JP2023138509A - 単細胞選別のための細胞培養プラットホームおよびiPSCの再プログラミングの増強 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)を生成し、培養するためのフィーダーフリー条件を含めた、幹細胞を培養するための細胞培養条件を提供する。【解決手段】本発明は、フィーダーフリー環境における多能性細胞の長期培養;フィーダーフリー環境における細胞の再プログラミング;多能性細胞の単細胞への解離;多能性細胞の細胞選別;未分化状態の維持;再プログラミングの効率の改善;およびナイーブ多能性細胞の生成を可能にする培養プラットフォームを提供する。【選択図】なし
Description
配列表に関する陳述
本願に関連した配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、明細書中に参考として援用される。配列表を含むテキストファイルの名前は、FATE_094_00WO_ST25.txtである。このキストファイルは4 KBで、2011年12月15日に作成され、EFS-Webによって電子的に提出される。
本願に関連した配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、明細書中に参考として援用される。配列表を含むテキストファイルの名前は、FATE_094_00WO_ST25.txtである。このキストファイルは4 KBで、2011年12月15日に作成され、EFS-Webによって電子的に提出される。
関連出願への相互参照
本願は、米国特許法第119条(e)項の下、2010年12月22日に出願された米国仮特許出願第61/426,369号、および2011年6月14日に出願された米国仮特許出願第61/496,991号の利益を主張し、この米国仮特許出願の各々は、それらの全体が参考として援用される。
本願は、米国特許法第119条(e)項の下、2010年12月22日に出願された米国仮特許出願第61/426,369号、および2011年6月14日に出願された米国仮特許出願第61/496,991号の利益を主張し、この米国仮特許出願の各々は、それらの全体が参考として援用される。
発明の背景
技術分野
本発明は、一般に、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)を生成し、培養するためのフィーダーフリー条件を含めた、幹細胞を培養するための細胞培養条件、培地、および培養プラットフォームに関する。
技術分野
本発明は、一般に、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)を生成し、培養するためのフィーダーフリー条件を含めた、幹細胞を培養するための細胞培養条件、培地、および培養プラットフォームに関する。
関連技術の説明
多能性幹細胞生物学を適用することにより、再生医療の新しい扉が開かれる。着床前胚盤胞を成長因子のカクテル中で培養することによってヒト胚性幹細胞(hESC)を得ることにより、in vitroまたはin vivoにおいて、拡大した自己再生細胞集団を療法に関連する細胞系統に分化させることができる、多くの有望な細胞療法の手法が導かれている。ESC生物学のさらなる適用において、および着床前遺伝子解析を用いることによって、いくつかの遺伝病の背景からESC系を得、したがって、これらの疾患を組織培養ディッシュにおいてモデリングすることが可能になった。しかし、ESC技術にはいくらかの制限がある:ESCを得ることができる遺伝的背景の範囲は技術的かつ政治的に制限され、ESCの遺伝的背景は必ずしも公知ではなく、ESC由来細胞療法の使用は基本的に同種異系移植であり、それには従来の組織/臓器移植と同じ拒絶反応の危険性が伴う。
多能性幹細胞生物学を適用することにより、再生医療の新しい扉が開かれる。着床前胚盤胞を成長因子のカクテル中で培養することによってヒト胚性幹細胞(hESC)を得ることにより、in vitroまたはin vivoにおいて、拡大した自己再生細胞集団を療法に関連する細胞系統に分化させることができる、多くの有望な細胞療法の手法が導かれている。ESC生物学のさらなる適用において、および着床前遺伝子解析を用いることによって、いくつかの遺伝病の背景からESC系を得、したがって、これらの疾患を組織培養ディッシュにおいてモデリングすることが可能になった。しかし、ESC技術にはいくらかの制限がある:ESCを得ることができる遺伝的背景の範囲は技術的かつ政治的に制限され、ESCの遺伝的背景は必ずしも公知ではなく、ESC由来細胞療法の使用は基本的に同種異系移植であり、それには従来の組織/臓器移植と同じ拒絶反応の危険性が伴う。
大きな進歩では、多能性細胞集団を成体の最終分化細胞から生成し、そのように得られた細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)と称される。iPSC技術により、任意のドナー由来の細胞を多能性の自己再生性の状態に再プログラミングすることが可能になり、したがって、任意の遺伝的背景から均一の細胞集団を拡大することが可能になる。iPSCは、ESCに関する倫理的な考慮事項を克服し、ハイスループットな薬物スクリーニングのための任意の遺伝的なヒト疾患のモデルまたは生体異物薬物毒性スクリーニングのための肝細胞および心筋細胞を得るために使用することができる。さらに、iPSCにより、最終的に、移植片拒絶を予防することができる、自己移植における患者自身の細胞から生成した細胞療法がもたらされ得る。発現および分化の分析により、クローンiPSC培養物の間に複数のESC系を比較した際に認められるものと同程度の変動があり、iPSCが分子レベルではESCに非常に近いことが示されている。
iPSCは、一般に、完全な再プログラミングのために必要であることが示されている
いくつかの重要な遺伝子、すなわち、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28およびNanogの組合せを異所性発現させることにより生成されている。iPSCは、最初に、重要な転写因子を発現させるための組込みウイルス系を用いて生成された。現在、ポリシストロニック系および誘導系を含めたレトロウイルス系およびレンチウイルス系が、iPSCの生成において首尾よく用いられている。しかし、挿入変異誘発に起因する恒久的なゲノムの変化およびiPSC分化後の外因性の遺伝子再活性化の潜在性により、その後の薬物スクリーニングおよびこれらの方法によって生成された細胞の治療への適用に関する潜在的な問題が示され得る。実際に、同じウイルス系を用いて生成したiPSCクローン間で有意な差異が報告されており、げっ歯類において、分化したニューロスフェアとして移植するとクローンの大部分が腫瘍を形成する。研究により、同じウイルスによる方法を用いて生成したiPSCは、一度分化すると異なって挙動し得ることが示唆されている。異所性遺伝子組込み部位が異なることにより、異なる挿入変異誘発および導入遺伝子の発現の後成的な制御がもたらされ得る。組込み系を含むiPSC生成方法については、多くのクローンを得、スクリーニングして、多能性の状態と分化した状態のどちらにおいても安定であるクローンを同定することが必要になる場合がある。したがって、所与のドナー細胞供給源からクローンiPSCを急速に得るための方法が有益であることになる。iPSCを生成するために、アデノウイルスまたはエピソームの一過性発現などの非組込み系を用いることも、効率が低いが実証されている。これらの系では、iPSCの生成における安全性および安定性の問題が克服され得るが、任意のDNAに基づく再プログラミング方法を用いる場合にはゲノムへの組込みの潜在性があり、これにより、iPSC由来細胞療法の開発においてそれらを用いる前に評価する必要がある。
いくつかの重要な遺伝子、すなわち、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28およびNanogの組合せを異所性発現させることにより生成されている。iPSCは、最初に、重要な転写因子を発現させるための組込みウイルス系を用いて生成された。現在、ポリシストロニック系および誘導系を含めたレトロウイルス系およびレンチウイルス系が、iPSCの生成において首尾よく用いられている。しかし、挿入変異誘発に起因する恒久的なゲノムの変化およびiPSC分化後の外因性の遺伝子再活性化の潜在性により、その後の薬物スクリーニングおよびこれらの方法によって生成された細胞の治療への適用に関する潜在的な問題が示され得る。実際に、同じウイルス系を用いて生成したiPSCクローン間で有意な差異が報告されており、げっ歯類において、分化したニューロスフェアとして移植するとクローンの大部分が腫瘍を形成する。研究により、同じウイルスによる方法を用いて生成したiPSCは、一度分化すると異なって挙動し得ることが示唆されている。異所性遺伝子組込み部位が異なることにより、異なる挿入変異誘発および導入遺伝子の発現の後成的な制御がもたらされ得る。組込み系を含むiPSC生成方法については、多くのクローンを得、スクリーニングして、多能性の状態と分化した状態のどちらにおいても安定であるクローンを同定することが必要になる場合がある。したがって、所与のドナー細胞供給源からクローンiPSCを急速に得るための方法が有益であることになる。iPSCを生成するために、アデノウイルスまたはエピソームの一過性発現などの非組込み系を用いることも、効率が低いが実証されている。これらの系では、iPSCの生成における安全性および安定性の問題が克服され得るが、任意のDNAに基づく再プログラミング方法を用いる場合にはゲノムへの組込みの潜在性があり、これにより、iPSC由来細胞療法の開発においてそれらを用いる前に評価する必要がある。
切り出し可能なウイルス系およびゲノム全域にわたる発現プロファイリングにより、発現カセットが組み込まれたiPSCは、ウイルス因子が切り取られた同じクローンよりもESCと類似していないことが示されている。さらに、現在では、最も一般的に使用される転写因子をE.coliにおいて細胞透過性ペプチドとの融合タンパク質として発現させる、タンパク質のみの再プログラミングが実証されている。精製タンパク質の複数回投与をマウス線維芽細胞に適用することにより、iPSCが生成した。このタンパク質のみの系を用いた再プログラミングの効率は非常に低かった。これは、タンパク質形質導入の効率、タンパク質の比活性および/またはタンパク質の安定性に起因する可能性がある。
多能性遺伝子を異所性発現させることまたはそれらをタンパク質形質導入またはmRNAによって導入することによる分化細胞の再プログラミングのプロセスには、数ヶ月、および熟練の幹細胞生物学者の知識が必要である。再プログラミングされた細胞の同定は、最初に、目測でのESC様コロニー形態のスクリーニングである。そのようなコロニーは手動で選び取らなければならず、通常、機械的に継代し、拡大する。多能性因子を導入することによっても、形質転換された細胞コロニーならびに不完全に再プログラミングされた細胞が作製される。研究者は、形質転換された細胞のバックグラウンドから真のiPSCコロニーを同定することが可能であり得るが、これは効率的なプロセスではない。次いで、真の多能性集団としてさらに特徴付け、認識することが必要であり、通常、多能性のマーカー、遺伝子発現および後成的分析ならびに多能性集団の3種の胚葉(外胚葉、中胚葉および内胚葉)に分化する能力についての免疫細胞化学染色を含む。多能性細胞を同定し、選択したら、そのような細胞は一般にコロニーとして成長し、長期にわたって細胞を維持するために、細胞を選び取り、機械的に解離させた後に再プレーティングすることによって手動で継代することが必要である。
種々の着床前段階および着床後段階に由来する胚性幹細胞は、別個の多能性の状態を示す。例えば、胚盤胞の内部細胞集団に由来する細胞は、より「ナイーブ」であるとみなされ、無作為に分化する傾向がより高くより「プライムされた」とみなされる着床後由来細胞とはかなり異なる重要な性質を有する。ナイーブ細胞は、より「基底状態(groun
ded state)」であるようであり、それらの未分化状態を維持するために外因性のシグナル伝達を必要としない。他方では、プライムされた細胞は、それらの未分化状態を維持するために、TGFβ、アクチビンおよびbFGFを含めた重要なサイトカインの外因性のシグナル伝達を必要とし、ERK/MAPK細胞経路に大きく依存する。
ded state)」であるようであり、それらの未分化状態を維持するために外因性のシグナル伝達を必要としない。他方では、プライムされた細胞は、それらの未分化状態を維持するために、TGFβ、アクチビンおよびbFGFを含めた重要なサイトカインの外因性のシグナル伝達を必要とし、ERK/MAPK細胞経路に大きく依存する。
iPSCの生成プロセスを改善することにより、技術的障壁を劇的に低下させ、プロセスを迅速化することができ、その後の、薬物スクリーニングおよび細胞療法などの当該技術を工業的に適用するためのスケールアップおよび細胞の分化が可能になる。外因性の材料を使用せずにiPSCをより効率的に作製し、再プログラミングされた細胞をより効率的に同定し、選択するための方法が必要である。ヒト多能性幹細胞のナイーブな状態を促進するiPSCを生成する方法が、再生医療、例えば、疾患矯正、定方向分化および製造規模の拡大における今後の適用において著しく有利になることになる。さらに、iPSCを、単細胞継代およびスケーラビリティを可能にする定義済みの培養条件でより効率的に作製するための方法が必要である。
発明の簡単な要旨
本発明の一実施形態は、多能性細胞をフィーダーフリー環境において培養する方法であって、マウス胚性幹細胞ではない多能性細胞を、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、およびiv)Rock阻害剤からなる群から選択される、細胞の多能性を維持する作用剤を少なくとも1種含む培地中のフィーダーフリー環境において培養し、培養している間、細胞の多能性を維持するステップを含む方法を提供する。
本発明の一実施形態は、多能性細胞をフィーダーフリー環境において培養する方法であって、マウス胚性幹細胞ではない多能性細胞を、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、およびiv)Rock阻害剤からなる群から選択される、細胞の多能性を維持する作用剤を少なくとも1種含む培地中のフィーダーフリー環境において培養し、培養している間、細胞の多能性を維持するステップを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、培地は、細胞の多能性を維持しながら少なくとも1回の細胞分裂を可能にするために十分な量の作用剤を含む。さらなる実施形態では、培地は、細胞の多能性を維持する作用剤を少なくとも2種含む。特定の実施形態では、培地は、細胞の多能性を維持する作用剤を少なくとも3種または4種含む。
別の特定の実施形態では、細胞の多能性を維持する作用剤はRock阻害剤を含む。特定の実施形態では、Rock阻害剤はチアゾビビン(thiazovivin)またはY27632である。
一実施形態では、細胞の多能性を維持する作用剤はTFGβ阻害剤を含み、特定の実施形態では、TFGβ阻害剤はA-83-01またはSB431542である。
ある実施形態では、細胞の多能性を維持する作用剤はGSK3阻害剤を含み、特定の実施形態では、GSK3阻害剤はCHIR99021またはBIOである。
本発明の一実施形態では、細胞の多能性を維持する作用剤はMEK阻害剤を含む。特定の実施形態では、MEK阻害剤はPD98059またはPD032901である。
特定の実施形態では、培地は、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含む。本発明のさらに特定の実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
本発明のいくつかの実施形態では、細胞の多能性が少なくとも5回の細胞分裂にわたって維持される。他の実施形態では、細胞の多能性が少なくとも10回の細胞分裂にわたっ
て維持される。
て維持される。
いくつかの実施形態では、細胞を成長因子およびサイトカインの不在下、必要に応じて、可溶性フィブロネクチンの存在下で培養する。さらなる実施形態では、細胞をMatrigel(商標)の不在下で培養し、さらに別の実施形態では、培地はbFGFを実質的に含まない。
本発明の特定の実施形態では、多能性細胞はヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞である。
本発明の別の実施形態は、マウス胚性幹細胞ではない多能性細胞を成長因子およびサイトカインの不在下で培養するステップを含む、多能性細胞を培養する方法を提供する。
ある実施形態では、方法は、多能性細胞を、細胞の多能性を維持しながら少なくとも1回の細胞分裂を可能にするため、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、およびiv)Rock阻害剤からなる群から選択される、細胞の多能性を維持する作用剤を少なくとも1種含む培地中で培養するステップを含む。
一実施形態では、多能性細胞はヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞である。
さらなる実施形態では、培地は、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、およびiv)Rock阻害剤からなる群から選択される少なくとも2種、少なくとも3種、または4種の作用剤を含み、特定の実施形態では、培地は、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含み、他の特定の実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
本発明のさらに別の実施形態は、解離したヒト多能性細胞を得る方法であって、ヒト多能性細胞を解離させて、解離細胞を得るステップと、解離細胞を、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、およびiv)Rock阻害剤からなる群から選択される、解離細胞の生存能力(viability)を増強する作用剤を少なくとも1種含む培地と接触させ、それにより、解離細胞の生存能力を増強するステップとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、解離細胞の生存能力が少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも100%、少なくとも200%、または少なくとも500%増強される。
他の実施形態では、本発明の方法は、培地中で解離細胞を、解離細胞の多能性を維持しながら少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも5回、または少なくとも10回の継代にわたって培養するステップをさらに含む。
ある実施形態では、培養後の解離細胞の核型は、解離させる前の細胞集団の核型と実質的に同様である。
いくつかの実施形態では、方法は、作用剤の存在下で解離させるステップを含む。さらに他の実施形態では、方法は、多能性細胞を、解離させる前に作用剤と接触させるステップを含む。特定の実施形態では、解離細胞を培地と接触させるステップは、解離細胞を培地中に懸濁させるステップを含む。
他の実施形態では、本発明は、フィーダーフリー環境における細胞の能力(poten
cy)を増大させる方法であって、細胞をフィーダーフリー環境において、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、およびiv)Rock阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の低分子作用剤を含む培地と接触させて、培地と接触させる前の細胞と比較して能力が増大した細胞を得るステップを含む方法を提供する。特定の実施形態では、培地は、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含み、ある実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
cy)を増大させる方法であって、細胞をフィーダーフリー環境において、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、およびiv)Rock阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の低分子作用剤を含む培地と接触させて、培地と接触させる前の細胞と比較して能力が増大した細胞を得るステップを含む方法を提供する。特定の実施形態では、培地は、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含み、ある実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
一実施形態では、接触させるステップは、細胞の能力を増大させるために十分な条件下で細胞を培養するステップを含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞、多能性細胞、多分化能細胞、非多能性細胞、および体細胞からなる群から選択される。
特定の実施形態では、細胞は、マウス胚性幹細胞ではない。他の特定の実施形態では、細胞はヒト細胞であり、ある実施形態では、細胞は人工多能性幹細胞である。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞を少なくとも1種の多能性因子と接触させるステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、多能性因子は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または低分子を含む。いくつかの実施形態では、多能性因子は外因性転写因子である。特定の実施形態では、外因性転写因子は、Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogポリペプチド、またはOct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogをコードするポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、細胞膜を横切る輸送を可能にするアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、外因性転写因子は、Oct4、Sox2、およびKlf4ポリヌクレオチドを含む。
さらに他の実施形態では、能力が増大している細胞は、Oct4、Nanog、KLF4、SSEA4およびTRA 1-81からなる群から選択される少なくとも1種の多能性幹細胞マーカーの発現、多能性幹細胞の形態、生殖細胞系列伝達(germline transmission)に寄与する能力、奇形腫の形成、出発系統とは異なる系統に分化または分化転換する能力、およびin vitroにおける三系統分化の1つまたは複数によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、能力が増大している細胞は、培地と接触させる前の細胞と比較して少なくとも2倍高いレベルのOct4を発現する。さらに他の実施形態では、能力が増大している細胞は、従来法で培養したiPSCと比較して少なくとも2倍低いXist活性を有する。さらなる実施形態では、能力が増大している細胞は、密集した、ドーム形のコロニー形態を有する。
いくつかの実施形態では、能力が増大している細胞は、TFGβ、アクチビン、およびMEKシグナル伝達経路の外因性の刺激の不在下で、および必要に応じて、bFGF経路の外因性の刺激の不在下で複製し、かつ多能性を維持する。
他の実施形態では、方法は、能力が増大している細胞を、フィーダーフリー環境において、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種の存在下で培養して、細胞の能力を維持しながら少なくとも1回の細胞分裂を可能にするステップをさらに含む。特定の実施形態では、細胞をTFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤の存在下で培養し、ある実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害
剤はチアゾビビンである。
剤はチアゾビビンである。
本発明は、上記の実施形態のいずれかによって作製される、能力が増大している細胞も提供する。
本発明は、さらに、フィーダーフリー環境における細胞集団の再プログラミングの効率を改善する方法であって、細胞集団を、フィーダーフリー環境において、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、およびiv)Rock阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の低分子作用剤と、再プログラミングを誘導し、それにより、再プログラミングの効率を、細胞集団を低分子作用剤と接触させていない場合の再プログラミングの効率と比較して少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも100%、少なくとも300%、または少なくとも500%改善するために十分な条件下で接触させるステップを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、細胞をTFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤と接触させ、ある実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
いくつかの実施形態では、再プログラミング前の細胞集団は、非多能性細胞を含む。他の実施形態では、再プログラミングの効率を、再プログラミングのために必要とされる時間によって、または再プログラミングされた細胞の数によって測定する。
さらに他の実施形態では、再プログラミングを誘導するために十分な条件は、細胞集団を、Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogポリペプチド、またはOct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1種の外因性転写因子と接触させることを含む。特定の実施形態では、条件は、細胞集団を、Oct4、Sox2、およびKlf4ポリペプチドまたはOct4、Sox2、およびKlf4をコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む。
本発明のさらに別の実施形態は、細胞集団をフィーダーフリー環境において選別して、多能性細胞が富化された細胞集団を得る方法であって、フィーダーフリー環境において細胞の混成集団を含む解離細胞の懸濁物を得るステップと、懸濁物中の細胞を選別して、1種または複数種の多能性のマーカーを発現している細胞を得、それにより、多能性細胞が富化された富化細胞集団を得るステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、懸濁物は、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種を含む。さらなる実施形態では、選別は、磁気ビーズまたはフローサイトメトリーによるものである。特定の実施形態では、選別は、磁気ビーズによるものである。他の特定の実施形態では、選別は、フローサイトメトリーによるものである。
いくつかの実施形態では、方法は、富化細胞集団を、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種を、必要に応じて、可溶性フィブロネクチンと組み合わせて含む培地中で培養するステップをさらに含む。
特定の実施形態では、懸濁物中の細胞の混成集団を、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種と選別前に接触させる。ある実施形態では、細胞の混成集団を、TFGβ阻害剤、GS
K3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤と接触させ、他のある実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
K3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤と接触させ、他のある実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
特定の実施形態では、細胞の混成集団は、1種または複数種の多能性のマーカーを発現している細胞を含む。特定の実施形態では、1種または複数種の多能性のマーカーは、SSEA4、TRA160、TRA181、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD30、CD50、CD133/プロミニン(prominin)、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31、CD34、OCT4、NanogまたはSox2を含む。具体的な実施形態では、多能性のマーカーは、SSEA4、TRA181、TRA160、およびCD30からなる群から選択される。
特定の実施形態では、方法は、細胞の混成集団を1種または複数種の多能性因子と接触させて、再プログラミングを誘導するステップを含む。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、1種または複数種の多能性因子を細胞の混成集団内の細胞に導入するステップ含む。ある実施形態では、多能性因子は、Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogポリペプチド、またはOct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogをコードするポリヌクレオチドを含む。他の特定の実施形態では、多能性因子は、Oct4、Sox2、およびKlf4ポリペプチド、またはOct4、Sox2、およびKlf4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、多能性細胞は人工多能性細胞である。
いくつかの実施形態では、富化細胞集団が、1種または複数種の多能性のマーカーを発現している細胞に関して少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも100%、少なくとも200%、または少なくとも500%富化されている。
別の実施形態では、本発明は、人工多能性幹細胞を得る方法であって、細胞集団を処理して再プログラミングを誘導するステップと、細胞集団を含む解離細胞の懸濁物を調製するステップと、懸濁物中の細胞を選別して、1種または複数種の多能性のマーカーを発現している選別細胞を得るステップと、1種または複数種の多能性のマーカーを発現している選別細胞を培養するステップとを含み、ここで、iPSCが得られる方法を提供する。特定の実施形態では、選別された細胞をサイトカインおよび成長因子の不在下、必要に応じて、フィーダーフリー環境において、および必要に応じて、可溶性フィブロネクチンの存在下で培養する。
いくつかの実施形態では、細胞集団を、i)TGFβ阻害剤;ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種と接触させる。特定の実施形態では、細胞集団を、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤と接触させ、ある実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
他の実施形態では、細胞集団を処理して再プログラミングを誘導するステップは、細胞集団を、1種または複数種の多能性因子と接触させるステップを含む。特定の実施形態では、多能性因子は、Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogポリペプチド、またはOct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogをコードするポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、多能性因子は、Oct
4、Sox2、およびKlf4ポリペプチド、またはOct4、Sox2、およびKlf4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
4、Sox2、およびKlf4ポリペプチド、またはOct4、Sox2、およびKlf4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、細胞集団を処理して再プログラミングを誘導するステップは、細胞集団を、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種と接触させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、細胞をTFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤と接触させ、ある実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
他の実施形態では、懸濁物は、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種を含む。特定の実施形態では、懸濁物は、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含み、ある実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
