CN112481297A - 一种制造染色体结构变异的方法 - Google Patents
一种制造染色体结构变异的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112481297A CN112481297A CN202011205066.6A CN202011205066A CN112481297A CN 112481297 A CN112481297 A CN 112481297A CN 202011205066 A CN202011205066 A CN 202011205066A CN 112481297 A CN112481297 A CN 112481297A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- cells
- chromosome
- protein kinase
- kinase inhibitor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 210000001726 chromosome structure Anatomy 0.000 title abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 122
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 92
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 229940122466 DNA-dependent protein kinase inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 48
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 21
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 34
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000005886 chromosome breakage Effects 0.000 claims description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 10
- 230000037361 pathway Effects 0.000 abstract description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 7
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 abstract description 5
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 abstract description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 abstract description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 abstract description 5
- 230000005971 DNA damage repair Effects 0.000 abstract description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 4
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000011559 double-strand break repair via nonhomologous end joining Effects 0.000 abstract 2
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 31
- 102000005768 DNA-Activated Protein Kinase Human genes 0.000 description 17
- 108010006124 DNA-Activated Protein Kinase Proteins 0.000 description 17
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 6
- 101710168331 ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 description 5
- 229940126289 DNA-PK inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 4
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 101150023956 ALK gene Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 230000007035 DNA breakage Effects 0.000 description 3
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 3
- 101150084041 WT1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 108090000740 RNA-binding protein EWS Proteins 0.000 description 2
- 102000004229 RNA-binding protein EWS Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 102100039524 DNA endonuclease RBBP8 Human genes 0.000 description 1
- 108050008316 DNA endonuclease RBBP8 Proteins 0.000 description 1
- 102100033195 DNA ligase 4 Human genes 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 102100027828 DNA repair protein XRCC4 Human genes 0.000 description 1
- 101150112524 EWSR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000927810 Homo sapiens DNA ligase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000649315 Homo sapiens DNA repair protein XRCC4 Proteins 0.000 description 1
