JP2020191880A - ガイドｒｎａのペアを使用したターゲティングによる遺伝子改変の方法及び組成物 - Google Patents

ガイドｒｎａのペアを使用したターゲティングによる遺伝子改変の方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】胞内のゲノムにターゲティングによる両対立遺伝子改変を生成及び促進するための組成物及び方法、並びに、改変されたゲノムを有する非ヒト動物を作成するための組成物及び方法を提供すること。【解決手段】ある対立遺伝子についてヘテロ接合型である細胞内のゲノムをその対立遺伝子についてホモ接合型となるように改変するための組成物及び方法も提供される。これらの方法は、Ｃａｓタンパク質、及び同じゲノム遺伝子座内の異なる位置を標的とする２種類以上のガイドＲＮＡを利用したものである。改変されたゲノムを有する細胞を同定するための方法も提供される。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年１１月１２日出願の米国特許出願第６２／０８３，００５号、２０１５年６月１９日出願の米国特許出願第６２／１８２，３１４号、及び２０１５年８月２８日出願の米国特許出願第６２／２１１，４２１号の利益を主張するものであり、これらの出願のそれぞれをその全容にわたってすべての目的で本明細書に参照により援用するものである。
配列表の参照はＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でテキストファイルとして提出されている。
４７２２２５ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔのファイルに記載の配列表は３２．７ｋｂであり、２０１５年１１月２０日に作成されたものであり、本明細書に参照によって援用する。
様々なゲノム遺伝子座のターゲティングは進歩を遂げてきたものの、依然として効率的にターゲティングできないゲノム遺伝子座、又は従来のターゲティング手法では適切に又は効率的に実現できないゲノム改変が数多く存在している。例えば、特に真核細胞及び真核生物において、ターゲティングによる大きなゲノムの欠失又はターゲティングによる他の大きな遺伝子改変を生じさせようとする場合には困難が生じる。
特に、従来のターゲティング手法を用いた場合、ターゲティングによる大きなゲノムの欠失又は他のゲノム改変についてホモ接合型又は複合ヘテロ接合型（例えばヘミ接合型）である細胞又は動物を効率的に作成することは困難である。例えば、ターゲティングによる大きなゲノムの欠失についてヘテロ接合型であるＦ０世代のマウスは従来のターゲティング手法によって得ることができるが、この欠失についてホモ接合型であるＦ２世代を作成するにはこれらのヘテロ接合型のマウスを続いて交配させる必要がある。これらの更なる交配ステップはコストが嵩み、時間がかかるものである。
細胞内のゲノムを改変するための方法及び組成物が提供される。一態様では、本発明は、細胞内のゲノムに改変を行うための方法であって、前記ゲノムを、（ａ）第１のＣａｓタンパク質、（ｂ）ゲノム標的遺伝子座内の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、（ｃ）前記ゲノム標的遺伝子座内の第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、（ｄ）ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び（ｅ）細胞が１細胞期胚である場合にターゲティングベクターの長さは５ｋｂ以下であるものとして、５’標的配列にハイブリダイズする５’ホモロジーアームと３’標的配列にハイブリダイズする３’ホモロジーアームとを隣接させた核酸インサートを含むターゲティングベクター、と接触させることを含み、前記ゲノムが、前記ゲノム標的遺伝子座を含む第１及び第２の相同染色体のペアを含み、前記第１のＣａｓタンパク質が前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも１つの二本鎖切断を生ずる、方法を提供する。一態様では、本発明は、細胞内のゲノムに両対立遺伝子改変を行うための方法であって、前記ゲノムを、（ａ）第１のＣａｓタンパク質、（ｂ）ゲノム標的遺伝子座内の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、（ｃ）前記ゲノム標的遺伝子座内の第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、（ｄ）ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び（ｅ）細胞が１細胞期胚である場合にターゲティングベクターの長さは５ｋｂ以下であるものとして、５’標的配列にハイブリダイズする５’ホモロジーアームと３’標的配列にハイブリダイズする３’ホモロジーアームとを隣接させた核酸インサートを含むターゲティングベクター、と接触させることを含み、前記ゲノムが、前記ゲノム標的遺伝子座を含む第１及び第２の相同染色体のペアを含み、前記第１のＣａｓタンパク質が前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも１つの二本鎖切断を生ずる、方法を提供する。
方法は、前記改変されたゲノムを有する細胞を同定することを更に含むことができる。特定の方法では、前記核酸インサートが、第１の標的配列にハイブリダイズする第１のホモロジーアームに隣接した選択カセットを含み前記第１のホモロジーアームが前記５’ホモロジーアームであり、かつ前記第１の標的配列が前記５’標的配列であるか、又は前記第１のホモロジーアームが前記３’ホモロジーアームであり、かつ前記第１の標的配列が前記３’標的配列であり、前記同定することが、（ａ）前記細胞からＤＮＡを得ることと、（ｂ）前記細胞の前記ＤＮＡを、前記第１の標的配列内に結合するプローブ、前記核酸インサート内に結合するプローブ、及び既知のコピー数を有する参照遺伝子内に結合するプローブに曝露することであって、各プローブは結合する際に検出可能なシグナルを発生する、ことと、（ｃ）前記プローブのそれぞれの結合からのシグナルを検出することと、（ｄ）前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第１の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第１の標的配列のコピー数を決定し、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサートのコピー数を決定することと、を含み、前記核酸インサートのコピー数が１又は２であり、前記第１の標的配列のコピー数が２である場合には、前記ゲノム標的遺伝子座への前記核酸インサートのターゲティングによる挿入を示し、前記核酸インサートのコピー数が１以上であり、前記第１の標的配列のコピー数が３以上である場合には、前記ゲノム標的遺伝子座以外のゲノム遺伝子座への前記核酸インサートのランダムな挿入を示す。
特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質は、前記第１及び第２の相同染色体のそれぞれの前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して前記第１及び第２の相同染色体のそれぞれに少なくとも１つの二本鎖切断を生ずる。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質は、前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも２つの二本鎖切断を生じる。
特定の方法は、前記ゲノムを、前記ゲノム標的遺伝子座内の第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ゲノム標的遺伝子座内の第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡと接触させることを更に含む。場合により、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、又は約９０ｋｂ〜約１００ｋｂだけ離れている。場合により、前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、又は約９０ｋｂ〜約１００ｋｂだけ離れている。場合により、前記第１及び第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第１のペアであり、前記第２及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第２のペアであり、前記第１のペアと前記第２のペアとは、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂ、約３Ｍｂ〜約４Ｍｂ、約４Ｍｂ〜約５Ｍｂ、約５Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂだけ離れている。
特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質は、前記第１、第２、第３、及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列のうちの少なくとも２つを切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも２つの二本鎖切断を生ずる。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質は、前記第１、第２、第３、及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列のうちの少なくとも２つを切断して前記第１及び第２の相同染色体の両方に少なくとも２つの二本鎖切断を生ずる。
特定の方法では、前記核酸インサートは、前記５’標的配列と前記３’標的配列との間に挿入される。場合により、前記５’及び３’標的配列は、前記ゲノム標的遺伝子座内にある。場合により、前記細胞は１細胞期胚ではなく、前記ターゲティングベクターは少なくとも１０ｋｂのラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）である。
特定の方法では、前記ゲノムを前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの両方と接触させることにより、前記ゲノムを第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡのいずれか単独と接触させる場合と比較して両対立遺伝子改変の効率が高くなる。特定の方法では、前記細胞は二倍体であり、前記両対立遺伝子改変によって前記ゲノム標的遺伝子座にホモ接合性、又は複合ヘテロ接合性が生じる。場合により、複合ヘテロ接合性はヘミ接合性である。特定の方法では、前記両対立遺伝子改変は、前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失を含む。特定の方法では、前記両対立遺伝子改変は、前記第１及び第２の相同染色体の両方の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失を含む。特定の方法では、前記両対立遺伝子改変は、前記第１及び第２の相同染色体の両方の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への核酸インサートの挿入を更に含む。特定の方法では、前記両対立遺伝子改変は、（１）前記第１及び第２の相同染色体の両方の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失、及び（２）前記第２の相同染色体ではなく、前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入を含む特定の方法では、前記両対立遺伝子改変は、（１）前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失、及び（２）前記第２の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の遺伝子座の破壊を含む。特定の方法では、前記両対立遺伝子改変は、（１）前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失、（２）前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への核酸インサートの挿入、及び（３）前記第２の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間の遺伝子座の破壊を含む。特定の方法では、前記両対立遺伝子改変は、（１）前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失、及び（２）前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入を含み、前記核酸インサート配列は、前記欠失される配列とホモロガスであるか又はオルソロガスである。
特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ認識配列とは、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂだけ離れている。特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂだけ離れている。特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、又は約９００ｂｐ〜約１ｋｂだけ離れている。特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、２５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、１５０ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、２５０ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、３５０ｂｐ未満、４００ｂｐ未満、４５０ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、６００ｂｐ未満、７００ｂｐ未満、８００ｂｐ未満、９００ｂｐ未満、１ｋｂ未満、２ｋｂ未満、３ｋｂ未満、４ｋｂ未満、５ｋｂ未満、又は１０ｋｂ未満だけ離れている。
特定の方法では、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列はそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、又は少なくとも１００ｋｂに位置している。特定の方法では、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列はそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、又は約５０ｋｂ〜約１００ｋｂに位置している。特定の方法では、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列はそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、５０ｂｐより遠く、１００ｂｐより遠く、２００ｂｐより遠く、３００ｂｐより遠く、４００ｂｐより遠く、５００ｂｐより遠く、６００ｂｐより遠く、７００ｂｐより遠く、８００ｂｐより遠く、９００ｂｐより遠く、１ｋｂより遠く、２ｋｂより遠く、３ｋｂより遠く、４ｋｂより遠く、５ｋｂより遠く、６ｋｂより遠く、７ｋｂより遠く、８ｋｂより遠く、９ｋｂより遠く、１０ｋｂより遠く、２０ｋｂより遠く、３０ｋｂより遠く、４０ｋｂより遠く、５０ｋｂより遠く、６０ｋｂより遠く、７０ｋｂより遠く、８０ｋｂより遠く、９０ｋｂより遠く、又は１００ｋｂより遠くに位置している。
特定の方法では、欠失される核酸は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂである。特定の方法では、前記欠失される核酸は、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂである。場合により、前記欠失される核酸は、少なくとも５５０ｋｂ、少なくとも６００ｋｂ、少なくとも６５０ｋｂ、少なくとも７００ｋｂ、少なくとも７５０ｋｂ、少なくとも８００ｋｂ、少なくとも８５０ｋｂ、少なくとも９００ｋｂ、少なくとも９５０ｋｂ、少なくとも１Ｍｂ、少なくとも１．５Ｍｂ、又は少なくとも２Ｍｂである。
特定の方法では、前記ターゲティングベクターは直鎖状の形態である。場合により、前記ターゲティングベクターは一本鎖又は二本鎖である。特定の方法では、前記細胞は１細胞期胚ではなく、前記ターゲティングベクターは少なくとも１０ｋｂのラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）である。特定の方法では、前記細胞は１細胞期胚ではなく、前記ターゲティングベクターはラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び３’ホモロジーアームの合計は少なくとも１０ｋｂである。場合により、前記ＬＴＶＥＣは、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、又は約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂである。場合により、前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂである。
特定の方法では、前記細胞は真核細胞である。場合により、前記真核細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、及びラット細胞である。場合により、前記真核細胞は、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、げっ歯類多能性細胞、マウス多能性細胞、ラット多能性細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラットＥＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発生的に制限されたヒト前駆細胞、又はヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。場合により、前記真核細胞は１細胞期胚である。場合により、前記真核細胞は１細胞期胚であり、前記ターゲティングベクターの長さは約５０ヌクレオチド〜約５ｋｂである。場合により、前記真核細胞は１細胞期胚であり、前記ターゲティングベクターは一本鎖ＤＮＡであり、その長さは約６０〜約２００ヌクレオチドである。
特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質はＣａｓ９である。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に対してヌクレアーゼ活性を有する。
特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質はニッカーゼである。特定の方法は、前記ゲノムを、（ｆ）ニッカーゼである第２のＣａｓタンパク質、（ｇ）第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び（ｈ）第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、と接触させることを更に含み、前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第１の鎖を切断し、前記第２のＣａｓタンパク質が、前記第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内及び前記第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第２の鎖を切断する。
特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとは互いに第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）として融合され、かつ／又は前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとが互いに第２のｇＲＮＡとして融合される。特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとは別々のＲＮＡ分子であり、かつ／又は前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとは別々のＲＮＡ分子である。
特定の方法では、前記接触させることは、前記第１のＣａｓタンパク質、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを前記細胞に導入することを含む。特定の方法では、（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質は、タンパク質、前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、若しくは前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入され、（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入され、（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で細胞に導入され、かつ／又は（ｄ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入される。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、第１のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入され、かつ／又は前記第１のＣａｓタンパク質、前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、第２のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入される。特定の方法では、（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡは、第１の発現コンストラクト内の第１のプロモーターと機能的に連結され、（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡは、第２の発現コンストラクト内の第２のプロモーターと機能的に連結され、（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡは、第３の発現コンストラクト内の第３のプロモーターと機能的に連結され、かつ／又は（ｄ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡは、第４の発現コンストラクト内の第４のプロモーターと機能的に連結されており、前記第１、第２、第３、及び第４のプロモーターは前記細胞内で活性である。場合により、前記第１、第２、第３、及び／又は第４の発現コンストラクトは、１個の核酸分子の構成要素である。特定の方法では、（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡは、第１の発現コンストラクト内の第１のプロモーターと機能的に連結され、（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡとは、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡに互いに融合されるとともに第２の発現コンストラクト内の第２のプロモーターと機能的に連結され、かつ／又は、（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡとは、第２のｇＲＮＡをコードするＤＮＡに互いに融合されるとともに第３の発現コンストラクト内の第３のプロモーターと機能的に連結されており、前記第１、第２、及び第３のプロモーターは前記細胞内で活性である。場合により、前記第１、第２、及び／又は第３の発現コンストラクトは、１個の核酸分子の構成要素である。
特定の方法では、前記細胞は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）を低下させるか、かつ／又は遺伝子変換若しくは相同組換え型修復（ＨＤＲ）を増大させるように改変されている。場合により、前記細胞は、ＤＮＡ−ＰＫの発現若しくは活性を低下させるか、かつ／又はＰＡＲＰ１の発現若しくは活性を低下させるように改変されている。場合により、細胞はリガーゼＩＶの発現又は活性を低下させるように改変されている。場合により、前記発現又は活性の低下は、誘導性、可逆性、時間特異的、及び／又は空間特異的である。
特定の方法では、（１）前記細胞は１細胞期胚ではなく、前記ターゲティングベクターはラージターゲティングベクターであり、前記５’及び３’ホモロジーアームの合計は少なくとも１０ｋｂであり、（２）前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列はそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、２００ｂｐより遠く、３００ｂｐより遠く、４００ｂｐより遠く、５００ｂｐより遠く、６００ｂｐより遠く、７００ｂｐより遠く、８００ｂｐより遠く、９００ｂｐより遠く、１ｋｂより遠く、２ｋｂより遠く、３ｋｂより遠く、４ｋｂより遠く、５ｋｂより遠く、６ｋｂより遠く、７ｋｂより遠く、８ｋｂより遠く、９ｋｂより遠く、１０ｋｂより遠く、２０ｋｂより遠く、３０ｋｂより遠く、４０ｋｂより遠く、５０ｋｂより遠く、６０ｋｂより遠く、７０ｋｂより遠く、８０ｋｂより遠く、９０ｋｂより遠く、若しくは１００ｋｂより遠くに位置しており、前記第１のＣａｓタンパク質は、前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも２つの二本鎖切断を生じ、前記両対立遺伝子改変は、前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失、及び前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入を含み、前記核酸インサート配列は、前記欠失される配列とホモロガスであるか又はオルソロガスである。
本発明はまた、Ｆ０世代の非ヒト動物を作成するための方法であって、（ａ）上記の方法のいずれかによって作成された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト宿主胚に導入することと、（ｂ）前記非ヒト宿主胚を代理母に懐胎させることと、を含み、前記代理母が、前記両対立遺伝子改変を有するＦ０世代の非ヒト動物を作る、方法を提供する。特定の方法は、（ａ）非ヒトＥＳ細胞のゲノムを、（ｉ）第１のＣａｓタンパク質、（ｉｉ）ゲノム標的遺伝子座内の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、（ｉｉｉ）前記ゲノム標的遺伝子座内の第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、（ｉｖ）ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び（ｖ）５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームを隣接させた核酸インサートを含むターゲティングベクターと接触させることであって、前記ゲノムが、前記ゲノム標的遺伝子座を含む第１及び第２の相同染色体のペアを含み、前記第１のＣａｓタンパク質が前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも１つの二本鎖切断を生ずる、ことと、（ｂ）前記両対立遺伝子改変を有する非ヒトＥＳ細胞を同定することと、（ｃ）前記両対立遺伝子改変を有する前記非ヒトＥＳ細胞を非ヒト宿主胚に導入することと、（ｄ）前記非ヒト宿主胚を代理母に懐胎させることと、を含み、前記代理母が、前記両対立遺伝子改変を有するＦ０世代の非ヒト動物を作る。
特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質は、前記第１及び第２の相同染色体のそれぞれの前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して前記第１及び第２の相同染色体のそれぞれに少なくとも１つの二本鎖切断を生ずる。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質は、前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも２つの二本鎖切断を生じる。
特定の方法では、前記非ヒト動物はマウスであり、前記非ヒトＥＳ細胞はマウスＥＳ細胞であり、前記非ヒト宿主胚はマウス宿主胚である。特定の方法では、前記非ヒト動物はラットであり、前記非ヒトＥＳ細胞はラットＥＳ細胞であり、前記非ヒト宿主胚はラット宿主胚である。
特定の方法では、前記両対立遺伝子改変によって前記ゲノム標的遺伝子座にホモ接合性、又は複合ヘテロ接合性が生じる。場合により、複合ヘテロ接合性はヘミ接合性である。
特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとは互いに第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）として融合され、かつ／又は前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとが互いに第２のｇＲＮＡとして融合される。特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとは別々のＲＮＡ分子であり、かつ／又は前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとは別々のＲＮＡ分子である。
特定の方法では、前記接触させることは、前記第１のＣａｓタンパク質、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを前記細胞に導入することを含む。特定の方法では、（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質は、タンパク質、前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、若しくは前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入され、（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入され、（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で細胞に導入され、かつ／又は（ｄ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入される。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、第１のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入され、かつ／又は前記第１のＣａｓタンパク質、前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、第２のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入される。特定の方法では、（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡは、第１の発現コンストラクト内の第１のプロモーターと機能的に連結され、（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡは、第２の発現コンストラクト内の第２のプロモーターと機能的に連結され、（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡは、第３の発現コンストラクト内の第３のプロモーターと機能的に連結され、かつ／又は（ｄ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡは、第４の発現コンストラクト内の第４のプロモーターと機能的に連結されており、前記第１、第２、第３、及び第４のプロモーターは前記細胞内で活性である。場合により、前記第１、第２、第３、及び／又は第４の発現コンストラクトは、１個の核酸分子の構成要素である。特定の方法では、（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡは、第１の発現コンストラクト内の第１のプロモーターと機能的に連結され、（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡとは、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡに互いに融合されるとともに第２の発現コンストラクト内の第２のプロモーターと機能的に連結され、かつ／又は、（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡとは、第２のｇＲＮＡをコードするＤＮＡに互いに融合されるとともに第３の発現コンストラクト内の第３のプロモーターと機能的に連結されており、前記第１、第２、及び第３のプロモーターは前記細胞内で活性である。場合により、前記第１、第２、及び／又は第３の発現コンストラクトは、１個の核酸分子の構成要素である。
特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質はＣａｓ９である。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に対してヌクレアーゼ活性を有する。
特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質はニッカーゼである。特定の方法は、前記ゲノムを、（ｆ）ニッカーゼである第２のＣａｓタンパク質、（ｇ）第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び（ｈ）第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、と接触させることを更に含み、前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第１の鎖を切断し、前記第２のＣａｓタンパク質が、前記第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内及び前記第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第２の鎖を切断する。
特定の方法では、前記細胞は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）を低下させるか、かつ／又は遺伝子変換若しくは相同組換え型修復（ＨＤＲ）を増大させるように改変されている。場合により、前記細胞は、ＤＮＡ−ＰＫの発現若しくは活性を低下させるか、かつ／又はＰＡＲＰ１の発現若しくは活性を低下させるように改変されている。場合により、細胞はリガーゼＩＶの発現又は活性を低下させるように改変されている。場合により、前記発現又は活性の低下は、誘導性、可逆性、時間特異的、及び／又は空間特異的である。
本発明はまた、Ｆ０世代の非ヒト動物を作成するための方法であって、上記の方法のいずれかによって作成された遺伝子改変された１細胞期胚を代理母に移植することを含み、前記代理母が、前記両対立遺伝子改変を有するＦ０世代の非ヒト動物を作る、方法を提供する。
本発明はまた、第１の対立遺伝子についてヘテロ接合型である細胞内のゲノムを改変するための方法であって、前記ゲノムを、（ａ）第１のＣａｓタンパク質、（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡ、（ｃ）前記第２の対立遺伝子内の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡであって、前記第１の対立遺伝子が第１の相同染色体上にあり、第２の対立遺伝子が第２の相同染色体上の対応する遺伝子座にある、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び（ｄ）前記第２の対立遺伝子内の第２のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、と接触させることを含み、前記第１のＣａｓタンパク質が前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断することで、少なくとも１つの二本鎖切断及び組換えを起こす末端配列を生じ、前記組換えが前記第１の対立遺伝子と前記第２の対立遺伝子との間で起こることで、前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型である改変されたゲノムを生じる、方法も提供する。特定の方法は、前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型である細胞を同定することを更に含む。
特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質は、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断する。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断することで、少なくとも２つの二本鎖切断及び組換えを起こす末端配列を生じる。特定の方法では、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は前記第２の対立遺伝子内に位置しており、前記第１の対立遺伝子には位置してない。特定の方法では、Ｃａｓタンパク質と第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとは天然に一緒に存在していないものである。
特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ認識配列とは、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂだけ離れている。特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂだけ離れている。特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、又は約９００ｂｐ〜約１ｋｂだけ離れている。特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、２５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、１５０ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、２５０ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、３５０ｂｐ未満、４００ｂｐ未満、４５０ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、６００ｂｐ未満、７００ｂｐ未満、８００ｂｐ未満、９００ｂｐ未満、１ｋｂ未満、２ｋｂ未満、３ｋｂ未満、４ｋｂ未満、５ｋｂ未満、又は１０ｋｂ未満だけ離れている。
特定の方法では、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子との間の配列の相違は、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂにわたる。特定の方法では、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子との間の配列の相違は、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂにわたる。
特定の方法では、前記第１の対立遺伝子はターゲティングによる改変を有し、前記第２の対立遺伝子は野生型対立遺伝子である。特定の方法では、前記第１の対立遺伝子は野生型対立遺伝子であり、前記第２の対立遺伝子は疾患原因突然変異を有する。
特定の方法では、前記組換えは遺伝子変換を含む。特定の方法では、前記組換えはヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む。
特定の方法では、前記細胞は真核細胞である。場合により、前記真核細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、又はラット細胞である。場合により、前記真核細胞は、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、げっ歯類多能性細胞、マウス多能性細胞、ラット多能性細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラットＥＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発生的に制限されたヒト前駆細胞、又はヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。
特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質はＣａｓ９である。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に対してヌクレアーゼ活性を有する。
特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質はニッカーゼである。特定の方法は、前記ゲノムを、（ｆ）ニッカーゼである第２のＣａｓタンパク質、（ｇ）第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び（ｈ）第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、と接触させることを更に含み、前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第１の鎖を切断し、前記第２のＣａｓタンパク質が、前記第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内及び前記第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第２の鎖を切断する。
特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとは互いに第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）として融合され、かつ／又は前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとが互いに第２のｇＲＮＡとして融合される。特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとは別々のＲＮＡ分子であり、かつ／又は前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとは別々のＲＮＡ分子である。
特定の方法では、前記接触させることは、前記第１のＣａｓタンパク質、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを前記細胞に導入することを含む。特定の方法では、（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質は、タンパク質、前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、若しくは前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入され、（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入され、（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で細胞に導入され、かつ／又は（ｄ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入される。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、第１のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入され、かつ／又は前記第１のＣａｓタンパク質、前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、第２のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入される。特定の方法では、（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡは、第１の発現コンストラクト内の第１のプロモーターと機能的に連結され、（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡは、第２の発現コンストラクト内の第２のプロモーターと機能的に連結され、（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡは、第３の発現コンストラクト内の第３のプロモーターと機能的に連結され、かつ／又は（ｄ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡは、第４の発現コンストラクト内の第４のプロモーターと機能的に連結されており、前記第１、第２、第３、及び第４のプロモーターは前記細胞内で活性である。場合により、前記第１、第２、第３、及び／又は第４の発現コンストラクトは、１個の核酸分子の構成要素である。特定の方法では、（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡは、第１の発現コンストラクト内の第１のプロモーターと機能的に連結され、（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡとは、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡに互いに融合されるとともに第２の発現コンストラクト内の第２のプロモーターと機能的に連結され、かつ／又は、（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡとは、第２のｇＲＮＡをコードするＤＮＡに互いに融合されるとともに第３の発現コンストラクト内の第３のプロモーターと機能的に連結されており、前記第１、第２、及び第３のプロモーターは前記細胞内で活性である。場合により、前記第１、第２、及び／又は第３の発現コンストラクトは、１個の核酸分子の構成要素である。
特定の方法では、前記細胞は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）を低下させるか、かつ／又は遺伝子変換若しくは相同組換え型修復（ＨＤＲ）を増大させるように改変されている。場合により、前記細胞は、ＤＮＡ−ＰＫの発現若しくは活性を低下させるか、かつ／又はＰＡＲＰ１の発現若しくは活性を低下させるように改変されている。場合により、細胞はリガーゼＩＶの発現又は活性を低下させるように改変されている。場合により、前記発現又は活性の低下は、誘導性、可逆性、時間特異的、及び／又は空間特異的である。
本発明はまた、第１の対立遺伝子についてヘテロ接合型である細胞内のゲノムを改変するための方法であって、前記ゲノムを、（ａ）第１のＣａｓタンパク質、（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び（ｃ）第１の非対立遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと接触させることを含み、前記第１の対立遺伝子が第１の相同染色体上にあり、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列が、第２の相同染色体上の、前記第１の対立遺伝子に対応する遺伝子座に対してセントロメア側にあり、前記第１のＣａｓタンパク質が前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断して二本鎖切断を生じ、前記細胞が前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型となるように改変される、方法。特定の方法は、前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型である細胞を同定することを更に含む。特定の方法では、Ｃａｓタンパク質と第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとは天然に一緒に存在していないものである。
このような方法は、ゲノムを、第２の相同染色体上の、前記第１の対立遺伝子に対応する遺伝子座に対してセントロメア側の第２の非対立遺伝子特的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと接触させることを更に含んでもよく、第１のＣａｓタンパク質が第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して少なくとも１つの二本鎖切断を生成する。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質は、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断する。
特定の方法では、ヘテロ接合性の喪失は、前記二本鎖切断のテロメアで生じる。
特定の方法では、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、第２の相同染色体上に位置しており、第１の相同染色体には位置していない。特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識部位は、セントロメアから約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂにある。特定の方法では、第１の対立遺伝子は、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識部位から約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂにある。特定の方法では、ヘテロ接合性の喪失によって置換される第２の相同染色体の領域は、約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂである。
特定の方法では、前記細胞は真核細胞である。場合により、前記真核細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、げっ歯類多能性細胞、マウス多能性細胞、ラット多能性細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラットＥＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発生的に制限されたヒト前駆細胞、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は１細胞期胚である。
特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質はＣａｓ９である。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に対してヌクレアーゼ活性を有する。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質はニッカーゼである。場合により、前記第１のＣａｓタンパク質はニッカーゼであり、前記方法は更に、前記ゲノムを、ニッカーゼである第２のＣａｓタンパク質、第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと接触させることを更に含み、前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第１の鎖を切断し、前記第２のＣａｓタンパク質が、前記第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内及び前記第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第２の鎖を切断する。
特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとは互いに第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）として融合され、かつ／又は前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとが互いに第２のｇＲＮＡとして融合される。特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとは別々のＲＮＡ分子であり、かつ／又は前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとは別々のＲＮＡ分子である。
特定の方法では、前記接触させることは、前記第１のＣａｓタンパク質、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを前記細胞に導入することを含む。特定の方法では、前記第１のＣａｓタンパク質は、タンパク質、前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、又はは前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入される。場合により、前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡは、第１の発現コンストラクト内の第１のプロモーターと機能的に連結され、前記第１のプロモーターは前記細胞内で活性である。特定の方法では、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、又は前記第１のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入される。場合により、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡは、第２の発現コンストラクト内の第２のプロモーターと機能的に連結され、前記第２のプロモーターは前記細胞内で活性である。特定の方法では、前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、又は前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入される。場合により、前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡは、第３の発現コンストラクト内の第３のプロモーターと機能的に連結され、前記第３のプロモーターは前記細胞内で活性である。特定の方法では、前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入される。場合により、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡは、第４の発現コンストラクト内の第４のプロモーターと機能的に連結され、前記第４のプロモーターは前記細胞内で活性である。場合により、前記第１、第２、第３、及び／又は第４の発現コンストラクトは、１個の核酸分子の構成要素である。
場合により、前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡは、第１の発現コンストラクト内の第１のプロモーターと機能的に連結され、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡとは、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡに互いに融合されるとともに第２の発現コンストラクト内の第２のプロモーターと機能的に連結され、かつ／又は、（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡとは、第２のｇＲＮＡをコードするＤＮＡに互いに融合されるとともに第３の発現コンストラクト内の第３のプロモーターと機能的に連結されており、前記第１、第２、及び第３のプロモーターは前記細胞内で活性である。場合により、前記第１、第２、及び／又は第３の発現コンストラクトは、１個の核酸分子の構成要素である。
場合により、前記第１のＣａｓタンパク質、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、第１のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入され、かつ／又は前記第１のＣａｓタンパク質、前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、第２のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入される。
特定の方法では、前記細胞は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）を低下させるか、かつ／又は遺伝子変換若しくは相同組換え型修復（ＨＤＲ）を増大させるように改変されている。場合により、前記細胞は、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＡＲＰ１、及びリガーゼＩＶのうちの１つ以上の発現又は活性を低下させるように改変されている。場合により、前記発現又は活性の低下は、誘導性、可逆性、時間特異的、及び／又は空間特異的である。
