することが可能
である。例えば、前述したように、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接
触残基および認識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＡＣＨ１：
ＡＣＨ２：
ヒトの成長ホルモン遺伝子のプロモーターにおいて配列５’－ＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＣ
ＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号２４）を切断する合理設計メガヌクレアーゼ・
ヘテロダイマー（ＨＧＨ１／ＨＧＨ２）を生産することが可能である。例えば、前述した
ように、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分
部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＨＧＨ１：
ＨＧＨ２：
ヒトのＣＦＴＲ遺伝子のΔＦ５０８対立遺伝子における５’－ＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴ
ＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴ－３’（配列番号２５）を切断する合理設計メガヌクレアーゼ・
ヘテロダイマー（ＣＦ１／ＣＦ２）を生産することが可能である。例えば、前述したよう
に、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分部位
を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＣＦ１：
ＣＦ２：
ヒトのＣＣＲ５遺伝子（ＨＩＶコレセプター）の配列５’－ＡＡＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧ
ＴＧＡＧＡＴＧＣＣＴ－３’（配列番号２６）を切断する合理設計メガヌクレアーゼ・ヘ
テロダイマー（ＣＣＲ１／ＣＣＲ２）を生産することが可能である。例えば、前述したよ
うに、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分部
位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＣＣＲ１：
ＣＣＲ２：
ヒトのＤＭキナーゼ遺伝子の３´非翻訳領域における５’－ＧＡＣＣＴＣＧＴＣＣＴＣ
ＣＧＡＣＴＣＧＣＴＧ－３’（配列番号２７）を切断する合理設計メガヌクレアーゼ・ヘ
テロダイマー（ＭＹＤ１／ＭＹＤ２）を生産することが可能である。例えば、前述したよ
うに、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分部
位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＭＹＤ１：
ＭＹＤ１：
２．病原体ゲノムのＤＮＡ配列を切断するメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー
単純ヘルペスウィルス－１および単純ヘルペスウィルス－２のＵＬ３６遺伝子の配列５
’－ＣＴＣＧＡＴＧＴＣＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＡ－３’（配列番号２８）を切断する
合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー（ＨＳＶ１／ＨＳＶ２）を生産することが可
能である。例えば、前述したように、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の
接触残基および認識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＨＳＶ１：
ＨＳＶ２：
ＢＡＣＩＬＬＵＳ ＡＮＴＨＲＡＣＩＳゲノムの配列５’－ＡＣＡＡＧＴＧＴＣＴＡＴ
ＧＧＡＣＡＧＴＴＴＡ－３’（配列番号２９）を切断する合理設計メガヌクレアーゼ・ヘ
テロダイマー（ＡＮＴ１／ＡＮＴ２）を生産することが可能である。例えば、前述したよ
うに、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分部
位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＡＮＴ１：
ＡＮＴ２：
痘瘡（天然痘）ウィルスＧＰ００９遺伝子の配列５’－ＡＡＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＴＧ
ＡＣＡＴＣＧＣＡ－３’（配列番号３０）を切断する合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロ
ダイマー（ＰＯＸ１／ＰＯＸ２）を生産することが可能である。例えば、前述したように
、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分部位を
持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＰＯＸ１：
ＰＯＸ２：
エプスタインバーウィルスＢＡＬＦ２遺伝子の配列５’－ＣＧＧＧＧＴＣＴＣＧＴＧＣ
ＧＡＧＧＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３１）を切断する合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテ
ロダイマー（ＥＢＢ１／ＥＢＢ２）を生産することが可能である。例えば、前述したよう
に、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分部位
を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＥＢＢ１：
ＥＢＢ１：
３．植物ゲノムにおけるＤＮＡ配列を切断するメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー
ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳＴＨＡＬＩＡＮＮＡ ＧＬ２遺伝子の配列５’－ＣＡＣＴＡＡ
ＣＴＣＧＴＡＴＧＡＧＴＣＧＧＴＧ－３’（配列番号３２）を切断する合理設計メガヌク
レアーゼ・ヘテロダイマー（ＧＬＡ１／ＧＬＡ２）を生産することが可能である。例えば
、前述したように、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認
識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＧＬＡ１：
ＧＬＡ２：
ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ ＴＨＡＬＩＡＮＮＡ ＢＰ１遺伝子の配列５’－ＴＧＣＣＴ
ＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＣＣＧＧＡＧ－３’（配列番号３３）を切断する合理設計メガヌ
クレアーゼ・ヘテロダイマー（ＢＲＰ１／ＢＲＰ２）を生産することが可能である。例え
ば、前述したように、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および
認識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＢＲＰ１：
ＢＲＰ２：
ＮＩＣＯＴＩＡＮＡ ＴＡＢＡＣＵＭマグネシウムケラターゼ遺伝子の配列５’－ＴＡ
ＡＡＡＴＣＴＣＴＡＡＧＧＴＣＴＧＴＧＣＡ－３’（配列番号３４）を切断する合理設計
メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー（ＭＧＣ１／ＭＧＣ２）を生産することが可能である
。例えば、前述したように、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基
および認識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＭＧＣ１：
ＭＧＣ２：
ＮＩＣＯＴＩＡＮＡ ＴＡＢＡＣＵＭ ＣＹＰ８２Ｅ４遺伝子の配列５’－ＣＡＡＧＡ
ＡＴＴＣＡＡＧＣＧＡＧＣＡＴＴＡＡ－３’（配列番号３５）を切断する合理設計メガヌ
クレアーゼ・ヘテロダイマー（ＣＹＰ／ＨＧＨ２）を生産することが可能である。例えば
、前述したように、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認
識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＣＹＰ：
ＨＧＨ２：
４．酵母ゲノムにおけるＤＮＡ配列を切断するメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー
ＳＡＣＣＨＡＲＯＭＹＣＥＳ ＣＥＲＥＶＩＳＩＡＥ ＵＲＡ３遺伝子の配列５’－Ｔ
ＴＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＧＡＣＧＣＡＴ－３’（配列番号３６）を切断する合理設
計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー（ＵＲＡ１／ＵＲＡ２）を生産することが可能であ
る。例えば、前述したように、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残
基および認識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ＵＲＡ１：
ＵＲＡ２：
５．認識配列特異性
本実施例において上に概説した合理設計メガヌクレアーゼを、実施例１と同様にして、
クローンし、大腸菌において発現し、精製した。次いで、各精製メガヌクレアーゼを、そ
のヘテロダイマー形成パートナー（例えば、ＡＣＨ１をＡＣＨ２と、ＨＧＨ１をＨＧＨ２
と、など）と１：１で混合し、各メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーのために意図される
非パリンドロームＤＮＡ認識配列を含む、直線化ＤＮＡ基質とインキュベートした。図３
に示すように、各合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーは、その意図されたＤＮＡ
部位を切断する。
図１（Ａ）は、結晶学データに基づいて、Ｉ－ＣＲＥＩホモダイマー及びその天然の２本鎖認識配列の相互作用を示す。本模式図は、二つの卵形として示すホモダイマーによって結合される、図示目的のためだけに巻き戻された状態で示される認識配列（配列番号２及び配列番号３）を描いたものである。各ＤＮＡ半分部位の塩基には、－１から－９までの番号がふられ、認識表面を形成する、Ｉ－ＣＲＥＩのアミノ酸残基は、１文字アミノ酸表示および残基位置を示す数字によって表される。実線：ＤＮＡ塩基に対する水素結合。鎖線：酵素設計では新たな接触点を形成するが、野生型複合体ではＤＮＡと接触しないアミノ酸位置。矢印：ＤＮＡバックボーンと相互作用を持ち、切断活性に影響を及ぼす残基。また、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）の右側の切断半分部位の－４位置におけるＡ－Ｔ塩基対間の野生型接触を示す。具体的に言うと、残基Ｑ２６が、Ａ塩基と相互作用を持つところが示される。残基Ｉ７７は、該塩基対に近接するが、特異的相互作用は持たない。更に、図１（Ｃ）は、残基Ｉ７７が修飾されてＥ７７に変更された、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの、合理設計変種との間の相互作用を示す。この変更の結果、－４位置ではＧ－Ｃ塩基対が好まれる。Ｑ２６とＧ塩基との間の相互作用は、図１（Ａ）の左側の切断半分部位において結晶学的に観察されるように、水分子によって仲介される。更に又、図１（Ｄ）は、残基Ｑ２６が修飾されてＥ２６に変更され、残基Ｉ７７が修飾されてＲ７７に変更された、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの合理設計変種との間の相互作用を示す。この変更の結果、－４位置ではＧ－Ｃ塩基対が好まれる。そして更に、図１（Ｅ）は、残基Ｑ２６が修飾されてＡ２６に変更され、残基Ｉ７７が修飾されてＱ７７に変更された、Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの合理設計変種との間の相互作用を示す。この変更の結果、－４位置ではＴ－Ａ塩基対が好まれる。 図２（Ａ）は、野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼ（ＷＴ）及び本発明の１１種の合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーそれぞれの一認識配列の比較を示す。ＷＴ認識配列に対して保存される塩基には陰影を施す。９ＢＰの半分部位は太字で示す。ＷＴ：野生型（配列番号４）；ＣＦ：多くの嚢胞性線維症例の原因となる、ヒトＣＦＴＲ遺伝子のΔＦ５０８対立遺伝子（配列番号２５）；ＭＹＤ：筋緊張性ジストロフィーと関連するヒトＤＭキナーゼ遺伝子；ＣＣＲ：ヒトＣＣＲ５遺伝子（大型ＨＩＶコレセプター）（配列番号２６）；ＡＣＨ；軟骨無形成症と相関するヒトのＦＧＦＲ３遺伝子（配列番号２３）；ＴＡＴ：ＨＩＶ－１ＴＡＴ／ＲＥＶ遺伝子（配列番号１５）；ＨＳＶ：ＨＳＶ－１ ＵＬ３６遺伝子（配列番号２８）；ＬＡＭ：バクテリオファージλ Ｐ０５遺伝子（配列番号２２）；ＰＯＸ：痘瘡（天然痘）ウィルスＧＰ００９遺伝子（配列番号３０）；ＵＲＡ：ＳＡＣＣＨＡＲＯＭＹＣＥＳ ＣＥＲＶＩＳＩＡＥ ＵＲＡ３遺伝子（配列番号３６）；ＧＬＡ：ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ ＴＨＡＬＩＡＮＡ ＧＬ２遺伝子（配列番号３２）；ＢＲＰ：ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳＴＨＡＬＩＡＮＡ ＢＰ－１遺伝子（配列番号３３）。図２（Ｂ）は、野生型Ｉ－ＣＲＥＩ（ＷＴ）及び１１種の合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーのそれぞれと、１２種全ての酵素の認識部位を担持するプラスミドと、３７℃で６時間インキュベートした場合の結果を示す。各ボックスに切断パーセントが示される。 図３は、野生型および合理設計Ｉ－ＣＲＥＩホモダイマーの切断パターンを示す。（Ａ）野生型Ｉ－ＣＲＥＩ。（Ｂ）Ｉ－ＣＲＥＩＫ１１６Ｄ。（Ｃ－Ｌ）本発明の合理設計メガヌクレアーゼ。酵素は、２７通りの対応する単一塩基対変動を持つ、意図される切断半分部位のパリンドロームを担持する、一組のプラスミドと共にインキュベートした。黒色バー：表１に基づいて予想される切断パターン。灰色バー：予想される切断パターンから変位するＤＮＡ部位。円は、意図される認識部位における塩基を示す。さらに、２時間における切断の時間経過も示される。ＣおよびＬにおける白抜き円の時間経過プロットは、Ｅ８０Ｑ突然変異を欠くＣＣＲ１およびＢＲＰ２酵素による切断に対応する。切断部位は、図２（Ａ）に記載されるヘテロダイマー酵素の、５’（左コラム）、および３’（右コラム）半分部位に対応する。
Figure 2024001024000048
Figure 2024001024000049
Figure 2024001024000050
Figure 2024001024000051
Figure 2024001024000052
Figure 2024001024000053
Figure 2024001024000054

Claims (48)

  1. 野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対
    する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対し少なくとも８５％
    の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
    配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５から成る群より選ばれるＩ－ＣＲ
    ＥＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分
    部位に対して特異性を有し、
    排外的修飾ではない表５の少なくとも一つの修飾を含む、組み換えメガヌクレアーゼ。
  2. 野生型Ｉ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対
    する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの残基６－１６０に対し少なくとも８５％
    の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
    配列番号７及び配列番号８から成る群より選ばれるＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼ認識
    配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分部位に対して特異性を有し
    、
    排外的修飾ではない表７の少なくとも一つの修飾を含む、組み換えメガヌクレアーゼ。
  3. 野生型Ｉ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼと比べ、認識配列に対する特異性が変更された組
    み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号９のＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼの残基３－１８６に対し少なくとも８５％
    の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
    配列番号１０及び配列番号１１から成る群より選ばれるＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼ
    認識配列と、少なくとも１塩基対異なる認識配列に対して特異性を有し、
    排外的修飾ではない表９の少なくとも一つの修飾を含む、組み換えメガヌクレアーゼ。
  4. 野生型Ｉ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対
    する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号１２のＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの残基５－２１１に対し少なくとも８５
    ％の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
    配列番号１３及び配列番号１４から成る群より選ばれるＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼ
    認識配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分部位に対して特異性を
    有し、
    排外的修飾ではない表１１の少なくとも一つの修飾を含む、組み換えメガヌクレアーゼ
    。
  5. 野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対
    する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対し少なくとも８５％
    の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
    配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５から成る群より選ばれるＩ－ＣＲ
    ＥＩメガヌクレアーゼ認識配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分
    部位に対して特異性を有し、
    （１）位置－１における特異性が、
    （Ａ）Ｑ７０、Ｃ７０、Ｌ７０、Ｙ７５、Ｑ７５、Ｈ７５、Ｈ１３９、Ｑ４６及びＨ
    ４６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＴに変更され；
    （Ｂ）Ｙ７５、Ｌ７５、Ｃ７５、Ｙ１３９、Ｃ４６及びＡ４６から成る群より選ばれ
    る修飾によって、センス鎖においてＡに変更され；
    （Ｃ）Ｋ７０、Ｅ７０、Ｅ７５、Ｅ４６及びＤ４６から成る群より選ばれる修飾によ
    って、センス鎖においてＧに変更され、
    （Ｄ）Ｈ７５、Ｒ７５、Ｈ４６、Ｋ４６及びＲ４６から成る群より選ばれる修飾によ