- 101100172782 Homo sapiens EWSR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000015087 Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010064218 Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710179684 Poly [ADP-ribose] polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100023712 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920000776 Poly(Adenosine diphosphate-ribose) polymerase Polymers 0.000 description 1
- 108700020467 WT1 Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229940045988 antineoplastic drug protein kinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000005880 cancer cell killing Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000003909 protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
- C12N15/1024—In vivo mutagenesis using high mutation rate "mutator" host strains by inserting genetic material, e.g. encoding an error prone polymerase, disrupting a gene for mismatch repair
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本申请公开一种制造染色体结构变异的方法，包括：形成预设染色体断裂；利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理所述细胞，获得结构变异后的预设染色体。DNA‑PK是DNA损伤修复中非同源重组末端修复(NHEJ)通路中关键的蛋白激酶。本申请在用CRISPR系统造成DNA断裂末端时，通过利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂短暂抑制DNA‑PK的活性，使得产生的DNA末端无法被体内DNA损伤修复NHEJ系统迅速连接，这样增加染色体间DNA断裂末端接触的机会，从而增加染色体结构变异的概率，运用于染色体结构变异疾病模型构建。
Description
技术领域
本申请属于基因编辑技术领域，具体涉及一种制造染色体结构变异的方法。
背景技术
染色体结构变异是染色体变异的一种，是内因和外因共同作用的结果，外因有各种射线、化学药剂、温度的剧变等，内因有生物体内代谢过程的失调、衰老等。主要类型有缺失、重复、倒位、易位。其中，以染色体易位举例说明，染色体易位就是染色体位置片段的改变，包括了单个染色体内的位置片段改变和染色体间的位置片段改变。染色体间的易位又可分为染色体非相互易位(non-reciprocal translocation)和染色体相互易位(reciprocal translocation)。染色体易位的发生需要两个个条件，一是同时存在两条染色体上的DNA断裂；二是体内的DNA损伤修复机制将不同染色体间的DNA末端重新连接起来。
现有在细胞系中实现染色体上的DNA断裂通常利用基因编辑系统，分别靶向染色体，从而造成DNA双链的断裂。断裂的DNA末端在体内修复过程中随机重新连接，DNA末端重新连接时，存在一定的可能将非原本连接染色体片段断裂末端重新连接，从而造成染色体结构变异。然而体内DNA修复系统更容易将同一DNA分子损伤产生的两个DNA末端重新连接，这样的修复并不能产生染色体结构变异，染色体间的错位连接完全依赖于随机连接的概率，因而这种方法制造染色体结构变异效率低下。
发明内容
本申请提供一种制造染色体结构变异的方法，以解决染色体结构变异效率低下的技术问题。
为解决上述技术问题，本申请采用的一个技术方案是：一种制造染色体易位的方法，包括：形成预设染色体断裂；利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理所述细胞，获得结构变异后的预设染色体。
根据本申请一实施方式，所述利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理所述细胞，包括：利用第一预设浓度的DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理所述细胞第一预设时间；停止所述DNA依赖性蛋白激酶抑制剂对所述细胞的作用，继续培养第二预设时间，收集所述细胞。
根据本申请一实施方式，所述利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理所述细胞，包括：利用含DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814的培养基培养所述细胞10h-20h，所述DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814的第一预设浓度为100nM-1μM；更换为不含所述DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814的培养基培养所述细胞24h-32h，收集所述细胞；或者，利用含DNA依赖性蛋白激酶抑制剂KU57788的培养基培养所述细胞10h-20h，所述DNA依赖性蛋白激酶抑制剂KU57788的第一预设浓度为1μM-10μM；更换为不含所述DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814的培养基培养所述细胞24h-32h，收集所述细胞。
根据本申请一实施方式，所述形成预设染色体断裂包括：构建用于所述预设染色体断裂的CRISPR系统；将所述CRISPR系统导入细胞。
根据本申请一实施方式，所述构建用于预设染色体断裂的CRISPR系统，包括：利用预设引物序列合成pCS2-Cas9表达载体；分别合成与所述预设染色体的断裂位点相关的sgRNA表达载体。
根据本申请一实施方式，所述将所述CRISPR系统导入细胞，包括：利用脂质体混合所述pCS2-Cas9表达载体和所述sgRNA表达载体转染所述细胞第三预设时间，以将所述pCS2-Cas9表达载体和所述sgRNA表达载体导入所述细胞。
根据本申请一实施方式，所述构建用于预设染色体断裂的CRISPR系统，还包括：测序验证所述pCS2-Cas9表达载体和所述sgRNA表达载体，利用所述测序验证后的所述pCS2-Cas9表达载体和所述sgRNA表达载体转染所述细胞。