いくつかの実施形態では、選別は、フローサイトメトリーによるかまたは磁気ビーズによるものである。特定の実施形態では、細胞を選別して、少なくとも1種 、2種、3種、4種、またはそれより多い多能性のマーカーを発現している細胞を得る。他の特定の実施形態では、1種または複数種の多能性のマーカーは、SSEA4、TRA160、TRA181、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD30、CD50、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31、CD34、OCT4、NanogまたはSox2を含む。他の特定の実施形態では、1種または複数種の多能性のマーカーは、SSEA4、TRA160、TRA181、およびCD30からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、1種または複数種の多能性のマーカーは、SSEA4、CD30、およびTRA160またはTRA181である。別の実施形態では、細胞を、特異的なマーカーを用いて選別して、再プログラミングされていない細胞を再プログラミング集団から枯渇させる。
いくつかの実施形態では、培養するステップは、細胞を、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、およびiv)Rock阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の低分子作用剤を含む、培地中で培養するステップを含む。特定の実施形態では、培地は、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含み、ある実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
特定の実施形態では、細胞をフィーダーフリー環境において培養する。ある実施形態では、細胞をフィーダーフリー環境において処理し、懸濁させ、選別し、培養する。
いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞は、約2~22日間に得られる。特定の実施形態では、人工多能性幹細胞は、約4~約18日間に得られる。
他の実施形態では、人工多能性幹細胞は、細胞集団を処理して再プログラミングを誘導した後約4~約22日間以内に得られる。ある実施形態では、人工多能性幹細胞は、細胞集団を処理して再プログラミングを誘導した後約6~約18日間以内に得られ、他のある実施形態では、人工多能性幹細胞は、細胞集団を処理して再プログラミングを誘導した後
約10~約16日間以内に得られる。
約10~約16日間以内に得られる。
本発明は、別の実施形態において、上記の方法のいずれかによって得られる人工多能性幹細胞も提供する。
本発明は、さらに、多能性細胞を細胞集団から枯渇させる方法であって、多能性細胞を有する細胞の混成集団を含む解離細胞の懸濁物を得るステップと、懸濁物中の細胞を選別して、1種または複数種の多能性のマーカーを発現している細胞を除去し、それにより、多能性細胞を細胞集団から枯渇させるステップとを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、細胞の混成集団は、多分化能細胞または(成体)体細胞を含む。
他の実施形態では、懸濁物中の細胞の混成集団を、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、およびiv)Rock阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の低分子作用剤を含む培地中で、懸濁物を得る前に培養する。特定の実施形態では、培地は、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含み、ある実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
本発明のさらなる実施形態では、懸濁物は、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、およびiv)Rock阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の低分子作用剤を含む。特定の実施形態では、懸濁物は、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含み、ある実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
いくつかの実施形態では、選別は、フローサイトメトリーによるものである。他の実施形態では、選別は、抗体でコーティングした磁気ビーズ富化によるものである。
本発明のいくつかの実施形態は、ゲノム安定性を有する多能性細胞を得る方法であって、細胞を、フィーダーフリー環境において、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、およびiv)Rock阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の低分子作用剤と、c-mycの不在下、ゲノム安定性を有する多能性細胞を得るために十分な条件下で接触させるステップを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞、多能性細胞、多分化能細胞、非多能性細胞、および体細胞である。いくつかの具体的な実施形態では、細胞は、非多能性細胞を含む。
ある実施形態では、条件は、細胞を少なくとも1種の多能性因子と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、多能性因子は、Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogポリペプチド、またはOct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される外因性転写因子である。特定の実施形態では、多能性因子は、Oct4、Sox2、およびKlf4ポリヌクレオチドを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、低分子作用剤はRock阻害剤を含む。特定の実施形態では、Rock阻害剤はチアゾビビンまたはY27632であり、さらに特定の実施
形態では、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
形態では、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
本発明の他の実施形態では、低分子作用剤はTFGβ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、TFGβ阻害剤は、A-83-01またはSB431542である。
いくつかの実施形態では、低分子作用剤はGSK3阻害剤を含み、特定の実施形態では、GSK3阻害剤はCHIR99021またはBIOである。
本発明の他の実施形態では、低分子作用剤はMEK阻害剤を含む。いくつかの特定の実施形態では、MEK阻害剤はPD98059またはPD032901である。
本発明のいくつかの実施形態では、低分子作用剤は、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含む。特定の実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
本発明は、多能性細胞を培養して、細胞のゲノム安定性を維持する方法であって、多能性細胞を、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、およびiv)Rock阻害剤からなる群から選択される、多能性細胞のゲノム安定性を維持する作用剤を少なくとも1種含む培地中のフィーダーフリー環境において培養し、培養している間、多能性細胞のゲノム安定性を維持するステップを含む方法をさらに含む。
ある実施形態では、条件は、細胞を少なくとも1種の多能性因子と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、多能性因子は、Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogポリペプチド、またはOct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される外因性転写因子である。特定の実施形態では、多能性因子は、Oct4、Sox2、およびKlf4ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、培地は、少なくとも2種、少なくとも3種、または4種の作用剤を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、作用剤はRock阻害剤を含む。特定の実施形態では、Rock阻害剤はチアゾビビンまたはY27632であり、さらに特定の実施形態では、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
本発明の他の実施形態では、作用剤はTFGβ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、TFGβ阻害剤は、A-83-01またはSB431542である。
いくつかの実施形態では、作用剤はGSK3阻害剤を含み、特定の実施形態では、GSK3阻害剤はCHIR99021またはBIOである。
本発明の他の実施形態では、作用剤はMEK阻害剤を含む。いくつかの特定の実施形態では、MEK阻害剤はPD98059またはPD032901である。
本発明のいくつかの実施形態では、作用剤は、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含む。特定の実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
本発明のいくつかの実施形態では、多能性細胞を、培地中で少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも5回、少なくとも10回、または少なくとも15回の継代にわたって、多能性細胞のゲノム安定性を維持しながら培養する。
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)を生成し、培養するためのフィーダーフリー条件を含めた、幹細胞を培養するための頑強な培養システムを提供する。詳細には、本発明は、フィーダーフリー環境における多能性細胞の長期培養;フィーダーフリー環境における細胞の再プログラミング;多能性細胞の単細胞への解離;多能性細胞の細胞選別;再プログラミングの効率の改善;ナイーブ多能性細胞の生成;および多能性細胞を同定し、選択するためのマーカーの同定を可能にする培養プラットフォームを提供する。本発明の培地および培養方法は、単細胞に解離させたヒト幹細胞の生存能力および生存を支持し、幹細胞の未分化状態を維持して、解離した単細胞を、分化を伴わずに培養し、継代することを可能にする。
本発明は、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)を生成し、培養するためのフィーダーフリー条件を含めた、幹細胞を培養するための頑強な培養システムを提供する。詳細には、本発明は、フィーダーフリー環境における多能性細胞の長期培養;フィーダーフリー環境における細胞の再プログラミング;多能性細胞の単細胞への解離;多能性細胞の細胞選別;再プログラミングの効率の改善;ナイーブ多能性細胞の生成;および多能性細胞を同定し、選択するためのマーカーの同定を可能にする培養プラットフォームを提供する。本発明の培地および培養方法は、単細胞に解離させたヒト幹細胞の生存能力および生存を支持し、幹細胞の未分化状態を維持して、解離した単細胞を、分化を伴わずに培養し、継代することを可能にする。
定義
本明細書で使用される場合、「再プログラミング」または「脱分化」または「細胞能力の増大」または「発生能の増大」という用語は、細胞の能力を増大させる、または細胞を分化の程度が低い状態に脱分化させる方法を指す。例えば、細胞能力が増大した細胞は、再プログラミングされていない状態にある同じ細胞と比較して発生の可塑性がより高い(すなわち、より多くの細胞型に分化することができる)。言い換えれば、再プログラミングされた細胞とは、再プログラミングされていない状態にある同じ細胞よりも分化の程度が低い状態にある細胞である。
本明細書で使用される場合、「再プログラミング」または「脱分化」または「細胞能力の増大」または「発生能の増大」という用語は、細胞の能力を増大させる、または細胞を分化の程度が低い状態に脱分化させる方法を指す。例えば、細胞能力が増大した細胞は、再プログラミングされていない状態にある同じ細胞と比較して発生の可塑性がより高い(すなわち、より多くの細胞型に分化することができる)。言い換えれば、再プログラミングされた細胞とは、再プログラミングされていない状態にある同じ細胞よりも分化の程度が低い状態にある細胞である。
本明細書で使用される場合、「能力」という用語は、細胞が利用できる発生の選択肢(すなわち、発生能)全ての合計を指す。当業者は、細胞能力は、最大の発生能を有する最も可塑性の細胞である全能性幹細胞から、最小の発生能を有する最小の可塑性の細胞である最終分化細胞までにわたる連続体であることを認識されよう。細胞能力の連続体は、これらに限定されないが、全能性細胞、多能性細胞、多分化能細胞、小能性細胞、単能性細胞、および最終分化細胞を含む。最も厳密な意味では、幹細胞は多能性である;したがって、いかなる成熟細胞型も生じさせることができる。しかし、多分化能、小能性または単能性の前駆細胞は、時には系統制限幹細胞(例えば、間葉幹細胞、脂肪組織由来幹細胞など)および/または前駆細胞と称される。
本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、細胞の、体部または細胞体(すなわち、胚本体(embryo proper))の全ての系統を形成する能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、3種の胚葉、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の各々から細胞を形成することができる多能性幹細胞の一種である。多能性とは、完全な生物体を生じさせることができない不完全または部分的に多能性の細胞(例えば、胚盤葉上層幹細胞またはEpiSC)から、完全な生物体を生じさせることができる、より初期の、より多能性の細胞(例えば、胚性幹細胞)までにわたる発生能の連続体である。細胞の多能性のレベルは、細胞の多能性特性を評価することによって決定することができる。多能性特性としては、これらに限定されないが、i)多能性幹細胞の形態、ii)これらに限定されないが、
SSEA1(マウスのみ)、SSEA3/4;TRA1-60/81;TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31、CD34、OCT4、Nanogおよび/またはSox2、ならびに本発明に記載の通り、CD30およびCD50を含めた多能性幹細胞マーカーの発現;iii)マウスキメラにおける、多能性マウス幹細胞の、生殖細胞系列伝達に寄与する能力;iv)四倍体胚補完アッセイを用いた、多能性幹細胞の、胚本体に寄与する能力;v)多能性幹細胞の奇形腫の形成;vi)胚様体の形成:およびvii)不活性なX染色体の再活性化が挙げられる。
SSEA1(マウスのみ)、SSEA3/4;TRA1-60/81;TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31、CD34、OCT4、Nanogおよび/またはSox2、ならびに本発明に記載の通り、CD30およびCD50を含めた多能性幹細胞マーカーの発現;iii)マウスキメラにおける、多能性マウス幹細胞の、生殖細胞系列伝達に寄与する能力;iv)四倍体胚補完アッセイを用いた、多能性幹細胞の、胚本体に寄与する能力;v)多能性幹細胞の奇形腫の形成;vi)胚様体の形成:およびvii)不活性なX染色体の再活性化が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞の形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特徴を指す。通常の胚性幹細胞形態は、丸く小さな形状であり、核細胞質比が高く、核小体が顕著に存在し、細胞間の間隔が典型的であることによって特徴付けられる。
本明細書で使用される場合、「多分化能」という用語は、成体幹細胞の、1つの系統の複数の細胞型を形成する能力を指す。例えば、造血幹細胞は、血液細胞系統、例えば、リンパ系細胞および骨髄系細胞の全ての細胞を形成することができる。
「接着」とは、容器に付着している細胞、例えば、適切な培地の存在下で滅菌プラスチック(またはコーティングされたプラスチック)の細胞培養ディッシュまたはフラスコに付着している細胞を指す。特定のクラスの細胞は持続性ではない、または、細胞培養容器に接着させなければ培養物中で成長しない。特定のクラスの細胞(「非接着性細胞」)は、接着させることなく培養物中で維持され、かつ/または増殖する。
「培養」または「細胞培養」とは、細胞をin vitro環境において維持し、成長させ、かつ/または分化させることを指す。「細胞培養培地(cell culture
media)」、「培地(culture media)」(それぞれの場合において単数の「培地(medium)」)、「補充物」および「培地補充物」とは、細胞培養物を培養する栄養組成物を指す。
media)」、「培地(culture media)」(それぞれの場合において単数の「培地(medium)」)、「補充物」および「培地補充物」とは、細胞培養物を培養する栄養組成物を指す。
「培養する」とは、組織または体の外側で、例えば、滅菌プラスチック(またはコーティングされたプラスチック)の細胞培養ディッシュまたはフラスコ中で細胞を持続させ、繁殖させ(成長させる)、かつ/または分化させることを指す。「培養」では、培地を、栄養分、ホルモンおよび/または細胞を繁殖させ、かつ/または持続させるために役立つ他の因子の供給源として利用することができる。
本明細書で使用される場合、「解離した」細胞とは、他の細胞から、または表面(例えば、培養プレート表面)から実質的に分離または精製されている細胞を指す。例えば、細胞は、動物または組織から、機械的または酵素的方法によって解離させることができる。あるいは、in vitroで凝集する細胞は、例えば、クラスター、単細胞または単細胞とクラスターの混合物の懸濁物へと酵素によってまたは機械的に解離させることによって互いから解離させることができる。さらに別の代替的な実施形態では、接着性細胞を培養プレートまたは他の表面から解離させる。したがって、解離とは、細胞と細胞外マトリックス(ECM)および基質(substrate)(例えば、培養表面)との相互作用を破壊すること、または細胞間のECMを破壊することを含み得る。
本明細書で使用される場合、「富化する」および「富化すること」という用語は、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「富化された」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、富化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して比例的
に増加している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型(すなわち、特定の特性を有する細胞)に関して富化することができ、したがって、標的細胞型の割合またはパーセントは、富化される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較し上昇する。細胞集団を、当技術分野で公知の細胞選択および選別方法によって、標的細胞型について富化することができる。本発明のいくつかの実施形態では、細胞集団を、本明細書の実施例に記載の選別または選択プロセスによって富化する。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して少なくとも約20%富化される、つまり、富化細胞集団は、集団を富化する前の集団においてよりも、標的細胞型を比例的に約20%多く含む。一実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して、比例的に少なくとも約30+%、40+%、50+%、60+%、70+%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%、または少なくとも約98%、または特定の実施形態では、約99%富化される。
に増加している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型(すなわち、特定の特性を有する細胞)に関して富化することができ、したがって、標的細胞型の割合またはパーセントは、富化される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較し上昇する。細胞集団を、当技術分野で公知の細胞選択および選別方法によって、標的細胞型について富化することができる。本発明のいくつかの実施形態では、細胞集団を、本明細書の実施例に記載の選別または選択プロセスによって富化する。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して少なくとも約20%富化される、つまり、富化細胞集団は、集団を富化する前の集団においてよりも、標的細胞型を比例的に約20%多く含む。一実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して、比例的に少なくとも約30+%、40+%、50+%、60+%、70+%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%、または少なくとも約98%、または特定の実施形態では、約99%富化される。
本発明の特定の態様では、細胞集団を、多能性細胞または多能性特性を示す細胞の量に関して富化する。本発明の特定の実施形態では、再プログラミングを受けている細胞集団を、多能性特性、例えば、これらに限定することなく、SSEA4、TRA1-60、TRA-1-81、CD30またはCD50を含めた、多能性マーカーの発現を有する標的細胞について富化する。本発明の別の特定の実施形態では、再プログラミングを受けている細胞集団などの細胞集団から、例えば、CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、またはCD7を挙げることができる、分化している細胞または非多能性細胞に特異的な表面マーカーを使用して非多能性細胞を枯渇させる。したがって、生じた細胞集団は、多能性細胞が富化された細胞集団と記載することができる。本発明のある態様では、富化細胞集団内の細胞を、別個の遺伝子またはタンパク質の発現プロファイル、例えば、少なくとも2種の多能性マーカー、例えば、SSEA4、TRA1-60、TRA-1-81、CD30およびCD50の細胞表面発現を有する標的細胞について富化する。いくつかの実施形態では、細胞集団を、2種以上の多能性マーカーを発現している標的細胞について富化する。特定の実施形態では、細胞集団を、SSEA4をTra-181またはTra-160のいずれかと組み合わせて発現している標的細胞について富化する。さらに特定の実施形態では、細胞集団を、SSEA4、Tra181、およびCD30を発現している標的細胞について富化する。一実施形態では、富化細胞集団内の細胞の少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、70%、75%、80%、90%、95%、97%、98%、または99%が多能性細胞などの標的細胞型である。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、細胞集団を、多能性マーカー、例えば、SSEA4、TRA1-60、TRA-1-81、CD30およびCD50の細胞表面発現に基づいて選別し、そのようなマーカーを発現している細胞の画分を採取して、多能性細胞について富化された細胞集団を得ることによって、細胞の集団を多能性細胞について富化する方法を提供する。本発明の他の実施形態では、細胞集団を、分化しているまたは分化した細胞のマーカー、例えば、CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、およびCD7の細胞表面発現に基づいて選別し、細胞集団からそのような細胞を枯渇させて、多能性細胞について富化された細胞集団を得ることによって、細胞集団を多能性細胞について富化する。特定の実施形態では、細胞集団をCD13の発現に基づいて選別し、CD13+細胞を細胞集団から除去して、多能性細胞が富化された細胞集団を得る。
本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞」または「フィーダー」とは、第2の種類の細胞と共培養され、第2の種類の細胞が成長することができる環境をもたらす1種の細胞を説明するために使用される用語であり、なぜなら、フィーダー細胞から第2の細胞
種を支持するための成長因子および栄養分が提供されるからである。フィーダー細胞は、必要に応じて、それらが支持する細胞とは異なる種由来である。例えば、幹細胞を含めた特定の種類のヒト細胞を、マウス胚線維芽細胞の初代培養物、および不死化マウス胚線維芽細胞によって支持することができる。フィーダー細胞は、一般には、他の細胞と共培養する場合に、それらが支持する細胞よりも成長することを防ぐために、放射線照射またはマイトマイシンcなどの抗有糸分裂剤による処理によって不活性化することができる。前述に限定されることなく、1つの特定のフィーダー細胞型は、ヒトフィーダー、例えば、ヒト皮膚線維芽細胞またはヒト胚性幹細胞であってよい。別のフィーダー細胞型はマウス胚線維芽細胞(mEF)であってよい。
種を支持するための成長因子および栄養分が提供されるからである。フィーダー細胞は、必要に応じて、それらが支持する細胞とは異なる種由来である。例えば、幹細胞を含めた特定の種類のヒト細胞を、マウス胚線維芽細胞の初代培養物、および不死化マウス胚線維芽細胞によって支持することができる。フィーダー細胞は、一般には、他の細胞と共培養する場合に、それらが支持する細胞よりも成長することを防ぐために、放射線照射またはマイトマイシンcなどの抗有糸分裂剤による処理によって不活性化することができる。前述に限定されることなく、1つの特定のフィーダー細胞型は、ヒトフィーダー、例えば、ヒト皮膚線維芽細胞またはヒト胚性幹細胞であってよい。別のフィーダー細胞型はマウス胚線維芽細胞(mEF)であってよい。
本明細書で使用される場合、「フィーダーフリー」(FF)環境とは、基本的にフィーダー細胞を含まず、フィーダー細胞を培養することによって予備馴化(pre-condition)されていない細胞培養物または培地などの環境を指す。「予備馴化」培地とは、フィーダー細胞を培地中である期間にわたって、例えば、少なくとも1日間にわたって培養した後に回収した培地を指す。予備馴化培地は、培地中で培養されたフィーダー細胞から分泌される成長因子およびサイトカインなどの多くのメディエーター物質を含有する。
本発明のいくつかの実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的に、これらに限定することなく、ヒト線維芽細胞、ケラチノサイト、および胚性幹細胞を含めたヒトフィーダー細胞を含まず、特定の実施形態では、さらに、フィーダー細胞によって予備馴化されていない。本発明のさらなる実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的に、動物フィーダー細胞を含まず、さらに、特定の実施形態では、フィーダー細胞で予備馴化されていない。本発明のある実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的に、ヒトフィーダー細胞と動物フィーダー細胞のどちらも含まず、他のある実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的にヒトフィーダー細胞と動物フィーダー細胞のどちらも含まず、フィーダー細胞で予備馴化されていない。
ゲノム安定性とは、細胞の、DNAを忠実に複製し、DNA複製プロセスの完全性を維持する能力を指す。本明細書において、本発明の細胞を記載するために使用される場合、「ゲノム的に安定な細胞」および「ゲノム安定性を有する細胞」とは、正常なヒト体細胞と比較した変異および染色体異常(例えば、転座、異数性、コピー数の変動および重複など)の頻度と実質的に同様の変異および染色体異常の頻度を示す細胞を指す。
「成分」とは、起源が化学的であるにせよ生物学的であるにせよ、細胞の成長および/または分化を維持し、かつ/または促進するために細胞培養培地において使用することができる任意の化合物または他の材料を指す。「構成成分」「栄養分」および「成分」という用語は、互換的に使用することができる。細胞培養培地のために使用される従来の成分は、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質などを含んでよいが、これらに限定されない。ex vivoでの細胞の培養を促進し、かつ/または維持する他の成分は、当業者が所望の効果のために必要とするとおりに選択することができる。
「単離する」または「単離すること」とは、組成物または材料を、その天然の環境から分離すること、および採取すること、例えば、個々の細胞または細胞培養物を組織または体から分離することを指す。一態様では、細胞集団または細胞の組成物は、天然ではそれに結合する可能性がある細胞および材料を実質的に含まない。「単離された」または「精製された」または「実質的に純粋な」とは、標的細胞集団に関しては、総細胞集団を構成する標的細胞に関して少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、および特定の実施形態では、少なくとも約95%純粋な細胞集団を
指す。細胞集団または細胞の組成物の純度は、当技術分野で周知の適切な方法によって評価することができる。例えば、多能性細胞の実質的に純粋な集団とは、総細胞集団を構成する多能性細胞に関して少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、および特定の実施形態では、少なくとも約95%、およびある実施形態では、約98%純粋な細胞集団を指す。「基本的に純粋な」という用語は、本明細書では、「実質的に純粋な」と互換的に使用される。
指す。細胞集団または細胞の組成物の純度は、当技術分野で周知の適切な方法によって評価することができる。例えば、多能性細胞の実質的に純粋な集団とは、総細胞集団を構成する多能性細胞に関して少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、および特定の実施形態では、少なくとも約95%、およびある実施形態では、約98%純粋な細胞集団を指す。「基本的に純粋な」という用語は、本明細書では、「実質的に純粋な」と互換的に使用される。
「継代する」または「継代すること」とは、細胞が所望の程度まで増殖した場合に、細胞を複数の細胞培養表面または容器へと小分けし、プレーティングする行為を指す。いくつかの実施形態では、「継代する」または「継代すること」とは、細胞を小分けし、希釈し、プレーティングすることを指す。細胞を初代培養表面または容器からその後の表面または容器のセットへと継代すると、その後の培養は、本明細書では、「二次培養」または「最初の継代」などと称することができる。新しい培養容器へと小分けし、プレーティングする行為の各々が1回の継代とみなされる。
「プレーティング」とは、1つまたは複数の細胞を培養容器内に、細胞が細胞培養容器に接着し、その上に拡散するように置くことを指す。
「多能性因子」とは、単独で、または他の作用剤と組み合わせてのいずれかで、細胞の発生能を増大させることができる作用剤を指す。多能性因子としては、限定することなく、細胞の発生能を増大させることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、および低分子が挙げられる。例示的な多能性因子としては、例えば、転写因子および低分子再プログラミング作用剤が挙げられる。転写因子とは、本明細書における使用に他の指示がなければ、タンパク質(すなわち、ポリペプチド)ならびにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを指し得る。例示的な転写因子としては、例えば、Oct、Klf、Myc、およびSoxポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。さらなる転写因子の例は本明細書において提供される。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、それに反する指定がなければ、互換的に従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として使用される。ポリペプチドは、特定の長さに限定されない、例えば、ポリペプチドは、全長のタンパク質配列または全長のタンパク質の断片を含んでよく、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに天然に存在する、および天然に存在しない当技術分野で公知の他の修飾を含んでよい。本発明の方法において使用されるポリペプチドは、種々の周知の組換え法および/または合成法のいずれを用いても調製することができる。
本発明の方法は、ある実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド(例えば、Sox-2、c-Myc、Oct3/4、Klf4、Lin28、Nanogなど、またはその基質、補因子および/または下流のエフェクター)の活性断片、例えば、本明細書に記載のポリペプチドの、全ての中間の長さを含めた、少なくとも約10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000などの連続したアミノ酸、またはそれより多くを含む活性断片を使用する。特定の実施形態では、使用される断片または断片の組合せは、本明細書に記載の方法において使用される場合に、多能性を調節し、誘導し、かつ/または維持する能力を保持する。