特定の方法では、前記第１の対立遺伝子は突然変異を有する。場合により、前記突然変異はターゲティングによる改変である。特定の方法では、前記第１の対立遺伝子は野生型対立遺伝子であり、前記第２の相同染色体上の対応する遺伝子座は突然変異を有する。
本発明はまた、１細胞期胚ではない二倍体細胞の標的ゲノム遺伝子座への核酸インサートのターゲティングによる挿入を同定するための方法であって、（ａ）細胞からＤＮＡを得ることであって、細胞が、第１の標的配列にハイブリダイズする第１のホモロジーアームと第２の標的配列にハイブリダイズする第２のホモロジーアームとを隣接させた前記核酸インサートを含むラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）と接触させられ、前記核酸インサートが、前記第１のホモロジーアームに隣接した選択カセットを含むことと、（ｂ）前記細胞の前記ＤＮＡを、前記第１の標的配列内に結合するプローブ、前記核酸インサート内に結合するプローブ、及び既知のコピー数を有する参照遺伝子内に結合するプローブに曝露することであって、各プローブは結合する際に検出可能なシグナルを発生することと、（ｃ）前記プローブのそれぞれの結合からのシグナルを検出することと、（ｄ）前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第１の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第１の標的配列のコピー数を決定し、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサートのコピー数を決定することと、を含み、前記核酸インサートのコピー数が１又は２であり、前記第１の標的配列のコピー数が２である場合には、前記標的ゲノム遺伝子座への前記核酸インサートのターゲティングによる挿入を示し、前記核酸インサートのコピー数が１以上であり、前記第１の標的配列のコピー数が３以上である場合には、前記標的ゲノム遺伝子座以外のゲノム遺伝子座への前記核酸インサートのランダムな挿入を示す、方法。
特定の方法では、前記第１の標的配列プローブの結合からのシグナルを用いて前記第１の標的配列の閾サイクル（Ｃｔ）値を決定し、前記参照遺伝子プローブの結合からのシグナルを用いて前記参照遺伝子の閾サイクル（Ｃｔ）値を決定し、前記第１の標的配列のＣｔ値と前記参照遺伝子のＣｔ値とを比較することによって前記第１の標的配列のコピー数を決定する。特定の方法では、前記核酸インサートプローブの結合からのシグナルを用いて前記核酸インサートの閾サイクル（Ｃｔ）値を決定し、前記第１の標的配列のＣｔ値と前記参照遺伝子のＣｔ値とを比較することによって前記核酸インサートのコピー数を決定する。
特定の方法では、選択カセットは薬剤選択遺伝子を含む。
特定の方法では、前記核酸インサートは、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂである。特定の方法では、プローブが第１の標的配列及び選択カセット内で結合する配列間の距離は、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、又は５ｋｂ以下である。
特定の方法は、前記第２の標的配列のコピー数を決定することを更に含む。場合により、前記工程（ｂ）は、前記細胞の前記ＤＮＡを前記第２の標的配列に結合するプローブに曝露することを更に含み、前記工程（ｃ）は、前記第２の標的配列プローブの結合からのシグナルを検出することを更に含み、前記工程（ｄ）は、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第２の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第２の標的配列のコピー数を決定することを更に含む。
特定の方法は、前記核酸インサート内の１つ以上の更なる配列のコピー数を決定することを更に含む。場合により、前記工程（ｂ）は、前記細胞の前記ＤＮＡを前記核酸インサートに結合する１つ以上の更なるプローブに曝露することを更に含み、前記工程（ｃ）は、前記１つ以上の更なるプローブの結合からのシグナルを検出することを更に含み、前記工程（ｄ）は、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記１つ以上の更なる核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサート内の前記１つ以上の更なる配列のコピー数を決定することを更に含む。場合により、前記核酸インサート内の前記１つ以上の更なる配列は、前記第２の標的配列に隣接した配列を含む。
特定の方法では、前記ＬＴＶＥＣが前記標的ゲノム遺伝子座から内因性配列を欠失させるように設計されているか、又は前記細胞が、Ｃａｓタンパク質、標的ゲノム遺伝子座内の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、前記標的ゲノム遺伝子座内の第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと更に接触させられている。場合により、かかる方法は、標的ゲノム遺伝子座における前記内因性配列のコピー数を決定することを更に含む。場合により、前記工程（ｂ）は、前記細胞の前記ＤＮＡを前記標的ゲノム遺伝子座の前記内因性配列に結合するプローブに曝露することを更に含み、前記工程（ｃ）は、前記内因性配列プローブの結合からのシグナルを検出することを更に含み、前記工程（ｄ）は、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記内因性配列プローブからのシグナルと比較して前記内因性配列のコピー数を決定することを更に含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
細胞内のゲノムに両対立遺伝子改変を行うための方法であって、前記ゲノムを、
（ａ）第１のＣａｓタンパク質、
（ｂ）ゲノム標的遺伝子座内の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、
（ｃ）前記ゲノム標的遺伝子座内の第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、
（ｄ）ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び
（ｅ）前記細胞が１細胞期胚である場合にターゲティングベクターの長さは５ｋｂ以下であるものとして、５’標的配列にハイブリダイズする５’ホモロジーアームと３’標的配列にハイブリダイズする３’ホモロジーアームとを隣接させた核酸インサートを含むターゲティングベクター、と接触させることを含み、
前記ゲノムが、前記ゲノム標的遺伝子座を含む第１及び第２の相同染色体のペアを含み、
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも１つの二本鎖切断を生ずる、方法。
（項目２）
前記改変されたゲノムを有する細胞を同定することを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記核酸インサートが、第１の標的配列にハイブリダイズする第１のホモロジーアームに隣接した選択カセットを含み
前記第１のホモロジーアームが前記５’ホモロジーアームであり、かつ前記第１の標的配列が前記５’標的配列であるか、又は前記第１のホモロジーアームが前記３’ホモロジーアームであり、かつ前記第１の標的配列が前記３’標的配列であり、
前記同定することが、
（ａ）前記細胞からＤＮＡを得ることと、
（ｂ）前記細胞の前記ＤＮＡを、前記第１の標的配列内に結合するプローブ、前記核酸インサート内に結合するプローブ、及び既知のコピー数を有する参照遺伝子内に結合するプローブに曝露することであって、各プローブは、結合する際に検出可能なシグナルを発生することと、
（ｃ）前記プローブのそれぞれの結合からのシグナルを検出することと、
（ｄ）前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第１の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第１の標的配列のコピー数を決定し、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサートのコピー数を決定することと、を含み、
前記核酸インサートのコピー数が１又は２であり、前記第１の標的配列のコピー数が２である場合には、前記ゲノム標的遺伝子座への前記核酸インサートのターゲティングによる挿入を示し、
前記核酸インサートのコピー数が１以上であり、前記第１の標的配列のコピー数が３以上である場合には、前記ゲノム標的遺伝子座以外のゲノム遺伝子座への前記核酸インサートのランダムな挿入を示す、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１及び第２の相同染色体のそれぞれの前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して前記第１及び第２の相同染色体のそれぞれに少なくとも１つの二本鎖切断を生ずる、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも２つの二本鎖切断を生ずる、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記ゲノムを、
（ｆ）前記ゲノム標的遺伝子座内の第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び
（ｇ）前記ゲノム標的遺伝子座内の第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと接触させることを更に含む、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とが、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、又は約９０ｋｂ〜約１００ｋｂだけ離れており、かつ／又は
（ｂ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とが、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、又は約９０ｋｂ〜約１００ｋｂだけ離れている、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記第１及び第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列がＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第１のペアであり、前記第２及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列がＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第２のペアであり、前記第１のペアと前記第２のペアとが、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂ、約３Ｍｂ〜約４Ｍｂ、約４Ｍｂ〜約５Ｍｂ、約５Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂだけ離れている、項目６又は７に記載の方法。
（項目９）
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１、第２、第３、及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列のうちの少なくとも２つを切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも２つの二本鎖切断を生ずる、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１、第２、第３、及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列のうちの少なくとも２つを切断して前記第１及び第２の相同染色体の両方に少なくとも２つの二本鎖切断を生ずる、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ゲノムを前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの両方と接触させることにより、前記ゲノムを前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡのいずれか単独と接触させる場合と比較して両対立遺伝子改変の効率が高くなる、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記核酸インサートが前記５’標的配列と前記３’標的配列との間に挿入される、項目１〜１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記細胞が二倍体であり、前記両対立遺伝子改変によって、前記ゲノム標的遺伝子座にホモ接合性、複合ヘテロ接合性、又はヘミ接合性が生じる、項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記両対立遺伝子改変が、前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失を含む、項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記両対立遺伝子改変が、前記第１及び第２の相同染色体の両方の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記両対立遺伝子改変が、前記第１及び第２の相同染色体の両方の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入を更に含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記両対立遺伝子改変が、
（ａ）前記第１及び第２の相同染色体の両方の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、及び前記第２の相同染色体ではなく、前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入、
（ｂ）前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、及び前記第２の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の遺伝子座の破壊、
（ｃ）前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入、及び前記第２の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間の遺伝子座の破壊、又は、
（ｄ）前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、及び前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入を含み、前記核酸インサート配列が、前記欠失される配列とホモロガスであるか又はオルソロガスである、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
（ａ）前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列がそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、若しくは少なくとも１００ｋｂに位置しているか、
（ｂ）前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列がそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、５０ｂｐより遠く、１００ｂｐより遠く、２００ｂｐより遠く、３００ｂｐより遠く、４００ｂｐより遠く、５００ｂｐより遠く、６００ｂｐより遠く、７００ｂｐより遠く、８００ｂｐより遠く、９００ｂｐより遠く、１ｋｂより遠く、２ｋｂより遠く、３ｋｂより遠く、４ｋｂより遠く、５ｋｂより遠く、６ｋｂより遠く、７ｋｂより遠く、８ｋｂより遠く、９ｋｂより遠く、１０ｋｂより遠く、２０ｋｂより遠く、３０ｋｂより遠く、４０ｋｂより遠く、５０ｋｂより遠く、６０ｋｂより遠く、７０ｋｂより遠く、８０ｋｂより遠く、９０ｋｂより遠く、若しくは１００ｋｂより遠くに位置しているか、又は、
（ｃ）前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列がそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、若しくは約５０ｋｂ〜約１００ｋｂに位置している、項目１〜１７のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とが、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂだけ離れているか、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とが、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、若しくは少なくとも５００ｋｂだけ離れているか、
（ｃ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とが、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、若しくは約９００ｂｐ〜約１ｋｂだけ離れているか、又は、
（ｄ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とが、２５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、１５０ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、２５０ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、３５０ｂｐ未満、４００ｂｐ未満、４５０ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、６００ｂｐ未満、７００ｂｐ未満、８００ｂｐ未満、９００ｂｐ未満、１ｋｂ未満、２ｋｂ未満、３ｋｂ未満、４ｋｂ未満、５ｋｂ未満、若しくは１０ｋｂ未満だけ離れている、項目１〜１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
（ａ）前記欠失される核酸が、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂであるか、又は、
（ｂ）前記欠失される核酸が、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、若しくは少なくとも５００ｋｂであるか、又は、
（ｃ）前記欠失される核酸が、少なくとも５５０ｋｂ、少なくとも６００ｋｂ、少なくとも６５０ｋｂ、少なくとも７００ｋｂ、少なくとも７５０ｋｂ、少なくとも８００ｋｂ、少なくとも８５０ｋｂ、少なくとも９００ｋｂ、少なくとも９５０ｋｂ、少なくとも１Ｍｂ、少なくとも１．５Ｍｂ、若しくは少なくとも２Ｍｂである、項目１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記５’及び３’標的配列が、前記ゲノム標的遺伝子座内にある、項目１〜２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記ターゲティングベクターが直鎖状の形態である、項目１〜２１のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記ターゲティングベクターが一本鎖又は二本鎖である、項目１〜２２のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
前記細胞が真核細胞である、項目１〜２３のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、げっ歯類多能性細胞、マウス多能性細胞、ラット多能性細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラットＥＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発生的に制限されたヒト前駆細胞、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は１細胞期胚である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記細胞が１細胞期胚であり、
（ａ）前記ターゲティングベクターの長さが約５０ヌクレオチド〜約５ｋｂであるか、又は、
（ｂ）前記ターゲティングベクターが一本鎖ＤＮＡであり、その長さが約６０〜約２００ヌクレオチドである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記細胞が１細胞期胚ではなく、
（ａ）前記ターゲティングベクターが、少なくとも１０ｋｂのラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であるか、又は、
（ｂ）前記ターゲティングベクターがラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び３’ホモロジーアームの合計が少なくとも１０ｋｂである、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
（ａ）前記ＬＴＶＥＣが、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、若しくは約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂであるか、又は、
（ｂ）前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び３’ホモロジーアームの合計が、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞が１細胞期胚ではなく、
前記ターゲティングベクターがラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、前記５’及び３’ホモロジーアームの合計が少なくとも１０ｋｂであり、
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列がそれぞれ、前記５’及び３’標的配列の両方から、２００ｂｐより遠く、３００ｂｐより遠く、４００ｂｐより遠く、５００ｂｐより遠く、６００ｂｐより遠く、７００ｂｐより遠く、８００ｂｐより遠く、９００ｂｐより遠く、１ｋｂより遠く、２ｋｂより遠く、３ｋｂより遠く、４ｋｂより遠く、５ｋｂより遠く、６ｋｂより遠く、７ｋｂより遠く、８ｋｂより遠く、９ｋｂより遠く、１０ｋｂより遠く、２０ｋｂより遠く、３０ｋｂより遠く、４０ｋｂより遠く、５０ｋｂより遠く、６０ｋｂより遠く、７０ｋｂより遠く、８０ｋｂより遠く、９０ｋｂより遠く、若しくは１００ｋｂより遠くに位置しており、
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方の前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断して前記第１及び第２の相同染色体の少なくとも一方に少なくとも２つの二本鎖切断を生じ、
前記両対立遺伝子改変が、前記第１の相同染色体の前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の前記欠失、及び前記第１の相同染色体の前記５’標的配列と前記３’標的配列との間への前記核酸インサートの挿入を含み、前記核酸インサート配列が、前記欠失される配列とホモロガスであるか又はオルソロガスである、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
第１の対立遺伝子についてヘテロ接合型である細胞内のゲノムを改変するための方法であって、前記ゲノムを、
（ａ）第１のＣａｓタンパク質、
（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び
（ｃ）第１の非対立遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、と接触させることを含み、前記第１の対立遺伝子が第１の相同染色体上にあり、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列が、第２の相同染色体上の、前記第１の対立遺伝子に対応する遺伝子座に対してセントロメア側にあり、
前記第１のＣａｓタンパク質が前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断して二本鎖切断を生じ、前記細胞が前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型となるように改変される、方法。
（項目３１）
前記ゲノムを、第２の相同染色体上の、前記第１の対立遺伝子に対応する遺伝子座に対してセントロメア側の第２の非対立遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと接触させることを更に含み、
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して少なくとも１つの二本鎖切断を生ずる、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
ヘテロ接合性の喪失が前記二本鎖切断のテロメア側で生じる、項目３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列が、前記第２の相同染色体上に位置し、前記第１の相同染色体上には位置していない、項目３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識部位が、セントロメアから約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂにある、項目３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記第１の対立遺伝子が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列から約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂにある、項目３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
ヘテロ接合性の喪失によって置換される前記第２の相同染色体の領域が、約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂである、項目３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
（ａ）前記第１の対立遺伝子が突然変異を有するか、又は、
（ｂ）前記第１の対立遺伝子が野生型対立遺伝子であり、前記第２の相同染色体上の対応する遺伝子座が突然変異を有する、項目３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記第１の対立遺伝子が突然変異を有し、前記突然変異がターゲティングによる改変である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
第１の対立遺伝子についてヘテロ接合型である細胞内のゲノムを改変するための方法であって、前記ゲノムを、
（ａ）第１のＣａｓタンパク質、
（ｂ）ｔｒａｃｒＲＮＡ、
（ｃ）第２の対立遺伝子内の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡであって、前記第１の対立遺伝子が第１の相同染色体上にあり、前記第２の対立遺伝子が第２の相同染色体上の対応する遺伝子座にある、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び
（ｄ）前記第２の対立遺伝子内の第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、と接触させることを含み、
前記第１のＣａｓタンパク質が前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断することで、少なくとも１つの二本鎖切断及び組換えを起こす末端配列を生じ、前記組換えが前記第１の対立遺伝子と前記第２の対立遺伝子との間で起こることで、前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型である改変されたゲノムを生じる、方法。
（項目４１）
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列が前記第２の対立遺伝子内に位置し、前記第１の対立遺伝子内には位置していない、項目４０又は４１に記載の方法。
（項目４３）
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とが、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂだけ離れているか、又は、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とが、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、若しくは少なくとも５００ｋｂだけ離れている、項目４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。（項目４４）
（ａ）前記第１の対立遺伝子と前記第２の対立遺伝子との間の配列の相違が、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂにわたるか、又は、
（ｂ）前記第１の対立遺伝子と前記第２の対立遺伝子との間の配列の相違が、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂにわたる、項目４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
（ａ）前記第１の対立遺伝子がターゲティングによる改変を有し、前記第２の対立遺伝子が野生型対立遺伝子であるか、又は、
（ｂ）前記第１の対立遺伝子が野生型対立遺伝子であり、前記第２の対立遺伝子が疾患原因突然変異を有する、項目４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記組換えが、遺伝子変換又はヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む、項目４０〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記第１の対立遺伝子についてホモ接合型である細胞を同定することを更に含む、項目３０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記Ｃａｓタンパク質と前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとが天然に一緒に存在していない、項目３０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記細胞が真核細胞である、項目３０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、げっ歯類多能性細胞、マウス多能性細胞、ラット多能性細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラットＥＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発生的に制限されたヒト前駆細胞、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は１細胞期胚である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記第１のＣａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目１〜５０のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
前記第１のＣａｓタンパク質が、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に対してヌクレアーゼ活性を有する、項目１〜５１のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
前記第１のＣａｓタンパク質がニッカーゼである、項目１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記第１のＣａｓタンパク質がニッカーゼであり、前記方法が、前記ゲノムを、
（ｆ）ニッカーゼである第２のＣａｓタンパク質、
（ｇ）第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ、及び
（ｈ）第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ、と接触させることを更に含み、
前記第１のＣａｓタンパク質が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第１の鎖を切断し、前記第２のＣａｓタンパク質が、前記第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内及び前記第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第２の鎖を切断する、項目１〜３９及び項目４１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとが互いに第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）として融合され、かつ／若しくは前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとが互いに第２のｇＲＮＡとして融合されているか、又は、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとが別々のＲＮＡ分子であり、かつ／若しくは前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡとが別々のＲＮＡ分子である、項目１〜２９及び項目３１〜５４のいずれか一項に記載の方法。（項目５６）
前記接触させることが、前記第１のＣａｓタンパク質、前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを前記細胞に導入することを含む、項目１〜５５のいずれかに記載の方法。
（項目５７）
（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質が、タンパク質、前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、若しくは前記第１のＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入され、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入され、
（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、ＲＮＡの形態で、若しくは前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入され、かつ／又は
（ｄ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、ＲＮＡの形態で、若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で前記細胞に導入される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記第１のＣａｓタンパク質、前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、第１のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入され、かつ／又は前記第１のＣａｓタンパク質、前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、第２のタンパク質／ＲＮＡ複合体として前記細胞に導入される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質をコードした前記ＤＮＡが、第１の発現コンストラクト内の第１のプロモーターと機能的に連結され、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードした前記ＤＮＡが、第２の発現コンストラクト内の第２のプロモーターと機能的に連結され、
（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードした前記ＤＮＡが、第３の発現コンストラクト内の第３のプロモーターと機能的に連結され、かつ／又は
（ｄ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードした前記ＤＮＡが、第４の発現コンストラクト内の第４のプロモーターと機能的に連結されており、
前記第１、第２、第３、及び第４のプロモーターが前記細胞内で活性である、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記第１、第２、第３、及び／又は第４の発現コンストラクトが、１個の核酸分子の構成要素である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
（ａ）前記第１のＣａｓタンパク質をコードした前記ＤＮＡが、第１の発現コンストラクト内の第１のプロモーターと機能的に連結され、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードした前記ＤＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードした前記ＤＮＡとが、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡに互いに融合されるとともに第２の発現コンストラクト内の第２のプロモーターと機能的に連結され、かつ／又は、
（ｃ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードした前記ＤＮＡと前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードした前記ＤＮＡとが、第２のｇＲＮＡをコードするＤＮＡに互いに融合されるとともに第３の発現コンストラクト内の第３のプロモーターと機能的に連結されており、
前記第１、第２、及び第３のプロモーターが前記細胞内で活性である、項目５７に記載の方法。
（項目６２）
前記第１、第２、及び／又は第３の発現コンストラクトが、１個の核酸分子の構成要素である、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記細胞が、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）を低下させるか、かつ／又は遺伝子変換若しくは相同組換え型修復（ＨＤＲ）を増大させるように改変されている、項目１〜６２のいずれかに記載の方法。
（項目６４）
前記細胞が、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＡＲＰ１、及びリガーゼＩＶのうちの１つ以上の発現又は活性を低下させるように改変されている、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記発現又は活性の低下が、誘導性、可逆性、時間特異的、及び／又は空間特異的である、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
Ｆ０世代の非ヒト動物を作成するための方法であって、
（ａ）項目１〜２５及び項目２７〜６５のいずれか一項に記載の方法によって作成された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト宿主胚に導入することと、
（ｂ）前記非ヒト宿主胚を代理母に懐胎させることと、を含み、
前記代理母が、前記両対立遺伝子改変を有する前記Ｆ０世代の非ヒト動物を作る、方法。
（項目６７）
Ｆ０世代の非ヒト動物を作成するための方法であって、項目１〜２６及び項目３０〜６５のいずれか一項に記載の方法によって作成された遺伝子改変された１細胞期胚を代理母に移植することを含み、
前記代理母が、前記両対立遺伝子改変を有する前記Ｆ０世代の非ヒト動物を作る、方法。
（項目６８）
前記非ヒト動物がマウス又はラットである、項目６６又は６７に記載の方法。
（項目６９）
１細胞期胚ではない二倍体細胞の標的ゲノム遺伝子座への核酸インサートのターゲティングによる挿入を同定するための方法であって、
（ａ）前記細胞からＤＮＡを得ることであって、前記細胞が、第１の標的配列にハイブリダイズする第１のホモロジーアームと第２の標的配列にハイブリダイズする第２のホモロジーアームとを隣接させた前記核酸インサートを含むラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）と接触させられ、前記核酸インサートが、前記第１のホモロジーアームに隣接した選択カセットを含むことと、
（ｂ）前記細胞の前記ＤＮＡを、前記第１の標的配列内に結合するプローブ、前記核酸インサート内に結合するプローブ、及び既知のコピー数を有する参照遺伝子内に結合するプローブに曝露することであって、各プローブは、結合する際に検出可能なシグナルを発生することと、
（ｃ）前記プローブのそれぞれの結合からのシグナルを検出することと、
（ｄ）前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第１の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第１の標的配列のコピー数を決定し、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサートのコピー数を決定することと、を含み、
前記核酸インサートのコピー数が１又は２であり、前記第１の標的配列のコピー数が２である場合には、前記標的ゲノム遺伝子座への前記核酸インサートのターゲティングによる挿入を示し、
前記核酸インサートのコピー数が１以上であり、前記第１の標的配列のコピー数が３以上である場合には、前記標的ゲノム遺伝子座以外のゲノム遺伝子座への前記核酸インサートのランダムな挿入を示す、方法。
（項目７０）
前記第１の標的配列プローブの結合からのシグナルを用いて前記第１の標的配列の閾サイクル（Ｃｔ）値を決定し、前記参照遺伝子プローブの結合からのシグナルを用いて前記参照遺伝子の閾サイクル（Ｃｔ）値を決定し、前記第１の標的配列のＣｔ値と前記参照遺伝子のＣｔ値とを比較することによって前記第１の標的配列のコピー数を決定し、
前記核酸インサートプローブの結合からのシグナルを用いて前記核酸インサートの閾サイクル（Ｃｔ）値を決定し、前記第１の標的配列のＣｔ値と前記参照遺伝子のＣｔ値とを比較することによって前記核酸インサートのコピー数を決定する、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記選択カセットが薬剤耐性遺伝子を含む、項目６９又は７０に記載の方法。
（項目７２）
前記核酸インサートが、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂである、項目６９〜７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記プローブが前記第１の標的配列及び前記選択カセット内で結合する配列間の距離が、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、又は５ｋｂ以下である、項目６９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記第２の標的配列のコピー数を決定することを更に含む、項目６９〜７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記工程（ｂ）が、前記細胞の前記ＤＮＡを前記第２の標的配列に結合するプローブに曝露することを更に含み、
前記工程（ｃ）が、前記第２の標的配列プローブの結合からのシグナルを検出することを更に含み、
前記工程（ｄ）が、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第２の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第２の標的配列のコピー数を決定することを更に含む、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記核酸インサート内の１つ以上の更なる配列の前記コピー数を決定することを更に含む、項目６９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記工程（ｂ）が、前記細胞の前記ＤＮＡを前記核酸インサートに結合する１つ以上の更なるプローブに曝露することを更に含み、
前記工程（ｃ）が、前記１つ以上の更なるプローブの結合からのシグナルを検出することを更に含み、
前記工程（ｄ）が、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを、前記１つ以上の更なる核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサート内の前記１つ以上の更なる配列のコピー数を決定することを更に含む、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記核酸インサート内の前記１つ以上の更なる配列が、前記第２の標的配列に隣接した配列を含む、項目７６又は７７に記載の方法。
（項目７９）
前記ＬＴＶＥＣが、前記標的ゲノム遺伝子座から内因性配列を欠失させるように設計されているか、又は
前記細胞が、Ｃａｓタンパク質、標的ゲノム遺伝子座内の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、前記標的ゲノム遺伝子座内の第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと更に接触させられている、項目６９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記方法が、標的ゲノム遺伝子座における前記内因性配列のコピー数を決定することを更に含む、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記工程（ｂ）が、前記細胞の前記ＤＮＡを前記標的ゲノム遺伝子座における前記内因性配列に結合するプローブに曝露することを更に含み、
前記工程（ｃ）が、前記内因性配列プローブの結合からのシグナルを検出することを更に含み、
前記工程（ｄ）が、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記内因性配列プローブからのシグナルと比較して前記内因性配列のコピー数を決定することを更に含む、項目８０に記載の方法。
ＬＴＶＥＣと、５’領域（Ａ、Ｂ、Ｂ２）、中間領域（Ｃ、Ｄ）、及び３’領域（Ｅ２、Ｅ、Ｆ）のｇＲＮＡの１つ又は２つとを用いた、同時に行われるマウスＬｒｐ５エクトドメインの欠失と対応するヒトＬＲＰ５エクトドメインによる置換の模式図を示す。ＬＴＶＥＣは図の上部に示されており、マウスＬｒｐ５遺伝子座は図の下部に示されている。８種類のガイドＲＮＡによって導かれるＣａｓ９切断部位の位置が、マウス遺伝子配列の下に縦の矢印で示されている。横の矢印は、マウス及びヒト配列に対するＰＣＲプライマーを表す。 同時に行われる、ＬＴＶＥＣ及び２種類のガイドＲＮＡ（ガイドＲＮＡ Ａ及びＢ）を用いたマウス遺伝子の欠失と対応するヒト遺伝子による置換の一般的な模式図を示す。ＬＴＶＥＣは図２Ａの上部に示されており、マウス遺伝子座は図２Ａの下部に示されている。２種類のガイドＲＮＡによって導かれるＣａｓ９切断部位の位置が、マウス遺伝子配列の下に矢印で示されている。 ２種類のガイドＲＮＡが用いられる場合により高い頻度で起きる固有の両対立遺伝子改変（対立遺伝子のタイプ）を示す。斜めのハッチングを有する太線はマウス遺伝子を示し、破線はマウス遺伝子の欠失を示し、太い黒線はヒト遺伝子の挿入を示す。図２Ｂは、ホモ接合型の破壊された対立遺伝子を示す（大きなＣＲＩＳＰＲ誘導欠失）。 ２種類のガイドＲＮＡが用いられる場合により高い頻度で起きる固有の両対立遺伝子改変（対立遺伝子のタイプ）を示す。斜めのハッチングを有する太線はマウス遺伝子を示し、破線はマウス遺伝子の欠失を示し、太い黒線はヒト遺伝子の挿入を示す。図２Ｃは、ホモ接合型にターゲティングされた対立遺伝子を示す。 ２種類のガイドＲＮＡが用いられる場合により高い頻度で起きる固有の両対立遺伝子改変（対立遺伝子のタイプ）を示す。斜めのハッチングを有する太線はマウス遺伝子を示し、破線はマウス遺伝子の欠失を示し、太い黒線はヒト遺伝子の挿入を示す。図２Ｄは、ヘミ接合型にターゲティングされた対立遺伝子を示す。 ２種類のガイドＲＮＡが用いられる場合により高い頻度で起きる固有の両対立遺伝子改変（対立遺伝子のタイプ）を示す。斜めのハッチングを有する太線はマウス遺伝子を示し、破線はマウス遺伝子の欠失を示し、太い黒線はヒト遺伝子の挿入を示す。図２Ｅは、複合ヘテロ接合型対立遺伝子を示す。 選択されたクローンの遺伝子型を確認するＰＣＲアッセイを示す。図３Ａは、プライマーｍ−ｌｒ−ｆ及びｍ−５’−ｒを使用した、選択されたＥＳ細胞クローンのロングレンジＰＣＲアッセイの結果を示す。この結果は、ヒトインサートと、５’ホモロジーアームと相同な配列の外側の配列との連結を証明しており、正確なターゲティングを示している。 選択されたクローンの遺伝子型を確認するＰＣＲアッセイを示す。図３Ｂは、５’Ｄｅｌ Ｊ、５’Ｉｎｓ Ｊ、Ｄｅｌ Ａ＋Ｆ、及びＤｅｌ Ａ＋Ｅ２のＰＣＲアッセイの結果を示す。５’Ｄｅｌ Ｊは、ｍ−５’−ｆ及びｍ−５−ｒプライマーを使用したＰＣＲ産物を示し、ｇＲＮＡ Ａの切断部位の周辺の野生型配列が増幅され、この配列の維持又は喪失が証明される。５’Ｉｎｓ Ｊは、ｍ−５’−ｆ及びｈ−５’−ｒプライマーを使用したＰＣＲ産物を示し、ヒトインサートとマウスゲノムとの連結が証明されている。このアッセイは、ターゲティングにより組み込まれたクローンとランダムに組み込まれたクローンの両方で正の結果を与える。Ｄｅｌ Ａ＋Ｆは、クローンＢＯ−Ｆ１０及びＡＷ−Ａ８で２種類のｇＲＮＡ Ａ及びＦによって媒介される大きな欠失について、予想されるアンプリコンのサイズ（３５９ｂｐ）と実際のバンドを示しているＤｅｌ Ａ＋Ｅ２は、クローンＢＡ−Ａ７について同じ考え方を示している。Ｎｔは、鋳型なし（no template）を示し、＋／＋は、親ＶＧＦ１ハイブリッドＥＳ細胞の野生型コントロールを示し、Ｈ／＋は、ヘテロ接合型のヒト化遺伝子型を示し、Ｈ／Δは、ヘミ接合型のヒト化遺伝子型を示し、Ｈ／Ｈは、ホモ接合型のヒト化遺伝子型を示し、Δ／Δはホモ接合型の欠失の遺伝子型を示す。 Ａ〜Ｃは、Ｌｒｐ５ヒト化ＬＴＶＥＣとＣａｓ９及び２種類のｇＲＮＡとの組み合わせによりターゲティングされた、マウスＥＳ細胞クローンＡＷ−Ｄ９（図４Ａ）及びＢＡ−Ｄ５（図４Ｃ）、並びにＬＴＶＥＣ単独によりターゲティングされたクローンＢＳ−Ｃ４（図４Ｂ）の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を示す。矢印は、１９番染色体のＢバンド上のハイブリダイゼーションシグナルの位置を示す。赤色のシグナルは、マウスプローブのみとのハイブリダイゼーションを示す（破線矢印、図４Ｂ）。黄色の混合色のシグナルは、赤色のマウスプローブと緑色のヒトプローブの両方とのハイブリダイゼーションを示す。赤色のシグナルを有する一方の１９番染色体のＢバンド（破線矢印）及び黄色のシグナルを有する他方の１９番染色体のＢバンド（実線矢印）によって、正しい遺伝子座へのターゲティングとＢＳ−Ｃ４クローンのヘテロ接合型の遺伝子型が確認された（図４Ｂ）。黄色のシグナルを有する両方の１９番染色体のＢバンド（実線矢印、図４Ａ及び４Ｃ）によって、正しい遺伝子座へのターゲティングとＡＷ−Ｄ９及びＢＳ−Ｃ４クローンのホモ接合型の遺伝子型が確認された。 ＶＧＦ１ハイブリッドＥＳ細胞におけるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を分析することにより、２種類のガイドＲＮＡにより媒介される遺伝子変換又は有糸分裂組換え事象を調べるために設計されたアッセイによる１９番染色体の模式図を示す。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲ染色体コピー数（ＣＣＮ）アッセイのおよその位置が矢印で示されている。構造変異体（ＳＶ）多型ＰＣＲアッセイのおよその位置がシェブロン（山形）マークによって示されており、Ｌｒｐ５遺伝子座からのそれらの距離（単位Ｍｂ）がその上に示されている。１ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）ＴａｑＭａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイのおよその位置がアローヘッドにより示され、Ｌｒｐ５遺伝子座からのそれらの距離（単位Ｍｂ）がその下に示されている。Ｆ、Ｅ２、Ｄ、Ｂ２、ＡのｇＲＮＡ認識部位の位置が、Ｌｒｐ５遺伝子の表現の上に斜めの矢印で示されている。 ＬＴＶＥＣと、５’領域（Ａ、Ｂ、Ｂ２）、中間領域（Ｃ、Ｄ）、及び３’領域（Ｅ、Ｅ２）のｇＲＮＡの１つ又は２つとを用いた、同時に行われるマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子のエクソン２から終止コドンまでの領域の欠失と対応するヒトＣ５遺伝子の領域による置換の模式図を示す。ＬＴＶＥＣは図の上部に示されており、マウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子座は図の下部に示されている。６種類のガイドＲＮＡによって導かれるＣａｓ９切断部位の位置が、マウス遺伝子配列の下に矢印で示されている。 Ａ及びＢは、Ｈｃヒト化ＬＴＶＥＣとＣａｓ９及び２種類のｇＲＮＡとの組み合わせによりターゲティングされた、マウスＥＳ細胞クローンＱ−Ｅ９（図７Ａ）及びＯ−Ｅ３（図７Ｂ）の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を示す。矢印は、２番染色体のＢバンド上のハイブリダイゼーションシグナルの位置を示す。赤色のシグナルは、マウスプローブのみとのハイブリダイゼーションを示す（破線矢印、図７Ａ）。黄色の混合色のシグナルは、赤色のマウスプローブと緑色のヒトプローブの両方とのハイブリダイゼーションを示す（実線矢印）。赤色のシグナルを有する一方の２番染色体のＢバンド（破線矢印）及び黄色のシグナルを有する他方の２番染色体のＢバンド（実線矢印）によって、正しい遺伝子座へのターゲティングとＱ−Ｅ９クローンのヘテロ接合型の遺伝子型が確認された（図７Ａ）。黄色のシグナルを有する両方の２番染色体のＢバンド（実線矢印、図７Ｂ）によって、正しい遺伝子座へのターゲティングとＯ−Ｅ３クローンのホモ接合型の遺伝子型が確認された。 ＬＴＶＥＣと、５’領域（Ａ、Ｂ）、中間領域（Ｄ、Ｃ）、及び３’領域（Ｅ、Ｆ）のｇＲＮＡの１つ又は２つとを用いた、同時に行われるマウスＲｏｒ１遺伝子の欠失と対応するヒトＲＯＲ１遺伝子による置換の模式図を示す。ＬＴＶＥＣは図の上部に示されており、マウスＲｏｒ１遺伝子座は図の下部に示されている。６種類のガイドＲＮＡによって導かれるＣａｓ９切断部位の位置が、マウス遺伝子配列の下に矢印で示されている。 ＬＴＶＥＣと、５’領域（Ａ、Ａ２、Ｂ）、中間領域（Ｃ、Ｄ）、及び３’領域（Ｅ２、Ｅ、Ｆ）のｇＲＮＡの１つ又は２つとを用いた、同時に行われるマウスＴｒｐａ１遺伝子の欠失と対応するヒトＴＲＰＡ１遺伝子による置換の模式図を示す。ＬＴＶＥＣは図の上部に示されており、マウスＴｒｐａ１遺伝子座は図の下部に示されている。８種類のガイドＲＮＡによって導かれるＣａｓ９切断部位の位置が、マウス遺伝子配列の下に矢印で示されている。 Ａ〜Ｅは、クローンＢＲ−Ｂ４、ＢＰ−Ｇ７、ＢＯ−Ｇ１１、ＢＯ−Ｆ１０、Ｂ０−Ａ８、及びＢＣ−Ｈ９、並びにコントロールとして用いたＶＧＦ１（Ｆ１Ｈ４）、１２９、及びＢ６ ＤＮＡの構造変異体（ＳＶ）アッセイの結果を示す。各アッセイは、Ｌｒｐ５遺伝子座に対してテロメア側へ以下の距離で行った。すなわち、１３．７Ｍｂ（図１０Ａ）、２０．０Ｍｂ（図１０Ｂ）、３６．９Ｍｂ（図１０Ｃ）、４８．３Ｍｂ（図１０Ｄ）、及び５６．７Ｍｂ（図１０Ｅ）。Ｂ６及び１２９対立遺伝子のＰＣＲ産物の位置が矢印で示されている。 Ａ〜Ｃは、Ｌｒｐ５のセントロメア側０．３２Ｍｂ（図１１Ａ）、Ｌｒｐ５のテロメア側１．２Ｍｂ（図１１Ｂ）、及びＬｒｐ５のテロメア側５７．２Ｍｂ（図１１Ｃ）の対立遺伝子識別プロットを示す。それぞれの軸上の値は、相対蛍光強度を表す。これらのプロットは、各試料について４つの複製試料を示し、中黒のドット（Ｂ６対立遺伝子）、白抜きのドット（１２９対立遺伝子）、及び斜線のドット（Ｂ６／１２９対立遺伝子の両方）として示されている。 Ａ〜Ｃは、ホモ接合型事象及びヘテロ接合性の喪失によって検出される広範囲の遺伝子変換を生じうる細胞周期のＧ２期における有糸分裂組換えの考えられる機構を示した模式図である。図１２Ａは、１２９ホモログ上のターゲティングによるヒト化についてヘテロ接合型であるハイブリッド１２９／Ｂ６ ＥＳ細胞の２本の染色分体を示す複製された相同染色体を示す。両矢印は、標的対立遺伝子のセントロメア側の交叉として示される、相同染色体上の染色分体間の相同組換えによる相互的交換を促進する、２種類のｇＲＮＡにより誘導されるＣａｓ９切断によって形成される潜在的な二本鎖切断を示しており、この交叉により図１２Ｂに示されるハイブリッド染色分体を生じる。