根据本申请一实施方式，所述构建用于预设染色体断裂的CRISPR系统包括：合成目标模板DNA的正向引物和反向引物；利用所述目标模板DNA的正向引物和反向引物，通过聚合酶链式反应扩增所述目标模板DNA；利用RNA转录试剂转录所述目标模板DNA，并纯化获得sgRNA；获取Cas9野生型蛋白表达载体，并转化菌株，诱导所述Cas9野生型蛋白表达载体在所述菌株内表达；收集并破碎所述菌株，收集并纯化Cas9蛋白。
根据本申请一实施方式，所述将所述CRISPR系统导入细胞，包括：将所述sgRNA和所述Cas9蛋白在室温下混合孵育，获得核酸蛋白复合物；将所述核酸蛋白复合物与含有所述细胞的电转液混合，并电转所述细胞，将所述核酸蛋白复合物导入所述细胞。
根据本申请一实施方式，所述方法包括：合成所述结构变异后的预设染色体基因的正向引物和反向引物；利用所述正向引物和所述反向引物进行聚合酶链式反应，以扩增所述结构变异后后的预设染色体基因；通过电泳分析观察所述预设染色体的易位效果；所述正向引物的序列选自如：SEQ ID NO1:5’-CAGTTGCTTGGTTCCCAGTT-3’；和SEQ ID NO2:5’-GGGGAGAGGAAATCTTGCTG-3’；或者如：SEQ ID NO3:5’-GTTGCTCACTTCTCTTGGGGCT-3’；所述反向引物的序列选自如：SEQ ID NO4:5’-AGGAATTGGCCTGCCTTAGT-3’；和SEQ ID NO5:5’-GCAGCTTCAGTGCAATCACA-3’；或者如：SEQ ID NO6:5’-TCAAGAAATGAAAACAGAGCCAGGT-3’。
本申请的有益效果是：DNA-PK是DNA损伤修复中非同源重组末端修复(NHEJ)通路中关键的蛋白激酶。本申请在用CRISPR系统造成DNA断裂末端时，通过利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂短暂抑制DNA-PK的活性，使得产生的DNA末端无法被体内DNA损伤修复NHEJ系统迅速连接，这样增加染色体间DNA断裂末端接触的机会，从而增加染色体结构变异的概率，运用于染色体结构变异疾病模型构建。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，其中：
图1是本申请的制造染色体结构变异的方法一实施例的流程示意图；
图2是本申请的制造染色体结构变异的方法的具体实施例中染色体易位示意图；
图3是本申请的制造染色体结构变异的方法中具体实施例1和具体实施例2的检测易位效果示意图；
图4是本申请的制造染色体结构变异的方法中具体实施例3和具体实施例4的检测易位效果示意图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在细胞系中实现染色体结构变异通常首先利用锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶技术(TALEN)或者CRISPR(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)基因编辑系统，分别靶向染色体，从而造成DNA双链的断裂，断裂的DNA末端在体内修复过程中随机重新链接。DNA末端重新连接时，存在一定的可能将非原本连接染色体片段断裂末端重新连接，从而造成染色体结构变异。
本申请人研究发现DNA损伤可以通过多种途径修复，同源重组修复途径依赖于修复模板，根据修复模板的序列将DNA损伤部位修复；非同源重组DNA末端连接(NHEJ)不依赖于修复模板，可已将断裂的DNA末端重新连接。非同源重组DNA末端连接也分为两种途径，一种是经典途径(canonical NHEJ)，依赖于XRCC4和LIG4以及PARP3；另一途径为，非经典途径(Alternative NHEJ)也被称为微小同源末端连接(MMHJ)，依赖于CtIP和PARP1。以染色体结构变异中的染色体易位举例，染色体易位主要通过经典的非同源重组DNA末端连接途径，当这条途径被阻碍时，MMEJ也会发挥作用产生染色体易位。DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)是DNA损伤修复中非同源重组末端修复(NHEJ)通路中关键的蛋白激酶。抑制DNA-PK通常能增强放疗杀灭癌细胞的效果，因为抑制DNA-PK降低癌细胞基因组修复的能力，从而激活细胞凋亡通路。抑制DNA-PK可以降低NHEJ的频率，从而用于提高同源重组效率。所以本申请通过抑制DNA-PK，实现增加染色体结构变异的概率。
具体地，请参阅图1，图1是本申请的制造染色体结构变异的方法一实施例的流程示意图。
本申请提供了一种制造染色体结构变异的方法，包括如下步骤：
S11：形成预设染色体断裂。
实现预设染色体断裂通常利用锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶技术(TALEN)或者CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)基因编辑系统，分别靶向预设染色体，从而造成DNA双链的断裂。
以CRISPR基因编辑系统举例，形成预设染色体断裂包括：
一：构建用于预设染色体断裂的CRISPR系统。
构建用于预设染色体断裂的CRISPR系统可至少通过如下两种方法实现：
第一种方法A-1：
1、利用预设引物序列合成pCS2-Cas9表达载体，预设引物序列见下表1：
表1引物序列
合成表1中的引物，并用Q5高保真酶PCR扩增，通过无缝克隆技术构建pCS2-Cas9表达载体。
2、分别合成与预设染色体的断裂位点相关的sgRNA表达载体，与预设染色体的易位位点相关的sgRNA靶向位点可通过查阅参考文献获得。
为了确保表达载体构建成功，可通过测序验证pCS2-Cas9表达载体和sgRNA表达载体序列是否与预设相同，将测序验证通过后的pCS2-Cas9表达载体和sgRNA表达载体用于后续实验。
第二种方法A-2：
利用目标模板DNA的正向引物和反向引物，通过聚合酶链式反应扩增目标模板DNA；
利用RNA转录试剂转录目标模板DNA，并纯化获得sgRNA。
获取Cas9野生型蛋白表达载体，并转化菌株，诱导Cas9野生型蛋白表达载体在菌株内表达；
收集并破碎菌株，收集并纯化Cas9蛋白。
通过上述两种方法均可以构建用于预设染色体断裂的CRISPR系统。当然，在其他实施例中，还可以采用其他方法构建CRISPR系统。
二：将CRISPR系统导入细胞。
将CRISPR系统导入细胞也可至少通过B-1和B-2如下两种方法实现：
其中，若采用步骤S101中的第一种方法A-1构建用于预设染色体断裂的CRISPR系统，则需要对应采用第一种方法B-1将CRISPR系统导入细胞：
第一种方法B-1：
利用脂质体混合pCS2-Cas9表达载体和sgRNA表达载体转染细胞第三预设时间，以将pCS2-Cas9表达载体和sgRNA表达载体导入细胞。
若采用步骤S101中的第二种方法A-2构建用于预设染色体断裂的CRISPR系统，则需要采用第二种方法B-2将CRISPR系统导入细胞：
第二种方法B-2：
将sgRNA和Cas9蛋白在室温下混合孵育，获得核酸蛋白复合物(RNP)；
将核酸蛋白复合物与含有细胞的电转液混合，并电转细胞，将核酸蛋白复合物导入细胞。
通过上述两种方法即可将CRISPR系统导入细胞，以实现靶向预设染色体，从而造成DNA双链的断裂。
S12：利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理细胞，获得结构变异后的预设染色体。