別の態様では、本発明では、本明細書に記載のポリペプチド組成物(例えば、Sox-2、c-Myc、Oct3/4、Klf4、Lin28、Nanogなど、またはその基質、補因子および/または下流のエフェクター)の変異体を使用する。一般に本発明に包含されるポリペプチド変異体は、一般には、その長さに沿って、本明細書に記載のポリペ
プチド配列に対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%またはそれより高い同一性(下記の通り決定される)を示す。特定の実施形態では、使用される変異体または変異体の組合せは、本明細書に記載の多能性を誘導する能力を保持する。
プチド配列に対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%またはそれより高い同一性(下記の通り決定される)を示す。特定の実施形態では、使用される変異体または変異体の組合せは、本明細書に記載の多能性を誘導する能力を保持する。
別の態様では、本発明は、その長さに沿って、本開示に従って使用される野生型哺乳動物ポリペプチドの対応する領域に対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%またはそれより高い同一性(下記の通り決定される)を示すポリペプチド変異体を使用する。
ポリペプチド変異体は、天然に存在するポリペプチドと、1つまたは複数の置換、欠失、付加および/または挿入により異なり得る。そのような変異体は、天然に存在し得るか、または、例えば、本発明の方法において使用される上記のポリペプチド配列のうちの1つまたは複数を改変することによって合成により生成することができ、当技術分野で周知のいくつもの技法のいずれかを用いてそれらの影響を評価することができる。
ポリペプチド変異体は、天然に存在するポリペプチドと、1つまたは複数の置換、欠失、付加および/または挿入により異なり得る。そのような変異体は、天然に存在し得るか、または、例えば、本発明の方法において使用される上記のポリペプチド配列のうちの1つまたは複数を改変することによって合成により生成することができ、当技術分野で周知のいくつもの技法のいずれかを用いてそれらの影響を評価することができる。
「増殖する」とは、1つの細胞が2つの基本的に同一の細胞へと分裂する性質または細胞集団の数が増加する(例えば、複製するために)性質を指す。
「繁殖」とは、細胞が組織または体の外側で、例えば、プラスチック(またはコーティングされたプラスチック)の細胞培養ディッシュまたはフラスコなどの滅菌容器内で成長(例えば、細胞増殖によって複製する)ことを指す。
「初代培養物」とは、単離された細胞が、培地を伴う最初の培養容器に配置された、細胞、組織および/または培養物を指す。細胞、組織および/または培養物は、維持され得、かつ/または増殖し得るが、その細胞、組織および/または培養物が最初の容器内に残っている限りは、その細胞、組織および/または培養物は初代培養物と称される。
「低分子再プログラミング作用剤」または「低分子再プログラミング化合物」という用語は、本明細書では互換的に使用され、単独で、または他の多能性因子と組み合わせてのいずれかで細胞の発生能を増大させることができる低分子を指す。「低分子」とは、分子量が約5kD未満、約4kD未満、約3kD未満、約2kD未満、約1kD未満、または約.5kD未満である作用剤を指す。低分子は、核酸、ペプチド模倣物、ペプトイド、炭水化物、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であってよい。化学的混合物および/または生物学的混合物、例えば、真菌抽出物、細菌抽出物、または藻類抽出物のライブラリーは当技術分野で公知であり、本発明のアッセイのいずれを用いてもスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、本明細書で使用される低分子再プログラミング作用剤は、分子量が10,000ダルトン未満、例えば、8000ダルトン未満、6000ダルトン未満、4000ダルトン未満、2000ダルトン未満、例えば、50~1500ダルトン、500~1500ダルトン、200~2000ダルトン、500~5000ダルトンである。
本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」および「基本的に含まない」という用語は、互換的に使用され、組成物、例えば、細胞集団または培地を記載するために使用される場合、特定の物質を含まない、例えば、特定の物質を95%含まない、96%含まない、97%含まない、98%含まない、99%含まない組成物、または、従来の手段によって測定したところ検出不可能な組成物を指す。特定の物質または組成物の構成成分の不在について言及する場合、「不在」という用語に同様の意味を適用することができる。
本発明において使用するための細胞 本発明において使用するための出発細胞集団は、
基本的に任意の適切な供給源に由来してよく、細胞型または多能性の状態に関して不均一であっても均一であってよい。一実施形態では、細胞は哺乳動物の細胞であり、特定の実施形態では、細胞は、げっ歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、または霊長類からなる群から選択される哺乳動物から単離する。ある実施形態では、哺乳動物はヒトである。他のある実施形態では、本発明に従って使用または処理される細胞は、基本的に任意の利用できる成体細胞型を含めた成体細胞である。
基本的に任意の適切な供給源に由来してよく、細胞型または多能性の状態に関して不均一であっても均一であってよい。一実施形態では、細胞は哺乳動物の細胞であり、特定の実施形態では、細胞は、げっ歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、または霊長類からなる群から選択される哺乳動物から単離する。ある実施形態では、哺乳動物はヒトである。他のある実施形態では、本発明に従って使用または処理される細胞は、基本的に任意の利用できる成体細胞型を含めた成体細胞である。
細胞は、体性幹細胞、非多能性幹細胞、不完全に多能性の幹細胞もしくは部分的に多能性の幹細胞、多分化能細胞、小能性細胞、単能性細胞、最終分化細胞、または前述の細胞の任意の組合せを含む細胞の混成集団であってよい。本発明の方法において使用される多能性細胞は、胚性幹細胞を含めた天然に存在する幹細胞であってよい、または人工多能性幹細胞であり得る。「混成」細胞集団とは、発生能の程度が様々な細胞集団である。例えば、細胞の混成集団は、再プログラミングを受けている細胞を含んでよく、したがって、混成集団は、多能性細胞、部分的に多能性の細胞、および非多能性細胞、例えば、完全に分化した細胞を含む。
一実施形態では、出発細胞集団は、成体または新生児の幹/前駆細胞から選択される。特定の実施形態では、幹/前駆細胞の出発集団は、中胚葉幹/前駆細胞、内胚葉幹/前駆細胞、および外胚葉幹/前駆細胞からなる群から選択される。
別の実施形態では、幹/前駆細胞の出発集団は、中胚葉幹/前駆細胞である。説明的な中胚葉幹/前駆細胞の例としては、これらに限定されないが、中胚葉幹/前駆細胞、内皮幹/前駆細胞、骨髄幹/前駆細胞、臍帯幹/前駆細胞、脂肪組織由来幹/前駆細胞、造血幹/前駆細胞(HSC)、間葉幹/前駆細胞、筋肉幹/前駆細胞、腎臓幹/前駆細胞、骨芽細胞幹/前駆細胞、軟骨細胞幹/前駆細胞などが挙げられる。
他の関連する実施形態では、幹/前駆細胞の出発集団は、外胚葉幹/前駆細胞である。説明的な外胚葉幹/前駆細胞の例としては、これらに限定されないが、神経幹/前駆細胞、網膜幹/前駆細胞、皮膚幹/前駆細胞などが挙げられる。
他の関連する実施形態では、幹/前駆細胞の出発集団は、内胚葉幹/前駆細胞である。説明的な内胚葉幹/前駆細胞の例としては、これらに限定されないが、肝臓幹/前駆細胞、膵臓幹/前駆細胞、上皮幹/前駆細胞などが挙げられる。
ある特定の実施形態では、出発細胞集団は、膵島細胞、CNS細胞、PNS細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、造血細胞、骨細胞、肝臓細胞、脂肪細胞、腎細胞、肺細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、濾胞細胞、血管細胞、上皮細胞、免疫細胞、内皮細胞などからなる群から選択される、不均一または均一の細胞集団であってよい。
再プログラミングの誘導および細胞の能力の増大
細胞における多能性を誘導するため、または能力を増大させるため(Takahashi, K.、およびYamanaka, S.、Cell 126巻、663~676頁(2006年);Takahashiら、Cell 131巻、861~872頁(2007年);Yuら、Science 318巻、1917~1920頁(2007年);Zhouら、Cell Stem Cell 4巻、381~384頁(2009年);Kimら、Cell Stem Cell 4巻、472~476頁(2009年);Yamanakaら、2009年;Saha, K.、Jaenisch, R.、Cell Stem Cell 5巻、584~595頁(2009年))、および再プログラミングの効率を改善するため(Shiら、Cell Stem Cell 2巻、525~528頁(2008年a);Shiら、Cell Stem Cell 3巻、568
~574頁(2008年b);Huangfuら、Nat Biotechnol 26巻、795~797頁(2008年a);Huangfuら、Nat Biotechnol 26巻、1269~1275頁(2008年b);Silvaら、Plos Bio 6巻、e253. doi:10.1371/journal. pbio. 0060253(2008年);Lyssiotisら、PNAS 106巻、8912~8917頁(2009年);Ichidaら、Cell Stem Cell 5巻、491~503頁(2009年);Maherali, N.、Hochedlinger,
K.、Curr Biol 19巻、1718~1723頁(2009年b);Estebanら、Cell Stem Cell 6巻、71~79頁(2010年);およびFengら、Cell Stem Cell 4巻、301~312頁(2009年))の種々の戦略が追求されている。
細胞における多能性を誘導するため、または能力を増大させるため(Takahashi, K.、およびYamanaka, S.、Cell 126巻、663~676頁(2006年);Takahashiら、Cell 131巻、861~872頁(2007年);Yuら、Science 318巻、1917~1920頁(2007年);Zhouら、Cell Stem Cell 4巻、381~384頁(2009年);Kimら、Cell Stem Cell 4巻、472~476頁(2009年);Yamanakaら、2009年;Saha, K.、Jaenisch, R.、Cell Stem Cell 5巻、584~595頁(2009年))、および再プログラミングの効率を改善するため(Shiら、Cell Stem Cell 2巻、525~528頁(2008年a);Shiら、Cell Stem Cell 3巻、568
~574頁(2008年b);Huangfuら、Nat Biotechnol 26巻、795~797頁(2008年a);Huangfuら、Nat Biotechnol 26巻、1269~1275頁(2008年b);Silvaら、Plos Bio 6巻、e253. doi:10.1371/journal. pbio. 0060253(2008年);Lyssiotisら、PNAS 106巻、8912~8917頁(2009年);Ichidaら、Cell Stem Cell 5巻、491~503頁(2009年);Maherali, N.、Hochedlinger,
K.、Curr Biol 19巻、1718~1723頁(2009年b);Estebanら、Cell Stem Cell 6巻、71~79頁(2010年);およびFengら、Cell Stem Cell 4巻、301~312頁(2009年))の種々の戦略が追求されている。
一般に、再プログラミングの技法は、特定の細胞の経路を、ポリヌクレオチドに基づく手法、ポリペプチドに基づく手法および/または低分子に基づく手法を用いて直接的に、または間接的に調節することを伴う。細胞の発生能は、例えば、細胞を、1種または複数種の多能性因子と接触させることによって増大させることができる。「接触させること」とは、本明細書で使用される場合、多能性因子(例えば、低分子、タンパク質、ペプチドなどのような)の存在下で細胞を培養すること、または多能性因子を細胞に導入することを含み得る。多能性因子は、タンパク質などの転写因子を含めた因子の存在下、転写因子を細胞に導入することが可能になる条件下で細胞を培養することによって、細胞に導入することができる。例えば、Zhou Hら、Cell Stem Cell. 2009年5月8日;4巻(5号):381~4頁;WO/2009/117439を参照されたい。細胞への導入は、例えば、一過性の方法、例えば、タンパク質形質導入、マイクロインジェクション、組込みによらない遺伝子送達、mRNA形質導入など、または任意の他の適切な技法を用いて促進することができる。いくつかの実施形態では、転写因子を、細胞に導入された組換えベクターからの発現によって、または細胞を外因性転写因子ポリペプチドの存在下で、ポリペプチドが細胞に進入するようにインキュベートすることによって細胞に導入する。
特定の実施形態では、多能性因子は転写因子である。細胞の能力を増大させること、確立すること、または維持することに関連する例示的な転写因子としては、これらに限定されないが、Oct-3/4、Cdx-2、Gbx2、Gsh1、HesX1、HoxA10、HoxA11、HoxB1、Irx2、Isl1、Meis1、Meox2、Nanog、Nkx2.2、Onecut、Otx1、Oxt2、Pax5、Pax6、Pdx1、Tcf1、Tcf2、Zfhx1b、Klf-4、Atbf1、Esrrb、Gcnf、Jarid2、Jmjd1a、Jmjd2c、Klf-3、Klf-5、Mel-18、Myst3、Nac1、REST、Rex-1、Rybp、Sall4、Sall1、Tif1、YY1、Zeb2、Zfp281、Zfp57、Zic3、Coup-Tf1、Coup-Tf2、Bmi1、Rnf2、Mta1、Pias1、Pias2、Pias3、Piasy、Sox2、Lef1、Sox15、Sox6、Tcf-7、Tcf7l1、c-Myc、L-Myc、N-Myc、Hand1、Mad1、Mad3、Mad4、Mxi1、Myf5、Neurog2、Ngn3、Olig2、Tcf3、Tcf4、Foxc1、Foxd3、BAF155、C/EBPβ、mafa、Eomes、Tbx-3;Rfx4、Stat3、Stella、およびUTF-1が挙げられる。例示的な転写因子としては、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、およびNanogが挙げられる。
低分子再プログラミング作用剤も多能性因子であり、これも、本発明の方法において再プログラミングを誘導するため、および細胞能力を維持または増大させるために使用することができる。本発明のいくつかの実施形態では、体細胞の多能性を誘導するため、細胞
の能力を増大させるもしくは維持するため、または再プログラミングの効率を改善するために、1種または複数種の低分子再プログラミング作用剤を使用する。
の能力を増大させるもしくは維持するため、または再プログラミングの効率を改善するために、1種または複数種の低分子再プログラミング作用剤を使用する。
いくつかの実施形態では、再プログラミングの効率を改善するために、低分子再プログラミング作用剤を本発明の方法において使用する。再プログラミングの効率の改善は、(1)再プログラミングおよび多能性細胞の生成のために必要な時間の減少(例えば、多能性細胞を生成するための時間を、低分子を用いない同様のまたは同じプロセスと比較して少なくとも1日短縮することによって)、またはその代わりに、またはそれと組み合わせて、(2)特定のプロセスによって生成される多能性細胞の数の増加(例えば、所与の期間内に再プログラミングされた細胞の数が、低分子を用いない同様のまたは同じプロセスと比較して少なくとも10%、30%、50%、100%、200%、500%など増加すること)によって測定することができる。いくつかの実施形態では、再プログラミング効率の2倍~20倍の改善が観察される。いくつかの実施形態では、再プログラミング効率が20倍超改善される。いくつかの実施形態では、低分子再プログラミング作用剤を用いない方法と比較して100倍超の効率の改善が認められる(例えば、生成する多能性細胞の数が100倍超増加する)。
いくつかのクラスの低分子再プログラミング作用剤は、細胞の能力を増大させ、確立し、かつ/または維持するために重要であり得る。例示的な低分子再プログラミング作用剤としては、これらに限定されないが、:H3K9のメチル化を阻害する、またはH3K9の脱メチル化を促進する作用剤;H3K4の脱メチル化を阻害する、またはH3K4のメチル化を促進する作用剤;ヒストンの脱アセチル化を阻害する、またはヒストンのアセチル化を促進する作用剤;L-型Caチャネルアゴニスト;cAMP経路の活性化因子;DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)阻害剤;核受容体リガンド;GSK3阻害剤、MEK阻害剤;TGFβ受容体/ALK5阻害剤;HDAC阻害剤;Erk阻害剤;ROCK阻害剤;FGFR阻害剤;およびPARP阻害剤が挙げられる。例示的な低分子再プログラミング作用剤としては、GSK3阻害剤、MEK阻害剤;TGFβ受容体/ALK5阻害剤;HDAC阻害剤;Erk阻害剤;およびROCK阻害剤が挙げられる。これらのクラスの低分子作用剤の各々は下により詳細に記載されている。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の方法の1種または複数種の転写因子と置き換えて、多能性を誘導するため、再プログラミングの効率を改善するため、および/または細胞の能力を増大させるもしくは維持するために、低分子再プログラミング作用剤を使用する。例えば、いくつかの実施形態では、細胞を、1種または複数種の低分子再プログラミング作用剤と接触させ、ここで、作用剤は再プログラミングの効率を改善するために十分な量で含まれる。他の実施形態では、本発明の方法の転写因子に加えて1種または複数種の低分子再プログラミング作用剤を使用する。一実施形態では、細胞を、少なくとも1種の多能性転写因子および少なくとも1種の低分子再プログラミング作用剤と、細胞の能力を増大させ、確立し、かつ/もしくは維持するため、または再プログラミングプロセスの効率を改善するための条件下で接触させる。
別の実施形態では、細胞を、少なくとも1種の多能性転写因子および少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種、または少なくとも10種の低分子再プログラミング作用剤と、細胞の能力を増大させ、確立し、かつ/もしくは維持するため、または再プログラミングの効率を改善するために十分な条件下で、および、そのために十分な時間にわたって接触させる。細胞の能力または分化の状態は、本明細書の他の箇所に記載の通り多能性特性をモニタリングすることによって評価することができる。
一実施形態では、細胞を、1種または複数種の多能性因子および/または低分子再プロ
グラミング作用剤の組合せを含む組成物と接触させ、ここで、多能性因子および低分子により、細胞の多能性が増大する、または誘導される。本発明の細胞は、in vitro、ex vivo、またはin vivoで接触させることができることが意図されている。
グラミング作用剤の組合せを含む組成物と接触させ、ここで、多能性因子および低分子により、細胞の多能性が増大する、または誘導される。本発明の細胞は、in vitro、ex vivo、またはin vivoで接触させることができることが意図されている。
多能性細胞の特徴付け
再プログラミングを誘導した後、再プログラミングされた細胞を、多能性に関連する、該当する検出可能な形態学的変化、分子的変化および/または生化学的変化に基づいて選択することができる。細胞の能力の評価において別々にまたは組み合わせてモニタリングすることができる細胞の多能性の特異的な特性としては、これらに限定されないが、遺伝子発現、メチル化、ならびにin vivoおよびin vitroにおける特性、例えば、i)丸くて平らな多能性幹細胞の形態;ii)SSEA1(マウス多能性幹細胞)、SSEA3/4(ヒト多能性幹細胞);TRA1-60/81;TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31、CD34、OCT4、Nanogおよび/またはSox2、ならびに本発明によって提供されるCD30およびCD50、ならびに前述のものの組合せを含めた多能性幹細胞マーカーの発現;iii)マウスキメラにおける、多能性幹細胞の生殖細胞系列伝達に寄与する能力;iv)四倍体胚補完アッセイを用いた、多能性幹細胞の、胚本体に寄与する能力;v)多能性幹細胞の奇形腫の形成;vi)胚様体の形成およびin vitroにおける三系統分化;ならびにvii)不活性なX染色体の再活性化が挙げられる。ある実施形態では、上記の特性のいずれかのサブセットを使用して、細胞能力をモニタリングする。一実施形態では、多能性細胞は、平らな丸いコロニー形態、SSEA4およびOct4の発現、ならびにキメラおよび奇形腫を形成する能力を有することによって特徴付けられる。
再プログラミングを誘導した後、再プログラミングされた細胞を、多能性に関連する、該当する検出可能な形態学的変化、分子的変化および/または生化学的変化に基づいて選択することができる。細胞の能力の評価において別々にまたは組み合わせてモニタリングすることができる細胞の多能性の特異的な特性としては、これらに限定されないが、遺伝子発現、メチル化、ならびにin vivoおよびin vitroにおける特性、例えば、i)丸くて平らな多能性幹細胞の形態;ii)SSEA1(マウス多能性幹細胞)、SSEA3/4(ヒト多能性幹細胞);TRA1-60/81;TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31、CD34、OCT4、Nanogおよび/またはSox2、ならびに本発明によって提供されるCD30およびCD50、ならびに前述のものの組合せを含めた多能性幹細胞マーカーの発現;iii)マウスキメラにおける、多能性幹細胞の生殖細胞系列伝達に寄与する能力;iv)四倍体胚補完アッセイを用いた、多能性幹細胞の、胚本体に寄与する能力;v)多能性幹細胞の奇形腫の形成;vi)胚様体の形成およびin vitroにおける三系統分化;ならびにvii)不活性なX染色体の再活性化が挙げられる。ある実施形態では、上記の特性のいずれかのサブセットを使用して、細胞能力をモニタリングする。一実施形態では、多能性細胞は、平らな丸いコロニー形態、SSEA4およびOct4の発現、ならびにキメラおよび奇形腫を形成する能力を有することによって特徴付けられる。
本明細書で考察されている通り、多能性は連続体として存在し、人工多能性幹細胞は、「プライムされた」状態および「ナイーブな」状態の両方で存在し、おそらくナイーブな状態にある細胞の方が分化の潜在性が大きいようである。従来の培地中で生成した人工多能性幹細胞は、プライムされた状態で存在し、着床後胚盤胞に由来する細胞によりよく似ているが、ナイーブiPSCは、マウス胚性幹細胞または着床前胚盤胞に由来する細胞によりよく似ている多能性特性を示す。プライムされた細胞の状態およびナイーブ細胞の状態は、コロニー形態、重要なシグナル伝達経路の阻害または活性化に対する細胞の応答、遺伝子発現のサイン、および胚体外の細胞に関連する遺伝子を再活性化する能力の差異を含めた種々の差異によって定義することができる。例えば、プライムされた多能性の状態を示す従来のiPSCは平らなコロニー形態を示すが、ナイーブiPSCはマウス胚性幹細胞と同様の密集したドーム形のコロニー形態を示す。さらに、従来のiPSCは、未分化の状態を維持するためには、重要なサイトカイン、例えば、TGFβ、アクチビン、およびbFGFの外因性のシグナル伝達を必要とし、ERK/MEK細胞シグナル伝達に依存し、細胞を、例えば、TGFβ阻害剤またはMEK阻害剤と接触させることによってこれらの経路が阻害されると分化する。対照的に、ナイーブ細胞は、外因性のシグナル伝達を必要とせず、TGFβシグナル伝達経路およびMEKシグナル伝達経路の阻害剤で処理した場合でさえ、多能性を維持する。
さらに、遺伝子発現解析により、ナイーブ多能性細胞とプライム多能性細胞の間の有意差が示されている。例えば、ナイーブiPSCではXistの発現が有意に抑制されているが、従来のiPSCはXistの発現のそれほど大きくない抑制のみを示し、ナイーブ細胞は、従来のiPSCにおいて見出される発現と比較して、有意なX染色体の再活性化およびX染色体に位置する遺伝子の発現の増加を示し、ナイーブ細胞は、これらに限定することなく、Gata6、CDX2、およびCGBを含めた胚体外の幹細胞マーカーを発現する。対照的に、分化の初期のマーカー、例えば、Foxa2、Sox17、およびB
rachyuryの系統特異的な遺伝子などは、従来のiPSCにおいて、ナイーブiPSCと比較してより高度に発現される。ナイーブな多能性の状態にある細胞を同定するために有用なさらなるマーカーとしては、Klf4、Tbx3、Gbx2、Lin28、Soc3の増大またはOtx2、Sox17、Cer1、FoxA2、Zic1、Lhx2、Xistの低下が挙げられる。
rachyuryの系統特異的な遺伝子などは、従来のiPSCにおいて、ナイーブiPSCと比較してより高度に発現される。ナイーブな多能性の状態にある細胞を同定するために有用なさらなるマーカーとしては、Klf4、Tbx3、Gbx2、Lin28、Soc3の増大またはOtx2、Sox17、Cer1、FoxA2、Zic1、Lhx2、Xistの低下が挙げられる。
本発明の特定の実施形態では、ナイーブ細胞が示すXistの発現は、従来のiPSCと比較して少なくとも2倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍低下する。本発明のいくつかの実施形態では、ナイーブな多能性の状態にある細胞では、Xistの発現が従来のiPSCの2倍低く、X染色体に位置する少なくとも5種の遺伝子の発現が従来のiPSCの3倍高いレベルである。
X染色体の再活性化は、X染色体に位置する少なくとも5種の遺伝子、少なくとも10種の遺伝子、または特定の実施形態では少なくとも100種の遺伝子の発現の、従来のiPSCにおけるそのような遺伝子のレベルと比較して少なくとも2倍、3倍、5倍、またはそれより高いレベルの上昇によって示すことができる。
本発明の特定の実施形態では、本発明の多能性細胞は、例えば、少なくとも1回、3回、5回、7回、10回、15回、20回またはそれより多くの継代などの複数回の細胞継代にわたって多能性特性を保持する。
本発明の方法において使用するための培地プラットフォーム
本発明の培地(すなわち、培養プラットフォーム)は、化学的に定義された保存基本培地、および、
フィーダーフリー環境における多能性細胞の長期培養;
フィーダーフリー環境における細胞の再プログラミング;
多能性細胞の単細胞への解離;
多能性細胞の細胞選別;
未分化状態の維持;
再プログラミングの効率の改善;および
ナイーブ多能性細胞の生成
を可能にする低分子阻害剤を含めた低分子の種々の組合せを含む。
本発明の培地(すなわち、培養プラットフォーム)は、化学的に定義された保存基本培地、および、
フィーダーフリー環境における多能性細胞の長期培養;
フィーダーフリー環境における細胞の再プログラミング;
多能性細胞の単細胞への解離;
多能性細胞の細胞選別;
未分化状態の維持;
再プログラミングの効率の改善;および
ナイーブ多能性細胞の生成
を可能にする低分子阻害剤を含めた低分子の種々の組合せを含む。
本発明の培地に使用するための化学的に定義された保存基本培地は、幹細胞の維持、成長、および/または分化を支持するために適した定義済みの任意の基本培地、例えば、従来のヒト胚性幹細胞用培地であってよい。本発明に従って使用することができる定義済みの基本培地の例としては、これらに限定されないが、とりわけ、ダルベッコ改変イーグル培地(「DMEM」)、イーグル基本培地(BME)、DMEM/F-12(1:1DMEMおよびF-12、vol:vol);199培地;F-12(Ham)栄養混合物;F-10(Ham)栄養混合物;最小必須培地(MEM)、ウイリアムズ培地E;およびRPMI1640が挙げられ、これらは全て、Gibco-BRL/Life Technologies,Inc.、Gaithersburg、Md.から入手可能である。これらの培地の多くのいくつかのバージョンが利用可能であり、本発明の培地を構築するために特に有用な培地としては、これらに限定されないが、:DMEM11966、DMEM10314、MEM11095、ウイリアムズ培地E12251、Ham F12 11059、MEM-アルファ12561、および培地-199 11151が挙げられる(全てGibco-BRL/Life Technologiesから入手可能である(1995~1996年カタログ))。培地は、例えば、以下の1つまたは複数を含んでよい:アミノ酸、ビタミン、有機塩、無機塩、微量元素、緩衝塩、糖、ATPなど(適切な基本培地の成分は、Sigma-Aldrich of Saint Louis、M
o.から入手可能である)。
o.から入手可能である)。
本発明の細胞培養培地において使用するための低分子、およびそのクラスは下により詳細に記載されている。特定の実施形態では、本発明の培地は、TGFβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびROCK阻害剤のうちの1種または複数種、2種以上、または3種以上を含む。ある実施形態では、本発明の培地は、TGFβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびROCK阻害剤を含む。本発明の細胞培養培地および方法において使用するための例示的なTGFβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびROCK阻害剤は下に記載されている。培地は、PARP阻害剤、例えば、Olaparib(AZD-2281)などをさらに含んでよい。
GSK-3β阻害剤
GSK-3βの阻害剤としては、これらに限定されないが、GSK-3βに結合する抗体、ドミナントネガティブGSK-3β変異体、ならびにGSK-3βを標的とするsiRNAおよびアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なGSK-3β阻害剤としては、これらに限定されないが、ケンパウロン(Kenpaullone)、1-アザケンパウロン(Azakenpaullone)、CHIR99021、CHIR98014、AR-A014418、CT99021、CT20026、SB216763、AR-A014418、リチウム、SB415286、TDZD-8、BIO、BIO-アセトキシム、(5-メチル-1H-ピラゾール-3-イル)-(2-フェニルキナゾリン-4-イル)アミン、ピリドカルバゾール-シクロペンタジエニルルテニウム(cyclopenadienylruthenium)複合体、TDZD-8 4-ベンジル-2-メチル-1,2,4-チアジアゾリジン-3,5-ジオン、2-チオ(3-ヨードベンジル)-5-(1-ピリジル)-[1,3,4]-オキサジアゾール、OTDZT、アルファ-4-ジブロモアセトフェノン、AR-AO 144-18、3-(1-(3-ヒドロキシプロピル)-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル]-4-ピラジン-2-イル-ピロール-2,5-ジオン;TWSl 19ピロロピリミジン化合物、L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2またはそのミリストイル化形態;2-クロロ-1-(4,5-ジブロモ-チオフェン-2-イル)-エタノン、SB216763、およびSB415286が挙げられる。本発明の細胞培養培地において使用するための例示的なGSK3阻害剤としてはCHIR99021、BIO、およびケンパウロン(Kenpaullone)が挙げられるが、特定の実施形態ではCHIR99021が好ましい。
GSK-3βの阻害剤としては、これらに限定されないが、GSK-3βに結合する抗体、ドミナントネガティブGSK-3β変異体、ならびにGSK-3βを標的とするsiRNAおよびアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なGSK-3β阻害剤としては、これらに限定されないが、ケンパウロン(Kenpaullone)、1-アザケンパウロン(Azakenpaullone)、CHIR99021、CHIR98014、AR-A014418、CT99021、CT20026、SB216763、AR-A014418、リチウム、SB415286、TDZD-8、BIO、BIO-アセトキシム、(5-メチル-1H-ピラゾール-3-イル)-(2-フェニルキナゾリン-4-イル)アミン、ピリドカルバゾール-シクロペンタジエニルルテニウム(cyclopenadienylruthenium)複合体、TDZD-8 4-ベンジル-2-メチル-1,2,4-チアジアゾリジン-3,5-ジオン、2-チオ(3-ヨードベンジル)-5-(1-ピリジル)-[1,3,4]-オキサジアゾール、OTDZT、アルファ-4-ジブロモアセトフェノン、AR-AO 144-18、3-(1-(3-ヒドロキシプロピル)-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル]-4-ピラジン-2-イル-ピロール-2,5-ジオン;TWSl 19ピロロピリミジン化合物、L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2またはそのミリストイル化形態;2-クロロ-1-(4,5-ジブロモ-チオフェン-2-イル)-エタノン、SB216763、およびSB415286が挙げられる。本発明の細胞培養培地において使用するための例示的なGSK3阻害剤としてはCHIR99021、BIO、およびケンパウロン(Kenpaullone)が挙げられるが、特定の実施形態ではCHIR99021が好ましい。
ERK/MEK阻害剤