図１２Ｃは、有糸分裂及び細胞分裂後に、娘細胞への染色体の４つのタイプの別れ方が可能であることを示している。ヘテロ接合性の維持を示す２つ、すなわち親タイプのヘテロ接合体（ヒト／＋、左上）と、対等の交換によるヘテロ接合体（ヒト／＋、右上）とはＬＯＨアッセイで区別することはできない。残りの２つはヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を示しており、テロメア側のＢ６対立遺伝子を喪失しているヒト化ホモ接合体（ヒト／ヒト、例えばクローンＢＯ−Ａ８、左下）と、テロメア側の１２９対立遺伝子を喪失している野生型ホモ接合体（＋／＋、右下）である。この後者のタイプは、ヒト化対立遺伝子の薬剤耐性カセットを維持していないために死んでしまう。 ホモロジーアームのサイズが３５ｋｂ及び３１ｋｂであるターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）又はホモロジーアームのサイズがそれぞれ５ｋｂであるターゲティングベクター（ｓＴＶＥＣ）と、５’領域（Ａ、Ｂ）、中間領域（Ｃ、Ｄ）、及び３’領域（Ｅ、Ｅ２）のｇＲＮＡの１つ又は２つとを用いた、同時に行われるマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子のエクソン２から終止コドンまでの領域の欠失と対応するヒトＣ５遺伝子の領域による置換の模式図を示す。２つのターゲティングベクターは図の上部に示されており、マウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子座は図の下部に示されている。６種類のガイドＲＮＡによって導かれるＣａｓ９切断部位の位置が、マウス遺伝子配列の下に縦の矢印で示され、スクリーニングに用いたプライマーが横の矢印で示されている。インサートのコピー数を定量化する対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）アッセイの位置、及びターゲティングにより欠失されるマウス配列を定量化する対立遺伝子の損失（ＬＯＡ）アッセイが三角で示されている。 ＬＴＶＥＣ及び２種類の５’領域（Ａ、Ｂ）ｇＲＮＡを用いた、同時に行われるマウスＣｍａｈ遺伝子座の最初の５個のエクソンの欠失とＬａｃＺレポーター及びヒグロマイシン耐性選択カセットによる置換の模式図を示す。ＬＴＶＥＣは図の上部に示されており、マウスＣｍａｈ遺伝子座は図の下部に示されている。２つのガイドＲＮＡにより導かれるＣａｓ９切断部位の位置がマウス遺伝子配列の下に縦の矢印で示され、インサートのコピー数を定量化するＧＯＡアッセイの位置及びターゲティングにより欠失されるマウス配列を定量化するＬＯＡアッセイが三角で示されている。 図１５は、マウスＣｍａｈ遺伝子座（配列番号１０９）を２種類の５’領域ｇＲＮＡ（Ａ及びＢ、それぞれ配列番号１０７及び配列番号１０８）によりターゲティングした場合の切断事象及び生じる切除産物（配列番号１１２）の模式図を示す。Ｃｍａｈ遺伝子座にハイブリダイズしたｇＲＮＡ配列が太字で示され、Ｃａｓタンパク質が細かい点が打たれた卵形で示され、Ｃａｓ９切断部位が縦の矢印で示され、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）がボックスで囲んで示されている。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＬＯＡアッセイのフォワードプライマー、プローブ、及びリバースプライマーのおよその位置が図の上に横棒と横の矢印で示されている。切断及び切除後に生じる５’及び３’フラグメントは、それぞれ配列番号１１０及び配列番号１１１である。 １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス系統に由来する１個の半数体染色体組と、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）マウス系統に由来する１個の半数体染色体組とを有するＦ１ハイブリッドマウスＥＳ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化実験で観察されたヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む結果を説明する考えられる機構を示す。図１６Ａは、有糸分裂交叉による相互的染色分体交換を示しており、ゲノム複製前又はゲノム複製後に１２９系染色体上でヘテロ接合型改変が起きた後、姉妹染色分体間で遺伝子変換が生じている。 １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス系統に由来する１個の半数体染色体組と、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）マウス系統に由来する１個の半数体染色体組とを有するＦ１ハイブリッドマウスＥＳ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化実験で観察されたヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む結果を説明する考えられる機構を示す。図１６Ｂは、有糸分裂交叉による相互的染色分体交換を示しており、１本の１２９系染色分体がゲノム複製後に改変されている。 １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス系統に由来する１個の半数体染色体組と、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）マウス系統に由来する１個の半数体染色体組とを有するＦ１ハイブリッドマウスＥＳ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化実験で観察されたヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む結果を説明する考えられる機構を示す。図１６Ｃは、有糸分裂交叉による相互的染色分体交換を示しており、ＬＴＶＥＣによるターゲティングは起きていないが、Ｃａｓ９による切断が１２９又はＢ６系染色体上で生じている（Ｂ６の切断部位が示されている）。 １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス系統に由来する１個の半数体染色体組と、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）マウス系統に由来する１個の半数体染色体組とを有するＦ１ハイブリッドマウスＥＳ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化実験で観察されたヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む結果を説明する考えられる機構を示す。図１６Ｄは、切断誘導型複製による染色分体のコピー化を示しており、ゲノム複製前又はゲノム複製後に１２９系染色体上でヘテロ接合型改変が起きた後、姉妹染色分体間で遺伝子変換が生じている。 １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス系統に由来する１個の半数体染色体組と、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）マウス系統に由来する１個の半数体染色体組とを有するＦ１ハイブリッドマウスＥＳ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化実験で観察されたヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む結果を説明する考えられる機構を示す。図１６Ｅは、切断誘導型複製による染色分体のコピー化を示しており、１本の１２９系染色分体がゲノム複製後に改変されている。 １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス系統に由来する１個の半数体染色体組と、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）マウス系統に由来する１個の半数体染色体組とを有するＦ１ハイブリッドマウスＥＳ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化実験で観察されたヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む結果を説明する考えられる機構を示す。図１６Ｆは、切断誘導型複製による染色分体のコピー化を示しており、ＬＴＶＥＣによるターゲティングは起きていないが、Ｃａｓ９による切断が１２９又はＢ６系染色体上で生じている（Ｂ６の切断部位が示されている）。 ターゲティングによる改変についてスクリーニングを行う手法を示す。図１７Ａは、マウス染色体の内因性配列が欠失されてＮｅｏ−ＳＤＣインサートにより置換されるラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）によるヘテロ接合型のターゲティングを検出するための標準的な「対立遺伝子の改変（modification of allele）」（ＭＯＡ）スクリーニング手法を示す。この手法では、ターゲティングにより欠失される内因性配列の上流及び下流領域に対するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブｍＴｕ及びｍＴＤを使用する。 ターゲティングによる改変についてスクリーニングを行う手法を示す。図１７Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化についてスクリーニングを行うためのＴａｑＭａｎ（登録商標）リテンションアッセイ（ｒｅｔＵ及びｒｅｔＤプローブ）と対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイ（対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）アッセイではｍＴＧＵ、ｍＴＭ、及びｍＴＧＤプローブ、対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）アッセイではｈＴＵ及びｈＴＤプローブ）との組み合わせの使用を示す。図１７Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化についてスクリーニングを行うためのＴａｑＭａｎ（登録商標）リテンションアッセイ（ｒｅｔＵ及びｒｅｔＤプローブ）と対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイ（対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）アッセイではｍＴＧＵ、ｍＴＭ、及びｍＴＧＤプローブ、対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）アッセイではｈＴＵ及びｈＴＤプローブ）との組み合わせの使用を示す。 ターゲティングによる改変についてスクリーニングを行う手法を示す。図１７Ｃは、ガイドＲＮＡのペア（ｇＵ及びｇＤ）を使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援欠失についてスクリーニングを行うためのＴａｑＭａｎ（登録商標）リテンションアッセイ（ｒｅｔＵ及びｒｅｔＤプローブ）と対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）アッセイ（ｍＴＧＵ、ｍＴＭ、及びｍＴＧＤプローブ）との組み合わせの使用を示す。 可変領域の遺伝子セグメントがヒトの可変領域遺伝子セグメント（三角）により置換されたマウス免疫グロブリン重鎖の遺伝子座のおよそ９００ｋｂの領域と、ｌｏｘＰ部位を隣接させたＰｇｋ−Ｎｅｏインサート（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子と機能的に連結されたホスホグリセリン酸キナーゼＩプロモーター）を有するターゲティングベクターの模式図（縮尺は正しくない）である。２種類のｇＲＮＡを用いてマウス免疫グロブリン重鎖の遺伝子座を５’末端で切断し、２種類のｇＲＮＡを用いてこの遺伝子座を３’末端で切断し、ターゲティングベクターによってマウス免疫グロブリン重鎖の遺伝子座を欠失させてＰｇｋ−Ｎｅｏインサートに置換している。４種類のガイドＲＮＡによって導かれるＣａｓ９切断部位の位置が標的遺伝子座の下に縦の矢印で示されている。丸で囲まれた横線は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブであり、対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイ用（ｈＩｇＨ３１、ｈＩｇＨ１、ｍＩｇＨＡ１、ｍＩｇＨＡ７、及びｈＩｇＨ９）と、リテンションアッセイ用（５’ＩｇＨ Ａｒｍ １、５’ＩｇＨ Ａｒｍ ２、ｍＩｇＭ−３９８、及びｍＩｇＭ−１０４５）のものである。
用語の定義
本明細書で互換的に使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」なる用語には、コード及び非コードアミノ酸、並びに化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態が含まれる。これらの用語には、修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含まれる。
本明細書で互換的に使用される「核酸」及び「ポリヌクレオチド」なる用語には、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの類似体若しくは改変バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態が含まれる。核酸及びポリヌクレオチドには、プリン塩基、ピリミジン塩基、又は他の天然の、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、及び多重鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びにポリマーが含まれる。
「コドン最適化」は一般的に、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に、又は最も頻繁に使用されるコドンと置換することによって、特定の宿主細胞での発現を高めるように核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、又は任意の他の宿主細胞を含む特定の原核細胞又は真核細胞でより高い使用頻度を有するコドンで置換するように改変することができる。コドン使用頻度表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能である。これらの表は、様々な形で適用することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：２９２を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。特定の宿主における発現に対する特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムも入手可能である（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照）。
「機能的な連結」又は「機能的に連結されている」とは、２以上の要素（例えば、プロモーターと別の配列エレメント）が近接して配置されていることにより、両方の要素が正常に機能し、かつ要素のうちの少なくとも１つが他の要素の少なくとも１つに及ぼされる機能を媒介することができる可能性を有することを含む。例えば、プロモーターが、１以上の転写調節因子の有無に応じてコード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーターは、コード配列に機能的に連結されうる。
核酸の「相補性」とは、核酸の一方の鎖のヌクレオチド配列が、そのヌクレオ塩基の配向のために、対向する核酸鎖上の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡの相補的塩基は通常は、ＴとＡ及びＧとＣである。ＲＮＡでは相補的塩基は通常は、ＧとＣ及びＡとＵである。相補性は、完全であるか又は実質的／充分なものでありうる。２つの核酸間の完全な相補性とは、これら２つの核酸が、二重鎖中のすべての塩基がワトソン−クリック対合によって相補的塩基と結合した二重鎖を形成することができることを意味する。「実質的な」又は「充分な」相補性とは、一方の鎖中の配列が対向する鎖中の配列と完全に及び／又は完璧に相補的ではないが、一群のハイブリダイゼーション条件（例えば塩濃度及び温度）下で安定したハイブリッド複合体を形成するのに充分な結合が２つの鎖の塩基間で生じることを意味する。そのような条件は、配列及び標準的な数学的計算法を用いてハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測することにより、又は常法を用いてＴｍを経験的に決定することにより予測することができる。Ｔｍは、２本の核酸鎖間で形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性する温度を含む。Ｔｍ未満の温度では、ハイブリダイゼーション複合体が形成される傾向にあり、Ｔｍを上回る温度では、ハイブリダイゼーション複合体の鎖同士が融解すなわち分離する傾向にある。Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（Ｇ＋Ｃ（％））を用いることによって、１Ｍ
ＮａＣｌ水溶液中で既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸について推定することができるが、他の既知のＴｍ計算は、核酸の構造的特徴を考慮したものもある。
「ハイブリダイゼーション条件」には、１つの核酸鎖が、相補鎖同士の相互作用及び水素結合によって第２の核酸鎖と結合することでハイブリダイゼーション複合体を形成するような累積的な環境を含む。こうした条件には、核酸を含有する水溶液又は有機溶液の化学成分及びそれらの濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、並びに混合物の温度が含まれる。インキュベーション時間の長さ又は反応チャンバの寸法といった他の要因も環境に寄与しうる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．１．９０〜１．９１，９．４７〜９．５１，１ １．４７〜１１．５７（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。
ハイブリダイゼーションには、塩基間のミスマッチの可能性はあるものの、２つの核酸が相補的配列を含むことが必要である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適した条件は、当該技術分野において周知の変数である、核酸の長さ及び相補性の程度によって決まる。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値は大きくなる。短かい相補性の区間（例えば、３５個以下、３０個以下、２５個以下、２２個以下、２０個以下、又は１８個以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置が重要になる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上記参照、１１．７〜１１．８を参照されたい）。一般的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小の長さとしては、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、及び少なくとも約３０ヌクレオチドが挙げられる。更に、温度及び洗浄溶液の塩濃度は、相補性領域の長さ及び相補性の程度などの要因に基づいて必要に応じて調整することができる。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はない。更に、ポリヌクレオチドは、介在する又は隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないようにして１以上のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい（例えば、ループ構造又はヘアピン構造）。ポリヌクレオチド（例えばｇＲＮＡ）は、それらが標的とする標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相補性を有することができる。例えば、２０個中１８個のヌクレオチドが標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするｇＲＮＡは、９０％の相補性を表す。この例では、残りの非特異的ヌクレオチドには相補的ヌクレオチドがクラスターとして存在するか又は分散して存在してよく、これらのヌクレオチド同士が互いに、又は相補的ヌクレオチドと連続している必要はない。
核酸内の核酸配列の特定の区間同士の間の相補性率（％）は、当該技術分野では周知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所的アライメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ
Ｒｅｓ．７：６４９〜６５６）を使用して、又は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２〜４８９）を使用したデフォルト設定を用いたＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用して普通に決定することができる。
本明細書で提供される方法及び組成物では、様々な異なる構成要素が用いられる。特定の構成要素は活性な変異体及びフラグメントを有しうることが、本明細書全体を通して認識される。そのような構成要素としては、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びガイドＲＮＡが挙げられる。これらの構成要素のそれぞれの生物活性については、本明細書の別の個所で述べる。
２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に関連して「配列同一性」又は「同一性」とは、指定された比較ウィンドウにわたって最大限に一致するようにアラインされる際に同じである２つの配列中の残基を参照する。配列同一性の割合（％）がタンパク質に関して用いられる場合、同じでない残基の位置は、多くの場合、アミノ酸残基が同様の化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換されるために分子の機能特性を変化させない保存的アミノ酸置換によって異なることが認識される。配列同士が保存的置換で異なっている場合、配列同一性の割合（％）は、置換の保存的性質を補正するために上方に調整することができる。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は、当業者には周知のものである。一般的に、この調整では、保存的置換を完全なミスマッチではなく、部分的ミスマッチとしてスコア評価することを行い、それにより配列同一性の割合（％）が高くなる。したがって、例えば、同一であるアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換に０のスコアが与えられる場合、保存的置換は、０〜１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコア評価は、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（インテリジェネティクス社（Intelligenetics）、カリフォルニア州マウンテンビュー）で実行されるよ
うにして計算される。
「配列同一性の割合（％）」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列同士を比較することによって決定される値を含む。ただし、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列同士の最適なアラインメントを得るために参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。この割合（％）は、同一である核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中で生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の割合（％）を得ることによって計算される。
特に断らないかぎり、配列同一性／類似性の値には、以下のパラメータ、すなわち、ＧＡＰ重み＝３及び長さ重み＝３、並びにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリング行列を使用するヌクレオチド配列の同一率（％）及び類似率（％）、ＧＡＰ重み＝８及び長さ重み＝２、並びにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用するアミノ酸配列の同一率（％）及び類似率（％）、又はそれらの任意の同等のプログラムを用いるＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０を使用して得られる値が含まれる。「同等のプログラム」には、対象とされる任意の２つの配列について、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合に、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のマッチ及び同一の配列同一率（％）を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムが含まれる。
「インビトロ」なる用語には、人工環境及び人工環境（例えば試験管）内で生じるプロセス又は反応が含まれる。「インビボ」なる用語には、天然の環境（例えば細胞又は生物又は身体）及び天然の環境内で生じるプロセス又は反応が含まれる。「エクスビボ」なる用語には、個体の身体から取り出された細胞及びかかる細胞内で生じるプロセス又は反応が含まれる。
１以上の列挙された要素を「含む（comprising）」又は「有する（including）」組成
物又は方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含みうる。例えば、あるタンパク質を「含む」又は「有する」組成物は、そのタンパク質を単独で、又は他の成分と組み合わせて含有することができる。
値の範囲の指定は、その範囲内の、又はその範囲を規定するすべての整数、及びその範囲内の整数によって規定されるすべての部分範囲を含む。
文脈から明らかではないかぎり、「約」なる用語には、記載された値の測定値の標準的な誤差（例えばＳＥＭ）の範囲内の値が包含される。
単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈によりそうでない旨が明らかでないかぎり、複数の指示対象を含む。例えば、「Ｃａｓタンパク質」又は「少なくとも１つのＣａｓタンパク質」なる用語には、これらの混合物を含む複数のＣａｓタンパク質が含まれうる。
（発明を実施するための形態）
Ｉ．概要
細胞内のゲノムを改変するための方法及び組成物が提供される。本方法及び組成物は、１つのゲノム標的遺伝子座内の異なる部位をターゲティングする２種類のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いるものである。例えば、本方法及び組成物は、２種類のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いることによって、１つのゲノム標的遺伝子座内の異なる部位に二本鎖切断のペアを形成することができる。また、本方法及び組成物は、２種類のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いることによって、１つのゲノム標的遺伝子座内の異なる部位に一本鎖切断のペアを形成することもできる。特定の方法では、２種類以上のガイドＲＮＡ（例えば３種類又は４種類）を使用することで例えば１つのゲノム標的遺伝子座内の異なる部位に２箇所以上の一本鎖切断又は二本鎖切断を形成することができる。
特定の方法は、両対立遺伝子の遺伝子改変を促進し、大きな核酸配列を２箇所の切断部位の間の染色体から欠失させるゲノム破壊を含む。他の方法は、両対立遺伝子の遺伝子改変を促進し、細胞内の核酸配列の欠失と、外因性の核酸配列による置換を同時に行うものである。下記に更に詳細に概要を述べるように、２種類のｇＲＮＡを使用するこれらの方法は、ターゲティングによる両対立遺伝子の遺伝子改変によって細胞又は動物を作出する効率を、単一のターゲティング工程でそのような細胞及び動物の作出を促進することによって高めるものである。その結果、ターゲティングによる両対立遺伝子の遺伝子改変によって動物を作出するうえで必要とされる動物及び交配の数が低減される。
他の方法は、ある対立遺伝子についてヘテロ接合型であるゲノムを、対応する相同染色体上の対応する対立遺伝子内で２種類のｇＲＮＡによって決定される部位で切断することによってその対立遺伝子についてホモ接合型となるように改変する、遺伝子変換又はヘテロ接合性の喪失を含む。下記に更に詳細に概要を述べるように、これらの方法における２種類のｇＲＮＡの使用は、遺伝子変換の頻度を高め、染色体ＤＮＡの大きな範囲にわたった遺伝子変換を可能とするものである。
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
本明細書に開示される方法及び組成物は、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム、又
はかかるシステムの構成要素を利用して細胞内のゲノムを改変することが可能である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与するか又はその活性を誘導する転写産物及び他のエレメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型のシステムであってよい。本明細書に開示される方法及び組成物は、ＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）からなる）を核酸の部位特異的な切断に利用することによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いるものである。
本明細書に開示される方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一部のものは、天然には存在しないものである。「天然に存在しない」システムには、システムの１以上の構成要素が、それらが天然に存在する状態から変異若しくは突然変異しているもの、それらが自然界において本来関連している少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まないもの、又はそれらが本来関連していない少なくとも１つの他の構成成分と関連付けられているものなど、人為的な関与を示すあらゆるものが含まれる。例えば、特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、天然に一緒に存在しないｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質からなる天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ複合体を用いている。
Ａ．Ｃａｓ ＲＮＡ先導型エンドヌクレアーゼ
Ｃａｓタンパク質は一般的に少なくとも１つのＲＮＡ認識又は結合ドメインを有している。そのようなドメインは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、下記により詳しく説明する）と相互作用することができる。Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量化ドメイン、及び他のドメインを含んでもよい。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断のための触媒活性を有する。切断は、核酸分子の共有結合の切断を含む。切断は、平滑末端又は付着末端を生じさせることができ、一本鎖又は二本鎖でありうる。
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１若しくはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６、並びにこれらのホモログ又は改変体が挙げられる。
特定の場合では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来するものである。例えば、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質であってもよく、又はＣａｓ９タンパク質から誘導されてもよい。Ｃａｓ９タンパク質は通常、保存された構造を有する４つの主要なモチーフを共有している。モチーフ１、２、及び４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス−サーモフィルス、ストレプトコッカス属、黄色ブドウ球菌、ノカルジオプシス−ダソンビレイ、ストレプトミセス−プリスチナエスピラリス、ストレプトミセス−ビリドクロモゲネス、ストレプトミセス−ビリドクロモゲネス、ストレプトスポランギウム−ロセウム、ストレプトスポランギウム−ロセウム、アリサイクロバチルス−アシドカルダリウス（AlicyclobacHlus acidocaldarius）、バチルス−シュ
ードミコイデス、バチルス−セレニティレドセンス、イグジォバクテリウム−シビリカム、ラクトバチラス−デルブリッキー、ラクトバチラス−サリバリウス、ミクロシラ−マリナ、バークホルデリア−バクテリウム、ポラロモナス−ナフタレニボランス、ポラロモナス属、クロコスファエラ−ワトソニイ、シアノセイス属、ミクロキスティス−エルギノーサ、シネココックス属、アセトハロビウム−アラビティカム、アンモニフェツクス−デゲンシイ、カルディセルロシルプター−ベシー、カンジデイタス−デサルホルディス、クロストリジウム−ボツリナム、クロストリジウム−ディフィシル、フィネゴルディア−マグナ、ナトロアナエロビウス−サーモフィルス、ペロトマクルム−サーモプロピオニカム、アシディチオバチルス−カルダス、アシディチオバチルス−フェロオキシダンス、アロクロマチウム−ビノスム、マリノバクター属、ニトロソコッカス−ハロフィルス、ニトロソコッカス−ワトソニイ、シュードアルテロモナス−ハロプランクティス、クテドノバクター−ラセミファー、メタノハロビウム−エベスチガータム、アナベナ−バリアビリス、ノジュラリア−スプミゲナ、ノストック属、アルスロスピラ−マキシマ、アルスロスピラ−プラテンシス、アルスロスピラ属、リングビア属、ミクロコレウス−クソノプラステス、オスキラトリア属、ペトロトガ−モビリス、サーモシフォ−アフリカヌス、又はアカリオクロリス−マリナ由来のものであってよい。Ｃａｓ９ファミリーメンバーのその他の例としては、その全容を参照により本明細書に援用するところの国際公開第２０１４／１３１８３３号に記載されるＣａｓ９ファミリーメンバーが挙げられる。具体的な一例では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿レンサ球菌）由来のＣａｓ９タンパク質であるか、又はそれから誘導されるものである。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいてアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２で見ることができる。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち天然に存在するもの）、改変Ｃａｓタンパク質（すなわちＣａｓタンパク質変異体）、又は野生型若しくは改変Ｃａｓタンパク質のフラグメントであってもよい。Ｃａｓタンパク質は、野生型又は改変Ｃａｓタンパク質の活性変異体又はフラグメントであってもよい。活性変異体又はフラグメントは、野生型若しくは改変Ｃａｓタンパク質又はこれらの部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有してよく、ただし、活性変異体は所望の切断部位で切断する能力を維持し、したがってニック誘導活性又は二本鎖切断誘導活性を維持している。ニック誘導活性又は二本鎖切断誘導活性についてのアッセイは周知のものであり、一般的に切断部位を有するＤＮＡ基質に対するＣａｓタンパク質の全体的な活性及び特異性を測定するものである。
Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、及び／又は酵素活性を増大又は低下させるように改変することができる。Ｃａｓタンパク質は、安定性など、タンパク質の任意の他の活性又は特性を変化させるように改変することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１以上のヌクレアーゼドメインを、改変、欠失、若しくは不活性化するか、又はＣａｓタンパク質を、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するように、又はＣａｓタンパク質の活性を最適化（例えば強化若しくは低減）するように切り詰めることができる。
一部のＣａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２個のヌクレアーゼドメインを有している。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを有することができる。ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインはそれぞれ、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断することによってＤＮＡに二本鎖切断を形成することができる。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６〜８２１を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。
これらのヌクレアーゼドメインの一方又は両方を欠失又は突然変異させることにより、それらの機能を失わせるか又はヌクレアーゼ活性を低下させることができる。ヌクレアーゼドメインのうちの一方が欠失又は突然変異される場合、得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）はニッカーゼと呼ばれ、二本鎖ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列に二本鎖切断ではなく一本鎖切断を形成することができる（すなわち、相補鎖又は非相補鎖を切断できるが、両方は切断できない）。ヌクレアーゼドメインの両方が欠失されるか又は突然変異される場合には、得られるＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低下する。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の１つの例として、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の位置１０のアスパラギン酸がアラニンに置換される）突然変異がある。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸位置８３９のヒスチジンがアラニンに置換される）又はＨ８４０Ａ（アミノ酸位置８４０のヒスチジンがアラニンに置換される）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の他の例としては、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９の上記に相当する突然変異がある。例えばＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９：９２７５〜９２８２及び国際公開第２０１３／１４１６８０号を参照されたい。尚、各文献の全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。こうした突然変異は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介型突然変異誘発、又は全遺伝子合成などの公知の方法を使用して発生させることができる。ニッカーゼを作る他の突然変異の例は、例えば国際公開第２０１３／１７６７７２Ａ１号及び同第２０１３／１４２５７８Ａ１号に見ることができる。尚、各文献の全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。
Ｃａｓタンパク質は融合タンパク質であってもよい。例えばＣａｓタンパク質は、切断ドメイン、エピジェネティックな改変ドメイン、転写活性化ドメイン、転写抑制因子ドメインと融合させることができる。例えば国際公開第２０１４／０８９２９０号を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。Ｃａｓタンパク質は、増大した、又は低下した安定性を与える異種ポリペプチドと融合させることもできる。融合ドメイン又は異種ポリペプチドは、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、又はその内部に位置することができる。
Ｃａｓ融合タンパク質の１つの例として、細胞内で局在化させるための異種ポリペプチドと融合されたＣａｓタンパク質がある。そのような配列としては、例えば、核に標的化するためのＳＶ４０ ＮＬＳなどの核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアに標的化するためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどが挙げられる。例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：５１０１〜５１０５を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。例えば、Ｃａｓタンパク質は、１個以上の核局在化シグナルと融合させることができる（例えば、２個又は３個の核局在化シグナル）。そのような細胞内局在化シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこに位置してもよい。ＮＬＳは塩基性アミノ酸からなる区間を有することができ、単節型（monopartite）配列又は双節型（bipartite）配列でありうる。
Ｃａｓタンパク質は細胞膜透過性ドメインを有してもよい。例えば、細胞膜透過性ドメインは、ＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスからの細胞透過性ペプチド、又はポリアルギニンペプチド配列から誘導することができる。例えば国際公開第２０１４／０８９２９０号を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。細胞膜透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこに位置してもよい。
Ｃａｓタンパク質は、蛍光タンパク質、精製タグ、又はエピトープタグなど、追跡又は精製を容易にするための異種ポリペプチドを含んでもよい。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−エクスプレス、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−単量体、ＨｃＲｅｄ−タンデム、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮａＮＰ）、タンデム親和性精製（ＴＡＢ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質は任意の形態で与えることができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で与えることができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＲ））又はＤＮＡなど、Ｃａｓタンパク質をコードした核酸の形態で与えることもできる。場合により、Ｃａｓタンパク質をコードした核酸は、特定の細胞又は生物においてタンパク質に効率的に翻訳されるように最適化されたコドンであってもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードした核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、又は任意の他の対象とする宿主細胞においてより高い頻度で使用されるコドンに置換するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードした核酸が細胞内に導入されると、Ｃａｓタンパク質は細胞内で一過的、条件的、又は構成的に発現されうる。
Ｃａｓタンパク質をコードした核酸は、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、かつ細胞内で活性を有するプロモーターと機能的に連結されてもよい。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードした核酸は、発現コンストラクトのプロモーターに機能的に連結されてもよい。発現コンストラクトとしては、遺伝子又は他の対象となる核酸配列（例えばＣａｓ遺伝子）の発現を誘導することができ、かつそのような対象となる核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸コンストラクトが挙げられる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核酸インサートを含むターゲティングベクター及び／又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在してよい。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核酸インサートを含むターゲティングベクター及び／又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別個のベクター又はプラスミド内に存在してもよい。発現コンストラクトに使用することができるプロモーターとしては、例えば、多能性ラット、真核細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、又はハムスター細胞中で活性を有するプロモーターが挙げられる。１細胞期胚で活性を有するプロモーターを使用することもできる。そのようなプロモーターは、例えば、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターであってよい。他のプロモーターの例は、本明細書の別の個所で述べる。
Ｂ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」はＣａｓタンパク質と結合して、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子を含む。ガイドＲＮＡは、２つの部分、すなわち「ＤＮＡターゲティングセグメント」と「タンパク質結合セグメント」とを含むことができる。「セグメント」には、ＲＮＡ内のヌクレオチドの連続的区間のような、分子のセグメント、部分、又は領域が含まれる。特定のｇＲＮＡは、２個の別々のＲＮＡ分子、すなわち「アクチベーターＲＮＡ」と「ターゲッターＲＮＡ」とを含む。他のｇＲＮＡは、「単鎖分子ｇＲＮＡ」、「単鎖ガイドＲＮＡ」、又は「ｓｇＲＮＡ」とも呼ばれる場合もある単鎖ＲＮＡ分子（単鎖ＲＮＡポリヌクレオチド）である。例えば、それぞれの全容をすべての目的で本明細書に参照により援用するところの国際公開第２０１３／１７６７７２Ａ１号、同第２０１４／０６５５９６Ａ１号、同第２０１４／０８９２９０Ａ１号、同第２０１４／０９３６２２Ａ２号、同第２０１４／０９９７５０Ａ２号、同第２０１３１４２５７８Ａ１号、及び同第２０１４／１３１８３３Ａ１号を参照されたい。「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」なる用語には、二分子ｇＲＮＡ及び一分子ｇＲＮＡの両方が含まれる。
代表的な二分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ターゲッターＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ反復」）分子と、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「アクチベーターＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又は「足場」）分子とを含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメント（一本鎖）、及びｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドの区間の両方を含んでいる。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドの区間を含んでいる。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドの一区間は、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドの一区間と相補的であり、この区間とハイブリダイズしてｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有していると言うことができる。ＴｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば完全長のｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び異なる長さのものであってよい。ｔｒａｃｒＲＮＡの形態には、一次転写産物又はプロセシングされた形態が含まれる。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓでは、異なる形態のｔｒａｃｒＲＮＡとして、１７１個のヌクレオチド、８９個のヌクレオチド、７５個のヌクレオチド、及び６５個のヌクレオチドからなるものが挙げられる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２〜６０７及び国際公開第２０１４／０９３６６１号を参照されたい。尚、各文献の全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。
ｃｒＲＮＡと対応するｔｒａｃｒＲＮＡとはハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡは更に、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡターゲティングセグメントを与える。改変を行うために細胞内で使用される場合、特定のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、そのＲＮＡ分子が使用される種に特異的となるように設計されてもよい。例えば、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３〜８２６；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６〜８２１；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２２７〜２２９；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３〜２３９；及びＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９〜８２３を参照されたい。尚、各文献の全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。
特定のｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメント（ｃｒＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ内の配列と相補的なヌクレオチド配列を含んでいる。ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントは、ハイブリダイゼーションを介して配列特異的な形で標的ＤＮＡと相互作用する（すなわち、塩基対合）。したがって、ＤＮＡターゲティングセグメントのヌクレオチド配列は異なりうるものであり、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。対象となるｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントは、標的ＤＮＡの任意の所望の配列にハイブリダイズするように改変することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９システム及び生物によって異なるが、多くの場合、２１〜４６ヌクレオチド長の２個の直列反復（direct repeat）（ＤＲ）が隣接した２１〜７２ヌクレオチド長のターゲティングセグメントを含んでいる（例えば国際公開第２０１４／１３１８３３を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓでは、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、ターゲティングセグメントは３０ヌクレオチド長である。３’側に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的でこれとハイブリダイズし、このｔｒａｃｒＲＮＡがＣａｓ９タンパク質と結合する。
ＤＮＡターゲティングセグメントは、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、ＤＮＡターゲティングセグメントは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、又は約１２ｎｔ〜約１９ｎｔの長さを有することができる。あるいは、ＤＮＡターゲティングセグメントは、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約７０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約９０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約１００ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約９０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有してもよい。
標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列）と相補的であるＤＮＡターゲティングセグメントのヌクレオチド配列は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有することができる。例えば、ＤＮＡターゲティング配列（すなわち、標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と相補的であるＤＮＡターゲティングセグメント内の配列）は、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、又は少なくとも約４０ｎｔの長さを有することができる。あるいは、ＤＮＡターゲティング配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約６０ｎｔの長さを有してもよい。特定の場合では、ＤＮＡターゲティング配列は約２０ｎｔの長さを有してもよい。
ＴｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長のｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び異なる長さのものであってよい。ＴｒａｃｒＲＮＡは、一次転写産物又はプロセシングされた形態を含むことができる。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単鎖ガイドＲＮＡの一部として、若しくは二分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の全部若しくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）を含むか又はそれからなるものでよい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１個のヌクレオチド、８９個のヌクレオチド、７５個のヌクレオチド、及び６５個のヌクレオチドからなるものが挙げられる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２〜６０７；国際公開第２０１４／０９３６６１号を参照されたい。尚、各文献の全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、及び＋８５型内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大で＋ｎ個のヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。例えば米国特許第８，６９７，３５９号を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。