利用DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)抑制剂处理细胞，包括：
利用第一预设浓度的DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理细胞第一预设时间；
停止DNA依赖性蛋白激酶抑制剂对细胞的作用，继续培养第二预设时间，收集细胞，细胞内预设染色体发生结构变异。
其中，DNA依赖性蛋白激酶抑制剂可以选择DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814或者DNA依赖性蛋白激酶抑制剂KU57788，在其他实施例中，还可以选用其他DNA依赖性蛋白激酶抑制剂。
需要说明的是，第一预设时间、第二预设时间等可根据DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)抑制剂的种类以及第一预设浓度具体调整。
本申请在用CRISPR系统造成DNA断裂末端时，通过利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂短暂抑制DNA-PK的活性，使得产生的DNA末端无法被体内DNA损伤修复NHEJ系统迅速连接，这样增加染色体间DNA断裂末端接触的机会，从而增加染色体结构变异的概率，运用于染色体结构变异疾病模型构建。
以下通过几个具体实施例进行说明：
实施例1：
实施例1采用A-1结合B-1方法，构建用于预设染色体易位的CRISPR系统，并导入细胞，具体地：
1、构建用于预设染色体易位的CRISPR系统，
利用预设引物序列合成pCS2-Cas9表达载体。预设引物序列见上表1。
合成表1中的引物，并用Q5高保真酶PCR扩增，通过无缝克隆技术构建pCS2-Cas9表达载体。
预设染色体为人基因组5号染色体和人基因组2号染色体，分别合成与预设染色体的易位位点相关的sgRNA表达载体，与预设染色体的易位位点相关的sgRNA靶向位点具体如下：
NPM位于人基因组5号染色体上：
SEQ ID NO11：
NPM 1-sg F：5’-ACCGTGAACCCAGTAGCAGTTCG-3’；
SEQ ID NO12：
NPM1-sg R：5’-AAACCGAACTGCTACTGGGTTCAC-3’。
ALK位于人基因组2号染色体上：
SEQ ID NO13：
ALK-sg F：5’-ACCGTCGGTCCATTGCATAGAGG-3’；
SEQ ID NO14：
ALK-sg R：5’-AAACCCTCTATGCAATGGACCGAC-3’。
将相同量F和R寡核苷酸混合，高温变性，退火，形成短双链DNA，并用T4 DNA连接酶将退火形成的短双链DNA连接到限制性核酸内切酶Bsa I处理的pGL3-U6-sgRNA载体上，形成与预设染色体的易位位点相关的sgRNA表达载体。测序验证pCS2-Cas9表达载体和sgRNA表达载体。
2、将CRISPR系统导入细胞。
转染前一天将5×105个293T细胞接种到24孔板的一个孔中，第二天利用Fugene脂质体混合250ngpCS2-Cas9表达载体、125ng的sgRNA表达载体pGL3-U6-sgRNA-ALK、以及125ng的pGL3-U6-sgRNA-NPM，并利用混合物转染细胞6h，以将pCS2-Cas9表达载体和sgRNA表达载体导入细胞，细胞为人胚胎肾细胞。当然，在其他实施例中转染时间可根据实际转染条件和转染进程实时调整。
3、利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理细胞，获得易位后的预设染色体。
利用第一预设浓度为500nM的DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814处理细胞第一预设时间18h；
停止DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814对细胞的作用，更换为不含DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814的培养基培养细胞第二预设时间30h，收集细胞。
在本实施例中各参数选用如上，在实验操作过程中，第一预设浓度为100nM-1μM，例如100nM、500nM或者1μM等，第一预设浓度不宜过高，会对细胞产生毒性。第一预设时间为10h-20h，例如10h、14h、18h或者20h等。第二预设时间为24h-32h，例如24h、28h、30h或者32h等。
4、检测预设染色体的易位效果。
合成易位后的预设染色体基因的正向引物和反向引物；
利用正向引物和反向引物进行聚合酶链式反应，以扩增易位后的预设染色体基因；
通过电泳分析观察预设染色体的易位效果。
NPM-ALK染色体易位利用两组引物，第一组：NPM-ALK-F1(SEQ ID NO1)：5’-CAGTTGCTTGGTTCCCAGTT-3’和NPM-ALK-R1(SEQ ID NO4):5’-AGGAATTGGCCTGCCTTAGT-3’；第二组：NPM-ALK-F2(SEQ ID NO2)：5’-GGGGAGAGGAAATCTTGCTG-3’和NPM-ALK-R2(SEQ IDNO5)：5’-GCAGCTTCAGTGCAATCACA-3’进行巢式PCR检测。
巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异，检测正确率高。
实施例2：
实施例2中也采用A-1结合B-1方法，构建用于预设染色体易位的CRISPR系统，并导入细胞。
1、构建用于预设染色体易位的CRISPR系统。
实施例2与实施例1中构建用于预设染色体易位的CRISPR系统的方法基本相同，此处不再赘述，其中，不同之处在于：
实施例2中预设染色体为人基因组22号染色体和人基因组11号染色体，与预设染色体的易位位点相关的sgRNA靶向位点具体如下：
EWSR1位于人基因组22号染色体上：
SEQ ID NO15：
EWSR1-sg F：5’-ACCGGGGCATCCAAGATGTTAGC-3’；
SEQ ID NO16：
EWSR1-sg R：5’-AAACGCTAACATCTTGGATGCCCC-3’。
WT1位于人基因组11号染色体上：
SEQ ID NO17：
WT1-sg F：5’-ACCGGGCTGAGCCCTTTATGTGA-3’；
SEQ ID NO18：
WT1-sg R：5’-AAACTCACATAAAGGGCTCAGCCC-3’。
2、将CRISPR系统导入细胞。
转染前一天将5×105个293T细胞接种到24孔板的一个孔中，第二天利用Fugene脂质体混合250ng pCS2-Cas9表达载体、125ng的sgRNA表达载体pGL3-U6-sgRNA-WT1，以及125ng的pGL3-U6-sgRNA-EWSR1，并利用混合物转染细胞，第三预设时间为6h，以将pCS2-Cas9表达载体和sgRNA表达载体导入细胞，细胞为人胚胎肾细胞。当然，第三预设时间可根据实际转染条件和转染进程实时调整。
3、利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理细胞，获得易位后的预设染色体。
利用第一预设浓度为500nM的DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814处理细胞第一预设时间18h；
