JP2021090446A - 破壊及び場による細胞への化合物及び組成物の送達 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、米国特許法第119条(e)項に基づいて、2015年10月8日に出願した米国仮出願第62,239,241号及び2014年11月14日に出願した米国仮出願第62/080,201号の優先権の利益を主張し、その全体を参照により本明細書に援用する。
本発明は、米国国立衛生研究所により付与された助成金番号R01GM101420‐01A1の下で政府の支援によってなされた。政府は本発明の一定の権利を有する。
妨げとなる。さらに、現在の電気穿孔法技術で使用する強い電場は、重大な損傷または死に至らしめる場合がある(Yarmush,M.L.et al.,Annu.Rev.Biomed.Eng.16,295‐320(2014);Geng,T.&Lu,C.,Lab Chip 13,3803‐21(2013))。ペイロードを細胞及び細胞小器官に直接送達可能な技術が必要である。
ミッタの磁石、音響装置は、別の装置(第二、第三の、またはさらなる装置)の内部にあり、それによってエネルギー場を、マイクロ流体チャネルを有する装置内を通過させ、電極(複数可)を有する装置から放出させる。
り、非限定的な例は、Kalderon et al.,(1984)Cell 39(3 Pt2):499‐509;Makkerh et al.,(1996)Curr
Biol.6(8):1025‐7;Dingwall et al.,(1991)Trends in Biochemical Sciences 16(12):478‐81;Scott et al.,(2011)BMC Bioinformatics 12:317(7pages);Omura T(1998)J Biochem.123(6):1010‐6;Rapaport D(2003) EMBO Rep.4(10):948‐52;及びBrocard&Hartig(2006) Biochimica et Biophysica Acta(BBA)‐Molecular Cell Research 1763(12):1565‐1573に記載され、これらの各内容は、参照により本明細書に援用される。
電場の強度も変動し得る。いくつかの実施形態では、電場の強度またはパルス強度は、実質的にまたは約1〜3kV/cmまたは0.1〜0.5、0.1〜1、0.1〜1.5、0.1〜2、0.1〜2.5、もしくは0.1〜3kV/cmであってもよい。いくつかの実施形態では、電場の強度またはパルス強度は、実質的にまたは約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、または2.5kV/cmであってもよい。電場の強度は、0.1〜10kV/cmの範囲内であり得るか、または特定の場合においてはより広い。例えば、電場の強度またはパルス強度は、実質的にまたは約0.1〜20kV/cm、または1kV/cm未満である。様々な実施形態において、電場の強度またはパルス強度は、実質的にまたは約10〜20kV/cm、または1kV/cm未満である。本発明のいくつかの実施形態では、電場は、実質的にまたは約0.1、0.1〜2、または0.1〜2000msの持続時間で、1〜20、0.1〜2000、または1〜200msの周期でパルスする。場合によっては、電場の強度またはパルス強度は、細胞を電気穿孔するのに必要な強度よりも低くてもよい。例えば、電場の強度またはパルス強度は、細胞を電気穿孔するのに必要な強度よりも実質的にまたは約50、1〜50、50〜99、または1〜99%低くてもよい。
チは、負電荷を有する異なるアミノ酸の混合物を含む。あるいは、荷電アミノ酸ストレッチは同じアミノ酸の繰り返しを有する。アミノ酸は、天然、非天然、またはそれらの組み合わせであってもよい。ストレッチの長さは、改変するペイロードのサイズ及びペイロードに付加する所望の電荷に応じて、変化してもよい。様々な実施形態において、アミノ酸ストレッチは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、または1〜50残基のアミノ酸を含む。
セスの前に、最中に、かつ/または後に、細胞を抗原と接触させてもよい。いくつかの実施形態では、DFEを使用して抗原または他の遺伝子産物をコードするmRNAまたはDNAなどの核酸を送達し、それにより遺伝子産物を細胞内で産生する。また、CAR‐T細胞の生成のために、DFEを使用して細胞にDNAを送達してもよい。