ERK/MEK経路の例示的な阻害剤としては、これらに限定されないが、MEKまたはERKに対する抗体、ドミナントネガティブMEKまたはERK変異体、ならびにMEKおよび/またはERKの発現を抑制するsiRNAおよびアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なERK/MEK阻害剤としては、これらに限定されないが、PD0325901、PD98059、UO126、SL327、ARRY-162、PD184161、PD184352、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、GSKl 120212、ARRY-438162、RO5126766、XL518、AZD8330、RDEAl 19、AZD6244、FR180204およびPTK787が挙げられる。
ERK/MEK経路の例示的な阻害剤としては、これらに限定されないが、MEKまたはERKに対する抗体、ドミナントネガティブMEKまたはERK変異体、ならびにMEKおよび/またはERKの発現を抑制するsiRNAおよびアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なERK/MEK阻害剤としては、これらに限定されないが、PD0325901、PD98059、UO126、SL327、ARRY-162、PD184161、PD184352、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、GSKl 120212、ARRY-438162、RO5126766、XL518、AZD8330、RDEAl 19、AZD6244、FR180204およびPTK787が挙げられる。
さらなるMEK/ERK阻害剤としては、国際公開特許出願WO 99/01426、WO 02/06213、WO 03/077914、WO 05/051301およびWO 2007/044084に開示されている化合物が挙げられる。
さらなる説明的なMEK/ERK阻害剤の例としては、以下の化合物が挙げられる:--6-(4-ブロモ-2-クロロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-メチル-3H
-ベンゾイミダゾール-e-5-カルボン酸(2,3-ジヒドロキシ-プロポキシ)-アミド;6-(4-ブロモ-2-クロロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-(テトラヒドロ-ピラン-2-イルメチル(ylm- ethyl))-3H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸(2-ヒドロキシ-エトキシ)-アミド、1-[6-(4-ブロモ-2-クロロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-メチル-3H-ベンゾイミダゾール-5-イル]-2-ヒドロキシ-エタノン、6-(4-ブロモ-2-クロロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-メチル-3H-ベンゾイミダゾール-e-5-カルボン酸(2-ヒドロキシ-1,1-ジメチル-エトキシ)-アミド、6-(4-ブロモ-2-クロロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-(テトラヒドロ-フラン-2-イルメチル(ylm- ethyl))-3H-ベンゾイミダゾール-5--カルボン酸(2-ヒドロキシ-エトキシ)-アミド、6-(4-ブロモ-2-フルオロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-メチル-3H-ベンゾイミダゾール-e-5-カルボン酸(2-ヒドロキシ-エトキシ)-アミド、6-(2,4-ジクロロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-メチル-3H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸(2-ヒドロキシ-エトキシ)-アミド、6-(4-ブロモ-2-クロロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-メチル-3H-ベンゾイミダゾール-e-5-カルボン酸(2-ヒドロキシ-エトキシ)-アミド、以後MEK阻害剤1と称される;2-[(2-フルオロ-4-ヨードフェニル)アミノ]-N-(2-ヒドロキシエトキシ)-1,5-ジメチル-6--オキソ-1,6-ジヒドロピリジン-3-カルボキサミド;以後MEK阻害剤2と称される;および4-(4-ブロモ-2-フルオロフェニルアミノ)-N-(2-ヒドロキシエトキシ)-1,5-ジメチル-6--オキソ-1,6-ジヒドロピリダジン-3-カルボキサミドまたはそれらの薬学的に許容される塩。ある実施形態では、本発明の細胞培養培地において使用するためのMEK/ERK阻害剤はPD98059である。
-ベンゾイミダゾール-e-5-カルボン酸(2,3-ジヒドロキシ-プロポキシ)-アミド;6-(4-ブロモ-2-クロロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-(テトラヒドロ-ピラン-2-イルメチル(ylm- ethyl))-3H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸(2-ヒドロキシ-エトキシ)-アミド、1-[6-(4-ブロモ-2-クロロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-メチル-3H-ベンゾイミダゾール-5-イル]-2-ヒドロキシ-エタノン、6-(4-ブロモ-2-クロロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-メチル-3H-ベンゾイミダゾール-e-5-カルボン酸(2-ヒドロキシ-1,1-ジメチル-エトキシ)-アミド、6-(4-ブロモ-2-クロロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-(テトラヒドロ-フラン-2-イルメチル(ylm- ethyl))-3H-ベンゾイミダゾール-5--カルボン酸(2-ヒドロキシ-エトキシ)-アミド、6-(4-ブロモ-2-フルオロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-メチル-3H-ベンゾイミダゾール-e-5-カルボン酸(2-ヒドロキシ-エトキシ)-アミド、6-(2,4-ジクロロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-メチル-3H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸(2-ヒドロキシ-エトキシ)-アミド、6-(4-ブロモ-2-クロロ-フェニルアミノ)-7-フルオロ-3-メチル-3H-ベンゾイミダゾール-e-5-カルボン酸(2-ヒドロキシ-エトキシ)-アミド、以後MEK阻害剤1と称される;2-[(2-フルオロ-4-ヨードフェニル)アミノ]-N-(2-ヒドロキシエトキシ)-1,5-ジメチル-6--オキソ-1,6-ジヒドロピリジン-3-カルボキサミド;以後MEK阻害剤2と称される;および4-(4-ブロモ-2-フルオロフェニルアミノ)-N-(2-ヒドロキシエトキシ)-1,5-ジメチル-6--オキソ-1,6-ジヒドロピリダジン-3-カルボキサミドまたはそれらの薬学的に許容される塩。ある実施形態では、本発明の細胞培養培地において使用するためのMEK/ERK阻害剤はPD98059である。
TGFβ受容体/ALK5阻害剤
例示的なALK5阻害剤としては、ALK5に対する抗体、ALK5のドミナントネガティブ変異体、およびALK5の発現を抑制するアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なALK5阻害剤としては、これらに限定されないが、SB431542、A-83-01、2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン、Wnt3a/BIO、BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604、SB-505124、およびピリミジン誘導体が挙げられ、例えば、参照により本明細書に組み込まれるWO2008/006583を参照されたい。
例示的なALK5阻害剤としては、ALK5に対する抗体、ALK5のドミナントネガティブ変異体、およびALK5の発現を抑制するアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なALK5阻害剤としては、これらに限定されないが、SB431542、A-83-01、2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン、Wnt3a/BIO、BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604、SB-505124、およびピリミジン誘導体が挙げられ、例えば、参照により本明細書に組み込まれるWO2008/006583を参照されたい。
さらに、「ALK5阻害剤」は非特異的なキナーゼ阻害剤を包含しないものとし、「ALK5阻害剤」は、ALK5に加えて、ALK4および/またはALK7を阻害する阻害剤、例えば、SB-431542などを包含するものと理解されるべきである(例えば、Inmanら、J MoI. Phamacol. 62巻(1号):65~74頁(2002年)を参照されたい。
ALK5を阻害することの効果を示す本明細書のデータを考慮して、TGFβ/アクチビン経路を阻害することも同様の効果を有すると考えられる。したがって、例えば、TGFβ/アクチビン経路の上流または下流の任意の阻害剤を、本明細書の各パラグラフに記載のALK5阻害剤と組み合わせて、またはその代わりに用いることができる。例示的なTGFβ/アクチビン経路阻害剤としては、これらに限らないが、:TGFβ受容体阻害剤、SMAD2/3リン酸化の阻害剤、SMAD2/3とSMAD4の相互作用の阻害剤、ならびにSMAD6およびSMAD7の活性化因子/アゴニストが挙げられる。さらに、下記のカテゴリー化は、ただ単に組織的な目的のためのものであり、当業者には、化合物が、経路内の1つまたは複数の点に影響を及ぼし得、したがって、化合物が2種以上の定義済みのカテゴリーにおいて機能し得ることが分かるであろう。
TGFβ受容体阻害剤としては、TGFβ受容体に対する抗体、TGFβ受容体のドミナントネガティブ変異体およびTGFβ受容体を標的とするsiRNAまたはアンチセンス核酸を挙げることができる。阻害剤の特定の例としては、これらに限らないが、SU5416;2-(5-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-イル-2-tert-ブチル-3H-イミダゾール-4-イル)-6-メチルピリジン塩酸塩(SB-505124);レルデリムマブ(lerdelimumb)(CAT-152);メテリムマブ(metelimumab)(CAT-192);GC-1008;IDl 1;AP-12009;AP-11014;LY550410;LY580276;LY364947;LY2109761;SB-505124;SB-431542;SD-208;SM16;NPC-30345;Ki26894;SB-203580;SD-093;グリベック(Gleevec);3,5,7,2’,4’-ペンタヒドロキシフラボン(pentahydroxyfiavone)(Morin);アクチビン-M108A;P144;可溶性TBR2-Fc;およびTGFβ受容体を標的とするアンチセンストランスフェクト腫瘍細胞が挙げられる(例えば、Wrzesinskiら、Clinical Cancer Research 13巻(18号):5262~5270頁(2007年);Kaminskaら、Acta Biochimica Polonica 52巻(2号):329~337頁(2005年);およびChangら、Frontiers in Bioscience 12巻:4393~4401頁(2007年)を参照されたい。
本発明の細胞培養培地において使用するための例示的なTGFβ受容体阻害剤としては、SB431542、A-83-01、およびRepSoxが挙げられる。特定の実施形態では、TGFβ阻害剤はSB431542である。
ROCK阻害剤
ROCKは、Rho(3種のアイソフォーム-RhoA、RhoBおよびRhoCが存在する)の標的タンパク質としての機能を果たすセリン/トレオニンキナーゼである。例示的なROCK阻害剤としては、これらに限定されないが、ROCKに対する抗体、ドミナントネガティブROCK変異体、ならびにROCKの発現を抑制するsiRNAおよびアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なROCK阻害剤としては、これらに限定されないが、チアゾビビン、Y27632、ファスジル(Fasudil)、AR122-86、Y27632 H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、ヒドロキシル-HA-1077、GSK269962A、SB-772077-B、N-(4-ピリジル)-N’-(2,4,6-トリクロロフェニル)尿素、3-(4-ピリジル)-1H-インドール、および(R)-(+)-トランス-N-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキシアミドが挙げられる。
ROCKは、Rho(3種のアイソフォーム-RhoA、RhoBおよびRhoCが存在する)の標的タンパク質としての機能を果たすセリン/トレオニンキナーゼである。例示的なROCK阻害剤としては、これらに限定されないが、ROCKに対する抗体、ドミナントネガティブROCK変異体、ならびにROCKの発現を抑制するsiRNAおよびアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なROCK阻害剤としては、これらに限定されないが、チアゾビビン、Y27632、ファスジル(Fasudil)、AR122-86、Y27632 H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、ヒドロキシル-HA-1077、GSK269962A、SB-772077-B、N-(4-ピリジル)-N’-(2,4,6-トリクロロフェニル)尿素、3-(4-ピリジル)-1H-インドール、および(R)-(+)-トランス-N-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキシアミドが挙げられる。
本発明の細胞培養培地において使用するための例示的なROCK阻害剤としては、チアゾビビン、Y27632、ピリンテグリン(pyrintegrin)、およびブレビスタチンが挙げられる。ある実施形態では、ROCK阻害剤はチアゾビビンである。
FGFR阻害剤
例示的なFGFR阻害剤としては、これらに限定されないが、FGFRに対する抗体、ドミナントネガティブFGFR変異体、ならびにFGFRの発現を抑制するsiRNAおよびアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なFGFR阻害剤としては、これらに限定されないが、RO-4396686、CHIR-258、PD 173074、PD 166866、ENK-834、ENK-835、SU5402、XL-999、SU6668、R04383596、およびBIBF-1120が挙げられる。
例示的なFGFR阻害剤としては、これらに限定されないが、FGFRに対する抗体、ドミナントネガティブFGFR変異体、ならびにFGFRの発現を抑制するsiRNAおよびアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なFGFR阻害剤としては、これらに限定されないが、RO-4396686、CHIR-258、PD 173074、PD 166866、ENK-834、ENK-835、SU5402、XL-999、SU6668、R04383596、およびBIBF-1120が挙げられる。
PARP阻害剤
PARP阻害剤は、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(「PARP」)を阻害する。PARPタンパク質は、細胞においてDNA修復経路を調節するように機能するDNA修復酵素である。PARPは、塩基除去修復(BER)経路に関与し、PARPを阻害することにより、再プログラミングの間の細胞のゲノム安定性または多能性細胞の維持が促進され得る。本発明の細胞培養培地において使用するための例示的なPARP阻害剤としては、限定することなく、イニパリブ(iniparib)、ベリパリブ(veliparib)、およびオラパリブ(olaparib)(AZD-2281)が挙げられる。
PARP阻害剤は、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(「PARP」)を阻害する。PARPタンパク質は、細胞においてDNA修復経路を調節するように機能するDNA修復酵素である。PARPは、塩基除去修復(BER)経路に関与し、PARPを阻害することにより、再プログラミングの間の細胞のゲノム安定性または多能性細胞の維持が促進され得る。本発明の細胞培養培地において使用するための例示的なPARP阻害剤としては、限定することなく、イニパリブ(iniparib)、ベリパリブ(veliparib)、およびオラパリブ(olaparib)(AZD-2281)が挙げられる。
本発明の細胞培養培地中の低分子の量は変えることができ、使用する特定の分子および組合せ、培地中で培養する細胞の種類、および本発明の培地への使用の特定の適用を含めた特定の培養条件に従って最適化することができる。いくつかの実施形態では、低分子は、培地中に、多能性を誘導するため、再プログラミングの効率を改善するため、または細胞の能力を増大させるためもしくは維持するために十分な濃度で存在する。
特定の実施形態では、本発明の細胞培養培地中の好ましい低分子の濃度および組合せが表1に示されている。本発明の細胞培養培地の特定の実施形態では、細胞培養培地は表1に記載の「SMC4」培地である。SMC4培地は、表1に示されている従来のヒトESC培地および特定の経路修飾因子および添加物を含む。培地の構成成分は、培地中に、表1に示されているそのような構成成分に最適な範囲内の量で存在してよく、表1に示されている最適な濃度で存在する。SMC4培地の複数の実施形態は、必要に応じて、表2に示されている代替培地および経路修飾因子および活性化因子の任意の1つまたは複数を、表2に示されている最適な範囲内の濃度で、および、ある実施形態では、表2に示されている最適な範囲内の濃度で含んでよい。培地の特定の実施形態では、SMC4培地は、可溶性フィブロネクチンを含み、全体を通して「SMC4+フィブロネクチン」と称される。
いくつかの実施形態では、本発明の培地は、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドのうちの1つまたは複数をさらに含む。いくつかの実施形態では、培地は細胞を含まない。いくつかの実施形態では、培地は、細胞、例えば、非多能性細胞、部分的に多能性の細胞、多能性細胞、または種々の能力の状態の細胞を含有する細胞の混成集団をさらに含む。
表1.細胞培養の構成成分および添加物。
下記の表には、単細胞継代および細胞選別および富化の手順を受けている細胞の生存能力および多能性を増強するため、再プログラミングプロセスを増強するため、ならびに多能性幹細胞を未分化の状態に維持するために使用することができる分子、およびそれらが影響を及ぼすシグナル伝達経路の例が列挙されている。
下記の表には、単細胞継代および細胞選別および富化の手順を受けている細胞の生存能力および多能性を増強するため、再プログラミングプロセスを増強するため、ならびに多能性幹細胞を未分化の状態に維持するために使用することができる分子、およびそれらが影響を及ぼすシグナル伝達経路の例が列挙されている。
表2.フィーダーフリー系における単細胞継代、細胞選別および培養における細胞の多能性および生存能力を増強するための特定の代替的な細胞培養構成成分および添加物
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の細胞培養培地は、サイトカインおよび/または成長因子を実質的に含まず、必要に応じて、フィーダーフリー環境である。他の実施形態では、細胞培養培地は、補充物、例えば、血清、抽出物、成長因子、ホルモン、サイトカインなどを含有する。
種々の成長因子および培地におけるそれらの使用は当技術分野で周知であり、それらとしては、例えば、ECMタンパク質、ラミニン1、フィブロネクチン、IV型コラーゲンアイソタイプ、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、細胞表面接着タンパク質、細胞-シグナル伝達タンパク質、カドヘリン、細胞内クロライドチャネル1、膜貫通受容体PTK7、インスリン様成長因子、インヒビンベータA、TGFβ/アクチビン/節(nodal)シグナル伝達経路の誘導因子、およびアクチビンAが挙げられる。培地において使用するサイトカインとしては、例えば、以下の1つまたは複数を挙げることができる:成長因子、例えば、上皮成長因子(EGF)、酸性線維芽細胞成長因子(aFGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、肝細胞成長因子(HGF)、インスリン様成長因子1(IGF-1)、インスリン様成長因子2(IGF-2)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、神経成長因子(NGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、形質転換成長因子ベータ(TGF-β)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)、トランスフェリン、種々のインターロイキン(例えば、IL-1~IL-18)、種々のコロニー-刺激因子(例えば、顆粒球/マクロファージコロニー-刺激因子(GM-CSF))、種々のインターフェロン(例えば、IFN-γなど)および幹細胞に対する効果を有する他のサイトカイン、例えば、幹細胞因子(SCF)およびエリスロポエチン(Epo)。これらのサイトカインは、商業的に、例えば、R&D Systems、Minneapolis、Minn.から入手することができ、また、天然または組換え型のどちらであってもよい。いくつかの実施形態では、多種多様な哺乳動物の細胞を培養するために、基本培地は、FGFを約0.01~100ng/ml、約0.2~20ng/mlの濃度で、および、特定の実施形態では、約0.5~10ng/mlの濃度で含有する。他のサイトカインを使用す
る場合、経験的に決定される濃度または確立されたサイトカインの技術分野で手引きされる濃度で添加することができる。
る場合、経験的に決定される濃度または確立されたサイトカインの技術分野で手引きされる濃度で添加することができる。
本培地に含めることができるさらなる構成成分は、インスリン(特にインスリンZn++として)およびトランスフェリンである。これらのさらなる成分は市販されており(例えば、Sigma-Aldrich、St.Louis、Mo.から)、本培地に約0.1~約100μg/mlまたは約1~約10μg/mlの濃度範囲で処方することができる。さらに、組換えインスリンまたはインスリンの亜鉛ベースの塩で動物またはヒト由来のインスリンを置き換えることができる。他の成分または代替物を、当業者に公知のように補充組成物に加えることができる。
その代わりに(またはそれに加えて)、サイトカインおよび同様の補充物の構成成分を基本培地に含めることができる。そのような構成成分は、一般には、補充組成物は従来、基本培地を保管するために定期的に用いられる約4℃の温度ではなく約-20℃で保管されるので、補充組成物と一緒に含める。サイトカインおよび同様の構成成分は、-20℃に近い温度でより好都合であり得る。
本発明の方法において使用するための基質
任意の適切な容器または細胞培養容器を、基本培地および/または細胞培養補充物中の細胞培養物の支持体として使用することができる。支持体上の基質コーティングは必要ない。しかし、培養容器の表面を、接着促進性基層(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、RGDを含有するポリペプチド、ゼラチンなど)でコーティングすることにより、細胞の付着が促進され、それにより、本明細書に開示されている細胞培養培地および補充物の効果が増強され得る。細胞を培養し、継代するための適切な基質は当技術分野で公知であり、それらとしては、限定することなく、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチン、オステオポンチン、天然に存在する細胞系により産生されたマトリックス、例えば、Matrigel(商標)の混合物、ならびに、合成または人工の表面、例えば、ポリアミン単層およびカルボキシ末端単層が挙げられる。
フィーダーフリー環境
細胞は、一般には、フィーダー細胞上でまたはフィーダー細胞で予備馴化され、ウシ胎仔血清を含有する培養環境で培養されているが、そのような環境は、臨床的な使用および治療的な使用のための細胞を作製するためには不適当な場合がある。例えば、そのような異物が混入した環境において培養された細胞は、一般に、動物の構成成分に曝露することにより、免疫拒絶反応および処置される患者に未確認の病原体が伝染する重大な危険性がもたらされる可能性があり、また、動物レトロウイルスを潜在的に再活性化する恐れがあるので、ヒト細胞移植には不適当であるとみなされる。動物を含まない培地を用いた培養系、例えば本発明のフィーダーフリー環境により、臨床グレードの細胞系、特にhESC細胞系およびiPSC細胞系を作製することが容易になる。
任意の適切な容器または細胞培養容器を、基本培地および/または細胞培養補充物中の細胞培養物の支持体として使用することができる。支持体上の基質コーティングは必要ない。しかし、培養容器の表面を、接着促進性基層(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、RGDを含有するポリペプチド、ゼラチンなど)でコーティングすることにより、細胞の付着が促進され、それにより、本明細書に開示されている細胞培養培地および補充物の効果が増強され得る。細胞を培養し、継代するための適切な基質は当技術分野で公知であり、それらとしては、限定することなく、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチン、オステオポンチン、天然に存在する細胞系により産生されたマトリックス、例えば、Matrigel(商標)の混合物、ならびに、合成または人工の表面、例えば、ポリアミン単層およびカルボキシ末端単層が挙げられる。
フィーダーフリー環境
細胞は、一般には、フィーダー細胞上でまたはフィーダー細胞で予備馴化され、ウシ胎仔血清を含有する培養環境で培養されているが、そのような環境は、臨床的な使用および治療的な使用のための細胞を作製するためには不適当な場合がある。例えば、そのような異物が混入した環境において培養された細胞は、一般に、動物の構成成分に曝露することにより、免疫拒絶反応および処置される患者に未確認の病原体が伝染する重大な危険性がもたらされる可能性があり、また、動物レトロウイルスを潜在的に再活性化する恐れがあるので、ヒト細胞移植には不適当であるとみなされる。動物を含まない培地を用いた培養系、例えば本発明のフィーダーフリー環境により、臨床グレードの細胞系、特にhESC細胞系およびiPSC細胞系を作製することが容易になる。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のフィーダーフリー環境は、これらに限定することなく、ヒト線維芽細胞、ケラチノサイト、および胚性幹細胞を含めたヒトフィーダー細胞を基本的に含まず、フィーダー細胞によって予備馴化されていない。本発明のさらなる実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的に、動物フィーダー細胞を含まず、さらに、いくつかの実施形態では、フィーダー細胞で予備馴化されていない。本発明の特定の実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的にヒトフィーダー細胞と動物フィーダー細胞のどちらも含まず、さらにより特定の実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的にヒトフィーダー細胞と動物フィーダー細胞のどちらも含まず、フィーダー細胞で予備馴化されていない。
本発明のフィーダーフリー細胞培養培地は、多能性細胞の培養、細胞の再プログラミン
グ、多能性細胞の単細胞への解離、多能性細胞の細胞選別、ナイーブ多能性細胞の生成、および細胞の未分化状態の維持を含めた、本発明の方法において使用される。本発明の特定の方法では、フィーダーフリー環境は、多能性を誘導するため、再プログラミングの効率を改善するため、および/または細胞の能力を増大させるもしくは維持するための方法において使用される。ある実施形態では、フィーダーフリー環境は、bFGFを含めたサイトカインおよび成長因子を実質的に含まない。
グ、多能性細胞の単細胞への解離、多能性細胞の細胞選別、ナイーブ多能性細胞の生成、および細胞の未分化状態の維持を含めた、本発明の方法において使用される。本発明の特定の方法では、フィーダーフリー環境は、多能性を誘導するため、再プログラミングの効率を改善するため、および/または細胞の能力を増大させるもしくは維持するための方法において使用される。ある実施形態では、フィーダーフリー環境は、bFGFを含めたサイトカインおよび成長因子を実質的に含まない。
解離
細胞を単細胞、例えば、単細胞懸濁物に解離させることは、酵素的または機械的な手段によって実現することができる。細胞を単細胞に解離させることができる当技術分野で公知の任意の酵素剤を、本発明の方法において使用することができる。本発明の一実施形態では、解離作用剤は、トリプシン/EDTA、TrypLE-Select、コラゲナーゼIVおよびディスパーゼから選択される。
細胞を単細胞、例えば、単細胞懸濁物に解離させることは、酵素的または機械的な手段によって実現することができる。細胞を単細胞に解離させることができる当技術分野で公知の任意の酵素剤を、本発明の方法において使用することができる。本発明の一実施形態では、解離作用剤は、トリプシン/EDTA、TrypLE-Select、コラゲナーゼIVおよびディスパーゼから選択される。
キレート化剤、例えば、EDTA、アキュターゼ(Accutase)、またはAccuMaxも、本発明の方法による細胞の解離において単独で、または酵素剤と組み合わせて用いることができる。単細胞への解離を容易にするために、解離作用剤をカルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSに溶解させることができる。
解離の間およびその後の細胞の生存を増強するために、生存促進物質(例えば、成長因子、細胞死およびアポトーシスに関与する細胞経路の阻害剤、または馴化培地)を添加することができる。いくつかの実施形態では、従来の培地で培養した細胞を解離させ、単細胞を、1種または複数種の低分子阻害剤を有する本発明の細胞培養物、例えば、SMC4培地またはSMC4+フィブロネクチン培地に入れる。解離した単細胞は、必要に応じて、フィーダーフリー環境に置くことができる。他の実施形態では、細胞をフィーダーフリー環境において培養した後に解離させ、1種または複数種の低分子阻害剤を有する本発明の細胞培養物、例えば、SMC4培地またはSMC4+フィブロネクチン培地に入れ、必要に応じてフィーダーフリー環境に置いてもよい。
単細胞への酵素による解離を機械力により支持することができる。あるいは、解離作用剤は、ピペットまたは先の尖ったミクロキャピラリーなどの機械的ツールを使用して細胞を引き離すことによるものなどの機械力のみであってよい。
細胞培養および培地収集の一般的な技法は、Large Scale Mammalian Cell Culture(Huら、Curr. Opin. Biotechnol. 8巻:148頁、1997年);Serum-free Media(K. Kitano、Biotechnology 17巻:73頁、1991年);Large
Scale Mammalian Cell Culture(Curr. Opin. Biotechnol. 2巻:375頁、1991年);およびSuspension Culture of Mammalian Cells(Birchら、Bioprocess Technol. 19巻:251頁、1990年)に概説されている。他の対象の読み物としては、Understanding Media(M. McLuhan、Mentor N.Y.、1964年)およびThe Medium is the Massage(M. McLuhan & Q. Fiore、Bantam
N.Y.、1967年)が挙げられる。
Scale Mammalian Cell Culture(Curr. Opin. Biotechnol. 2巻:375頁、1991年);およびSuspension Culture of Mammalian Cells(Birchら、Bioprocess Technol. 19巻:251頁、1990年)に概説されている。他の対象の読み物としては、Understanding Media(M. McLuhan、Mentor N.Y.、1964年)およびThe Medium is the Massage(M. McLuhan & Q. Fiore、Bantam
N.Y.、1967年)が挙げられる。
本発明の実施において有用な一般的な技法のさらなる詳細について、実践者は、細胞生物学、組織培養、および発生学における標準の教本および総説を参照することができる。「Teratocarcinomas and embryonic stem cells:A practical approach」(E. J. Robertson