ＤＮＡターゲティング配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の相補性率（％）は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）であってもよい。特定の場合では、ＤＮＡターゲティング配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ認識配列との間の相補性率（％）は、約２０個の連続するヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であってもよい。１つの例では、ＤＮＡターゲティング配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の相補性率（％）は、標的ＤＮＡの相補鎖内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の５’末端における１４個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの部分にわたって０％となる。その場合、ＤＮＡターゲティング配列は、１４ヌクレオチド長であると見なすことができる。別の例では、ＤＮＡターゲティング配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の相補性率（％）は、標的ＤＮＡの相補鎖内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の５’末端における７個の隣接ヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの部分にわたって０％となる。その場合、ＤＮＡターゲティング配列は、７ヌクレオチド長であると見なすことができる。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチドの２つの区間を含むことができる。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチド同士はハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。対象となるｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントがＣａｓタンパク質と相互作用すると、ｇＲＮＡは、ＤＮＡターゲティングセグメントを介して、結合したＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列へと誘導する。
ガイドＲＮＡは、更なる所望の特性（例えば、改変又は調節された安定性、細胞内ターゲティング、蛍光標識による追跡、タンパク質又はタンパク質複合体に対する結合部位など）を与える改変又は配列を含んでもよい。そのような改変の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリＡテール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質複合体による調節された安定性及び／又は調節されたアクセシビリティーを可能にすること）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわちヘアピン）を形成する配列、細胞内部位（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）にＲＮＡを標的化する改変又は配列、追跡を可能とする改変又は配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部位への結合、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、転写アクチベーター、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含むＤＮＡに作用するタンパク質）との結合部位を与える改変又は配列、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードした核酸配列を含むことができる。例えば、ｇＲＮＡは、（ａ）核酸配列５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ−３’（配列番号１）を有するキメラＲＮＡ、又は（ｂ）核酸配列５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３’（配列番号２）を有するキメラＲＮＡを含むことができる。
特定の場合では、ｃｒＲＮＡは、５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３’（配列番号３）、５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧ（配列番号４）、又は５’−ＧＡＧＵＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＵＵＵＵＡ−３’（配列番号５）を含む。
特定の場合では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、５’−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３’（配列番号６）又は５’−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ−３’（配列番号７）を含む。
ガイドＲＮＡは、任意の形態で与えることができる。例えば、ｇＲＮＡは、２分子（別々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）として又は１分子（ｓｇＲＮＡ）としてＲＮＡの形態で、また場合によりＣａｓタンパク質との複合体の形態で与えることができる。ｇＲＮＡは、ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形態で与えることもできる。ｇＲＮＡをコードしたＤＮＡは、１個のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）又は別々のＲＮＡ分子（例えば、別々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしたものであってよい。後者の場合、ｇＲＮＡをコードしたＤＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードした別々のＤＮＡ分子として与えることができる。
ｇＲＮＡをコードしたＤＮＡが細胞内に導入されると、ｇＲＮＡは、細胞内で一時的、条件的、又は構成的に発現されうる。ｇＲＮＡをコードしたＤＮＡは細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞内で活性を有するプロモーターに機能的に連結されてもよい。あるいは、ｇＲＮＡをコードしたＤＮＡは、発現コンストラクト内のプロモーターに機能的に連結されてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードしたＤＮＡは、核酸インサートを含むターゲティングベクター及び／又はｇＲＮＡをコードした核酸を含むベクター内に存在してよい。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードしたＤＮＡは、核酸インサートを含むターゲティングベクター及び／又はｇＲＮＡをコードする核酸を含むベクターとは別個のベクター又はプラスミド内に存在してもよい。発現コンストラクトに使用することができるプロモーターとしては、例えば、多能性ラット細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳類細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、又はハムスター細胞内で活性を有するプロモーターが挙げられる。１細胞期胚で活性を有するプロモーターを使用することもできる。そのようなプロモーターは、例えば、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターであってよい。特定の場合では、プロモーターは、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、又はマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。他のプロモーターの例は、本明細書の別の個所で述べる。
あるいは、ｇＲＮＡは、様々な他の方法によって調製することができる。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって調製することができる（例えば、国際公開第２０１４／０８９２９０号及び同第２０１４／０６５５９６号を参照されたい。尚、各文献の全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する）。ガイドＲＮＡは、化学合成によって調製された、人工的に作成された分子であってもよい。
Ｃ．ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列
「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列」なる用語は、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントが結合する標的ＤＮＡ内に存在する核酸配列を含むが、ただし、結合のための充分な条件が存在することを条件とする。例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、ガイドＲＮＡがそれに対する相補性を有するように設計される配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とＤＮＡターゲティング配列との間のハイブリダイゼーションによってＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションが生じてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するだけの充分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、下記により詳細に説明するＣａｓタンパク質の切断部位も含む。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、例えば、細胞の核若しくは細胞質又はミトコンドリア若しくは葉緑体などの細胞の小器官内に存在しうる任意のポリヌクレオチドを含むことができる。
標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡによってターゲティングすることができる（すなわち、Ｃａｓタンパク質若しくはｇＲＮＡが結合するか、又はＣａｓタンパク質若しくはｇＲＮＡにハイブリダイズするか、又はＣａｓタンパク質若しくはｇＲＮＡと相補的でありうる）。適当なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞内に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の適当なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は当該技術分野では周知のものである（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。）。Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡと相補的であり、これらとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は「相補鎖」と呼ぶことができ、「相補鎖」と相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡと相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は「非相補鎖」又は「鋳型鎖」と呼ぶことができる。
Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントが結合する標的ＤＮＡ内に存在する核酸配列の内側又は外側の部位で核酸を切断することができる。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断又は二本鎖切断を形成する核酸の位置を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したｇＲＮＡを含む）は、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントが結合する標的ＤＮＡ内に存在する核酸配列内又はその近く（例えばそこから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対、又はそれよりも多い塩基対以内）で、一方又は両方の鎖の切断を生じうる。切断部位が、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントが結合する核酸配列の外側にある場合でも、切断部位は「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列」内にあると見なされる。切断部位は、核酸の一方のみの鎖又は両方の鎖上にあってもよい。切断部位は、核酸の両方の鎖の同じ位置にあってもよく（平滑末端を生じる）、又はそれぞれの鎖の異なる部位にあってもよい（付着末端を生じる）。付着末端は、例えば、それぞれがそれぞれの鎖の異なる切断部位に一本鎖切断を形成することによって二本鎖切断を形成する２種類のＣａｓタンパク質を使用することによって形成されうる。例えば、第１のニッカーゼによって二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖に一本鎖切断を形成し、第２のニッカーゼによってｄｓＤＮＡの第２の鎖に一本鎖切断を形成することができ、これにより突出配列が形成される。特定の場合では、第１の鎖のニッカーゼのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、第２の鎖のニッカーゼのＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ認識配列から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、又は１，０００塩基対だけ離れている。
Ｃａｓ９による標的ＤＮＡの部位特異的切断は、標的ＤＮＡ内の、（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの塩基対合相補性、及び（ｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で生じうる。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列に隣接することができる。場合により、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の３’末端にＰＡＭが隣接してもよい。例えば、Ｃａｓ９の切断部位は、ＰＡＭ配列の約１〜約１０又は約２〜約５塩基対（例えば、３塩基対）だけ上流又は下流に位置することができる。特定の場合では、（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９又は近縁のＣａｓ９が使用される場合）非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−Ｎ１ＧＧ−３’でありうる（ただし、Ｎ１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの非相補鎖のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列のすぐ３’側に位置する）。したがって、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＮ２−３’である（ただし、Ｎ２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの相補鎖のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列のすぐ５’側に位置する）。いくつかのそのような場合では、Ｎ１とＮ２とが相補的であってよく、Ｎ１−Ｎ２の塩基対は任意の塩基対であってよい（例えば、Ｎ１＝ＣでＮ２＝Ｇ、Ｎ１＝ＧでＮ２＝Ｃ、Ｎ１＝ＡでＮ２＝Ｔ、又はＮ１＝ＴでＮ２＝Ａ）。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の例には、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントと相補的なＤＮＡ配列、又はＰＡＭ配列以外のそのようなＤＮＡ配列が含まれる。例えば、標的モチーフは、Ｃａｓタンパク質により認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列、例えばＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号８）又はＮ２０ＮＧＧ（配列番号９）であってよい（例えば、国際公開第２０１４／１６５８２５号を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する）。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の他の例は、インビトロでＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するために、５’末端に２個のグアニンヌクレオチドを有することができる（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ、配列番号１０）。例えば、国際公開第２０１４／０６５５９６号を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。他のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、５’末端にＧ又はＧＧ及び３’末端にＧＧ又はＮＧＧを有する、配列番号８〜１０のヌクレオチド４〜２２個の長さを有することができる。更に他のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、配列番号８〜１０のヌクレオチド１４〜２０個の長さを有することができる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の具体的な例としては、配列番号１１〜３８のいずれか１つを有する核酸と相補的なＤＮＡ配列が挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、細胞に内因性又は外因性の任意の核酸配列であってよい。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列若しくは非コード配列（例えば制御配列）であってもよく、又は両方を有してもよい。特定の場合では、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は疾患関連遺伝子若しくは核酸内、及び／又はシグナル伝達経路関連遺伝子若しくは核酸内にあってよい。疾患関連遺伝子又は核酸には、非疾患コントロールの組織又は細胞と比較して疾患組織に由来する細胞において転写産物又は翻訳産物を異常なレベル又は異常な形態で生成する任意の遺伝子又は核酸が含まれる。例えば、疾患関連遺伝子は、直接疾患の原因となるか又は疾患の原因となる１以上の遺伝子と連鎖不平衡にある１以上の突然変異又は遺伝子変異を有しうる。転写又は翻訳される産物は既知のものであっても未知のものであってもよく、正常又は異常なレベルでありうる。疾患関連遺伝子又は核酸の例は、ジョンズホプキンス大学（メリーランド州ボルチモア）のＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、及びアメリカ国立医学図書館（メリーランド州ベセスダ）の米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）より入手可能であり、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ上で提供されている。疾患関
連遺伝子又は核酸の例については、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用するところの米国特許第８，６９７，３５９号を参照されたい。
疾患原因遺伝子における突然変異は、劣性突然変異又は優性突然変異でありうる。二倍体の生物（すなわちそれぞれの染色体の２本のコピーを有する生物）は、それぞれの遺伝子の２つのコピーを通常有している。ある個体においてこの２つのコピーが同じである場合、その個体はその遺伝子についてホモ接合型である。このコピーが互いに異なる対立遺伝子である場合、その個体はその遺伝子についてヘテロ接合型である。遺伝子型なる用語には、ある個体が１個の遺伝子（又は複数の遺伝子）に突然変異を有しているか否かが含まれ、表現型なる用語には、その遺伝子型の物理的及び機能的な結果が含まれる。劣性突然変異は、突然変異体の表現型が観察されるためには両方の対立遺伝子が突然変異体でなければならない突然変異を含む（すなわちその生物は、突然変異体の表現型を示すためには突然変異体対立遺伝子についてホモ接合型でなければならない）。劣性突然変異は、例えば変異の生じた遺伝子を不活性化させ、機能の喪失につながりうる。例えば、劣性突然変異は、染色体からある遺伝子の全体又は一部を除去するか、遺伝子の発現を妨げるか、又はコードされたタンパク質の構造を変化させることによりその機能を変化させるものでありうる。これに対して、優性突然変異は、その突然変異についてヘテロ接合型である生物で突然変異体の表現型が認められる突然変異を含む（すなわちその生物は１個の突然変異体対立遺伝子と１個の野生型対立遺伝子を有している）。優性突然変異は例えば機能の獲得につながりうる。例えば、優性突然変異は、特定の遺伝子産物の活性を増大させるか、その遺伝子産物に新たな活性を与えるか、又はその空間的及び時間的に不適当な発現につながりうる。優性突然変異は機能の喪失をともなう場合もある。特定の場合では、遺伝子の２つのコピーが正常な機能に必要とされ、１個のコピーを除去することで突然変異体の表現型が引き起こされる。このような遺伝子はハプロ不全である。他の場合では、一方の対立遺伝子における突然変異が、他方の対立遺伝子によってコードされる野生型対立遺伝子の機能を阻害するタンパク質の構造変化をもたらしうる。このような突然変異は優性ネガティブ突然変異である。対立遺伝子には、劣性及び優性の表現型の両方をともなうものもある。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列には、突然変異を有する遺伝子又は核酸内に位置するものもある。そのような突然変異は例えば優性突然変異又は劣性突然変異でありうる。特定の例では、優性突然変異は、優性突然変異についてヘテロ接合型である細胞内に存在する（すなわちその細胞は１個の野生型対立遺伝子と、優性突然変異を有する１個の突然変異体対立遺伝子とを有する）。そのような場合の一部では、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は野生型対立遺伝子ではなく突然変異体対立遺伝子内に存在しうる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は突然変異体対立遺伝子ではなく野生型対立遺伝子内に存在する場合もある。
ＩＩＩ．ターゲティングベクター及び核酸インサート
本明細書に開示される方法及び組成物では、核酸インサート及びホモロジーアームを含むターゲティングベクターを使用して細胞内のゲノムを改変することもできる。かかる方法では、核酸インサートは、相同組換え事象を介してホモロジーアームによって決定されるゲノム標的遺伝子座に組み込まれる。本明細書で提供される方法は、相同組換え事象と組み合わせてヌクレアーゼ剤（例えばＣａｓタンパク質）を利用することができる。かかる方法では、ヌクレアーゼ剤によってヌクレアーゼ切断部位に形成されるニック又は二本鎖切断を相同組換えと組み合わせて利用することで、ゲノム標的遺伝子座への核酸インサートのターゲティングによる挿入を促進することができる。
Ａ．１細胞期胚以外の細胞用のターゲティングベクター及び核酸インサート
（１）核酸インサート
本明細書に開示される方法では１以上の別々の核酸インサートを使用することができ、これらの核酸インサートは、別々のターゲティングベクターにより、又は同じターゲティングベクター上で細胞に導入することができる。核酸インサートは、ゲノム標的遺伝子座に組み込むためのＤＮＡのセグメントを含む。標的遺伝子座への核酸インサートの組み込みは、標的遺伝子座への対象となる核酸配列の付加、標的遺伝子座における対象となる核酸配列の欠失、及び／又は標的遺伝子座における対象となる核酸配列の置換を生じることができる。
核酸インサート又は置換される標的遺伝子座の対応する核酸は、コード領域、イントロン、エクソン、非翻訳領域、調節領域、プロモーター、エンハンサー、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。更に、核酸インサート又は置換される標的遺伝子座の対応する核酸は、例えば、１０〜１００ヌクレオチド長、１００〜５００ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド〜１ｋｂ長、１ｋｂ〜１．５ｋｂヌクレオチド長、１．５ｋｂ〜２ｋｂヌクレオチド長、２ｋｂ〜２．５ｋｂヌクレオチド長、２．５ｋｂ〜３ｋｂヌクレオチド長、３ｋｂ〜５ｋｂヌクレオチド長、５ｋｂ〜８ｋｂヌクレオチド長、８ｋｂ〜１０ｋｂヌクレオチド長、又はそれ以上の長さを有する任意の所望の長さのものであってよい。他の場合では、その長さは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約２．８Ｍｂ、約２．８Ｍｂ〜約３Ｍｂであってもよい。更に他の場合では、その長さは、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、若しくは９００ヌクレオチド、又は少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ以上であってもよい。核酸インサートには更に小さいものがあってもよい。例として、約４ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチドの長さのインサートを挿入して制限酵素部位を形成することができる。
特定のターゲティングベクターでは、核酸インサートは、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂであってよい。あるいは、核酸インサートは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂであってもよい。
特定の場合では、標的遺伝子座の核酸の置換によって、約１ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２ｋｂ〜約２０ｋｂ、又は約０．５ｋｂ〜約３Ｍｂの範囲の核酸配列の欠失が生じる。特定の場合では、欠失の範囲は、５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームの合計の長さよりも大きい。
特定の場合では、核酸配列の欠失の範囲は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約２．８Ｍｂ、約２．８Ｍｂ〜約３Ｍｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲である。
他の場合では、核酸インサート又は置換される標的遺伝子座の対応する核酸は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってよい。
核酸インサートは、ゲノムＤＮＡ又は任意の他の種類のＤＮＡを含むことができる。例えば、核酸インサートは、原核生物、真核生物、酵母、鳥類（例えばニワトリ）、非ヒト哺乳動物、げっ歯動物、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えばマーモセット、アカゲザル）、家畜用哺乳動物若しくは農業用哺乳動物、又は他の任意の対象となる生物に由来するものであってよい。
核酸インサート及び／又は標的遺伝子座における核酸は、コード配列又は調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、若しくは転写リプレッサー結合エレメント）などの非コード配列を含んでもよい。例えば、核酸インサートは、内因性遺伝子の少なくとも１つのエクソンのノックイン対立遺伝子、又は外因性遺伝子全体のノックイン対立遺伝子（すなわち、「遺伝子スワップノックイン」）を含んでもよい。
例えば、核酸インサートは、ゲノム標的遺伝子座のターゲティングにより欠失させようとする配列とホモロガスであるか又はオルソロガスであってよい。このようなホモロガス又はオルソロガスな核酸インサートによって、ゲノム標的遺伝子座のターゲティングにより欠失させようとする配列を置換することができる。ホモロガスな配列は、既知の参照配列と同じであるか又は大きく類似した核酸配列を有し、既知の参照配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同じである。オルソロガスな配列には、別の種の既知の参照配列と機能的に同等である１つの種からの核酸配列が含まれる。これにより、核酸インサートの挿入がホモロガス又はオルソロガスなヒト核酸配列による非ヒト核酸配列の置換を生じる（すなわち核酸インサートが対応する非ヒトＤＮＡ配列の代わりにその内因性ゲノム遺伝子座に挿入される）場合に遺伝子座のヒト化を生じることができる。
核酸インサートは、条件的対立遺伝子（conditional allele）を含んでもよい。条件
的対立遺伝子は、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用するところの米国特許第２０１１／０１０４７９９号に記載されるように、多機能性対立遺伝子であってもよい。例えば、条件的対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に対してセンス方向の作動配列（actuating sequence）、（ｂ）センス方向又はアンチセンス方向の薬剤選択カセ
ット（ＤＳＣ）、（ｃ）アンチセンス方向の対象ヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、及び（ｄ）「逆位による条件的」（conditional by inversion）モジュール（ＣＯＩＮ）（エクソンを分割するイントロン及びジーントラップ様モジュールを利用したもの）を含むことができる。例えば米国特許出願公開第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。条件的対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼに曝露されることで組み換えを起こして、（ｉ）作動配列及びＤＳＣを欠き、かつ（ｉｉ）センス方向のＮＳＩ及びアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む条件的対立遺伝子を形成する組み換え可能な単位を更に含んでもよい。米国特許出願公開第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。
特定の核酸インサートは、選択マーカーをコードしたポリヌクレオチドを含む。選択マーカーは、選択カセット内に含まれてもよい。かかる選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、若しくは単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。選択マーカーをコードしたポリヌクレオチドは、ターゲティングされる細胞内で活性を有するプロモーターに機能的に連結されてもよい。プロモーターの例については、本明細書の別の個所で述べる。
特定のターゲティングベクターでは、核酸インサートはレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子の例としては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＭｍＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、及びそれらの組み合わせがある。かかるレポーター遺伝子は、ターゲティングされる細胞内で活性を有するプロモーターに機能的に連結されてもよい。プロモーターの例については、本明細書の別の個所で述べる。
特定のターゲティングベクターでは、核酸インサートは、１以上の発現カセット又は欠失カセットを含む。特定の発現カセットは、対象となるヌクレオチド配列、選択マーカーをコードした核酸配列、及び／又はレポーター遺伝子を、発現に影響を与える様々な調節要素とともに含むことができる。含まれうる選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の例については、本明細書の別の箇所で詳細に考察する。
特定のターゲティングベクターでは、核酸インサートは、部位特異的組み換え標的配列が隣接した核酸を含む。核酸インサート全体にそのような部位特異的組み換え標的配列が隣接してもよいが、核酸インサート内の任意の対象となる領域又は個々のポリヌクレオチドにそのような部位が隣接してもよい。核酸インサート又は核酸インサート中の任意の対象ポリヌクレオチドに隣接させることができる部位特異的組み換え標的配列としては、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、及びこれらの組み合わせが挙げることができるが、これらに限定されない。１つの例では、部位特異的組み換え部位は、核酸インサート内に含まれる選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子をコードしたポリヌクレオチドに隣接する。標的遺伝子座に核酸インサートが組み込まれた後、部位特異的組換え部位間の配列は除去されてもよい。
（２）ターゲティングベクター
標的ゲノム遺伝子座に核酸インサートを導入するためにターゲティングベクターを用いることができるが、このようなターゲティングベクターは核酸インサート及び核酸インサートに隣接したホモロジーアームを含む。ターゲティングベクターは直鎖状又は環状であってよく、一本鎖又は二本鎖であってもよい。ターゲティングベクターは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）であってよい。参照を容易にするため、本明細書ではホモロジーアームを、５’及び３’（すなわち、上流及び下流）ホモロジーアームと呼ぶ。この呼び方は、ターゲティングベクター内の核酸インサートに対するホモロジーアームの相対位置に関する。５’及び３’ホモロジーアームは、本明細書においてそれぞれ「５’」標的配列及び「３’」標的配列と呼ばれる標的遺伝子座内の領域に対応している。特定のターゲティングベクターは、５’及び３’ホモロジーアームを有するが核酸インサートは有さない。そのようなターゲティングベクターは、核酸インサートを挿入することなく５’標的配列と３’標的配列との間の配列を欠失させるように機能することができる。
ホモロジーアームと標的配列とは、これら２つの領域が相同組み換え反応の基質として機能するように互いに充分な配列同一性を共有している場合に、相互に「対応する」又は「対応している」という。「相同性」なる用語には、対応する配列と同じであるか又は配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含まれる。特定の標的配列とターゲティングベクター上に見られる対応するホモロジーアームとの間の配列同一性は、相同組み換えが生じることを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、ターゲティングベクターのホモロジーアーム（又はそのフラグメント）と標的配列（又はそのフラグメント）とによって共有される配列同一性の量は、配列同士が相同組み換えを起こすように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性であってよい。更に、ホモロジーアームと対応する標的配列との間の対応する相同性領域は、切断された認識部位における相同組み換えを促進するために充分な任意の長さであってよい。例えば、特定のホモロジーアーム及び／又は対応する標的配列は、ホモロジーアームが、細胞のゲノム内の対応する標的配列と相同組み換えを起こすために充分な相同性を有するよう、（例えば、本明細書の別の箇所に述べられるＬＴＶＥＣベクターにおいて述べられるように）約５〜１０ｋｂ、５〜１５ｋｂ、５〜２０ｋｂ、５〜２５ｋｂ、５〜３０ｋｂ、５〜３５ｋｂ、５〜４０ｋｂ、５〜４５ｋｂ、５〜５０ｋｂ、５〜５５ｋｂ、５〜６０ｋｂ、５〜６５ｋｂ、５〜７０ｋｂ、５〜７５ｋｂ、５〜８０ｋｂ、５〜８５ｋｂ、５〜９０ｋｂ、５〜９５ｋｂ、５〜１００ｋｂ、１００〜２００ｋｂ、若しくは２００〜３００ｋｂ、又はそれ以上の対応する相同性領域を含むことができる。
ホモロジーアームは、細胞の在来の遺伝子座（例えば標的遺伝子座）に対応してもよく、あるいは、ホモロジーアームは、例えば、導入遺伝子、発現カセット、又は異種若しくは外因性のＤＮＡの領域を含む、細胞のゲノムに組み込まれた異種若しくは外因性のＤＮＡのセグメントの領域に対応してもよい。あるいは、ターゲティングベクターのホモロジーアームは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、若しくはヒト人工染色体の領域、又は適当な宿主細胞に含まれる他の操作された領域に対応してもよい。なお更に、ターゲティングベクターのホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、又はＰ１ファージライブラリーの領域に対応してもよいか、又はそれらから誘導されてもよい。特定の場合では、ターゲティングベクターのホモロジーアームは、原核生物、酵母、鳥類（例えばニワトリ）、非哺乳動物、齧歯動物、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えばマーモセット、アカゲザル）家畜用哺乳動物又は農業用哺乳動物、又は他の対象とする生物に在来、異種、又は外因性のものであってよい。特定の場合では、ホモロジーアームは、ヌクレアーゼ剤（例えばＣａｓタンパク質）によって誘導されるニック若しくは二本鎖切断が存在しなければ、従来法を用いてターゲティングできないか、又は不正確にターゲティングされるだけであるか若しくは著しく低い効率でしかターゲティングできない細胞内の遺伝子座に対応する。特定の場合では、ホモロジーアームは、合成ＤＮＡから誘導される。
特定のターゲティングベクターでは、５’及び３’ホモロジーアームは標的ゲノムに対応している。あるいは、ホモロジーアームは関連するゲノムに由来するものでもよい。例えば、標的ゲノムは第１の系統のマウスゲノムに由来するものであり、ターゲティングアームが第２の系統のマウスゲノムに由来するものであり、ただし第１の系統と第２の系統とは異なる。特定の例では、ホモロジーアームは同じ動物のゲノムに由来するか又は同じ系統のゲノムに由来する。例えば、標的ゲノムが第１の系統のマウスゲノムであり、ターゲティングアームは同じマウスから、又は同じ系統からのマウスゲノムに由来するものである。
ターゲティングベクターのホモロジーアームは、例えば少なくとも５〜１０ｋｂ、５〜１５ｋｂ、５〜２０ｋｂ、５〜２５ｋｂ、５〜３０ｋｂ、５〜３５ｋｂ、５〜４０ｋｂ、５〜４５ｋｂ、５〜５０ｋｂ、５〜５５ｋｂ、５〜６０ｋｂ、５〜６５ｋｂ、５〜７０ｋｂ、５〜７５ｋｂ、５〜８０ｋｂ、５〜８５ｋｂ、５〜９０ｋｂ、５〜９５ｋｂ、５〜１００ｋｂ、１００〜２００ｋｂ、若しくは２００〜３００ｋｂの長さ、又はそれ以上を含む、対応する標的部位との相同組み換え事象を促進するために充分な任意の長さであってよい。下記に更に詳細に述べるように、ラージターゲティングベクターでは、より大きな長さのターゲティングアームを用いることができる。
標的遺伝子座の改変を助けるため、ターゲティングベクターと組み合わせてヌクレアーゼ剤（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）を用いることができる。そのようなヌクレアーゼ剤は、ターゲティングベクターと標的遺伝子座との間の相同組み換えを促進することができる。ヌクレアーゼ剤がターゲティングベクターと組み合わせて使用される場合、ターゲティングベクターは、ヌクレアーゼ切断部位にニック又は二本鎖切断が生じる際に標的配列とホモロジーアームとの間の相同組み換え事象の発生を促進するようにヌクレアーゼ切断部位の充分近くに位置する５’及び３’標的部位に対応した５’及び３’ホモロジーアームを含んでもよい。「ヌクレアーゼ切断部位」なる用語には、ヌクレアーゼ剤によってニック又は二本鎖切断が形成されるＤＮＡ配列が含まれる（例えば、Ｃａｓ９切断部位）。ターゲティングベクターの５’及び３’ホモロジーアームに対応する標的遺伝子座内の標的配列同士は、その距離が認識部位にニック又は二本鎖切断が生じる際に５’及び３’標的配列とホモロジーアームとの間の相同組み換え事象の発生を促進するようなものである場合に、ヌクレアーゼ切断部位の「充分近くに位置」する。したがって、具体的な場合では、ターゲティングベクターの５’及び／又は３’ホモロジーアームに対応する標的配列は、特定の認識部位の少なくとも１ヌクレオチド以内であるか、又は特定の認識部位の少なくとも１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂ以内である。特定の場合では、ヌクレアーゼ切断部位は、標的配列の少なくとも一方又は両方に直接隣接する。
ターゲティングベクターのホモロジーアームに対応する標的配列とヌクレアーゼ切断部位との位置関係は異なりうる。例えば、標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位の５’側に位置してもよく、標的配列はヌクレアーゼ切断部位の３’側に位置してもよく、又は標的配列はヌクレアーゼ切断部位に隣接してもよい。
（例えば、ラージターゲティングベクターを含む）ターゲティングベクターとヌクレアーゼ剤とを組み合わせて使用することによって、ターゲティングベクター単独での使用と比較して、ターゲティング効率を向上させることができる。例えば、ターゲティングベクターがヌクレアーゼ剤と組み合わせて使用される場合、ターゲティングベクターのターゲティング効率は、ターゲティングベクター単独での使用と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、又は少なくとも１０倍向上しうる。
（３）ラージターゲティングベクター
一部のターゲティングベクターは、「ラージターゲティングベクター」又は「ＬＴＶＥＣ」であり、これには、細胞内で相同組み換えを行うことを目的とした他の手法で一般的に使用される核酸配列よりも大きな核酸配列に相当し、このような大きな核酸配列から誘導されたホモロジーアームを含むターゲティングベクターが含まれる。ＬＴＶＥＣには、細胞内で相同組み換えを行うことを目的とした他の手法で一般的に使用される核酸配列よりも大きな核酸配列を有する核酸インサートを含むターゲティングベクターも含まれる。例えば、ＬＴＶＥＣは、従来のプラスミド系ターゲティングベクターではそれらのサイズ制限のために対処することができない大きな遺伝子座の改変を可能にする。例えば、標的遺伝子座は、ヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニック若しくは二本鎖切断が存在しなければ、従来法を用いてターゲティングできないか、又は不正確にターゲティングされるだけであるか若しくは著しく低い効率でしかターゲティングできない細胞内の遺伝子座であってよい（すなわち５’及び３’ホモロジーアームがこの遺伝子座に相当してよい）。
ＬＴＶＥＣの例としては、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）から誘導されるベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ＬＴＶＥＣ及びその作成方法の非限定的な例については、例えば、参照によりそれぞれを本明細書に援用するところの米国特許第６，５８６，２５１号、米国特許第６，５９６，５４１号、米国特許第７，１０５，３４８号、及び国際公開第２００２／０３６７８９号（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／４５３７５号）に記載されている。ＬＴＶＥＣは、直鎖状又は環状であってよい。
ＬＴＶＥＣは、例えば、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、又は約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂを含む任意の長さであってよい。あるいは、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。ＬＴＶＥＣのサイズは大きすぎるために、従来のアッセイ、例えばサザンブロッティング及びロングレンジ（例えば、１ｋｂ〜５ｋｂ）ＰＣＲ）によるターゲティング事象のスクリーニングを行えない可能性がある。
特定の場合では、ＬＴＶＥＣは、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂの範囲の核酸インサートを含む。他の場合では、核酸インサートは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲であってもよい。
特定のＬＴＶＥＣでは、５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとの合計は、少なくとも１０ｋｂである。他のＬＴＶＥＣでは、５’ホモロジーアームは、約５ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲であり、かつ／又は３’ホモロジーアームは、約５ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲である。それぞれのホモロジーアームは、例えば、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂであってよい。５’及び３’ホモロジーアームの合計は、例えば、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂであってよい。あるいは、それぞれのホモロジーアームが、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、又は少なくとも２００ｋｂであってもよい。同様に、５’及び３’ホモロジーアームの合計は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。
特定の場合では、ＬＴＶＥＣ及び核酸インサートは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの標的遺伝子座の欠失を可能にするように設計される。あるいは、この欠失は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。
他の場合では、ＬＴＶＥＣ及び核酸インサートは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲の外因性核酸配列の標的遺伝子座への挿入を可能にするように設計される。あるいは、この挿入は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。
更に他の場合では、核酸インサート及び／又は欠失される内因性遺伝子座の領域は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、若しくは９００ヌクレオチド、又は少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、又はそれ以上である。
Ｂ．１細胞期胚用のターゲティングベクター及び核酸インサート
１細胞期胚に使用するためのターゲティングベクターは、長さが５ｋｂ以下であり、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）であってよく、一本鎖又は二本鎖であってよく、環状又は直鎖状であってよい。１細胞期胚に使用するための代表的なターゲティングベクターは、約５０ヌクレオチド〜約５ｋｂの長さである。例えば、１細胞期胚に使用するためのターゲティングベクターは、約５０〜約１００、約１００〜約２００、約２００〜約３００、約３００〜約４００、約４００〜約５００、約５００〜約６００、約６００〜約７００、約７００〜約８００、約８００〜約９００、又は約９００〜約１，０００ヌクレオチドの長さであってよい。あるいは、１細胞期胚に使用するためのターゲティングベクターは、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約４．５ｋｂ、又は約４．５ｋｂ〜約５ｋｂの長さであってもよい。あるいは、１細胞期胚に使用するためのターゲティングベクターは、例えば、５ｋｂ、４．５ｋｂ、４ｋｂ、３．５ｋｂ、３ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、１．５ｋｂ、１ｋｂ、９００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、又は５０ヌクレオチド以下の長さであってもよい。一本鎖ＤＮＡのドナーの場合では、代表的なターゲティングベクターは、約６０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチド（例えば、約６０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約１２０ヌクレオチド、約１２０ヌクレオチド〜約１４０ヌクレオチド、約１４０ヌクレオチド〜約１６０ヌクレオチド、約１６０ヌクレオチド〜約１８０ヌクレオチド、又は約１８０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチド）であってよい。
そのようなターゲティングベクターは、ターゲティングされる遺伝子座（それぞれ５’標的配列及び３’標的配列）内の領域に対応した５’及び３’ホモロジーアームを含んでいる。場合により、ターゲティングベクターは、５’及び３’ホモロジーアームを隣接させた核酸インサート（ゲノムの標的遺伝子座に組み込もうとするＤＮＡのセグメント）を含む。標的遺伝子座への核酸インサートの組み込みにより、対象とする核酸配列の標的遺伝子座への付加、対象とする核酸配列の標的遺伝子座における欠失、及び／又は対象とする核酸配列の標的遺伝子座における置換（すなわち欠失及び挿入）を生じさせることができる。
更に、ホモロジーアームと対応する標的配列との対応する相同領域は、相同組み換えを促すうえで充分な任意の長さのものとすることができる。１細胞期胚に使用するための代表的なホモロジーアームは、約２０ヌクレオチド〜約２．５ｋｂの長さ（例えば約３０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さ）であってよい。例えば、特定のホモロジーアーム及び／又は対応する標的配列は、ホモロジーアームが細胞のゲノム内の対応する標的配列と相同組み換えを起こすような充分な相同性を有するように、約２０〜約３０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５０〜約６０、約６０〜約７０、約７０〜約８０、約８０〜約９０、約９０〜約１００、約１００〜約１５０、約１５０〜約２００、約２００〜約２５０、約２５０〜約３００、約３００〜約３５０、約３５０〜約４００、約４００〜約４５０、又は約４５０〜約５００ヌクレオチドの長さの対応する相同領域を有することができる。あるいは、特定のホモロジーアーム及び／又は対応する標的配列は、約０．５ｋｂ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、又は約２ｋｂ〜約２．５ｋｂの長さの対応する相同領域を含んでもよい。一本鎖のＤＮＡドナーの場合では、代表的なホモロジーアームは、約３０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド（例えば、約３０〜約４０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、又は約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド）であってよい。
ホモロジーアームは、細胞に本来存在する遺伝子座（例えば、ターゲティングされる遺伝子座）に対応したものか、又は、細胞のゲノム内に組み込まれた異種若しくは外因性のＤＮＡのセグメントの領域に対応したものとすることができる。上記に述べたように、５’及び３’標的配列は、Ｃａｓ切断部位に一本鎖切断（ニック）又は二本鎖切断が形成される際に標的配列とホモロジーアームとの間での相同組み換え事象が生じやすくなるようにＣａｓ切断部位の充分近くに位置していることが好ましい。
核酸インサート又は欠失及び／又は置換される標的遺伝子座における対応する核酸は様々な長さでありうる。代表的な核酸インサート又は欠失及び／又は置換される標的遺伝子座の対応する核酸は、約１０ヌクレオチド〜約５ｋｂの長さである。例えば、核酸インサート又は欠失及び／又は置換される標的遺伝子座の対応する核酸は、約１〜約１０、約１０〜約２０、約２０〜約３０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５０〜約６０、約６０〜約７０、約７０〜約８０、約８０〜約９０、約９０〜約１００、約１００〜約１１０、約１１０〜約１２０、約１２０〜約１３０、約１３０〜約１４０、約１４０〜約１５０、約１５０〜約１６０、約１６０〜約１７０、約１７０〜約１８０、約１８０〜約１９０、約１９０〜約２００、約２００〜約３００、約３００〜約４００、約４００〜約５００、約５００〜約６００、約６００〜約７００、約７００〜約８００、約８００〜約９００、又は約９００〜約１，０００ヌクレオチドの長さであってよい。例として、約４ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチドの長さのインサートを挿入して制限酵素部位を形成することができる。同様に、核酸インサート又は欠失及び／又は置換される標的遺伝子座の対応する核酸は、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約４．５ｋｂ、又は約４．５ｋｂ〜約５ｋｂの長さであってよい。ゲノムの標的遺伝子座から欠失される核酸は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約２００ｋｂ、約ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜約９００ｋｂ、約９００ｋｂ〜約１Ｍｂ又はそれよりも長くてもよい。あるいは、ゲノムの標的遺伝子座から欠失される核酸は、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂ、約３Ｍｂ〜約４Ｍｂ、約４Ｍｂ〜約５Ｍｂ、約５Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂであってもよい。
上記に述べたように、核酸インサートはゲノムＤＮＡ又は他の任意の種類のＤＮＡを含んでよく、核酸インサート又は欠失及び／又は置換される標的遺伝子座の対応する核酸は、コード領域又は非コード領域であってよく、更に、核酸インサートは、標的ゲノム遺伝子座に欠失を生じさせるためにターゲティングされる配列に対してホモロガス又はオルソロガスであってよい。核酸インサートは、条件的対立遺伝子、選択マーカーをコードしたポリヌクレオチド、レポーター遺伝子、１以上の発現カセット、１以上の欠失カセット、又は上記に述べたような部位特異的組換え標的配列を隣接させた核酸を含む核酸インサートを含んでもよい。
Ｃ．プロモーター
本明細書に述べられる様々な核酸配列は、プロモーターと機能的に連結することができる。そのようなプロモーターは、例えば、多能性ラットの細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、又はハムスター細胞中で活性なものであってよい。１細胞期胚において活性であるプロモーターを使用することもできる。プロモーターは例えば、構成的に活性であるプロモーター、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば発生的に調節されるプロモーター）、又は空間的に制限されたプロモーター（例えば細胞特異的又は組織特異的プロモーター）とすることができる。プロモーターの例は、例えば国際公開第２０１３／１７６７７２号に見ることができる。尚、その全容を参照により本明細書に援用する。
誘導性プロモーターの例としては、例えば化学的に調節されるプロモーター及び物理的に調節されるプロモーターが挙げられる。化学的に調節されるプロモーターとしては、例えば、アルコール調節プロモーター（例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えばテトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ−Ｏｎプロモーター、又はｔｅｔ−Ｏｆｆプロモーター）、ステロイド調節プロモーター（例えばラット糖質コルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体のプロモーター、又はエクジソン受容体のプロモーター）、又は金属調節プロモーター（例えば金属タンパク質プロモーター）が挙げられる。物理的に調節されるプロモーターとしては、例えば、温度調節プロモーター（例えばヒートショックプロモーター）及び光調節プロモーター（例えば光誘導性プロモーター又は光抑制性プロモーター）が挙げられる。
組織特異的プロモーターは、例えば、神経細胞特異的プロモーター、グリア細胞特異的プロモーター、筋細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、腎細胞特異的プロモーター、骨細胞特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、又は免疫細胞特異的プロモーター（例えばＢ細胞プロモーター又はＴ細胞プロモーター）であってよい。