パターニング法がこの材料で十分に確立されており、したがって、新しい装置の製造、設計変更などが容易であるためである。さらに、シリコンの剛性は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)のようなより柔軟な基板よりも利点、例えばより高い送達速度を提供することができる。例えば、装置は、2、10、20、25、45、50、75、100またはそれ以上のチャネルを備える。シリコンのエッチングにより、装置を微細加工する。圧力を加えることによりチャネルまたは導管を介して、細胞を移動させる(例えば押し込む)。細胞輸送装置は圧力を加えることができる。細胞輸送装置は、例えば、加圧ポンプ、ガスボンベ、圧縮機、真空ポンプ、シリンジ、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、手動シリンジ、ピペット、ピストン、キャピラリーアクター、及び重力を備えることができる。チャネルの代替として、ネットまたは密接に配置したプレートの形態の狭窄部に細胞を通過させてもよい。いずれの場合でも、細胞が通過する狭窄部の幅は、細胞が収縮していない状態、すなわち懸濁状態において、処理対象の細胞の幅または直径の20〜99%である。温度は、組成物の取り込み、及び生存率に影響を与えることができる。本方法は、室温(例えば、20℃)、生理学的温度(例えば、39℃)、生理学的温度より高い温度、もしくは低温(例えば、0.1℃)、またはこれらの例示的温度の間の温度(0.1〜40℃)で実施する。
子の発現レベル及び濃度に対するその感受性を試験するために、既知量の遺伝子構築物を細胞へ定量的に送達することも容易に達成することができる。より容易/より効率的で安定した送達、相同組換え、及び部位特異的突然変異誘発を達成するために、既知量のDNA配列と共にDNA組換えを増強する既知量の酵素を送達することができる。本明細書に記載の方法及び装置は、より効率的/決定的なRNA試験のためのRNAの定量的送達にも有用であり得る。細胞の細胞質への低分子干渉RNA(siRNA)の送達も容易に達成される。
的組成物を取り込む。開口部のサイズをそれに応じて、すなわち、狭窄部の幅がクラスターのサイズよりもわずかに小さくなるように調整する。例えば、チャネルの幅は細胞クラスターの幅の20〜99%である。
/Lの浸透圧、及び/または約0.1〜5mS/cm、0.1〜4mS/cmの導電性、例えば、25℃で約3.5mS/cmである。この緩衝液は、ペイロード送達性能を維持しながら変更または改変し得る。例えば、ミオイノシトールは、同濃度のグルコースで置換し得るが、それでもなお同等の性能を提供する。緩衝液または溶液は、使用する場のタイプ及び強度、細胞型、ならびに使用する狭窄部などの多くの要因及び考慮事項に基づいて調整してもよい。モル浸透率及び導電率、ならびにカリウム及びカルシウムなどのイオンの存在の有無を調整してもよい。特定の実施形態では、溶液または緩衝液は、実質的にまたは約1mS〜10mSまたは0.5mS〜15mSの導電率、及び/または1〜310または10〜300mOsm/Lの浸透圧を有する。いくつかの実施形態において、緩衝液のpHは、実質的にまたは約4〜10、5〜9、6〜8、6.5〜7.5、または7である。いくつかの実施形態において、緩衝液は、処理対象の細胞型を電気穿孔するのに適した緩衝液である。電場強度が電気穿孔に十分なものであるかどうかにかかわらず、電気穿孔に適した緩衝液を実施形態で使用してもよい。
、脊椎動物、無脊椎動物、節足動物、哺乳類、げっ歯類、霊長類、及びヒト細胞が挙げられる。細胞は、例えば単細胞生物または多細胞生物の細胞であってもよい。細胞は、例えば、原核生物細胞または不死化真核生物細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。特定の実施形態では、細胞はヒト細胞以外のものである。様々な実施形態において、細胞は、2つ以上の細胞型の混合物であってもよく、または複数の細胞が、2つ以上の細胞型の混合物であってもよい。細胞型の混合物は、複数の細胞型(例えば、本明細書に開示するもののうちの2つ以上)の共培養物であってもよく、全血のもののように天然で共に存在する細胞型の混合物であってもよい。
.1、0.5、1、2、3、4、5、0.1〜5cm、1〜10、1〜100、または1〜1000cmである。
ラットフォームは、スループットが高く、外因性物質または場からの独立しており、かつ細胞生存率が高いという利点を有する。膜破壊に基づく送達プラットフォームの例は、2014年9月25日に公開された米国特許公開第2014/0287509号に記載されており、その全体の内容が参照により本明細書に明示的に援用される。しかしながら、電場と組み合わせることにより、プラスミドDNAの送達に応答した遺伝子発現を誘導することが可能になる。本主題は、任意の細胞型に任意の機能的標的分子を送達することができる細胞内送達技術及びプラットフォームを包含する。