    って、センス鎖においてＣに変更され、又は、
    （Ｅ）Ｇ７０、Ａ７０、Ｓ７０及びＧ４６から成る群より選ばれる修飾によって、セ
    ンス鎖において任意の塩基に変更され；
    及び／又は
    （２）位置－２における特異性が、
    （Ａ）Ｑ７０、Ｔ４４、Ａ４４、Ｖ４４、Ｉ４４、Ｌ４４及びＮ４４から成る群より
    選ばれる修飾によって、センス鎖においてＡに変更され；
    （Ｂ）Ｅ７０、Ｄ７０、Ｋ４４及びＲ４４から成る群より選ばれる修飾によって、セ
    ンス鎖においてＣに変更され；
    （Ｃ）Ｈ７０、Ｄ４４及びＥ４４から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＧに変更され；又は、
    （Ｄ）Ｃ４４を含む修飾によって、センス鎖においてＡ又はＴに変更され；
    及び／又は、
    （３）位置－３における特異性が、
    （Ａ）Ｑ６８及びＣ２４から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＡ
    に変更され；
    （Ｂ）Ｅ６８、Ｆ６８、Ｋ２４及びＲ２４から成る群より選ばれる修飾によって、セ
    ンス鎖においてＣに変更され；
    （Ｃ）Ｍ６８、Ｃ６８、Ｌ６８及びＦ６８から成る群より選ばれる修飾によって、セ
    ンス鎖においてＴに変更され；
    （Ｄ）Ｈ６８を含む修飾によってセンス鎖においてＡ又はＣに変更され；
    （Ｅ）Ｙ６８を含む修飾によってセンス鎖においてＣ又はＴに変更され；
    （Ｆ）Ｋ６８を含む修飾によってセンス鎖においてＧ又はＴに変更され；
    及び／又は、
    （４）位置－４における特異性が、
    （Ａ）Ｅ７７及びＫ２６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣ
    に変更され；
    （Ｂ）Ｅ２６及びＲ７７から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧ
    に変更され；
    （Ｃ）Ｓ７７を含む修飾によってセンス鎖においてＣ又はＴに変更され；又は、
    （Ｄ）Ｓ２６を含む修飾によってセンス鎖において任意の塩基に変更され；
    及び／又は、
    （５）位置－５における特異性が、
    （Ａ）Ｅ４２を含む修飾によってセンス鎖においてＣに変更され；
    （Ｂ）Ｒ４２を含む修飾によってセンス鎖においてＧに変更され；
    （Ｃ）Ｃ２８及びＱ４２から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＡ
    又はＣに変更され；又は、
    （Ｄ）Ｍ６６及びＫ６６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖において任
    意の塩基に変更され；
    及び／又は、
    （６）位置－６における特異性が、
    （Ａ）Ｃ４０、Ｉ４０、Ｖ４０、Ｃ７９、Ｉ７９、Ｖ７９及びＱ２８から成る群より
    選ばれる修飾によって、センス鎖においてＴに変更され；
    （Ｂ）Ｅ４０及びＲ２８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣ
    に変更され；
    （Ｃ）Ｒ４０を含む修飾によってセンス鎖においてＧに変更され；
    及び／又は、
    （７）位置－７における特異性が、
    （Ａ）Ｅ３８、Ｋ３０及びＲ３０から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＣに変更され；
    （Ｂ）Ｋ３８、Ｒ３８及びＥ３０から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＧに変更され；
    （Ｃ）Ｉ３８及びＬ３８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＴ
    に変更され；
    （Ｄ）Ｃ３８を含む修飾によってセンス鎖においてＡ又はＧに変更され；
    （Ｅ）Ｈ３８、Ｎ３８及びＱ３０から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいて任意の塩基に変更され；
    及び／又は、
    （８）位置－８における特異性が、
    （Ａ）Ｌ３３、Ｖ３３、Ｉ３３、Ｆ３３及びＣ３３から成る群より選ばれる修飾によ
    って、センス鎖においてＴに変更され；
    （Ｂ）Ｅ３３及びＤ３３から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣ
    に変更され；
    （Ｃ）Ｋ３３から成る修飾によってセンス鎖においてＧに変更され；
    （Ｄ）Ｒ３２を含む修飾によってセンス鎖においてＡ又はＣに変更され；
    （Ｅ）Ｒ３３を含む修飾によってセンス鎖においてＡ又はＧに変更され；
    及び／又は、
    （９）位置－９における特異性が、
    （Ａ）Ｅ３２を含む修飾によってセンス鎖においてＣに変更され；
    （Ｂ）Ｒ３２及びＫ３２から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧ
    に変更され；
    （Ｃ）Ｌ３２、Ｖ３２、Ａ３２及びＣ３２から成る群より選ばれる修飾によって、セ
    ンス鎖においてＴに変更され；
    （Ｄ）Ｄ３２及びＩ３２から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣ
    又はＴに変更され；又は、
    （Ｅ）Ｓ３２、Ｎ３２、Ｈ３２、Ｑ３２及びＴ３２から成る群より選ばれる修飾によ
    って、センス鎖において任意の塩基に変更される、
    ことを特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ。
  6. 野生型Ｉ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対
    する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの残基６－１６０に対し少なくとも８５％
    の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
    配列番号７及び配列番号８から成る群より選ばれるＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼ認識
    配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分部位に対して特異性を有し
    、
    （１）位置－１における特異性が、
    （Ａ）Ｋ７５、Ｑ７７、Ａ４９、Ｃ４９及びＫ７９から成る群より選ばれる修飾によ
    って、センス鎖においてＡに変更され；
    （Ｂ）Ｃ７７、Ｌ７７及びＱ７９から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＴに変更され；
    （Ｃ）Ｋ７７、Ｒ７７、Ｅ４９及びＥ７９から成る群より選ばれる修飾によって、セ
    ンス鎖においてＧに変更され；
    及び／又は、
    （２）位置－２における特異性が、
    （Ａ）Ｑ７５、Ｋ８１、Ｃ４７、Ｉ４７及びＬ４７から成る群より選ばれる修飾によ
    って、センス鎖においてＡに変更され；
    （Ｂ）Ｅ７５、Ｄ７５、Ｒ４７、Ｋ４７、Ｋ８１及びＲ８１から成る群より選ばれる
    修飾によって、センス鎖においてＣに変更され；
    （Ｃ）Ｋ７５、Ｅ４７及びＥ８１から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＧに変更され；
    及び／又は、
    （３）位置－３における特異性が、
    （Ａ）Ｑ７２、Ｃ２６、Ｌ２６、Ｖ２６、Ａ２６及びＩ２６から成る群より選ばれる
    修飾によって、センス鎖においてＡに変更され；
    （Ｂ）Ｅ７２、Ｙ７２、Ｈ２６、Ｋ２６及びＲ２６から成る群より選ばれる修飾によ
    って、センス鎖においてＣに変更され；
    （Ｃ）Ｋ７２、Ｙ７２及びＨ２６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＴに変更され；
    及び／又は、
    （４）位置－４における特異性が、
    （Ａ）Ｋ２８、Ｋ８３及びＱ２８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＴに変更され；
    （Ｂ）Ｒ８３及びＫ８３から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧ
    に変更され；
    （Ｃ）Ｋ２８及びＱ８３から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＡ
    に変更され；
    及び／又は、
    （５）位置－５における特異性が、
    （Ａ）Ｒ４５及びＥ２８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧ
    に変更され；
    （Ｂ）Ｑ２８を含む修飾によってセンス鎖においてＴに変更され；
    （Ｃ）Ｒ２８を含む修飾によってセンス鎖においてＣに変更され；
    及び／又は、
    （６）位置－６における特異性が、
    （Ａ）Ｋ４３、Ｖ８５、Ｌ８５及びＱ３０から成る群より選ばれる修飾によって、セ
    ンス鎖においてＴに変更され；
    （Ｂ）Ｅ４３、Ｅ８５、Ｋ３０及びＲ３０から成る群より選ばれる修飾によって、セ
    ンス鎖においてＣに変更され；または、
    （Ｃ）Ｒ４３、Ｋ４３、Ｋ８５、Ｒ８５、Ｅ３０及びＤ３０より成る群から選ばれる
    修飾によって、センス鎖においてＧに変更され；
    及び／又は、
    （７）位置－７における特異性が、
    （Ａ）Ｅ３２及びＥ４１から成る群から選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣ
    に変更され；
    （Ｂ）Ｒ３２、Ｒ４１及びＫ４１から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＧに変更され；
    （Ｃ）Ｋ３２、Ｍ４１、Ｌ４１及びＩ４１から成る群より選ばれる修飾によって、セ
    ンス鎖においてＴに変更され；
    及び／又は、
    （８）位置－８における特異性が、
    （Ａ）Ｋ３２及びＫ３５から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＴ
    に変更され；
    （Ｂ）Ｅ３２を含む修飾によってセンス鎖においてＣに変更され；
    （Ｃ）Ｋ３２、Ｋ３５及びＲ３５から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＧに変更され；
    及び／又は、
    （９）位置－９における特異性が、
    （Ａ）Ｎ３４及びＨ３４から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＡ
    に変更され；
    （Ｂ）Ｓ３４、Ｃ３４、Ｖ３４、Ｔ３４及びＡ３４から成る群より選ばれる修飾によ
    って、センス鎖においてＴに変更され；
    （Ｃ）Ｋ３４、Ｒ３４及びＨ３４から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＧに変更される、
    ことを特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ。
  7. 野生型Ｉ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼと比べ、認識配列に対する特異性が変更された組
    み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号９のＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼの残基３－１８６に対し少なくとも８５％
    の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
    配列番号１０及び配列番号１１のＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼと、少なくとも１塩基
    対異なる認識配列に対して特異性を有し、
    （１）位置４における特異性が、
    （Ａ）Ｋ５０を含む修飾によってセンス鎖においてＡに変更され；
    （Ｂ）Ｋ５７、Ｍ５７及びＱ５０から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＴに変更され；
    （Ｃ）Ｅ５０、Ｒ５７及びＫ５７から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＧに変更され；及び／又は、
    （２）位置５における特異性が、
    （Ａ）Ｋ４８、Ｑ１０２から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＡ
    に変更され；
    （Ｂ）Ｅ４８、Ｋ１０２及びＲ１０２から成る群より選ばれる修飾によって、センス
    鎖においてＧに変更され；
    （Ｃ）Ｑ４８、Ｃ１０２、Ｌ１０２及びＶ１０２から成る群より選ばれる修飾によっ
    て、センス鎖においてＴに変更され；
    及び／又は、
    （３）位置６における特異性が、
    （Ａ）Ｋ５９を含む修飾によってセンス鎖においてＡに変更され；
    （Ｂ）Ｒ５９及びＫ５９から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣ
    に変更され；
    （Ｂ）Ｋ８４及びＥ５９から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧ
    に変更され；
    及び／又は、
    （４）位置７における特異性が、
    （Ａ）Ｒ４６、Ｋ４６及びＥ８６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＣに変更され；
    （Ｂ）Ｋ８６、Ｒ８６及びＥ４６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＧに変更され；
    （Ｃ）Ｃ４６、Ｌ４６及びＶ４６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＡに変更され；
    及び／又は、
    （５）位置８における特異性が、
    （Ａ）Ｅ８８、Ｒ６１及びＨ６１から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＣに変更され；
    （Ｂ）Ｋ８８、Ｑ６１及びＨ６１から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＴに変更され；
    （Ｃ）Ｋ６１、Ｓ６１、Ｖ６１、Ａ６１及びＬ６１から成る群より選ばれる修飾によ
    って、センス鎖においてＡに変更され；
    及び／又は、
    （６）位置９における特異性が、
    （Ａ）Ｃ９８、Ｖ９８及びＬ９８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＡに変更され；
    （Ｂ）Ｒ９８及びＫ９８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣ
    に変更され；又は、
    （Ｃ）Ｅ９８及びＤ９８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧ
    に変更され；
    及び／又は、
    （７）位置１０における特異性が、
    （Ａ）Ｋ９６及びＲ９６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣ
    に変更され；
    （Ｂ）Ｄ９６及びＥ９６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧ
    に変更され；
    （Ｃ）Ｃ９６及びＡ９６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＡ
    に変更され；
    及び／又は、
    （８）位置１１における特異性が、
    （Ａ）Ｑ９０を含む修飾によってセンス鎖においてＴに変更され；
    （Ｂ）Ｋ９０及びＲ９０から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣ
    に変更され；
    （Ｃ）Ｅ９０を含む修飾によってセンス鎖においてＧに変更され；
    及び／又は、
    （９）位置１２における特異性が、
    （Ａ）Ｑ１９３を含む修飾によってセンス鎖においてＡに変更され；
    （Ｂ）Ｅ１６５、Ｅ１９３及びＤ１９３から成る群より選ばれる修飾によって、セン
    ス鎖においてＣに変更され；
    （Ｃ）Ｋ１６５及びＲ１６５から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖におい
    てＧに変更され；
    及び／又は、
    （１０）位置１３における特異性が、
    （Ａ）Ｑ１９３、Ｃ１６３及びＬ１６３から成る群より選ばれる修飾によって、セン
    ス鎖においてＴに変更され；
    （Ｂ）Ｅ１９３、Ｄ１９３、Ｋ１６３及びＲ１９２から成る群より選ばれる修飾によ
    って、センス鎖においてＧに変更され；
    （Ｃ）Ｃ１９３およびＬ１９３から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖にお
    いてＡに変更され；
    及び／又は、
    （１１）位置１４における特異性が、
    （Ａ）Ｋ１６１及びＱ１９２から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖におい
    てＴに変更され；
    （Ｂ）Ｌ１９２及びＣ１９２から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖におい
    てＡに変更され；
    （Ｃ）Ｋ１４７、Ｋ１６１、Ｒ１６１、Ｒ１９７、Ｄ１９２及びＥ１９２から成る群
    より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧに変更され；または、
    （Ｄ）Ｋ１６１及びＱ１９２から成る群から選ばれる修飾によって、センス鎖におい
    てＴに変更され；
    及び／又は
    （１２）位置１５における特異性が、
    （Ａ）Ｃ１５１、Ｌ１５１及びＫ１５１から成る群より選ばれる修飾によって、セン
    ス鎖においてＴに変更され；
    （Ｂ）Ｋ１５１を含む修飾によってセンス鎖においてＧに変更され；又は、
    （Ｃ）Ｅ１５１を含む修飾によってセンス鎖においてＣに変更され；
    及び／又は、
    （１３）位置１７における特異性が、
    （Ａ）Ｇ１５２及びＱ１５０から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖におい
    てＴに変更され；
    （Ｂ）Ｋ１５２及びＫ１５０から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖におい
    てＣに変更され；
    （Ｃ）Ｎ１５２、Ｓ１５２、Ｄ１５２、Ｄ１５０及びＥ１５０から成る群より選ばれ
    る修飾によってセンス鎖においてＧに変更され；
    及び／又は、
    （１４）位置１８における特異性が、
    （Ａ）Ｈ１５５及びＹ１５５から成る群より選ばれる修飾によってセンス鎖において
    Ｔに変更され；
    （Ｂ）Ｒ１５５及びＫ１５５から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖におい
    てＣに変更され；
    （Ｃ）Ｋ１５５及びＣ１５５から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖におい
    てＡに変更される
    ことを特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ。
  8. 野生型Ｉ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼと比べ、少なくとも一つの認識配列半分部位に対
    する特異性が変更された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号１２のＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの残基５－２１１に対し少なくとも８５