停止DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814对细胞的作用，更换为不含DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814的培养基培养细胞第二预设时间30h，收集细胞。
在本实施例中各参数选用如上，在实验操作过程中，第一预设浓度为100nM-1μM，例如100nM、500nM或者1μM等，第一预设浓度不宜过高，会对细胞产生毒性。第一预设时间为10h-20h，例如10h、14h、18h或者20h等。第二预设时间为24h-32h，例如24h、28h、30h或者32h等。
4、检测预设染色体的易位效果。
合成易位后的预设染色体基因的正向引物和反向引物；
利用正向引物和反向引物进行聚合酶链式反应，以扩增易位后的预设染色体基因；
通过电泳分析观察预设染色体的易位效果。
EWSR-WT易位利用引物如下：EWSR-WT-F(SEQ ID NO3)：5’-GTTGCTCACTTCTCTTGGGGCT-3’和EWSR-WT-R(SEQ ID NO6)：5’-TCAAGAAATGAAAACAGAGCCAGGT-3’通过PCR检测。
分析：实施例1和实施例2的染色体易位效果参见图2。NPM和ALK基因位点分别位于人基因组5号染色体和2号染色体上，基因名下方或上方的箭头表示该基因转录方向。如图2左上方所示，在CRISPR剪切下在两条染色体分别形成断裂，当染色体易位发生时形成NPM-ALK易位时，可通过右侧所示的黑色箭头表示的引物扩增出目的片段。EWSR1和WT1分别位于人基因组22号染色体和11号染色体上，如图2左下方所示，CRISPR分别靶向这两条染色体剪切，重新连接形成WT1-EWSR1染色体易位。
实施例1和实施例2的具体检测结果参见图3。在人胚胎肾细胞中DNA-PK抑制剂M3814显著增加NPM-ALK和WT1-EWSR1染色体易位。在人胚胎肾293T细胞中导入靶向NPM和ALK基因位点的CRISPR系统，或者导入靶向WT1和EWSR1基因位点的CRISPR系统，然后利用DNA-PK抑制剂M3814处理细胞，收集细胞检测染色体易位效果。WT代表没有导入CRISPR系统的细胞，没有检测到染色体易位情况。在有CRISPR系统导入的细胞中均检测到染色体易位，而在M3814处理细胞中有明显更强的染色体易位信号。Actin beta是内参基因。
由上述结果可知，在引入CRISPR分别切割不同染色体造成染色体双链断裂的基础上，通过DNA-PK抑制剂短暂抑制DNA-PK活性，可以显著提高染色体易位效率。
实施例3：
实施例3采用A-2结合B-2方法，构建用于预设染色体易位的CRISPR系统，并导入细胞，具体地：
1、构建用于预设染色体易位的CRISPR系统。
预设染色体为人基因组5号染色体和人基因组2号染色体。
合成目标模板DNA的正向引物和反向引物，目标模板DNA用于转录出sgRNA，目标模板DNA的正向引物和反向引物如下：
预设易位位点NPM位于人基因组5号染色体上：
SEQ ID NO19：NPM-F：
5’-TAATACGACTCACTATAGTGAACCCAGTAGCAGTTCG-3’；
SEQ ID NO20：NPM-R：
5’-TTCTAGCTCTAAAACCGAACTGCTACTGGGTTCA-3’；
预设易位位点ALK位于人基因组2号染色体上：
SEQ ID NO21：ALK-F：
5’-TAATACGACTCACTATAGTCGGTCCATTGCATAGAG-3’；
SEQ ID NO22：ALK-R：
5’-TTCTAGCTCTAAAACCCTCTATGCAATGGACCGAC-3’。
利用目标模板DNA的正向引物和反向引物，根据试剂盒提供的条件通过聚合酶链式反应扩增目标模板DNA，试剂盒可选择Invitrogen precision gRNA synthesis kit(货号：A29377)。
利用试剂盒提供的RNA转录试剂转录目标模板DNA获得sgRNA，并纯化获得sgRNA。
获取Cas9野生型蛋白表达载体(Cas9野生型蛋白表达载体购买于Addgene(货号62374))，并转化菌株，在20℃、0.5mM IPTG条件下诱导Cas9野生型蛋白表达载体在菌株内表达过夜。
第二天收集细菌细胞，超声破碎菌株，用Ni-NTA亲和纯化cas9蛋白，然后利用离子交换在AKTA仪器上纯化Cas9蛋白。
2、将CRISPR系统导入细胞。
将0.55ugsgRNA和1.6μg Cas9蛋白在室温下混合孵育10分钟，获得核酸蛋白复合物；然后与20μL含有3.0×105个细胞的电转液混合，转移到20μL电转管中，在电转仪上通过380V、30ms的参数电转细胞，从而将核酸蛋白复合物导入细胞，细胞为人胚胎肾细胞。
3、利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理细胞，获得易位后的预设染色体。
在电转细胞后，立刻利用第一预设浓度为500nM的DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814处理细胞第一预设时间16h；
停止DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814对细胞的作用，更换为不含DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814的培养基培养细胞第二预设时间32h，收集细胞。
在本实施例中各参数选用如上，在实验操作过程中，第一预设浓度为100nM-1μM，例如100nM、500nM或者1μM等，第一预设浓度不宜过高，会对细胞产生毒性。第一预设时间为10h-20h，例如10h、14h、18h或者20h等。第二预设时间为24h-32h，例如24h、28h、30h或者32h等。
4、检测预设染色体的易位效果。
合成易位后的预设染色体基因的正向引物和反向引物；
利用正向引物和反向引物进行聚合酶链式反应，以扩增易位后的预设染色体基因；
通过电泳分析观察预设染色体的易位效果。
NPM-ALK染色体易位利用两组引物，第一组：NPM-ALK-F1(SEQ ID NO1)：5’-CAGTTGCTTGGTTCCCAGTT-3’和NPM-ALK-R1(SEQ ID NO4):5’-AGGAATTGGCCTGCCTTAGT-3’；第二组：NPM-ALK-F2(SEQ ID NO2)：5’-GGGGAGAGGAAATCTTGCTG-3’和NPM-ALK-R2(SEQ IDNO5)：5’-GCAGCTTCAGTGCAATCACA-3’进行巢式PCR检测。
巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异，检测正确率高。
实施例4：
实施例4采用A-2结合B-2方法，构建用于预设染色体易位的CRISPR系统，并导入细胞，具体地：
1、构建用于预设染色体易位的CRISPR系统。
预设染色体为人基因组5号染色体和人基因组2号染色体，预设易位位点为NPM和ALK，构建用于预设染色体易位的CRISPR系统的方法与实施例3相同，此处不再赘述。
2、将CRISPR系统导入细胞。
将CRISPR系统导入细胞的方法与实施例3相同，此处不再赘述。
3、利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理细胞，获得易位后的预设染色体。