着することができる。次いで、これらの2つのウェーハを、例えば、陽極または別の接合手段を介して互いに接合し、マイクロ流体チャネルを封止することができる。いくつかの例では、電極は、上部(例えばガラス)プレート/ウェーハに配置される(すなわち、下部(シリコンウェーハ)に存在しない;あるいは、電極は下部プレート上に配置される(上部プレート/ウェーハに存在しない)。いくつかの実施形態では、電極は、装置の両側、例えば上部及び下部プレートもしくはウェーハの表面または内部に配置される。図2中の水平線は、ネガティブパッドまたはポジティブパッドのいずれかに接続する電極を示している(図中の長方形)。本構成では、ガラスウェーハ内に配置された電極の下で、細胞が左から右に流れる。各細胞を電場に確実に曝露するために、電極構成内のある位置(例えば、電極のグレー部分)において、電極をずらす。例えば、図2に示すように、そのずれは約1〜90°、例えば20〜80°、例えば約45°の角度のものである。このようにして、マイクロ流体装置を一直線に流れる細胞は、マイクロ流体チャネルの全長にわたって横断する少なくともわずかな間、電場に曝される。
ることにより、1つの過程または装置の通過時に、比較的大きな分子及び小さな分子の両方を細胞内に効果的に送達する。例えば、本システムは、遺伝子産物をコードする核酸、例えばプラスミドDNAを細胞及び核に送達して、送達した遺伝子の発現を達成するのに特に有用である。例えば、細胞変形狭窄部を通過した後の電場への細胞の曝露は、プラスミドの核内進入を容易にする。本アプローチはまた、タンパク質及び核酸などの様々な物質の同時送達を可能にすることもできる。細胞変形要素は、外膜の破壊を促進して細胞質タンパク質の送達を促進し、電場は潜在的な核破壊を容易にして、細胞への電気泳動的な物質流入を可能にする。
別段定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、当業者に一般的に理解されているもの(例えば、細胞培養、分子遺伝学、及び生化学において)と同じ意味を有するものと解釈するべきである。
胞内で複製することもできる。発現ベクターは、原核生物用または真核生物用のいずれであることができ、そして一般的にはプラスミドである。本発明の発現ベクターは、本発明の宿主細胞、例えば、本明細書に記載する原核細胞または真核細胞の1つ、例えば、グラム陽性、グラム陰性、病原性、非病原性、共生生物、球菌、桿菌、もしくは螺旋状の細菌細胞;古細菌細胞;または原生動物、藻類、真菌、酵母、植物、動物、脊椎動物、無脊椎動物、節足動物、哺乳類、げっ歯類、霊長類、もしくはヒト細胞で機能する(遺伝子発現を導く)任意のベクターを含む。本発明の発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、及び宿主細胞と適合性を有しかつポリヌクレオチドの発現を制御する他の調節配列などを含む。特に、本発明の発現ベクターは、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、及び終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター及びリプレッサー配列などの転写開始を制御するものである。適切な転写制御配列には、本発明の細胞の少なくとも1種において機能し得る任意の転写制御配列が含まれる。種々のこのような転写制御配列が、当業者に公知である。好ましい実施形態では、本方法は、核酸分子または構築物を送達するためにアデノウイルスのようなウイルスベクターの使用を含まない。
ミトコンドリア病は、機能不全のミトコンドリアに起因する。ミトコンドリア病は、例えば、ミトコンドリアDNA(mtDNA)またはミトコンドリア成分をコードする核遺伝子における後天性または先天性の変異によって生じ得る。疾患は、薬物、感染症、または他の環境的要因の副作用による後天性ミトコンドリア機能不全に起因し得る。ミトコンドリア病の例として、ミトコンドリア筋症;糖尿病性腎症;糖尿病及び難聴(DAD)のいくつかの形態;レーバー遺伝性視神経萎縮症(LHON);リー症候群;神経障害、運動失調、網膜色素変性症、及び眼瞼下垂(NARP);筋神経胃腸脳症(MNGIE);赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群(MERRF);ミトコンドリア筋症、脳筋症、乳酸アシドーシス、脳卒中様症状(MELAS);ならびにミトコンドリア神経胃腸管脳筋症(MNGIE)が挙げられる。