    ％の配列類似性を有するポリペプチドを含み、かつ、
    配列番号１３及び配列番号１４から成る群より選ばれるＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼ
    認識配列内の半分部位と、少なくとも１塩基対異なる認識配列半分部位に対して特異性を
    有し、
    （１）位置－１における特異性が、
    （Ａ）Ｃ９２、Ａ９２及びＶ９２から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＡに変更され；
    （Ｂ）Ｑ１１６及びＱ９２から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖において
    Ｔに変更され；
    （Ｃ）Ｅ１１６及びＥ９２から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖において
    Ｇに変更され；
    及び／又は、
    （２）位置－２における特異性が、
    （Ａ）Ｑ１１７、Ｃ９０、Ｌ９０及びＶ９０から成る群より選ばれる修飾によって、
    センス鎖においてＡに変更され；
    （Ｂ）Ｋ１１７、Ｒ１２４、Ｋ１２４、Ｅ１２４、Ｅ９０及びＤ９０から成る群から
    選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧに変更され；
    （Ｃ）Ｅ１１７、Ｄ１１７、Ｒ１７４、Ｋ１２４、Ｋ９０及びＫ６８から成る群から
    選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣに変更され；
    及び／又は、
    （３）位置－３における特異性が、
    （Ａ）Ｃ７０、Ｖ７０、Ｔ７０、Ｌ７０及びＫ７０から成る群より選ばれる修飾によ
    って、センス鎖においてＡに変更され；
    （Ｂ）Ｑ７０を含む修飾によってセンス鎖においてＴに変更され；
    （Ｂ）Ｋ７０を含む修飾によってセンス鎖においてＣに変更され；
    及び／又は、
    （４）位置－４における特異性が、
    （Ａ）Ｅ１２６、Ｄ１２６、Ｒ８８、Ｋ８８及びＫ７２から成る群より選ばれる修飾
    によって、センス鎖においてＣに変更され；
    （Ｂ）Ｋ１２６、Ｌ１２６及びＱ８８から成る群より選ばれる修飾によって、センス
    鎖においてＴに変更され；
    （Ｃ）Ｑ１２６、Ｎ１２６、Ｋ８８、Ｌ８８、Ｃ７２、Ｌ７２及びＶ７２から成る群
    より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＡに変更され；
    及び／又は、
    （５）位置－５における特異性が、
    （Ａ）Ｅ７４、Ｋ１２８、Ｒ１２８及びＥ１２８から成る群より選ばれる修飾によっ
    て、センス鎖においてＧに変更され；
    （Ｂ）Ｃ１２８、Ｌ１２８、Ｖ１２８及びＴ１２８から成る群から選ばれる修飾によ
    って、センス鎖においてＴに変更され；又は、
    （Ｃ）Ｃ７４、Ｌ７４、Ｖ７４及びＴ７４から成る群より選ばれる修飾によって、セ
    ンス鎖においてＡに変更され；
    及び／又は、
    （６）位置－６における特異性が、
    （Ａ）Ｋ８６、Ｃ８６及びＬ８６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＴに変更され；
    （Ｂ）Ｄ８６、Ｅ８６、Ｒ８４及びＫ８４から成る群より選ばれる修飾によって、セ
    ンス鎖においてＣに変更され；又は、
    （Ｃ）Ｋ１２８、Ｒ１２８、Ｒ８６、Ｋ８６及びＥ８４から成る群より選ばれる修飾
    によって、センス鎖においてＧに変更され；
    及び／又は、
    （７）位置－７における特異性が、
    （Ａ）Ｒ７６、Ｋ７６及びＨ７６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＣに変更され；
    （Ｂ）Ｅ７６及びＲ８４から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＧ
    に変更され；
    （Ｃ）Ｈ７６及びＱ７６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＴ
    に変更され；
    及びび／又は、
    （８）位置－８における特異性が、
    （Ａ）Ｙ７９、Ｒ７９及びＱ７６から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＡに変更され；
    （Ｂ）Ｄ７９、Ｅ７９、Ｄ７６及びＥ７６から成る群より選ばれる修飾によって、セ
    ンス鎖においてＣに変更され；
    （Ｃ）Ｒ７９、Ｋ７９、Ｋ７６及びＲ７６から成る群より選ばれる修飾によって、セ
    ンス鎖においてＧに変更され；
    及び／又は、
    （９）位置－９における特異性が、
    （Ａ）Ｋ７８、Ｖ７８、Ｌ７８、Ｃ７８及びＴ７８から成る群より選ばれる修飾によ
    って、センス鎖においてＴに変更され；
    （Ｂ）Ｄ７８及びＥ７８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖においてＣ
    に変更され；又は、
    （Ｃ）Ｒ７８、Ｋ７８及びＨ７８から成る群より選ばれる修飾によって、センス鎖に
    おいてＧに変更される、
    ことを特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ。
  9. 野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼと比べ、２本鎖ＤＮＡに対する結合親和度が変更
    された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対して少なくとも８５
    ％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
    ＤＮＡ結合親和度が、
    （Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ又はＲによるＥ８０、Ｄ１３７、Ｉ８１、Ｌ１１２、Ｐ
    ２９、Ｖ６４又はＹ６６の置換；
    又は、
    （Ｂ）Ｋ又はＲによるＴ４６、Ｔ１４０又はＴ１４３の置換、
    から成る群より選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾によって上昇する
    ことを特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ。
  10. 野生型Ｉ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼと比べ、２本鎖ＤＮＡに対する結合親和度が変更
    された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対して少なくとも８５
    ％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
    ＤＮＡ結合親和度が、
    （Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥによるＫ３４、Ｋ４８、Ｒ５１、Ｋ８２、Ｋ１１
    ６、またはＫ１３９の置換；
    又は、
    （Ｂ）Ｄ又はＥによるＩ８１、Ｌ１１２、Ｐ２９、Ｖ６４、Ｙ６６、Ｔ４６、Ｔ１４０
    又はＴ１４３の置換から成る群より選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾
    によって低下することを特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ。
  11. 野生型Ｉ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼと比べ、２本鎖ＤＮＡに対する結合親和度が変更
    された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの残基６－１６０に対して少なくとも８５
    ％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
    ＤＮＡ結合親和度が、
    （Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ又はＲによるＥ１４７、Ｉ８５、Ｇ８６又はＹ１１８の
    置換；
    又は、
    （Ｂ）Ｋ又はＲによるＱ４１、Ｎ７０、Ｓ８７、Ｔ８８、Ｈ８９、Ｑ１２２、Ｑ１３９
    、Ｓ１５０又はＮ１５２の置換から成る群より選ばれる一つの置換に対応する少なくとも
    一つの修飾によって上昇することを特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ。
  12. 野生型Ｉ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼと比べ、２本鎖ＤＮＡに対する結合親和度が変更
    された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの残基６－１６０に対して少なくとも８５
    ％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
    ＤＮＡ結合親和度が、
    （Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥによるＫ３６、Ｒ５１、Ｋ１２３、Ｋ１４３、ま
    たはＲ１４４の置換；
    又は
    （Ｂ）Ｄ又はＥによるＩ８５、Ｇ８６、Ｙ１１８、Ｑ４１、Ｎ７０、Ｓ８７、Ｔ８８、
    Ｈ８９、Ｑ１２２、Ｑ１３９、Ｓ１５０又はＮ１５２の置換から成る群より選ばれる一つ
    の置換に対応する少なくとも一つの修飾によって低下することを特徴とする、組み換えメ
    ガヌクレアーゼ。
  13. 野生型Ｉ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼと比べ、２本鎖ＤＮＡに対する結合親和度が変更
    された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号９のＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼの残基３－１８６に対して少なくとも８５
    ％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
    ＤＮＡ結合親和度が、
    （Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ又はＲによるＤ２０１、Ｌ１９、Ｌ８０、Ｌ９２、Ｙ１
    ５１、Ｙ１８８、Ｉ１９１、Ｙ１９９又はＹ２２２の置換；
    又は
    （Ｂ）Ｋ又はＲによるＮ１５、Ｎ１７、Ｓ８１、Ｈ８４、Ｎ９４、Ｎ１２０、Ｔ１５６
    、Ｎ１５７、Ｓ１５９、Ｎ１６３、Ｑ１６５、Ｓ１６６, Ｎ１９４又はＳ２０２の置換か
    ら成る群より選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾によって上昇すること
    を特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ。
  14. 野生型Ｉ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼと比べ、２本鎖ＤＮＡに対する結合親和度が変更
    された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号９のＩ－ＳＣＥＩメガヌクレアーゼの残基３－１８６に対して少なくとも８５
    ％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
    ＤＮＡ結合親和度が、
    （Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥによるＫ２０、Ｋ２３、Ｋ６３、Ｋ１２２、Ｋ１
    ４８、Ｋ１５３、Ｋ１９０、Ｋ１９３、Ｋ１９５又はＫ２２３の置換；
    又は
    （Ｂ）Ｄ又はＥによるＬ１９、Ｌ８０、Ｌ９２、Ｙ１５１、Ｙ１８８、Ｉ１９１、Ｙ１
    ９９、Ｙ２２２、Ｎ１５、Ｎ１７、Ｓ８１、Ｈ８４、Ｎ９４、Ｎ１２０、Ｔ１５６、Ｎ１
    ５７、Ｓ１５９、Ｎ１６３、Ｑ１６５、Ｓ１６６、Ｎ１９４又はＳ２０２の置換から成る
    群から選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾によって低下することを特徴
    とする、組み換えメガヌクレアーゼ。
  15. 野生型Ｉ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼと比べ、２本鎖ＤＮＡに対する結合親和度が変更
    された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号１２のＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの残基５－２１１に対して少なくとも８
    ５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
    ＤＮＡ結合親和度が、
    （Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ又はＲによるＤ２５又はＤ１２８の置換又は
    （Ｂ）Ｋ又はＲによるＳ６８、Ｎ７０、Ｈ９４、Ｓ１１７、Ｎ１２０、Ｎ１２９、又は
    Ｈ１７２の置換から成る群より選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾によ
    って上昇することを特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ。
  16. 野生型Ｉ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼと比べ、２本鎖ＤＮＡに対する結合親和度が変更
    された組み換えメガヌクレアーゼであって、
    配列番号１２のＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの残基５－２１１に対して少なくとも８
    ５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
    ＤＮＡ結合親和度が、
    （Ａ）Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥによるＫ２１、Ｋ２８、Ｋ３１、Ｒ１１２、Ｒ１
    １４、またはＲ１３０の置換；
    又は
    （Ｂ）Ｄ又はＥによるＳ６８、Ｎ７０、Ｈ９４、Ｓ１１７、Ｎ１２０、Ｎ１２９又はＨ
    １７２の置換から成る群より選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾によっ
    て低下することを特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ。
  17. 参照メガヌクレアーゼモノマーによるダイマー形成に対する親和度を変更させた組み換
    えメガヌクレアーゼモノマーであって、
    配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対して少なくとも８５
    ％の配列類似性を有するポリペプチドを含み、
    ダイマー形成に対する親和度が、
    （Ａ）Ｄ又はＥによるＫ７、Ｋ５７又はＫ９６の置換；
    又は
    （Ｂ）Ｋ又はＲによるＥ８又はＥ６１の置換から成る群より選ばれる置換に対応する少
    なくとも一つの修飾によって変えられることを特徴とする組み換えメガヌクレアーゼモノ
    マー。
  18. 組み換えメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーであって、
    配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対して少なくとも８５
    ％の配列類似性を有する第１ポリペプチドであって、
    ダイマー形成に対する親和度が、
    （Ａ）Ｄ又はＥによるＫ７、Ｋ５７又はＫ９６の置換から成る群から選ばれる置換に対
    応する少なくとも一つの修飾によって変えられる第１ポリペプチド及び、
    配列番号１のＩ－ＣＲＥＩメガヌクレアーゼの残基２－１５３に対して少なくとも８５
    ％の配列類似性を有する第２ポリペプチドであって、
    ダイマー形成に対する親和度が、
    （Ｂ）Ｋ又はＲによるＥ８又はＥ６１の置換から成る群から選ばれる置換に対応する少
    なくとも一つの修飾によって変えられる第２ポリペプチドを含む、
    ことを特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー。
  19. 参照メガヌクレアーゼモノマーによるダイマー形成に対する親和度を変更させた組み換
    えメガヌクレアーゼモノマーであって、
    配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの残基６－１６０に対して少なくとも８５
    ％の配列類似性を有するポリペプチドを含み、
    ダイマー形成に対する親和度が、
    （Ａ）Ｄ又はＥによるＲ３０２の置換；
    又は
    （Ｂ）Ｋ又はＲによるＤ２０、Ｅ１１又はＱ６４の置換から成る群から選ばれる置換に
    対応する少なくとも一つの修飾によって変えられることを特徴とする、組み換えメガヌク
    レアーゼモノマー。
  20. 組み換えメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーであって、
    配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの残基６－１６０に対して少なくとも８５
    ％の配列類似性を有する第１ポリペプチドであって、
    ダイマー形成に対する親和度が、
    （Ａ）Ｄ又はＥによるＲ３０２の置換から成る群より選ばれる置換に対応する少なくと
    も一つの修飾によって変えられる第１ポリペプチド及び、
    配列番号６のＩ－ＭＳＯＩメガヌクレアーゼの残基６－１６０に対して少なくとも８５
    ％の配列類似性を有する第２ポリペプチドであって、
    ダイマー形成に対する親和度が、
    （Ｂ）Ｋ又はＲによるＤ２０、Ｅ１１又はＱ６４の置換から成る群から選ばれる置換に
    対応する少なくとも一つの修飾によって変えられる第２ポリペプチドを含む、
    ことを特徴とする、組み換えメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー。
  21. 参照メガヌクレアーゼモノマーによるダイマー形成に対する親和度を変更させた組み換
    えメガヌクレアーゼモノマーであって、
    配列番号１２のＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの残基５－２１１に対して少なくとも８
    ５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み、
    ダイマー形成に対する親和度が、
    （Ａ）Ｄ又はＥによるＲ９３の置換；
    又は
    （Ｂ）Ｋ又はＲによるＥ１５２の置換から成る群から選ばれる置換に対応する少なく共
    一つの修飾によって変えられることを特徴とする、前記組み換えメガヌクレアーゼモノマ
    ー。
  22. 組み換えメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーであって、
    配列番号１２のＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの残基５－２１１に対して少なくとも８
    ５％の配列類似性を有する第１ポリペプチドであって、
    ダイマー形成に対する親和度が、
    （Ａ）Ｄ又はＥによるＲ９３の置換から成る群より選ばれる置換に対応する少なくとも
    一つの修飾によって変えられる第１ポリペプチド及び、
    配列番号１２のＩ－ＣＥＵＩメガヌクレアーゼの残基５－２１１に対して少なくとも８
    ５％の配列類似性を有する第２ポリペプチドであって、
    ダイマー形成に対する親和度が、
    （Ｂ）Ｋ又はＲによるＥ１５２の置換から成る群より選ばれる置換に対応する少なくと