在电转细胞后，立刻利用第一预设浓度为10μM的DNA依赖性蛋白激酶抑制剂KU57788处理细胞第一预设时间18h；
停止DNA依赖性蛋白激酶抑制剂KU57788对细胞的作用，更换为不含DNA依赖性蛋白激酶抑制剂KU57788的培养基培养细胞第二预设时间30h，收集细胞。
在本实施例中各参数选用如上，在实验操作过程中，第一预设浓度为1μM-10μM，例如1μM、5μM或者10μM等，第一预设浓度不宜过高，会对细胞产生毒性。第一预设时间为10h-20h，例如10h、14h、16h、18h或者20h等。第二预设时间为24h-32h，例如24h、28h、30h或者32h等。
4、检测预设染色体的易位效果。
检测预设染色体的易位效果的方法与实施例3相同，此处不再赘述。
分析：实施例3和实施例4的染色体易位效果参见图2。NPM和ALK基因位点分别位于人基因组5号染色体和2号染色体上，基因名下方或上方的箭头表示该基因转录方向。如图2左上方所示，在CRISPR剪切下在两条染色体分别形成断裂，当染色体易位发生时形成NPM-ALK易位时，可通过右侧所示的黑色箭头表示的引物扩增出目的片段。
实施例3和实施例4的具体检测结果参见图4，CRISPR系统以核酸蛋白复合物RNP的形式导入的人胚胎肾细胞后，用DNA-PK抑制剂M3814(500nM)和KU57788(10uM)处理16小时，CRISPR系统导入48小时后收集细胞检测染色体易位效果。WT代表未经处理的人胚胎肾细胞，未见任何染色体易位。两种DNA-PK抑制剂均能显著的增强CRISPR诱导产生的染色体易位效果。
由上述结果可知，在引入CRISPR分别切割不同染色体造成染色体双链断裂的基础上，通过DNA-PK抑制剂短暂抑制DNA-PK活性，可以显著提高染色体易位效率。
以上所述仅为本申请的实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 一种制造染色体结构变异的方法
<130> PACN2013501
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cagttgcttg gttcccagtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggggagagga aatcttgctg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gttgctcact tctcttgggg ct 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aggaattggc ctgccttagt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcagcttcag tgcaatcaca 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcaagaaatg aaaacagagc caggt 25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
accggtgcca ccatggacta t 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tccactgccg aattcctttt tc 22
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgacctctag aactatagtg agtcg 25
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
catggtggca ccggtcaagt agcttgtatt ctatagtg 38
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
accgtgaacc cagtagcagt tcg 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aaaccgaact gctactgggt tcac 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
accgtcggtc cattgcatag agg 23
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aaaccctcta tgcaatggac cgac 24
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
accggggcat ccaagatgtt agc 23
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aaacgctaac atcttggatg cccc 24
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
accgggctga gccctttatg tga 23
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aaactcacat aaagggctca gccc 24
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
taatacgact cactatagtg aacccagtag cagttcg 37
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ttctagctct aaaaccgaac tgctactggg ttca 34
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
taatacgact cactatagtc ggtccattgc atagag 36
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ttctagctct aaaaccctct atgcaatgga ccgac 35
Claims (10)
1.一种制造染色体结构变异的方法，其特征在于，包括：
形成预设染色体断裂；
利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理所述细胞，获得结构变异后的预设染色体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理所述细胞，包括：
利用第一预设浓度的DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理所述细胞第一预设时间；
停止所述DNA依赖性蛋白激酶抑制剂对所述细胞的作用，继续培养第二预设时间，收集所述细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述利用DNA依赖性蛋白激酶抑制剂处理所述细胞，包括：
利用含DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814的培养基培养所述细胞10h-20h，所述DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814的第一预设浓度为100nM-1μM；