編、IRL Press Ltd. 1987年);「Guide to Techniques in Mouse Development」(P. M. Wassermanら編、Academic Press 1993年);「Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro」(M. V. Wiles、Meth. Enzymol. 225巻:900頁、1993年);「Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy」(P. D. Rathjenら、1993年)が挙げられる。幹細胞の分化は、Robertson、Meth. Cell
Biol. 75巻:173頁、1997年;およびPedersen、Reprod. Fertil. Dev. 10巻:31頁、1998年に概説されている。
編、IRL Press Ltd. 1987年);「Guide to Techniques in Mouse Development」(P. M. Wassermanら編、Academic Press 1993年);「Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro」(M. V. Wiles、Meth. Enzymol. 225巻:900頁、1993年);「Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy」(P. D. Rathjenら、1993年)が挙げられる。幹細胞の分化は、Robertson、Meth. Cell
Biol. 75巻:173頁、1997年;およびPedersen、Reprod. Fertil. Dev. 10巻:31頁、1998年に概説されている。
富化および枯渇の戦略
本発明は、iPSC生成の効率を上昇させる方法として細胞集団を多能性細胞について富化するための戦略も提供する。富化戦略により、クローンiPSCコロニーを比較的短い時間で得、iPSC生成の効率を改善する方法が提供される。本発明の富化方法は、再プログラミングされるように誘導された細胞集団を選別して、多能性のマーカーを発現している細胞を同定し、それを得、それにより、多能性細胞が富化された細胞集団を得ることを含む。選別される細胞は、再プログラミングされるように誘導されていてよく、また、再プログラミングを受けている細胞の混成集団を含んでよく、したがって、集団は、多能性細胞、部分的に多能性の細胞、および非多能性細胞、例えば、完全に分化した細胞を含む。一実施形態では、選別される細胞集団は、再プログラミングされるように誘導されており、多能性のマーカーを発現している。いくつかの実施形態では、細胞を、約4~30日間、約4~24日間、約6~22日間、または約8~約12日間にわたって再プログラミングを誘導した後に培養する。さらなる富化方法体系は、分化または非多能性のマーカーを発現している細胞を枯渇させて、多能性細胞が富化された集団を得ることを包含する。
本発明は、iPSC生成の効率を上昇させる方法として細胞集団を多能性細胞について富化するための戦略も提供する。富化戦略により、クローンiPSCコロニーを比較的短い時間で得、iPSC生成の効率を改善する方法が提供される。本発明の富化方法は、再プログラミングされるように誘導された細胞集団を選別して、多能性のマーカーを発現している細胞を同定し、それを得、それにより、多能性細胞が富化された細胞集団を得ることを含む。選別される細胞は、再プログラミングされるように誘導されていてよく、また、再プログラミングを受けている細胞の混成集団を含んでよく、したがって、集団は、多能性細胞、部分的に多能性の細胞、および非多能性細胞、例えば、完全に分化した細胞を含む。一実施形態では、選別される細胞集団は、再プログラミングされるように誘導されており、多能性のマーカーを発現している。いくつかの実施形態では、細胞を、約4~30日間、約4~24日間、約6~22日間、または約8~約12日間にわたって再プログラミングを誘導した後に培養する。さらなる富化方法体系は、分化または非多能性のマーカーを発現している細胞を枯渇させて、多能性細胞が富化された集団を得ることを包含する。
本発明の富化戦略は、選別される細胞集団の単細胞懸濁物を得ることを含む。本発明の一実施形態では、単細胞懸濁物は、集団内の細胞を解離させることおよび細胞を再懸濁させることによって得られる。細胞を維持するため、または細胞選別を実施するために、解離細胞を、任意の適切な溶液または培地に再懸濁させることができる。特定の実施形態では、単細胞懸濁物は、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤のうちの1つまたは複数を含有する。ある実施形態では、単細胞懸濁物は、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含み、ある特定の実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。
本発明の富化プロセスでは、細胞を選別して多能性細胞を得る、または細胞について、再プログラミングされていない細胞または非多能性細胞を枯渇させ、それにより、多能性細胞が富化された細胞集団を得る。一実施形態では、単細胞懸濁物を調製し、次いで、単細胞を、選別するために、例えば、多能性のマーカーについて、例えば、適切な抗体を使用して染色することによって調製する。細胞は、細胞を選別する任意の適切な方法、例えば、磁気ビーズまたはフローサイトメトリー(FACS)による選別によって選別することができる。
細胞は、Oct、Sox、Nanog、SSEA3/4;TRA1-60/81;TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31
、CD34、OCT4、KLF4、SSEA1(マウス)、および本発明において実証されているCD30およびCD50の発現を含めた種々の多能性のマーカーに基づいて選別することができる。種々の実施形態では、細胞を、少なくとも2種、少なくとも3種、または少なくとも4種の多能性のマーカーに基づいて選別する。ある実施形態では、細胞を、SSEA4の発現に基づいて選別し、ある特定の実施形態では、TRA181またはTRA160と組み合わせたSSEA4の発現に基づいて選別する。ある実施形態では、細胞を、SSEA4、Tra181またはTra160およびCD30に基づいて選別する。ある実施形態では、細胞について、最初に、再プログラミングされていない細胞を、これらに限定されないが、CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、またはCD7を含み得る、分化している細胞の表面マーカーを使用して枯渇させ、次いで、多能性マーカー、例えば、SSEA4、Tra181およびCD30について富化する。
、CD34、OCT4、KLF4、SSEA1(マウス)、および本発明において実証されているCD30およびCD50の発現を含めた種々の多能性のマーカーに基づいて選別することができる。種々の実施形態では、細胞を、少なくとも2種、少なくとも3種、または少なくとも4種の多能性のマーカーに基づいて選別する。ある実施形態では、細胞を、SSEA4の発現に基づいて選別し、ある特定の実施形態では、TRA181またはTRA160と組み合わせたSSEA4の発現に基づいて選別する。ある実施形態では、細胞を、SSEA4、Tra181またはTra160およびCD30に基づいて選別する。ある実施形態では、細胞について、最初に、再プログラミングされていない細胞を、これらに限定されないが、CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、またはCD7を含み得る、分化している細胞の表面マーカーを使用して枯渇させ、次いで、多能性マーカー、例えば、SSEA4、Tra181およびCD30について富化する。
選別して多能性マーカーに対して陽性である細胞を得た後の所望の細胞画分は、多能性細胞が富化された細胞集団である。多能性細胞が富化された集団は、細胞培養系、例えば、従来のhESC培地または本発明の細胞培養培地などに入れることができる。細胞培養系は、フィーダー細胞が補充されていてよい、または必要に応じて、フィーダーフリー環境であってよい。いくつかの実施形態では、選別された、多能性のマーカーを発現している細胞を、フィーダー細胞が補充された培養系に置き、次いで、フィーダーフリー環境に移す。細胞培養系は、表1に示されている特定の経路修飾因子および添加物のうちの1つまたは複数が補充されていてよい。一実施形態では、細胞培養培地は、フィーダーフリー環境であり、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤のうちの少なくとも1つを含み、特定の実施形態では、細胞培養培地は、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含み、ある実施形態では、TFGβ阻害剤はSB431542であり、GSK3阻害剤はCHIR99021であり、MEK阻害剤はPD0325901であり、Rock阻害剤はチアゾビビンである。本発明の他の特定の実施形態では、細胞培養系は、表1に示されているMatrigel(商標)でコーティングした組織プレート、従来のhESC培地、および特定の経路修飾因子を含むフィーダーフリー環境である。一実施形態では、細胞培養系は、表1に記載のSMC4培地を、必要に応じて、表2に示されている代替培地および経路修飾因子のいずれかと組み合わせて含む。
富化細胞集団を、本明細書に記載の細胞培養物系において培養して、一般には、選別の約3~約25日後;選別の約5~9日後、または選別の約5~7日後に現れるiPSCコロニーを得ることができる。iPSCコロニーを、クローンを拡大するために選び取ることまたは選別することができる。本発明の富化戦略を使用して、細胞集団を多能性細胞について3倍に富化する。
本発明は、細胞集団から望ましくない細胞を枯渇させる方法も提供する。いくつかの実施形態では、細胞集団、例えば、再プログラミングを受けている細胞集団または多能性細胞の集団から分化細胞を枯渇させる。本発明の方法では、多能性細胞の集団または再プログラミングされるように誘導された細胞から、分化細胞の細胞表面マーカーを有する細胞を枯渇させることができる。細胞集団を、分化している細胞の表面マーカー、例えば、CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、またはCD7に基づいて選別することができ、分化している細胞のマーカーを発現している細胞を、細胞集団から除去して、多能性細胞が富化された細胞集団を得ることができる。本発明の特定の実施形態では、分化している細胞の表面マーカーとしてCD13を使用する。
他の実施形態では、分化するように誘導された細胞集団、例えば、所望の系統に分化するように誘導された細胞集団から多能性細胞を枯渇させて、分化している細胞または分化
した細胞の集団を得る。いくつかの実施形態では、分化細胞の集団は、特定の系統に分化するように誘導されたESCまたはiPSCなどの細胞集団を含む。上記の選別技法、例えば、集団内の細胞を磁気ビーズまたはFACsによって、多能性のマーカーに基づいて選別することを用いて、細胞集団から多能性細胞を枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、分化細胞を含む細胞集団を、FACsによって、多能性マーカーを使用して選別し、多能性マーカーを発現している細胞が枯渇した画分を得る。他の実施形態では、細胞集団を、FACsによって、分化のマーカー、例えば、CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、またはCD7のような系統特異的なマーカーに基づいて選別して、多能性のマーカーが枯渇した画分を得る。本発明の特定の実施形態では、分化している細胞の表面マーカーとしてCD13を使用する。
した細胞の集団を得る。いくつかの実施形態では、分化細胞の集団は、特定の系統に分化するように誘導されたESCまたはiPSCなどの細胞集団を含む。上記の選別技法、例えば、集団内の細胞を磁気ビーズまたはFACsによって、多能性のマーカーに基づいて選別することを用いて、細胞集団から多能性細胞を枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、分化細胞を含む細胞集団を、FACsによって、多能性マーカーを使用して選別し、多能性マーカーを発現している細胞が枯渇した画分を得る。他の実施形態では、細胞集団を、FACsによって、分化のマーカー、例えば、CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、またはCD7のような系統特異的なマーカーに基づいて選別して、多能性のマーカーが枯渇した画分を得る。本発明の特定の実施形態では、分化している細胞の表面マーカーとしてCD13を使用する。
本発明の実施では、特に反する指示がなければ、当技術分野の技術の範囲内にある化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA技法、遺伝学、免疫学、細胞生物学、幹細胞プロトコール、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来の方法を用い、その多くは例証するために下に記載されている。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版、2001年);Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、1989年);Maniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982年);Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology(John
Wiley and Sons、2008年7月更新);Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-interscience;Glover、DNA Cloning:A Practical Approach、I巻およびII巻(IRL Press、Oxford、1985年);Anand、Techniques for the Analysis of Complex Genomes、(Academic Press、New York、1992年);GuthrieおよびFink、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press、New York、1991年);Oligonucleotide Synthesis(N. Gait編、1984年);Nucleic Acid Hybridization(B. HamesおよびS. Higgins編、1985年);Transcription and Translation(B. HamesおよびS. Higgins編、1984年);Animal Cell Culture(R. Freshney編、1986年);Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning(1984年);Fireら、RNA Interference Technology:From Basic Science to Drug Development(Cambridge University Press、Cambridge、2005年);Schepers、RNA Interference in Practice(Wiley-VCH、2005年);Engelke、RNA Interference(RNAi):The Nuts & Bolts of siRNA Technology(DNA Press、2003年);Gott、RNA Interference、Editing, and Modification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology;Human Press、Totowa、NJ、2004年);Sohail、Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application(CRC、2004年);ClarkeおよびSansea
u、microRNA:Biology, Function & Expression(Nuts & Bolts series;DNA Press、2006年);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press、1986年);the treatise、Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.、N.Y.);Gene Transfer
Vectors For Mammalian Cells(J. H. MillerおよびM. P. Calos編、1987年、Cold Spring Harbor Laboratory);HarlowおよびLane、Antibodies、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold
Spring Harbor、N.Y.、1998年);Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(MayerおよびWalker編、Academic Press、London、1987年);Handbook Of Experimental Immunology、I~IV巻(D. M. WeirおよびCC Blackwell編、1986年);Riott、Essential Immunology、第6版、(Blackwell Scientific Publications、Oxford、1988年);Embryonic Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kurstad Turksen編、2002年);Embryonic Stem Cell Protocols:I巻:Isolation and Characterization(Methods in Molecular Biology)(Kurstad Turksen編、2006年);Embryonic Stem Cell Protocols:II巻:Differentiation Models(Methods
in Molecular Biology)(Kurstad Turksen編、2006年);Human Embryonic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kursad Turksen編、2006年);Mesenchymal Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Darwin J. Prockop、Donald G. Phinney、およびBruce A. Bunnell編、2008年);Hematopoietic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Medicine)(Christopher A. Klug、およびCraig T. Jordan編、2001年);Hematopoietic
Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kevin D. Bunting編、2008年)Neural Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Leslie P. Weiner編、2008年);Hoganら、Methods of Manipulating
the Mouse Embyro(第2版、1994年);Nagyら、Methods of Manipulating the Mouse Embryo(第3版、2002年)、およびThe zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish(Danio rerio)、第4版、(Univ. of Oregon Press、Eugene、Oreg.、2000年)を参照されたい。
Wiley and Sons、2008年7月更新);Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-interscience;Glover、DNA Cloning:A Practical Approach、I巻およびII巻(IRL Press、Oxford、1985年);Anand、Techniques for the Analysis of Complex Genomes、(Academic Press、New York、1992年);GuthrieおよびFink、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press、New York、1991年);Oligonucleotide Synthesis(N. Gait編、1984年);Nucleic Acid Hybridization(B. HamesおよびS. Higgins編、1985年);Transcription and Translation(B. HamesおよびS. Higgins編、1984年);Animal Cell Culture(R. Freshney編、1986年);Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning(1984年);Fireら、RNA Interference Technology:From Basic Science to Drug Development(Cambridge University Press、Cambridge、2005年);Schepers、RNA Interference in Practice(Wiley-VCH、2005年);Engelke、RNA Interference(RNAi):The Nuts & Bolts of siRNA Technology(DNA Press、2003年);Gott、RNA Interference、Editing, and Modification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology;Human Press、Totowa、NJ、2004年);Sohail、Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application(CRC、2004年);ClarkeおよびSansea
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in Molecular Biology)(Kurstad Turksen編、2006年);Human Embryonic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kursad Turksen編、2006年);Mesenchymal Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Darwin J. Prockop、Donald G. Phinney、およびBruce A. Bunnell編、2008年);Hematopoietic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Medicine)(Christopher A. Klug、およびCraig T. Jordan編、2001年);Hematopoietic
Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kevin D. Bunting編、2008年)Neural Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Leslie P. Weiner編、2008年);Hoganら、Methods of Manipulating
the Mouse Embyro(第2版、1994年);Nagyら、Methods of Manipulating the Mouse Embryo(第3版、2002年)、およびThe zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish(Danio rerio)、第4版、(Univ. of Oregon Press、Eugene、Oreg.、2000年)を参照されたい。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a(1つの)」、「an(1つの)」および「the(その)」は、その内容からそうでないことが明らかでない限り、複数の参照対象を含む。
本明細書全体を通して、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、「含む(compri
se)」、「含む(comprises)」および「含む(comprising)」という単語は、規定されたステップまたは要素またはステップもしくは要素の群を包含するが、任意の他のステップまたは要素またはステップもしくは要素の群を排除しないことを意味すると理解される。「からなる(consisting of)」とは、「からなる(consisting of)」という句に続くいかなるものも包含し、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる(consisting of)」という句は、列挙されている要素が必要または必須であること、および他の要素は存在し得ないことを示す。「から本質的になる(consisting essentially of)」とは、この句の後に列挙されているいかなる要素も包含し、列挙されている要素についての本開示に明記されている活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる(consisting essentially of)」という句は、列挙されている要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択であり、また、それらは、列挙されている要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。
se)」、「含む(comprises)」および「含む(comprising)」という単語は、規定されたステップまたは要素またはステップもしくは要素の群を包含するが、任意の他のステップまたは要素またはステップもしくは要素の群を排除しないことを意味すると理解される。「からなる(consisting of)」とは、「からなる(consisting of)」という句に続くいかなるものも包含し、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる(consisting of)」という句は、列挙されている要素が必要または必須であること、および他の要素は存在し得ないことを示す。「から本質的になる(consisting essentially of)」とは、この句の後に列挙されているいかなる要素も包含し、列挙されている要素についての本開示に明記されている活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる(consisting essentially of)」という句は、列挙されている要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択であり、また、それらは、列挙されている要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。
上記の種々の実施形態を組み合わせてさらなる実施形態をもたらすことができる。本明細書において参照され、かつ/または本出願のデータシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要であれば、なおさらなる実施形態をもたらすために、種々の特許、出願および刊行物の概念を用いるように改変することができる。
上記の詳細な記載に照らして、これらおよび他の変化を実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、全ての可能性のある実施形態を、そのような特許請求の範囲に権利が与えられる等価物全範囲と共に包含するものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されない。
(実施例1)
実験的方法
A.多能性幹細胞の細胞培養
フィーダーフリーに適合させる前に、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を、フィーダー細胞(マイトマイシンCで処理したマウス胚線維芽細胞(MEF)細胞(Millipore))上で維持し、従来の培地で培養した。本出願において使用される場合、「従来の培地」とは、DMEM/F12(Mediatech)、10ng/mLのbFGF(Invitrogen)、20%v/vのノックアウト血清代替物(Invitrogen)、1%v/vの非必須アミノ酸(Mediatech)、2mMのL-グルタミン(Mediatech)および100μMのβ-メルカプトエタノール(Invitrogen)を含有する基本ヒト胚性幹細胞(hESC)培地を指す。従来の培地は、表1の最初の項にも記載されている。hiPSCを5~7日ごとに、先の細いガラスピペットを使用してコロニーを小さな片に機械的に切り、こすり取ることによって継代し(凝集塊継代)、採取し、新しく播種した、マイトマイシンC処理したMEF細胞上に1:3~1:6に希釈継代し、hESC培地を毎日添加した。細胞培養物を、加湿インキュベーターセットにおいて37℃、5%CO2で維持した。フィーダー細胞を伴う従来の培地中で、凝集塊継代を用いて細胞を培養するステップは、本明細書では、「従来の培養」と称される。
実験的方法
A.多能性幹細胞の細胞培養
フィーダーフリーに適合させる前に、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を、フィーダー細胞(マイトマイシンCで処理したマウス胚線維芽細胞(MEF)細胞(Millipore))上で維持し、従来の培地で培養した。本出願において使用される場合、「従来の培地」とは、DMEM/F12(Mediatech)、10ng/mLのbFGF(Invitrogen)、20%v/vのノックアウト血清代替物(Invitrogen)、1%v/vの非必須アミノ酸(Mediatech)、2mMのL-グルタミン(Mediatech)および100μMのβ-メルカプトエタノール(Invitrogen)を含有する基本ヒト胚性幹細胞(hESC)培地を指す。従来の培地は、表1の最初の項にも記載されている。hiPSCを5~7日ごとに、先の細いガラスピペットを使用してコロニーを小さな片に機械的に切り、こすり取ることによって継代し(凝集塊継代)、採取し、新しく播種した、マイトマイシンC処理したMEF細胞上に1:3~1:6に希釈継代し、hESC培地を毎日添加した。細胞培養物を、加湿インキュベーターセットにおいて37℃、5%CO2で維持した。フィーダー細胞を伴う従来の培地中で、凝集塊継代を用いて細胞を培養するステップは、本明細書では、「従来の培養」と称される。
単細胞に解離させるために、hiPSCをリン酸塩緩衝食塩水(PBS)(Media
tech)で1回洗浄し、アキュターゼ(Millipore)またはTrypL(Invitrogen)を用いて37℃で3~5分処理し、その後ピペッティングして単細胞へと破壊した。次いで、上記の通り単細胞懸濁物を従来の培地と等体積で混合し、300gで5分間遠心沈澱させ、SMC4培地またはSMC4+フィブロネクチン培地に再懸濁させた。ほとんどの場合、単細胞に解離させた細胞を、0.4μMのPD0325901、1μMのCHIR99021、5μMのチアゾビビンおよび2μMのSB431542(全てBiovision)を含めた種々の低分子および添加物を補充した従来のhESC培地で構成されるSMC4培地中で維持した。低分子は、DMSO中5~25μMのストック濃度で、-20℃で維持してから培地に添加した。全ての作業培地を4℃で最大4週間維持した。Rock阻害剤に関して、細胞を未分化の状態で維持するためには、Y27632と比較して、チアゾビビンと一緒に培養することが好ましかった。
tech)で1回洗浄し、アキュターゼ(Millipore)またはTrypL(Invitrogen)を用いて37℃で3~5分処理し、その後ピペッティングして単細胞へと破壊した。次いで、上記の通り単細胞懸濁物を従来の培地と等体積で混合し、300gで5分間遠心沈澱させ、SMC4培地またはSMC4+フィブロネクチン培地に再懸濁させた。ほとんどの場合、単細胞に解離させた細胞を、0.4μMのPD0325901、1μMのCHIR99021、5μMのチアゾビビンおよび2μMのSB431542(全てBiovision)を含めた種々の低分子および添加物を補充した従来のhESC培地で構成されるSMC4培地中で維持した。低分子は、DMSO中5~25μMのストック濃度で、-20℃で維持してから培地に添加した。全ての作業培地を4℃で最大4週間維持した。Rock阻害剤に関して、細胞を未分化の状態で維持するためには、Y27632と比較して、チアゾビビンと一緒に培養することが好ましかった。
適切な培地中に再懸濁させた後、細胞を、予めMatrigel(商標)(1:25希釈;BD Biosciences)でコーティングしたフィーダーフリー組織培養プレート(BD Falcon)に移して37℃で1~2時間置いた。この様式では、細胞は常套的に新鮮な培地を1日おきに受け、集密度が66~75%に到達したら継代した。上記66~75%の集密度は通常、継代してから4~5日後に起こった。各継代細胞を単細胞に再解離させ、Matrigel(商標)(BD Biosciences)でコーティングした新しい組織培養プレートに1:5~1:10の希釈継代で移した。定義済みの、成長因子を含まない培養のために、細胞懸濁物を予め1%ゼラチン(Gelatin)(Mediatech)でコーティングした組織培養プレートに加えた。SMC4培地がbFGFを含めた全てのサイトカインおよび成長因子を実質的に含まないこと以外は上記の通りに細胞を維持し、継代した。