    も一つの修飾によって変えられる第２ポリペプチドを含む、
    ことを特徴とする組み換えメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー。
  23. 表１から選ばれる少なくとも一つの修飾で、排外的修飾ではない修飾をさらに含むこと
    を特徴とする、
    請求項１７又は請求項１８に記載の組み換えメガヌクレアーゼモノマー又はヘテロダイ
    マー。
  24. 表２から選ばれる少なくとも一つの修飾で、排外的修飾ではない修飾をさらに含むこと
    を特徴とする、
    請求項１９又は請求項２０に記載の組み換えメガヌクレアーゼモノマー又はヘテロダイ
    マー。
  25. 表４から選ばれる少なくとも一つの修飾で、排外的修飾ではない修飾をさらに含むこと
    を特徴とする、
    請求項２１又は請求項２２に記載の組み換えメガヌクレアーゼモノマー又はヘテロダイ
    マー。
  26. 真核細胞の染色体に挿入される興味の外因性配列を含む遺伝学的に修飾された真核細胞
    を生産するための方法であって、
    真核細胞を、
    （Ｉ）メガヌクレアーゼをコードする第１核酸配列及び、
    （ＩＩ）前記興味の配列を含む第２核酸配列
    を含む一つ以上の核酸によってトランスフェクトすることを含み、
    前記メガヌクレアーゼが前記染色体の中に切断部位を生産し、かつ、前記興味の配列が
    前記切断部位において前記染色体の中に挿入され、
    前記メガヌクレアーゼが請求項１～２５のいずれか１項による組み換えメガヌクレアー
    ゼであることを特徴とする方法。
  27. 前記第２核酸が、前記切断部位に側接する配列に対し相同な配列をさらに含み、前記興
    味の配列が、相同組み換えによって前記切断部位において挿入されることを特徴とする、
    請求項２６に記載の方法。
  28. 前記第２核酸が、前記切断部位に対し実質的相同性を欠き、前記興味の配列が、非相同
    的末端接合によって前記染色体に挿入されることを特徴とする、
    請求項２６に記載の方法。
  29. 真核細胞の染色体に挿入される興味の外因性配列を含む、遺伝学的に修飾された真核細
    胞を生産するための方法であって、
    真核細胞にメガヌクレアーゼタンパクを導入すること；
    及び、
    前記興味の配列を含む核酸によって前記真核細胞をトランスフェクトすることを含み、
    前記メガヌクレアーゼが、前記染色体の中に切断部位を生産し、前記興味の配列が、前
    記切断部位において前記染色体の中に挿入され；
    かつ、
    前記メガヌクレアーゼが請求項１～２５のいずれか１項による組み換えメガヌクレアー
    ゼであることを特徴とする方法。
  30. 前記核酸が、前記切断部位に側接する配列に対し相同な配列をさらに含み、前記興味の
    配列が、相同組み換えによって前記切断部位において挿入されることを特徴とする、
    請求項２９に記載の方法。
  31. 前記核酸が、前記切断部位に対し実質的相同性を欠き、前記興味の配列が、非相同的末
    端接合によって前記染色体に挿入されることを特徴とする、
    請求項２９に記載の方法。
  32. 真核細胞の染色体中の標的配列を破壊することによって遺伝学的に修飾された真核細胞
    を生産するための方法であって、
    メガヌクレアーゼをコードする核酸によって真核細胞をトランスフェクトすることを含
    み、
    前記メガヌクレアーゼが、前記染色体の中に切断部位を生産し、前記標的配列が、前記
    切断部位において非相同的末端接合によって破壊され；
    かつ、
    前記メガヌクレアーゼが、請求項１～２５のいずれか１項による組み換えメガヌクレア
    ーゼであることを特徴とする方法。
  33. 遺伝学的に修飾された生物体を生産する方法であって、
    請求項２６～３２のいずれか１項の方法に従って遺伝学的に修飾された真核細胞を生産
    するステップと、
    及び、
    前記遺伝学的に修飾された真核細胞を育成して遺伝学的に修飾された生物体を生産する
    ステップと、
    を含む方法。
  34. 前記真核細胞が、配偶子、接合子、胚盤胞細胞、胚幹細胞及びプロトプラスト細胞から
    成る群より選ばれることを特徴とする、
    請求項３３に記載の方法。
  35. 真核生物において遺伝子治療によって疾患を治療するための方法であって、
    前記真核生物の少なくとも一つの細胞を、
    （Ｉ）メガヌクレアーゼをコードする第１核酸配列及び、
    （ＩＩ）興味の配列を含む第２核酸配列
    によってトランスフェクトすることを含み；
    前記メガヌクレアーゼが、前記染色体の中に切断部位を生産し、前記興味の配列が、前
    記切断部位において前記染色体の中に挿入され；
    かつ、
    前記メガヌクレアーゼが、請求項１－２５のいずれか１項による組み換えメガヌクレア
    ーゼであることを特徴とする方法。
  36. 前記第２核酸配列が、前記切断部位に側接する配列に対し相同な配列をさらに含み、前
    記興味の配列が、相同組み換えによって前記切断部位において挿入されることを特徴とす
    る、
    請求項３５に記載の方法。
  37. 前記第２核酸配列が、前記切断部位に対し実質的相同性を欠き、前記興味の配列が、非
    相同的末端接合によって前記染色体に挿入されることを特徴とする、
    請求項３５に記載の方法。
  38. 真核生物において遺伝子治療によって疾患を治療するための方法であって、
    前記真核生物の少なくとも一つの細胞の中にメガヌクレアーゼタンパクを導入すること
    ステップと、
    前記真核細胞を、興味の配列を含む核酸によってトランスフェクトするステップとを含
    み、
    前記メガヌクレアーゼが、前記染色体の中に切断部位を生産し、前記興味の配列が、前
    記切断部位において前記染色体の中に挿入され；
    前記メガヌクレアーゼが請求項１～２５のいずれか１項による組み換えメガヌクレアー
    ゼであり；
    かつ、
    前記興味の配列の挿入が、前記疾患に対する前記遺伝子治療を与えることを特徴とする
    方法。
  39. 前記核酸が、前記切断部位に側接する配列に対し相同な配列をさらに含み、前記興味の
    配列が、相同組み換えによって前記切断部位において挿入されることを特徴とする、
    請求項３８に記載の方法。
  40. 前記核酸が、前記切断部位に対し実質的相同性を欠き、前記興味の配列が、非相同的末
    端接合によって前記染色体に挿入されることを特徴とする、
    請求項３８に記載の方法。
  41. 真核生物において、前記真核生物の染色体中の標的配列の破壊による遺伝子治療によっ
    て疾患を治療するための方法であって、
    前記真核生物の少なくとも一つの細胞を、メガヌクレアーゼをコードする核酸によって
    トランスフェクトすることを含み；
    前記メガヌクレアーゼが、前記染色体の中に切断部位を生産し、前記標的配列が、前記
    切断部位において非相同的末端接合によって破壊され；
    前記メガヌクレアーゼが、請求項１－２５のいずれか１項による組み換えメガヌクレア
    ーゼであり；
    かつ、
    前記標的配列の破壊が、前記疾患に対する前記遺伝子治療を与えることを特徴とする方
    法。
  42. 真核細胞宿主におけるウィルス性病原体感染を、前記ウィルス病原体のゲノムにおける
    標的配列を破壊することによって治療する方法であって、
    前記真核細胞宿主の少なくとも一つの感染細胞を、メガヌクレアーゼをコードする核酸
    によってトランスフェクトすることを含み；
    前記メガヌクレアーゼが、前記ウィルスゲノムの中に切断部位を生産し、前記標的配列
    が、前記切断部位において非相同的末端接合によって破壊され、
    前記メガヌクレアーゼが、請求項１－２５のいずれか１項による組み換えメガヌクレア
    ーゼであり；
    かつ、
    前記標的配列の破壊が、前記感染に対する治療を与えることを特徴とする方法。
  43. 真核細胞宿主におけるウィルス性病原体感染を、前記ウィルス病原体のゲノムにおける
    標的配列を破壊することによって治療する方法であって、
    前記真核細胞宿主の少なくとも一つの感染細胞を、メガヌクレアーゼをコードする第１
    核酸、および第２核酸によってトランスフェクトすることを含み；
    前記メガヌクレアーゼが、前記ウィルスゲノムの中に切断部位を生産し、前記標的配列
    が、前記切断部位において、前記ウィルスゲノムと前記第２核酸との相同組み換えによっ
    て破壊され；
    前記メガヌクレアーゼが、請求項１－２５のいずれか１項による組み換えメガヌクレア
    ーゼであり；
    前記第２核酸が、前記切断部位に側接する配列に対して相同な配列を含み；
    かつ、
    前記標的配列の破壊が、前記感染に対する治療を与えることを特徴とする方法。
  44. 真核細胞宿主における前核細胞病原体感染を、前記前核細胞病原体のゲノムにおける標
    的配列を破壊することによって治療する方法であって、
    前記真核細胞宿主に感染する前記前核細胞病原体の少なくとも一つの細胞を、メガヌク
    レアーゼをコードする核酸によってトランスフェクトすることを含み；
    前記メガヌクレアーゼが、前記前核細胞ゲノムの中に切断部位を生産し、前記標的配列
    が、前記切断部位において、非相同的末端接合によって破壊され；
    前記メガヌクレアーゼが、請求項１～２５のいずれか１項による組み換えメガヌクレア
    ーゼであり；
    かつ、
    前記標的配列の破壊が、前記感染に対する治療を与えることを特徴とする方法。
  45. 真核細胞宿主における前核細胞病原体感染を、前記前核細胞病原体のゲノムにおける標
    的配列を破壊することによって治療する方法であって、
    前記真核細胞宿主に感染する前記前核細胞病原体の少なくとも一つの細胞を、メガヌク
    レアーゼをコードする第１核酸、および第２核酸によってトランスフェクトすることを含
    み；
    前記メガヌクレアーゼが、前記前核細胞ゲノムの中に切断部位を生産し、前記標的配列
    が、前記切断部位において、前記前核細胞ゲノムと前記第２核酸との相同組み換えによっ
    て破壊され；
    前記メガヌクレアーゼが、請求項１～２５のいずれか１項による組み換えメガヌクレア
    ーゼであり；
    前記第２核酸が、前記切断部位に側接する配列に対して相同な配列を含み；
    かつ、
    前記標的配列の破壊が、前記感染に対する治療を与えることを特徴とする方法。
  46. 少なくとも一つの所望の変化を含むように、認識配列の少なくとも一つの塩基位置に対
    する特異性を変更させた組み換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法であって、
    （１）参照メガヌクレアーゼ－ＤＮＡ複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定する
    こと；
    （２）前記塩基位置において塩基接触面を形成するアミノ酸残基を特定すること；
    （３）前記接触面を含む少なくとも第１残基のβ－炭素と、前記塩基位置における少な
    くとも第１塩基との間の距離を決めること；
    及び、
    （４）前記所望の変化を促進するアミノ酸置換を、表２に示される群の中から、
    （Ａ）第１塩基から６オングストローム未満の距離にある第１残基については、Ｇ群
    、Ｃ群、Ｔ群又はＡ群のうち、前記所望の変化を促進するのに適切なもののメンバーであ
    る１群及び／又は２群の置換を選択すること；
    又は、
    （Ｂ）前記第１塩基から６オングストロームより遠い距離にある第１残基については
    、Ｇ群、Ｃ群、Ｔ群又はＡ群のうち、前記所望の変化を促進するのに適切なもののメンバ
    ーである２群及び／又は３群の置換を選択することによって特定すること、
    を含む方法。
  47. ＤＮＡ－結合親和度を上昇させる組み換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法で
    あって、
    （１）参照メガヌクレアーゼ－ＤＮＡ複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定する
    こと；
    （２）バックボーン接触面を形成するアミノ酸接触残基を特定すること；
    （３）前記ＤＮＡ－結合親和度を上昇させるアミノ酸置換を、
    （Ａ）陰性荷電、または疎水性側鎖を持つ接触残基については、非荷電／極性、また
    は陽性荷電側鎖を持つ置換を選択すること；
    又は
    （Ｂ）非荷電／極性側鎖を持つ接触残基については、陽性荷電側鎖を持つ置換を選択
    することによって特定すること、
    を含む方法。
  48. ＤＮＡ－結合親和度を低下させる組み換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法で
    あって、
    （１）参照メガヌクレアーゼ－ＤＮＡ複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定する
    こと；
    （２）バックボーン接触面を形成するアミノ酸接触残基を特定すること；
    （３）前記ＤＮＡ－結合親和度を低下させるアミノ酸置換を、
    （Ａ）陽性荷電側鎖を持つ接触残基については、非荷電／極性、または陰性荷電側鎖
    を持つ置換を選択すること；
    又は
    （Ｂ）疎水性、または非荷電／極性側鎖を持つ接触残基については、陰性荷電側鎖を
    持つ置換を選択することによって特定すること、
    を含む方法。
JP2023148314A 2005-10-18 2023-09-13 配列特異性およびｄｎａ－結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ Pending JP2024001024A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72751205P 2005-10-18 2005-10-18
US60/727,512 2005-10-18
JP2020196767A JP2021054830A (ja) 2005-10-18 2020-11-27 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2022017853A JP2022070928A (ja) 2005-10-18 2022-02-08 配列特異性およびｄｎａ－結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022017853A Division JP2022070928A (ja) 2005-10-18 2022-02-08 配列特異性およびｄｎａ－結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024001024A true JP2024001024A (ja) 2024-01-09

Family

ID=37963286

Family Applications (9)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008536805A Active JP5937292B2 (ja) 2005-10-18 2006-10-18 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2012110691A Active JP6148437B2 (ja) 2005-10-18 2012-05-14 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2012125663A Active JP6050611B2 (ja) 2005-10-18 2012-06-01 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2016167826A Pending JP2017048179A (ja) 2005-10-18 2016-08-30 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2017177739A Pending JP2018039808A (ja) 2005-10-18 2017-09-15 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2018246447A Pending JP2019077698A (ja) 2005-10-18 2018-12-28 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2020196767A Pending JP2021054830A (ja) 2005-10-18 2020-11-27 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2022017853A Pending JP2022070928A (ja) 2005-10-18 2022-02-08 配列特異性およびｄｎａ－結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2023148314A Pending JP2024001024A (ja) 2005-10-18 2023-09-13 配列特異性およびｄｎａ－結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ

Family Applications Before (8)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008536805A Active JP5937292B2 (ja) 2005-10-18 2006-10-18 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2012110691A Active JP6148437B2 (ja) 2005-10-18 2012-05-14 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2012125663A Active JP6050611B2 (ja) 2005-10-18 2012-06-01 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2016167826A Pending JP2017048179A (ja) 2005-10-18 2016-08-30 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2017177739A Pending JP2018039808A (ja) 2005-10-18 2017-09-15 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2018246447A Pending JP2019077698A (ja) 2005-10-18 2018-12-28 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2020196767A Pending JP2021054830A (ja) 2005-10-18 2020-11-27 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
JP2022017853A Pending JP2022070928A (ja) 2005-10-18 2022-02-08 配列特異性およびｄｎａ－結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ

Country Status (9)

Country Link
US (20) US8021867B2 (ja)
EP (13) EP2662442B1 (ja)
JP (9) JP5937292B2 (ja)
AT (1) ATE549401T1 (ja)
AU (1) AU2006304668B2 (ja)
CA (3) CA3055968A1 (ja)
DK (9) DK2357226T3 (ja)
ES (9) ES2539616T3 (ja)
WO (1) WO2007047859A2 (ja)

Families Citing this family (445)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2292994T3 (es) † 2002-03-15 2008-03-16 Cellectis Meganucleasas hibridas y de cadena sencilla y su utilizacion.