発生的に調節されるプロモーターとしては、例えば、発生の胚形成期においてのみ、又は成体細胞においてのみ活性であるプロモーターが挙げられる。
プロモーターは細胞の種類に基づいて選択することもできる。例えば、様々な既知のプロモーターが、真核細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発生的に制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、又はＣＨＯ細胞に用途を見出している。
ＩＶ．ゲノムを改変する方法、及び遺伝子改変された非ヒト動物を作成する方法
Ａ．ゲノムを改変する方法
２種類のガイドＲＮＡを使用して１つのゲノム標的遺伝子座内の異なる領域をターゲティングすることによって細胞内のゲノムを改変するための様々な方法が提供される。２種類以上（例えば３種類のガイドＲＮＡ又は４種類のガイドＲＮＡ）のガイドＲＮＡを使用して１つのゲノム標的遺伝子座内の異なる領域をターゲティングする方法も提供される。これらの方法は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで行うことができる。かかる方法は、両対立遺伝子の遺伝子改変の形成を促進し、ゲノム破壊又は他のターゲティングによる改変、例えばゲノム内の核酸配列の欠失と外因性の核酸配列による置換を同時に行うことを含みうる。
ターゲティングベクターと標的遺伝子座との間の相同組み換えによるターゲティング遺伝子改変は、特にげっ歯類の胚性幹細胞以外の細胞種では極めて非効率でありうる。ターゲティングベクターと、標的遺伝子座におけるヌクレアーゼによる二本鎖ＤＮＡ切断とを組み合わせて用いることにより、小さな欠失又は挿入のような単純な改変についてヘテロ接合型のターゲティング効率を大幅に高めることができる。
ターゲティングベクターと、１種類のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）により導かれるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼとを組み合わせることによっても、マウス遺伝子の欠失と相当するヒト遺伝子による置換とを同時に行う（ヒト化）などの極めて大きくかつ低効率の遺伝子改変についてヘテロ接合型のターゲティング効率を高めることができる。かかる改変は極めて大きな（例えば５０ｋｂよりも大きい）欠失及び挿入をともないうる（例えば実施例１におけるＬｒｐ５、Ｃ５（Ｈｃ）、Ｒｏｒ１、及びＴｒｐａ１のターゲティング）。
標的ゲノム遺伝子座にＣａｓ９などのヌクレアーゼによって形成される１箇所以上の二本鎖切断が相同性に基づいて修復される際、こうした１箇所以上の切断部位は、最初に５’末端のリセクションによって突出した３’末端の一本鎖を生じるように加工（プロセス）される。次いでＲａｄ５１が、この一本鎖ＤＮＡ上で重合して相同な配列を探索し、損傷していない相同な鋳型二重鎖ＤＮＡ（例えばターゲティングベクター）内への鎖侵入が起こり、中間のＤループ構造が形成されて損傷していない相同ＤＮＡ（例えばターゲティングベクター）を鋳型として用いて１箇所以上の二本鎖切断の修復を促す。次に、隣接する相同領域が関与する二重交叉事象によってターゲティングベクターからの核酸インサートによって染色体の配列が置換される。このプロセスが正しく進行するかどうかは、核酸インサートのサイズ、ターゲティングベクターのホモロジーアームに相同な領域の長さ、及びターゲティングベクターのホモロジーアームに相同な領域の位置（例えば１以上の二本鎖切断に対する）などのいくつかの因子に影響される。
核酸インサート又は標的ゲノム遺伝子座のサイズが大きくなるほど、リセクション過程はより予測不能となり、中間のＤループ構造の安定性が低下してより予測不能となり、組換え反応の成功率は一般に低下してより予測不能となる。例えば、ターゲティングによる改変のサイズが大きくなるほど、特に置換される配列と挿入される配列とが似ている場合には内部組換えのリスクが大きくなる。このような内部組換えが起きる場合、相同組換えの交換が対象とする標的領域の内側で起きるために、完全な核酸インサートがゲノム標的遺伝子座に組み込まれない。更に、従来の考え方は、相同組換え（ＨＲ）によって媒介される挿入の効率は、二本鎖切断と突然変異又は挿入部位との間の距離が大きくなるほど（例えば１００ｂｐ又は２００ｂｐよりも）低くなるというものである。Ｂｅｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｅｓ￥Ｇｅｎｏｍｅｓ￥Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：６５７〜６６４；Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：９３〜１０１；及びＢｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３（３）：ｅ２１を参照されたい。これらをいずれもすべての目的でその全容にわたって参照により本明細書に援用する。
標的ゲノム遺伝子座に大きな欠失を生じると同時に大きな外来ＤＮＡ片を挿入するターゲティングによる遺伝子改変を実現するには、組換え中間体として二重オメガ構造が形成される必要がある。改変が大きくなるほどこの構造の安定性は低くなる。１細胞期胚以外の細胞種では、全体の相同性の総和が１０ｋｂ以上であるＬＴＶＥＣを使用することができる。全体の相同性の総和が１０ｋｂ以上であるホモロジーアームを有するＬＴＶＥＣは、二重オメガ組換え中間体の安定性を高めることによってヌクレアーゼにより媒介される大きな欠失及び同時に行われる大きな核酸インサートによる置換を促進し、更に、相同領域に隣接した二本鎖切断がターゲティング効率を高めることを可能とするばかりでなく、相同領域から遠く離れた二本鎖切断がターゲティング効率を高めることも可能とする。
極めて大きなヒト化を行う遺伝子改変では、ターゲティングベクターと２種類のｇＲＮＡにより導かれるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステムとを組み合わせることによって、１種類のｇＲＮＡを用いて実現されるよりもターゲティング効率を更に高めることができる（実施例１のＬｒｐ５、Ｃ５（Ｈｃ）、Ｒｏｒ１、及びＴｒｐａ１によるヒト化を参照）。２種類のｇＲＮＡの使用により、この点に関して予想外の結果がもたらされる。両対立遺伝子の改変を低頻度で生じるか又はまったく生じない１種類のｇＲＮＡを用いたターゲティングと比較して、２種類のｇＲＮＡによるターゲティングは、ホモ接合型にターゲティングされた細胞、ホモ接合型に欠失された細胞、及び複合ヘテロ接合型にターゲティングされた細胞（ヘミ接合型にターゲティングされた細胞を含む）を大幅に高い割合で生じる。
１回のターゲティング実験で、ホモ接合型にターゲティングされた対立遺伝子、ホモ接合型に欠失された対立遺伝子、及び複合ヘテロ接合型にターゲティングされた対立遺伝子（特にヘミ接合型にターゲティングされた対立遺伝子）の対立遺伝子の３つのタイプを作成するための本方法は、ターゲティングによる遺伝子改変における新たな可能性及び向上した効率を与えるものである。マウスＥＳ細胞における遺伝子のターゲティングによる欠失及び遺伝子発現を報告するタンパク質（例えばβガラクトシダーゼ又は蛍光タンパク質）をコードした配列によるその置換のような単純な遺伝子改変では、ターゲティングベクターと２種類のｇＲＮＡによって導かれるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムと組み合わせることによって、ヘテロ接合型にターゲティングされたＥＳ細胞の作成性が向上し、これを使用してＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）法によって完全にＥＳ細胞から誘導されたＦ０世代を作成することができる。Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：９１〜９９を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。これらのマウスは、レポーターノックイン対立遺伝子による組織特異的発現を研究するうえで有用である。同じ実験で作成されたホモ接合型にターゲティングされたＥＳ細胞クローンを、ホモ接合型のターゲティングによる遺伝子欠失を有するＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅに変換することができ、これを遺伝子ノックアウトの表現型の結果及びレポーターからの遺伝子発現について調べることができる。標的遺伝子のホモ接合型ＣＲＩＳＰＲ誘導欠失を有するＥＳ細胞からＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅを作成することによって、ホモ接合型にターゲティングされたマウスに見られるノックアウト表現型の確認が可能となり、きれいな遺伝子欠失と、レポーター及び薬剤選択カセットの挿入をともなう欠失との間の表現型の相違を明らかにすることができる。ターゲティングにより欠失／挿入された対立遺伝子及びＣＲＩＳＰＲ誘導欠失の両方を有する複合ヘテロ接合型（及び特にヘミ接合型）ＥＳ細胞クローンは、ホモ接合型にターゲティングされたクローン及びホモ接合型に欠失されたクローンから誘導されるものと同じ研究の条件を与えるＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅの作成を可能とする。更に、これらのマウスを交配させることによって単一のＥＳ細胞クローンから、ターゲティングによる欠失と単純な欠失による突然変異系統の両方を確立することができる。
これらの利点は、ヒト化のケースに応用される場合に付加価値を有する。マウス遺伝子のヒト化の重要な用途の１つに、ヒトに特異的な治療薬を試験するための動物モデルを作成することがある。ヒト化が効果的なモデルとなるためには、マウス遺伝子を除去するか又は不活性化して、生物学的機能又は薬剤との適正な相互作用を阻害しうるマウスとヒトの遺伝子産物間の相互作用を防止しなければならない。同時に、ヒト遺伝子は、それに相当するマウス遺伝子の生物学的機能を代わりに行うことができなければならない。これらの要求条件は、２種類のｇＲＮＡによって導かれるＣａｓ９ヌクレアーゼを、マウス遺伝子の欠失とヒト遺伝子による置換とを同時に行うように設計されたターゲティングベクターと組み合わせることによって試験することができる。ホモ接合型にターゲティングされたヒト化を有するＥＳ細胞から誘導されたＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅを、マウス遺伝子のホモ接合型ＣＲＩＳＰＲ誘導欠失を有するＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅと比較することができる。ノックアウト欠失が観察可能な突然変異表現型を引き起こすものであり、ヒト化マウスがこの表現型を発現せずに正常である場合には、そのヒト遺伝子はマウス遺伝子の生物学的機能を代わりに行うことができるということになる。ホモ接合型ヒト化マウス、又はヒト化された対立遺伝子とＣＲＩＳＰＲ誘導欠失を有する対立遺伝子との複合ヘテロ接合型（例えばヘミ接合型）の組み合わせを動物モデルとして用いることによって、ヒトに特異的な治療薬の作用機序及び有効性を調べることができる。複合ヘテロ接合型（例えばヘミ接合型）ＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅを用いて、従来の交配によってヒト化されたマウス系統及び欠失ノックアウトマウス系統の両方を作成することもできる。したがって、２種類のｇＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲシステムをターゲティングベクターと組み合わせた１遺伝子のターゲティング実験から、治療薬の前臨床試験用の有用なマウス、及びヒト薬剤の標的遺伝子のマウスにおけるホモログの生物学的機能を調べるためのノックアウト系統の両方を生じる遺伝子改変マウスが作成される。
（１）両対立遺伝子の遺伝子改変を発生、促進、又はその頻度を高める方法
本明細書では、細胞内のゲノムに両対立遺伝子改変を行うか、又は細胞内のゲノムに対する両対立遺伝子改変を促進するか若しくはその頻度を高めるための方法が提供される。かかる方法によって、例えばゲノムを破壊して、後に組換えを生じるゲノムＤＮＡの２つの配列間の大きなゲノムＤＮＡの部分を除去することができる。かかる方法によって、核酸インサートを挿入するか、又は大きなゲノムＤＮＡの部分を欠失させて核酸インサートで置換することもできる。
細胞内のゲノムを改変するための本明細書で提供されるこれらの方法は、前記ゲノムを、第１のＣａｓタンパク質、ゲノム標的遺伝子座内の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、前記ゲノム標的遺伝子座内の第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含む。場合により、ゲノムを、前記ゲノム標的遺伝子座内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする更なるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、例えば、前記ゲノム標的遺伝子座内の第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び／又は前記ゲノム標的遺伝子座内の第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと更に接触させることもできる。両対立遺伝子改変は、前記ゲノムを、第１のＣａｓタンパク質、ゲノム標的遺伝子座内の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、前記ゲノム標的遺伝子座内の第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることによって生成することができる。下記に更に詳細に述べるように、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態で、かつ任意の手段によって細胞内に導入することができる。同様に、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡのすべて又は一部を、任意の組み合わせで同時に、又は順次、導入することもできる。このようなゲノムの接触は、直接的（すなわち、成分がゲノム自体と直接接触する）、又は間接的（すなわち、成分がゲノムと直接接触する別の成分と相互作用する）に生じうる。
ゲノムは、ゲノム標的遺伝子座を含む第１の相同染色体と第２の相同染色体のペアを含むことができる。第１のＣａｓタンパク質は、これらの染色体の一方又は両方を、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の一方又は両方の内部で（すなわち、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内の第１の切断部位及び／又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内の第２の切断部位において）切断することができる。第３及び／又は第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが更に用いられる場合、第１のＣａｓタンパク質は、これらの染色体の一方又は両方を、第３及び／又は第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の一方又は両方の内部で（すなわち、第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内の第３の切断部位及び／又は第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内の第４の切断部位において）切断することができる。これにより、切断事象（cleavage event）は、染色体の一方又は両方に少なくとも
１箇所の二本鎖切断（double-strand break）を形成することができる。切断事象は、染色体の一方又は両方に少なくとも２箇所の二本鎖切断を形成することもできる。Ｃａｓニッカーゼが用いられる場合、切断事象は、染色体の一方又は両方に少なくとも１箇所の一本鎖切断（single-strand break）を、又は染色体の一方又は両方に少なくとも２箇所の二本鎖切断を形成することができる。第３及び／又は第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが用いられる場合、切断事象は、染色体の一方又は両方に少なくとも３箇所又は４箇所の一本鎖又は二本鎖切断を形成することができる。次いで、二本鎖切断により形成された末端配列が組換えを起こすか、又は一本鎖切断により形成された末端配列が組換えを起こすことができる。この後、両対立遺伝子改変を含む改変ゲノムを有する細胞を同定することができる。
例えば、第１のＣａｓタンパク質は、第１及び第２の相同染色体の第１のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ認識配列内の第１の切断部位及び少なくとも第１の相同染色体の第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内の第２の切断部位においてゲノムを切断することによって、第１及び第２の相同染色体に末端配列を形成することができる。次いで、末端配列は組換えを起こしてターゲティングによる改変を含む両対立遺伝子改変を有するゲノムが形成される。このターゲティングによる改変は、少なくとも第１の染色体の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失を含む。
第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、ゲノム標的遺伝子座内のどこでもよい。第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は対象とする任意のゲノム領域に隣接したものとすることができる。例えば、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、Ｌｒｐ５遺伝子座、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子座、Ｒｏｒ１遺伝子座、又はＴｒｐａ１遺伝子座などの遺伝子のコード配列の全体又は一部に隣接したものとすることができる。第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、Ｃｍａｈ遺伝子のコード配列の全体又は一部に隣接したものとすることもできる。あるいは、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、調節エレメント（例えばプロモーター）のような非コード配列、又はコード配列及び非コード配列の両方に隣接したものとすることもできる。第３及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、例えば、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列が隣接した対象とするゲノム領域内のどこであってもよい。
一例として、第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列に隣接したものとし、第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列に隣接したものとすることができる。したがって、第１及び第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列がＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第１のペアとなり、第２及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列がＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第２のペアとなりうる。例えば、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは（かつ／又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは）、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約４．５ｋｂ、約４．５ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、又は約９ｋｂ〜約１０ｋｂだけ離れていてよい。一例として、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは（かつ／又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは）、約１００ｂｐ〜約１ｋｂだけ離れていてよい。あるいは、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは（かつ／又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは）、重なり合っていてもよい。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第１のペアは、ゲノム標的遺伝子座の５’末端の近くに位置してよく、第２のペアは、ゲノム標的遺伝子座の３’末端の近くに位置してよい。あるいは、第１及び第２のペアが両方ともゲノム標的遺伝子座の５’末端の近くに位置してもよく、両方とも標的遺伝子座の３’末端の近くに位置してもよい。あるいは、一方又は両方のペアが、ゲノム標的遺伝子座の内部に位置してもよい。例えば、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第１のペアは、ゲノム標的遺伝子座の５’末端から２５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、１５０ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、２５０ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、３５０ｂｐ未満、４００ｂｐ未満、４５０ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、６００ｂｐ未満、７００ｂｐ未満、８００ｂｐ未満、９００ｂｐ未満、１ｋｂ未満、２ｋｂ未満、３ｋｂ未満、４ｋｂ未満、５ｋｂ未満、又は１０ｋｂ未満に位置してよい。同様に、第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第２のペアは、ゲノム標的遺伝子座の３’末端から２５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、１５０ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、２５０ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、３５０ｂｐ未満、４００ｂｐ未満、４５０ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、６００ｂｐ未満、７００ｂｐ未満、８００ｂｐ未満、９００ｂｐ未満、１ｋｂ未満、２ｋｂ未満、３ｋｂ未満、４ｋｂ未満、５ｋｂ未満、又は１０ｋｂ未満に位置してよい。
あるいは、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第１のペアは、ゲノム標的遺伝子座の５’末端から、例えば、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂに位置してもよい。同様に、第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第１のペアは、ゲノム標的遺伝子座の３’末端から、例えば、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂに位置してもよい。
あるいは、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第１のペアは、ゲノム標的遺伝子座の５’末端から、例えば、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、又は約９０ｋｂ〜約１００ｋｂに位置してもよい。同様に、第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第１のペアは、ゲノム標的遺伝子座の５’末端から、例えば、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、又は約９０ｋｂ〜約１００ｋｂに位置してもよい。
第１の切断部位と第２の切断部位又は第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、例えば、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂだけ離れていてよい。第１の切断部位と第２の切断部位又は第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、例えば、約３Ｍｂ〜約４Ｍｂ、約４Ｍｂ〜約５Ｍｂ、約５Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂだけ離れていてもよい。第１の切断部位と第２の切断部位又は第１のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、例えば、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、又は約９００ｂｐ〜約１ｋｂだけ離れていてもよい。同様に、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第１のペアは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第２のペアから、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂ、約３Ｍｂ〜約４Ｍｂ、約４Ｍｂ〜約５Ｍｂ、約５Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂだけ離れていてよい。
あるいは、第１の切断部位と第２の切断部位又は第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、例えば、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ、又はそれ以上離れていてもよい。同様に、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第１のペアは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第２のペアから、例えば、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ、又はそれ以上離れていてよい。
あるいは、第１の切断部位と第２の切断部位又は第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、例えば、２５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、１５０ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、２５０ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、３５０ｂｐ未満、４００ｂｐ未満、４５０ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、６００ｂｐ未満、７００ｂｐ未満、８００ｂｐ未満、９００ｂｐ未満、１ｋｂ未満、２ｋｂ未満、３ｋｂ未満、４ｋｂ未満、５ｋｂ未満、又は１０ｋｂ未満だけ離れていてもよい。同様に、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第１のペアは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の第２のペアから、２５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、１５０ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、２５０ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、３５０ｂｐ未満、４００ｂｐ未満、４５０ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、６００ｂｐ未満、７００ｂｐ未満、８００ｂｐ未満、９００ｂｐ未満、１ｋｂ未満、２ｋｂ未満、３ｋｂ未満、４ｋｂ未満、５ｋｂ未満、又は１０ｋｂ未満だけ離れていてもよい。
第１及び第２の切断部位でのゲノムの切断によって生じる末端配列は、平滑末端であっても付着末端であってもよく、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失は、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の核酸配列、並びに第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を含む核酸配列の全体又は一部を含むことができる。同様に、第３及び／又は第４の切断部位でのゲノムの切断によって生じる末端配列は、平滑末端であっても付着末端であってもよい。例えば、欠失は、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の核酸配列の一部のみ、及び／又は第１のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ認識配列及び／又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の一部のみを含むことができる。あるいは、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失は、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ認識配列との間の核酸配列の全体を含んでもよい。同様に、この欠失は、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列、又はその一部を含むことができる。特定の場合では、この欠失は、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の外側（すなわち、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを含まず、かつ第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間でもない配列）を更に含む。
第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失は、任意の長さでありうる。例えば、欠失される核酸は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂであってよい。
あるいは、欠失される核酸は、例えば、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ、又はそれ以上であってもよい。特定の場合では、欠失される核酸は、少なくとも５５０ｋｂ、少なくとも６００ｋｂ、少なくとも６５０ｋｂ、少なくとも７００ｋｂ、少なくとも７５０ｋｂ、少なくとも８００ｋｂ、少なくとも８５０ｋｂ、少なくとも９００ｋｂ、少なくとも９５０ｋｂ、少なくとも１Ｍｂ、少なくとも１．５Ｍｂ、少なくとも２Ｍｂ、少なくとも２．５Ｍｂ、少なくとも３Ｍｂ、少なくとも４Ｍｂ、少なくとも５Ｍｂ、少なくとも１０Ｍｂ、少なくとも２０Ｍｂ、少なくとも３０Ｍｂ、少なくとも４０Ｍｂ、少なくとも５０Ｍｂ、少なくとも６０Ｍｂ、少なくとも７０Ｍｂ、少なくとも８０Ｍｂ、少なくとも９０Ｍｂ、又は少なくとも１００Ｍｂ（例えば染色体の大部分）であってよい。
第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失は、欠失される核酸が第１のＣａｓタンパク質切断部位と第２のＣａｓタンパク質切断部位との間の核酸配列のみからなり、改変されたゲノム標的遺伝子座に更なる欠失も挿入も含まないような正確な欠失であってもよい。第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失は、第１及び第２のＣａｓタンパク質切断部位を超えて延びる不正確な欠失であってもよく、これは非相同末端連結（ＮＨＥＪ）による不正確な修復に一致し、改変されたゲノム遺伝子座に更なる欠失及び／又は挿入を生じる。例えば、この欠失は、第１及び第２のＣａｓタンパク質切断部位を超えて約１ｂｐ、約２ｂｐ、約３ｂｐ、約４ｂｐ、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２０ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、又はそれ以上延びることができる。同様に、改変されたゲノム遺伝子座は、例えば、約１ｂｐ、約２ｂｐ、約３ｂｐ、約４ｂｐ、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２０ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、又はそれ以上の挿入のような、ＮＨＥＪによる不正確な修復と一致する更なる挿入を含みうる。
接触は、外因性ドナー配列の非存在下で、又は細胞が１細胞期胚である場合には外因性ドナー配列の長さが５ｋｂ以下であるものとして、外因性ドナー配列の存在下で生じうる。外因性分子又は配列としては、細胞内に通常は存在しない分子又は配列が含まれる。通常存在する、とは、細胞の特定の発生段階及び環境条件に関して存在することを含む。外因性分子又は配列には、例えば、細胞内の対応する内因性配列に突然変異を導入した配列、例えば内因性配列をヒト化した配列が含まれる。これに対して、内因性分子又は配列には、特定の細胞中に、特定の発生段階において、特定の環境条件下で通常存在する分子又は配列が含まれる。
外因性ドナー配列はターゲティングベクター内に存在してもよく、細胞が１細胞期胚である場合にはターゲティングベクターの長さが５ｋｂ以下であるものとして、ゲノム内の５’及び３’標的配列に対応した５’及び３’ホモロジーアームを隣接させた核酸インサートを含むことができる。１細胞期胚以外の細胞種では、ターゲティングベクターはこれより長くてもよい。１細胞期胚以外の細胞種では、ターゲティングベクターは、例えば本明細書に述べられるようなラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であってよく、少なくとも１０ｋｂであってよい。このように、特定の方法では、ゲノムはターゲティングベクターと更に接触させられ、核酸インサートが５’標的配列と３’標的配列との間に挿入される。
あるいは、外因性ドナー配列は、核酸インサートを有さずに５’及び３’ホモロジーアームを含むものでもよい。このような核酸インサートのないターゲティングベクターは、ゲノム内の５’標的配列と３’標的配列との間の正確な欠失を促すことができる。このような正確な欠失は、例えば、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、少なくとも５００ｋｂ、少なくとも５５０ｋｂ、少なくとも６００ｋｂ、少なくとも６５０ｋｂ、少なくとも７００ｋｂ、少なくとも７５０ｋｂ、少なくとも８００ｋｂ、少なくとも８５０ｋｂ、少なくとも９００ｋｂ、少なくとも９５０ｋｂ、少なくとも１Ｍｂ、少なくとも１．５Ｍｂ、又は少なくとも２Ｍｂ、又はそれよりも大きいものでありうる。
特定のこのような方法では、５’及び３’ホモロジーアームは、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列及び／又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を含むゲノム標的遺伝子座の５’及び３’標的配列に対応する。第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又は第１及び第２の切断部位は、５’標的配列に隣接していてもよく、３’標的配列に隣接していてもよく、又は５’標的配列にも３’標的配列にも隣接していなくてもよい。あるいは、第１のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ認識配列又は第１の切断部位が５’標的配列に隣接していてもよく、第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又は第２の切断部位が３’標的配列に隣接していてもよい。あるいは、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又は第１の切断部位が５’標的配列又は３’標的配列のいずれかに隣接していてもよく、第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又は第２の切断部位が５’標的配列にも３’標的配列にも隣接していなくてもよい。
例えば、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、５’標的配列と３’標的配列との間に位置してもよく、又は５’標的配列及び／又は３’標的配列に隣接するか、若しくは例えば、５’及び／又は３’標的配列の１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂ、１５０ｋｂ、１６０ｋｂ、１７０ｋｂ、１８０ｋｂ、１９０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、４５０ｋｂ、又は５００ｋｂ以内のように近接していてもよい。同様に、第１及び第２の切断部位は、５’標的配列と３’標的配列との間に位置してもよく、又は５’標的配列及び／又は３’標的配列に隣接するか、若しくは例えば、５’及び／又は３’標的配列の１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂ、１５０ｋｂ、１６０ｋｂ、１７０ｋｂ、１８０ｋｂ、１９０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、４５０ｋｂ、又は５００ｋｂ以内のように近接していてもよい。例えば、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又は第１の切断部位は、５’標的配列又は５’及び３’標的配列の５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂ、１５０ｋｂ、１６０ｋｂ、１７０ｋｂ、１８０ｋｂ、１９０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、４５０ｋｂ、又は５００ｋｂ以内に位置してもよい。同様に、第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又は第２の切断部位は、３’標的配列又は５’及び３’標的配列の５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂ、１５０ｋｂ、１６０ｋｂ、１７０ｋｂ、１８０ｋｂ、１９０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、４５０ｋｂ、又は５００ｋｂ以内に位置してもよい。
あるいは、第１及び／又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、５’及び／又は３’標的配列から少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂに位置してもよい。同様に、第１及び／又は第２の切断部位は、５’及び／又は３’標的配列から少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂに位置してもよい。例えば、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又は第１の切断部位は、５’標的配列から、又は５’及び３’標的配列から少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂに位置してもよい。例えば、第２の切断部位の第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、３’標的配列から、又は５’及び３’標的配列から少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂに位置してもよい。
例えば、第１及び／又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、５’及び／又は３’標的配列から、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、又は約４００ｋｂ〜約５００ｋｂに位置してもよい。同様に、第１及び／又は第２の切断部位は、５’及び／又は３’標的配列から、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、又は約４００ｋｂ〜約５００ｋｂに位置してもよい。例えば、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又は第１の切断部位は、５’標的配列から、又は５’及び３’標的配列から、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、又は約４００ｋｂ〜約５００ｋｂに位置してもよい。同様に、第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又は第２の切断部位は、３’標的配列から、又は５’及び３’標的配列から、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、又は約４００ｋｂ〜約５００ｋｂに位置してもよい。
あるいは、第１及び／又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又は第１及び／又は第２の切断部位は、５’及び／又は３’標的配列から、５０ｂｐより遠く、１００ｂｐより遠く、２００ｂｐより遠く、３００ｂｐより遠く、４００ｂｐより遠く、５００ｂｐより遠く、６００ｂｐより遠く、７００ｂｐより遠く、８００ｂｐより遠く、９００ｂｐより遠く、１ｋｂより遠く、２ｋｂより遠く、３ｋｂより遠く、４ｋｂより遠く、５ｋｂより遠く、６ｋｂより遠く、７ｋｂより遠く、８ｋｂより遠く、９ｋｂより遠く、１０ｋｂより遠く、２０ｋｂより遠く、３０ｋｂより遠く、４０ｋｂより遠く、５０ｋｂより遠く、６０ｋｂより遠く、７０ｋｂより遠く、８０ｋｂより遠く、９０ｋｂより遠く、又は１００ｋｂより遠くに位置してもよい。例えば、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又は第１の切断部位は、５’標的配列から、又は５’及び３’標的配列から、５０ｂｐより遠く、１００ｂｐより遠く、２００ｂｐより遠く、３００ｂｐより遠く、４００ｂｐより遠く、５００ｂｐより遠く、６００ｂｐより遠く、７００ｂｐより遠く、８００ｂｐより遠く、９００ｂｐより遠く、１ｋｂより遠く、２ｋｂより遠く、３ｋｂより遠く、４ｋｂより遠く、５ｋｂより遠く、６ｋｂより遠く、７ｋｂより遠く、８ｋｂより遠く、９ｋｂより遠く、１０ｋｂより遠く、２０ｋｂより遠く、３０ｋｂより遠く、４０ｋｂより遠く、５０ｋｂより遠く、６０ｋｂより遠く、７０ｋｂより遠く、８０ｋｂより遠く、９０ｋｂより遠く、又は１００ｋｂより遠くに位置してもよい。同様に、第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列又は第２の切断部位は、３’標的配列から、又は５’及び３’標的配列から、５０ｂｐより遠く、１００ｂｐより遠く、２００ｂｐより遠く、３００ｂｐより遠く、４００ｂｐより遠く、５００ｂｐより遠く、６００ｂｐより遠く、７００ｂｐより遠く、８００ｂｐより遠く、９００ｂｐより遠く、１ｋｂより遠く、２ｋｂより遠く、３ｋｂより遠く、４ｋｂより遠く、５ｋｂより遠く、６ｋｂより遠く、７ｋｂより遠く、８ｋｂより遠く、９ｋｂより遠く、１０ｋｂより遠く、２０ｋｂより遠く、３０ｋｂより遠く、４０ｋｂより遠く、５０ｋｂより遠く、６０ｋｂより遠く、７０ｋｂより遠く、８０ｋｂより遠く、９０ｋｂより遠く、又は１００ｋｂより遠くに位置してもよい。
本明細書に述べられる方法は、両対立遺伝子改変を促進し、その頻度を高めるものである。詳細には、ゲノムを第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと接触させることにより、ゲノムを第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡのいずれか単独と接触させる場合と比較して両対立遺伝子改変が生じる効率を高めることができる。両対立遺伝子改変が生じる効率は、ゲノムを第１、第２、第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、又は第１、第２、第３、及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと接触させることによって高めることもできる。両対立遺伝子改変には、（例えば二倍体細胞の）対応する相同染色体上の同じ遺伝子座に同じ改変が行われるか、又は対応する相同染色体上の同じ遺伝子座に異なる改変が行われる事象が含まれる。相同染色体には、同じ遺伝子座（ただし場合により異なる対立遺伝子）に同じ遺伝子を有する染色体（例えば減数分裂の際に対合する染色体）が含まれる。対立遺伝子なる用語には、遺伝子配列の１以上の選択的形態のいずれも含まれる。二倍体の細胞又は生物では、特定の配列の２個の対立遺伝子は、相同染色体のペアの対応する遺伝子座を一般的に占めている。
両対立遺伝子改変は、ターゲティングによる改変についてホモ接合を、又はターゲティングによる改変について複合ヘテロ接合（例えばヘミ接合）を生じうる。細胞集団での１回のターゲティング実験は、ターゲティングによる改変（例えばある遺伝子座のヒト化）についてホモ接合型である細胞、ターゲティングによる改変について複合ヘテロ接合型である細胞（ターゲティングによる改変についてヘミ接合型である細胞を含む）、及び第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間でホモ接合的に破壊された（すなわち２個のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列間で大きな核酸配列が欠失された）細胞を生じうる。ホモ接合には、標的遺伝子座の両方の対立遺伝子（すなわち両方の相同染色体上の対応する対立遺伝子）がターゲティングによる改変を有する状況が含まれる。複合ヘテロ接合には、標的遺伝子座の両方の対立遺伝子（すなわち両方の相同染色体上の対応する対立遺伝子）が改変されているが、それらが異なる形で改変されている（例えば一方の対立遺伝子はターゲティングによる改変を有し、他方の対立遺伝子は不活性化又は破壊されている）状況が含まれる。内因性の核酸配列の破壊は、例えばＣａｓタンパク質によって形成された二本鎖切断が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるＤＮＡ修復によって修復される場合に生じうるものであり、これにより核酸配列の挿入又は欠失を含む突然変異対立遺伝子が生じることによってそのゲノム遺伝子座の破壊を引き起こす。破壊の例としては、調節エレメント（例えば、プロモーター又はエンハンサー）の変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、切断突然変異、ヌル突然変異、又は（例えば、フレームシフト突然変異を引き起こす）少ない数のヌクレオチドの挿入若しくは欠失が挙げられる。破壊は、不活性化（すなわち機能の喪失）又は対立遺伝子の喪失をもたらしうる。
例えば、両対立遺伝子改変は、細胞がターゲティングによる改変を有する１つの対立遺伝子と、発現されないか又は他の形で機能しない別の対立遺伝子を有する場合に複合ヘテロ接合を生じうる。複合ヘテロ接合にはヘミ接合が含まれる。ヘミ接合には、標的遺伝子座の一方の対立遺伝子（すなわち２本の相同染色体の一方の上の対立遺伝子）のみが存在する場合が含まれる。例えば、両対立遺伝子改変は、ターゲティングによる改変が一方の対立遺伝子に生じ、他方の対立遺伝子に対応する喪失又は欠失が生じる場合にターゲティングによる改変についてヘミ接合を生じることができる。
特定の例では、両対立遺伝子改変は、第１及び第２の相同染色体のペアにおける第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失を含むことができる。このような欠失は同時に生じてもよく、又は欠失が最初に第１の相同染色体に生じてもよく、その場合、ホモ接合は、細胞が第１の相同染色体をドナー配列として用いて遺伝子変換（gene conversion）などの相同組換えによって１箇所以上の第２の相同染色体の二本鎖切断を修復することによって得られる。第１の相同染色体と第２の相同染色体で欠失される核酸配列は同じであってもよく、部分的に重なっていてもよく、又は異なっていてもよい。あるいは、両対立遺伝子改変は、第１の相同染色体の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失と、第２の相同染色体の対応する対立遺伝子又は遺伝子座の喪失とからなるものであってもよい。あるいは、両対立遺伝子改変は、第１の相同染色体の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失と、第２の相同染色体の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の対応する対立遺伝子又は遺伝子座の不活性化又は破壊とからなるものであってもよい。
ドナー配列が用いられる場合、両対立遺伝子改変は、第１及び第２の相同染色体のペアにおける第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失、及び５’標的配列と３’標的配列との間への核酸インサートの挿入からなるものであってもよく、これによりホモ接合型の改変ゲノムを生じる。このような欠失と挿入とは同時に生じてもよく、又は欠失及びが最初に第１の相同染色体に生じてもよく、その場合、ホモ接合は、細胞が第１の相同染色体をドナー配列として用いて遺伝子変換などの相同組換えによって第２の相同染色体の二本鎖切断を修復することによって得られる。例えば、いずれの特定の理論に束縛されることも望むものではないが、核酸インサートの挿入が第１の相同染色体において生じ（Ｃａｓタンパク質による切断をともなうか又はともなわずに）、次いで第２の相同染色体が、第２の相同染色体上のＣａｓタンパク質による切断により刺激される遺伝子変換事象によって改変されると考えられる。
あるいは、両対立遺伝子改変は、複合ヘテロ接合型の改変ゲノムを生じることもできる。例えば、ターゲティングによる改変は、第１及び第２の相同染色体の両方における第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失と、第１の相同染色体への核酸インサートの挿入（ただし第２の相同染色体には挿入されない）とからなるものであってもよい。あるいは、ターゲティングによる遺伝子改変は、第１の相同染色体における第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失及び核酸インサートの挿入と、第２の相同染色体における対応する対立遺伝子又は遺伝子座の不活性化又は破壊とからなるものであってもよい。あるいは、両対立遺伝子改変は、ターゲティングによる改変が、第１の相同染色体における第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失及び核酸インサートの挿入と、第２の相同染色体における対応する対立遺伝子又は遺伝子座の喪失又は欠失とからなるヘミ接合型の改変ゲノムを生じるものであってもよい。
ターゲティングによるホモ接合型及び複合ヘテロ接合型（特にヘミ接合型）遺伝子改変は、これらの改変を有する遺伝子改変動物を作成するプロセス（下記により詳細に述べる）がより効率的かつ時間のかからないものとなりうることから有益である。遺伝子を除去してその遺伝子が存在しないことの影響を調べるなどの多くの場合では、ターゲティングによる遺伝子改変についてのヘテロ接合（すなわち一方の対立遺伝子が改変され、他方の対立遺伝子は改変されない）のみでは充分ではない。従来のターゲティングのアプローチでは、ターゲティングによる大きなゲノムの欠失についてヘテロ接合型であるＦ０世代は得ることができるが、その欠失についてホモ接合型であるＦ１世代を作成するにはこれらのヘテロ接合型動物を続いて交配させる必要がある。これらの更なる交配ステップはコストが嵩み、時間がかかるものである。ターゲティングによる遺伝子改変についてホモ接合型又は複合ヘテロ接合型（特にヘミ接合型）であるＦ０世代の遺伝子改変動物を作成できることで、必要とされる交配ステップの数が減ることから大幅な効率化と時間の節約がもたらされる。
（２）遺伝子変換（gene conversion）又はヘテロ接合性の喪失
特定の方法では、改変しようとするゲノムは第１の対立遺伝子についてヘテロ接合型である細胞内にあり、この遺伝子を第１の対立遺伝子についてホモ接合型となるように改変する。ヘテロ接合型なる用語には、ゲノムが、１個以上の対応する染色体遺伝子座に異なる対立遺伝子（例えば相同染色体上の対応する遺伝子座に異なる対立遺伝子）を有する場合含まれる。ホモ接合型なる用語には、ゲノムが、対応する染色体遺伝子座（例えば対応する相同染色体上の）に同じ対立遺伝子を有する場合が含まれる。特定のこのような方法では、ホモ接合は、細胞が第１の対立遺伝子をドナー配列として用いて遺伝子変換などの相同組換えによって対応する第２の対立遺伝子の二本鎖切断を修復することによって得られる。一般的に、遺伝子変換の範囲は数百塩基対に限定されている。例えば、Ｋａｓｐａｒｅｋ ＆ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６〜８９７を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。しかしながら、１個の遺伝子座内の異なる切断部位での切断を誘導するガイドＲＮＡのペアを用いることにより、より大きな範囲にわたった遺伝子変換能を促進及び向上させることができる。
こうした方法はいくつかの点で有用である。第１の対立遺伝子は突然変異を有することができる。特定の方法では、例えば、第１の対立遺伝子はターゲティングによる所望の遺伝子改変を有する。ターゲティングによるその遺伝子改変についてホモ接合を得ることによって、例えばその改変についてホモ接合型である非ヒト動物を作成することが目的である場合には、大幅な時間及びコストの削減につながりうる。他の方法では、第１の対立遺伝子は、ある遺伝子の疾患の原因となる第２の対立遺伝子に対応するその遺伝子の野生型対立遺伝子である。また、第２の対立遺伝子は任意の突然変異を有することができる。したがって、本方法を用いることによって、疾患の原因となる対立遺伝子をその天然の染色体遺伝子座において野生型対立遺伝子に置換するという遺伝子治療の最大の目標が達成されうるものである。
第１の対立遺伝子についてヘテロ接合型であるゲノムを第１の対立遺伝子についてホモ接合型となるように改変するための特定のこうした方法では、ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、ｔｒａｃｒＲＮＡ、並びに、第２の対立遺伝子内の第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び第２の対立遺伝子内の第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと接触させ、ただし、第１の対立遺伝子は第１の相同染色体上にあり、第２の対立遺伝子は第２の相同染色体上の対応する遺伝子座にある（すなわち第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子とは、第１及び第２の相同染色体のペアの対応する対立遺伝子であってよい）。場合により、ゲノムを、第２の対立遺伝子内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする更なるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（例えば第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、又は第３及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）と接触させることもできる。Ｃａｓタンパク質は、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の一方又は両方を切断することができる（すなわち、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内の第１の切断部位及び／又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内の第２の切断部位において）。第１及び第２の切断部位におけるゲノムの切断は、ゲノムＤＮＡ内に平滑末端を形成するか又は付着末端を形成することができる。この後、切断部位は第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子との間の組換えによって修復され、第１の対立遺伝子についてホモ接合型である改変ゲノムを生じることができる。この後、改変ゲノムを有する細胞を同定することができる。