凍結させるために、細胞を単細胞に解離させ、10%v/vのDMSO(Mediatech)を補充したSMC4+フィブロネクチン培地に再懸濁させ、クライオバイアル(Nalgene)に入れた。蓋をしたら、クライオバイアルをMr.Frosty(Nalgene)の中に入れ、-80℃で一晩保持した。次の日に、クライオバイアルを長期間保管するために液体窒素に移した。解凍するために、凍結したクライオバイアルを37℃のウォーターバスに、氷の大部分が融解するまでおよそ1~2分入れた。次いで、解凍した細胞溶液を新鮮な従来のhESC培地と穏やかに混合し、300gで5分間遠心沈澱させた。細胞溶液をSMC4+フィブロネクチン培地に再懸濁させ、Matrigel(商標)(BD Biosciences)でコーティングした組織培養プレートに移した。他の細胞培養インキュベーションの全てと同様に、細胞を加湿インキュベーターセット中、37℃、5%CO2で維持した。
B.再プログラミングの誘導
再プログラミングプロセスを開始するために、再プログラミング因子の異所性発現(ヒトOct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、およびNanogの多様な組合せで)をレンチウイルスの形質導入または他の方法、例えば、タンパク質のみの処理を用いて実現した。ほとんどの場合、出発細胞は、10%集密度(すなわち、6ウェルプレートのウェル当たり細胞1×105個)で、ゼラチン(Mediatech)でコーティングした表面上にプレーティングした。ウイルス感染の方法については、新しく採取したレンチウイルスを出発細胞に1:2希釈で加え、4μg/mLのポリブレン(Millipore)を補充し、32℃、650gで1.5時間スピン感染させた。培養物を37℃、5%CO2に移してさらに7時間置いた。インキュベーションが達成されたら、細胞をPBSで3回洗浄し、新鮮な培地を供給した。細胞、例えば、IMR90線維芽細胞をフィーダーフリー培養系において感染させることは難しく、このプロセスを、最初の感染の48時間後にもう1回繰り返した。再プログラミングの誘導の非遺伝学的方法、例えば、細胞に直接タンパク質を適用することの使用について、8μg/mLの再プログラミング因子からなるタンパク質混合物、またはカクテルを細胞溶液に添加し、24時間維持し
てから培地を換えた。このステップをさらに2~4回繰り返した。出発細胞は全て、それら自体のそれぞれの体細胞用培地で、最初にタンパク質を添加した後4日目まで培養し、その時点で培地を、一部は体細胞用培地に、そして一部は従来のhESC培地に切り換えた。集密になったら(通常4~6日)、細胞をトリプシン処理し、等量の培地と混合し、300gで5分間遠心沈澱させ、1:1の体細胞/従来のhESC培地に再懸濁させ、より大きな培養プレートへと1:4~1:6で拡大した。例えば、6ウェルプレートの2つのウェル中の細胞を通常10cmディッシュ上に拡大する。拡大した次の日に、培地を従来のhESC培地に完全に切り換える。拡大した細胞が集密に達したら(通常8~12日)、細胞を、富化(独特の集団富化を参照されたい)するために処理する。全ての場合において、培地を常套的に1日おきに交換した。
B.再プログラミングの誘導
再プログラミングプロセスを開始するために、再プログラミング因子の異所性発現(ヒトOct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、およびNanogの多様な組合せで)をレンチウイルスの形質導入または他の方法、例えば、タンパク質のみの処理を用いて実現した。ほとんどの場合、出発細胞は、10%集密度(すなわち、6ウェルプレートのウェル当たり細胞1×105個)で、ゼラチン(Mediatech)でコーティングした表面上にプレーティングした。ウイルス感染の方法については、新しく採取したレンチウイルスを出発細胞に1:2希釈で加え、4μg/mLのポリブレン(Millipore)を補充し、32℃、650gで1.5時間スピン感染させた。培養物を37℃、5%CO2に移してさらに7時間置いた。インキュベーションが達成されたら、細胞をPBSで3回洗浄し、新鮮な培地を供給した。細胞、例えば、IMR90線維芽細胞をフィーダーフリー培養系において感染させることは難しく、このプロセスを、最初の感染の48時間後にもう1回繰り返した。再プログラミングの誘導の非遺伝学的方法、例えば、細胞に直接タンパク質を適用することの使用について、8μg/mLの再プログラミング因子からなるタンパク質混合物、またはカクテルを細胞溶液に添加し、24時間維持し
てから培地を換えた。このステップをさらに2~4回繰り返した。出発細胞は全て、それら自体のそれぞれの体細胞用培地で、最初にタンパク質を添加した後4日目まで培養し、その時点で培地を、一部は体細胞用培地に、そして一部は従来のhESC培地に切り換えた。集密になったら(通常4~6日)、細胞をトリプシン処理し、等量の培地と混合し、300gで5分間遠心沈澱させ、1:1の体細胞/従来のhESC培地に再懸濁させ、より大きな培養プレートへと1:4~1:6で拡大した。例えば、6ウェルプレートの2つのウェル中の細胞を通常10cmディッシュ上に拡大する。拡大した次の日に、培地を従来のhESC培地に完全に切り換える。拡大した細胞が集密に達したら(通常8~12日)、細胞を、富化(独特の集団富化を参照されたい)するために処理する。全ての場合において、培地を常套的に1日おきに交換した。
C.独特の集団富化
出発細胞を、Oct4および/またはKlf4および/またはSox2および/またはMycを含有する個々のレンチウイルス構築物またはポリシストロニックベクターを含めた種々の戦略を用いて再プログラミングされるように誘導し、およそ8~12日間(上記を参照されたい)培養した後、細胞を単細胞に解離させ(多能性幹細胞の細胞培養を参照されたい)、種々の多能性の表面マーカー、体細胞のマーカーおよび/または不完全な再プログラミングのマーカーで染色した。簡単に述べると、解離細胞を、ハンクス平衡塩類溶液(Invitrogen)、4%ウシ胎仔血清(Invitrogen)および10mMのHepes(Invitrogen)を含有する染色溶液に再懸濁させ、氷上で保持した。製造者推奨の希釈に従って、結合体化させた一次抗体を細胞溶液に添加し、溶液を氷上で15分間インキュベートした。細胞溶液を洗浄し、染色緩衝液に再懸濁させ、氷上で維持した。この時点で、蛍光活性化細胞選別(Fluorescent Activated Cell Sorting)(BD Biosciences、以下を参照されたい)および磁気細胞選別(Magnetic Cell Sorting)(Miltenyi Biotec、以下を参照されたい)を含めた種々の富化/枯渇戦略をとった。
出発細胞を、Oct4および/またはKlf4および/またはSox2および/またはMycを含有する個々のレンチウイルス構築物またはポリシストロニックベクターを含めた種々の戦略を用いて再プログラミングされるように誘導し、およそ8~12日間(上記を参照されたい)培養した後、細胞を単細胞に解離させ(多能性幹細胞の細胞培養を参照されたい)、種々の多能性の表面マーカー、体細胞のマーカーおよび/または不完全な再プログラミングのマーカーで染色した。簡単に述べると、解離細胞を、ハンクス平衡塩類溶液(Invitrogen)、4%ウシ胎仔血清(Invitrogen)および10mMのHepes(Invitrogen)を含有する染色溶液に再懸濁させ、氷上で保持した。製造者推奨の希釈に従って、結合体化させた一次抗体を細胞溶液に添加し、溶液を氷上で15分間インキュベートした。細胞溶液を洗浄し、染色緩衝液に再懸濁させ、氷上で維持した。この時点で、蛍光活性化細胞選別(Fluorescent Activated Cell Sorting)(BD Biosciences、以下を参照されたい)および磁気細胞選別(Magnetic Cell Sorting)(Miltenyi Biotec、以下を参照されたい)を含めた種々の富化/枯渇戦略をとった。
フローサイトメトリー選別をFACS Aria(BD、Biosciences)で実施した。使用した一次抗体は、明記されている通りSSEA4(BD Biosciences)、Tra-181(Biosciences)、Tra-161(BD Biosciences)、CD30(BD Biosciences)、およびCD50(BD Biosciences)を含んだ。次いで、選別された細胞を遠心沈澱させ、SMC4+フィブロネクチン培地に再懸濁させ、Matrigel(商標)でコーティングした組織培養プレートに移した。マイクロウェル、すなわち、96ウェルプレートに選別して入れた場合、プレートを300gで2分間遠心沈澱した。SMC4+フィブロネクチン培地を3~4日間、1日おきに交換した。3~4日後、一般には、培養の残りの時間はSMC4+フィブロネクチン培地をSMC4培地と交換した。コロニー形成は、一般には、選別の7~9日後に認められた。フローサイトメトリー分析をGuava EasyCyte 8HT(Millipore)で実施した。
MACSミクロビーズ(Miltenyi Biotec)分離をプロトコールに従って実施した。簡単に述べると、細胞を単細胞へと解離させ(多能性幹細胞の細胞培養を参照されたい)、明記されている通りSSEA4(BD Biosciences)、Tra-1-81(BD Biosciences)、Tra-160(BD Biosciences)、CD30(BD Biosciences)、およびCD50(BD Biosciences)を含めた、適切なFITCと結合体化した一次抗体を用いて染色した。次いで、細胞を抗-FITCミクロビーズ(Anti-FITC Microbeads)(Miltenyi Biotec)で磁気的に標識した。次いで、標識した細胞懸濁物をLS MACS Column(Miltenyi Biotec)にローデ
ィングした。陽性選択された画分または陰性選択された画分のいずれかから採取した細胞を、300gで5分間遠心沈澱し、SMC4+フィブロネクチン培地に再懸濁させ、Matrigel(商標)(BD Biosciences)でコーティングした組織培養プレートに移した。翌日、新鮮な培地を培養物に加え、その後、1日おきに交換した。3~4日後、一般には、培養の残りの時間はSMC4+フィブロネクチン培地をSMC4培地と交換した。一般には選別の5~7日後にコロニーが現れた。
ィングした。陽性選択された画分または陰性選択された画分のいずれかから採取した細胞を、300gで5分間遠心沈澱し、SMC4+フィブロネクチン培地に再懸濁させ、Matrigel(商標)(BD Biosciences)でコーティングした組織培養プレートに移した。翌日、新鮮な培地を培養物に加え、その後、1日おきに交換した。3~4日後、一般には、培養の残りの時間はSMC4+フィブロネクチン培地をSMC4培地と交換した。一般には選別の5~7日後にコロニーが現れた。
D.アルカリホスファターゼ染色
細胞を4%v/vのパラホルムアルデヒド(Alfa Aesar)中に30秒間固定し、PBSで3回洗浄し、アルカリホスファターゼ染色キット(Alkaline Phosphatase Staining Kit)(Sigma-Aldrich)で染色した。簡単に述べると、亜硝酸ナトリウム溶液(Sodium Nitrite Solution)1mLをFRV-アルカリ性溶液(FRV-Alkaline Solution)1mLに加え、混合し、25℃で2分間インキュベートした。次いで、この溶液を45mLのH2Oと混合し、その後、ナフトールAS-BIアルカリ性溶液(Naphthol AS-BI Alkaline Solution)1mLを加えた。アルカリ性色素混合物を固定した細胞に加え、25℃で15分間インキュベートした後、PBS洗浄した。次いで、細胞をアルカリホスファターゼの存在についてスコア化した。
細胞を4%v/vのパラホルムアルデヒド(Alfa Aesar)中に30秒間固定し、PBSで3回洗浄し、アルカリホスファターゼ染色キット(Alkaline Phosphatase Staining Kit)(Sigma-Aldrich)で染色した。簡単に述べると、亜硝酸ナトリウム溶液(Sodium Nitrite Solution)1mLをFRV-アルカリ性溶液(FRV-Alkaline Solution)1mLに加え、混合し、25℃で2分間インキュベートした。次いで、この溶液を45mLのH2Oと混合し、その後、ナフトールAS-BIアルカリ性溶液(Naphthol AS-BI Alkaline Solution)1mLを加えた。アルカリ性色素混合物を固定した細胞に加え、25℃で15分間インキュベートした後、PBS洗浄した。次いで、細胞をアルカリホスファターゼの存在についてスコア化した。
E.免疫蛍光検査による染色
細胞を、4%v/vのパラホルムアルデヒド(Alfa Aesar)を使用して15分間固定し、0.2%v/vのTween(PBST)(Fisher Scientific)を含有するPBSで3回洗浄し、PBS中0.15%v/vのトリトンX-100(TritonX-100)(Sigma-Aldrich)を用いて25℃で1時間透過性を上げた。透過性を上げた後、細胞を、PBST(Fisher Scientific)中1%v/vのBSA(Invitrogen)(PBSTB)を用いて25℃で30分間ブロッキングした。PBSTBを穏やかに除去した後、細胞を、PBSTB中の一次抗体と一緒に4℃で一晩インキュベートした。この試験において使用した一次抗体は、Nanog(Abcam)、Tra-1-60(BD Biosciences)、Tra-181(BD Biosciences)、SSEA4(BD Biosciences)、β-III チューブリン(β-III Tubulin)(R&D Systems)、α-平滑筋アクチン(α-Smooth Muscle Actin)(Sigma)およびSox17(R&D Systems)を含んだ。一晩インキュベートした後、細胞をPBSTで3回洗浄し、PBSTB中に1:200希釈した二次抗体(Alexa 488または555;Invitrogen)を用いて25℃で1時間染色した。細胞をPBST中で3回洗浄し、Hoechst色素(Invitrogen)で染色した。染色された細胞の画像を蛍光顕微鏡検査およびCCDカメラを使用して捕捉した。
細胞を、4%v/vのパラホルムアルデヒド(Alfa Aesar)を使用して15分間固定し、0.2%v/vのTween(PBST)(Fisher Scientific)を含有するPBSで3回洗浄し、PBS中0.15%v/vのトリトンX-100(TritonX-100)(Sigma-Aldrich)を用いて25℃で1時間透過性を上げた。透過性を上げた後、細胞を、PBST(Fisher Scientific)中1%v/vのBSA(Invitrogen)(PBSTB)を用いて25℃で30分間ブロッキングした。PBSTBを穏やかに除去した後、細胞を、PBSTB中の一次抗体と一緒に4℃で一晩インキュベートした。この試験において使用した一次抗体は、Nanog(Abcam)、Tra-1-60(BD Biosciences)、Tra-181(BD Biosciences)、SSEA4(BD Biosciences)、β-III チューブリン(β-III Tubulin)(R&D Systems)、α-平滑筋アクチン(α-Smooth Muscle Actin)(Sigma)およびSox17(R&D Systems)を含んだ。一晩インキュベートした後、細胞をPBSTで3回洗浄し、PBSTB中に1:200希釈した二次抗体(Alexa 488または555;Invitrogen)を用いて25℃で1時間染色した。細胞をPBST中で3回洗浄し、Hoechst色素(Invitrogen)で染色した。染色された細胞の画像を蛍光顕微鏡検査およびCCDカメラを使用して捕捉した。
F.分化の誘導および奇形腫の形成
フィーダーフリーiPSCを、単層として、および胚様体としての両方で分化させた。単層分化については、細胞は通常、分化の際にそれらの増殖を減少させるので、iPSCを集密近くまで到達させた後に分化培地に切り換えた。簡単に述べると、集密になったら、SMC4培地を、DMEM/F12(Mediatech)、20% ウシ胎仔血清(Invitrogen)、1% 非必須アミノ酸(Mediatech)、2mMのL-グルタミン(Mediatech)および100μMのβ-メルカプトエタノールを含有する分化培地に切り換えた。培地を切り換えたら、iPSCを14日間分化させた。培地を2~3日ごとに替えた。胚葉体(「EB」)の形成および分化については、hiPSCを、アキュターゼ(Millipore)を用いて単細胞に解離し、分化培地に再懸濁させて、最終濃度を1mL当たり細胞75,000個にし、5uMのチアゾビビン(Thi
azovivan)を加えた。細胞を、V底96ウェルの非組織培養プレート(Nunc)にウェル当たり100μLで播種し、950gで5分間遠心分離した。翌日、密集した「球様凝集塊」を超低結合6ウェルプレート(Corning)にP1000を用いておよそウェル当たりEB30~40個で移した。7日後に、移したEBをMatrigelでコーティングした6ウェルプレートに1:1で移した。3週間培養した後、細胞を固定し、染色した。
フィーダーフリーiPSCを、単層として、および胚様体としての両方で分化させた。単層分化については、細胞は通常、分化の際にそれらの増殖を減少させるので、iPSCを集密近くまで到達させた後に分化培地に切り換えた。簡単に述べると、集密になったら、SMC4培地を、DMEM/F12(Mediatech)、20% ウシ胎仔血清(Invitrogen)、1% 非必須アミノ酸(Mediatech)、2mMのL-グルタミン(Mediatech)および100μMのβ-メルカプトエタノールを含有する分化培地に切り換えた。培地を切り換えたら、iPSCを14日間分化させた。培地を2~3日ごとに替えた。胚葉体(「EB」)の形成および分化については、hiPSCを、アキュターゼ(Millipore)を用いて単細胞に解離し、分化培地に再懸濁させて、最終濃度を1mL当たり細胞75,000個にし、5uMのチアゾビビン(Thi
azovivan)を加えた。細胞を、V底96ウェルの非組織培養プレート(Nunc)にウェル当たり100μLで播種し、950gで5分間遠心分離した。翌日、密集した「球様凝集塊」を超低結合6ウェルプレート(Corning)にP1000を用いておよそウェル当たりEB30~40個で移した。7日後に、移したEBをMatrigelでコーティングした6ウェルプレートに1:1で移した。3週間培養した後、細胞を固定し、染色した。
奇形腫移植および分析を、Applied Stem Cells(Menlo Park、CA)によって行った。簡単に述べると、単細胞に解離させた100~200万個のhiPSCを、SMC4培地100μL(uL)を補充した培地およびMatrigel100uL中に混合し、Beige SCIDマウスの腎被膜および睾丸に導入した。発生した奇形腫を回収し、切片作製し、種々の分化細胞型および構造について分析した。
G.RT-qPCRおよびqPCR分析
RNAを、PicoPure RNA Isolationキット(MDS Analytical Technologies)を使用して単離し、0.5μgのRNAを用いて、iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)を使用して第一鎖cDNAを生成した。相対的な遺伝子発現レベルを、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)および下で表3に列挙されているFAMで標識したTaqManプローブを使用して決定した。
RNAを、PicoPure RNA Isolationキット(MDS Analytical Technologies)を使用して単離し、0.5μgのRNAを用いて、iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)を使用して第一鎖cDNAを生成した。相対的な遺伝子発現レベルを、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)および下で表3に列挙されているFAMで標識したTaqManプローブを使用して決定した。
表3:ABIプライマーおよびプローブ
全RNAを、Pico Pure RNA Isolation Kit(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を使用して細胞から単離した。簡単に述べると、ビオチン化したaRNAを、MessageAmp II aRNA Amplification Kit(Applied Biosystems/Ambion、Austin、TX)用の標準のプロトコールを使用して、任意選択のSecond Round Amplificationを利用して調製し、次いで、Messa
geAmp II Biotin Enhanced Kit(Applied Biosystems/Ambion、Austin、TX)を使用し、標準のプロトコールを用いてビオチン標識したaRNAへと転写した。ビオチン標識したaRNAをAffymetrixの推奨に従って精製し、断片化した。20μgの断片化したaRNAを使用して、Human Genome U133 Plus2.0チップ(Affymetrix Inc. Santa Clara、CA)と、45℃で16時間にわたってハイブリダイズさせた。アレイを洗浄し、Affymetrix Fluidics Station 450で染色し、Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7Gを使用してスキャンした。画像データを、Affymetrix Expression Consoleソフトウェアを使用し、初期状態の解析設定を用いて解析した。アレイを、対数尺度ロバストマルチアレイ解析(log scale robust multi-array analysis)(RMA)によって正規化し、Spotfire for Genomics 3.1(Tibco Spotfire、Palo Alto、CA)で可視化した。
I.核型分析およびコピー数変動分析
20のG-バンド染色した中期細胞に対する細胞遺伝学的分析を、Madison、WIに所在するCell Line Geneticsが実施した。
20のG-バンド染色した中期細胞に対する細胞遺伝学的分析を、Madison、WIに所在するCell Line Geneticsが実施した。
高分解能比較ゲノムハイブリダイゼーション(NimbleGen12x135k)およびその後のコピー数変動分析をWiCell(Madison、WI)によって行った。
(実施例2)
フィーダーフリー培養環境および酵素による単細胞への解離および多能性幹細胞の継代を可能にするための細胞培養条件および方法
本実施例は、多能性細胞集団の培養および解離に関する。そのような細胞集団としては、これらに限定されないが、胚性幹細胞(ESC)および人工多能性細胞、例えば、体細胞核移植(SCNT)によって、または多能性因子を導入することによって生成されるもの-人工多能性幹細胞(iPSC)が挙げられる。多能性幹細胞の培養条件には、伝統的に、放射線照射またはマイトマイシンC処理によって有糸分裂が不活性にされているが、幹細胞の培養を支持するために必要な成長因子および栄養分を提供するフィーダー細胞の使用が含まれていた。フィーダー細胞を使用せずに幹細胞集団を培養するステップは、幹細胞の均一な集団が必要である研究および工業的な適用にとって、または拡大した工業的活動が幹細胞生成物のための異種を含まない定義済みの培養条件を必要とする、研究および工業的な適用にとって有利になる。本実施例では、特定の細胞シグナル伝達経路のいくつかの低分子修飾因子を試験して、個々の低分子または低分子の組合せ(「カクテル」)をフィーダーフリー系における多能性細胞の培養を増強するために使用することができるかどうかを確立した。
フィーダーフリー培養環境および酵素による単細胞への解離および多能性幹細胞の継代を可能にするための細胞培養条件および方法
本実施例は、多能性細胞集団の培養および解離に関する。そのような細胞集団としては、これらに限定されないが、胚性幹細胞(ESC)および人工多能性細胞、例えば、体細胞核移植(SCNT)によって、または多能性因子を導入することによって生成されるもの-人工多能性幹細胞(iPSC)が挙げられる。多能性幹細胞の培養条件には、伝統的に、放射線照射またはマイトマイシンC処理によって有糸分裂が不活性にされているが、幹細胞の培養を支持するために必要な成長因子および栄養分を提供するフィーダー細胞の使用が含まれていた。フィーダー細胞を使用せずに幹細胞集団を培養するステップは、幹細胞の均一な集団が必要である研究および工業的な適用にとって、または拡大した工業的活動が幹細胞生成物のための異種を含まない定義済みの培養条件を必要とする、研究および工業的な適用にとって有利になる。本実施例では、特定の細胞シグナル伝達経路のいくつかの低分子修飾因子を試験して、個々の低分子または低分子の組合せ(「カクテル」)をフィーダーフリー系における多能性細胞の培養を増強するために使用することができるかどうかを確立した。
多能性細胞集団を、フィーダーは使用しないが、その代わりに、より明確な細胞外マトリックス、例えば、Matrigel(商標)を従来のhESC細胞培養培地(例えば、表1の最初の項に記載の従来の/基本培地処方物)において使用して培養したところ、細胞の生存能力および多能性は支持されなかった(図1)。しかし、Rockキナーゼの低分子阻害剤を使用することにより、これらの条件下で細胞の生存能力が改善された。さらに、MAPキナーゼ、TGFβおよびWnt/β-カテニン経路の低分子阻害剤を使用することにより、フィーダーの不在下で細胞の多能性が維持されたが、細胞の生存能力の変化を認めることができた。Rockキナーゼ阻害剤と、MEK阻害剤、TGFβ阻害剤およびGSK3阻害剤の組合せにより、フィーダーフリー環境において培養したときに多能性幹細胞の生存能力と多能性の両方が維持された。
多能性細胞、例えば、ESCまたはiPSCは、一般には、凝集塊として成長する。伝統的に、これらの細胞は、当技術分野の研究者によって認識される形態を有するコロニーを手動で選び取ることによって拡大し、継代されてきた。そのような手順は、本文書の実施例1に記載されている(凝集塊継代として記載されている)。次いで、選び取ったコロニーを機械的に壊し、解離細胞を再プレーティングする。多能性細胞集団の急速な拡大には、酵素による単細胞の継代の使用が有効となる。トリプシンおよびアキュターゼなどの酵素が、継代の間に細胞を単細胞に解離させるために一般に使用される。
特定の実証では、iPSC細胞は、フィーダーフリー環境において単細胞として酵素により継代し、播種したときに、図3Bにおける7AADの組込みにより認めることができるように、生存能力の有意な降下を示した。表1に列挙されているものなどの培地組成物を含む本発明の培養プラットフォームを使用することによって多能性細胞集団をフィーダーフリー培養で培養し、単細胞継代のために酵素により解離させ、細胞の生存能力および多能性の維持がはるかに改善された。より詳細には、従来の/基本hESC培地処方物とMAPキナーゼ経路、TGFβ経路、Wnt/β-カテニン経路およびRho/Rock経路などの細胞シグナル伝達経路の修飾因子の組合せを使用することによって、単細胞への解離およびフィーダーフリー培養を必要とする適用の間、多能性幹細胞の生存能力および多能性が維持された。
図2に示されている通り、フィーダー細胞培養において、凝集塊継代を用いて生成したiPSCを、アキュターゼなどの酵素を用いて単細胞に解離し、フィーダーフリー系において、例えば、Matrigel(商標)上に、表1に記載のSMC4培地組成物またはSMC4+フィブロネクチン培地組成物を使用して単細胞としてプレーティングした。細胞の生存能力は、解離細胞を、これらの培地に記載の低分子の組合せを含有する培地に置いた場合にのみ維持された。従来の培地を使用することにより、多能性細胞を酵素により単細胞に解離し、フィーダーフリー環境にプレーティングしたときに大量の細胞が損失した。細胞をフィーダーフリー培養および単細胞継代に適合させたら、それらを、SMC4培地を用いてこのように連続的に維持した。フィーダーフリーの、単細胞継代条件に適合させたhiPSC細胞の完全な特徴付けが図3に示されている。これらの細胞の多能性状態は、複数回の継代の後に維持された:多能性マーカーを、免疫蛍光検査および遺伝子発現によって同定した。さらに、細胞の約99.8%がフローサイトメトリーによって測定されるSSEA4およびTra1-81陽性染色を維持した。これらの細胞の遺伝子発現プロファイルは、フィーダー上で培養したヒトESCと同様であった。hiPSCの導入遺伝子サイレンシングが維持され、核型は通常であり、かつフィーダー細胞培養で成長させた同じクローンと同一であった。さらに、このように継代し維持したhiPSCは、in vitroにおける分化と奇形腫の形成の両方によって実証された通り、3種の胚葉に分化した(図3Iおよび3J)。
(実施例3)
多能性および細胞の生存能力を維持しながら多能性細胞からの単細胞選別を可能にするための方法および培養条件
実施例2に記載の通り、ESCまたはiPSCの幹細胞培養物は、常套的にフィーダー細胞上で培養し、細胞コロニーを手動で選択することによって継代し、その後それを機械的に解離させた後に再プレーティングする。熟練した研究者は、多能性、非分化特性を有する幹細胞コロニーを、コロニー形態に基づいて認識し、これを、多能性細胞を選択する方法として用いることができる。したがって、多能性集団または所望の特性を有する集団を、一部の細胞があまり望ましくない特性を有する、例えば、培養物または死細胞の凝集塊中の分化の徴候を示す細胞の細胞集団から選び取り、手動で富化することができる。このプロセスは、労力を要し、所望の細胞集団を選び取ることは熟練した研究者に依存する
。したがって、細胞を所望の特性に基づいて個別に選択する場合に細胞富化または選別技術を用いることは、この分野に大きな利益を与えることになる。現在利用可能な技法、例えば、磁気活性化細胞選別(MACS)または蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いたそのような富化ステップには、多能性細胞集団を単細胞様式へと酵素により継代した後に、富化し、また培養物に播種することが必要になる。さらに、フィーダーにより支持した培養物を使用することは、これらの技法にはあまり望ましくないことになり、フィーダーフリー培養系を用いることが必要である。
多能性および細胞の生存能力を維持しながら多能性細胞からの単細胞選別を可能にするための方法および培養条件
実施例2に記載の通り、ESCまたはiPSCの幹細胞培養物は、常套的にフィーダー細胞上で培養し、細胞コロニーを手動で選択することによって継代し、その後それを機械的に解離させた後に再プレーティングする。熟練した研究者は、多能性、非分化特性を有する幹細胞コロニーを、コロニー形態に基づいて認識し、これを、多能性細胞を選択する方法として用いることができる。したがって、多能性集団または所望の特性を有する集団を、一部の細胞があまり望ましくない特性を有する、例えば、培養物または死細胞の凝集塊中の分化の徴候を示す細胞の細胞集団から選び取り、手動で富化することができる。このプロセスは、労力を要し、所望の細胞集団を選び取ることは熟練した研究者に依存する
。したがって、細胞を所望の特性に基づいて個別に選択する場合に細胞富化または選別技術を用いることは、この分野に大きな利益を与えることになる。現在利用可能な技法、例えば、磁気活性化細胞選別(MACS)または蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いたそのような富化ステップには、多能性細胞集団を単細胞様式へと酵素により継代した後に、富化し、また培養物に播種することが必要になる。さらに、フィーダーにより支持した培養物を使用することは、これらの技法にはあまり望ましくないことになり、フィーダーフリー培養系を用いることが必要である。
特定の実施形態では、表1に記載の本発明の培地組成物ならびに実施例1および2に記載の方法を用いて、多能性または細胞の生存能力を喪失することなく、多能性細胞集団を単細胞に解離させ、磁気活性化細胞選別(Magnetic Activated Cell Sorting)(MACS)または蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて富化し、フィーダーフリー培養物上に播種した。
特定の例では、図4に示されている通り、SMC4培地(表1)で維持した、単細胞に解離させた多能性細胞の集団を選択し、FACSにより、細胞表面マーカーに対して陽性の細胞SSEA4+/Tra181+に基づいて選別した。これらの表面抗原は、多能性に対するマーカーとして一般に使用されている。次いで、選別された二重の陽性集団をフィーダーフリー培養(Matrigel(商標)ECMコーティング)に移し、SMC4培地(表1)またはSMC4+フィブロネクチン培地のいずれかで2~4日間成長させた後、SMC4培地(表1)に再度切り換えた。選別してから24時間以内に細胞分裂が認められ、細胞は選別の5日後までにほぼ集密になった。選別された細胞を、さらに5回の継代にわたって単細胞培養し、SSEA4+/Tra181+細胞についての二重染色フローサイトメトリーによって判断したところ、未分化状態のマーカーを発現するだけでなく、実質的に純粋な多能性細胞の集団も示したことが示された(図4Bおよび4C)。
培養している間に多能性幹細胞を富化し、選別する例では、多能性細胞と分化細胞の両方を含有する培養物を、Tra181に対して陽性の細胞について富化し、次いで、Tra181+細胞の継代を継続して、純粋な多能性幹細胞の集団を維持した(図17C)。
多能性細胞の単細胞選別の効率を調査した。図4DおよびEにおいて認めることができるように、FACS機器によって測定された種々の数の選別後事象を、SMC4培地またはSMC4+フィブロネクチン培地のいずれかを用いてフィーダーフリー培養系にプレーティングし、アルカリホスファターゼ陽性細胞の数をスコア化した。アルカリホスファターゼは、多能性のコロニー形成の初期の指標である。播種した細胞の数当たりのアルカリ陽性コロニーの数によって示される、定量化した選別後播種効率はこの系ではおよそ8~10%であることが分かった(図4E)。多能性細胞集団の維持における単細胞選別の潜在性のさらなる実証では、iPSC培養物を単細胞に解離させ、蛍光を結合体化した、多能性マーカーであるSSEA4およびTra181に特異的な抗体で標識し、FACSに適用し、これらのマーカーに基づいて選択した。選択されたSSEA4+/Tra181+細胞を、FACS機器から直接96ウェルプレートに、ウェル当たり1~9事象でプレーティングした。ウェル当たりわずか1事象により、クローンアルカリホスファターゼ陽性コロニーが生じた(図4Fおよび4G)。したがって、そのような単細胞選別系を、特定の細胞表面マーカーに関連する好ましい特性に基づいて多能性細胞のクローン選択を行うために用いた。