WO2009095742A1 (en) 2008-01-31 2009-08-06 Cellectis New i-crei derived single-chain meganuclease and uses thereof
EP2522723B1 (en) * 2003-01-28 2014-12-03 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
EP2325307A1 (en) * 2005-03-15 2011-05-25 Cellectis I-crel meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof
US20090263900A1 (en) 2008-04-14 2009-10-22 Sangamo Biosciences, Inc. Linear donor constructs for targeted integration
WO2007060495A1 (en) * 2005-10-25 2007-05-31 Cellectis I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof
WO2007139982A2 (en) * 2006-05-25 2007-12-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
WO2008093152A1 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Cellectis Obligate heterodimer meganucleases and uses thereof
US20100086533A1 (en) * 2007-02-19 2010-04-08 Cellectis Laglidadg homing endonuclease variants having novel substrate specificity and use thereof
AU2008258782B2 (en) 2007-06-05 2013-09-19 Bayer Cropscience Ag Methods and means for exact replacement of target DNA in eukaryotic organisms
CA2686225A1 (en) * 2007-06-22 2008-12-31 Scidose Llc Solubilized formulation of docetaxel without tween 80
CA2691440A1 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for altering the genome of a monocot plant cell
WO2009013559A1 (en) * 2007-07-23 2009-01-29 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from the human hemoglobin beta gene and uses thereof
WO2009019528A1 (en) * 2007-08-03 2009-02-12 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from the human interleukin-2 receptor gamma chain gene and uses thereof
CA2700231C (en) * 2007-09-27 2018-09-18 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
US8563314B2 (en) 2007-09-27 2013-10-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
US11235026B2 (en) 2007-09-27 2022-02-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
AU2008318430A1 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Precision Biosciences, Inc. Rationally-designed single-chain meganucleases with non-palindromic recognition sequences
JP2011504744A (ja) * 2007-11-28 2011-02-17 セレクティス 新規な基質特異性を有するＩ−ＭｓｏＩホーミングエンドヌクレアーゼ変異型及びその使用
AU2008335324A1 (en) * 2007-12-07 2009-06-18 Precision Biosciences, Inc. Rationally-designed meganucleases with recognition sequences found in DNase hypersensitive regions of the human genome
CA2716625C (en) 2008-02-29 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Corn plant event mon87460 and compositions and methods for detection thereof
WO2009114321A2 (en) * 2008-03-11 2009-09-17 Precision Biosciencs, Inc. Rationally-designed meganucleases for maize genome engineering
US20100071083A1 (en) * 2008-03-12 2010-03-18 Smith James J Temperature-dependent meganuclease activity
EP2279250A4 (en) * 2008-04-28 2011-10-12 Prec Biosciences Inc Fusion Molecules of DNA Binding Proteins with Rational Design and Effects Domain
EP3495478A3 (en) * 2008-07-14 2019-07-24 Precision Biosciences, Inc. Recognition sequences for i-crei-derived meganucleases and uses thereof
KR20160015400A (ko) 2008-08-22 2016-02-12 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 표적화된 단일가닥 분할 및 표적화된 통합을 위한 방법 및 조성물
DK2370575T3 (en) * 2008-12-17 2018-02-05 Dow Agrosciences Llc TARGETED INTEGRATION IN THE ZP15 LOCUS
AU2010211057B2 (en) 2009-02-04 2014-12-18 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating neuropathies
WO2010093966A2 (en) * 2009-02-12 2010-08-19 Fred Hutchinson Cancer Research Center Generation of a dna nicking enzyme that stimulates site-specific gene conversion from a homing endonuclease
US8871905B2 (en) 2009-03-20 2014-10-28 Sangamo Biosciences, Inc. Modification of CXCR4 using engineered zinc finger proteins
WO2010122367A2 (en) * 2009-04-21 2010-10-28 Cellectis Meganuclease variants cleaving the genomic insertion of a virus and uses thereof
US8772008B2 (en) 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
WO2010136981A2 (en) * 2009-05-26 2010-12-02 Cellectis Meganuclease variants cleaving the genome of a pathogenic non-integrating virus and uses thereof
WO2010136841A2 (en) * 2009-05-26 2010-12-02 Cellectis Meganuclease variants cleaving the genome of a non-genomically integrating virus and uses thereof
JP5798116B2 (ja) * 2009-06-30 2015-10-21 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 生物活性のあるヌクレアーゼの迅速なスクリーニングおよびヌクレアーゼ修飾細胞の単離
AU2010281705B2 (en) 2009-07-28 2015-02-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating trinucleotide repeat disorders
EP2462230B1 (en) * 2009-08-03 2015-07-15 Recombinetics, Inc. Methods and compositions for targeted gene modification
US20110041195A1 (en) 2009-08-11 2011-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Organisms homozygous for targeted modification
EP2491127B1 (en) 2009-10-22 2017-09-20 Dow AgroSciences LLC Engineered zinc finger proteins targeting plant genes involved in fatty acid biosynthesis
EP2319872A1 (en) 2009-11-04 2011-05-11 BASF Plant Science GmbH Amylopectin type starch with enhanced retrogradation stability
CN102762726A (zh) 2009-11-27 2012-10-31 巴斯夫植物科学有限公司 嵌合内切核酸酶及其用途
CA2781693C (en) 2009-11-27 2018-12-18 Basf Plant Science Company Gmbh Chimeric endonucleases and uses thereof
US9404099B2 (en) 2009-11-27 2016-08-02 Basf Plant Science Company Gmbh Optimized endonucleases and uses thereof
WO2011082310A2 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for targeted polynucleotide modification
US20110203012A1 (en) * 2010-01-21 2011-08-18 Dotson Stanton B Methods and compositions for use of directed recombination in plant breeding
JP2013518602A (ja) 2010-02-09 2013-05-23 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 部分的に一本鎖のドナー分子による標的化ゲノム改変
CA2791116A1 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 Olivier Danos Use of endonucleases for inserting transgenes into safe harbor loci
CA2794037A1 (en) 2010-03-22 2011-09-29 Philip Morris Products S.A. Modifying enzyme activity in plants
HUE048072T2 (hu) 2010-05-03 2020-05-28 Sangamo Therapeutics Inc Készítmények cinkujj-modulok összekapcsolására
EP3156062A1 (en) 2010-05-17 2017-04-19 Sangamo BioSciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
AU2011264074B2 (en) * 2010-06-09 2015-01-22 Bayer Cropscience Nv Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering
CN103119169B (zh) * 2010-06-09 2018-11-20 拜尔作物科学公司 植物基因组改造中常用的在核苷酸序列上修饰植物基因组的方法和工具
EP2596011B1 (en) 2010-07-21 2018-10-03 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of a hla locus
EP2601297B1 (en) * 2010-08-02 2020-09-16 Cellectis Method for targeted genomic events in algae
AU2011312562B2 (en) 2010-09-27 2014-10-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inhibiting viral entry into cells
CN103354715A (zh) 2011-01-14 2013-10-16 双刃基金会 具有针对柑橘溃疡病的抗性的柑橘树
EA201391373A1 (ru) 2011-03-23 2014-07-30 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Способы получения сложного локуса трансгенных признаков
WO2012138901A1 (en) * 2011-04-05 2012-10-11 Cellectis Sa Method for enhancing rare-cutting endonuclease efficiency and uses thereof
US9476040B2 (en) 2011-05-02 2016-10-25 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Plants with useful traits and related methods
EP2535416A1 (en) 2011-05-24 2012-12-19 BASF Plant Science Company GmbH Development of phytophthora resistant potato with increased yield
EP3489366B1 (en) 2011-06-01 2019-12-25 Precision Biosciences, Inc. Methods for producing engineered mammalian cell lines with amplified transgenes
ES2657825T3 (es) 2011-06-06 2018-03-07 Bayer Cropscience Nv Métodos y medios para modificar el genoma de una planta en un sitio preseleccionado
US9758796B2 (en) 2011-06-10 2017-09-12 Basf Plant Science Company Gmbh Nuclease fusion protein and uses thereof
CA2844470A1 (en) 2011-06-21 2013-05-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for producing male sterile plants
AR087167A1 (es) 2011-07-12 2014-02-26 Two Blades Foundation Genes de resistencia al tizon tardio
WO2013016446A2 (en) 2011-07-25 2013-01-31 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for alteration of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (cftr) gene
MX348003B (es) 2011-08-22 2017-03-08 Bayer Cropscience Nv Metodos y medios para modificar un genoma vegetal.
AU2013204310C1 (en) * 2011-08-22 2015-12-10 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Methods and means to modify a plant genome
CN103917644A (zh) 2011-09-21 2014-07-09 桑格摩生物科学股份有限公司 调控转基因表达的方法和组合物
JP6188703B2 (ja) 2011-10-27 2017-08-30 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｈｐｒｔ遺伝子座を修飾するための方法および組成物
EP2612918A1 (en) 2012-01-06 2013-07-10 BASF Plant Science Company GmbH In planta recombination
WO2013109754A1 (en) 2012-01-17 2013-07-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transcription factors, promoters and uses thereof
BR112014018294B1 (pt) 2012-01-26 2022-01-11 Norfolk Plant Sciences, Ltd Método para produzir uma planta, cassete de expressão, e, célula bacteriana
AU2013225950B2 (en) 2012-02-29 2018-02-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
CN104302773A (zh) 2012-03-13 2015-01-21 圭尔夫大学 增加植物对热胁迫的耐受性及氨基酸含量的方法
US20150203864A1 (en) 2012-03-13 2015-07-23 University Of Guelph Myb55 promoter and use thereof
CN104245940A (zh) 2012-04-23 2014-12-24 拜尔作物科学公司 植物中的靶向基因组工程
AU2013256240B2 (en) 2012-05-02 2018-09-20 Corteva Agriscience Llc Targeted modification of malate dehydrogenase
BR112014027468A2 (pt) 2012-05-04 2017-06-27 Du Pont polinucleotídeo isolado ou recombinante, construção de dna recombinante, célula, planta, explante vegetal, semente transgênica, polipeptídeo isolado, composição, métodos de produção de meganuclease, de introdução de rompimento e de integração de um polinucleotídeo.
CN104471067B (zh) 2012-05-07 2020-08-14 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于核酸酶介导的转基因靶向整合的方法和组合物
JP6329537B2 (ja) 2012-07-11 2018-05-23 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 生物学的薬剤の送達のための方法および組成物
EP3196301B1 (en) 2012-07-11 2018-10-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of monogenic diseases
DK2890780T3 (da) 2012-08-29 2020-09-21 Sangamo Therapeutics Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af en genetisk tilstand
EP3763810A3 (en) 2012-10-10 2021-07-14 Sangamo Therapeutics, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
DK2925864T3 (en) 2012-11-27 2019-02-11 Childrens Medical Ct Corp DIRECTIONAL TARGETING OF DISTANT BCL11A CONTROLS FOR FETAL HEMOGLOBIN REINUCTION
JP2016500268A (ja) 2012-12-13 2016-01-12 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー トウモロコシにおける特定の遺伝子座に対する精密な遺伝子標的化
US10227610B2 (en) * 2013-02-25 2019-03-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
ES2786253T3 (es) 2013-03-14 2020-10-09 Immusoft Corp Métodos para la diferenciación y transducción in vitro de células b de memoria con vectores virales pseudotipados vsv-g
WO2014161821A1 (en) 2013-04-02 2014-10-09 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in eukaryotes
KR102192599B1 (ko) 2013-04-05 2020-12-18 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 식물의 게놈 내의 외인성 서열의 통합을 위한 방법 및 조성물
WO2015006437A1 (en) 2013-07-10 2015-01-15 Majzoub Joseph A Mrap2 knockouts
MX2016002306A (es) 2013-08-22 2016-07-08 Du Pont Promotor u6 de polimerasa iii de soja y metodos de uso.
EP3988654A1 (en) 2013-08-28 2022-04-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
WO2015033343A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Compositions and methods for expressing recombinant polypeptides
US10767188B2 (en) 2013-09-25 2020-09-08 Nutech Ventures Methods and compositions for obtaining useful plant traits
KR20150037550A (ko) * 2013-09-30 2015-04-08 주식회사 엘지화학 국지적으로 편광 해소 영역을 갖는 편광판 및 그 제조 방법
EP3057432B1 (en) 2013-10-17 2018-11-21 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
ES2881473T3 (es) 2013-10-17 2021-11-29 Sangamo Therapeutics Inc Métodos de suministro y composiciones para la modificación por ingeniería genética del genoma mediada por nucleasas
KR102269769B1 (ko) 2013-11-04 2021-06-28 코르테바 애그리사이언스 엘엘씨 최적 메이즈 유전자좌
CA2928855A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Dow Agrosciences Llc Optimal maize loci
NZ746567A (en) 2013-11-04 2019-09-27 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
CN105934524A (zh) 2013-11-11 2016-09-07 桑格摩生物科学股份有限公司 用于治疗亨廷顿氏病的方法和组合物
PL3492593T3 (pl) 2013-11-13 2022-04-19 Children's Medical Center Corporation Regulacja ekspresji genów, w której pośredniczą nukleazy
EP3757116A1 (en) 2013-12-09 2020-12-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for genome engineering
KR20230007559A (ko) 2013-12-20 2023-01-12 프레드 허친슨 캔서 센터 태그된 키메라 이펙터 분자 및 그의 리셉터
WO2015116680A1 (en) 2014-01-30 2015-08-06 Two Blades Foundation Plants with enhanced resistance to phytophthora
WO2015117081A2 (en) 2014-02-03 2015-08-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a beta thalessemia
AU2015218576B2 (en) 2014-02-24 2020-02-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
TW201538518A (zh) 2014-02-28 2015-10-16 Dow Agrosciences Llc 藉由嵌合基因調控元件所賦予之根部特異性表現
EP3116533B1 (en) 2014-03-12 2020-08-12 Precision Biosciences, Inc. Dystrophin gene exon deletion using engineered nucleases
CA2942762C (en) 2014-03-18 2023-10-17 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression
GB201407852D0 (en) 2014-05-02 2014-06-18 Iontas Ltd Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules
WO2015171603A1 (en) 2014-05-06 2015-11-12 Two Blades Foundation Methods for producing plants with enhanced resistance to oomycete pathogens
WO2015171932A1 (en) 2014-05-08 2015-11-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
DE102014209264B8 (de) * 2014-05-15 2017-01-12 Olympus Winter & Ibe Gmbh Hochfrequenz-Chirurgiegerät
JP2017518372A (ja) * 2014-05-30 2017-07-06 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 潜伏性ウイルス感染用の処置剤を送達するための組成物および方法
AU2015288157A1 (en) 2014-07-11 2017-01-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
WO2016019144A2 (en) 2014-07-30 2016-02-04 Sangamo Biosciences, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
RS62334B1 (sr) 2014-09-16 2021-10-29 Sangamo Therapeutics Inc Postupci i sastavi za inženjering genoma posredovan nukleazom i korekciju kod matičnih ćelija hematopoeze
AU2015324935B2 (en) 2014-10-01 2021-04-08 The General Hospital Corporation Methods for increasing efficiency of nuclease-induced homology-directed repair
WO2016100333A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Syngenta Participations Ag Pesticidal microrna carriers and use thereof
ES2785329T3 (es) 2014-12-23 2020-10-06 Syngenta Participations Ag Métodos y composiciones para identificar y enriquecer células que comprenden modificaciones genómicas específicas para el sitio
WO2016118726A2 (en) 2015-01-21 2016-07-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for identification of highly specific nucleases
EP4218771A1 (en) 2015-03-27 2023-08-02 Yeda Research and Development Co. Ltd Methods of treating motor neuron diseases
CA2981077A1 (en) 2015-04-03 2016-10-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of b-cells
CN107614690A (zh) 2015-04-15 2018-01-19 美国陶氏益农公司 用于转基因表达的植物启动子
AU2016250064A1 (en) 2015-04-15 2017-10-19 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
US11491342B2 (en) 2015-07-01 2022-11-08 Btl Medical Solutions A.S. Magnetic stimulation methods and devices for therapeutic treatments
WO2016176652A2 (en) 2015-04-29 2016-11-03 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified stem cells and uses thereof
WO2016179112A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Precision Biosciences, Inc. Precise deletion of chromoscomal sequences in vivo and treatment of nucleotide repeat expansion disorders using engineered nucleases
WO2016182917A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Children's Medical Center Corporation Targeting bcl11a enhancer functional regions for fetal hemoglobin reinduction
WO2016182881A1 (en) 2015-05-09 2016-11-17 Two Blades Foundation Late blight resistance gene from solanum americanum and methods of use
EP3294280A1 (en) 2015-05-11 2018-03-21 Yeda Research and Development Co., Ltd. Citrin inhibitors for the treatment of cancer
CN107849142B (zh) 2015-05-15 2022-04-26 综合医院公司 拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体
US11680244B2 (en) 2015-05-20 2023-06-20 The Regents Of The University Of California Method for generating human dendritic cells for immunotherapy
WO2016205825A1 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Precision Biosciences, Inc. Self-limiting viral vectors encoding nucleases
JP6980534B2 (ja) 2015-06-25 2021-12-15 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 造血幹細胞の増大、富化、および維持に関する方法および組成物
EP3322297A4 (en) 2015-07-13 2019-04-17 Sangamo Therapeutics, Inc. RELEASE METHOD AND COMPOSITIONS FOR NUCLEASE-DERIVED GENOMINE ENGINEERING
US10882894B2 (en) 2015-08-11 2021-01-05 Anie Philip Peptidic TGF-beta antagonists
WO2017031370A1 (en) 2015-08-18 2017-02-23 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for altering function and structure of chromatin loops and/or domains
CA2997909A1 (en) * 2015-09-08 2017-03-16 Precision Biosciences, Inc. Treatment of retinitis pigmentosa using engineered meganucleases
TW201718862A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 Dow Agrosciences Llc 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
TW201718861A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 道禮責任有限公司 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
IL287319B2 (en) 2015-10-05 2023-02-01 Prec Biosciences Inc Genetically modified cells containing a modified human t cell receptor alpha constant region gene
ES2883116T3 (es) 2015-10-05 2021-12-07 Prec Biosciences Inc Meganucleasas diseñadas con secuencias de reconocimiento encontradas en el gen de la región constante alfa del receptor de células T humanas
WO2017062790A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Two Blades Foundation Cold shock protein receptors and methods of use
AU2016340893B2 (en) 2015-10-22 2019-06-27 Corteva Agriscience Llc Plant promoter for transgene expression
MX2018005274A (es) 2015-10-30 2019-09-19 The Regents Of The Universtiy Of California Metodos para la generacion de celulas-t a partir de celulas madre y metodos inmunoterapeuticos que utilizan las celulas-t.