特定の方法では、第１及び／又は第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は第２の対立遺伝子内に位置しており、第１の対立遺伝子内には位置してない。第１及び／又は第２の対立遺伝子は野生型対立遺伝子であってもよく、又はターゲティングによる改変又は野生型ターゲティングからの他の変異を有してもよい。例えば、第１の対立遺伝子が所望のターゲティングによる改変を有してもよく、第２の対立遺伝子が野生型対立遺伝子であってもよい。あるいは、第１の対立遺伝子が野生型対立遺伝子でもよく、第２の対立遺伝子が疾患原因突然変異のような望ましくない改変を有するものであってもよい。特定のこうした方法では、ターゲティングによる遺伝子修復又はターゲティングによる遺伝子修正は、第２の対立遺伝子の疾患原因突然変異が第１の対立遺伝子をドナー配列として用いた組換えによって修正されるように生じる。
第１の切断部位と第２の切断部位又は第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、例えば、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂだけ離れていてよい。
あるいは、第１の切断部位と第２の切断部位又は第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とは、例えば、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂだけ離れていてもよい。
特定の方法では、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子との間の配列の相違は、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂにわたる。
他の方法では、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子との間の相違は、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂにわたる。
第１の対立遺伝子についてヘテロ接合型である細胞内のゲノムを第１の対立遺伝子についてホモ接合型となるように改変するための他のこうした方法では、ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１の非対立遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと接触させる。第１の対立遺伝子は第１の相同染色体上にあり、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、第２の相同染色体上の第１の対立遺伝子に対してセントロメア側（すなわちセントロメアにより近くに）にある。Ｃａｓタンパク質は第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断して二本鎖切断を生成することができる。この後、組換えが起こって細胞を第１の対立遺伝子についてホモ接合型となるように改変することができる。
場合により、細胞は１個以上の更なる対立遺伝子についてヘテロ接合型であり、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、第２の相同染色体上の前記１個以上の更なる対立遺伝子に対応する遺伝子座に対してセントロメア側にあり、組換えによって細胞が前記１個以上の更なる対立遺伝子についてホモ接合型となるように改変される。
場合により、本方法は、ゲノムを、第２の相同染色体の第１の対立遺伝子に対応する遺伝子座に対してセントロメア側の第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とハイブリダイズする第２の非対立遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと接触させることを更に含んでもよく、Ｃａｓタンパク質が第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の少なくとも一方を切断して少なくとも１箇所の二本鎖切断を生成する。場合により、本方法は、ゲノムを、第２の相同染色体上の第１の対立遺伝子に対応する遺伝子座に対してセントロメア側のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする更なる非対立遺伝子突然変異特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（例えば第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、又は第３及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）と接触させることを更に含んでもよい。この後、改変ゲノムを有する細胞を同定することができる。
特定の方法では、第１（又は第２、第３、若しくは第４）のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、第２の相同染色体上に位置しており、第１の相同染色体には位置していない。第１（又は第２、第３、若しくは第４）のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識部位は、セントロメアから約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂに位置しうる。
第１の対立遺伝子及び／又は前記１つ以上の更なる対立遺伝子は、例えばターゲティングによる改変などの突然変異を有することができる。あるいは、第１の対立遺伝子及び／又は前記１つ以上の更なる対立遺伝子は野生型対立遺伝子であってもよく、第２の相同染色体上の対応する遺伝子座が疾患原因突然変異などの突然変異を有するものであってもよい。第１の対立遺伝子は、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識部位から約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂに位置しうる。あるいは、第１の対立遺伝子は、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識部位から少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１Ｍｂ、少なくとも１０Ｍｂ、少なくとも２０Ｍｂ、少なくとも３０Ｍｂ、少なくとも４０Ｍｂ、少なくとも５０Ｍｂ、少なくとも６０Ｍｂ、少なくとも７０Ｍｂ、少なくとも８０Ｍｂ、少なくとも９０Ｍｂ、又は少なくとも１００Ｍｂ又はそれ以上に位置しうる。
Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９であってよい。Ｃａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に対してヌクレアーゼ活性を有してもよく、又はニッカーゼであってもよい。特定の方法では、Ｃａｓタンパク質と第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとは天然に一緒に存在していないものである。
組換えは、二本鎖切断のテロメア側（すなわちテロメアに向かう方向）のヘテロ接合性の喪失を含むことができる（例えば極性又は方向性の遺伝子変換又はヘテロ接合性の喪失）。ヘテロ接合性の喪失によって置換される第２の相同染色体の領域は、約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂでありうる。あるいは、置換される第２の相同染色体の領域は、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１Ｍｂ、少なくとも１０Ｍｂ、少なくとも２０Ｍｂ、少なくとも３０Ｍｂ、少なくとも４０Ｍｂ、少なくとも５０Ｍｂ、少なくとも６０Ｍｂ、少なくとも７０Ｍｂ、少なくとも８０Ｍｂ、少なくとも９０Ｍｂ、又は少なくとも１００Ｍｂ又はそれ以上であってもよい。例えば、染色体の大部分が置換されてもよい。
Ｂ．遺伝子改変された非ヒト動物の作成方法
遺伝子改変された非ヒト動物を、本明細書に開示される様々な方法を用いて作成することができる。特定の場合では、遺伝子改変された非ヒト動物を作成する方法は、（１）上記に述べた方法を用いて多能性細胞のゲノムを改変することと、（２）前記遺伝子改変された多能性細胞を選択することと、（３）前記遺伝子改変された多能性細胞を宿主胚に導入することと、（４）前記遺伝子改変された多能性細胞を有する前記宿主胚を代理母に移植することと、を含む。前記遺伝子改変された多能性細胞から子孫細胞が作成される。このドナー細胞を例えば胚盤胞期又は前桑実胚期（すなわち４細胞期又は８細胞期胚）などの任意の段階の宿主胚に導入することができる。前記遺伝子改変を生殖細胞系に伝えることが可能な子孫細胞が作成される。多能性細胞は、本明細書の他の箇所で述べるようなＥＳ細胞（例えばマウスＥＳ細胞又はラットＥＳ細胞）であってよい。例えば、米国特許第７，２９４，７５４号を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。
あるいは、遺伝子改変された非ヒト動物を作成する方法は、（１）上記に述べた方法を用いて１細胞期胚のゲノムを改変することと、（２）前記遺伝子改変された胚を選択することと、（３）前記遺伝子改変された胚を代理母に導入することと、を含むことができる。前記遺伝子改変を生殖細胞系に伝えることが可能な子孫細胞が作成される。
核移植法を用いて非ヒト哺乳動物を生成することもできる。簡単に述べると、核移植の方法は、（１）卵母細胞を除核するか又は除核卵母細胞を提供する工程と、（２）前記除核卵母細胞と合わせるためのドナー細胞又は核を単離又は提供する工程と、（３）前記細胞又は核を前記除核卵母細胞に挿入して再構成細胞を形成する工程と、（４）前記再構成細胞を動物の子宮内に移植して胚を形成する工程と、（５）前記胚を発生させる工程と、を含むことができる。こうした方法では、卵母細胞は一般的には死んだ動物から採取されるが、生きた動物の卵管及び／又は卵巣から単離することもできる。卵母細胞は、除核に先立って当業者には周知の様々な培地中で成熟させることができる。卵母細胞の除核は、当業者には周知の多くの方法で行うことができる。再構成細胞を形成するための除核卵母細胞へのドナー細胞又は核の挿入は、融合に先立って透明帯下にドナー細胞をマイクロインジェクションすることによって行うことができる。融合は、接触／融合面の両側にＤＣ電気パルスを印加すること（電気融合法）により、又はポリエチレングリコールなどの融合促進物質に細胞を曝露することにより、又はセンダイウイルスなどの不活性化ウイルスによって誘発させることができる。再構成細胞は、核ドナーとレシピエント卵母細胞との融合の前、その間、及び／又はその後で電気及び／又は非電気手段によって活性化させることができる。活性化方法としては、電気パルス、化学誘導ショック、精子の侵入、卵母細胞内の二価陽イオンの濃度上昇、及び卵母細胞内の細胞タンパク質のリン酸化の低下（キナーゼ阻害剤などによる）が挙げられる。活性化された再構成細胞又は胚は、当業者には周知の培地中で培養してから動物の子宮に移すことができる。例えば米国特許出願公開第２００８／００９２２４９号、国際公開第１９９９／００５２６６Ａ２号、米国特許出願公開第２００４／０１７７３９０号、国際公開第２００８／０１７２３４Ａ１号、及び米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたい。当該文献のそれぞれをすべての目的でその全容にわたって参照により本明細書に援用する。
遺伝子改変された非ヒト動物を作成する特定の方法は、Ｆ０世代の非ヒト動物を作成する方法を含む。こうした方法は、非ヒトＥＳ細胞のゲノムを、Ｃａｓタンパク質、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含みうる。Ｃａｓタンパク質は、ゲノムを第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内で切断して末端配列を形成する。次いでこれらの末端配列は組換えを起こしてターゲティングによる改変を有するゲノムを形成し、このターゲティングによる改変は、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の欠失を含むことができる。
本方法は、更に、（１）ターゲティングによる改変を有する非ヒトＥＳ細胞を同定することと、（２）前記ターゲティングによる改変を有する前記非ヒトＥＳ細胞を非ヒト宿主胚に導入することと、（３）前記非ヒト宿主胚を代理母に懐胎させることと、を含むことができる。これにより、代理母は、ターゲティングによる改変を有するＦ０世代の非ヒト動物を作ることができる。遺伝子改変された多能性細胞又は全能性細胞（例えば非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚を、胚盤胞期にまでインキュベートした後、代理母に移植してＦ０動物を作成することができる。遺伝子改変されたゲノム遺伝子座を有する動物は、本明細書に述べられるような対立遺伝子の改変（modification of allele）（ＭＯＡ）アッセイによって同定することができる。
本明細書に述べられる様々な方法は、遺伝子改変されたＦ０動物の改変を可能とするものであり、遺伝子改変されたＦ０動物の細胞はターゲティングによる改変を有する。Ｆ０動物を作成するために用いられる方法に応じて、対象とするヌクレオチド配列を有し、かつリコンビナーゼカセット及び／又は選択カセットを有さないＦ０動物内の細胞の数は変動する。例えばＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法による対応する生物（例えば８細胞期胚）から前桑実胚期胚へのドナーＥＳ細胞の導入によって、Ｆ０動物の細胞集団のより大きな割合が、ターゲティングによる遺伝子改変を有する対象ヌクレオチド配列を有する細胞で構成されるようになる。特定の場合では、非ヒトＦ０動物の細胞寄与の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、ターゲティングによる改変を有する細胞集団で構成される。他の場合では、Ｆ０動物の生殖細胞の少なくとも１個以上がターゲティングによる改変を有する。
特定の場合では、遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、ターゲティングによる改変についてヘテロ接合型であるか又は複合ヘテロ接合型である。例えば、遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、ターゲティングによる改変についてヘミ接合型であってよい。他の場合では、遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、ターゲティングによる改変についてホモ接合型である。
特定の場合では、本明細書に開示される方法及び組成物によって作成されるＦ０動物を野生型動物と交配することによってターゲティングによる改変についてヘテロ接合型であるＦ１世代を作成することができる。次いで、Ｆ１世代の動物同士を互いに交配することによってターゲティングによる改変についてホモ接合型であるＦ２動物を作成することができる。Ｆ１子孫は、特異的なプライマー及び／又はプローブを使用して遺伝子型を決定することによってターゲティングによる遺伝子改変の有無を判定することができる。
Ｃ．ゲノム及び標的ゲノム遺伝子座
本明細書に開示される方法によって改変されたゲノム又はゲノム標的遺伝子座は、細胞内のＤＮＡの任意のセグメント又は領域を有することができる。ゲノム又はゲノム標的遺伝子座は、細胞に天然に存在するものでもよく、細胞のゲノムに組み込まれた異種又は外因性のＤＮＡのセグメントであってもよく、又はそれらの組み合わせであってもよい。そのような異種又は外因性のＤＮＡのセグメントは、導入遺伝子、発現カセット、選択マーカーをコードしたポリヌクレオチド、又はゲノムＤＮＡの異種若しくは外因性領域を含むことができる。
ゲノム又はゲノム標的遺伝子座は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、又は適当な宿主細胞中に含まれる他の任意の操作されたゲノム領域などの、細胞内の染色体外ＤＮＡを含んでもよい。
Ｄ．Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡの形態
特定の方法では、上記のゲノムを接触させることは、１以上のＣａｓタンパク質、１以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び１以上のｔｒａｃｒＲＮＡを細胞内に導入することを含む。このような導入は任意の手段によって行うことができ、成分のうちの１つ以上（例えば成分のうちの２つ、又は成分のすべて）を任意の組み合わせで同時又は順次に細胞内に導入することができる。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとは細胞に導入するためにガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）として互いに融合することができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとは、異なるＲＮＡ分子であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ＲＮＡの形で、又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡの形で細胞に導入することができる。同様に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＲＮＡの形で、又はｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡの形で細胞に導入することができ、ｇＲＮＡはＲＮＡの形で、又はｇＲＮＡをコードしたＤＮＡの形で細胞に導入することができる。
Ｃａｓタンパク質は、タンパク質、Ｃａｓタンパク質をコードしたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、又はＣａｓタンパク質をコードしたＤＮＡの形で細胞に導入することができる。特定の方法では、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、タンパク質ＲＮＡ複合体として細胞に導入することができる。同様に、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡは、タンパク質ＲＮＡ複合体として細胞に導入することができる。Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性Ｃａｓタンパク質（例えば細胞浸透ドメインを有するＣａｓタンパク質）であってもよい。
Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡは、細胞内で活性を有するプロモーターと機能的に連結することができる。このようなＤＮＡは、１以上の発現コンストラクト内に存在してよい。特定の方法では、１以上のこのような発現コンストラクトは１個の核酸分子の構成要素であってよい。例えば、１以上のＣａｓタンパク質、１以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡ、及び１以上のｔｒａｃｒＲＮＡをコードしたＤＮＡがすべて、１個の核酸分子の構成要素であってもよい。あるいは、これらは任意の組み合わせで、２個、３個、４個、又はそれよりも多くの核酸分子間で別れていてもよい。
同様に、Ｃａｓタンパク質をコードしたＤＮＡ及びｇＲＮＡをコードしたｄＮＡを、細胞内で活性を有するプロモーターと機能的に連結することができる。このようなＤＮＡは、１以上の発現コンストラクト内に存在してもよい。特定の方法では、１以上のこのような発現コンストラクトは１個の核酸分子の構成要素であってよい。例えば、１以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードしたＤＮＡ、及び１以上のｇＲＮＡをコードしたＤＮＡがすべて、１個の核酸分子の構成要素であってもよい。あるいは、これらは任意の組み合わせで、２個、３個、４個、又はそれよりも多くの核酸分子間で別れていてもよい。
特定の方法では、Ｃａｓタンパク質とＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡとは天然に一緒に存在していないものである。特定の方法では、例えば、Ｃａｓタンパク質と第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとは天然に一緒に存在していないものであり、Ｃａｓタンパク質と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとは天然に一緒に存在していないものであり、かつ／又はＣａｓタンパク質とｔｒａｃｒＲＮＡとは天然に一緒に存在していないものである。
特定の方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。Ｃａｓタンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）などの異種ポリペプチドと融合させることができる。Ｃａｓタンパク質は、完全な切断活性を有し、ゲノムＤＮＡ内に二本鎖切断（例えば平滑末端を有する二本鎖切断）を形成することができるものであってもよく、又はゲノムＤＮＡの一本鎖のみを切断できるニッカーゼであってもよい。
特定の方法では、ニッカーゼのペアが用いられる。例えば、ゲノムをＤＮＡの対向した鎖を切断する第１及び第２のニッカーゼと接触させることができ、これによりゲノムはダブルニッキングによって改変される。第１のニッカーゼはゲノムＤＮＡの第１の鎖（すなわち相補鎖）を切断することができ、第２のニッカーゼはゲノムＤＮＡの第２の鎖（すなわち非相補鎖）を切断することができる。あるいは、両方のニッカーゼが同じ鎖を切断してもよい。第１及び第２のニッカーゼは、例えば第１のニッカーゼのＲｕｖＣドメイン内の触媒残基に突然変異（例えば本明細書の他の箇所に述べられるＤ１０Ａ突然変異）を導入し、第２のニッカーゼのＨＮＨドメイン内の触媒残基に突然変異（例えば本明細書の他の箇所に述べられるＨ８４０Ａ突然変異）を導入することによって作成することができる。あるいは、第１のニッカーゼを用いて両方のニックを形成することもできる。
特定のこのような方法では、ダブルニッキングを用いて付着末端を有する１箇所以上の二本鎖切断を形成することができる。例えばダブルニッキングを利用して第１及び第２の切断部位に付着末端が形成される。第１のニッカーゼは、第１のＤＮＡ鎖を、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡがハイブリダイズする第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内で切断することができ、第２のニッカーゼは、第２のＤＮＡ鎖を、第３及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡがハイブリダイズする第３及び第４の標的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内で切断することができる。あるいは、第１のニッカーゼを用いて第１、第２、第３、及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列を切断することもできる。第１及び第３の標的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、第１及び第２のニッカーゼによって第１及び第２のＤＮＡ鎖に形成されるニックが二本鎖切断を形成するような第１の切断部位を形成するように配置することができる（すなわち、第１の切断部位は第１及び第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のニックからなる）。同様に、第２及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、第１及び第２のニッカーゼによって第１及び第２のＤＮＡ鎖に形成されるニックが二本鎖切断を形成するような第２の切断部位を形成するように配置することができる（すなわち、第２の切断部位は第２及び第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のニックからなる）。特定の場合では、第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のニックと第３のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のニック、及び／又は、第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のニックと第４のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列内のニックとはオフセットしたニックであってよい。オフセットの範囲は、例えば少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ又はそれ以上であってよい。Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５４：１３８０〜１３８９；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１：８３３〜８３８；ａｎｄ Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：３９９〜４０４を参照されたい。これらをいずれもすべての目的でその全容にわたって参照により本明細書に援用する。
Ｅ．核酸及びタンパク質を細胞に導入する方法
本明細書では、細胞内に核酸を導入することを可能とする様々な組成物及び方法を提供する。特定の場合では、核酸を導入するために用いられるシステムは、特定のゲノム遺伝子座におけるターゲティングによる組み込みを可能とする。かかるシステムは様々な要素を使用するものであり、説明の便宜上、「ターゲティングによるゲノム組み込みシステム」なる用語には、一般的に、導入事象に必要とされるすべての要素（例えば、ヌクレアーゼ剤、ヌクレアーゼ切断部位、挿入ＤＮＡポリヌクレオチド、ターゲティングベクター、標的ゲノム遺伝子座、及び対象とするポリヌクレオチドのうちの１つ以上）が含まれるものである。
本明細書で提供される方法は、ターゲティングによるゲノム組み込みシステムの１以上の要素を含む１以上のポリヌクレオチド又はポリペプチドコンストラクトを細胞に導入することを含みうる。「導入する」には、配列（ポリペプチド又はポリヌクレオチド）が細胞の内部にアクセスできるような形で細胞に配列を与えることが含まれる。本明細書で提供される方法は、核酸又はタンパク質が少なくとも１個の細胞の内部にアクセスできるものであれば、細胞に核酸又はタンパク質を導入するための特定の方法に依存しない。様々な細胞種に核酸又はタンパク質を導入するための方法は、当該技術分野では周知のものであり、安定的なトランスフェクション法、一過性のトランスフェクション法、及びウイルスにより媒介される方法が含まれる。
特定の場合では、本方法及び組成物で用いられる細胞は、それらのゲノムに安定的に組み込まれたＤＮＡコンストラクトを有する。例えば、本明細書に開示される方法で用いられる細胞は、そのゲノムに安定的に組み込まれた予め存在するＣａｓコード遺伝子を有することができる（すなわちＣａｓ準備細胞）。「安定的に組み込まれた」又は「安定的に導入された」には、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれ、その子孫に遺伝するような、細胞へのポリヌクレオチドの導入が含まれる。ＤＮＡコンストラクト又はターゲティングによるゲノム組み込みシステムの様々な要素を安定的に組み込むためのいずれのプロトコールを使用することもできる。
トランスフェクションのプロトコール及び細胞にポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を導入するためのプロトコールは異なりうる。非限定的なトランスフェクション法としては、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６〜６７，Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４（４）：１５９０〜４，ａｎｄ Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）、Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６〜９７）、デンドリマー、又はＤＥＡＥデキストラン若しくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを用いた化学物質に基づくトランスフェクション法が挙げられる。非化学的な方法として、電気穿孔法、音響穿孔法、及び光学的トランスフェクションが挙げられる。粒子に基づいたトランスフェクションとしては、遺伝子銃、又はマグネットアシステッドトランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７〜２８）が挙げられる。ウイルスを用いた方法をトランスフェクションに使用することもできる。
特定の場合では、核酸又はタンパク質の細胞への導入は、電気穿孔法、細胞質内注入、ウイルス感染、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、又はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）によって媒介される。
核酸又はタンパク質の細胞（１細胞期胚）への導入は、マイクロインジェクションによって行うこともできる。１細胞期胚では、マイクロインジェクションは、母系及び／又は父系前核内に、又は細胞質内に行うことができる。マイクロインジェクションが１個だけの前核内に行われる場合、父系前核がそのより大きなサイズのために好ましい。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは細胞質内に行われることが好ましい（例えば翻訳マシナリーにｍＲＮＡを直接送達させるため）が、Ｃａｓタンパク質、又はＣａｓタンパク質をコードするか若しくはＲＮＡをコードした核酸分子は核／前核内に行われることが好ましい。また、マイクロインジェクションは、核／前核及び細胞質の両方への注入によって行うこともできる。すなわち、最初に核／前核内に針を導入して第１の量を注入し、その１細胞期胚から針を抜く際に第２の量を細胞質中に注入することができる。Ｃａｓタンパク質が細胞質に注入される場合、Ｃａｓタンパク質は核／前核への送達を確実にするために核局在化シグナルを含むことが好ましい。マイクロインジェクションを行うための方法は周知のものである。例えば、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｇｙ Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．，２００３，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｓ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：１５０２２〜１５０２６及びＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９：９３５４〜９３５９を参照されたい。これらの文献のそれぞれをその全容にわたってすべての目的で本明細書に参照により援用するものである。
核酸又はタンパク質の細胞への導入は、１回で、又は一定時間にわたって複数回で行うことができる。例えば、このような導入は、一定時間にわたって少なくとも２回、一定時間にわたって少なくとも３回、一定時間にわたって少なくとも４回、一定時間にわたって少なくとも５回、一定時間にわたって少なくとも６回、一定時間にわたって少なくとも７回、一定時間にわたって少なくとも８回、一定時間にわたって少なくとも９回、一定時間にわたって少なくとも１０回、一定時間にわたって少なくとも１１回、一定時間にわたって少なくとも１２回、一定時間にわたって少なくとも１３回、一定時間にわたって少なくとも１４回、一定時間にわたって少なくとも１５回、一定時間にわたって少なくとも１６回、一定時間にわたって少なくとも１７回、一定時間にわたって少なくとも１８回、一定時間にわたって少なくとも１９回、又は一定時間にわたって少なくとも２０回行うことができる。
ヌクレアーゼ剤及びターゲティングベクター（例えば１細胞期胚以外の細胞ではＬＴＶＥＣ）が両方とも細胞に導入される場合、これらを同時に導入することができる。あるいは、ヌクレアーゼ剤はターゲティングベクターとは別に導入することができる。例えば、ヌクレアーゼ剤はターゲティングベクターの導入の前に導入するか、又はターゲティングベクターの導入の後で導入することができる。
Ｆ．組換えの機構、及び非相同末端結合、遺伝子変換、又は相同組換えの発生率を変えるための方法
組換えとは、２個のポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のあらゆるプロセスを含むものであり、あらゆる機構によって生じうる。二本鎖切断（ＤＳＢ）に応じた組換えは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え（ＨＲ）という２つの保存されたＤＮＡ修復経路で主として生じる。Ｋａｓｐａｒｅｋ ＆ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６〜８９７を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。ＮＨＥＪは、相同性鋳型を必要とせずに、切断末端同士を互いに直接連結することによる核酸の二重鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる不連続配列の連結は、二重鎖切断部位の近くに欠失、挿入、又は転位をしばしば生じうる。組換えは、相同組換え型修復（ＨＤＲ）又は相同組換え（ＨＲ）によっても生じうる。ＨＤＲ又はＨＲは、ヌクレオチド配列の相同性を必要としうる核酸修復の形を含み、「標的」分子（すなわち二本鎖切断が生じた分子）の修復の鋳型とするために「ドナー」分子を利用し、ドナーから標的への遺伝情報の転移を生じる。いかなる特定の理論に束縛されることも望むものではないが、このような移動は、切断が生じた標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修復、及び／又は標的の一部になることとなる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される合成依存性鎖アニーリング、及び／又は関連するプロセスに関与してもよい。場合によっては、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの部分、ドナーポリヌクレオチドの複製、又はドナーポリヌクレオチドの複製の部分は、標的ＤＮＡ内に組み込まれる。
ある対立遺伝子についてヘテロ接合型である細胞のゲノムをその対立遺伝子についてホモ接合型となるように改変する点に関して、組換えは、ホモ接合型の細胞がヘテロ接合型の細胞から誘導されるあらゆる手段を含みうる。このような手段としては、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）、遺伝子変換（gene conversion）、又は任意の既知の組換え機構によって生じうる交叉事象が挙げられる。理論に束縛されることを望むものではないが、ＬＯＨは、遺伝子変換をともなうか又はともなわない有糸分裂組換えにより、又は染色体の喪失及び重複によって起きるものと考えられる。例えば、Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７：２５７〜２５８を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。この点に関して、遺伝子変換は、ドナー配列から高い相同性を有するアクセプターへの遺伝物質の一方向の移動をともないうる（すなわち１個の分子からそのホモログへの遺伝情報の非相互的交換）。遺伝子変換には任意の既知の組換え機構によって対立遺伝子をコピーする任意の手段が含まれる。例えば、遺伝子変換は、無傷の配列から二本鎖切断を有する相同領域への遺伝情報の非相互的移動をともなう場合があり、姉妹染色分体、相同染色体、又は同じ染色分体上若しくは異なる染色体上の相同配列間で生じうる。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．８：７６２〜７７５を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。特定の場合では、遺伝子変換は、相同染色体から遺伝情報がコピーされる結果として相同組換えから直接生じる。これにより、相同配列同士が同じでない場合に局所的なヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）が生じる。
例として、ＬＯＨは、有糸分裂交叉による、又は切断誘導複製による染色分体の複製による相互型の染色分体交換によって生じうる。いずれの場合も、ゲノム複製の前に１本の染色体がターゲティングされるヘテロ接合型改変が起きうる。あるいは、ゲノム複製後に１本の染色分体がターゲティングされた後、染色分体間の遺伝子変換が起きてもよい。
本明細書に開示される方法のいずれにおいても、細胞は、ＮＨＥＪ活性を高めるか又は低めるように改変された細胞とすることができる。同様に、細胞は、遺伝子変換又はＨＤＲ活性を高めるように改変された細胞とすることもできる。このような改変は、ＮＨＥＪ、遺伝子変換、及び／又はＨＤＲの調節に関与する遺伝子の発現又は活性の改変を含みうる。例えば、ＮＨＥＪの活性を低下させ、かつ／又はＨＤＲの活性を高めることによって、２種類のｇＲＮＡに対応したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列間のゲノム領域の両対立遺伝子破壊を促進することができる。いずれの特定の理論によって束縛されることも望まないが、両対立遺伝子破壊が起こる１つの機構は、第１の対立遺伝子内のＮＨＥＪ媒介修復又はＨＤＲ媒介修復、及び遺伝子変換などのＨＤＲ機構による同じ第２の対立遺伝子の形成によるものである（実施例１を参照）。したがって、ＨＤＲ媒介経路を促進する（例えばＮＨＥＪ活性を低下させるか又はＨＤＲ活性を高めることにより）ことによって、ゲノム領域の両対立遺伝子破壊を促進することもできる。同様に、いずれの特定の理論によって束縛されることも望まないが、１個の遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡのペアを使用することによるヘテロ接合型細胞のホモ接合型細胞への変換は、ＮＨＥＪ活性が低下させられ、それに対応してＨＤＲ活性（例えば遺伝子変換活性）が高められる場合に促進することができる。
阻害剤を使用してＮＨＥＪ活性を高めるか若しくは低める、又はＨＤＲ活性を高めるか若しくは低めることができる。このような阻害剤は、小分子又は短鎖干渉核酸（例えば短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などの阻害性核酸、又は遺伝子転写産物に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができる。阻害剤は、ＮＨＥＪ若しくはＨＤＲ、又は例えばリン酸化、ユビキチン化、及びＳＵＭＯ化などの翻訳後修飾によるそれらの上流の調節に関与する酵素を標的とすることができる。
哺乳動物細胞では、ＮＨＥＪは主要なＤＳＢ修復機構であり、細胞周期全体を通じて活性である。脊椎動物では、「正規の（canonical）」又は「古典的な（classical）」ＮＨＥＪ経路（Ｃ−ＮＨＥＪ）は、ＤＳＢを修復するためにＤＮＡ−ＰＫ、Ｋｕ７０−８０、アルテミス、リガーゼＩＶ（Ｌｉｇ４）、ＸＲＣＣ４、ＣＬＦ、及びＰｏｌμを含むいくつかのコア因子を必要とする。Ｋａｓｐａｒｅｋ ＆ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６〜８９７を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。ＮＨＥＪでは、ＤＮＡの末端同士は、他のＮＨＥＪの要素がローディングされるためのドッキングステーションとして機能する、豊富に存在する末端保護Ｋｕタンパク質によって結合される。
したがって、本明細書に開示される方法の一部のものでは、細胞は、Ｃ−ＮＨＥＪに関与する因子の発現又は活性を低下若しくは消失させるか、又は増大させるように改変されている。例えば、特定の方法では、細胞は、ＤＮＡ−ＰＫ、Ｋｕ７０−８０、アルテミス、リガーゼＩＶ（Ｌｉｇ４）、ＸＲＣＣ４、ＣＬＦ、及び／又はＰｏｌμの発現又は活性を低下若しくは消失させるように改変されている。特定の方法では、細胞は、ＤＮＫ−ＰＫの発現又は活性（例えばＤＮＫ−ＰＫｃｓの発現又は活性；代表的なＵｎｉＰｒｏｔ配列はＰ９７３１３として指定されている）を低減若しくは消失させるか、又はＤＮＫ−ＰＫの発現又は活性を増大させるように改変されている。ＤＮＫ−ＰＫｃｓ阻害剤の例としては、例えばＮＵ７０２６及びＮＵ７４４１が挙げられる。例えば米国特許第６，９７４，８６７号を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。特定の方法では、細胞は、リガーゼＩＶの発現又は活性を低減若しくは消失させるか、又はリガーゼＩＶの発現又は活性を増大させるように改変されている。リガーゼＩＶ阻害剤の例としては、ＳＣＲ７がある。
ＡＴＭ（例えばＫＵ５５９３３）、ＣＨＫ１／ＣＨＫ２（例えば、ＫＬＤ１１６２又はＣＨＩＲ−１２４）及びＡＴＲ（例えばＶＥ８２１）のような細胞周期チェックポイントタンパク質を標的とする阻害剤を使用することで、特定のＤＮＡ修復阻害剤の作用を相乗的に高めるか、又は細胞周期停止及び／又はアポトーシスのような意図しない副作用を防止することもできる（Ｃｉｃｃｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４０：１７９を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。）。
Ｃ−ＮＨＥＪの阻害によって、「代替的」ＮＨＥＪ（Ａ−ＮＨＥＪ）経路により媒介される異常連結のレベルが高まり、また、ＨＲ修復も増大しうる。Ａ−ＮＨＥＪ経路は、マイクロホモロジーにより媒介される連結を促す傾向を有し、Ｃ−ＮＨＥＪよりも遅い反応速度論にしたがう。ＭＲＮ複合体（ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＮＢＳ１）、ＣｔＩＰ、ＸＲＣＣ１、ＰＡＲＰ、Ｌｉｇ１、及びＬｉｇ３を含むいくつかの因子の関与が提唱されている。Ｋａｓｐａｒｅｋ ＆ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６〜８９７及びＣｌａｙｂｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３８（２１）：７５３８〜７５４５を参照されたい。尚、各文献の全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。
したがって、本明細書に開示される方法の一部のものでは、細胞は、Ａ−ＮＨＥＪに関与する因子の発現又は活性を低下若しくは消失させるか、又は増大させるように改変されている。例えば、特定の方法では、細胞は、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＮＢＳ１、ＣｔＩＰ、ＸＲＣＣ１、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ１）、Ｌｉｇ１、及び／又はＬｉｇ３の発現又は活性を低下若しくは消失させるように改変されている。他の方法では、細胞は、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＮＢＳ１、ＣｔＩＰ、ＸＲＣＣ１、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ１）、Ｌｉｇ１、及び／又はＬｉｇ３の発現又は活性を増大させるように改変されている。特定の方法では、細胞は、ＰＡＲＰ１（代表的なＵｎｉＰｒｏｔ配列はＰ１１１０３として指定されている）の発現又は活性を低減若しくは消失させるか、又はＰＡＲＰ１の発現又は活性を増大させるように改変されている。ＰＡＲＰ阻害剤（例えばＮＵ１０２５、イニパリブ、オラパリブ）の例としては、ニコチンアミド；イソキノリノン及びジヒドロイソキノリノン；ベンズイミダゾール及びインドール；フタラジン−１（２Ｈ）−オン及びキナゾリノン；イソインドリノン並びにその類似体及び誘導体；フェナントリジン及びフェナントリジノン；ベンゾピロン並びにその類似体及び誘導体；不飽和ヒドロキサム酸誘導体並びにその類似体及び誘導体；縮合ピリダジンを含むピリダジン並びにその類似体及び誘導体；及び／又はカフェイン、テオフィリン、及びチミジンなどの他の化合物、並びにそれらの類似体及び誘導体が挙げられる。例えば、米国特許第８，０７１，５７９号を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。
Ｃ−ＮＨＥＪもやはりＨＲと競合的な関係を示すため、Ｃ−ＮＨＥＪの阻害はやはりＨＲ修復の増大につながりうる。ＮＨＥＪの阻害は、ランダムな組み込みの低下及び恐らくは相同組換えによる標的の組み込みの増大による遺伝子ターゲティングの向上につながりうるため、ＮＨＥＪとＨＲとの間のこのような競合を利用することができる。
相同組換え修復には、一本鎖アニーリング、遺伝子変換、交叉、及び切断誘導性複製（break-induced replication）を含むいくつかの形態が存在する。一本鎖アニーリングはＨＲ修復のマイナーな形であり、リセクションされたＤＳＢの両側の相同な一本鎖配列同士がアニールすることによって染色体の再構成を生じるものである。一本鎖アニーリングは、２個の配列相同性領域を隔てる距離に応じて異なるサイズの欠失を生じる。遺伝子変換は、相同染色体から遺伝情報がコピーされる結果としてＨＲから直接生じる、１個の分子からそのホモログへの遺伝情報の非相互的な交換を含む。これにより、相同配列同士が同じでない場合に局所的なＬＯＨが生じる。通常は、遺伝子変換の範囲は数百塩基対に限定されている。しかしながら、ＲＡＤ５１Ｃ欠損を含む特定の遺伝的背景では、長い範囲の遺伝子変換も報告されている。Ｎａｇａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８０７５〜８０８６を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。交叉は例えば相同染色体間で起こり、Ｇ１期に起こる場合には相互転座を、Ｇ２期に起こる場合には切断部位から遠位テロメアまで延びる非相互転座及びＬＯＨを生じる可能性がある。切断誘導性複製はＨＲの１形態であり、鎖侵入後にＤＮＡ複製が染色体の末端まで継続するものである。このように、ＨＲがＬＯＨを促進する機構には多くのものがある。
したがって、本明細書に開示される方法の一部のものでは、細胞は、ＨＲに関与する因子の発現又は活性を低下若しくは消失させるか、又は増大させるように改変されている。例えば、特定の方法では、細胞は、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＢＲＣＡ１、及び／又はＢＲＣＡ２の発現又は活性を増大させるように改変されている。他の方法では、細胞は、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＢＲＣＡ１、及び／又はＢＲＣＡ２の発現又は活性を低下若しくは消失させるように改変されている。
特定の方法では、ＮＨＥＪ及び／又はＨＲの調節に関与する更に他のタンパク質の発現又は活性を変化させることができる。例えば、特定の方法では、細胞は、Ｃｈｋ２の発現又は活性を低下若しくは消失させ、Ｃｌｓｐｎの発現又は活性を低下若しくは消失させ、Ｓｅｔｄ２の発現又は活性を低下若しくは消失させ、Ｋａｔ２ａの発現又は活性を増大させ、かつ／又はＲａｄ５１の発現又は活性を増大させるように改変されている。他の方法では、細胞は、Ｃｈｋ２の発現又は活性を増大させ、Ｃｌｓｐｎの発現又は活性を増大させ、Ｓｅｔｄ２の発現又は活性を増大させ、Ｋａｔ２ａの発現又は活性を低下若しくは消失させ、かつ／又はＲａｄ５１の発現又は活性を低下若しくは消失させるように改変されている。
Ｃｈｋ２（Ｃｈｅｋ２及びＲａｄ５３としても知られる。Ｓ．ｐｏｍｂｅのホモログはＣｄｓ１である）は、ＤＮＡ二本鎖切断の存在に応じた、チェックポイント媒介型細胞周期停止、ＤＮＡ修復の活性化及びアポトーシスに必要とされるセリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。Ｂｌａｉｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４２：５６４４〜５６５６を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。Ｃｌｓｐｎ（Ｃｌａｓｐｉｎとしても知られる。Ｓ．ｐｏｍｂｅのホモログはＭｒｃ１である）は、ＤＮＡ損傷に応じたチェックポイント媒介型細胞周期停止に必要とされるタンパク質である。Ｓ．ｐｏｍｂｅにおけるＣｈｋ２又はＣｌｓｐｎのホモログの欠失は、野生型と比較して大幅に高い切断誘導遺伝子変換のレベルを示す超組換え体（hyper-recombinant）の表現型を生じることが報告さ
れている。詳細には、遺伝子変換のレベルが大幅に高くなったのに対して、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）、姉妹染色分体変換（ＳＣＣ）、及びヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）のレベルは低下したことが報告されている。Ｂｌａｉｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２：５６４４〜５６５６を参照されたい。
Ｋａｔ２ａ（Ｇｃｎ５及びＧｃｎ５ｌ２としても知られる）は転写活性化を促進する遍在性のヒストンアセチルトランスフェラーゼであり、二本鎖切断の修復に関係していることが報告されている。Ｋａｔ２ａ依存性のヒストンＨ３リシン３６（Ｈ３Ｋ３６）のアセチル化によって、クロマチンアクセシビリティーが増大し、リセクションが増大し、非相同性末端結合が抑制される一方で相同組換えが促進される。Ｐａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：４０９１を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。Ｓｅｔｄ２（Ｋｉａａ１７３２、Ｋｍｔ３ａ、及びＳｅｔ２）は、ヒストンＨ３のリシン３６を、脱メチル化されたリシン３６（Ｈ３Ｋ３６ｍｅ２）を基質として用いて特異的にトリメチル化する（Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３）ヒストンメチルトランスフェラーゼである。Ｓｅｔｄ２−依存性のＨ３Ｋ３６のメチル化によって、クロマチンアクセシビリティーが低下し、リセクションが低下し、ＮＨＥＪが促進される。（Ｐａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：４０９１を参照）。
Ｒａｄ５１（Ｒｅｃａ、Ｒａｄ５１Ａ、及びＤＮＡ修復タンパク質Ｒａｄ５１ホモログ１としても知られる）は、ｒａｄ５２及び他のタンパク質とともに機能して相同組換えの際に鎖交換を行い、ミスマッチ修復によって解かれることで遺伝子変換範囲を生じるヘテロ二重鎖ＤＮＡを形成する。哺乳動物細胞では、Ｒａｄ５１及びＲａｄ５２の過剰発現は、相同組換え及び遺伝子変換の頻度を高めることが報告されている。Ｙａｎｅｚ ＆ Ｐｏｒｔｅｒ（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１２８２〜１２９０及びＬａｍｂｅｒｔ ＆ Ｌｏｐｅｚ（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ．１９：３０９０〜３０９９を参照されたい。尚、すべての目的でそれらの全容を参照により本明細書に援用する。
ＮＨＥＪ、遺伝子変換、及び／又は相同組換え型修復の調節に関与する遺伝子の発現又は活性の改変は、空間的又は時間的に特異的であってよく、また、誘導性であるか又は一過性かつ可逆的なものであってもよい。例えば、様々な形態のカセットを、特定の発生段階において、又は誘導される際に特定の細胞又は組織型における欠失を可能にするように構築することができる。このようなカセットではリコンビナーゼシステムを用いることができるが、こうしたリコンビナーゼシステムでは、カセットの両側にリコンビナーゼ認識部位が隣接しており、所望の細胞型において発現されるか、所望の発生段階で発現されるか、又は誘導される際に発現若しくは活性化されるリコンビナーゼを使用してカセットを除去することができる。このようなカセットは、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用するところの米国特許出願公開第２０１１／０１０４７９９号に記載される、ヌル、条件的、又は条件的／ヌルの組み合わせの対立遺伝子が生じるように配置された異なるリコンビナーゼ認識部位のペアの配列を含むように更に構築することもできる。リコンビナーゼ遺伝子の調節は、例えばリコンビナーゼ遺伝子を細胞特異的、組織特異的、若しくは発生的に調節されるプロモーター（又は他の調節エレメント）と機能的に連結するか、又はリコンビナーゼ遺伝子を特定の細胞型、組織型、若しくは発生段階においてのみ活性を有するｍｉＲＮＡの認識部位を含む３’−ＵＴＲと機能的に連結することなどによる様々な方法で制御することができる。リコンビナーゼは、例えば、エフェクター若しくは代謝産物（例えば、ＣｒｅＥＲＴ２、その活性はタモキシフェンにより正に制御される）の制御下にリコンビナーゼを置く融合タンパク質を用いることにより、又は誘導性プロモーター（例えば、その活性がドキシサイクリン及びＴｅｔＲ又はＴｅｔＲ変異体により制御されるもの）の制御下にリコンビナーゼ遺伝子を置くことによって調節することもできる。様々な形態のカセット及びリコンビナーゼ遺伝子を調節する手段は、例えば米国特許第８，５１８，３９２号、同第８，３５４，３８９号、及び同第８，６９７，８５１号に記載されている。尚、上記特許のそれぞれの全容を参照により本明細書に援用する。
Ｇ．細胞及び動物
本明細書で提供される様々な組成物及び方法では、例えば動物由来の細胞などの細胞を用いる。かかる細胞は非ヒト動物に由来するものでよい。かかる細胞は、例えば真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞などの真核細胞であってよい。哺乳動物細胞は、例えば非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、又はＣＨＯ細胞であってよい。真核細胞は、全能性細胞、例えば非ヒト多能性細胞（例えばマウス胚性幹（ＥＳ）細胞若しくはラットＥＳ細胞）若しくはヒト多能性細胞などの多能性細胞、又は非多能性細胞であってよい。全能性細胞としては、あらゆる細胞型を生じることができる未分化細胞が挙げられ、多能性細胞としては、１以上の分化した細胞型に発生する能力を有する未分化細胞が挙げられる。かかる多能性及び／又は全能性細胞は、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞のようなＥＳ様細胞であってもよい。胚性幹細胞としては、胚への導入後に発生中の胚のあらゆる組織に寄与することが可能である胚由来の全能性又は多能性細胞が挙げられる。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から誘導することができ、脊椎動物の３つの胚葉（内胚葉、外胚葉、及び中胚葉）のいずれの細胞にも分化することが可能である。
真核細胞は、初代体細胞ではない細胞であってもよい。体細胞は、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞、又は未分化の幹細胞ではないあらゆる細胞を含むことができる。
真核細胞には初代細胞も含まれる。初代細胞には、生物、臓器、又は組織から直接単離された細胞又は細胞の培養物が含まれる。初代細胞には、形質転換もされていなければ不死細胞でもない細胞が含まれる。こうした細胞には、予め組織培養中で継代されていないか、又は予め組織培養中で継代されているが組織培養中で無限に継代することはできない生物、臓器、又は組織から得られたあらゆる細胞が含まれる。かかる細胞は従来の方法によって単離することができ、例えば、体細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞、角化細胞、メラニン細胞、単核細胞、単核球、脂肪細胞、脂肪前駆細胞、神経細胞、グリア細胞、肝細胞、骨格筋芽細胞、及び平滑筋細胞が挙げられる。例えば、初代細胞は、結合組織、筋肉組織、神経系組織、又は上皮組織に由来したものとすることができる。
真核細胞には不死化細胞も含まれる。不死化細胞には、通常は無限に増殖しないが突然変異又は改変のために正常な細胞老化を免れ、分裂し続けることができる多細胞生物からの細胞が含まれる。かかる突然変異又は改変は、自然に生じるか又は意図的に誘発させることができる。不死化細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎細胞（例えばＨＥ２９３細胞）、及びマウス胚性線維芽細胞（例えば３Ｔ３細胞）が挙げられる。多くの種類の不死化細胞が当該技術分野では周知である。
不死化又は初代細胞には、組換え遺伝子又はタンパク質を培養又は発現させるために一般的に使用されている細胞が含まれる。
真核細胞には１細胞期胚（すなわち受精卵母細胞又は接合子）も含まれる。かかる１細胞期胚は、あらゆる遺伝的背景（例えばＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、又はこれらの組み合わせ）からのものでよく、新鮮なものであっても凍結されたものであってもよく、自然交配又はインビトロ受精から得られるものでもよい。
細胞、多能性及び／又は全能性細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ドナー細胞、及び／又は宿主胚に関連した「動物」なる用語には、哺乳動物、魚類、及び鳥類が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、雄牛、シカ、バイソン、ヒツジ、げっ歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット）、家畜（乳牛、子牛などのウシの種、ヒツジ、ヤギなどのヒツジの種、並びにブタ及びイノシシなどのブタの種）が挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリ、七面鳥、ダチョウ、ガン、アヒルなどが挙げられる。家畜化された動物及び農業用動物も含まれる。「非ヒト動物」なる用語にはヒトは含まれない。