(実施例4)
フィーダーフリー培養系において細胞を多能性の状態に効率的に再プログラミングさせる方法および条件
工業的適用および/または臨床的適用のためのiPSCの使用には、完全に定義済みの
培養条件、詳細には、異種を含まない条件において細胞を生成し、選択し、維持することが必要である。したがって、フィーダーフリー培養条件において細胞を再プログラミングさせることが非常に望ましい。しかし、線維芽細胞およびケラチノサイトは皮膚生検材料または毛包を介して入手するので、これらが再プログラミングに最も一般的に使用される細胞型であるが、これらの細胞型の再プログラミングの効率は非常に低く、これらの細胞をフィーダーフリー培養において再プログラミングさせるための効率的な方法はまだ実証されていない。
フィーダーフリー培養系において細胞を多能性の状態に効率的に再プログラミングさせる方法および条件
工業的適用および/または臨床的適用のためのiPSCの使用には、完全に定義済みの
培養条件、詳細には、異種を含まない条件において細胞を生成し、選択し、維持することが必要である。したがって、フィーダーフリー培養条件において細胞を再プログラミングさせることが非常に望ましい。しかし、線維芽細胞およびケラチノサイトは皮膚生検材料または毛包を介して入手するので、これらが再プログラミングに最も一般的に使用される細胞型であるが、これらの細胞型の再プログラミングの効率は非常に低く、これらの細胞をフィーダーフリー培養において再プログラミングさせるための効率的な方法はまだ実証されていない。
実施例2に記載の通り、細胞シグナル伝達経路-詳細には、MAPキナーゼ経路、TGFβ経路、Wnt/β-カテニン経路およびRho/Rock経路の阻害剤が存在する従来のhESC幹細胞用培地を使用することにより、フィーダー細胞の不在下で多能性培養物を成長させ、維持すること、およびこれらの培養物を、酵素による単細胞継代を用いて拡大することが可能になった。本実施例では、フィーダー細胞を欠く培養系においてiPSC細胞を生成した。詳細には、ヒト線維芽細胞を、多能性因子であるOct4、KLF4、Sox2およびC-mycを発現しているウイルスに感染させた。再プログラミングプロトコールを、フィーダー細胞ではなくMatrigel(商標)にプレーティングした細胞を用いて実施例1に記載の通り行った。
従来のhESC幹細胞用培地またはSMC4培地(表1)に列挙されている特定の経路修飾因子を補充した従来のhESC培地のいずれかを用いて、フィーダーフリー細胞の再プログラミングの比較を行った。図5に認めることができるように、Oct4、Klf4、Sox2およびMycを発現している個々のレンチウイルスを用いて再プログラミングを誘導した20日後に、SMC4培地を補充したフィーダーフリー培養物では多くのiPSC様コロニーが認められたが、従来のhESC培地単独で維持した培養物に認められたコロニーはわずかであった、または全く認められなかった。SMC4培地中で生成したコロニーのその後の特徴付けにより、それらの多くが真のiPSCコロニーであることが示された。これらの細胞は、免疫蛍光検査、フローサイトメトリーおよび遺伝子発現プロファイリングを用いた、多能性マーカーであるOct4、Nanog、Sox2、KLF4、SSEA4およびTRA 1-81の発現により、多能性であることが決定された(図13C~E)。さらに、細胞は、分化培地で培養したときに、3種の胚葉全てに有効に分化することが示された。したがって、フィーダーフリー培養系におけるiPSCの効率的な生成が本発明によって実証された。他の再プログラミングの方法と比較したこの手法の効率は、実施例8および表4に記載されている。
(実施例5)
ナイーブな状態の多能性細胞の生成および維持において使用する細胞培養組成物
最近の研究により、後成的な再プログラミングを通じて、最終分化細胞は、前駆体様の状態(Xie, H.、Ye, M.、Feng, R.、およびGraf, T. 2004年)、異なる分化した細胞の状態(Szabo、Bhatia 2010年)または、元の胚様の状態(Takahashiら、2006年)例えば、iPSCにまで戻って再度コース設定する(recourse)能力を有することが実証された。iPSCの生成はより常套的になってきたが、所与の実験において、非常に低い百分率の体細胞のみがiPSCに再プログラミングされる。この低効率には、体細胞の増殖性の状態、遺伝子の活性化または抑制を導くさらなる変異誘発、遺伝子送達の様式および環境要因を含めたいくつかのパラメータが起因する。iPSCとして同定された全ての細胞がESCに類似した挙動をするとは限らないことも報告されている。例えば、遺伝子発現プロファイリングにより、多くのiPSCが、それらのESC対応物に対して発現プロファイルの有意差を示すことが実証された。さらに、Xist活性の試験およびX染色体の再活性化の分析により、一部のESCはナイーブな状態(すなわち、多能性の基底状態)にあるが、得られたiPSCの全てではないが大部分はプライムされた状態(すなわち、分化するように
プライムされた)にあることが示されている。まとめると、これらの差異が、多能性の低下およびiPSCの特定の細胞型への分化の効率が低いことの一因である可能性があり、これにより再生医療におけるiPSCの価値が下がっている。
ナイーブな状態の多能性細胞の生成および維持において使用する細胞培養組成物
最近の研究により、後成的な再プログラミングを通じて、最終分化細胞は、前駆体様の状態(Xie, H.、Ye, M.、Feng, R.、およびGraf, T. 2004年)、異なる分化した細胞の状態(Szabo、Bhatia 2010年)または、元の胚様の状態(Takahashiら、2006年)例えば、iPSCにまで戻って再度コース設定する(recourse)能力を有することが実証された。iPSCの生成はより常套的になってきたが、所与の実験において、非常に低い百分率の体細胞のみがiPSCに再プログラミングされる。この低効率には、体細胞の増殖性の状態、遺伝子の活性化または抑制を導くさらなる変異誘発、遺伝子送達の様式および環境要因を含めたいくつかのパラメータが起因する。iPSCとして同定された全ての細胞がESCに類似した挙動をするとは限らないことも報告されている。例えば、遺伝子発現プロファイリングにより、多くのiPSCが、それらのESC対応物に対して発現プロファイルの有意差を示すことが実証された。さらに、Xist活性の試験およびX染色体の再活性化の分析により、一部のESCはナイーブな状態(すなわち、多能性の基底状態)にあるが、得られたiPSCの全てではないが大部分はプライムされた状態(すなわち、分化するように
プライムされた)にあることが示されている。まとめると、これらの差異が、多能性の低下およびiPSCの特定の細胞型への分化の効率が低いことの一因である可能性があり、これにより再生医療におけるiPSCの価値が下がっている。
ナイーブな状態およびプライムされた状態の背後にある機構に関与する重要な細胞経路を標的にすることにより、本発明者らは、従来のiPSCを含めたプライムされた状態で存在する多能性幹細胞を、ナイーブな状態に形質転換する能力を実証した。表1に列挙されている培地組成物を使用して、そのようなプライムされた多能性細胞および従来のiPSCをナイーブな状態にさらに再プログラミングさせることが可能であった。より詳細には、体細胞を再プログラミングさせることまたは細胞シグナル伝達経路、例えば、MAPキナーゼ経路、TGFβ経路、および/またはWnt/β-カテニン経路の修飾因子を含有する培地中でiPSCを培養することにより、生成または培養したiPSCの遺伝子発現のサインが従来のiPSC(従来の培地中で生成し、かつ/または培養し、細胞シグナル伝達経路の修飾因子と接触させていないiPSC)よりもESC様になる。階層クラスタリングにおいて実証されている通り、従来の培地で得られたhiPSCとSMC4培地で得られたhiPSCは互いに同様であり、どちらもそれらの親系統であるIMR90とは異なった(図6B)。しかし、SMC4培地中で培養したiPSCをフィーダー細胞上に戻してプレーティングしたときに、それらは、従来法で培養したiPSCよりもマウスESCによく似ており、このことはナイーブ状態の別の実証であった(図6E)。さらに、SMC4培地中で培養したiPSCでは、Xist活性が有意に低下し、X染色体の遺伝子の発現が増強された(図6Cおよび6D)。最後に、SMC4培地中で培養したiPSCは、3種の胚葉全てに分化しただけでなく、ナイーブな状態にある細胞のみが保有する能力である、胚体外の細胞に関連する遺伝子を再活性化する能力も実証された(図3H)。したがって、プライムされた状態で存在するiPSCを含めた多能性幹細胞をSMC4培地中で培養することにより、ナイーブ状態が促進され、また、分化の潜在性が増強された。
SMC4補充培地および細胞選別プラットフォームを使用して生成したhiPSCクローンの多能性の状態を決定するために(図7)、hiPSCを、同じ開始線維芽細胞系ならびにOct4、Klf4およびMycを発現している3-因子ポリシストロニックベクターから得たが、凝集塊継代およびフィーダー細胞(FTi99)を含めた従来の培養下で維持した。hESC由来の種々のクローンならびにmRNAのAffymetrix包括的遺伝子発現解析を行った(図7B)。全ての多能性系が対照線維芽細胞系と異なるプロファイルを有し(FTC1、ピアソンスコア0.886)互いに基本的に同様の発現プロファイルを有する(ピアソンスコア0.969)ことが分かった。ヒートマップサインを作成して、hESC/FTi99(フィーダー細胞および従来の培地で生成し、維持したhESCまたはhiPSC)群とFTi91/FTi93(フィーダーフリーおよびSMC4培地で生成し、維持したhiPSC)群の間で4倍差次的に発現された1,739種のプローブを示した(図7C)。1,739種の差次的に発現された転写物内の遺伝子の深さ分析では、興味深い傾向が同定された:FTi91/FTi93群では一般にナイーブな状態に関連するいくつかの多能性遺伝子が上方制御されたが、より有意に、この群内で、プライムな状態に関連する多くの分化遺伝子は抑制された(図7D)。SMC4培地で生成したhiPSCに関する本発明者らの包括的分析により、培養条件が、未分化の状態の決定において、出発細胞系または誘導戦略と比較してより影響力の大きい役割を果たすことが示唆されている。データにより、SMC4培養条件において得られた、またはそれに適合させたクローンは、好ましい品質、例えば、初期の系統マーカーの発現の低下を伴う高度に未分化の状態を伴うナイーブな特性が実証されることも示唆されている(図7E)。
(実施例6) 真正なhiPSCを同定するための抗体カクテルの同定
多能性幹細胞表面マーカーを調査した。SSEA4およびTra181の発現に加えて、CD30およびCD50の発現も同定し、さらなる多能性の表面マーカーを示すとみなした(図10)。Oct4、Klf4およびSox2を発現しているポリシストロニックなレンチウイルスを用いて再プログラミングされた細胞は、種々の能力の状態を示し、真の多能性のマーカー、例えば、Nanogの発現を担持するわずかな細胞を用いて同定される。現在まで、表面マーカーの発現に基づいて真に多能性のhiPSCを同定する信頼できる方法は存在していない。例えば、図11において認められるように、SSEA4、Tra181およびCD9について陽性と同定された一部のクローン集団は、Nanogを発現せず、hiPSCであると不正確に同定されたことになる。
多能性幹細胞表面マーカーを調査した。SSEA4およびTra181の発現に加えて、CD30およびCD50の発現も同定し、さらなる多能性の表面マーカーを示すとみなした(図10)。Oct4、Klf4およびSox2を発現しているポリシストロニックなレンチウイルスを用いて再プログラミングされた細胞は、種々の能力の状態を示し、真の多能性のマーカー、例えば、Nanogの発現を担持するわずかな細胞を用いて同定される。現在まで、表面マーカーの発現に基づいて真に多能性のhiPSCを同定する信頼できる方法は存在していない。例えば、図11において認められるように、SSEA4、Tra181およびCD9について陽性と同定された一部のクローン集団は、Nanogを発現せず、hiPSCであると不正確に同定されたことになる。
本発明は、真に多能性細胞のマーカーであるNanogを発現している細胞の集団を同定する細胞表面マーカーの組合せを提供する。詳細には、CD30、SSEA4およびTra181である表面マーカーに対して陽性の細胞により、Nanogを発現している細胞が同定される(図11)。
追加富化の別の例では、再プログラミングを受けている細胞集団を選別して、CD13表面マーカーの発現に対して陽性の細胞を同定し、これらのCD13+細胞を再プログラミング細胞集団から除去した。CD13+集団は体細胞および再プログラミングされていない細胞と相関し、再プログラミング細胞集団からCD13+細胞を枯渇させることにより、SSEA4/Tra181陽性細胞の富化が増強された(図12)。図12において実証されている通り、体細胞を、Oct4、Klf4およびSox2を発現しているポリシストロニックベクターを用いて21日間再プログラミングさせたとき、多様な表面マーカーの発現パターンを有する種々の細胞集団が生み出され、細胞の少数のサブセットのみがSSEA4およびTra181陽性細胞を示した(点線の矢印、図12)。しかし、同じ集団を、CD13発現に基づいて最初に評価したところ(実線の矢印、図12)、CD13に対して陰性の(すなわち、CD13細胞が枯渇した)集団サブセットは、SSEA4およびTra181を発現している細胞について有意に富化された集団を示した(11.04%、図12)。反対に、高レベルのCD13を発現した細胞のサブセットは、SSEA4とTra181の両方を発現したわずかな細胞を示した(1.14%、図12)。
(実施例7)
分化細胞からの人工多能性幹細胞の生成における単細胞選別の使用
図8Aにおいて認めることができるように、Oct4、Klf4、Sox2およびmycを発現している個々のレンチウイルスを用いて誘導した再プログラミングプロセスの初期にある線維芽細胞培養物は、形態学的に異なる細胞のコロニーを含有した。これらの細胞の一部は多能性のマーカーに対して陽性に染色されたが、他はただ単に形質転換された成長が速い細胞であった。再プログラミングプロセスのこの段階では、細胞形態単独では、どの細胞コロニーがiPSCを形成するようになるかは明らかにならない。成長がより速く、形質転換されたが多能性ではない細胞がすぐに培養物を引き継ぐ。したがって、再プログラミングプロセスの初期にあるiPSCを選択する富化ステップを有することが有利であることになる。さらに、図8に示されている通り、一部のコロニーは再プログラミングプロセスの間にいくつかの多能性マーカーを発現し、それは、真のiPSCであったが、一部のコロニーは完全には再プログラミングされておらず、一部の多能性のマーカーのみを発現した。図8Bのコロニー1は、SSEA4とTra181の両方に対して陽性であったが、コロニー4および5は、どちらかのマーカーに対してのみ陽性であった。したがって、コロニー形態によるのではなく、多能性の細胞表面マーカーまたはいくつかのマーカーを同時に用いて多能性細胞を選択することがより効率的であり、技術的な困難が少ないことになる。
分化細胞からの人工多能性幹細胞の生成における単細胞選別の使用
図8Aにおいて認めることができるように、Oct4、Klf4、Sox2およびmycを発現している個々のレンチウイルスを用いて誘導した再プログラミングプロセスの初期にある線維芽細胞培養物は、形態学的に異なる細胞のコロニーを含有した。これらの細胞の一部は多能性のマーカーに対して陽性に染色されたが、他はただ単に形質転換された成長が速い細胞であった。再プログラミングプロセスのこの段階では、細胞形態単独では、どの細胞コロニーがiPSCを形成するようになるかは明らかにならない。成長がより速く、形質転換されたが多能性ではない細胞がすぐに培養物を引き継ぐ。したがって、再プログラミングプロセスの初期にあるiPSCを選択する富化ステップを有することが有利であることになる。さらに、図8に示されている通り、一部のコロニーは再プログラミングプロセスの間にいくつかの多能性マーカーを発現し、それは、真のiPSCであったが、一部のコロニーは完全には再プログラミングされておらず、一部の多能性のマーカーのみを発現した。図8Bのコロニー1は、SSEA4とTra181の両方に対して陽性であったが、コロニー4および5は、どちらかのマーカーに対してのみ陽性であった。したがって、コロニー形態によるのではなく、多能性の細胞表面マーカーまたはいくつかのマーカーを同時に用いて多能性細胞を選択することがより効率的であり、技術的な困難が少ないことになる。
本明細書に記載の細胞培養組成物を、同様に本明細書において提供される細胞の富化お
よび/または選別方法体系と組み合わせて用いると、再プログラミングプロセスの間に多能性の表面マーカーを示した個々の細胞を選択することによって、より多数のiPSCをより短期間で得ることが可能であった。より詳細に、図9AおよびBに概略的に示されている通り、再プログラミングの間に多能性のマーカーに基づいて単細胞を選別し、富化することを用いてiPSCを生成するための2つの経路を、本発明の方法を用いて実行した。
よび/または選別方法体系と組み合わせて用いると、再プログラミングプロセスの間に多能性の表面マーカーを示した個々の細胞を選択することによって、より多数のiPSCをより短期間で得ることが可能であった。より詳細に、図9AおよびBに概略的に示されている通り、再プログラミングの間に多能性のマーカーに基づいて単細胞を選別し、富化することを用いてiPSCを生成するための2つの経路を、本発明の方法を用いて実行した。
経路Aでは、再プログラミングの開始後、種々の能力の状態にある細胞の混成集団を生成した。細胞の混成集団は、分化細胞、部分的に再プログラミングされた細胞、再プログラミングされた細胞、および再プログラミングを受けている細胞を含有した。磁気ビーズ選別またはフローサイトメトリー選別などの方法(方法体系については実施例1を参照されたい)を用いて、細胞集団を多能性マーカー、例えば、SSEA4を発現した細胞について富化した。富化されたら、細胞をSMC4培地(表1)、または、特定の実施形態では、SMC4+フィブロネクチン培地でおよそ3日間、その後、SMC4培地と交換し、およそ6~10日間の培養期間の後、iPSCコロニーを、マーカー、例えば、SSEA4およびTRA181の生培養物染色に基づいて同定し、クローンを拡大するために選び取ったまたは選別した(図9)。
経路Bの概略図(図9)の下で、再プログラミングの開始後早期に、細胞の混成集団を選別して、2種以上の多能性のマーカーについて陽性である希少な細胞集団を得た。そのようなマーカーとしては、これらに限らないが、SSEA4およびTRA181が挙げられる。選択された、多能性マーカーの組合せを発現している細胞を、フィーダー細胞を補充した培養系またはフィーダーフリー培養系、詳細には、表1に記載の細胞培養培地組成物を補充した培養系に移した。このように、上記の方法体系と比較してタイムラインおよび技術的障壁を有意に減少させてiPSCコロニーを生成した。
この技術の特定の実証では、IMR90線維芽細胞に、Oct4およびSox2およびKlf4およびc-Myc(OSKM)を発現しているレンチウイルスを感染させた。数日間フィーダーフリー培養した後、再プログラミング細胞を、それらの体細胞用培地からSMC4培地(表1)を補充したフィーダーフリー培養に切り換えた。再プログラミングを開始した8日後に、フローサイトメトリー分析により、感染細胞集団が、多能性マーカーであるSSEA4を発現した細胞のそれほど大きくない亜集団を含有することが分かった(図13A)。実施例1に記載の通り磁気活性化細胞選別を用いて、多能性集団を、SSEA4を発現している細胞について3倍に富化した(図13A)。細胞を、SSEA4を発現している細胞について富化した後、選別された細胞を、Matrigel(商標)を含有し、従来のhESC培地もしくはSMC4培地、または特定の実施形態では、SMC4+フィブロネクチン培地のいずれかを補充したフィーダーフリー培養に移した。培養物のアルカリホスファターゼ染色により、MEK、GSK3、RockキナーゼおよびTGFβの低分子阻害剤を使用することにより、単細胞選別を用いた多能性細胞の富化が支持されたが、従来の基本培地ではそれが支持されなかったことが示されている(図13A)。
3つの独立した実験を定量化することにより、低分子阻害剤の存在下のみで単細胞選別による多能性細胞の選択が明白に実証された(図13B)。このように富化された細胞由来のコロニーを、SMC4培地中でさらに培養し、これは真のiPSCであると特徴付けられた:真のiPSCは、免疫蛍光検査およびフローサイトメトリーにおいて多能性マーカーであるSSEA4およびTra181に対して陽性に染色され(図13CおよびD);ヒトESCと同様の遺伝子発現プロファイルを示し(図13E);外因性の導入遺伝子の有意なサイレンシングを示し(図13F)、3種の胚葉全てに分化することができた(図13G)。同じプロトコールを使用したが、従来の培養条件(フィーダー細胞を含有し
、SMC4を欠く従来の培地からなる)を用いた場合には、多能性細胞コロニーはめったに観察されなかった。したがって、細胞の再プログラミングの間に、単細胞選別を用いて、多能性の細胞表面マーカーに基づいて多能性細胞集団を頑強に富化する能力は、細胞シグナル伝達経路阻害剤および表1に列挙されている添加物の使用に依存した。さらに、培養系において添加物としてフィブロネクチンを3日間使用したところ、選別後播種の改善が観察された。この再プログラミングプロセスは、ヒト脂肪由来の幹細胞を含めた他の出発細胞型に対しても同様に完了した。
、SMC4を欠く従来の培地からなる)を用いた場合には、多能性細胞コロニーはめったに観察されなかった。したがって、細胞の再プログラミングの間に、単細胞選別を用いて、多能性の細胞表面マーカーに基づいて多能性細胞集団を頑強に富化する能力は、細胞シグナル伝達経路阻害剤および表1に列挙されている添加物の使用に依存した。さらに、培養系において添加物としてフィブロネクチンを3日間使用したところ、選別後播種の改善が観察された。この再プログラミングプロセスは、ヒト脂肪由来の幹細胞を含めた他の出発細胞型に対しても同様に完了した。
当該技術のさらなる例では、多能性の細胞集団を再プログラミングされていない細胞、部分的に再プログラミングされた細胞および完全に再プログラミングされた細胞の混合物から富化するためにFACSを使用した。前述の実施例と同様に、IMR90線維芽細胞に、Oct4およびSox2およびKlf4/cおよびMyc(OSKM)を発現しているレンチウイルスを感染させた。線維芽細胞を感染させた数日後、細胞培養物をSMC4培地でのフィーダーフリー培養に切り換えた。感染細胞集団は、多能性マーカーであるSSEA4とTra181の両方に対して陽性であるそれほど大きくない細胞集団を含有した(図14A)。両方の多能性マーカーに対して陽性である細胞を選択し、両方のマーカーに対して陰性であるか、または一方のマーカーのみに対して陽性である細胞から離して選別した。表1に記載の通りに補充した培地を用いた、いくつかの実施形態ではフィブロネクチンを含有する表1に記載の通りに補充した培地を用いた、その後のフィーダーフリー培養物を比較することにより、両方のマーカーに対して陽性である細胞由来の培養物は、その後に多能性iPSCとして特徴付けられたコロニーを形成したが、FACSによって多能性のマーカーに対して陰性であるとゲーティングされた細胞は、アルカリホスファターゼ陽性コロニーを産生しなかったことが示された(図14A、B)。より詳細には、基本培地処方物への添加物としてのシグナル伝達分子MEK、GSK、RockおよびTGFβの阻害剤により、再プログラミングプロセスの初期にある多能性細胞の選別選択および富化におけるFACSの使用が容易になった。さらに、培養系においてフィブロネクチンを添加物として3日間使用したところ、選別後播種の改善が観察された。
次に、SMC4培地および培養系の利点を用いて、フィーダーフリーおよびクローニングにより得られるhiPSCを生成するためのハイスループットな方法を開発した。スキームは、再プログラミングされるように誘導された細胞をSMC4培地で処理し、多能性マーカーの組合せによって示される、忠実に再プログラミングされた希少な個々の細胞を選択するように工夫した。さらに、本発明者らは、再プログラミングプロセスとマルチプレックスプラットフォームを組み合わせて、最上位のクローンを二重マーカーフローサイトメトリー、qRTPCRおよび免疫蛍光検査の選択アッセイに基づいて有効に選択した(図15)。
最適化されたマルチプレックスプロトコールでは、3-因子(OKS)ポリシストロニックウイルスを用いて再プログラミングを開始し、SSEA4+/Tra181+集団の最初のバルクのFACS選別を感染の20日後に完了し、その後、30日目に、96ウェル-プレートにSSEA4+/Tra181+細胞をFACS再選別して入れた(図15およびB)。この戦略により、複数のクローンを得ることが可能になり、多能性マーカーを発現し、外因性の遺伝子活性の減弱およびOct4プロモーターの脱メチル化を示したクローンであるFTC1クローン1および2が生成された(図15A~C)。FTC1クローン1および2も、in vitroおよびin vivoで3つの体細胞系統に分化することにより、多能性であることが示された(図15D、E)。選択されたクローンを、染色体の完全性についても評価し、それらの親系統および通常の核型からのコピー数の変動が、FF培養液で20回連続して単細胞継代した後でさえも最小であり、これは他の再プログラミング戦略に対する顕著な改善であることが実証された(図17)。
プラットフォームの再現性を決定するために、さらなる線維芽細胞系であるFTC5およびFTC7を、Oct4、Klf4およびSox2を発現しているポリシストロニックベクターを用いて再プログラミングされるように誘導し、図15に記載のハイスループットプラットフォームに適用した。図18に記載の通り、FTC5およびFTC7線維芽細胞系に由来するコロニーは、それらの未分化の状態を維持し、それらの多能性およびゲノム安定性を保持することが示された。したがって、3種の多能性因子、SMC4培地およびマルチプレックス特徴付けプラットフォームを組み合わせることにより、フィーダーフリー再プログラミングのカイネティクスが有意に増強され、その一方で、クローンで得られ、ゲノム的に安定なhiPSCをハイスループットな様式で同定し、選択し拡大することが可能になる。
(実施例8)
複数のiPSCクローンを迅速に生成するための方法および培養組成物
ヒトiPSCを、多能性遺伝子、例えば、Oct4、Sox2、Klf4、c-myc、Lin28およびNanogを異所性発現させることによって生成することは、非効率的かつ技術的に困難なプロセスである。レンチウイルスまたはレトロウイルスによる多能性因子導入遺伝子の宿主細胞のゲノムへの組込みを、フィーダー細胞支持体を含む培養系と組み合わせてもたらす戦略が、iPSCを生成するための伝統的に最も効率的な方法であった。ヒトiPSCを生成するためのウイルスおよびフィーダー細胞方法体系を用いた歴史的研究についての文献レビューにより、0.001%~0.01%の効率で感染細胞がiPS細胞になることが示されており、潜在的な多能性細胞は感染後21~30日の期間で認められ、これらは、感染後30日間~45日間の間に手動の「凝集塊」継代によって、クローンで得られる(表4)。
複数のiPSCクローンを迅速に生成するための方法および培養組成物
ヒトiPSCを、多能性遺伝子、例えば、Oct4、Sox2、Klf4、c-myc、Lin28およびNanogを異所性発現させることによって生成することは、非効率的かつ技術的に困難なプロセスである。レンチウイルスまたはレトロウイルスによる多能性因子導入遺伝子の宿主細胞のゲノムへの組込みを、フィーダー細胞支持体を含む培養系と組み合わせてもたらす戦略が、iPSCを生成するための伝統的に最も効率的な方法であった。ヒトiPSCを生成するためのウイルスおよびフィーダー細胞方法体系を用いた歴史的研究についての文献レビューにより、0.001%~0.01%の効率で感染細胞がiPS細胞になることが示されており、潜在的な多能性細胞は感染後21~30日の期間で認められ、これらは、感染後30日間~45日間の間に手動の「凝集塊」継代によって、クローンで得られる(表4)。
多能性遺伝子を導入するための他の方法としては、エピソームベクター系および改変されたタンパク質の形質導入が挙げられる。そのような方法は、iPSC技術の最終の臨床的適用に向かう重要な発展であると考えられる。しかし、これらの方法体系は、ウイルス系を用いた再プログラミングよりもさらに効率が低い。さらに、フィーダー細胞フリー系を従来の幹細胞用培地処方物と組み合わせて使用する場合でも、再プログラミングプロセスの効率は低下する、または一部の条件では不可能であり、これにより工業的および治療的な使用のためのiPSCの開発が妨げられている。体細胞の再プログラミングは、確率論的なプロセスとして特徴付けられており、大多数の細胞が時間の経過とともに最終的に再プログラミングされる。しかし、単一の再プログラミングにおいて複数のiPSCクローンを作製するための頑強な、技術的に容易な、効率的な、かつスケーラブルな方法はまだ記載されていない。
本発明は、クローンiPSCコロニーを、現行の方法よりも比較的短い時間で、かつより低い技術的障壁で得るための細胞培養条件および方法体系を提供する。詳細には、図13Bに認めることができるように、特定のシグナル伝達経路の低分子阻害剤をSMC4培地において添加物として使用することにより、フィーダーフリー培養の環境において、SMC4培地を使用しない場合をはるかに超える効率でiPSCコロニーを生成することが可能になった。MEK、GSK、RockおよびTGFβシグナル伝達経路の阻害剤を使用して、フィーダーフリー環境における効率的な再プログラミングを可能にした。
図13および表4から認めることができるように、3つの独立した再プログラミング実験では、再プログラミングプロセスにおいて、フィーダーフリー環境で従来のhESC培地を使用した場合にはコロニーは認められなかった、または1つのコロニーが認められたが、低分子培養添加物(すなわち、SMC4培地)により、フィーダーフリー再プログラミング事象が0.035%の効率まで増強され、感染の14~21日後にコロニーがもたらされ、28~35日までにクローンのiPSCが得られた。したがって、低分子阻害剤
を使用することにより、再プログラミングまでの時間、再プログラミングされた細胞のパーセントに関して再プログラミングの効率が上昇した。この手法を用いて生成したコロニーは、免疫蛍光検査および遺伝子発現プロファイリングなどの標準の手順を用いて、多能性であると特徴付けられた。
を使用することにより、再プログラミングまでの時間、再プログラミングされた細胞のパーセントに関して再プログラミングの効率が上昇した。この手法を用いて生成したコロニーは、免疫蛍光検査および遺伝子発現プロファイリングなどの標準の手順を用いて、多能性であると特徴付けられた。
この技術のさらなる実証では、分化細胞を、個々の多能性遺伝子Oct4、Klf4、Sox2、およびMycを発現しているウイルスに感染させ、SMC4培地およびフィーダーフリー培養環境(表1)で8~12日間培養した。この時点で、および、実施例6ならびに図13および14に記載の通り、細胞を、FACSまたはMACS単細胞選別を用いて富化して、多能性マーカー、例えば、SSEA4およびTra181についての陽性染色によって定義される、小さな多能性細胞の集団を得た。この手法を用いて、iPSCを作製するためのタイムラインを著しく縮小し、再プログラミングされた細胞のパーセントの点で0.22%の効率が実証され、コロニーは、選別のすぐ後、数日のうちに現れた(10~16日)。この再プログラミングの効率により、感染の21~28日後までにクローンのiPSCを得ることが可能になった。
再プログラミングの効率の改善のさらなる実証では、3種(Oct4、Klf4、およびSox2)または4種(Oct4、Klf4、Sox2、およびmyc)の多能性因子を同じプロモーターエレメントから発現させるポリシストロニックベクター系を、最適化されたSMC4培地と、フィーダーフリー培養と、SSEA4およびTRA181を使用した単細胞選別系とを組み合わせて用い、その結果、0.756%の再プログラミング効率がもたらされ、コロニーは感染の6~8日後に最初に認められた。この方法は、感染のちょうど4日後にiPSCコロニーが存在していたほど効率的であった。これらの技法により、iPSCを生成する伝統的な方法に対して有意な改善が示される。
表4:種々の戦略における再プログラミングのカイネティクス。
N.I.、同定されず;*iPSC様コロニーの形態学的出現;**播種した細胞当たりのSSEA4+/Tra181+の数として算出した;***iPSCコロニーを拡大し、クローン系として維持するために必要な時間(Tra181/SSEA4染色に基づく)。灰色の枠は、文献検索からのデータを示す。個々の因子ウイルス;感染は、それぞれが重要な転写因子のうちの1つを発現している個々のウイルスを組み合わせることによって行い、3はOct4/Klf4/Sox2の組合せを表し、4はOct4/Klf4/Sox2/cMycの組合せを表す。
N.I.、同定されず;*iPSC様コロニーの形態学的出現;**播種した細胞当たりのSSEA4+/Tra181+の数として算出した;***iPSCコロニーを拡大し、クローン系として維持するために必要な時間(Tra181/SSEA4染色に基づく)。灰色の枠は、文献検索からのデータを示す。個々の因子ウイルス;感染は、それぞれが重要な転写因子のうちの1つを発現している個々のウイルスを組み合わせることによって行い、3はOct4/Klf4/Sox2の組合せを表し、4はOct4/Klf4/Sox2/cMycの組合せを表す。
単細胞選別および富化を用いて多能性細胞集団を分化細胞集団から枯渇させる方法