本発明の態様は、標準的なまたは以前に記載した電気穿孔法のパラメータと比較して、より低い電場強度の使用、またはより短時間の電場への曝露に関する。電気穿孔法のパラメータは、多数の細胞型について報告されている。例えば、www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/transfection---selection-misc/neon-transfection-system/neon-protocols-cell-line-data.htmlで入手可能なNeon(登録商標)形質移入システムに関する情報参照を参照されたい。また、Kim et al.,(2008) Biosens Bioelectron,23(9):1353‐1360参照も参照されたい。この全内容が参照により本明細書中に援用される。例えば、Neon(登録商標)形質移入システムは、0.3〜1kv/cmの電場を5ms〜50msのパルス持続時間で使用してもよい。Neon(登録商標)形質移入システムの電気穿孔法パラメータの例を、以下の表にも提供する。
DFEは、標準的または以前に開示した電気穿孔法システムと比較して、核酸のより効率
的かつ迅速な送達(及びその後の機能、例えばコードされた遺伝子産物の発現)を、高い細胞生存率でもたらす。本発明は、電場のようなエネルギー場が、細胞変形狭窄部によって生じる細胞膜内の摂動を介してペイロードを輸送するか、ペイロードを細胞内のある位置から別の位置へ、例えば、細胞膜の近傍から1つ以上の細胞小器官へ輸送する方法、システム、及び装置を提供する。いくつかの例示的な実装形態は電場を用いるが、一方で他の輸送機構が有用である。輸送機構として、例えば1つ以上の電場、磁場、及び音場を利用してもよい。
低いかまたは高い場合がある。周波数の非限定的な例として、10KHz〜10MHzが挙げられる。
癌特異的抗原を認識するキメラ抗原受容体(CAR)を発現するようにT細胞を改変することにより、免疫検出を免れた腫瘍細胞を認識させて死滅させることができる。本プロセスは、患者のT細胞を抽出し、それらにCARの遺伝子を形質移入し、その後、形質移入した細胞を患者に再注入することを含む。
本発明の態様は、細胞膜内に摂動を引き起こすためのマイクロ流体システムを提供し、該システムは、管腔を画定するとともに、緩衝液中に懸濁した細胞が管腔を通過できるように構成されたマイクロ流体チャネルを備え、マイクロ流体チャネルは細胞変形狭窄部を有し、狭窄部の直径は細胞の直径の関数であり、かつ該システムは、(a)エネルギー場;または(b)該狭窄部の下流、上流、もしくは上流及び下流に位置するエネルギー場のソースもしくはエミッタを有する。
、40、45、50、55、60、70、80、90、1〜10、1〜20、1〜30、1〜45、または1〜90°ずらして配置する。
狭窄部を有する。いくつかの実施形態では、該マイクロ流体チャネルは、単一の細胞変形狭窄部を有する。いくつかの実施形態では、細胞は複数の細胞であり、電場通過後に、約80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、90〜95、または80〜100%の細胞が生存可能である。いくつかの実施形態では、電場の強度またはパルス強度は、約10〜2000kV/m、または100kV/m未満である。いくつかの実施形態では、電場を、約0.1、0.1〜2、または0.1〜2000msの持続期間、1〜20、0.1〜2000、または1〜200msの周期でパルスする。いくつかの実施形態では、細胞は、約100、170、300、100〜300、200〜700、250〜400、100〜1000mm/s、または1〜1000mm/sの速度で電場を通過する。いくつかの実施形態では、細胞膜の摂動は、約1〜20、1〜600、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、または600nmの最大直径を有する。いくつかの実施形態では、約1〜20、1〜600、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、または600nmの最大直径を有する細胞膜の摂動が、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または1〜10分間、細胞膜内で持続する。
こすこと;発現ベクターを細胞内に輸送するために、少なくとも1つの電極によって生成された電場に溶液を通すことを含み、この場合、細胞変形狭窄部を通過することなく電場を通過した細胞における発現に比べて、導入遺伝子は、細胞内で、より広範囲に発現する。