WO2017079428A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 President And Fellows Of Harvard College Site specific germline modification
US20170121726A1 (en) 2015-11-04 2017-05-04 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
EP3370513A1 (en) 2015-11-06 2018-09-12 The Jackson Laboratory Large genomic dna knock-in and uses thereof
CA3005878A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lymphocyte antigen cd5-like (cd5l)-interleukin 12b (p40) heterodimers in immunity
EP3389677B1 (en) 2015-12-18 2024-06-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of the t cell receptor
JP2018537112A (ja) 2015-12-18 2018-12-20 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｍｈｃ細胞受容体の標的化破壊
JP6846429B2 (ja) 2015-12-23 2021-03-24 プレシジョン バイオサイエンシズ，インク． ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子に見られる認識配列を有する操作されたメガヌクレアーゼ
AU2017204950A1 (en) 2016-01-06 2018-08-16 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for treating malignant, autoimmune and inflammatory diseases
KR20180095719A (ko) 2016-01-11 2018-08-27 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 키메라 단백질 및 면역요법 방법
IL260532B2 (en) 2016-01-11 2023-12-01 Univ Leland Stanford Junior Systems containing chaperone proteins and their uses for controlling gene expression
EP3405024B1 (en) 2016-01-21 2022-12-28 The State of Israel - Ministry of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (ARO) (Volcani Center) Parthenocarpic plants and methods of producing same
WO2017130205A1 (en) 2016-01-31 2017-08-03 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Autosomal-identical pluripotent stem cell populations having non-identical sex chromosomal composition and uses thereof
EP3411056A4 (en) 2016-02-02 2019-10-02 Sangamo Therapeutics, Inc. COMPOUNDS FOR NETWORKING DNA BINDING DOMAINS AND SPLITTING DOMAINS
US20190046497A1 (en) 2016-02-14 2019-02-14 Yeda Research And Development Co., Ltd. Methods of modulating protein exocytosis and uses of same in therapy
US11674952B2 (en) 2016-02-24 2023-06-13 The Rockefeller University Embryonic cell-based therapeutic candidate screening systems, models for Huntington's Disease and uses thereof
US20190216891A1 (en) 2016-03-06 2019-07-18 Yeda Research And Development Co., Ltd. Method for modulating myelination
AU2017235461B2 (en) 2016-03-15 2023-02-23 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
DE212017000118U1 (de) 2016-04-27 2018-12-05 University Of Puerto Rico 1,5-Disubstituierte 1,2,3-Triazole sind Inhibitoren von Rac/Cdc42-GTPasen
WO2017192741A1 (en) 2016-05-03 2017-11-09 Precision Biosciences, Inc. Engineered nucleases useful for treatment of hemophilia a
CN109415737A (zh) 2016-05-25 2019-03-01 嘉吉公司 用于在植物中产生突变的工程化核酸酶
EP3464333B1 (en) 2016-05-26 2024-05-08 Nunhems B.V. Seedless fruit producing plants
WO2017221225A1 (en) 2016-06-19 2017-12-28 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Screening for chemotherapy resistance in human haploid cells
MX2018015798A (es) 2016-06-22 2019-07-12 Univ North Carolina State Método para incrementar la eficiencia de uso de nitrógeno y/o la eficiencia de utilización de nitrógeno en plantas.
KR20230088522A (ko) 2016-07-21 2023-06-19 맥스시티 인코포레이티드 게놈 dna를 변경하기 위한 방법 및 조성물
IL247368A0 (en) 2016-08-18 2016-11-30 Yeda Res & Dev Diagnostic and therapeutic uses of exosomes
KR20220145913A (ko) 2016-08-24 2022-10-31 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 가공된 표적 특이적 뉴클레아제
BR112019005633A8 (pt) 2016-09-23 2023-04-11 Hutchinson Fred Cancer Res Tcrs específicos para antigênio ha-1 de histocompatibilidade (h) menor e usos dos mesmos
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
EP3518657B1 (en) 2016-10-03 2022-07-13 Corteva Agriscience LLC Plant promoter for transgene expression
CA3038508A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
DK3523326T3 (da) 2016-10-04 2020-08-03 Prec Biosciences Inc Samstimulerende domæner til anvendelse i genetisk modificerede celler
CR20190181A (es) * 2016-10-14 2019-08-21 Prec Biosciences Inc Meganucleasas diseñadas específicamente para el reconocimiento de secuencias en el genoma del virus de la hepatitis b.
WO2018073393A2 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Cellectis Tal-effector nuclease (talen) -modified allogenic cells suitable for therapy
US11219695B2 (en) 2016-10-20 2022-01-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of Fabry disease
US11020492B2 (en) 2016-10-31 2021-06-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Gene correction of SCID-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
WO2018076335A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance
WO2018106782A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Case Western Reserve University Methods and compositions for enhancing functional myelin production
WO2018122771A1 (en) 2016-12-29 2018-07-05 Ukko Inc. Methods for identifying and de-epitoping allergenic polypeptides
SG11201908527SA (en) 2017-03-15 2019-10-30 Hutchinson Fred Cancer Res High affinity mage-a1-specific tcrs and uses thereof
WO2018183908A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating ovarian tumors
US20200071773A1 (en) 2017-04-12 2020-03-05 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Tumor signature for metastasis, compositions of matter methods of use thereof
WO2018191476A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 Magenta Therapeutics, Inc. Aryl hydrocarbon receptor antagonists and uses thereof
US20210115407A1 (en) 2017-04-12 2021-04-22 The Broad Institute, Inc. Respiratory and sweat gland ionocytes
EP3612232A1 (en) 2017-04-21 2020-02-26 The Broad Institute, Inc. Targeted delivery to beta cells
AU2018254576B2 (en) 2017-04-21 2022-12-22 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases specific for recognition sequences in the PCSK9 gene
IL301115A (en) 2017-04-28 2023-05-01 Acuitas Therapeutics Inc New lipid carbonyl and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2018201144A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Precision Biosciences, Inc. Methods for reducing dna-induced cytotoxicity and enhancing gene editing in primary cells
WO2018204469A2 (en) 2017-05-03 2018-11-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (cftr) gene
WO2018204777A2 (en) 2017-05-05 2018-11-08 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncrna associated with target genotypes and phenotypes
IL252151A0 (en) 2017-05-07 2017-07-31 Fainzilber Michael Treatment of stress disorders
AU2018266698A1 (en) 2017-05-08 2019-11-28 Precision Biosciences, Inc. Nucleic acid molecules encoding an engineered antigen receptor and an inhibitory nucleic acid molecule and methods of use thereof
CA3064000A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Effector Therapeutics, Inc. Methods and compositions for cellular immunotherapy
WO2018220582A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Tropic Biosciences UK Limited Methods of selecting cells comprising genome editing events
GB201708665D0 (en) 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing extractability of solids from coffee beans
GB201708662D0 (en) 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing shelf-life of banana
WO2018224861A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 International Rice Research Institute Increasing hybrid seed production through higher outcrossing rate in cytoplasmic male sterile gramineae plants and related materials and methods
WO2018232195A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
IL271516B2 (en) 2017-06-23 2024-10-01 Univ Of Kentucky Research Foundation A method for modulating the alkaloid content of a plant, a method for producing a plant and a modified plant
CA3064601A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 The Broad Institute, Inc. Crispr/cas-adenine deaminase based compositions, systems, and methods for targeted nucleic acid editing
JP2020529834A (ja) 2017-06-30 2020-10-15 プレシジョン バイオサイエンシズ，インク． Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子の改変されたイントロンを含む遺伝子改変ｔ細胞
WO2019014581A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING THE ACTIVITY OF A CYTOTOXIC LYMPHOCYTE
US12105089B2 (en) 2017-07-17 2024-10-01 The Broad Institute, Inc. Cell atlas of the healthy and ulcerative colitis human colon
IL253642A0 (en) 2017-07-24 2017-09-28 Seger Rony Combined treatment for cancer
CA3071440C (en) 2017-07-31 2023-09-26 R. J. Reynolds Tobacco Company Methods and compositions for viral-based gene editing in plants
US10430138B2 (en) * 2017-08-10 2019-10-01 Canon Kabushiki Kaisha Communication apparatus
WO2019038771A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 Technion Research & Development Foundation Limited COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING ALCOHOL TOLERANCE IN YEAST
US20210106618A1 (en) 2017-09-06 2021-04-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for improving adoptive cell therapy
CA3071661A1 (en) 2017-09-06 2019-03-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Strep-tag specific chimeric receptors and uses thereof
AU2018336128B2 (en) 2017-09-19 2023-01-05 Tropic Biosciences UK Limited Modifying the specificity of plant non-coding RNA molecules for silencing gene expression
WO2019070856A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 Precision Biosciences, Inc. MODIFIED EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR PEPTIDES FOR USE IN GENETICALLY MODIFIED CELLS
WO2019071054A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING THE FUNCTION AND STRUCTURE OF BUCKLES AND / OR CHROMATIN DOMAINS
EP3697435A1 (en) 2017-10-20 2020-08-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods of immunotherapy targeting tigit and/or cd112r or comprising cd226 overexpression
WO2019089826A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Magenta Therapeutics Inc. Compositions and methods for the expansion of hematopoietic stem and progenitor cells
CN111683669A (zh) 2017-10-31 2020-09-18 美真达治疗公司 用于造血干细胞和祖细胞移植疗法的组合物和方法
EP3704238B1 (en) 2017-11-01 2024-01-03 Precision Biosciences, Inc. Engineered nucleases that target human and canine factor viii genes as a treatment for hemophilia a
KR20200079539A (ko) 2017-11-09 2020-07-03 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 시토카인 유도성 sh2-함유 단백질 (cish) 유전자의 유전자 변형
EP3710039A4 (en) 2017-11-13 2021-08-04 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR CANCER TREATMENT BY TARGETING THE CLEC2D-KLRB1 PATH
IL255664A0 (en) 2017-11-14 2017-12-31 Shachar Idit Hematopoietic stem cells with enhanced properties
WO2019108619A1 (en) 2017-11-28 2019-06-06 Two Blades Foundation Methods and compositions for enhancing the disease resistance of plants
WO2019109047A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Binding proteins specific for 5t4 and uses thereof
EP3707641A2 (en) 2017-12-03 2020-09-16 Seedx Technologies Inc. Systems and methods for sorting of seeds
WO2019106639A1 (en) 2017-12-03 2019-06-06 Seedx Technologies Inc. Systems and methods for sorting of seeds
US11541428B2 (en) 2017-12-03 2023-01-03 Seedx Technologies Inc. Systems and methods for sorting of seeds
WO2019113375A2 (en) 2017-12-06 2019-06-13 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the mobilization of hematopoietic stem and progenitor cells
CA3087527A1 (en) 2018-01-03 2019-07-11 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the expansion of hematopoietic stem and progenitor cells and treatment of inherited metabolic disorders
US11994512B2 (en) 2018-01-04 2024-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Single-cell genomic methods to generate ex vivo cell systems that recapitulate in vivo biology with improved fidelity
WO2019140278A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting core binding factor antigens
CN111566121A (zh) 2018-01-12 2020-08-21 巴斯夫欧洲公司 小麦7a染色体上决定每穗小穗数QTL的基因
EP3737226A1 (en) 2018-01-12 2020-11-18 Two Blades Foundation Stem rust resistance genes and methods of use
EP3749368A1 (en) 2018-02-08 2020-12-16 Yeda Research and Development Co. Ltd Methods of identifying and using agents for treating diseases associated with intestinal barrier dysfunction
CN112041335A (zh) 2018-02-26 2020-12-04 弗雷德哈钦森癌症研究中心 用于细胞免疫治疗的组合物和方法
CA3093716A1 (en) 2018-03-16 2019-09-19 Immusoft Corporation B cells genetically engineered to secrete follistatin and methods of using the same to treat follistatin-related diseases, conditions, disorders and to enhance muscle growth and strength
IT201800004253A1 (it) 2018-04-05 2019-10-05 Composizioni e metodi per il trattamento della tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica dominante ereditaria.