薬物スクリーニングおよび幹細胞生物学の一部の臨床的適用には、ESCまたはiPSCなどの多能性細胞から特定の系統に分化した均一の細胞集団を生成することが必要である。分化細胞集団に多能性細胞が混入することにより、誤ったスクリーニング結果がもたらされる可能性がある、または、in vivoにおいて腫瘍/奇形腫の形成がもたらされる可能性さえある。細胞集団を分化細胞について富化するか、または多能性細胞を細胞集団から枯渇させるかのいずれかの方法は、本明細書の実施例3および6に記載の選別技術を含んでよい。細胞培養培地において低分子添加物を使用することにより、特に、本発明によって提供されるように、単細胞選別プロセスの間に多能性細胞が分化または部分的に分化することが妨げられ、これにより、完全に分化した細胞の集団から多能性細胞を陰性選択することが可能になる。逆に、細胞選別によって分化細胞を細胞集団から陽性選択することは、多能性細胞が多能性の表面マーカーに対して完全に陽性のままである培養条件下ではより有効であり得る。図20において認めることができるように、完全に分化した線維芽細胞と多能性細胞の混成集団は、表1に記載の培養環境において細胞を前培養した場合には、FACSを用いて有効に分離された。選別手順の間に低分子培養添加物も使用することができ、それにより単細胞懸濁物が安定化される。図20から、多能性マーカーに対して陰性であるとして選択された細胞は、その後の培養およびアルカリホスファターゼについての染色において完全に多能性細胞を含まないことが確かめられたことが理解され得る。
(実施例10)
多能性幹細胞のフィーダーフリー培養におけるサイトカインおよび成長因子を含まない培養
実施例2において考察されている通り、従来のヒト多能性培養系は、フィーダー細胞、および、ヒト多能性幹細胞を未分化の状態に維持するための外因性の刺激として機能するbFGFなどのサイトカインを含む。しかし、フィーダー細胞および組換えサイトカインを産生するためのプロセスは、異種汚染物質の供給源として機能する。さらに、フィーダー細胞から分泌される重要な因子(複数可)およびサイトカインによって刺激される正確な細胞経路はまだ同定されていない。したがって、ヒト多能性幹細胞の従来の培養は、不明確な系を表し、臨床グレードの製造への移行を妨げる可能性がある。
多能性幹細胞のフィーダーフリー培養におけるサイトカインおよび成長因子を含まない培養
実施例2において考察されている通り、従来のヒト多能性培養系は、フィーダー細胞、および、ヒト多能性幹細胞を未分化の状態に維持するための外因性の刺激として機能するbFGFなどのサイトカインを含む。しかし、フィーダー細胞および組換えサイトカインを産生するためのプロセスは、異種汚染物質の供給源として機能する。さらに、フィーダー細胞から分泌される重要な因子(複数可)およびサイトカインによって刺激される正確な細胞経路はまだ同定されていない。したがって、ヒト多能性幹細胞の従来の培養は、不明確な系を表し、臨床グレードの製造への移行を妨げる可能性がある。
この問題に取り組むために、本発明は、実施例2において考察されているフィーダーフリーおよび単細胞継代系を、bFGFおよび他のサイトカインおよび成長因子をSMC4培地処方物から除去することによってさらに改変したさらなる実施形態を包含する。さらに、本発明の一実施形態では、Matrigel(商標)は動物由来の細胞外マトリックスを表し、完全には特徴付けられていないので、Matrigel(商標)をゼラチンで置き換えた。本発明のこれらの実施形態により、iPSCを含めた多能性幹細胞の内因性自己再生および維持を可能にする、完全に定義済みかつサイトカインを含まない培養系が提供された。
図21Aおよび21Bにおいて実証されている通り、Oct4、Klf4、およびSox2を含有するポリシストロニックベクター系を用いて生成し、フィーダーフリー環境に
おいて維持したiPSCなどのヒト多能性幹細胞は、さらなるサイトカインまたは成長因子、例えばbFGFを欠くSMC4培地を有する、ゼラチンでコーティングした培養表面で容易に単細胞継代された。この完全に定義済みの系において数回の継代後、iPSCは、Tra181およびSSEA4の共発現によって実証された通り、それらの多能性の状態を維持した(図21C)。さらに、本発明者らは、この完全に定義済みかつサイトカインを含まない系におけるiPSCの生成を実証した。したがって、一実施形態では、本発明は、SMC4培地とゼラチンの組合せを含む、成長因子およびサイトカインが存在しない完全に定義済みの培養系を提供する。
おいて維持したiPSCなどのヒト多能性幹細胞は、さらなるサイトカインまたは成長因子、例えばbFGFを欠くSMC4培地を有する、ゼラチンでコーティングした培養表面で容易に単細胞継代された。この完全に定義済みの系において数回の継代後、iPSCは、Tra181およびSSEA4の共発現によって実証された通り、それらの多能性の状態を維持した(図21C)。さらに、本発明者らは、この完全に定義済みかつサイトカインを含まない系におけるiPSCの生成を実証した。したがって、一実施形態では、本発明は、SMC4培地とゼラチンの組合せを含む、成長因子およびサイトカインが存在しない完全に定義済みの培養系を提供する。
(実施例11)
多能性幹細胞の生成および維持におけるゲノム安定性
複数の試験により、多能性幹細胞の再プログラミングプロセスおよびその後の培養により、ゲノムの異常の傾向がより高くなり得ることが示唆されている。さらに、フィーダーフリー培養により、核型異常細胞のクローン成長を生じることが示されている。図17A、17Bおよび18Cにおいて実証されている通り、本発明は、再プログラミングさせてゲノム安定性を有する細胞を得る方法、ならびに再プログラミングされたゲノム安定性を有する細胞を維持する方法を提供する。本発明の方法では、細胞を本発明者らのOct4、Klf4およびSox2を含有する3因子ポリシストロニック構築物を使用して再プログラミングさせ、SMC4培地中で培養した場合に、再プログラミングプロセスの間、ならびに長期フィーダーフリー培養の間の両方でゲノム安定性が維持された。図17Aにおいて認められるように、高分解能比較ゲノムハイブリダイゼーションにより、長期フィーダーフリー培養において、SMC4培地を使用してhiPSCを生成し、維持した場合に、最小のコピー数の変動が検出されたことが実証された。さらに、図17Bおよび18Cにおいて実証されている通り、常套的な長期フィーダーフリー培養および単細胞培養の間、ゲノム安定性が維持された。
多能性幹細胞の生成および維持におけるゲノム安定性
複数の試験により、多能性幹細胞の再プログラミングプロセスおよびその後の培養により、ゲノムの異常の傾向がより高くなり得ることが示唆されている。さらに、フィーダーフリー培養により、核型異常細胞のクローン成長を生じることが示されている。図17A、17Bおよび18Cにおいて実証されている通り、本発明は、再プログラミングさせてゲノム安定性を有する細胞を得る方法、ならびに再プログラミングされたゲノム安定性を有する細胞を維持する方法を提供する。本発明の方法では、細胞を本発明者らのOct4、Klf4およびSox2を含有する3因子ポリシストロニック構築物を使用して再プログラミングさせ、SMC4培地中で培養した場合に、再プログラミングプロセスの間、ならびに長期フィーダーフリー培養の間の両方でゲノム安定性が維持された。図17Aにおいて認められるように、高分解能比較ゲノムハイブリダイゼーションにより、長期フィーダーフリー培養において、SMC4培地を使用してhiPSCを生成し、維持した場合に、最小のコピー数の変動が検出されたことが実証された。さらに、図17Bおよび18Cにおいて実証されている通り、常套的な長期フィーダーフリー培養および単細胞培養の間、ゲノム安定性が維持された。
(実施例12)
細胞表面マーカーを使用した、培養している間の多能性細胞の細胞集団の維持
多くの場合、幹細胞培養物の多能性を維持するために、分化細胞を多能性細胞培養物から除去することが有用である。現在まで、このプロセスには、分化細胞を細胞培養物から手動で選び取ること、または未分化細胞を実質的に分化した集団から採取することが必要である。どちらのプロセスも重労働であり、技術訓練を必要とし、常に培養物中の細胞の真の多能性の状態を示すとは限らない形態に基づいた細胞の選択に依拠する(図8)。
細胞表面マーカーを使用した、培養している間の多能性細胞の細胞集団の維持
多くの場合、幹細胞培養物の多能性を維持するために、分化細胞を多能性細胞培養物から除去することが有用である。現在まで、このプロセスには、分化細胞を細胞培養物から手動で選び取ること、または未分化細胞を実質的に分化した集団から採取することが必要である。どちらのプロセスも重労働であり、技術訓練を必要とし、常に培養物中の細胞の真の多能性の状態を示すとは限らない形態に基づいた細胞の選択に依拠する(図8)。
改善されたプロセスにおいて、本発明は、常套的な培養の間に未分化細胞を効率的かつ正確に選択する能力を提供する。図19Aにおいて実証されている通り、SMC4培地およびFF培養液において維持したhiPSCの集団は、未分化の多能性細胞の細胞培養物を維持するために容易に富化または選別された。別の例では、図19Bに記載の通り、通常は廃棄されることになる、大部分が分化細胞の集団を細胞培養物から除去して、Tra181の発現によって表されるように、大部分が未分化の多能性細胞を得ることができる。
Claims (126)
- 多能性細胞をフィーダーフリー環境において培養する方法であって、
マウス胚性幹細胞ではない多能性細胞を、
i)TFGβ阻害剤、
ii)GSK3阻害剤、
iii)MEK阻害剤、および
iv)Rock阻害剤
からなる群から選択される作用剤であって、該細胞の多能性を維持する作用剤を少なくとも1種含む培地中のフィーダーフリー環境において培養し、培養している間、該細胞の多能性を維持するステップ
を含む方法。 - 前記培地が、前記細胞の多能性を維持しながら少なくとも1回の細胞分裂を可能にするために十分な量の前記作用剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記培地が、前記細胞の多能性を維持する作用剤を少なくとも2種含む、請求項1に記載の方法。
- 前記培地が、前記細胞の多能性を維持する作用剤を少なくとも3種含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞の多能性を維持する前記作用剤がRock阻害剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記Rock阻害剤がチアゾビビンまたはY27632である、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞の多能性を維持する前記作用剤がTFGβ阻害剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記TFGβ阻害剤がA-83-01またはSB431542である、請求項7に記載の方法。
- 前記細胞の多能性を維持する前記作用剤がGSK3阻害剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記GSK3阻害剤がCHIR99021またはBIOである、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞の多能性を維持する前記作用剤がMEK阻害剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記MEK阻害剤がPD98059またはPD032901である、請求項11に記載の方法。
- 前記培地が、TFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記TFGβ阻害剤がSB431542であり、前記GSK3阻害剤がCHIR990
21であり、前記MEK阻害剤がPD0325901であり、前記Rock阻害剤がチアゾビビンである、請求項1に記載の方法。 - 前記細胞の多能性が少なくとも5回の細胞分裂にわたって維持される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞の多能性が少なくとも10回の細胞分裂にわたって維持される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞を成長因子およびサイトカインの不在下で培養する、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞をMatrigel(商標)の不在下で培養する、請求項1または17に記載の方法。
- 前記培地がbFGFを実質的に含まない、請求項1または17に記載の方法。
- 前記多能性細胞がヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- マウス胚性幹細胞ではない多能性細胞を成長因子およびサイトカインの不在下で培養するステップを含む、多能性細胞を培養する方法。
- 前記多能性細胞を、該細胞の多能性を維持しながら少なくとも1回の細胞分裂を可能にするために、
i)TFGβ阻害剤、
ii)GSK3阻害剤、
iii)MEK阻害剤、および
iv)Rock阻害剤
からなる群から選択される作用剤であって、該細胞の多能性を維持する作用剤を少なくとも1種含む培地中で培養するステップを含む、請求項21に記載の方法。 - 前記多能性細胞がヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞である、請求項21に記載の方法。
- 前記培地が、少なくとも2種、少なくとも3種、または4種の作用剤を含む、請求項21に記載の方法。
- 解離したヒト多能性細胞を得る方法であって、
a)ヒト多能性細胞を解離させて、解離細胞を得るステップと
b)該解離細胞を、
i)TFGβ阻害剤、
ii)GSK3阻害剤、
iii)MEK阻害剤、および
iv)Rock阻害剤
からなる群から選択される作用剤であって、単細胞の生存能力を増強する作用剤を少なくとも1種含む培地と接触させるステップであって、それにより、該解離細胞の生存能力が該作用剤と接触させていない解離細胞の生存能力と比較して増強されるステップと
を含む方法。 - 前記解離細胞の生存能力が、前記作用剤と接触させていない解離細胞の生存能力と比較
して少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも100%、少なくとも200%、または少なくとも500%増強される、請求項25に記載の方法。 - 前記解離細胞を前記培地中で、少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも5回、または少なくとも10回の継代にわたって、該解離細胞の多能性を維持しながら培養するステップをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 培養後の前記解離細胞の核型が、解離させる前の同じ細胞集団の核型と実質的に同様である、請求項27に記載の方法。
- 前記作用剤の存在下で解離させるステップを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記多能性細胞を、解離させる前に前記作用剤と接触させるステップをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 前記解離細胞を前記培地と接触させるステップが、該解離細胞を該培地中に懸濁させるステップを含む、請求項25に記載の方法。
- フィーダーフリー環境における細胞の能力を増大させる方法であって、細胞をフィーダーフリー環境において、
i)TFGβ阻害剤、
ii)GSK3阻害剤、
iii)MEK阻害剤、および
iv)Rock阻害剤
からなる群から選択される低分子作用剤であって、少なくとも1種の低分子作用剤を含む培地と接触させて、該培地と接触させる前の該細胞と比較して能力が増大した細胞を得るステップを含む方法。 - 接触させるステップが、前記細胞の前記能力を増大させるために十分な条件下で該細胞を培養するステップを含む、請求項32に記載の方法。
- 前記細胞が、
胚性幹細胞、
多能性細胞、
多分化能細胞、
非多能性細胞、および
体細胞
からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。 - 前記細胞がヒト細胞である、請求項32に記載の方法。
- 前記細胞が人工多能性幹細胞である、請求項32に記載の方法。
- 前記細胞の前記能力を増大させるために十分な前記条件が、該細胞を少なくとも1種の多能性因子と接触させることを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記多能性因子が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または低分子を含む、請求項37に記載の方法。
- 前記多能性因子が外因性転写因子である、請求項38に記載の方法。
- 前記外因性転写因子が、Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogポリペプチド、またはOct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、細胞膜を横切る輸送を可能にするアミノ酸配列を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記外因性転写因子が、Oct4、Sox2、およびKlf4ポリヌクレオチドを含む、請求項39に記載の方法。
- 能力が増大している前記細胞が、以下:
a)内在性のOct4、Nanog、SSEA4、Sox2、Klf4、Tra181、およびLin28からなる群から選択される少なくとも1種の多能性幹細胞マーカーの発現、
b)多能性幹細胞の形態、
c)生殖細胞系列伝達に寄与する能力、
d)奇形腫の形成、
e)出発系統とは異なる系統に分化または分化転換する能力、および
f)in vitroにおける三系統分化
の1つまたは複数によって特徴付けられる、請求項32に記載の方法。 - 能力が増大している前記細胞が、前記培地と接触させる前の該細胞と比較して少なくとも2倍高いレベルのOct4を発現する、請求項32に記載の方法。
- 能力が増大している前記細胞が、従来法で培養したiPSCと比較して少なくとも2倍低いXist活性を有する、請求項32に記載の方法。
- 能力が増大している前記細胞が、密集したドーム形のコロニー形態を有する、請求項32に記載の方法。
- 能力が増大している前記細胞が、TFGβ、アクチビン、およびMEKシグナル伝達経路の外因性の刺激の不在下、および必要に応じてbFGF経路の外因性の刺激の不在下で複製し、かつ多能性を維持する、請求項32に記載の方法。
- 能力が増大している前記細胞を、フィーダーフリー環境において、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種の存在下で培養して、該細胞の該能力を維持しながら少なくとも1回の細胞分裂を可能にするステップをさらに含む、請求項32に記載の方法。
- 請求項32から48までのいずれかに記載のプロセスによって作製された、能力が増大している細胞。
- フィーダーフリー環境における細胞集団の再プログラミングの効率を改善する方法であって、
細胞集団を、フィーダーフリー環境において、
i)TFGβ阻害剤、
ii)GSK3阻害剤、
iii)MEK阻害剤、および
iv)Rock阻害剤からなる群から選択される少なくとも1種の低分子作用剤と、再
プログラミングを誘導するために十分な条件下で接触させるステップであって、それにより、再プログラミングの効率が、該細胞集団を該低分子作用剤と接触させていない場合の再プログラミングの効率と比較して少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも100%、少なくとも300%、または少なくとも500%改善するステップを含む方法。 - 再プログラミング前の前記細胞集団が非多能性細胞を含む、請求項50に記載の方法。
- 前記再プログラミングの効率を、再プログラミングのために必要とされる時間または再プログラミングされた細胞の数によって測定する、請求項50に記載の方法。
- 前記条件が、前記細胞集団を、Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogポリペプチド、またはOct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1種の外因性転写因子と接触させることを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記条件が、前記細胞集団を、Oct4、Sox2、およびKlf4ポリペプチドまたはOct4、Sox2、およびKlf4をコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む、請求項50に記載の方法。
- 細胞集団をフィーダーフリー環境において選別して、多能性細胞が富化された細胞集団を得る方法であって、以下:
a)フィーダーフリー環境において細胞の混成集団を含む解離細胞の懸濁物を得るステップと、
b)該懸濁物中の該細胞を選別して、1種または複数種の多能性のマーカーを発現している細胞を得、それにより、多能性細胞が富化された富化細胞集団を得るステップと
を含む方法。 - 前記懸濁物が、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種を含む、請求項55に記載の方法。
- 選別が、磁気ビーズまたはフローサイトメトリーによるものである、請求項55に記載の方法。
- 選別が、磁気ビーズによるものである、請求項57に記載の方法。
- 選別が、フローサイトメトリーによるものである、請求項57に記載の方法。
- 前記富化細胞集団を、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種を、必要に応じて、可溶性フィブロネクチンと組み合わせて含む培地中で培養するステップをさらに含む、請求項55に記載の方法。
- 前記懸濁物中の前記細胞の混成集団を、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種と選別前に接触させる、請求項55に記載の方法。
- 前記細胞の混成集団が、1種または複数種の多能性のマーカーを発現している細胞を含む、請求項55に記載の方法。
- 前記1種または複数種の多能性のマーカーが、SSEA4、TRA160、TRA18
1、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD30、CD50、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31、CD34、OCT4、NanogまたはSox2を含む、請求項62に記載の方法。 - 前記多能性のマーカーが、SSEA4、TRA181、TRA160、およびCD30からなる群から選択される、請求項62に記載の方法。
- 前記細胞の混成集団を1種または複数種の多能性因子と接触させて、再プログラミングを誘導するステップを含む、請求項55に記載の方法。
- 接触させるステップが、1種または複数種の多能性因子を前記細胞の混成集団内の細胞に導入することを含む、請求項65に記載の方法。
- 前記多能性因子が、Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogポリペプチド、またはOct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項66に記載の方法。
- 前記多能性因子が、Oct4、Sox2、およびKlf4ポリペプチド、またはOct4、Sox2、およびKlf4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項66に記載の方法。
- 前記多能性細胞が人工多能性細胞である、請求項55に記載の方法。
- 前記富化細胞集団が、1種または複数種の多能性のマーカーを発現している細胞に関して少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも100%、少なくとも200%、または少なくとも500%富化されている、請求項55に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞(iPSC)を得る方法であって、以下:
a)細胞集団を処理して再プログラミングを誘導するステップと、
b)該細胞集団を含む解離細胞の懸濁物を調製するステップと、
c)該懸濁物中の該細胞を選別して、1種または複数種の多能性のマーカーを発現している選別細胞を得るステップと、
d)1種または複数種の多能性のマーカーを発現している該選別細胞を培養するステップと
を含み、ここで、iPSCが得られる方法。 - 前記細胞集団を、i)TGFβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種と接触させる、請求項71に記載の方法。
- 前記細胞集団を処理して再プログラミングを誘導するステップが、該細胞集団を、1種または複数種の多能性因子と接触させるステップを含む、請求項71に記載の方法。
- 前記多能性因子が、Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogポリペプチド、またはOct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項73に記載の方法。
- 前記多能性因子が、Oct4、Sox2、およびKlf4ポリペプチド、またはOct4、Sox2、およびKlf4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求
項73に記載の方法。 - 前記細胞集団を処理して再プログラミングを誘導するステップが、該細胞集団を、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種と接触させるステップをさらに含む、請求項73に記載の方法。
- 前記懸濁物が、i)TFGβ阻害剤、ii)GSK3阻害剤、iii)MEK阻害剤、またはiv)Rock阻害剤のうちの少なくとも1種を含む、請求項71に記載の方法。
- 選別するステップが、前記細胞をフローサイトメトリーまたは磁気ビーズを使用して選別するステップを含む、請求項71に記載の方法。
- 細胞を選別して、2種、3種、4種、またはそれより多くの多能性のマーカーを発現している細胞を得る、請求項71に記載の方法。
- 前記1種または複数種の多能性のマーカーが、SSEA4、TRA160、TRA181、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD30、CD50、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD105、CD31、CD34、OCT4、NanogまたはSox2を含む、請求項71に記載の方法。
- 前記1種または複数種の多能性のマーカーが、SSEA4、TRA160、TRA181、およびCD30からなる群から選択される、請求項71に記載の方法。
- 前記1種または複数種の多能性のマーカーが、SSEA4、CD30、およびTRA160またはTRA181である、請求項71に記載の方法。
- 培養するステップが、前記細胞を、
i)TFGβ阻害剤、
ii)GSK3阻害剤、
iii)MEK阻害剤、および
iv)Rock阻害剤
からなる群から選択される少なくとも1種の低分子作用剤を含む培地中で培養するステップを含む、請求項71に記載の方法。 - 前記細胞をフィーダーフリー環境において培養する、請求項83に記載の方法。
- 前記細胞をフィーダーフリー環境において処理し、懸濁させ、選別し、培養する、請求項71に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞が約2~22日間に得られる、請求項71に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞が約4~約18日間に得られる、請求項71に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞が、前記細胞集団を処理して再プログラミングを誘導した後約4~約22日間以内に得られる、請求項71に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞が、前記細胞集団を処理して再プログラミングを誘導した後約6~約18日間以内に得られる、請求項71に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞が、前記細胞集団を処理して再プログラミングを誘導した後約10~約16日間以内に得られる、請求項71に記載の方法。
- 請求項71から90までのいずれかに記載の方法によって得られる人工多能性幹細胞。
- 多能性細胞を細胞集団から枯渇させる方法であって、以下:
a)多能性細胞を有する細胞の混成集団を含む解離細胞の懸濁物を得るステップと、
b)該懸濁物中の該細胞を選別して、1種または複数種の多能性のマーカーを発現している細胞を除去し、それにより、多能性細胞を細胞集団から枯渇させるステップと
を含む方法。 - 前記細胞の混成集団が多分化能細胞または体細胞を含む、請求項92に記載の方法。
- 前記懸濁物中の前記細胞の混成集団を、
i)TFGβ阻害剤、
ii)GSK3阻害剤、
iii)MEK阻害剤、および
iv)Rock阻害剤
からなる群から選択される少なくとも1種の低分子作用剤を含む培地中で、該懸濁物を得る前に培養する、請求項92に記載の方法。 - 前記懸濁物が、
i)TFGβ阻害剤、
ii)GSK3阻害剤、
iii)MEK阻害剤、および
iv)Rock阻害剤
からなる群から選択される少なくとも1種の低分子作用剤を含む、請求項92に記載の方法。 - 選別するステップが、前記細胞をフローサイトメトリーまたは磁気ビーズを使用して選別するステップを含む、請求項92に記載の方法。
- ゲノム安定性を有する多能性細胞を得る方法であって、
細胞を、フィーダーフリー環境において、c-mycの不在下、ゲノム安定性を有する多能性細胞を得るために十分な条件下で、
i)TFGβ阻害剤、
ii)GSK3阻害剤、
iii)MEK阻害剤、および
iv)Rock阻害剤
からなる群から選択される少なくとも1種の低分子作用剤と接触させるステップ
を含む方法。 - 前記細胞が、
胚性幹細胞、
多能性細胞、
多分化能細胞、
非多能性細胞、および
体細胞からなる群から選択される、請求項97に記載の方法。 - 前記接触させる細胞が非多能性細胞を含む、請求項97に記載の方法。
- 前記条件が、前記細胞を少なくとも1種の多能性因子と接触させることを含む、請求項97に記載の方法。
- 前記多能性因子が、Oct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogポリペプチド、またはOct4、Sox、Klf、Myc、Lin28、もしくはNanogをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される外因性転写因子である、請求項100に記載の方法。
- 前記多能性因子がOct4、Sox2、およびKlf4ポリヌクレオチドを含む、請求項101に記載の方法。
- 前記低分子作用剤がRock阻害剤を含む、請求項97に記載の方法。
- 前記Rock阻害剤がチアゾビビンまたはY27632である、請求項103に記載の方法。
- 前記低分子作用剤がTFGβ阻害剤を含む、請求項97に記載の方法。
- 前記TFGβ阻害剤がA-83-01またはSB431542である、請求項105に記載の方法。
- 低分子作用剤がGSK3阻害剤を含む、請求項97に記載の方法。
- 前記GSK3阻害剤がCHIR99021またはBIOである、請求項107に記載の方法。
- 低分子作用剤がMEK阻害剤を含む、請求項97に記載の方法。
- 前記MEK阻害剤がPD98059またはPD032901である、請求項109に記載の方法。
- 低分子作用剤がTFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含む、請求項97に記載の方法。
- 前記TFGβ阻害剤がSB431542であり、前記GSK3阻害剤がCHIR99021であり、前記MEK阻害剤がPD0325901であり、前記Rock阻害剤がチアゾビビンである、請求項111に記載の方法。
- 多能性細胞を培養して、該細胞のゲノム安定性を維持する方法であって、
多能性細胞を、
i)TFGβ阻害剤、
ii)GSK3阻害剤、
iii)MEK阻害剤、および
iv)Rock阻害剤
からなる群から選択される作用剤であって、該多能性細胞のゲノム安定性を維持する作用剤を少なくとも1種含む培地中のフィーダーフリー環境において培養し、培養している間、該多能性細胞のゲノム安定性を維持するステップ
を含む方法。 - 前記培地が、少なくとも2種、少なくとも3種、または4種の作用剤を含む、請求項113に記載の方法。
- 前記作用剤がRock阻害剤を含む、請求項113に記載の方法。
- 前記Rock阻害剤がチアゾビビンまたはY27632である、請求項115に記載の方法。
- 前記作用剤がチアゾビビンを含む、請求項113に記載の方法。
- 前記作用剤がTFGβ阻害剤を含む、請求項117に記載の方法。
- 前記TFGβ阻害剤がA-83-01またはSB431542である、請求項118に記載の方法。
- 作用剤がGSK3阻害剤を含む、請求項113に記載の方法。
- 前記GSK3阻害剤がCHIR99021またはBIOである、請求項120に記載の方法。
- 作用剤がMEK阻害剤を含む、請求項113に記載の方法。
- 前記MEK阻害剤がPD98059またはPD032901である、請求項122に記載の方法。
- 前記作用剤がTFGβ阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、およびRock阻害剤を含む、請求項113に記載の方法。
- 前記TFGβ阻害剤がSB431542であり、前記GSK3阻害剤がCHIR99021であり、前記MEK阻害剤がPD0325901であり、前記Rock阻害剤がチアゾビビンである、請求項124に記載の方法。
- 前記多能性細胞を、前記培地中で少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも5回、少なくとも10回、または少なくとも15回の継代にわたって、該多能性細胞のゲノム安定性を維持しながら培養する、請求項113に記載の方法。
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