マウス多能性及び／又は全能性細胞は、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９とＣ５７ＢＬ／６との混血、ＢＡＬＢ／ｃ系統、又はＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ系統に由来するものであってよい。１２９系統の例としては、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６ （１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、及び１２９Ｔ２が挙げられる。例えばＦｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６）を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。Ｃ５７ＢＬ系統の例としては、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが挙げられる。マウス多能性及び／又は全能性細胞は、上記の１２９系統と上記のＣ５７ＢＬ／６系統との混血に由来するものでもよい（例えば５０％ １２９及び５０％ Ｃ５７ＢＬ／６）。同様に、マウス多能性及び／又は全能性細胞は、上記の１２９系統の混血又は上記のＢＬ／６系統の混血に由来するものでもよい（例えば１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）。マウスＥＳ細胞の具体例としては、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞がある。例えば、Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９，１０２４〜１０２８，１０３０，１０３２を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。
ラット多能性及び／又は全能性細胞は、例えばＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ
Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、又はＦｉｓｈｅｒ Ｆ３４４若しくはＦｉｓｈｅｒ
Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統を含む任意のラット系統に由来するものでもよい。ラット多能性及び／又は全能性細胞は、上記に記載した２以上の系統の混血に由来する系統から得ることもできる。例えば、ラット多能性及び／又は全能性細胞は、ＤＡ系統又はＡＣＩ系統に由来するものであってよい。ＡＣＩラット系統は、白い腹部と足及びＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有するブラックアグーチ色を有するものとして特徴付けられる。そのような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給元から入手可能である。ＡＣＩラット由来のラットＥＳ細胞株の例としては、ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞がある。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチ色の毛皮とＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有するものとして特徴付けられる。かかるラットは、チャールズリバー社（Charles River）及びハーラン・ラボラトリーズ社（Harlan Laboratories）を含む様々な供給元から入手可能である。ＤＡラット由来のラットＥＳ細胞株の例としては、ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株及びＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株がある。特定の場合では、ラット多能性及び／又は全能性細胞は、近交ラット系統に由来するものである。例えば、２０１４年２月２０日出願の、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用するところの米国特許出願公開第２０１４／０２３５９３３（Ａ１）号を参照されたい。
ヒト多能性細胞の例としては、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発生的に制限されたヒト前駆細胞、並びに、プライム型ヒトｉＰＳ細胞及びナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞などのヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。人工多能性幹細胞には、分化した成人細胞から直接誘導することができる多能性幹細胞が含まれる。ヒトｉＰＳ細胞は、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘファミリー転写因子（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５）、Ｍｙｃファミリー転写因子（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ｌ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ）、クルッペル様ファミリー（ＫＬＦ）転写因子（例えば、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５）、並びに／又は、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、及び／若しくはＧｉｌｓ１などの関連転写因子を含みうるリプログラミング因子の特定の組み合わせを細胞内に導入することによって作成することができる。ヒトｉＰＳ細胞はまた、例えば、ｍｉＲＮＡ、転写因子の作用を模倣する小分子、又は系譜決定因子（lineage specifier）の使用によって発生させてもよい。ヒトｉＰＳ細胞は、脊椎動物の３つの胚葉、例えば、内胚葉、外胚葉、又は内胚葉のあらゆる細胞に分化する能力によって特徴付けられる。ヒトｉＰＳ細胞はまた、適当なインビトロ培養条件下で無限に増殖する能力によっても特徴付けられる。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ １２６：６６３〜６７６を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。プライム型のヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞には、着床後の胚盤葉上層細胞に類似した特徴を発現し、系譜決定（lineage specification）及び分化にコミットした細胞が含まれる。ナイーブ型ヒトＥＳ細胞及びナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞には、着床前胚の内部細胞塊のＥＳ細胞に類似した特徴を発現し、系譜決定にコミットしていない細胞が含まれる。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００９）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ ４：４８７〜４９２を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。
宿主胚内に移植された細胞は、「ドナー細胞」と呼ぶ場合がある。遺伝子改変された多能性及び／又は全能性細胞は宿主胚と同じ系統、又は異なる系統に由来するものであってよい。同様に、代理母は、遺伝子改変された多能性及び／又は全能性細胞及び／又は宿主胚と同じ系統に由来するものであってもよく、あるいは代理母は、遺伝子改変された多能性及び／又は全能性細胞及び／又は宿主胚とは異なる系統に由来するものであってもよい。
様々な宿主胚を、本明細書に開示される方法及び組成物において使用することができる。例えば、ターゲティングによる遺伝子改変を有する多能性及び／又は全能性細胞を対応する生物に由来する前桑実胚期の胚（例えば８細胞期胚）に導入することができる。例えば米国特許第７，５７６，２５９号、米国特許第７，６５９，４４２号、米国特許第７，２９４，７５４号、及び米国特許出願公開第２００８／００７８０００（Ａ１）号を参照されたい。尚、各文献の全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する。他の場合では、ドナーＥＳ細胞は、２細胞期、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、３２細胞期、又は６４細胞期の宿主胚に移植することができる。宿主胚は胚盤胞であってもよく、前胚盤胞胚、前桑実胚期の胚、桑実胚期の胚、未接着桑実胚期の胚、又は接着桑実胚期の胚であってよい。マウス胚を使用する場合、宿主胚の段階は、Ｔｈｅｉｌｅｒ（１９８９）（「Ｔｈｅ Ｈｏｕｓｅ Ｍｏｕｓｅ：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されるタイラー（Ｔｈｅｉｌｅｒ）ステージを参照し、１（ＴＳ１）、ＴＳ２、ＴＳ３、ＴＳ４、ＴＳ５、及びＴＳ６から選択される。例えば、タイラーステージは、ＴＳ１、ＴＳ２、ＴＳ３、及びＴＳ４から選択することができる。特定の場合では、宿主胚は透明帯を有し、ドナー細胞は透明帯の穴から宿主胚に導入されるＥＳ細胞である。他の場合では、宿主胚は透明帯がない胚である。更に他の場合では、桑実期宿主胚は凝集される。
Ｈ．改変されたゲノムを有する細胞を同定する方法
上記の方法の一部のものは、改変されたゲノムを有する細胞を同定することを更に含む。様々な方法を用いて、欠失又は挿入などのターゲティングによる改変を有する細胞を同定することができる。そのような方法は、標的遺伝子座（例えば第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と第２のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとの間）にターゲティングによる改変を有する１個の細胞を同定することを含む。スクリーニングを行って改変されたゲノム遺伝子座を有するこうした細胞を同定することができる。
スクリーニング工程は、親染色体の「対立遺伝子の改変」（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のような定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって行うことができる。リアルタイムＰＣＲでは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットと、ターゲティングされない参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットとを用いることができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。
スクリーニング工程はリテンションアッセイを含んでもよい。リテンションアッセイは、標的ゲノム遺伝子座への核酸インサートのターゲティングによる正しい挿入と、標的ゲノム遺伝子座の外側のゲノム位置への核酸インサートのランダムなトランスジェニック挿入とを区別するために使用されるアッセイである。ロングレンジＰＣＲ又はサザンブロッティングのようなターゲティングによる改変についてスクリーニングするための従来のアッセイは、挿入されたターゲティングベクターを標的遺伝子座と結合させるものである。しかしながら、ＬＴＶＥＣは、その大きなホモロジーアームのサイズのためにこうした従来のアッセイによるスクリーニングを行うことはできない。ＬＴＶＥＣによるターゲティングについてスクリーニングを行うには、「対立遺伝子の喪失（loss-of-allele）」（ＬＯＡ）及び「対立遺伝子の獲得（gain-of-allele）」（ＧＯＡ）アッセイを含む「対立遺伝子の改変（modification-of-allele）」（ＭＯＡ）アッセイを使用することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１７８８７９号、及びＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５〜３０７を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する）。「対立遺伝子の喪失（loss-of-allele）」（ＬＯＡ）アッセイは、従来のスクリーニングの論理を逆にしたものであり、突然変異が誘導された天然の遺伝子座のコピーの数を定量化するものである。正しくターゲティングされた細胞クローンでは、ＬＯＡアッセイは、一方の対立遺伝子がターゲティングによる改変により破壊されている２個の天然の対立遺伝子の他方を検出する（Ｘ又はＹ染色体上にない遺伝子について）。同じ原理を逆にして「対立遺伝子の獲得（gain-of-allele）」（ＧＯＡ）アッセイとして適用することで挿入されたターゲティングベクターのコピー数を定量化することができる。例えば、ＧＯＡアッセイとＬＯＡアッセイを組み合わせて用いることで、正しくターゲティングされたヘテロ接合型のクローンを、天然の標的遺伝子の１つのコピーを失ったものとして、また、薬剤耐性遺伝子又は他の挿入されたマーカーの１つのコピーを獲得したものとして示すことができる。
一例として、対立遺伝子の定量化の方法として定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いることができるが、標的遺伝子の０、１、又は２個のコピー間の相違、又は核酸インサートの０、１、又は２個のコピー間の相違を高い信頼性で区別することができる任意の方法を用いてＭＯＡアッセイを開発することができる。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）を使用することにより、ゲノムＤＮＡサンプル中のＤＮＡ鋳型のコピーの数を、特に参照遺伝子との比較によって定量化することができる（例えば米国特許第６，５９６，５４１号を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する）。参照遺伝子は、標的遺伝子又は遺伝子座と同じゲノムＤＮＡ内で定量化される。したがって、２回のＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅（それぞれでそれぞれのプローブを使用する）が行われる。一方のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが参照遺伝子の「Ｃｔ」（閾サイクル）を決定し、他方のプローブは成功したターゲティングによって置換された標的遺伝子又は遺伝子座の領域のＣｔを決定する（すなわちＬＯＡアッセイ）。Ｃｔは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのそれぞれについて出発ＤＮＡの量を反映した量である。すなわち、より存在量の少ない配列は閾サイクルに達するのにより多くのＰＣＲサイクルを必要とする。ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応の鋳型配列のコピーの数を半分に減らすことによって、Ｃｔ単位が約１だけ増加する。標的遺伝子又は遺伝子座の一方の対立遺伝子が相同組換えによって置換された細胞におけるＴａｑＭａｎ（登録商標）反応によって、ターゲティングされない細胞からのＤＮＡと比較した場合に参照遺伝子のＣｔが増加することなく、標的ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応のＣｔが１だけ増加する。ＧＯＡアッセイでは、別のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用して、成功したターゲティングによって標的遺伝子又は遺伝子座を置換する核酸インサートのＣｔを決定することもできる。
ｇＲＮＡのペアは標的ゲノム遺伝子座にＣａｓの媒介による大きな欠失を形成することができるため、ＬＴＶＥＣによる正確なターゲティング（すなわち１細胞期胚以外の細胞で）を確認できるように標準的なＬＯＡ及びＧＯＡアッセイを強化することが有用でありうる。例えば、ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイ単独では、特にＧＯＡアッセイがＬＴＶＥＣインサート内の選択カセットに対するプローブを用いている場合、正しくターゲティングされた細胞クローンを、標的ゲノム遺伝子座の大きなＣａｓ誘導型欠失がゲノム内の他の場所へのＬＴＶＥＣのランダムな組み込みと一致しているクローンから区別できない場合がある。ターゲティングされた細胞における選択圧力は選択カセットに基づいていることから、ゲノムの他の場所へのＬＴＶＥＣのランダムなトランスジェニック組み込みは一般的に選択カセットとＬＴＶＥＣの隣接領域を含んでいるが、ＬＴＶＥＣのより遠位の領域は含んでいない。例えば、ＬＴＶＥＣの一部がゲノムにランダムに組み込まれ、ＬＴＶＥＣが約５ｋｂ以上の長さの核酸インサートを３’ホモロジーアームに隣接した選択カセットとともに含んでいる場合、一般的に５’ホモロジーアームではなく３’ホモロジーアームが選択カセットとともにトランスジェニックに組み込まれる。あるいは、選択カセットが５’ホモロジーアームに隣接している場合、一般的に３’ホモロジーアームではなく５’ホモロジーアームが選択カセットとともにトランスジェニックに組み込まれる。例として、ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイを用いてターゲティングによるＬＴＶＥＣの組み込みを評価する場合、ＧＯＡアッセイが選択カセットに対するプローブを用いている場合には、標的ゲノム遺伝子座におけるヘテロ接合型欠失とＬＴＶＥＣのランダムなトランスジェニック組み込みとが組み合わされることで、標的ゲノム遺伝子座におけるＬＴＶＥＣのヘテロ接合型にターゲティングされた組み込みと同じ指示値が与えられることになる。ＬＴＶＥＣによる正しいターゲティングを確認するためには、リテンションアッセイを単独で、又はＬＯＡ及び／又はＧＯＡアッセイと組み合わせて用いることができる。
リテンションアッセイは、５’標的配列（ＬＴＶＥＣの５’ホモロジーアームに対応する）及び／又は３’標的配列（ＬＴＶＥＣの３’ホモロジーアームに対応する）内のＤＮＡ鋳型のコピー数を決定する。詳細には、選択カセットに隣接したホモロジーアームに対応する標的配列内のＤＮＡ鋳型のコピー数を決定することが有用である。二倍体細胞では、２よりも大きいコピー数は、標的ゲノム遺伝子座にではなく、標的ゲノム遺伝子座の外側へのＬＴＶＥＣのランダムなトランスジェニック挿入を一般的に示し、これは望ましくない。正しくターゲティングされたクローンは、コピー数として２を維持する。更に、こうしたリテンションアッセイにおいて２よりも小さいコピー数は、ターゲティングによって欠失させようとする領域を超えて延びる大きなＣａｓ媒介型欠失を一般的に示し、これもやはり望ましくない。
二倍体細胞の標的ゲノム遺伝子座への核酸インサートのターゲティングによる挿入を同定するための代表的なリテンションアッセイでは、最初に、第１の標的配列にハイブリダイズする第１のホモロジーアームと第２の標的配列にハイブリダイズする第２のホモロジーアームとを隣接させた核酸インサートを含むラージターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）と接触させられた細胞からＤＮＡを得るが、前記核酸インサートは第１のホモロジーアームに隣接した選択カセットを含んでいる。場合により、選択カセットは薬剤選択遺伝子を含むことができる。次いでこのＤＮＡを、前記第１の標的配列内に結合するプローブ、前記核酸インサート内に結合するプローブ、及び既知のコピー数を有する参照遺伝子内に結合するプローブに曝露し、各プローブは結合する際に検出可能なシグナルを発生する。次いで、プローブのそれぞれの結合から生じるシグナルを検出する。参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第１の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第１の標的配列のコピー数を決定し、参照遺伝子プローブからのシグナルを前記核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサートのコピー数を決定する。核酸インサートのコピー数が１又は２であり、第１の標的配列のコピー数が２である場合には、標的ゲノム遺伝子座への核酸インサートのターゲティングによる挿入を一般的に示し、核酸インサートのコピー数が１以上であり、第１の標的配列のコピー数が３以上である場合には、標的ゲノム遺伝子座以外のゲノム遺伝子座への核酸インサートのランダムな挿入を一般的に示す。
第１の標的配列プローブの結合からのシグナルを用いて前記第１の標的配列の閾サイクル（Ｃｔ）値を決定することができ、参照遺伝子プローブの結合からのシグナルを用いて参照遺伝子の閾サイクル（Ｃｔ）値を決定することができ、第１の標的配列のＣｔ値と参照遺伝子のＣｔ値とを比較することによって第１の標的配列のコピー数を決定することができる。同様に、核酸インサートプローブの結合からのシグナルを用いて核酸インサートの閾サイクル（Ｃｔ）値を決定することができ、第１の標的配列のＣｔ値と参照遺伝子のＣｔ値とを比較することによって核酸インサートのコピー数を決定することができる。
ＬＴＶＥＣ内の核酸インサートは、例えば、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂであってよい。プローブが第１の標的配列及び選択カセット内で結合する配列間の距離は、例えば、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、又は５ｋｂ以下であってよい。
かかる方法は、前記第２の標的配列のコピー数を決定するための更なるリテンションアッセイを更に含むことができる。例えば、かかる方法は、前記細胞の前記ＤＮＡを前記第２の標的配列に結合するプローブに曝露することと、前記第２の標的配列プローブの結合からのシグナルを検出することと、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記第２の標的配列プローブからのシグナルと比較して前記第２の標的配列のコピー数を決定することと、を更に含むことができる。
同様に、かかる方法は、前記核酸インサート内の１つ以上の更なる配列のコピー数を決定するための更なるＧＯＡアッセイを更に含むことができる。例えば、かかる方法は、前記細胞の前記ＤＮＡを前記核酸インサートに結合する１つ以上の更なるプローブに曝露することと、前記１つ以上の更なるプローブの結合からのシグナルを検出することと、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記１つ以上の更なる核酸インサートプローブからのシグナルと比較して前記核酸インサート内の前記１つ以上の更なる配列のコピー数を決定することと、を更に含むことができる。
同様に、ＬＴＶＥＣが標的ゲノム遺伝子座から内因性配列を欠失させるように設計されている場合、又はｇＲＮＡのペアが用いられる場合（１個のゲノム標的遺伝子座内の異なる部位に二本鎖切断のペアを形成してその間の内因性配列を欠失させるため）、かかる方法は、標的ゲノム遺伝子座における内因性配列のコピー数を決定するためのＬＯＡアッセイを更に含むことができる。例えば、かかる方法は、前記細胞の前記ＤＮＡを前記標的ゲノム遺伝子座の前記内因性配列に結合するプローブに曝露することと、前記内因性配列プローブの結合からのシグナルを検出することと、前記参照遺伝子プローブからのシグナルを前記内因性配列プローブからのシグナルと比較して前記内因性配列のコピー数を決定することと、を更に含むことができる。
適当な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介型ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブへの定量的ハイブリダイゼーション、Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、ＭＭＰアッセイ（登録商標）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、又はＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば米国特許出願公開第２００５／０１４４６５５号を参照されたい。尚、その全容をすべての目的で参照により本明細書に援用する）。
ＬＴＶＥＣを使用せずに行われるターゲティングによる遺伝子改変では、ロングレンジＰＣＲ、サザンブロッティング、又はサンガーシークエンシングなどの、ターゲティングによる改変についてスクリーニングを行うための従来のアッセイを使用することができる。かかるアッセイは一般的には、挿入されたターゲティングベクターと標的ゲノム遺伝子座との結合の証拠を得るために用いられる。例えば、ロングレンジＰＣＲでは、一方のプライマーが、挿入されたＤＮＡ内の配列を認識することができるのに対して、他方のプライマーはターゲティングベクターの各ホモロジーアームの末端を超える標的遺伝子座の配列を認識する。
上記又は以下で引用した全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、あたかもそれぞれ個々のアイテムが参照により組み込まれると具体的かつ個別的に示されるように、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。異なるバージョンの配列がその時々においてアクセッション番号と関連付けられる場合、本願の有効出願日に当該アクセッション番号と関付けられたバージョンを意図する。有効出願日は、実際の出願日又は、該当する場合、アクセッション番号を参照する優先出願の出願日の早い方を意図する。同様に、異なるバージョンの出版物、ウェブサイトなどが異なる時点で公開される場合、別に指示がない限り、出願の有効出願日の直前に公開されたバージョンが有意である。本発明の機構、工程、要素、実施形態、又は態様はいずれも、別途記載のない限り、組み合わせて使用することができる。本発明を分かりやすさと理解を助ける目的で図示及び例によってある程度詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更及び改変を実施することができることは明らかであろう。
実施例１．１種類のガイドＲＮＡ又は２種類のガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ターゲティング
材料及び方法
ＥＳ細胞の培養、スクリーニング、及び電気穿孔法
ここに述べる各実験は、本発明者らによるＣ５７ＢＬ６ＮＴａｃ／１２９Ｓ６ＳｖＥｖＦ１ハイブリッドＸＹ ＥＳ細胞株であるＶＧＦ１を使用して行った（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１〜９９；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６５２〜６５９）。ＥＳ細胞をこれまでに記載されているようにして培養した（Ｍａｔｉｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｎ Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｄ．Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．１００〜１３２，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
電気穿孔法（ＥＰ）は、電極間隔２ｍｍのキュベット中、０．１２ｍｌの最終体積で７５０万個の細胞を使用して行った。ＥＰ用の電気的条件は、ＢＴＸ ＥＣＭ６３０エレクトロポレーションシステム（ハーバード・アパラタス社（Harvard Apparatus）、マサチューセッツ州ホリストン）を使用して７００Ｖ、抵抗４００Ω、及びキャパシタンス２５μＦとした。ＥＰ１回当たりのＬＴＶＥＣの量は０．００１５ｍｇとし、Ｃａｓ９発現プラスミドは０．００５ｍｇとし、ｓｇＲＮＡは０．０１０ｍｇとした。一部のＥＰは、ＬＴＶＥＣによって発現されるネオマイシン耐性について選択を行わずにクローンを選択できるようにプロマイシン耐性を与えるプラスミド１００ｎｇを添加して行った。ＥＰの後、細胞を２枚のゼラチンコートした１５ｃｍディッシュに播種し、培地を毎日交換した。１００μｇ／ｍｌのＧ−４１８硫酸塩又は０．００１５ｍｇ／ｍｌのプロマイシンを含む選択培地をＥＰの４８時間後から開始し、ＥＰの１０日後まで継続した。ＰＢＳ中にコロニーをピッキングして入れ、０．０５％トリプシンの入った９６ウェルディッシュに加え、１５分間解離させ、培地で中和してスクリーニング用のＤＮＡの単離に使用した。
「対立遺伝子の改変方法」（Ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｏｆ−ａｌｌｅｌｅ
ｍｅｔｈｏｄ（Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５〜３０７））を用いて、正しくターゲティングされたＥＳ細胞クローンを同定し、マウス対立遺伝子の遺伝子型を決定した。
ガイド配列の設計
Ｌｒｐ５又は他の標的化遺伝子の欠失させた部分の内側５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、又は１ｋｂの位置の周辺の約２００ｂｐのＤＮＡ（上流及び下流の両方）を、ＣＲＩＳＰＲ設計ツール（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）に入力して可能なｇＲＮＡ配列を取得した。次いで、可能性のあるｇＲＮＡ配列を、内因性のＤＮＡのみが切断され、ＬＴＶＥＣのヒト化インサートは切断されないようにフィルタリングした。
単鎖ガイドＲＮＡのクローニング
ｓｇＲＮＡを、シームレスなＲＮＡ発現を行うために７７ｂｐのスカフォールドと融合したｐＭＢ＿ｓｇＲＮＡ（Ｕ６プロモーター）内のＢｓｍｂＩ部位に二重鎖オリゴ（ＩＤＴ社）としてクローニングするか、又はジーンコピア社（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）より確認済みの発現プラスミドとして購入した（ＬＲＰ５ガイドＡ、Ｂ、Ｂ２、Ｅ２、Ｅ、及びＦ）。社内で作成したプラスミドをＰＣＲ及びサンガー法により配列決定して確認した。
遺伝子型を確認するためのＤＮＡ鋳型
ＥＳ細胞からＤＮＡを精製し、ターゲティングベクター、及びＣａｓ９を発現するプラスミド、及び複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の１つを発現するプラスミド又は異なるｇＲＮＡの組み合わせを発現する２種類のプラスミドを電気穿孔法で導入したＥＳ細胞からクローンを誘導した。対立遺伝子改変（すなわち対立遺伝子喪失又は対立遺伝子獲得）定量ＰＣＲアッセイにより、マウスの標的遺伝子座のターゲティングによる欠失及びターゲティングベクターの挿入を有するか、又はＣａｓ９／ｇＲＮＡにより誘導された欠失を有するものとして同定されたクローンをフォローアップとしての従来のＰＣＲアッセイを行うために選択した。
オリゴヌクレオチドの設計
ｇＲＮＡのそれぞれの組み合わせについて２つのＰＣＲアッセイを設計した。第１のＰＣＲは、異なるｇＲＮＡの組み合わせのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列間の破壊を検出するための欠失アッセイとした。第２のＰＣＲは、５’アッセイであり、２つのＰＣＲアッセイを含むものとした。最初のものはヒト化された対立遺伝子についての５’ヒトアッセイであり、マウス／ヒト接合部にわたって設計した。第２のものは、内因性のマウス対立遺伝子についての５’マウスアッセイであり、ターゲティングによる５’欠失接合部にわたって設計した。
ＰＣＲ反応及びＴＯＰＯクローニング
タカラバイオ株式会社（ＴａＫａＲａ）製ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（カタログ番号ＲＲ００２Ｍ）を使用してＥＳ細胞のＤＮＡ鋳型を増幅した。各ＰＣＲアッセイ反応ミックス及び水のネガティブコントロールで反応を行った。アッセイ混合物は以下を含むものとした。すなわち、ＥＳ細胞ＤＮＡ鋳型０．００５ｍＬ；１Ｘ ＬＡ ＰＣＲバッファーＩＩ（Ｍｇ２＋添加）；０．０１ｍＭ ｄＮＴＰミックス；０．００７５ｍＭフォワードオリゴ（それぞれに）；０．００７５ｍＭリバースオリゴ（それぞれに）；５０００単位／ｍＬ ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ；及びｄｄＨ２Ｏを加えて０．０２５ｍＬとした。
ＰＣＲサーモサイクルプログラムは、９４℃で１分の後、９４℃で３０秒、６０℃でのアニーリング勾配を３０秒、及び６８℃で１分を３５サイクル、１ｋｂの増幅当たり行った後、７２℃で１０分の重合からなるものとした。
ＰＣＲ産物を、インビトロゲン社（Invitrogen）製１ｋｂ ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（カタログ番号１０７８７−０１８）及び／又はインビトロゲン社（Invitrogen）製５０ｂｐ ＤＮＡラダー（カタログ番号１０４１６−０１４）とともに２％アガロースゲル上で電気泳動によって分画した。残りのＰＣＲ産物は、配列決定用にインビトロジェン社（Invitrogen）のＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（カタログ番号Ｋ４５７５−０２）の使用説明書にしたがってｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。クローニング反応物を、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０細胞に化学的に形質導入し、０．０６ｍｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌ及び０．０２５ｍｇ／ｍＬのカナマイシンアガープレートに播種した。
シークエンシング
白色のコロニーを０．０２５ｍｇ／ｍＬのカナマイシンを含んだＬＢ中に接種し、３７℃で振盪しながら一晩インキュベートした。各コロニーは、アッセイした産物の集団からの１つのアンプリコンを表す。キアジェン社（QUIAGEN）製ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐ
ｒｅｐキット（カタログ番号１２１２３）を使用して各細菌培養物からＤＮＡを抽出した。インサートのＤＮＡ配列を、０．００２ｍＬ ＴＯＰＯクローニングしたＰＣＲ、１ｘＰＣＲｘエンハンサー溶液（１０ｘストック）（カタログ番号Ｘ１１４９５−０１７）、０．００７５ｍＭオリゴ（Ｍ１３Ｆ又はＭ１３Ｒ）、及び０．０１５ｍＬとなるまでｄｄＨ２Ｏを含んだシークエンシング反応ミックス中で決定した。
シークエンシング分析
シークエンシングの結果から、不確定配列及びｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター配列をトリミングし、ＰＣＲインサート配列を単離した。配列決定したフラグメントを基準配列とアラインして変異を分析した。
破壊したクローンのシークエンシング
破壊したポジティブクローンからのＰＣＲ産物を製造者の指示にしたがってｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社（Invitrogen）カタログ番号Ｋ４５７５−０２）にクローニングし、次いでＯｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０細胞に化学的に形質導入し、０．０６０ｍｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌ及び０．０２５ｍｇ／ｍＬのカナマイシンアガープレートに播種した。キアジェン社（ＱＵＩＡＧＥＮ）製ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号１２１２３）を使用して細菌培養物からＤＮＡを抽出した。次いでインサートのシークエンシングの結果を予想した破壊基準配列とアラインしてインデル変異を分析した。Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡによって認識された配列内にＰＡＭから３塩基対の位置で切断することが予想された。予想された切断内の配列を基準配列から欠失させ、残りを用いて結果とアラインした。
１ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）のＴａｑＭａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイ
ＴａｑＭａｎ（登録商標）対立遺伝子識別反応液は、ゲノムＤＮＡ、それぞれの多型に対する特異的プローブ／プライマー、及びＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現ＰＣＲマスターミックスを含む０．００８ｍｌのものとした。プローブは、ライフ・テクノロジーズ社（Life Technologies）（サーモ社（Thermo））より、プライマーはＩＤＴ社より注文した。１２９対立遺伝子に対するプローブをＶＩＣ色素で標識し、Ｂ６対立遺伝子に対するプローブをＦＡＭ色素で標識した。各ＴａｑＭａｎ（登録商標）対立遺伝子アッセイは、３８４ウェルプレートで４重に行い、アプライド・バイオシステムズ社（Applied BioSystems）製ＶｉｉＡ ７プラットフォーム上で行った。ＳＮＶ ＰＣＲサイクリング
プログラムは以下とした。すなわち、９５℃で１０分間の後、９５℃で１５秒、６０℃で６０秒、及び６０℃で３０秒を４０サイクル。反応の分析及び結果の評価は、ＶｉｉＡ７ソフトウェアｖ１．１を使用して行った。
ＦＩＳＨ分析
選択されたＥＳ細胞クローンは、セルライン・ジェネティクス社（Cell Line Genetics）（ウィスコンシン州マディソン）、又はバン・アンデル・インスティテュート社（Van Andel Institute）（ミシガン州グランドラピッズ）により、各社の標準的手順によ
って蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて分析を行った。本発明者らは、マウス及びヒトＢＡＣを２色分析用のプローブとして提供した。
ゲノム破壊及び／又は標的遺伝子座のヒト化の向上
げっ歯類遺伝子の全体又は一部の正確な１工程での欠失及び場合によりそのヒトホモログの全体又は一部による同時置換を行うため、本発明者らは電気穿孔法によりげっ歯類ＥＳ細胞に以下の核酸分子を導入した。すなわち、（１）ＬＴＶＥＣ、（２）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードしたプラスミド又はｍＲＮＡ、及び（３）１以上のＣＲＩＳＰＲ単鎖ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードした１以上のプラスミド又はｇＲＮＡ自体。各実験でＬＴＶＥＣは直鎖化した。一部の実験では、ＬＴＶＥＣは、げっ歯類遺伝子を欠失させてヒト遺伝子を挿入する相同組換え事象を導くように設計されたげっ歯類のホモロジーアームを隣接させた遺伝子産物（タンパク質又はＲＮＡ）をコードしたヒト遺伝子の全体又は一部を含むものとした。他の実験では、ＬＴＶＥＣは、Ｃｈ２５ｈ遺伝子座のような別の遺伝子座をターゲティングするように設計した。いずれの場合も、ＬＴＶＥＣは、抗生物質（例えばＧ４１８）に対する耐性を与える酵素（例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）の発現を誘導する薬剤選択カセットも有していた。
ＬＴＶＥＣを取り込み、そのゲノムにＬＴＶＥＣを組み込んだＥＳ細胞は、抗生物質を含む増殖培地中、組織培養皿上で増殖してコロニーを形成することができた。ＬＴＶＥＣ分子よりも５００〜１，０００倍の量のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードした核酸分子及びｇＲＮＡをコードした核酸分子を導入したため、ＬＴＶＥＣを含む薬剤耐性コロニーの大部分は、少なくとも一時的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を含んでいた。薬剤耐性コロニーをピックし、「対立遺伝子の改変方法（modification-of-allele method）」（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：６５２〜６６０；Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５〜３０７；本明細書にそれらの全容にわたって参照により援用する。）によってスクリーニングして正確にターゲティングされたヒト化対立遺伝子を有するクローンを同定した。更に、ＬＴＶＥＣのホモロジーアーム内の配列を認識するリアルタイムＰＣＲアッセイ（リテンションアッセイと呼ばれる）を用いてマウスゲノムにＬＴＶＥＣが正しくターゲティングされていることを確認した。これらのリテンションアッセイのコピー数を決定することによって、コピー数として２を維持する正確にターゲティングされたＥＳクローンを、標的マウス遺伝子座の大きなＣａｓ９誘導欠失がゲノム内の他の場所へのＬＴＶＥＣのランダムな組み込みと一致しているクローン（その場合、リテンションアッセイは３（又はそれよりも大きい）コピー数を有する）から区別することを助ける更なる明確化が与えられた。ｇＲＮＡのペアによって標的マウス遺伝子座にＣａｓ９により媒介される大きな欠失を生じることができることは、これまでに述べられている標準的なＬＯＡ及びＧＯＡアッセイをリテンションアッセイによって強化することで更なる明確化を与え、正確なターゲティングを確認できることを意味している。したがって、リテンションアッセイを設計してＬＯＡ及びＧＯＡアッセイと組み合わせて用いた。
各実験で１種類又は２種類のｇＲＮＡを使用した。使用したｇＲＮＡは、単独で標的遺伝子座の５’末端の近傍（すなわちターゲティングによるマウス遺伝子欠失）、標的遺伝子座の中間、又は標的遺伝子座の３’末端の近傍にＣａｓ９による切断を誘導した。２種類のｇＲＮＡを使用した場合、一方のｇＲＮＡは標的遺伝子座の５’末端の近傍にＣａｓ９による切断を誘導し、他方のｇＲＮＡは標的遺伝子座の中間、又は標的遺伝子座の３’末端の近傍にＣａｓ９による切断を誘導した。
Ｌｒｐ５遺伝子座
一群の実験において、ＬＴＶＥＣは、マウスＬｒｐ５（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５）遺伝子の、エクトドメインをコードする部分の６８ｋｂの欠失を生じ、同時にヒトＬＲＰ５遺伝子（図１）からの相同配列の９１ｋｂのフラグメントで置換するように設計した。ＬＴＶＥＣは、欠失させようとするマウスＬｒｐ５遺伝子の６８ｋｂの配列に隣接したマウスＬｒｐ５遺伝子座の部分から誘導された７ｋｂ及び３３ｋｂのゲノムＤＮＡを含むホモロジーアームを隣接させたヒトＬＲＰ５遺伝子の９１ｋｂのフラグメントを含むものとした。別々の実験において、このＬｒｐ５をヒト化するＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９をコードしたプラスミド、及び欠失の標的とされるマウスＬｒｐ５遺伝子の領域内に二本鎖切断を形成するように設計された８種類のｇＲＮＡ（Ａ、Ｂ、Ｂ２、Ｃ、Ｄ、Ｅ２、Ｅ、Ｆ）のうちの１つをコードした第２のプラスミドと組み合わせた。各ｇＲＮＡは、ヒトＬＲＰ５遺伝子の挿入される部分内のどの配列も認識しないように設計した。他の実験では、ＬＴＶＥＣ、及びＣａｓ９をコードしたプラスミドを、欠失の標的とされるマウスＬｒｐ５遺伝子の領域内の異なる部位を標的とする２つの異なるｇＲＮＡをコードしたプラスミドと組み合わせた。
薬剤耐性ＥＳ細胞クローンを、ターゲティングによるヒト化について「対立遺伝子の改変アッセイ（modification-of-allele assays）」（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６５２〜６５９；Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５〜３０７）により、欠失内の配列に対して、また、薬剤選択カセット及びヒト遺伝子インサート内の配列に対してスクリーニングした。クローンは、２個の内因性マウス遺伝子配列の一方を失ってヒトインサートの１個のコピーを獲得し、更にリテンション配列（ＬＴＶＥＣのホモロジーアーム内に位置する）の２個のコピーを維持した場合に正しくターゲティングされたものと判定した。このスクリーニングを行うための２つのリテンションアッセイは、以下のプライマー及びプローブを使用したＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイとした。すなわち、７０６４ｒｅｔＵフォワードプライマーＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＧＣＡＧ（配列番号１１９）；７０６４ｒｅｔＵリバースプライマーＣＣＴＡＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴＧＴＡＴＣＡ（配列番号１２０）；７０６４ｒｅｔＵ ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブＴＴＣＴＧＣＣＣＴＴＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＣ（配列番号１２１）；７０６４ｒｅｔＤフォワードプライマーＣＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＴＧＡＡ（配列番号１２２）；７０６４ｒｅｔＤリバースプライマーＣＣＣＴＧＡＣＡＡＧＴＴＣＴＧＣＣＴＴＣＴＡＣ（配列番号１２３）；７０６４ｒｅｔＤ ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブＴＧＣＣＣＡＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴ（配列番号１２４）。
Ｌｒｐ５遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化の結果を表２に示す。ＬＴＶＥＣ単独をＥＳ細胞に導入した場合、スクリーニングされた薬剤耐性クローンの１．９％が正しくターゲティングされたヘテロ接合型のヒト化対立遺伝子を有していた（表２のヘテロ接合型ターゲティングの行（ターゲティングされていない対立遺伝子に突然変異がまったくなく、ＮＨＥＪによって引き起こされる小さい欠失などの小さいＣＲＩＳＰＲ誘導突然変異を有するクローンを含む）を参照）。これに対して、ＬＴＶＥＣを、８種類の試験したｇＲＮＡ（Ａ、Ｂ、Ｂ２、Ｃ、Ｄ、Ｅ２、Ｅ、Ｆ）のうちの７種類によって導かれるＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることで、２．１〜７．８％の範囲の効率で正しくターゲティングされた１対立遺伝子ヘテロ接合型突然変異が生じた。Ｂ２及びＤによるＣａｓ９誘導切断では、１対立遺伝子ターゲティングに加えて両対立遺伝子のホモ接合型ヒト化が１．０〜２．１％で検出された。ＬＴＶＥＣのみでは、小さい単純な欠失対立遺伝子についても両対立遺伝子ターゲティングは観察されなかった。ホモ接合型のＬｒｐ５ヒト化ＥＳ細胞は、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（本明細書にその全容を参照により援用するＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：９１〜９９）によって表現型及び薬剤有効性の研究に使用できる状態の完全なＥＳ細胞由来マウスに直接変換することができた。
予想される切断部位又はその近くのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９誘導ＮＨＥＪを検出するために考案されたＭＯＡアッセイによって、試験したすべてのｇＲＮＡにおいて突然変異活性が示された（データは示されていない）。すべてのクローン間で検出された１対立遺伝子又は両対立遺伝子のｇＲＮＡ誘導突然変異の割合は遺伝子座及び位置によって変化した。ｇＲＮＡの突然変異活性とＬＴＶＥＣによるターゲティングとの間に強い相関は見られなかったが、最も低いターゲティング効率は、しばしば最も低い突然変異頻度を有するｇＲＮＡと関連していた。
欠失の標的とされたＬｒｐ５遺伝子の領域の異なる末端を認識する２種類のｇＲＮＡを組み合わせることで、試験を行った５つの組み合わせのうちの３つにおいて主としてホモ接合型のターゲティング事象の頻度が高くなることによって、全体のヒト化ターゲティング効率が高くなった（表２）。ｇＲＮＡの組み合わせは、ｇＲＮＡによってプログラムされたＣａｓ９切断部位の間で大きな欠失を生じる可能性を有することから、本発明者らは、一方のＬｒｐ５対立遺伝子上にターゲティングによるヒト化を有し、他方の対立遺伝子上に大きなＣＲＩＳＰＲ誘導欠失を有するヘミ接合型ＥＳ細胞クローン（Ａ＋ＦのｇＲＮＡの組み合わせ、表２）についても観察を行った。更に、ｇＲＮＡの組み合わせのうちの２つ（Ａ＋Ｆ及びＡ＋Ｅ２）において、本発明者らは固有の遺伝子型（両方のＬｒｐ５対立遺伝子上の大きなＣＲＩＳＰＲ媒介欠失）を有するＥＳ細胞クローンを同定した。
表２に示されるように、１種類のｇＲＮＡではなく、１個の遺伝子座を標的とした２種類のｇＲＮＡを使用した場合に両対立遺伝子ターゲティングを有するクローンの割合（％）の有意な増大が認められ、ｇＲＮＡの組み合わせの使用が両対立遺伝子改変を促進することが示された。図２Ａは、同時に行われる、ＬＴＶＥＣ及び２種類のガイドＲＮＡ（Ａ及びＢ）を用いたマウス遺伝子の欠失と対応するヒト遺伝子による置換の一般的な模式図を示している。２種類のｇＲＮＡを使用した場合に大幅に高い頻度で観察される固有の突然変異対立遺伝子のタイプには、ホモ接合型に破壊された対立遺伝子（図２Ｂ；Δ／Δ）、ホモ接合型にターゲティングされた対立遺伝子（図２Ｃ；ヒト／ヒト）、ヘミ接合型にターゲティングされた対立遺伝子（図２Ｄ；（ヒト／Δ））、及び他の複合ヘテロ接合型にターゲティングされた対立遺伝子（例えば一方の対立遺伝子がＬＴＶＥＣによりターゲティングされたヒト化を有し、他方の対立遺伝子が小さい欠失などのＣＲＩＳＰＲ誘導突然変異を有する）（図２Ｅ）が含まれる。
ＭＯＡアッセイに基づいた遺伝子型を支持及び確認するためにいくつかのＰＣＲアッセイを行った。これらのプライマーは図１に示され、また、表１に見ることができる。Ｌｒｐ５ ＬＴＶＥＣは、ヒトインサートと隣接するマウスゲノム配列との間の物理的連結についてアッセイするＰＣＲによってターゲティングを証明するのに充分に短い（６．９ｋｂ）５’ホモロジーアームを有するものであった。ヘテロ接合型、ヘミ接合型、又はホモ接合型と判定されたクローンからのＤＮＡによる予想された７．５ｋｂのＰＣＲ産物が観察されたが、親ＥＳ細胞株からのＤＮＡ、又は両対立遺伝子の大きな欠失を有するものとして判定されたクローンからのＤＮＡによるＰＣＲ産物は観察されなかったことから（図３Ａ）、ＭＯＡ（すなわちＬＯＡ及びＧＯＡ）スクリーニングによって作成されたターゲティング細胞が確認され、推測された両対立遺伝子の大きな欠失が支持された。欠失と挿入の接合部の配列を調べる５’−Ｄｅｌ−Ｊ ＰＣＲアッセイ（図３Ｂ）は、親ＥＳ細胞株からのＤＮＡ及び大部分のヘテロ接合型ヒト化クローンからのＤＮＡ（データは示さず）による３３０ｂｐの産物を生じた。ヘテロ接合型クローンであるＡＷ−Ｃ３では、５’−Ｄｅｌ−Ｊ ＰＣＲアッセイは予想されるよりも小さい産物を生じた（図３Ｂ）が、これはｇＲＮＡ Ａ／Ｃａｓ９による切断がターゲティングされていない対立遺伝子上に小さい欠失突然変異を誘発したことを示しており、これはｇＲＮＡ Ａによる切断に対するＭＯＡアッセイによっても検出された（データは示さず）。予想されたように、５’−Ｄｅｌ−Ｊ ＰＣＲアッセイは、ヘミ接合型、ホモ接合型、及び両対立遺伝子欠失型の対立遺伝子を有するクローンでは陰性であった。ヒトＤＮＡインサートの５’末端と隣接するマウスフランキング配列との接合部の配列を調べる５’−Ｉｎｓ−Ｊ ＰＣＲ（図３Ｂ）は、ヘテロ接合型、ヘミ接合型、及びホモ接合型のクローンで４７８ｂｐの産物を生じた（これらは少なくとも１つのターゲティングによるヒト化対立遺伝子を有しているため）。５’−Ｉｎｓ−Ｊ ＰＣＲアッセイは、両対立遺伝子の大きな欠失を有するクローンでは産物を生じなかった（図３Ｂ）。ヘミ接合型及び両対立遺伝子欠失クローンにおける大きな欠失を確認するため、本発明者らは、二重のｇＲＮＡ標的部位の外側の配列を認識するプライマーを用いてＰＣＲを行った。ｇＲＮＡ部位ＡとＦとの間の欠失についてアッセイするＤｅｌ（Ａ＋Ｆ）ＰＣＲ（図１）は、クローンＡＷ−Ａ８及びＢＯ−Ｆ１０からのＤＮＡによる約３６０ｂｐの１種類の産物を生じ（図３Ｂ）、Ｌｒｐ５対立遺伝子の少なくとも一方が大きな欠失を有していることが確認された。ｇＲＮＡ部位ＡとＥ２との間の大きな欠失についてアッセイするＤｅｌ（Ａ＋Ｅ２）ＰＣＲ（図１）は、クローンＢＡ−Ａ７からのＤＮＡによる約２５０ｂｐの１種類の産物を生じた。欠失ＰＣＲは、接合部、ＬＯＡ、及びＧＯＡアッセイとともに両対立遺伝子の大きな欠失を有する遺伝子型を支持している。図３Ａ及び３Ｂに示されるアッセイの結果は、表２に示す両対立遺伝子の遺伝子型を確認するために本発明者らが蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；図４Ａ〜Ｃ）以外に行った同様のアッセイの代表的な例である。
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、Ｌｒｐ５遺伝子のターゲティングによるホモ接合型ヒト化を確認した。Ｌｒｐ５ヒト化ＬＴＶＥＣ（図１）をＣａｓ９及び２種類のｇＲＮＡ（Ａ＋Ｆ又はＡ＋Ｅ２）と組み合わせたターゲティング実験から、定量ＰＣＲ及び従来のＰＣＲアッセイによりターゲティングによるホモ接合型として判定されたＥＳ細胞クローンを、商業的な細胞学サービスに送ってＦＩＳＨ及び核型の分析を行ってもらった。マウスＬｒｐ５遺伝子を有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）を赤色蛍光マーカーで標識して内因性Ｌｒｐ５遺伝子座を同定するためのプローブとして使用し、ヒトＬＲＰ５遺伝子を有するＢＡＣを緑色蛍光マーカーで標識してヒトインサートでターゲティングした染色分体を同定するためのプローブとして使用した。標識した各ＢＡＣプローブを、ターゲティングしたクローンからの中期染色体スプレッドにハイブリダイズさせ、蛍光顕微鏡法によって可視化した。スプレッド上の染色体は、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で染色して可視化し、各クローンの別々の核型をギムザ染色によって決定した。典型的な結果を、正常な４０ＸＹの核型（図示せず）を有することが判明したクローンＡＷ−Ｄ９について図４Ａに示す。図４Ａの合成写真は、赤色のマウスＢＡＣプローブのシグナル及び緑色のヒトＢＡＣプローブのシグナルが両方ともＬｒｐ５遺伝子の既知の位置であるマウス１９番染色体の両方のコピー上の細胞学的Ｂバンドに一緒に局在化していたことを示している。図４Ｃの合成写真は、別のクローン（ＢＡ−Ｄ５）について同じホモ接合型のターゲティングを示している。これらの結果は、ヒト化ＬＴＶＥＣ内のヒトＬＲＰ５遺伝子の９１ｋｂのフラグメント（図１）が、クローンＡＷ−Ｄ９及びＢＡ−Ｄ５の１９番染色体の両方のホモログ上の目的とするマウスＬｒｐ５遺伝子座に正しく挿入されたことを確認するものである。これに対して、図４Ｂの合成写真は、赤色のマウスＢＡＣプローブのシグナル及び緑色のヒトＢＡＣプローブのシグナルが両方ともマウス１９番染色体の一本のコピー上の細胞学的Ｂバンドに一緒に局在化していた（実線の矢印）のに対して、赤色のマウスＢＡＣプローブのシグナルのみがマウス１９番染色体の他方のコピー上の細胞学的Ｂバンドに局在化していることを示している。これらの結果は、ヒト化ＬＴＶＥＣ内のヒトＬＲＰ５遺伝子の９１ｋｂのフラグメント（図１）が、１９番染色体の一方のコピーのみの上の目的とするマウスＬｒｐ５遺伝子座に正しく挿入されたことを確認するものである（ヘテロ接合型ターゲティング）。これらはまた、（図に示されていない他のコントロールとともに）ヒトＢＡＣプローブがマウスＬｒｐ５遺伝子座にクロスハイブリダイズせず、ヒトＬＲＰ５インサートのみを認識することも示している。
特定のクローンにおける、明らかな非相同末端連結修復によって両方の対立遺伝子に形成された同じＣＲＩＳＰＲ誘導インデル突然変異の存在は、Ｆ１Ｈ４ハイブリッド細胞（５０％の１２９ＳｖＳ６株及び５０％のＣ５７ＢＬ／６Ｎ株からなるもの）において遺伝子変換事象が起きたことを示唆するものである。２種類のｇＲＮＡを使用した場合の向上した両対立遺伝子ターゲティングの基礎をなす機構の知見を得るため、ＬＴＶＥＣ及びＡ＋Ｆ又はＡ＋Ｅ２のｇＲＮＡの組み合わせのいずれかを用いたターゲティングを行った後、ターゲティングによるホモ接合型のヒト化又はホモ接合型のＣＲＩＳＰＲによって誘導された大きな欠失を有する７つのクローンをスクリーニングした。
図５は、２種類のガイドＲＮＡによって媒介される遺伝子変換事象を調べるために設計されたアッセイの例を示している。詳細には、遺伝子変換の可能性を、Ｆ１Ｈ４ハイブリッドＥＳ細胞（５０％の１２９ＳｖＳ６株及び５０％のＣ５７ＢＬ／６Ｎ株からなる）におけるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を分析することにより調べた。遺伝子変換は、１２９ＳｖＳ６（１２９）とＣ５７ＢＬ／６Ｎ（Ｂ６）との間で既知の多型におけるヘテロ接合性の喪失によって示すことができ、このためＰＣＲアッセイはこれら２つの対立遺伝子のタイプを区別するように設計した。構造変異（ＳＶ）の多型について、１２９対立遺伝子とＢ６対立遺伝子との間の相違を検出するように設計した従来のＰＣＲによりアッセイした。下記で用いるＳＶアッセイのうちの１つのみが図５に示されているが、概念はそれぞれで同じである。Ｂ６と１２９マウス株との間の構造変異（ＳＶ）に基づいてプライマーを設計し、これを表１に示す。プライマーの設計条件は約２５ｂｐのＳＶを同定して約３００ｂｐのＰＣＲ産物を生じるように制約した。これらの条件は、あらゆる変化がゲル電気泳動によって見えるように選択した。