US11142750B2 (en) 2018-04-12 2021-10-12 Precision Biosciences, Inc. Optimized engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the Hepatitis B virus genome
KR102617818B1 (ko) 2018-04-12 2023-12-27 프리시젼 바이오사이언시스 인코포레이티드 인간 t 세포 수용체 알파 불변 영역 유전자에 대한 특이성을 갖는 최적화된 조작된 뉴클레아제
EP3781685A1 (en) 2018-04-18 2021-02-24 B.R.A.I.N. Biotechnology Research and Information Network AG Enrichment of genome-edited cells
SI3560330T1 (sl) 2018-04-24 2022-08-31 KWS SAAT SE & Co. KGaA Rastline z izboljšano prebavljivostjo in markerskimi haplotipi
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
US20210147831A1 (en) 2018-04-27 2021-05-20 The Broad Institute, Inc. Sequencing-based proteomics
GB201807192D0 (en) 2018-05-01 2018-06-13 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for reducing caffeine content in coffee beans
WO2019213660A2 (en) 2018-05-04 2019-11-07 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate innate lymphoid cell inflammatory responses
US11690921B2 (en) 2018-05-18 2023-07-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
US20210371932A1 (en) 2018-06-01 2021-12-02 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients
US12036240B2 (en) 2018-06-14 2024-07-16 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
EP3806619A1 (en) 2018-06-15 2021-04-21 Nunhems B.V. Seedless watermelon plants comprising modifications in an abc transporter gene
EP3810636A1 (en) 2018-06-25 2021-04-28 Yeda Research and Development Co. Ltd Systems and methods for increasing efficiency of genome editing
WO2020008412A1 (en) 2018-07-04 2020-01-09 Ukko Inc. Methods of de-epitoping wheat proteins and use of same for the treatment of celiac disease
WO2020014235A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 The Regents Of The University Of California Gene targets for t-cell-based immunotherapy
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
GB201812603D0 (en) 2018-08-02 2018-09-19 British American Tobacco Investments Ltd Method
US20210317429A1 (en) 2018-08-20 2021-10-14 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for optochemical control of crispr-cas9
CN112912387A (zh) 2018-08-22 2021-06-04 弗雷德哈钦森癌症研究中心 靶向kras或her2抗原的免疫疗法
CA3110089A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for adoptive t cell therapy incorporating induced notch signaling
SG11202102208WA (en) 2018-09-04 2021-04-29 Magenta Therapeutics Inc Aryl hydrocarbon receptor antagonists and methods of use
EP3853244A4 (en) 2018-09-18 2022-09-14 Sangamo Therapeutics, Inc. PROGRAMMED CELL DEATH 1 (PD1) SPECIFIC NUCLEASES
CA3113095A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Vnv Newco Inc. Arc-based capsids and uses thereof
WO2020068702A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Fred Hutchinson Cancer Research Center Chimeric receptor proteins and uses thereof
WO2020077236A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 The Broad Institute, Inc. Method for extracting nuclei or whole cells from formalin-fixed paraffin-embedded tissues
WO2020081730A2 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating microenvironment
IL262658A (en) 2018-10-28 2020-04-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Prevention of age related clonal hematopoiesis and diseases associated therewith
GB201817971D0 (en) 2018-11-02 2018-12-19 British American Tobacco Investments Ltd Method
CN113286815B (zh) 2018-11-09 2024-04-26 弗雷德哈钦森癌症中心 间皮素特异性t细胞受体及其在免疫治疗中的应用
GB201818715D0 (en) 2018-11-16 2019-01-02 British American Tobacco Investments Ltd Method
CA3124110A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof
US20220090047A1 (en) 2018-12-21 2022-03-24 Precision Biosciences, Inc. Genetic modification of the hydroxyacid oxidase 1 gene for treatment of primary hyperoxaluria
CA3123890A1 (en) 2019-01-04 2020-07-09 Cargill Incorporated Engineered nucleases to generate mutations in plants
US11739156B2 (en) 2019-01-06 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology Methods and compositions for overcoming immunosuppression
JP7523449B2 (ja) 2019-01-11 2024-07-26 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 活性剤の脂質ナノ粒子送達のための脂質
GB201900940D0 (en) 2019-01-23 2019-03-13 British American Tobacco Investments Ltd Method
US11857641B2 (en) 2019-02-06 2024-01-02 Sangamo Therapeutics, Inc. Method for the treatment of mucopolysaccharidosis type I
WO2020172343A2 (en) 2019-02-19 2020-08-27 Massachusetts Institute Of Technology Methods for treating injuries
KR20210130189A (ko) 2019-02-20 2021-10-29 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 Ras 신항원에 특이적인 결합 단백질 및 이의 용도
JP2022521010A (ja) 2019-02-21 2022-04-04 イッスム・リサーチ・デベロプメント・カムパニー・オブ・ザ・ヘブリュー・ユニバシティー・オブ・エルサレム リミテッド 薬物誘導性腎毒性を減少させるための方法
MX2021010611A (es) 2019-03-05 2021-11-12 The State Of Israel Ministry Of Agriculture & Rural Development Agricultural Res Organization Aro Vo Aves con genoma editado.
BR112021017703A8 (pt) 2019-03-11 2023-04-18 Hutchinson Fred Cancer Res Receptores de células t wt1 de alta avidez e usos dos mesmos
US20220154282A1 (en) 2019-03-12 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Detection means, compositions and methods for modulating synovial sarcoma cells
US20220152115A1 (en) 2019-03-13 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Microglial progenitors for regeneration of functional microglia in the central nervous system and therapeutics uses thereof
US20220143148A1 (en) 2019-03-14 2022-05-12 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate intestinal innate lymphoid cells
GB201903519D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd Introducing silencing activity to dysfunctional rna molecules and modifying their specificity against a gene of interest
GB201903520D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd Modifying the specificity of non-coding rna molecules for silencing genes in eukaryotic cells
GB201903521D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd No title
WO2020191069A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Modulation of type 2 immunity by targeting clec-2 signaling
US20220142948A1 (en) 2019-03-18 2022-05-12 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating metabolic regulators of t cell pathogenicity
WO2020205838A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods for the treatment of beta-thalassemia
EP3947682B1 (en) 2019-04-03 2023-10-11 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified immune cells comprising a microrna-adapted shrna (shrnamir)
EP3947646A1 (en) 2019-04-05 2022-02-09 Precision BioSciences, Inc. Methods of preparing populations of genetically-modified immune cells
AU2020268394A1 (en) 2019-05-07 2022-01-06 Precision Biosciences, Inc. Optimization of engineered meganucleases for recognition sequences
EP3969607A1 (en) 2019-05-13 2022-03-23 KWS SAAT SE & Co. KGaA Drought tolerance in corn
GB201906768D0 (en) 2019-05-14 2019-06-26 British American Tobacco Investments Ltd Method
WO2020232271A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for targeting multinucleated cells
AR118995A1 (es) 2019-05-25 2021-11-17 Kws Saat Se & Co Kgaa Mejorador de la inducción de haploides
WO2020243371A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating immune responses
WO2020243661A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 The Broad Institute, Inc. Methods for treating metabolic disorders by targeting adcy5
BR112021026248A2 (pt) 2019-06-27 2022-03-03 Two Blades Found Molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma proteína atrlp23 engenheirada, proteína atrlp23 engenheirada, cassete de expressão, vetor, célula hospedeira, planta ou célula vegetal, métodos para fazer uma proteína atrlp23 engenheirada, para fazer uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína atrlp23 engenheirada e para intensificar a resistência de uma planta
GB201909563D0 (en) 2019-07-03 2019-08-14 British American Tobacco Investments Ltd Method
GB201909562D0 (en) 2019-07-03 2019-08-14 British American Tobacco Investments Ltd Method
EP3994268A1 (en) 2019-07-04 2022-05-11 Ukko Inc. De-epitoped alpha gliadin and use of same for the management of celiac disease and gluten sensitivity
US20210071193A1 (en) 2019-07-12 2021-03-11 The Regents Of The University Of California Plants with enhanced resistance to bacterial pathogens
WO2021009692A1 (en) 2019-07-15 2021-01-21 Medimmune Limited Tripartite systems for protein dimerization and methods of use
IL268111A (en) 2019-07-16 2021-01-31 Fainzilber Michael Methods of treating pain
EP4004216A1 (en) 2019-07-25 2022-06-01 Precision BioSciences, Inc. Compositions and methods for sequential stacking of nucleic acid sequences into a genomic locus
EP4004212A1 (en) 2019-07-30 2022-06-01 The State of Israel, Ministry of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (ARO) (Volcani Institute) Methods of controlling cannabinoid synthesis in plants or cells and plants and cells produced thereby
EP4007596A1 (en) 2019-08-01 2022-06-08 Sana Biotechnology, Inc. Dux4 expressing cells and uses thereof
EP3772542A1 (en) 2019-08-07 2021-02-10 KWS SAAT SE & Co. KGaA Modifying genetic variation in crops by modulating the pachytene checkpoint protein 2
US20220282333A1 (en) 2019-08-13 2022-09-08 The General Hospital Corporation Methods for predicting outcomes of checkpoint inhibition and treatment thereof
WO2021035054A1 (en) 2019-08-20 2021-02-25 Precision Biosciences, Inc. Lymphodepletion dosing regimens for cellular immunotherapies
JP2022547809A (ja) 2019-08-20 2022-11-16 フレッド ハッチンソン キャンサー センター Ｗｔ－１に特異的なｔ細胞免疫療法
WO2021035170A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
US20230025289A1 (en) 2019-08-23 2023-01-26 Sana Biotechnology, Inc. Cd24 expressing cells and uses thereof
US20220298501A1 (en) 2019-08-30 2022-09-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
JP2022550608A (ja) 2019-10-02 2022-12-02 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド プリオン病の治療のためのジンクフィンガータンパク質転写因子
US20220324928A1 (en) 2019-10-02 2022-10-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Zinc Finger Protein Transcription Factors for Repressing Alpha-Synuclein Expression
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
US11793787B2 (en) 2019-10-07 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for enhancing anti-tumor immunity by targeting steroidogenesis
CN114846022A (zh) 2019-10-17 2022-08-02 科沃施种子欧洲股份两合公司 通过阻抑基因的下调增强作物的疾病抗性
US20220411479A1 (en) 2019-10-30 2022-12-29 Precision Biosciences, Inc. Cd20 chimeric antigen receptors and methods of use for immunotherapy
IL270306A (en) 2019-10-30 2021-05-31 Yeda Res & Dev Prevention and treatment of pre-myeloid and myeloid malignancies
US11844800B2 (en) 2019-10-30 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia
US20220401481A1 (en) 2019-11-01 2022-12-22 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the mobilization of hematopoietic stem and progenitor cells
WO2021100034A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Protalix Ltd. Removal of constructs from transformed cells
WO2021113765A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Precision Biosciences, Inc. Optimized engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the hepatitis b virus genome
CA3160096A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Bruce J. Mccreedy Jr. Methods for cancer immunotherapy
EP3835309A1 (en) 2019-12-13 2021-06-16 KWS SAAT SE & Co. KGaA Method for increasing cold or frost tolerance in a plant
IL271656A (en) 2019-12-22 2021-06-30 Yeda Res & Dev System and methods for identifying cells that have undergone genome editing
EP4096647A1 (en) 2020-01-30 2022-12-07 Yeda Research and Development Co. Ltd Treating acute liver disease with tlr-mik inhibitors
WO2021158915A1 (en) 2020-02-06 2021-08-12 Precision Biosciences, Inc. Recombinant adeno-associated virus compositions and methods for producing and using the same
AU2021241643A1 (en) 2020-03-25 2022-11-24 Sana Biotechnology, Inc. Hypoimmunogenic neural cells for the treatment of neurological disorders and conditions
US20230263121A1 (en) 2020-03-31 2023-08-24 Elo Life Systems Modulation of endogenous mogroside pathway genes in watermelon and other cucurbits
CN116096902A (zh) 2020-04-09 2023-05-09 R·J·雷诺兹烟草公司 用于调节烟草中尼古丁水平的方法
IL297690A (en) 2020-04-27 2022-12-01 Magenta Therapeutics Inc Methods and compositions for transduction of hematopoietic stem cells and progenitor cells in a living body.
CN115803435A (zh) 2020-05-06 2023-03-14 塞勒克提斯公司 用于在细胞基因组中靶向插入外源序列的方法
US20230279440A1 (en) 2020-05-06 2023-09-07 Cellectis S.A. Methods to genetically modify cells for delivery of therapeutic proteins
WO2021231259A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Precision Biosciences, Inc. Self-limiting viral vectors encoding nucleases
CA3177407A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 James M. Wilson Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
CA3172171A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 Victor Bartsevich Treatment of retinitis pigmentosa using improved engineered meganucleases
US20230190871A1 (en) 2020-05-20 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Methods and compositions for treatment of viral infections
UY39237A (es) 2020-05-29 2021-12-31 Kws Saat Se & Co Kgaa Inducción de haploides en plantas
AU2021308681A1 (en) 2020-07-16 2023-03-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
WO2022035793A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Precision Biosciences, Inc. Antibodies and fragments specific for b-cell maturation antigen and uses thereof
WO2022036150A1 (en) 2020-08-13 2022-02-17 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating sensitized patients with hypoimmunogenic cells, and associated methods and compositions
EP4199703A1 (en) 2020-08-18 2023-06-28 International Rice Research Institute Methods of increasing outcrossing rates in gramineae
CA3172292A1 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Cassandra GORSUCH Engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the transthyretin gene
EP4204545A2 (en) 2020-08-25 2023-07-05 Kite Pharma, Inc. T cells with improved functionality
WO2022066973A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting pbk or oip5 antigens
WO2022066965A2 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting sox2 antigens
IL301393A (en) 2020-09-25 2023-05-01 Sangamo Therapeutics Inc Zinc finger proteins are fused to edit nuclear bases
JP2023545999A (ja) 2020-10-05 2023-11-01 プロタリクス リミテッド ダイサー（ｄｉｃｅｒ）様ノックアウト植物細胞
WO2022076353A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for treating mage-a1-expressing disease
US20230365995A1 (en) 2020-10-07 2023-11-16 Precision Biosciences, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2022079719A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method of treating myeloid malignancies
WO2022087527A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 Elo Life Systems, Inc. Methods for producing vanilla plants with improved flavor and agronomic production
AU2021369793A1 (en) 2020-10-29 2023-06-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav capsids and compositions containing same
WO2022104062A1 (en) 2020-11-12 2022-05-19 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases having specificity for recognition sequences in the dystrophin gene
JP2023550979A (ja) 2020-11-26 2023-12-06 ウッコ インコーポレイテッド 改変された高分子量グルテニンサブユニット及びその使用
WO2022132836A2 (en) 2020-12-14 2022-06-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
IL279559A (en) 2020-12-17 2022-07-01 Yeda Res & Dev Controlling the ubiquitination process of mlkl for disease treatment
MX2023006207A (es) 2020-12-31 2023-08-09 Sana Biotechnology Inc Métodos y composiciones para modular la actividad de linfocitos t con receptores de antígenos quiméricos (t-car).
US20240299585A1 (en) 2021-01-08 2024-09-12 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the hydroxyacid oxidase 1 gene
EP4284823A1 (en) 2021-01-28 2023-12-06 Precision BioSciences, Inc. Modulation of tgf beta signaling in genetically-modified eukaryotic cells
WO2022197776A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for hematopoietic stem cell mobilization for stem cell transplants in multiple myeloma patients
CA3173051A1 (en) 2021-04-22 2022-10-22 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases that target human mitochondrial genomes
US20240141311A1 (en) 2021-04-22 2024-05-02 North Carolina State University Compositions and methods for generating male sterile plants
CA3173245A1 (en) 2021-04-22 2022-10-22 James Jefferson Smith Engineered meganucleases that target human mitochondrial genomes
AR125467A1 (es) 2021-04-27 2023-07-19 Univ Pennsylvania Cápsides de virus adenoasociados derivados de porcinos y usos de los estos
EP4337197A1 (en) 2021-05-10 2024-03-20 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Pharmaceutical compositions for treating neurological conditions
US20240218356A1 (en) 2021-05-11 2024-07-04 Two Blades Foundation Methods for preparing a library of plant disease resistance genes for functional testing for disease resistance
EP4342983A1 (en) 2021-05-18 2024-03-27 Cells & Genes Biotech (Shanghai) Co., Ltd Method for modifying cell
AU2022283291A1 (en) 2021-05-27 2023-11-02 Sana Biotechnology, Inc. Hypoimmunogenic cells comprising engineered hla-e or hla-g
WO2023275255A1 (en) 2021-07-02 2023-01-05 Tropic Biosciences UK Limited Delay or prevention of browning in banana fruit
WO2023287827A2 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Sana Biotechnology, Inc. Altered expression of y chromosome-linked antigens in hypoimmunogenic cells
TW202317602A (zh) 2021-07-15 2023-05-01 福瑞德哈金森腫瘤中心 嵌合多肽
CN118368974A (zh) 2021-07-30 2024-07-19 科沃施种子欧洲股份两合公司 具有提高的消化率和标记单倍型的植物
JP2024531910A (ja) 2021-08-04 2024-09-03 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト Ｌａｔ活性化キメラ抗原受容体ｔ細胞及びその使用方法
WO2023018621A1 (en) 2021-08-10 2023-02-16 Gamida-Cell Ltd. Engineered nk cells, methods of their production and uses thereof
IL310691A (en) 2021-08-11 2024-04-01 Sana Biotechnology Inc Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy
JP2024535677A (ja) 2021-08-11 2024-10-02 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド 即時血液媒介性炎症反応を減少させるための同種細胞療法を目的とした遺伝子改変細胞
JP2024534771A (ja) 2021-08-11 2024-09-26 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド 補体媒介性炎症反応を低減するための同種異系細胞療法のための遺伝子改変細胞
MX2024001443A (es) 2021-08-11 2024-05-15 Sana Biotechnology Inc Sistemas inducibles para alterar la expresión génica en células hipoinmunógenas.