更换为不含所述DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814的培养基培养所述细胞24h-32h，收集所述细胞；或者，
利用含DNA依赖性蛋白激酶抑制剂KU57788的培养基培养所述细胞10h-20h，所述DNA依赖性蛋白激酶抑制剂KU57788的第一预设浓度为1μM-10μM；
更换为不含所述DNA依赖性蛋白激酶抑制剂M3814的培养基培养所述细胞24h-32h，收集所述细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述形成预设染色体断裂包括：
构建用于所述预设染色体断裂的CRISPR系统；
将所述CRISPR系统导入细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述构建用于预设染色体断裂的CRISPR系统，包括：
利用预设引物序列合成pCS2-Cas9表达载体；
分别合成与所述预设染色体的断裂位点相关的sgRNA表达载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述将所述CRISPR系统导入细胞，包括：
利用脂质体混合所述pCS2-Cas9表达载体和所述sgRNA表达载体转染所述细胞第三预设时间，以将所述pCS2-Cas9表达载体和所述sgRNA表达载体导入所述细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述构建用于预设染色体断裂的CRISPR系统，还包括：
测序验证所述pCS2-Cas9表达载体和所述sgRNA表达载体，利用所述测序验证后的所述pCS2-Cas9表达载体和所述sgRNA表达载体转染所述细胞。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述构建用于预设染色体断裂的CRISPR系统包括：
合成目标模板DNA的正向引物和反向引物；
利用所述目标模板DNA的正向引物和反向引物，通过聚合酶链式反应扩增所述目标模板DNA；
利用RNA转录试剂转录所述目标模板DNA，并纯化获得sgRNA；
获取Cas9野生型蛋白表达载体，并转化菌株，诱导所述Cas9野生型蛋白表达载体在所述菌株内表达；
收集并破碎所述菌株，收集并纯化Cas9蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述将所述CRISPR系统导入细胞，包括：
将所述sgRNA和所述Cas9蛋白在室温下混合孵育，获得核酸蛋白复合物；
将所述核酸蛋白复合物与含有所述细胞的电转液混合，并电转所述细胞，将所述核酸蛋白复合物导入所述细胞。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
合成所述结构变异后的预设染色体基因的正向引物和反向引物；
利用所述正向引物和所述反向引物进行聚合酶链式反应，以扩增所述结构变异后后的预设染色体基因；
通过电泳分析观察所述预设染色体的易位效果；
所述正向引物的序列选自如：
SEQ ID NO1:5’-CAGTTGCTTGGTTCCCAGTT-3’；和
SEQ ID NO2:5’-GGGGAGAGGAAATCTTGCTG-3’；
或者如：
SEQ ID NO3:5’-GTTGCTCACTTCTCTTGGGGCT-3’；
所述反向引物的序列选自如：
SEQ ID NO4:5’-AGGAATTGGCCTGCCTTAGT-3’；和
SEQ ID NO5:5’-GCAGCTTCAGTGCAATCACA-3’；
或者如：
SEQ ID NO6:5’-TCAAGAAATGAAAACAGAGCCAGGT-3’。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011205066.6A CN112481297A (zh) | 2020-11-02 | 2020-11-02 | 一种制造染色体结构变异的方法 |
| PCT/CN2020/134673 WO2022088400A1 (zh) | 2020-11-02 | 2020-12-08 | 一种制造染色体结构变异的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011205066.6A CN112481297A (zh) | 2020-11-02 | 2020-11-02 | 一种制造染色体结构变异的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112481297A true CN112481297A (zh) | 2021-03-12 |
Family
ID=74926403
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011205066.6A Pending CN112481297A (zh) | 2020-11-02 | 2020-11-02 | 一种制造染色体结构变异的方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112481297A (zh) |
| WO (1) | WO2022088400A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115948477A (zh) * | 2022-07-20 | 2023-04-11 | 东北农业大学 | 一种提高CRISPR/Cas9的同源重组修复效率的诱导剂、方法以及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106399367A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-15 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 提高crispr介导的同源重组效率的方法 |
| US20190358347A1 (en) * | 2018-05-24 | 2019-11-28 | Crispr Therapeutics Ag | Methods and compositions for efficient gene deletion |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102531016B1 (ko) * | 2014-11-21 | 2023-05-10 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물 |
| CN105543223A (zh) * | 2015-12-25 | 2016-05-04 | 华侨大学 | 一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转录sgRNA的方法 |
-
2020
- 2020-11-02 CN CN202011205066.6A patent/CN112481297A/zh active Pending