遺伝子を高レベルで発現する細胞の割合よりも大きい。
DNA形質移入のための多くの技術が開発されている。リポフェクションのような担体に基づく方法は、担体と細胞膜との相互作用、及び生物学的に活性なプロセスであるDNAの細胞内輸送に大きく依存する。マイクロインジェクションは、転写のためにDNAを核に直接送達するために使用されてきたが、スループットにより制限される。電気穿孔法はDNA形質移入に広く使用されているが、そのメカニズムに依然として議論の余地があり、また電気パルス後の原形質膜から核への能動的DNA輸送に依存する点でも制限がある。ここでは、破壊及び場による送達(DFE;本用語は本実施例の実施形態に限定されない)と名付けた細胞内送達の概念を説明する。DFEでは、まず破壊によって原形質膜内の摂動部が開き、次いでこれらの間隙を介した細胞質及び核へのDNA送達が可能になる。本戦略は、機械的破壊と電場との組合せに関し、GFPプラスミドDNAのような積荷分子またはその混合物を核に直接送達し、処理後1時間以内に発現させるものであり、これは電気穿孔法のような他の方法よりも迅速である。この新規戦略は、形質移入が困難な細胞に対する細胞内遺伝子送達、及び広範な物質の同時送達に有用である。
(2012))。物理的方法は、主に、マイクロインジェクション、電気穿孔法、レーザーポレーション、及び微粒子銃を含む遺伝子送達用の膜破壊技術を用いる(O’Brien&Lummis,Nature Protoc.1,977‐981(2006);Wells,D.J.Gene Ther.11,1363‐1369(2004);Meacham et al.,J.Lab.Autom.19,1‐18(2014);Capecchi,Cell 22,479‐488(1980);Nagy et al.,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual(Cold Spring Laboratory,2003))。裸の核酸の細胞への送達は、細胞形質移入のための最も安全かつ最も頑強なアプローチである可能性が高い(Wolff&Budker,Advances in Genetics,54,3‐20(2005))。裸の遺伝物質を送達することができる物理的方法の中でも、電気穿孔法は、単純性、適度に良好な効率、及び特定の困難な初代細胞に対処する能力ゆえに、これまでで最も普及している方法である(Neumann et al.,EMBO J.1,841‐845(1982))。1980年代初頭の最初の報告以来、電気浸透法としても知られている電気穿孔法は、生物学的及び医学的応用における多くの異なる細胞に対する核酸の細胞内送達に広く用いられてきた。電気穿孔法はその利点を実証し、DNA形質移入に広く使用されているが、その基礎となる送達機構は完全には理解されていない(Escoffre et al.,Mol.Biotechnol.41,286‐95(2009);Vasilkoski et al.,Phys.Rev.E 74,021904(2006);Klenchin et al.,Electrically induced DNA uptake by cells
is a fast process involving DNA electrophoresis.60,(1991);Weaver et al.,Bioelectrochemistry 87,236‐43(2012);Jordan et al.(Eds.)(2013) Electroporation and electrofusion in cell biology. Springer Science&Business Media)。電気穿孔プロセスでは、DNA分子が電気パルス中に蓄積して、電気透過性の原形質膜と相互作用することが広く認められている。その後、これらのDNA凝集体は細胞質に内在化し、続いて遺伝子発現を引き起こす(Golzio et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.99,1292‐1297(2002);Paganin‐Gioanni et al. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,10443‐7(2011);Rosazza et al.Mol.Ther.21,2217‐2226(2013);Boukany et al.,Nat.Nanotechnol.6,747‐54(2011);Teissie et al.,Biochim.Biophys.Acta 1724,270‐80(2005);Yarmush et al.,Annu.Rev.Biomed.Eng.16,295‐320(2014);Geng&Lu,Lab