WO2023019226A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy
GB202112866D0 (en) 2021-09-09 2021-10-27 Tropic Biosciences Uk Ltd Resistance to fusarium wilt in a banana
GB202112865D0 (en) 2021-09-09 2021-10-27 Tropic Biosciences Uk Ltd Resistance to black sigatoka disease in banana
CA3233676A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 The Sainsbury Laboratory Plant disease resistance genes against stem rust and methods of use
WO2023064872A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Precision Biosciences, Inc. Combinations of anti-bcma car t cells and gamma secretase inhibitors
AU2022371430A1 (en) 2021-10-19 2024-05-30 Precision Biosciences, Inc. Gene editing methods for treating alpha-1 antitrypsin (aat) deficiency
WO2023070002A2 (en) 2021-10-19 2023-04-27 Precision Biosciences, Inc. Gene editing methods for treating alpha-1 antitrypsin (aat) deficiency
WO2023069790A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Sana Biotechnology, Inc. Methods of engineering allogeneic t cells with a transgene in a tcr locus and associated compositions and methods
CA3237482A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
WO2023081767A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Precision Biosciences, Inc. Methods for immunotherapy
EP4430206A1 (en) 2021-11-10 2024-09-18 Encodia, Inc. Methods for barcoding macromolecules in individual cells
WO2023087019A2 (en) 2021-11-15 2023-05-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
WO2023091910A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Precision Biosciences, Inc. Methods for cancer immunotherapy
EP4437092A1 (en) 2021-11-26 2024-10-02 Epigenic Therapeutics Inc. Method of modulating pcsk9 and uses thereof
KR20240130158A (ko) 2021-12-03 2024-08-28 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 효율적인 생체내 전달을 위한 조성물 및 방법
AU2022413848A1 (en) 2021-12-17 2024-06-27 Tropic Biosciences UK Limited Modified agrobacteria for editing plants
KR20240117153A (ko) 2021-12-22 2024-07-31 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 핵염기 편집을 위한 신규한 아연 핑거 융합 단백질
KR20240137574A (ko) 2021-12-23 2024-09-20 사나 바이오테크놀로지, 인크. 자가면역 질환 치료를 위한 키메라 항원 수용체[chimeric antigen receptor, car] t 세포 및 관련 방법
WO2023133525A1 (en) 2022-01-07 2023-07-13 Precision Biosciences, Inc. Optimized polynucleotides for protein expression
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
AU2023215810A1 (en) 2022-02-03 2024-08-15 Nicoventures Trading Limited Method of modulating alkaloid content in tobacco plants
KR20240132132A (ko) 2022-02-03 2024-09-02 니코벤처스 트레이딩 리미티드 담배 식물들에서 알칼로이드 함량을 조절하는 방법
MX2024009605A (es) 2022-02-04 2024-08-14 Nicoventures Trading Ltd Metodo para modular el contenido de alcaloides en plantas de tabaco.
WO2023154578A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating patients exhibiting a prior failed therapy with hypoimmunogenic cells
IL315000A (en) 2022-02-17 2024-10-01 Sana Biotechnology Inc Transgenic CD47 proteins and their uses
WO2023161178A1 (en) 2022-02-22 2023-08-31 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Cgas super-enzymes for cancer immunotherapy
WO2023173123A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells and compositions and uses thereof
WO2023196818A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 The Regents Of The University Of California Genetic complementation compositions and methods
GB202205149D0 (en) 2022-04-07 2022-05-25 Nicoventures Trading Ltd Method
GB202205148D0 (en) 2022-04-07 2022-05-25 Nicoventures Trading Ltd Method
GB202205561D0 (en) 2022-04-14 2022-06-01 Nicoventures Trading Ltd Method
GB202205562D0 (en) 2022-04-14 2022-06-01 Nicoventures Trading Ltd Method
GB202206109D0 (en) 2022-04-27 2022-06-08 Nicoventures Trading Ltd Method
GB202206107D0 (en) 2022-04-27 2022-06-08 Nicoventures Trading Ltd Method
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2023215498A2 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Modernatx, Inc. Compositions and methods for cd28 antagonism
WO2023220035A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus compositions and methods for gene therapy
WO2023220043A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified genome for gene therapy
WO2023220040A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified capsid for gene therapy
EP4278891A1 (en) 2022-05-20 2023-11-22 KWS SAAT SE & Co. KGaA Clubroot resistance and markers in brassica
WO2024015966A2 (en) 2022-07-15 2024-01-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav having aav clade d and clade e capsids and compositions containing same
WO2024040222A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Generation Bio Co. Cleavable closed-ended dna (cedna) and methods of use thereof
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2024042199A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 KWS SAAT SE & Co. KGaA Use of paired genes in hybrid breeding
WO2024056902A2 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Christopher Shaw Compositions and methods for treating neurological diseases
WO2024079157A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 KWS SAAT SE & Co. KGaA Virus and insect resistance and markers in barley
WO2024097639A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Modernatx, Inc. Hsa-binding antibodies and binding proteins and uses thereof
WO2024102277A2 (en) 2022-11-07 2024-05-16 Syngenta Crop Protection Ag Genes altering soy plant flowering time and/or maturation and uses thereof
WO2024118866A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Modernatx, Inc. Gpc3-specific antibodies, binding domains, and related proteins and uses thereof
WO2024124044A1 (en) 2022-12-07 2024-06-13 The Brigham And Women’S Hospital, Inc. Compositions and methods targeting sat1 for enhancing anti¬ tumor immunity during tumor progression
WO2024126696A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 King's College London Compositions and methods for treating neurological diseases
WO2024148167A1 (en) 2023-01-05 2024-07-11 Precision Biosciences, Inc. Optimized engineered meganucleases having specificity for the human t cell receptor alpha constant region gene
WO2024151541A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Sana Biotechnology, Inc. Type-1 diabetes autoimmune mouse
GB202300905D0 (en) 2023-01-20 2023-03-08 Nicoventures Trading Ltd Method
WO2024161022A2 (en) 2023-02-03 2024-08-08 King's College London Compositions and methods for treating neurological diseases
WO2024167814A1 (en) 2023-02-06 2024-08-15 Bluerock Therapeutics Lp Degron fusion proteins and methods of production and use thereof
GB202303077D0 (en) 2023-03-02 2023-04-19 Univ Oslo Brassica plants with improved seed retention
WO2024192141A1 (en) 2023-03-13 2024-09-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Treatment of cancers having a drug-resistant mesenchymal cell state
GB202305021D0 (en) 2023-04-04 2023-05-17 Tropic Biosciences Uk Ltd Methods for generating breaks in a genome

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE122007000007I2 (de) 1986-04-09 2010-12-30 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US6156304A (en) 1990-12-20 2000-12-05 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Gene transfer for studying and treating a connective tissue of a mammalian host
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5792640A (en) 1992-04-03 1998-08-11 The Johns Hopkins University General method to clone hybrid restriction endonucleases using lig gene
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US6395959B1 (en) 1992-05-05 2002-05-28 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I SceI and the use thereof
US5474896A (en) 1992-05-05 1995-12-12 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US5997861A (en) 1994-10-31 1999-12-07 Burstein Laboratories, Inc. Antiviral supramolecules containing target-binding molecules and therapeutic molecules bound to spectrin
US5830729A (en) 1996-04-18 1998-11-03 Institut Pasteur I Sce I-induced gene replacement and gene conversion in embryonic stem cells
US6265196B1 (en) 1996-05-07 2001-07-24 Johns Hopkins University Methods for inactivating target DNA and for detecting conformational change in a nucleic acid
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
US6060082A (en) 1997-04-18 2000-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery
US7041814B1 (en) 1998-02-18 2006-05-09 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Enterobacter cloacae for diagnostics and therapeutics
JP2002535994A (ja) 1999-02-03 2002-10-29 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレイション 標的ｄｎａのインビボ除去による遺伝子修復
JP2002535995A (ja) 1999-02-03 2002-10-29 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレイション 染色体標的部位での二本鎖ｄｎａ切断の誘導を含む遺伝子修復
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US6511676B1 (en) 1999-11-05 2003-01-28 Teni Boulikas Therapy for human cancers using cisplatin and other drugs or genes encapsulated into liposomes
US6593308B2 (en) 1999-12-03 2003-07-15 The Regents Of The University Of California Targeted drug delivery with a hyaluronan ligand
AU2001233099A1 (en) 2000-01-31 2001-08-07 Pharmacia And Upjohn Company Crystallization and structure determination of staphylococcus aureus nad synthetase
DE10131786A1 (de) 2001-07-04 2003-01-16 Sungene Gmbh & Co Kgaa Rekombinationssysteme und Verfahren zum Entfernen von Nukleinsäuresequenzen aus dem Genom eukaryotischer Organismen
ATE375388T1 (de) 2001-07-27 2007-10-15 Us Gov Health & Human Serv Systeme zur stellengerichteten in-vivo-mutagenese mit oligonukleotiden
AU2003251286B2 (en) 2002-01-23 2007-08-16 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
ES2292994T3 (es) 2002-03-15 2008-03-16 Cellectis Meganucleasas hibridas y de cadena sencilla y su utilizacion.
DE10226316B4 (de) * 2002-06-10 2004-10-28 Siemens Ag Verfahren zum Einrichten eines Zusatzdientes in einem Mobilfunknetz
WO2004037977A2 (en) 2002-09-05 2004-05-06 California Institute Of Thechnology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
AU2003290518A1 (en) 2002-09-06 2004-04-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions concerning designed highly-specific nucleic acid binding proteins
US7285699B2 (en) 2002-10-07 2007-10-23 Stowers Institute For Medical Research Ends-out gene targeting method
US20030175968A1 (en) 2002-10-30 2003-09-18 Golic Kent G. Gene targeting method
EP2522723B1 (en) * 2003-01-28 2014-12-03 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
PT2025756E (pt) 2003-11-18 2011-09-28 Bayer Bioscience Nv Inserção direccionada de adn em plantas
EP1591521A1 (en) 2004-04-30 2005-11-02 Cellectis I-Dmo I derivatives with enhanced activity at 37 degrees C and use thereof
EP2325307A1 (en) 2005-03-15 2011-05-25 Cellectis I-crel meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof
WO2006097784A1 (en) 2005-03-15 2006-09-21 Cellectis I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof
WO2007034262A1 (en) 2005-09-19 2007-03-29 Cellectis Heterodimeric meganucleases and use thereof
WO2007049095A1 (en) 2005-10-25 2007-05-03 Cellectis Laglidadg homing endonuclease variants having mutations in two functional subdomains and use thereof
WO2007060495A1 (en) 2005-10-25 2007-05-31 Cellectis I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof
WO2007093836A1 (en) 2006-02-13 2007-08-23 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from a xp gene and uses thereof
WO2008010009A1 (en) 2006-07-18 2008-01-24 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from a rag gene and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP3795682A2 (en) 2021-03-24
US20120028314A1 (en) 2012-02-02
EP3246403A3 (en) 2018-02-14
EP2341135A3 (en) 2011-10-12
US20120040405A1 (en) 2012-02-16
US20070117128A1 (en) 2007-05-24
US8119361B2 (en) 2012-02-21
US20120021465A1 (en) 2012-01-26
CA3055968A1 (en) 2007-04-26
DK2484758T3 (da) 2014-01-06
US20150135345A1 (en) 2015-05-14
EP2662442A1 (en) 2013-11-13
EP2484758A1 (en) 2012-08-08
JP6050611B2 (ja) 2016-12-21
JP2012196214A (ja) 2012-10-18
EP3246403B1 (en) 2020-08-26
EP2650365B1 (en) 2016-09-14
ES2582091T3 (es) 2016-09-09
DK2650365T3 (en) 2016-12-05
US20130227720A1 (en) 2013-08-29
EP2650365A1 (en) 2013-10-16
EP2484758B1 (en) 2013-10-02
JP5937292B2 (ja) 2016-06-22
JP2021054830A (ja) 2021-04-08
ES2533370T3 (es) 2015-04-09
EP2327774A2 (en) 2011-06-01
EP2650366A3 (en) 2014-02-12
DK2360244T3 (en) 2015-04-07
US8377674B2 (en) 2013-02-19
EP1945762B1 (en) 2013-05-01
ES2539616T3 (es) 2015-07-02
US8133697B2 (en) 2012-03-13
EP2341135A2 (en) 2011-07-06
CA2626262C (en) 2015-09-08
US8304222B1 (en) 2012-11-06
US20120264189A1 (en) 2012-10-18
US20200109383A1 (en) 2020-04-09
DK1945762T3 (da) 2013-07-29
JP6148437B2 (ja) 2017-06-14
CA2891996A1 (en) 2007-04-26
JP2022070928A (ja) 2022-05-13
ES2602184T3 (es) 2017-02-20
US8148098B2 (en) 2012-04-03
US20170335299A1 (en) 2017-11-23
ES2440801T3 (es) 2014-01-30
JP2009511085A (ja) 2009-03-19
DK2662442T3 (en) 2015-07-06
EP2357226B1 (en) 2012-03-14
US20120030783A1 (en) 2012-02-02
EP2662442B1 (en) 2015-03-25
CA2626262A1 (en) 2007-04-26
US20210284980A1 (en) 2021-09-16
WO2007047859A2 (en) 2007-04-26
US8163514B2 (en) 2012-04-24
AU2006304668B2 (en) 2013-03-07
US20120015421A1 (en) 2012-01-19
EP1945762A2 (en) 2008-07-23
ATE549401T1 (de) 2012-03-15
ES2829549T3 (es) 2021-06-01
EP3246403A2 (en) 2017-11-22
JP2013034473A (ja) 2013-02-21
US20120070877A1 (en) 2012-03-22
US8119381B2 (en) 2012-02-21
EP3795682A3 (en) 2021-06-16
US20240228994A9 (en) 2024-07-11
EP2628794B1 (en) 2016-05-04
US20120040406A1 (en) 2012-02-16
EP2628794A3 (en) 2013-12-04
DK2628794T3 (en) 2016-08-15
DK3246403T3 (da) 2020-10-26
EP2628794A2 (en) 2013-08-21
US8129134B2 (en) 2012-03-06
JP2017048179A (ja) 2017-03-09
JP2018039808A (ja) 2018-03-15
US20120021521A1 (en) 2012-01-26
US8124369B2 (en) 2012-02-28
EP2368981A3 (en) 2011-10-12
US8143015B2 (en) 2012-03-27
EP2360244B1 (en) 2014-12-24
EP2368981A2 (en) 2011-09-28
US8143016B2 (en) 2012-03-27
EP2327774A3 (en) 2011-09-28
EP2357226A1 (en) 2011-08-17
EP2650366B1 (en) 2017-03-22
DK2357226T3 (da) 2012-06-25
DK2650366T3 (en) 2017-07-10
ES2425022T3 (es) 2013-10-10
US8021867B2 (en) 2011-09-20
US20120266266A1 (en) 2012-10-18
EP2650366A2 (en) 2013-10-16
AU2006304668A1 (en) 2007-04-26
ES2626025T3 (es) 2017-07-21
US20120028315A1 (en) 2012-02-02
US20120015406A1 (en) 2012-01-19
JP2019077698A (ja) 2019-05-23
EP2360244A1 (en) 2011-08-24
ES2384440T3 (es) 2012-07-04
US20240132862A1 (en) 2024-04-25
WO2007047859A3 (en) 2007-11-15
US20120021520A1 (en) 2012-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2024001024A (ja) 配列特異性およびｄｎａ－結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
US20130224863A1 (en) Rationally-designed meganucleases with recognition sequences found in dnase hypersensitive regions of the human genome

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231012

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20231012

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240910

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20241004