各クローンでＰＣＲを行う前にアッセイを確認し、Ｂ６、１２９株からの野生型ＥＳ細胞ＤＮＡ、及びＦ１Ｈ４ ＥＳ細胞株からの野生型ＥＳ細胞ＤＮＡに対して最適化した。Ｂ６又は１２９対立遺伝子に対して特異的な区別可能なＰＣＲバンドを生じ、Ｆ１Ｈ４のＤＮＡを使用した場合にこれらの同じ２つの区別可能なバンドを一貫して生じるプライマーセットをクローンでの試験を行うために選択した。１９番染色体（Ｌｒｐ５遺伝子の位置）に対して、対立遺伝子改変（modification-of-allele）（ＭＯＡ）アッセイ及び従来のＰＣＲによって「ターゲティングによるホモ接合型導入」又は「ホモ接合型の破壊」のいずれかとして遺伝子型が決定されたＬｒｐ５ヒト化クローンで使用するために６つのプライマーセット（それぞれＩＤ１９００４５、１９００６１、１９００６８、１９００３０、１９００３３、１９００１３）を選択した。各ＳＶ ＰＣＲアッセイは、１９番染色体に沿ってＬｒｐ５遺伝子座から染色体のテロメア側端部まで、Ｌｒｐ５遺伝子座から約１３．７〜約５６．２Ｍｂの範囲で間隔を設けた。１９番染色体上の各ＳＶアッセイのＬｒｐ５遺伝子座からのおよその距離（Ｍｂ）は以下のとおりである。すなわち、アッセイ１９００４５では１３．７、アッセイ１９００６１では１９．０、アッセイ１９００６８では３５．０、アッセイ１９００３０では３７．４、アッセイ１９００３３では４８．３、及びアッセイ１９００１３では５６．２。図５にはアッセイ１９００３３のみが示されている（ＳＶ４８．３として示される）が、アッセイ１９００４５、１９００６１、１９００６８、１９００３０、１９００３３、及び１９００１３のプライマーを表１に示す。
ＰＣＲは、これらのクローンからのＤＮＡに対して、並びにＦ１Ｈ４のコントロールＤＮＡ、１２９のコントロールＤＮＡ、及びＢ６のコントロールＤＮＡに対して行った。ＰＣＲ産物は、６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分画し、次いでＧｅｌＲｅｄで染色した。２本のバンドを生じたクローンはＦ１Ｈ４コントロールと一致し、これにより上記の最適化から、上のバンドが１２９対立遺伝子に特異的であり、下のバンドがＢ６対立遺伝子に特異的であることが示された。１本のみのバンドを生じたクローンは、Ｂ６のバンドのみ、又は１２９のバンドのみを示した。クローンＡＷ−Ａ７、ＡＷ−Ｆ１０、ＢＡ−Ｄ５、ＢＡ−Ｆ２、ＢＣ−Ｈ９、及びＢＲ−Ｂ４が、６つのアッセイすべてでＢ６のバンドのみを示したのに対して、ＢＯ−Ａ８は、６つのアッセイすべてで１２９のバンドのみを示した。上記で述べたように、これらのクローンは、ＭＯＡ及び／又はＰＣＲによってターゲティングによるホモ接合型又はホモ接合型の破壊のいずれかとして遺伝子型が決定されており、異なるｇＲＮＡの組み合わせ（Ａ＋Ｆ、Ａ＋Ｅ２、Ｂ２、及びＤ）が関与した。ちょうど１本の対立遺伝子のバンドの存在は、遺伝子変換事象が起きていることを示している（変換が起きなければＦ１Ｈ４コントロールのように両方のバンドが依然として存在しているはずである）。
更に、１２９とＢ６対立遺伝子との間の１ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）について、ＴａｑＭａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイによりアッセイを行った。図５の１９番染色体マップ上の各ＳＮＶアッセイのおよその位置は、以下に示すＬｒｐ５遺伝子座からのそれぞれの距離（単位Ｍｂ）としてアローヘッドにより示されている。Ｌｒｐ５遺伝子座からの距離（単位Ｍｂ）は以下のとおりである。すなわち、Ｌｒｐ５のセントロメア側０．３２（Ｃ２）、Ｌｒｐ５のテロメア側１．２（Ｔ３）、Ｌｒｐ５のテロメア側１１．１（Ｔ６）、Ｌｒｐ５のテロメア側１３．２（Ｔ７）、Ｌｒｐ５のテロメア側１７．５（Ｔ８）、Ｌｒｐ５のテロメア側２５．８（Ｔ９）、Ｌｒｐ５のテロメア側３３．０（Ｔ１０）、Ｌｒｐ５のテロメア側３８．３（Ｔ１１）、Ｌｒｐ５のテロメア側４９．６（Ｔ１３）、及びＬｒｐ５のテロメア側５７．２（Ｔ１４）。１２９に特異的なプローブ及びＢ６に特異的なプローブ、並びにプライマーのペアを表１に示す。
表３は、ＳＶ及びＳＮＶ対立遺伝子の両方についてＬＯＨによってＬｒｐ５標的遺伝子座からテロメア側の方向に１９番染色体の長腕にわたった明らかな遺伝子変換事象を示したＥＳ細胞クローンの７つの例を示している。ＥＳ細胞クローンは、示されるように、Ｌｒｐ５ヒト化ＬＴＶＥＣ（図１）を１種類又は２種類のｇＲＮＡと組み合わせた独立したターゲティング実験から誘導された。ｇＲＮＡ認識部位の位置は、図５のＬｒｐ５遺伝子座の表現（太い左向きの矢印）の上に示されている。遺伝子型決定アッセイは、７つのクローンのうちの６つがホモ接合型にターゲティングされたＬｒｐ５遺伝子のヒト化を有したのに対して、１つはホモ接合型の破壊（ｇＲＮＡ部位間の大きな欠失）を有したことを示した。７つのクローンのうちの６つでは、１２９対立遺伝子が失われ、Ｂ６対立遺伝子のみが残っていた。他のクローンでは、Ｂ６対立遺伝子が失われ、１２９対立遺伝子のみが残っていた。すべてのクローンは、Ｌｒｐ５遺伝子座のセントロメア側でアッセイした対立遺伝子についてヘテロ接合型に保たれた（すなわちすべてのクローンはＣ２ＳＮＶアッセイによりヘテロ接合型Ｂ６／１２９であった）。７つのクローンで観察されたＬＯＨは、ＬＴＶＥＣを１種類の、又は（より高い頻度で）２種類のｇＲＮＡと組み合わせた場合にホモ接合型の遺伝子改変された対立遺伝子が得られる機構の１つは、一方の対立遺伝子上の第１のターゲティングによる遺伝子改変に続いて、ホモロジーに基づく組換え遺伝子変換事象が、ターゲティングによる遺伝子改変を一方の染色体からそのホモログにコピーする、というものであることを示している。
Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子座
別の実験群では、ＬＴＶＥＣは、補体成分５（Ｃ５又はＨｃ（溶血性補体））のマウス遺伝子の７６ｋｂの欠失と同時に相同なヒトＣ５遺伝子の９７ｋｂのフラグメントによる置換を行うように設計した（図６）。標的遺伝子座は、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子の終止コドンまでのエクソン２を含むものとした。ＬＴＶＥＣは、欠失させようとするマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子の７６ｋｂの配列に隣接したマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子座の部分から誘導された３５ｋｂ及び３１ｋｂのゲノムＤＮＡを含むホモロジーアームを隣接させたヒトＣ５遺伝子の９７ｋｂのフラグメントを含むものとした。別々の実験において、このＣ５（Ｈｃ）をヒト化するＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９をコードしたプラスミド、及び欠失の標的とされるマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子の領域内に二本鎖切断を形成するように設計された６種類のｇＲＮＡ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＥ２、表１を参照）のうちの１つをコードした第２のプラスミドと組み合わせた。各ｇＲＮＡは、ヒトＣ５遺伝子の挿入される部分内のどの配列も認識しないように設計した。他の実験では、ＬＴＶＥＣ、及びＣａｓ９をコードしたプラスミドを、欠失の標的とされるマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子の領域内の異なる部位を標的とする２つの異なるｇＲＮＡをコードしたプラスミドと組み合わせた。特定の実験では、Ｃ５（Ｈｃ）をヒト化するＬＴＶＥＣの代わりにＣｈ２５ｈを標的とするコントロールＬＴＶＥＣを使用した。コントロールＬＴＶＥＣは、Ｃｈ２５ｈ（約１ｋｂ）のコード配列全体を欠失させてＣｈ２５ｈ遺伝子座内にプロマイシン及びネオマイシン選択カセットを挿入するように設計されたものであり、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子座における相同組換えについてターゲティングされなかった薬剤耐性クローンを選択するための手段として用いた。
Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化の結果を表４に示すが、Ｌｒｐ５遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化について得られた結果と似た結果となっている。ＬＴＶＥＣ単独によるターゲティング効率は、Ｌｒｐ５よりもＣ５（Ｈｃ）のヒト化においてより高かった（６．１％）が、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡの添加によって、試験した６つのｇＲＮＡのうちの４つでターゲティング効率が向上した。Ｌｒｐ５と同様、Ｃ５（Ｈｃ）ヒト化においてｇＲＮＡを組み合わせる（すなわち２種類のｇＲＮＡの使用）ことによって、主としてヘミ接合型及びホモ接合型のターゲティング事象の頻度が高くなることによって全体のターゲティング効率が更に向上した。本発明者らは、両方の対立遺伝子に大きなＣＲＩＳＰＲ誘導欠失を有するＥＳ細胞クローンも見出した（１．８％〜３．６％の頻度で観察された）。更に、Ｃｈ２５ｈ遺伝子座を標的としたＬＴＶＥＣを２種類のＣ５（Ｈｃ）ｇＲＮＡと組み合わせて使用した場合、２種類のｇＲＮＡによるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の間で破壊されたホモ接合型の対立遺伝子を有するクローンが、１．２％〜６％の頻度で観察され、破壊事象が標的遺伝子座における相同組換え事象とは独立して起きることが示された。Ｌｒｐ５と同様、リテンションアッセイを用いて正しくターゲティングされたクローンを確認した。このスクリーニングを行うための２つのリテンションアッセイは、以下のプライマー及びプローブを使用したＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイとした。すなわち、７１４０ｒｅｔＵフォワードプライマーＣＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＣ（配列番号１２５）；７１４０ｒｅｔＵリバースプライマーＧＡＣＣＡＣＴＧＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧ（配列番号１２６）；７１４０ｒｅｔＵ ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブＣＣＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＴＴＡＣＴＧＴＴＡＧＣＡＴＣＡ（配列番号１２７）；７１４０ｒｅｔＤフォワードプライマーＣＣＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧ（配列番号１２８）；７１４０ｒｅｔＤリバースプライマーＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＴＣＡＧＧＡＴＴＴＧ（配列番号１２９）；７１４０ｒｅｔＤ ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブＴＡＧＴＣＡＣＧＴＴＴＴＧＴＧＡＣＡＣＣＣＣＡＧＡ（配列番号１３０）。
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子のターゲティングによるホモ接合型ヒト化を確認した。Ｃ５（Ｈｃ）ヒト化ＬＴＶＥＣ（図６）をＣａｓ９及び２種類のｇＲＮＡと組み合わせたターゲティング実験から、定量ＰＣＲ及び従来のＰＣＲアッセイによりターゲティングによるホモ接合型として判定されたＥＳ細胞クローンを、商業的な細胞学サービスに送ってＦＩＳＨ及び核型の分析を行ってもらった。マウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子を有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）を赤色蛍光マーカーで標識して内因性遺伝子座を同定するためのプローブとして使用し、ヒトＣ５遺伝子を有するＢＡＣを緑色蛍光マーカーで標識してヒトインサートでターゲティングした染色分体を同定するためのプローブとして使用した。標識した各ＢＡＣプローブを、ターゲティングしたクローンからの中期染色体スプレッドにハイブリダイズさせ、蛍光顕微鏡法によって可視化した。スプレッド上の染色体は、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で染色して可視化し、各クローンの別々の核型をギムザ染色によって決定した。典型的な結果をクローンＯ−Ｅについて図７Ｂに示す。図７Ｂの合成写真は、赤色のマウスＢＡＣプローブのシグナル及び緑色のヒトＢＡＣプローブのシグナルが両方ともＣ５（Ｈｃ）遺伝子の既知の位置であるマウス２番染色体の両方のコピー上のＣ５（Ｈｃ）遺伝子座に一緒に局在化していたことを示している。これらの結果は、ヒト化ＬＴＶＥＣ内のヒトＣ５遺伝子の９７ｋｂのフラグメント（図６）が、クローンＯ−Ｅ３の２番染色体の両方のホモログ上の目的とするマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子座に正しく挿入されたことを確認するものである。これに対して、図７Ａの合成写真は、赤色のマウスＢＡＣプローブのシグナル及び緑色のヒトＢＡＣプローブのシグナルが両方ともマウス２番染色体の一本のコピー上に一緒に局在化していた（実線の矢印）のに対して、赤色のマウスＢＡＣプローブのシグナルのみがマウス２番染色体の他方のコピー上のＣ５（Ｈｃ）遺伝子座に局在化していることを示している。これらの結果は、ヒト化ＬＴＶＥＣ内のヒトＣ５遺伝子の９７ｋｂのフラグメント（図６）が、クローンＱ−Ｅ９の２番染色体の一方のコピーのみの上の目的とするマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子座に正しく挿入されたことを確認するものである（ヘテロ接合型ターゲティング）。
Ｒｏｒ１遺伝子座
別の実験群では、ＬＴＶＥＣは、マウスＲｏｒ１（チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１）遺伝子の１１０ｋｂの欠失と同時に相同なヒトＲＯＲ１遺伝子の１３４ｋｂのフラグメントによる置換を行うように設計した（図８）。ＬＴＶＥＣは、欠失させようとするマウスＲｏｒ１遺伝子の１１０ｋｂの配列に隣接したマウスＲｏｒ１遺伝子座の部分から誘導された４１．８ｋｂ及び９６．４ｋｂのゲノムＤＮＡを含むホモロジーアームを隣接させたヒトＲＯＲ１遺伝子の１３４ｋｂのフラグメントを含むものとした。別々の実験において、このＲｏｒ１をヒト化するＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９をコードしたプラスミド、及び欠失の標的とされるマウスＲｏｒ１遺伝子の領域内に二本鎖切断を形成するように設計された６種類のｇＲＮＡ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ、表１を参照）のうちの１つをコードした第２のプラスミドと組み合わせた。各ｇＲＮＡは、ヒトＲＯＲ１遺伝子の挿入される部分内のどの配列も認識しないように設計した。他の実験では、ＬＴＶＥＣ、及びＣａｓ９をコードしたプラスミドを、欠失の標的とされるＲｏｒ１遺伝子内の異なる部位を標的とする２つの異なるｇＲＮＡをコードしたプラスミドと組み合わせた。
Ｒｏｒ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化の結果を表５に示すが、Ｌｒｐ５及びＣ５（Ｈｃ）遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化について得られた結果と似た結果となっている。ＬＴＶＥＣ単独によるターゲティング効率は０．３％であり、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡの添加によって試験した６つのｇＲＮＡのうちの２つでターゲティング効率がわずかに高くなった。ＡとＦのｇＲＮＡを組み合わせることにより、ヘテロ接合型及びヘミ接合型のターゲティング事象の両方の頻度が高くなることによって全体のＲｏｒ１ターゲティング効率が６．３％に上昇した。本発明者らは、両方の対立遺伝子に大きなＣＲＩＳＰＲ誘導欠失を有するＥＳ細胞クローンも見つけた（１．６％の頻度で観察された）。
Ｔｒｐａ１遺伝子座
別の実験群では、ＬＴＶＥＣは、マウスＴｒｐａ１（一過性受容体電位カチオンチャンネル、サブファミリーＡ、メンバー１）遺伝子の４５．３ｋｂの欠失と同時に相同なヒトＴＲＰＡ１遺伝子の５４．５ｋｂのフラグメントによる置換を行うように設計した（図９）。ＬＴＶＥＣは、欠失させようとするマウスＴｒｐａ１遺伝子の４５．３ｋｂの配列に隣接したマウスＴｒｐａ１遺伝子座の部分から誘導された４１．０ｋｂ及び５８．０ｋｂのゲノムＤＮＡを含むホモロジーアームを隣接させたヒトＴＲＰＡ１遺伝子の５４．５ｋｂのフラグメントを含むものとした。別々の実験において、このＴｒｐａ１をヒト化するＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９をコードしたプラスミド、及び欠失の標的とされるマウスＴｒｐａ１遺伝子の領域内に二本鎖切断を形成するように設計された８種類のｇＲＮＡ（Ａ、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ２、Ｅ、及びＦ、表１を参照）のうちの１つをコードした第２のプラスミドと組み合わせた。各ｇＲＮＡは、ヒトＴＲＰＡ１遺伝子の挿入される部分内のどの配列も認識しないように設計した。他の実験では、ＬＴＶＥＣ、及びＣａｓ９をコードしたプラスミドを、欠失の標的とされるＴｒｐａ１遺伝子内の異なる部位を標的とする２つの異なるｇＲＮＡをコードしたプラスミドと組み合わせた。
Ｔｒｐａ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化の結果を表６に示すが、Ｌｒｐ５及びＣ５（Ｈｃ）遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化について得られた結果と似た結果となっている。ＬＴＶＥＣ単独によるターゲティング効率は０．３％であり、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡの添加によって試験した８つのｇＲＮＡのうちの６つでターゲティング効率が高くなった。ＢとＦのｇＲＮＡを組み合わせることにより、ヘテロ接合型、ヘミ接合型及びホモ接合型のターゲティング事象の頻度が高くなることによって全体のＴｒｐａ１ターゲティング効率が３．４％に上昇した。本発明者らは、両方の対立遺伝子に大きなＣＲＩＳＰＲ誘導欠失を有するＥＳ細胞クローンも見つけた（０．３％の頻度で観察された）。
これらの例が示すように、広く隔てられた部位における２つのガイドＲＮＡの使用は、１つのｇＲＮＡと比較してヘテロ接合型のヒト化の向上性を高めた。更に、２つのガイドＲＮＡの使用は、１つのｇＲＮＡと比較して両対立遺伝子の事象を促進した。１種類のｇＲＮＡによるターゲティングと異なり、２種類のｇＲＮＡによるターゲティングは、両方の対立遺伝子がターゲティングによるヒト化を有する、ホモ接合型にターゲティングされた細胞（ヒト／ヒト）、どちらの対立遺伝子もヒト化ＬＴＶＥＣによってターゲティングされていないが両方が大きな欠失を有する、ホモ接合型に欠失された細胞（Δ／Δ）、及び、一方の対立遺伝子がターゲティングによるヒト化を有し、他方が２種類のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９によって誘導された大きな欠失を有する、ヘミ接合型にターゲティングされた細胞（ヒト／Δ）を生じる。第１に、本発明者らは、両方の標的遺伝子に正確かつ同じである極めて大きなヒト化を有する正しくターゲティングされたクローン（例えばターゲティングによる遺伝子改変についてホモ接合型である細胞）を見出した。Ｌｒｐ５のヒト化を行うために１種類のｇＲＮＡを使用した場合にはホモ接合型にターゲティングされたクローンも観察されたが、これらのクローンは、２種類のｇＲＮＡを用いた場合よりも大幅に低い頻度で生じた（表２を参照）。同様に、Ｃ５（Ｈｃ）のヒト化又はＴｒｐａ１のヒト化を行うために１種類のｇＲＮＡを使用した場合にはホモ接合型のターゲティングは観察されなかったが、ターゲティングベクターとともに２種類のｇＲＮＡを使用した場合にはホモ接合型のターゲティングが観察された（表４及び６を参照）。同様に、本発明者らは、Ｌｒｐ５のターゲティング、Ｃ５（Ｈｃ）のターゲティング、Ｒｏｒ１のターゲティング、及びＴｒｐａ１のターゲティングの遺伝子改変についてヘミ接合型である正しくターゲティングされたクローンを見出した（すなわちこれらのクローンは、一方の対立遺伝子に正確にターゲティングされたヒト化を有し、極めて大きな、場合により遺伝子を破壊する欠失を他方の対立遺伝子に有していた）。このような改変は、Ｌｒｐ５、Ｃ５（Ｈｃ）、Ｒｏｒ１、又はＴｒｐａ１のヒト化を行うために１種類のｇＲＮＡを使用した場合にはまったく生じなかった（表２、４、５、及び６をそれぞれ参照）。
第２に、本発明者らは、ターゲティングされた両方の対立遺伝子上に両方のｇＲＮＡによって導かれたＣａｓ９切断事象により誘導された非常に大きな同じ欠失（＞４５ｋｂ）を有するクローンを見出した（すなわち細胞は標的遺伝子座において、大きな、場合により遺伝子を破壊する欠失についてホモ接合型であった）。これらのタイプの突然変異は、同じ遺伝子を標的とするターゲティングベクターを必要としない。例えば、表４に示されるように、本発明者らは、Ｃａｓ９及び２種類のｇＲＮＡを、これらのｇＲＮＡによってターゲティングされる遺伝子とは無関係の異なる遺伝子を標的としたターゲティングベクターと組み合わせることによってホモ接合型のＣＲＩＳＰＲ誘導欠失を有するＥＳ細胞を得た。したがって、２種類のｇＲＮＡによって導かれるＣａｓ９ヌクレアーゼは、ターゲティングベクターを加えることなく細胞に大きな欠失を誘導することができる。そのような場合には、薬剤耐性遺伝子を発現するベクターによって与えられる一時的又は安定的な薬剤選択によって、ＤＮＡを取り込んだＥＳ細胞を濃縮することにより希なホモ接合型欠失クローンの単離を促進することができる。
実施例２．ｇＲＮＡの組み合わせによって誘導される大きな欠失の分析
ｇＲＮＡの組み合わせによって誘導される大きな欠失の対立遺伝子構造
２種類のｇＲＮＡによって導かれるＣａｓ９切断事象により誘導される大きな欠失を有するクローンに更なる配列分析を行った（表７を参照）。これらの大きな欠失は、ｇＲＮＡを、Ｌｒｐ５ ＬＴＶＥＣ又はほぼ３０Ｍｂ離れたＣｈ２５ｈ遺伝子を標的としたＬＴＶＥＣと組み合わせた場合にＬｒｐ５遺伝子座における大きな欠失がほぼ同じ頻度で得られたことから、同じ遺伝子座におけるＬＴＶＥＣ誘導型の相同組換えとは独立しているようであった。大きな欠失の特性評価を行うため、本発明者らは、４つのヒト化からの３７個のクローン（１５個のヘミ接合型のクローン及び２２個の両対立遺伝子の大きな欠損を有するクローン）で欠失をスパンするようなＰＣＲを行い、個々のＰＣＲ産物のクローンをシークエンシングした。配列では、３８ｋｂ〜１０９ｋｂの範囲の大きな欠失が確認された。これらのＥＳ細胞クローンのうちの２つ（Ｌｒｐ５クローンＡＷ−Ａ８及びＢＰ−Ｄ３）は、予想されるＣａｓ９切断部位の間に完全に修復された正確な欠失（６８．２ｋｂ）を有しており、１つのクローン（ＨｃクローンＰ−Ｂ１２）は、３８．１ｋｂの欠失以外に１塩基対の挿入を有していた。ＥＳ細胞クローンのうち２７個は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）による不正確な修復と符合する、Ｃａｓ９切断部位を超えて延びる欠失を有していた。残りの７つのＥＳ細胞クローンは明らかなＮＨＥＪ誘導欠失と挿入の組み合わせを有しており（例えばＬｒｐ５クローンＢＰ−Ｆ６及びＨｃクローンＯ−Ｅ４）、そのうち４つは２００ｂｐよりも大きい挿入を有しており、その由来するゲノム遺伝子座にマッピングすることができた（データは示さず）。Ｌｒｐ５クローンＢＯ−Ｅ９の２１０ｂｐの挿入は、セントロメア方向にｇＲＮＡ Ｆの標的部位の約２６００ｂｐ外側に位置する同じ配列（＋１９番染色体、３５８９１３８〜３５８９３４７）に対して反転した向きであった。この配列は、Ｌｒｐ５ ＬＴＶＥＣの長い３’ホモロジーアーム内に存在していた。Ｌｒｐ５クローンＢＰ−Ｆ６及びＢＰ−Ｇ７は、Ｌｒｐ５ ｇＲＮＡ Ａ及びＦを、Ｃａｓ９、及びＬｒｐ５からテロメア方向に３０Ｍｂ離れたＣｈ２５ｈ遺伝子を標的としたＬＴＶＥＣと組み合わせた実験から誘導された。クローンＢＰ−Ｆ６は、ベクター主鎖の一部と同じ１０３ｂｐのフラグメントがＣｈ２５ｈ近傍の配列と同じでかつＬＴＶＥＣの長腕にも存在する１６３ｂｐのフラグメント（＋１９番染色体、３４４７８１３６〜３４４７８２９８）と連結されたもので構成されていたことからＣｈ２５ｈ ＬＴＶＥＣの一方の末端から誘導されたものと考えられる２６６ｂｐの挿入を有していた。このフラグメントを、内因性の染色体配列に対して反転した向きで欠失に挿入した。ＨｃクローンＯ−Ｅ４は、ｇＲＮＡ Ａの認識部位から約３．１ｋｂ離れた欠失配列内に見られる同じ配列に対して反転した２５４ｂｐの挿入を有していた。ＨｃクローンＳ−Ｄ５の１３０４ｂｐの挿入は、２つのフラグメント、すなわち、予想されるｇＲＮＡ Ｅ２に誘導されるＣａｓ９切断部位から約１．４ｋｂ離れた欠失配列内に見られる同じ配列と同じ向きの１２３８ｂｐの部分と、ｇＲＮＡ Ｅ２切断部位の２５ｂｐ外側の同じ配列の反転された向きの複製である第２の６６ｂｐの部分とから構成されていた。

１ヒト／＋：ヘテロ接合型の遺伝子型を生じる、２個の天然の対立遺伝子の一方のターゲティングによるヒト化。ヒト／Δ：ヘミ接合型の遺伝子型を生じる、一方の対立遺伝子がターゲティングによるヒト化を有し、他方がＣａｓ９／ｇＲＮＡにより誘導される大きな欠失を有する両対立遺伝子改変。ヒト／ヒト：ホモ接合型の遺伝子型を生じる、両方の対立遺伝子がターゲティングによるヒト化を有する両対立遺伝子改変。Δ／Δ：両方の対立遺伝子が、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡにより誘導される大きな欠失を有する両対立遺伝子改変。
ホモ接合型対立遺伝子における遺伝子変換の証拠
両対立遺伝子の大きな欠失を有する２２個のＥＳ細胞クローンのうちの２１個が１つの固有の配列のみを有しており（表７）、これらがホモ接合型の対立遺伝子であることを示した。ＨｃクローンＳ−Ａ１１では、１２個のＰＣＲクローンのうち、１１個で同じ配列が見られた。異なる配列を有する１個のクローンは、２個の異なる欠失対立遺伝子を示唆している可能性があるが、本発明者らは、Ｈｃヘミ接合型クローンのうちの２つ、Ｎ−Ｄ１１及びＯ−Ｆ１２でも同じ結果を見出した。複数のクローンにおける異なるホモ接合型の欠失対立遺伝子は、これらが、一方の染色体上の欠失が相同染色体上のＣａｓ９切断の相同組換え修復の鋳型として機能する遺伝子変換機構によって生じた可能性を示唆した。本発明者らは、ＶＧＦ１ ＥＳ細胞株の１２９Ｓ６ＳｖＥｖＴａｃ（１２９）とＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）とのＦ１ハイブリッド組成（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１〜９９；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６５２〜６５９）を利用して、これらの細胞株間で１９番染色体上のＬｒｐ５遺伝子座及び２番染色体上のＨｃ遺伝子座（図示せず）の周辺の構造変異体（ＳＶ）及び１ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）（下記で用いる５つのＳＶアッセイ及び１０個のＳＮＶアッセイについては図５を参照）におけるヘテロ接合性の喪失として遺伝子変換についてアッセイを行った（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７：２５７〜２５８）。いずれのヘミ接合性の喪失も、染色体全体が喪失した結果でないことを確認するため、１２９株とＢ６株との間で同じであった部位で染色体コピー数（ＣＣＮ）アッセイを行った。Ｌｒｐ５がヒト化又は欠失された対立遺伝子については、１９番染色体のＬｒｐ５からテロメア方向に１．２Ｍｂ離れた点から長腕の末端までに位置する複数のＳＶ及びＳＮＶについてアッセイを行った（図５）。Ｌｒｐ５の位置がセントロメアに近いために、この遺伝子のセントロメア側にはＳＶは見つからず、ＳＮＶが１個だけ見つかった。Ｈｃについては、２番染色体上のこの遺伝子の両側で複数のＳＶ及びＳＮＶについてアッセイすることができた（図示せず）。Ｌｒｐ５クローンのうちの６つについての結果を図１０Ａ〜Ｅ及び１１Ａ〜Ｃに示す。
図１０Ａ〜Ｅは、その位置がＬｒｐ５から１３．７Ｍｂ離れた点から長腕の テロメア側末端に近い５６．７Ｍｂ離れた点までの範囲にわたる５つのＳＶアッセイについての結果を示している。これら５つのＳＶアッセイは、１２９、Ｂ６、及びＶＧＦ１コントロールにおいて１２９対立遺伝子（大きい方）及びＢ６（小さい方）の２つの異なるサイズの産物を生じた。１９番染色体マップ上のＳＶアッセイのおよその位置が図５に示されている（アッセイＳＶ１３．７、アッセイＳＶ２０．０、アッセイＳＶ３６．９、アッセイＳＶ４８．３、及びアッセイＳＶ５６．７を参照）。アッセイ数は、Ｌｒｐ５のテロメア側のＭｂ数を表す。これらのアッセイにおけるプライマーを表１に示し、結果を図１０Ａ〜Ｅに示す。クローンのうちの２つ、ＢＣ−Ｈ９（Ｌｒｐ５ヒト／ヒト、ｇＲＮＡ Ｂ２）及びＢＲ−Ｂ４（Ｌｒｐ５ヒト／ヒト、ｇＲＮＡ Ｄ）は、Ｂ６のＳＶ対立遺伝子のすべてを維持するヘテロ接合性の喪失を示し、第３のクローンであるＢ０−Ａ８（Ｌｒｐ５ヒト／ヒト、ｇＲＮＡ Ａ＋Ｆ）は、１２９対立遺伝子のすべてを維持していた。他の３つのクローン、ＢＯ−Ｆ１０（Ｌｒｐ５ヒト／ヒト、ｇＲＮＡｓ Ａ＋ Ｆ）、ＢＯ−Ｇ１１（Ｌｒｐ５ヒト／ヒト、ｇＲＮＡ Ａ＋Ｆ）、及びＢＰ−Ｇ７（Ｌｒｐ５Δ／Δ、ｇＲＮＡ Ａ＋Ｆ）はヘテロ接合型を維持した。
更に、１２９とＢ６対立遺伝子との間の１ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）について、ＴａｑＭａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイによりアッセイを行った。図５の１９番染色体マップ上の各ＳＮＶアッセイのおよその位置は、アッセイ数が下に示されたアローヘッドにより示されており、Ｌｒｐ５遺伝子座からのそれぞれの距離（単位Ｍｂ）を以下に示す。Ｌｒｐ５遺伝子座からの距離（単位Ｍｂ）は以下のとおりである。すなわち、Ｌｒｐ５のセントロメア側０．３２（Ｃ２）、Ｌｒｐ５のテロメア側１．２（Ｔ３）、Ｌｒｐ５のテロメア側１１．１（Ｔ６）、Ｌｒｐ５のテロメア側１３．２（Ｔ７）、Ｌｒｐ５のテロメア側１７．５（Ｔ８）、Ｌｒｐ５のテロメア側２５．８（Ｔ９）、Ｌｒｐ５のテロメア側３３．０（Ｔ１０）、Ｌｒｐ５のテロメア側３８．３（Ｔ１１）、Ｌｒｐ５のテロメア側４９．６（Ｔ１３）、及びＬｒｐ５のテロメア側５７．２（Ｔ１４）。１２９に特異的なプローブ及びＢ６に特異的なプローブ、並びにプライマーのペアを表１に示す。ＳＶアッセイによってテロメア側のヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を示した３つのクローン（ＢＣ−Ｈ９、ＢＯ−Ａ８、及びＢＲ−Ｂ４）についての結果を図１１Ａ〜Ｃに示す。ＳＮＶアッセイ（図１１Ａ〜Ｃ、データは示さず）により、Ｌｒｐ５のテロメア側の１９番染色体の長腕にわたった遺伝子変換事象が確認された（ＳＮＶ１．２及びＳＮＶ５７．２、図１１Ｂ及び図１１Ｃをそれぞれ参照）が、ＳＮＶ０．３２アッセイ（図１１Ａを参照）は、すべてのクローンが、Ｌｒｐ５からセントロメア側に３２０ｋｂ離れた対立遺伝子についてヘテロ接合型を維持したことを示した。アッセイを行った２４個のＬｒｐ５ヒト／ヒト又はＬｒｐ５Δ／Δクローンのうち、本発明者らは、Ｌｒｐ５のテロメア側の１９番染色体の長腕全体にわたってヘテロ接合性の喪失の証拠を有する６つを見つけた。クローンのうちの５つ（４つのＬｒｐ５ヒト／ヒト及び１つのＬｒｐ５Δ／Δ）が、ヘテロ接合型からホモ接合型Ｂ６に変換され、６つのクローン（Ｌｒｐ５ヒト／ヒト）がホモ接合型１２９に変換された。ＣＣＮアッセイにより、１９番染色体の２つのコピーの維持が示された。２１個のＨｃホモ接合型クローンにおける同様のヘテロ接合性の喪失アッセイによって、２つ（Ｒ−Ｅ２（Ｈｃヒト／ヒト、ｇＲＮＡ Ａ＋Ｆ）及びＲ−Ｅ８（ＨｃΔ／Δ、ｇＲＮＡ Ａ＋Ｆ））が、Ｈｃ遺伝子のテロメア側ですべてのＳＶ及びＳＮＶについてホモ接合型１２９へのヘテロ接合型の喪失を示す一方で、セントロメア側のすべての対立遺伝子についてはヘテロ接合性を維持したことが示された。ＣＣＮアッセイは、２番染色体には損失がなかったことを示した。
本発明者らによる結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、１００ｋｂにわたった大きな１工程のヒト化における相同組換え型修復を促進することを初めて示したものであり、大規模なゲノム操作の可能性を広げるものである。ＬＴＶＥＣとｇＲＮＡ／Ｃａｓ９を組み合わせることの最も驚くべき、かつ予想外の利点は、ターゲティングによるホモ接合型ヒト化を促進するその能力であった。両対立遺伝子突然変異及びホモ接合型のターゲティング事象は他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９実験でも報告されているが、これらの遺伝子改変及び挿入の多くは本発明者らによるヒト化対立遺伝子と比較して桁がいくつか低いものであった。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の使用前には、本発明者らはＬＴＶＥＣによるホモ接合型のターゲティングを見出したことは一度もなく、別々の遺伝子を標的とした複数のＬＴＶＥＣを組み合わせた場合に複数の遺伝子が同時にターゲティングされることも見出したことはなかった。この経験を踏まえると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって誘導されるホモ接合型のターゲティングは、両方の対立遺伝子を別々に標的とする２つのＬＴＶＥＣよりもむしろ、一方の対立遺伝子に対する最初のターゲティング事象が、１箇所以上のＣａｓ９切断によって促進される他方の対立遺伝子の相同変換の鋳型として機能しうることを示唆していた。２種類のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９によって誘導される大きな両対立遺伝子欠失はホモ接合型でもあることが解明された（表７）ことは、遺伝子変換の機構に更なる支持を与えるものである。
ヘテロ接合性の喪失アッセイ（図５）により、標的遺伝子のテロメア側の染色体の大きなフラグメントを包含する複数の対立遺伝子の大規模な遺伝子変換が、一部のホモ接合型のヒト化及び大きな欠失を引き起こしたことが示された。この種の広範囲の方向性遺伝子変換は、細胞周期のＧ２期における相同染色体の複製された染色分体間の有糸分裂組換えと符合している（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７：２５７〜２５８）（図１２））。この機構は、ホモ接合型の事象のごく一部のみを説明するものであるが、この機構によってｇＲＮＡ／Ｃａｓ９を用いて染色体の大きな部分にわたって複数の対立遺伝子についてヘテロ接合型からホモ接合型への大規模な変換を促進することができる手段を提供することが可能である。しかしながら、ホモ接合型の事象の多くは局所的な遺伝子変換の結果であると考えられ、その機構は更なる研究を要するところである。
広範囲の方向性遺伝子変換の更なる証拠が、Ｆ１Ｈ４ハイブリッドＥＳ細胞（５０％の１２９ＳｖＳ６株及び５０％のＣ５７ＢＬ／６Ｎ株からなる）に、Ｌｒｐ５ ｇＲＮＡ Ａ及びＦをコードしたプラスミド、Ｃａｓ９をコードしたプラスミド、並びにＬｒｐ５からテロメア方向に３０Ｍｂ離れたＣｈ２５ｈ遺伝子を標的としたＬＴＶＥＣを電気穿孔法により導入した後に得られた３つのクローンの分析によって与えられた。最初、３つのクローンは、２種類のｇＲＮＡ（５’末端に５００ｂｐ、３’末端に２ｋｂ離れた）の間の予想される欠失の内側でＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを用いた一次スクリーニング後に野生型として判定されたが、これに続く、１２９とＢ６対立遺伝子との間の１ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）についてアッセイするＴａｑＭａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイによって、驚くべきことにヘテロ接合性の喪失が示された。使用したＳＮＶアッセイは、１箇所のセントロメア側アッセイ（ＳＮＶ０．３２）及び２箇所のテロメア側アッセイ（ＳＮＶ１．２及びＳＮＶ５７．２）であった（図５を参照）。表８に示されるように、セントロメア側ＳＮＢアッセイ（０．３２Ｍｂ）により、３つのクローンすべてにおいてヘテロ接合性の維持が確認された。しかしながら、どちらのテロメア側ＳＮＶアッセイも、ＢＰ−Ｅ７及びＢＰ−Ｈ４が１２９対立遺伝子についてホモ接合型であることを示し、どちらのテロメア側ＳＮＶアッセイもＢＰ−Ｅ６がＢ６対立遺伝子についてホモ接合型であることを示した。３つのクローンはいずれも、１９番染色体の２つのコピーが維持されていることを示し、３つのクローンのいずれもＬＴＶＥＣターゲティングについてトランスジェニックであった（すなわちＣｈ２５ｈ遺伝子座がターゲティングされていた）。これらの結果は、ターゲティングによるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断を用いた強制的ホモ接合性への可能性を開くものである。
いくつかの可能性のある機構によって、マウスＦ１Ｈ４ハイブリッドＥＳ細胞（５０％の１２９ＳｖＳ６株及び５０％のＣ５７ＢＬ／６Ｎ株からなる）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ＬＴＶＥＣヒト化実験で観察された結果を説明することができる（図１６Ａ〜Ｆを参照）。そのような機構は、有糸分裂交叉による（図１６Ａ〜Ｃを参照）、又は切断誘導複製による染色分体の複製による（図１６Ｄ〜Ｅを参照）相互型の染色分体交換によって生じうる。いずれの場合も、１２９染色体又はＢ６染色体がゲノム複製に先立ってＬＴＶＥＣによってターゲティングされるヘテロ接合型の改変が生じうる（図１６Ａ及びＤを参照）。あるいは、１本の１２９染色分体又は１本のＢ６染色分体がゲノム複製後にターゲティングされた後、染色分体間の遺伝子変換が起こってもよい（図１６Ｂ及び１６Ｅを参照）。あるいは、標的ゲノム遺伝子座がＬＴＶＥＣによってターゲティングされず、Ｃａｓ９切断が１２９又はＢ６染色体上に生じてもよい（図１６Ｃ及び１６Ｆを参照）。この後者の可能性は、ＢＰ−Ｅ７、ＢＰ−Ｈ４、及びＢＰ−Ｅ６クローンで見られる結果を説明することができる。可能性としてありうる結果が図１６Ａ〜Ｆに示されている。図１６Ｆでは、Ｃａｓ９が１２９染色分体を切断する場合にＢ６対立遺伝子が維持されるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）が観察されることもありうる。上記に述べた各実験ではヘテロ接合性の喪失事象が観察され、両方の対立遺伝子がターゲティングされる（ヒト／ヒト）か、又は両方の対立遺伝子が野生型対立遺伝子となった（＋／＋）。
実施例３．ターゲティング効率に対するＬＴＶＥＣのホモロジーアームのサイズの影響
ターゲティング効率に対するＬＴＶＥＣのホモロジーアームのサイズの影響を調べるため、補体成分５（Ｃ５又はＨｃ（溶血性補体））のマウス遺伝子の７６ｋｂの欠失と同時に相同なヒトＣ５遺伝子の９７ｋｂのフラグメントによる置換を行うように設計された２種類のＬＴＶＥＣを比較した（図１３）。標的遺伝子座は、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子の終止コドンまでのエクソン２を含むものとした。第１のＬＴＶＥＣは、欠失させようとするマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子の７６ｋｂの配列に隣接したマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子座の部分から誘導された３５ｋｂ及び３１ｋｂのゲノムＤＮＡを含むホモロジーアームを隣接させたヒトＣ５遺伝子の９７ｋｂのフラグメントを含むものとした（図１３でＬＴＶＥＣとして示されたターゲティングベクターを参照）。第２のＬＴＶＥＣは、欠失させようとするマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子の７６ｋｂの配列に隣接したマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子座の部分から誘導された各５ｋｂのゲノムＤＮＡを含むホモロジーアームを隣接させたヒトＣ５遺伝子の９７ｋｂのフラグメントを含むものとした（図１３でｓＴＶＥＣとして示されたターゲティングベクターを参照）。
別々の実験において、このＣ５（Ｈｃ）をヒト化するＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９をコードしたプラスミド、及び欠失の標的とされるマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子の領域内に二本鎖切断を形成するように設計された６種類のｇＲＮＡ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＥ２、表１を参照）のうちの１つ又は２つをコードした第２のプラスミドと組み合わせた。各ｇＲＮＡは、ヒトＣ５遺伝子の挿入される部分内のどの配列も認識しないように設計した。
Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化の結果を表９に示す。第１のＬＴＶＥＣ（３５ｋｂ及び３１ｋｂのホモロジーアーム）単独のターゲティング効率は、第２のＬＴＶＥＣ（５ｋｂ及び５ｋｂのホモロジーアーム）単独のターゲティング効率よりも高かった。しかしながら、ｇＲＮＡとしてＡ及びＥ２と組み合わせた場合にそれぞれのＬＴＶＥＣの全体のターゲティング効率はほぼ同じであり（表９を参照）、５ｋｂのホモロジーアームのサイズ（すなわち合計で１０ｋｂ）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をＬＴＶＥＣによるターゲティングと組み合わせて用いた場合に観察されるターゲティング効率の上昇を促すうえで充分であることが示された。
実施例４．ターゲティング効率に対するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列間の距離をより短くすることの影響
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの認識配列間及び切断部位間の距離をより短くすることがターゲティング効率に与える影響を調べるため、シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（Ｃｍａｈ）のマウス遺伝子の１８．２ｋｂの欠失と同時にｌａｃＺレポーター及びヒグロマイシン耐性選択カセットを含んだインサートによる置換を行うように設計されたＬＴＶＥＣを設計した。このＬＴＶＥＣを、互いに間隔の近い配列を標的とした２種類のｇＲＮＡとともに使用した（図１４）。標的遺伝子座は、Ｃｍａｈ遺伝子の最初の５個のエクソンを含むものとした。ＬＴＶＥＣは、欠失させようとするマウスＣｍａｈ遺伝子の１８．２ｋｂの配列に隣接したマウスＣｍａｈ遺伝子座の部分から誘導された１２０ｋｂ及び５７ｋｂのゲノムＤＮＡを含むホモロジーアームを隣接させた８．８ｋｂのｌａｚＺ−ｈｙｇｒインサートを含むものとした。このＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９及びターゲティングにより欠失させようとするマウスＣｍａｈ遺伝子の領域の５’末端の近くに二本鎖切断を形成するように設計された２種類のｇＲＮＡ（Ａ及びＢ）をコードしたプラスミドと組み合わせた。これら２種類のｇＲＮＡは、欠失させようとする配列の５’末端のＡＴＧに近くの、互いに間隔の近い配列を標的としたものであり、標的切断部位は２７ｂｐ離れていた（図１５を参照）。２種類のｇＲＮＡにより導かれたＣａｓ９による切断によって、平滑末端を有する２７ｂｐの切り取られた配列が生じる。ＬＴＶＥＣ単独をコントロールとして使用した。
薬剤耐性ＥＳ細胞クローンを、ターゲティングによるヒト化について「対立遺伝子の改変アッセイ（modification-of-allele assays）」（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６５２〜６５９；Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５〜３０７）により、欠失内の配列に対して、また、薬剤選択カセット及びヒト遺伝子インサート内の配列に対してスクリーニングした。クローンは、２個の内因性マウス遺伝子配列の一方を失い、ｌａｚＺ−ｈｙｇｒインサートの１個のコピーを獲得した場合に正しくターゲティングされたものと判定した。更に、ＬＴＶＥＣのホモロジーアーム内の配列を認識するリアルタイムＰＣＲアッセイ（リテンションアッセイと呼ばれる）を用いてマウスゲノムにＬＴＶＥＣが正しくターゲティングされていることを確認した。これらのリテンションアッセイのコピー数を決定することによって、コピー数として２を維持する正確にターゲティングされたＥＳクローンを、標的マウス遺伝子座の大きなＣａｓ９誘導欠失がゲノム内の他の場所へのＬＴＶＥＣのランダムな組み込みと一致しているクローン（その場合、リテンションアッセイは３（又はそれよりも大きい）コピー数を有する）から区別することを助ける更なる明確化が与えられた。ｇＲＮＡのペアによって標的マウス遺伝子座にＣａｓ９により媒介される大きな欠失を生じることができることは、これまでに述べられている標準的なＬＯＡ及びＧＯＡアッセイをリテンションアッセイによって強化することで更なる明確化を与え、正確なターゲティングを確認できることを意味している。したがって、リテンションアッセイを設計してＬＯＡ及びＧＯＡアッセイと組み合わせて用いた。
このＣｍａｈターゲティング実験の結果を表１０に示す。ＬＴＶＥＣ単独を用いたコントロールのターゲティング実験では、スクリーニングされたクローンの５．４％（３／５６）がヘテロ接合型（ヘテロ）欠失置換突然変異を有し、クローンの９５％はＣｍａｈ遺伝子座で野生型（ＷＴ）を維持した。ＣＲＩＳＰＲターゲティング実験では、いくつかのＷＴクローン以外に５つの異なる突然変異対立遺伝子のタイプが観察された。ＬＴＶＥＣによりターゲティングした対立遺伝子は、以下の３つのタイプが観察された。すなわち、（１）ヘテロ、（２）ホモ（ホモ接合型欠失置換）、及び（３）ヘミ（一方の対立遺伝子上の欠失置換及び他方の対立遺伝子上のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９誘導突然変異）。これら３つのタイプは、スクリーニングされたすべてのクローンの４３．５％（１０６／２４４）を構成している。ＬＴＶＥＣ単独の場合と比較して、少なくとも一方の対立遺伝子がターゲティングされるＣｍａｈ遺伝子ターゲティングの８倍の向上が認められた。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９インデル突然変異のみを有する、以下の２つのタイプの対立遺伝子も観察された。すなわち、（１）ヘテロ（２個のＷＴ対立遺伝子の一方にインデルが検出されたもの）、及び（２）両対立遺伝子インデル突然変異（ホモ接合型（ホモ）又はヘミ接合型（ヘミ）のいずれかでありうる）。スクリーニングされたクローンのわずかに３．７％がＣｍａｈ遺伝子座に検出可能な突然変異を有さないＷＴに維持されていた。全体では、ｇＲＮＡ ＡとＢの組み合わせを使用した場合にクローンの９４％以上がＣａｓ９誘導突然変異を有していた。
実施例５．１細胞期胚におけるｇＲＮＡのペアを使用した大きな破壊
１細胞期胚においてターゲティングによる大きな欠失を行うため、エクトドメインをコードするマウスＬｒｐ５（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５）の部分の６８ｋｂの欠失と、場合により、２個の６０ヌクレオチドのホモロジーアームを隣接させた４ヌクレオチドのインサートを含む一本鎖ＤＮＡドナー配列（１２４ヌクレオチドの長さ）を使用して４ヌクレオチドの挿入による置換とが同時に行われるように実験を設計した。４ヌクレオチドのインサートは、標的遺伝子座に挿入されて制限酵素部位を形成した。別々の実験において、Ｃａｓ９タンパク質をタンパク質の形態で細胞質注入（ＣＩ）により導入するか、又はＣａｓ９をｍＲＮＡの形態で前核注入（ＰＮＩ）又は電気穿孔法（ＥＰ）により導入した。Ｃａｓ９は、ターゲティングにより欠失させようとするマウスＬｒｐ５遺伝子の領域内に二本鎖切断を形成するように設計された２種類のｇＲＮＡ（Ａ＋Ｆ）と、また、場合により相同組換えドナーと組み合わせた。ｇＲＮＡはＲＮＡの形態で注入した。この後、得られた１対立遺伝子及び両対立遺伝子突然変異の頻度を評価した。
結果を表１１に示すが、２個のガイドＲＮＡの標的部位間のＮＨＥＪ媒介型欠失、又はｓｓＤＮＡドナーによる相同組換え型修復によって支援される欠失が含まれている。ガイドＲＮＡのペア及びＣａｓ９を細胞質注入によりｓｓＤＮＡドナーと同時に導入した場合に両対立遺伝子突然変異が観察された。それぞれの観察された両対立遺伝子突然変異では、一方の染色体がＮＨＥＪ媒介型欠失によって改変され、一方の染色体がＨＤＲ支援型欠失によって改変されていた。これらの結果は、細胞質へのｍＲＮＡの圧電注入によって相同組換え型修復が安定して生じることを示すものであり、ドナーとのホモ接合型組換えの可能性を与えるものである。
実施例６．ターゲティングによる挿入とトランスジェニック挿入とを、また、ターゲティングによる欠失と標的領域を超えて延びる欠失とを区別するためのリテンションアッセイ
標準的な「対立遺伝子の改変（modification-of-allele）」（ＭＯＡ）スクリーニング手法（例えば図１７Ａを参照）は、各試料の４つの生物学的複製物のＣｔ値の平均をすべての試料のＣｔ値の中央値と比較することによってＴａｑＭａｎ（登録商標）コピー数を決定するものである。「対立遺伝子の喪失（loss-of-allele）」では、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを、ターゲティングにより欠失させようとする標的ゲノム遺伝子座の領域の上流（ｍＴＵ）及び下流（ｍＴＤ）領域に対して用いる。「対立遺伝子の獲得（gain-of-allele）」では、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをネオマイシン耐性カセットに対して用いる。しかしながら、これらのプローブは、核酸インサートの任意の領域に対して設計することができる。二倍体のヘテロ接合型にターゲティングされたクローンでは、ｍＴＵ、ｍＴＤ、及びＮｅｏプローブのそれぞれのＴａｑＭａｎ（登録商標）コピー数は１となる。二倍体のホモ接合型にターゲティングされたクローンでは、ｍＴＵ及びｍＴＤのそれぞれのＴａｑＭａｎ（登録商標）コピー数は０となり、ＮｅｏのＴａｑＭａｎ（登録商標）コピー数は２となる。同様に、二倍体のターゲティングされないクローンでは、ｍＴＵ及びｍＴＤのそれぞれのＴａｑＭａｎ（登録商標）コピー数は２となり、ＮｅｏのＴａｑＭａｎ（登録商標）コピー数は０となる。二倍体のヘテロ接合型に破壊されたクローンでは、ｍＴＵ及びｍＴＤのＴａｑＭａｎ（登録商標）コピー数は１となり、Ｎｅｏのコピー数は０となる。二倍体のホモ接合型に破壊されたクローンでは、ｍＴＵ、ｍＴＤ、及びＮｅｏプローブのそれぞれのＴａｑＭａｎ（登録商標）コピー数は０となる。
しかしながら、ｇＲＮＡのペアは標的ゲノム遺伝子座にＣａｓの媒介による大きな欠失を形成することができるため、ＬＴＶＥＣによる正確なターゲティングを確認できるように標準的なＬＯＡ及びＧＯＡアッセイを強化することが有用でありうる。例えば、ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイ単独では、正しくターゲティングされた細胞クローンを、標的ゲノム遺伝子座の大きなＣａｓ誘導型欠失がゲノム内の他の場所へのＬＴＶＥＣのランダムな組み込みと一致しているクローンから区別できない場合がある。ターゲティングされた細胞における選択圧力は選択カセットに基づいていることから、ゲノムの他の場所へのＬＴＶＥＣのランダムなトランスジェニック組み込みは一般的に選択カセットとＬＴＶＥＣの隣接領域を含んでいるが、ＬＴＶＥＣのより遠位の領域は含んでいない。例えば、ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイを用いてターゲティングによるＬＴＶＥＣの組み込みを評価する場合、ＧＯＡアッセイが選択カセットに対するプローブを用いている場合には、標的ゲノム遺伝子座におけるヘテロ接合型欠失とＬＴＶＥＣのランダムなトランスジェニック組み込みとが組み合わされることで、標的ゲノム遺伝子座におけるＬＴＶＥＣのヘテロ接合型にターゲティングされた組み込みと同じ指示値が与えられることになる。ＬＴＶＥＣによる正しいターゲティングを確認するためには、リテンションアッセイを単独で、又はＬＯＡ及び／又はＧＯＡアッセイと組み合わせて用いることができる。
ＴａｑＭａｎ（登録商標）リテンションアッセイを行う場合、５’ホモロジーアームの５’標的配列に対応した上流プローブ（ｒｅｔＵプローブ）及び３’ホモロジーアームの３’標的配列に対応した下流プローブ（ｒｅｔＤプローブ）が用いられる（図１７Ｂを参照。図は、ネオマイシン選択を用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ヒト化についてスクリーニングを行うためにＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイをＧＯＡ及びＬＯＡアッセイと組み合わせた使用を示している）。図１７Ｂは、核酸インサート内の異なるプローブをＧＯＡアッセイで使用する方法も示している（上流ｈＴＵプローブ及び下流ｈＴＤプローブを参照）。異なる種類のターゲティングによる改変及びトランスジェニック挿入についてのＧＯＡ、ＬＯＡ、及びリテンションアッセイの結果を表１２に示す。
ＴａｑＭａｎリテンションアッセイをＬＯＡアッセイと組み合わせて使用することでｇＲＮＡのペアを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援欠失についてスクリーニングを行うこともできる（図１７Ｃを参照）。このようなアッセイでは、ｒｅｔＵ及びｒｅｔＤのコピー数はすべての場合で２に維持される。２よりも小さいコピー数は、ターゲティングにより欠失させようとする領域を超えて延びる大きなＣａｓ９媒介型欠失を示す。異なる種類の破壊に関連した改変についてのＬＯＡ及びリテンションアッセイの結果を表１３に示す。
実施例７．４種類のガイドＲＮＡを使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介型ターゲティング
改変マウス免疫グロブリン重鎖インサートの約９００ｋｂの領域の正確な１工程の欠失と同時にｌｏｘＰ部位を隣接させたＰｇｋ−Ｎｅｏインサート（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子と機能的に連結されたホスホグリセリン酸キナーゼＩプロモーター）による置換を行うため、本発明者らは以下の核酸分子を電気穿孔法によってマウスＥＳ細胞に導入した。すなわち、（１）ＬＴＶＥＣ、（２）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードしたプラスミド、及び（３）４種類のＣＲＩＳＰＲ単鎖ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードした１以上のプラスミド。各実験でＬＴＶＥＣは直鎖化した。改変の標的となる遺伝子は、可変領域遺伝子のセグメント（ＶＨ、ＤＨ、ＴＨ）を相当するヒトの遺伝子セグメントで置換したマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の約９００ｋｂの領域とした。ＬＴＶＥＣは、標的遺伝子座の約９００ｋｂの領域を欠失させ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を誘導してＧ４１８に対する耐性を付与する薬剤耐性カセットを挿入する相同組換え事象を誘導するように設計された１９ｋｂの５’ホモロジーアームと１３ｋｂの３’ホモロジーアームとを隣接させた約２ｋｂの長さを有するＰｇｋ−Ｎｅｏインサートを含むものとした。
使用した４種類のｇＲＮＡのうち、２つが標的遺伝子座の５’末端の近くにＣａｓ９切断を誘導し（図１８の５’ｇＲＮＡ Ｉ及び５’ｇＲＮＡ ＩＩ）、２が標的遺伝子座の３’末端の近くにＣａｓ９切断（図１８の３’ｇＲＮＡ Ｉ及び３’ｇＲＮＡ ＩＩ）を誘導した。５’ｇＲＮＡ Ｉ標的配列と５’ｇＲＮＡ ＩＩ標的配列とは、互いから約１５０ｂｐ離れており、３’ｇＲＮＡ Ｉ標的配列と３’ｇＲＮＡ ＩＩ標的配列とは重なりあっていて３’ｇＲＮＡ ＩＩ標的配列が３’ｇＲＮＡ Ｉ標的配列に対して１ｂｐシフトしていた。
ＬＴＶＥＣを取り込み、そのゲノム内にＬＴＶＥＣを組み込んだＥＳ細胞は、抗生物質を含む増殖培地中、組織培養皿上で増殖してコロニーを形成することができた。薬剤耐性コロニーをピックし、「対立遺伝子の改変方法（modification-of-allele method）」（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：６５２〜６６０；Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５〜３０７；本明細書にそれらの全容にわたって参照により援用する。）によってスクリーニングして正確にターゲティングされたヒト化対立遺伝子を有するクローンを同定した（下記表１４を参照）。更に、ＬＴＶＥＣのホモロジーアーム内の配列を認識するリアルタイムＰＣＲアッセイ（リテンションアッセイと呼ばれる）を用いてマウスゲノムにＬＴＶＥＣが正しくターゲティングされていることを確認した（下記表１４を参照）。
得られたターゲティングされたＥＳ細胞では、約９００ｋｂの領域は両方の対立遺伝子で欠失してＰｇｋ−Ｎｅｏインサートに置換されていた（図１８参照）。この大きな欠失及び置換は、予想以上に高い効率で得られた（両対立遺伝子欠失で約１．２％の効率）。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
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