Chip 13,3803‐21(2013))。DNAプラスミドが、単に拡散によって粘性で密集した細胞質を通り抜けて核に到達する可能性は低い(Lechardeur et al.,Adv.Drug Deliv.Rev.57,755‐767(2005);Dowty et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92,4572‐4576(1995))。いくつかの研究は、原形質膜から核へのDNAの輸送が、微小管及びアクチンネットワークなどを介するものなどの細胞骨格輸送による能動的な生物学的プロセスであることを示している(Rosazza et al.Mol.Ther.21,2217‐2226(2013))。微小管及びアクチンネットワークは、細胞質内のDNA輸送において重要な役割を果たし、このようなプロセスの時間スケールは、細胞型に応じて長時間になり得ることが見出されている。原形質膜と核との間のDNA輸送の不明確なメカニズム及び複雑な性質は、形質移入が困難な細胞に対する電気穿孔法のさらなる適用及び改善を妨げる。さらに、現行の電気穿孔法で使用する強力な電場は、深刻な損傷または細胞死を招く場合がある(Yarmush et
al.,Annu.Rev.Biomed.Eng.16,295‐320(2014);Geng&Lu,Lab Chip 13,3803‐21(2013))が、本明細書に記載するDFEによってこの問題は回避される。この点において、明確に定義されていない輸送経路に頼ることなく、裸のDNAを核に直接移送できる技術の開発には、大きな関心が寄せられている。従来の方法またはアプローチは、技術的に複雑であることが多く、スループットが比較的低く、特定の一次細胞に対する適合性がない。
本明細書において、破壊及び場による送達(DFE)の概念の展開例を開示する。本アプローチでは、まず機械的プロセスによって細胞膜を破壊した後に、細胞を場に曝露して物質を標的細胞に輸送する。ハイスループットでDNAを細胞の核に直接送達することができるマイクロ流体装置が開発されている。DFE概念の1つの実装形態は、細胞圧搾を用いて細胞膜を一時的に破壊した後に細胞を電場に曝露し、それにより、例えば核膜またはミトコンドリア膜などの膜破壊を介して負に荷電しているDNAを輸送し、かつカート(carto)を細胞の細胞質ゾルへ送達した後に細胞核内へ輸送することを含む。CellSqueeze技術は、様々な細胞型にわたって多様な物質を送達する頑強な能力を実証したが、単独ではDNAの核送達を促進するには効果的ではない(Shalek et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107,1870‐5(2010))。DNA分子が原形質膜に向かって電気泳動的に移動して原形質膜上に凝集する電気穿孔法とは異なり、DFEプロセスでは、DNA分子は、機械的破壊によって生じる細胞膜内の摂動または間隙を介して細胞内へかつ/または細胞内部において移動する。例えば、図9A参照。本組合せプロセス(DFE)は、積荷、例えば荷電化合物、例えばDNAの、細胞質ゾル及び細胞下構造への送達において相乗効果をもたらす。相乗効果は、送達する積荷の機能、例えば、送達するDNAによる遺伝子発現を測定することによって実証される。
びモデルカーゴを使用して多数の実験を行い、本DFE技術の性能を特徴付けた。HeLa細胞とGFPプラスミドDNAとの混合物を異なるパルス振幅を用いてDFE装置で処理した。次いで、細胞を37Cで24時間インキュベートした。フローサイトメトリーを用いてGFP蛍光を測定することによりDNA発現を特徴付けた。本実験ではDFE10‐6装置を使用した。DFE10‐6とは、DFE装置の狭窄部寸法を示しており、第一の数字は狭窄部の長さに対応し、第二の数字は幅(ミクロン単位)に対応する。機械的破壊の性能に影響を及ぼす2つの支配的パラメータとして、細胞速度及び狭窄部寸法が挙げられ、電場の性能を支配する3つのパラメータは、電気パルスプロファイル、強度、及びパルス数である(チャネル内の細胞速度に依存する)。最初に、パルス強度がDNA形質移入にどのように影響するかを調べた。DFE10‐6処理では、適用する振幅をそれぞれ8V及び10Vに増加した場合、図10Aの赤色のカラムに示すように、細胞形質移入率は60%及び90%を上回る。対照群として、細胞は、同等の電場及び細胞速度を有するが、狭窄構造(本実験では、圧力ではなく速度を制御した)を有しない装置を用いて処理した。細胞を電場にのみ供して機械的破壊には供さないような設計においては、印加する振幅を14Vに増加した後、DNA形質移入効率は60%に達する。図10Bに示すように、両方の場合で、同等の細胞生存率を共有しており、これは、より低い電場強度で、機械的破壊がDNA送達を劇的に増強しながら、細胞にはほとんど損傷をもたらさないことを示している。原形質膜の機械的破壊は、その後の電気的形質移入プロセスを促進する。