- 2020-12-08 WO PCT/CN2020/134673 patent/WO2022088400A1/zh active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106399367A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-15 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 提高crispr介导的同源重组效率的方法 |
| US20190358347A1 (en) * | 2018-05-24 | 2019-11-28 | Crispr Therapeutics Ag | Methods and compositions for efficient gene deletion |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| EVI SOUTOGLOU等: "Positional stability of single double-strand breaks in mammalian cells" * |
| MASAAKI YANAI等: "DNA-PK Inhibition by NU7441 Enhances Chemosensitivity to Topoisomerase Inhibitor in Non-Small Cell Lung Carcinoma Cells by Blocking DNA Damage Repair", 《YONAGO ACTA MED》 * |
| VASSILIS ROUKOS等: "Spatial Dynamics of Chromosome Translocations in Living Cells" * |
| WEN LI等: "The nucleoskeleton protein IFFO1 immobilizes broken DNA and suppresses chromosome translocation during tumorigenesis" * |
| 蔡蓉等: "DNA依赖蛋白激酶的研究新进展", 《医学综述》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115948477A (zh) * | 2022-07-20 | 2023-04-11 | 东北农业大学 | 一种提高CRISPR/Cas9的同源重组修复效率的诱导剂、方法以及应用 |
| CN115948477B (zh) * | 2022-07-20 | 2024-05-28 | 东北农业大学 | 一种提高CRISPR/Cas9的同源重组修复效率的诱导剂、方法以及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022088400A1 (zh) | 2022-05-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2771583C1 (ru) | Ортогональные белки cas9 для рнк-направляемой регуляции и редактирования генов | |
| US20230091847A1 (en) | Compositions and methods for improving homogeneity of dna generated using a crispr/cas9 cleavage system | |
| Zetsche et al. | A survey of genome editing activity for 16 Cas12a orthologs | |
| RU2713328C2 (ru) | Гибридные днк/рнк-полинуклеотиды crispr и способы применения | |
| AU2019204675A1 (en) | Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing | |
| US20230212612A1 (en) | Genome editing system and method | |
| Wei et al. | Closely related type II-C Cas9 orthologs recognize diverse PAMs | |
| CN112481297A (zh) | 一种制造染色体结构变异的方法 | |
| WO2022046662A1 (en) | Systems and methods for transposing cargo nucleotide sequences | |
| CA3240465A1 (en) | C2c9 nuclease-based novel genome editing system and use thereof | |
| EP4041884A1 (en) | A nucleic acid delivery vector comprising a circular single stranded polynucleotide | |
| RU2712492C1 (ru) | Средство разрезания днк на основе cas9 белка из defluviimonas sp. | |
| WO2024078626A1 (zh) | 一种提高CRISPR/Cas9介导的基因组敲入编辑效率的方法 | |
| RU2712497C1 (ru) | Средство разрезания ДНК на основе Cas9 белка из биотехнологически значимой бактерии Clostridium cellulolyticum | |
| OA20197A (en) | DNA-cutting agent. | |
| Segal et al. | Processing of targeted psoralen cross-links in Xenopus oocytes | |
| TW202346580A (zh) | Ｄｎａ酶及其應用 | |
| OA20443A (en) | DNA-cutting agent based on CAS9 protein from the bacterium pasteurella pneumotropica | |
| EA041933B1 (ru) | Средство разрезания днк | |
| OA20196A (en) | DNA-cutting agent. | |
| GARFIN et al. | DNA Site Recognition by the EcoRI Restriction Endonuclease and Modification Methylase | |
| NZ754836B2 (en) | Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing | |
| NZ754837B2 (en) | Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing | |
| NZ716605B2 (en) | Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210312 |