胞の蛍光画像を図15に示す。DFEの機構をよりよく理解するために、図16に示すように、HeLa細胞内で発現したGFPの蛍光強度を統計的に比較した。BEPでは、核への移動及びその後の転写には多くの時間が必要であり、GFP蛍光は24時間にわたって増加していた。形質移入した細胞の大部分の蛍光強度は、処理直後に増加し始め、6時間以内に飽和した。このことは、DNAを核内に送達した場合と同等の開始時点からDNA転写が起きていたことを示している。
いては議論が進行中である。電気パルスが細胞膜を透過性にし、電気泳動が核に直接DNAを輸送すると考えている者もいれば、一方でDNAが原形質膜の電気透過性領域で凝集体を形成し、次いで生物学的に能動的なプロセスを介して核に移動すると述べる者もいる。本実施例に記載するBEPの結果では、形質移入した細胞の20%が最初の1時間以内にGFPを発現し、80%が次の20時間にわたって発現する。これは、前述のメカニズムの両方がBEPで起きたことを示している可能性がある。処理直後にGFPを発現する細胞のごく一部は、DNAの核への電気泳動を直接行うことができるが、その一方で4時間後にGFPを発現する細胞の大半は、発現のために、リポフェクションのように、DNAを核に輸送する必要がある。
シリコンウェーハをPyrexウェーハに結合させて、DFEマイクロ流体装置を形成した。下記の2つの主要な工程、すなわち(1)シリコンウェーハ上へのマイクロ流体チャネルの製造、及び(2)Pyrexウェーハ上へのマイクロ流体電極の製造が製造に関与していた。入口及び出口リザーバを備えたホルダに装置を取り付けた。発振器(Agilent E4422B)から電気パルスを発生させ、増幅器を介して増幅し、導電性エポキシを用いて電極パッドに結合したワイヤを介して装置を駆動した。所望の送達物質(積荷化合物または組成物)と混合した細胞の溶液を、入口リザーバ内に配置する。次いでこのリザーバを、調整器によって制御される圧縮空気ラインに接続する。圧力(0〜20psi)を利用して流体を輸送して装置に通過させるとともに、細胞が通過する際に装置に電気パルスを印加する。出口リザーバから細胞を回収してさらに処理する。
6×23mm2の寸法を有する別々のチップにダイシングした。最終的な装置を図9Bに示す。セットアップに使用する装置の電極フィンガー部の幅及び間隙空間は、それぞれ、40μm及び60μmである。シリコン基板内のマイクロ流体チャネルの高さは20μmである。
本明細書に記載する主題は、所望の構成に応じて、システム、装置、方法、及び/または物品に具体化することができる。上記の説明の実装形態は、本明細書に記載する主題に合致する全ての実装形態を表すものではない。代わりに、それらは、記載する主題に関連する態様に合致する単なるいくつかの例に過ぎない。いくつかの変形例を上記で詳細に説明したが、他の修正または追加が実行可能である。特に、本明細書に記載したものに加えて、さらなる特徴及び/または変形を提供することができる。例えば、上記の実装形態は、開示した特徴の様々な組合せ及び部分的組合せ、ならびに/または上記のいくつかのさらなる特徴の組合せ及び部分的組合せを対象とすることができる。さらに、添付の図面に示し、かつ/または本明細書に記載した論理フローは、望ましい結果を達成するために、示した特定の順序または連続的順序を必ずしも必要としない。他の実装形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内であり得る。
Claims (1)
- 細胞膜に摂動を引き起こすためのマイクロ流体システムであって、
管腔を画定するとともに、緩衝液中に懸濁した細胞が前記管腔を通過できるように構成されたマイクロ流体チャネルであって、細胞変形狭窄部を有し、前記狭窄部の直径が細胞の直径の関数である、前記マイクロ流体チャネル、
(a)エネルギー場、または、
(b)前記狭窄部の下流、上流、または上流及び下流に位置するエネルギー場のソースまたはエミッタ、
を備える、前記マイクロ流体システム。
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