JP2017506636A

JP2017506636A - 免疫細胞と病的細胞の両方に存在する抗原を標的とするように操作された、免疫療法のための細胞

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Publication number: JP2017506636A
Application number: JP2016551704A
Authority: JP
Inventors: フィリップデュシャトー; ローランポワロ
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2014-02-14
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2017-03-09
Anticipated expiration: 2035-02-13
Also published as: JP6673838B2; PT3105317T; BR112016017806B1; HUE041497T2; CN106029875B; CA2937711A1; KR102157924B1; EP3505623B1; BR112016017806A2; RU2714258C2; EP3105317A1; CN106029875A; ES2711498T3; IL246645A0; RU2016136702A3; AU2015216875A1; CA2937711C; US20200407682A1; EP3505623A1; RU2016136702A

Abstract

TALEN、Cas9、またはアルゴノートなどのレアカットエンドヌクレアーゼによって、病的細胞と免疫細胞の両方に共通して見られる抗原マーカー（例えば、CD38、CS1、またはCD70）をコードする遺伝子が前記免疫細胞において不活化されるという事実により、前記抗原マーカーを標的とするキメラ抗原受容体を備えることができる免疫療法用の遺伝子操作された免疫細胞を開発する方法を開示する。

Description

発明の分野
本発明は、病的細胞と免疫細胞の両方に共通して見られる抗原マーカー（例えば、CD38）を標的とするキメラ抗原受容体を備える、免疫療法のための遺伝子操作された、好ましくは、非アロ反応性の免疫細胞を開発する方法に関する。

前記方法は、前記抗原マーカーに対して向けられたCARを発現させる工程、および前記免疫細胞の表面に前記抗原マーカーが存在することに寄与する免疫細胞遺伝子を不活化する工程を含む。この不活化は、典型的には、RNAガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Cas9/クリスパー）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはTALヌクレアーゼをコードするトランスジーンを用いて行われる。操作された免疫細胞、好ましくは、T細胞は、免疫活性を悪性の感染細胞または欠損のある免疫細胞に向けると同時に、これらの相互破壊、自己刺激、または凝集を回避する。本発明は、癌、感染症、自己免疫疾患を処置するための免疫細胞を用いた標準的で手頃な価格の養子免疫療法戦略への道を開く。

発明の背景
エクスビボで生成された自己の抗原特異的免疫細胞の移入を含む養子免疫治療は、ウイルス感染および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫治療のために使用されるT細胞は、例えば、抗原特異的T細胞の増大または遺伝子改変を通したT細胞の向け直しのいずれかによって生成され得る（Park,Rosenberg et al. 2011）。

T細胞における新規特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された（Jena,Dotti et al.2010）。CARは、単一の融合分子として1つ以上のシグナリングドメインと会合したターゲティングモエティからなる合成受容体である。概してCARの結合モエティは、フレキシブルリンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片を含む、単鎖抗体（scFv）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドのドメインに基づく結合モエティも、成功裡に使用されている。第一世代CARのためのシグナリングドメインは、CD3ζ鎖またはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第一世代CARは、T細胞の細胞傷害を成功裡に向け直すことが示されたが、より長期間の増大および抗腫瘍活性をインビボで提供することはできなかった。CARによって改変されたT細胞の生存を増強し、増殖を増加させるため、CD28、OX-40（CD134）、および4-1BB（CD137）を含む共刺激分子に由来するシグナリングドメインが、単独で（第二世代）または組み合わせて（第三世代）付加された。CARは、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性疾患に由来する腫瘍細胞の表面に発現された抗原に対して、T細胞が向け直されることを、成功裡に可能にしている（Jena,Dotti et al.2010）。

養子免疫療法を用いて患者を処置する現行のプロトコールは自己細胞移入に基づいている。このアプローチでは、Tリンパ球が患者から回収され、遺伝子組換えされるか、エクスビボで選択され、必要に応じて細胞数を増幅するためにインビトロで培養され、最後に、患者に注入される。リンパ球注入に加えて、宿主は、T細胞の生着または免疫応答へのT細胞の関与を支援する他のやり方、例えば、（放射線または化学療法を用いた）プレコンディショニング（preconditioning）およびリンパ球増殖因子（例えば、IL-2）の投与で操作してもよい。各患者には、患者自身のリンパ球（すなわち、自家療法）を用いて、個々に作られた処置が与えられる。自家療法は、実際の適用に対して大きな技術的な障害および物流上の障害に直面している。作製するには、高価な専用施設および専門家が必要であり、患者を診断した後、短時間で作製しなければならない。多くの場合、患者の前処置によって免疫機能が低下し、患者のリンパ球は十分に機能せず、非常に少数で存在する可能性がある。これらの障害のために、各患者の自己細胞調製物は事実上新たな製品であり、その結果、効力および安全性の大幅なばらつきが生じる。

理想的には、同種異系治療用細胞を予め製造し、詳細に特徴付け、患者に即時に投与することができる標準化された療法を使用したい。同種異系とは、細胞が、同じ種に属する個体から得られているが、遺伝的に似ていないことを意味する。しかしながら、現在、同種異系細胞の使用には多くの欠点がある。免疫能力のある宿主では、同種異系細胞は素早く拒絶される。これは、宿主対移植片拒絶反応（HvG）と呼ばれるプロセスである。このため、導入された細胞の効力は大きく制限される。免疫能力のない宿主では、同種異系細胞は生着することができるが、その内因性T細胞受容体（TCR）特異性は宿主組織を異物として認識し、その結果、移植片対宿主病（GvHD）が起こる。移植片対宿主病（GvHD）は重大な組織損傷および死亡につながる場合がある。

同種異系T細胞を提供するために、本発明者らは、T細胞を遺伝子操作する方法を以前に開示し、この方法では、登録商標TALEN（商標）（Cellectis, 8, rue de la Croix Jarry, 75013 PARIS）の方がよく知られている特異的TAL-ヌクレアーゼを用いることによって、様々なエフェクター遺伝子、特にT細胞受容体をコードする遺伝子が不活性化される。この方法は、プラットフォームの一部としてRNAトランスフェクションを使用し、初代細胞において高効率であることが分かっており、そのため同種異系T細胞を大量生産することができる（WO2013/176915）。

サイクリックADPリボース加水分解酵素とも知られるCD38（分化クラスター38）は、CD4+、CD8+、Bリンパ球、およびナチュラルキラー細胞を含む、多くの免疫細胞（白血球）、特に、T細胞の表面に見出される糖タンパク質である。CD38はまた細胞接着、シグナル伝達、およびカルシウムシグナル伝達においても機能する。このタンパク質についての構造情報はUniProtKB/Swiss-ProtデータベースにリファレンスP28907で見られる。ヒトでは、CD38タンパク質は、4番染色体に位置するCD38遺伝子によってコードされる。CD38は、NAD+からサイクリックADP-リボース（cADPR）の合成およびADP-リボースへの加水分解を触媒する多機能エクトエンザイムである。これらの反応産物は細胞内Ca2+の調節に必要不可欠だと考えられている。また、CD38機能の喪失が免疫応答不全および代謝障害と関連づけられた（Malavasi F., et al. （2008）.「Evolution and function of the ADP ribosyl cyclase/CD38 gene family in physiology and pathology」. Physiol. Rev. 88（3）： 841-86）。

他方で、CD38タンパク質は、HIV感染、白血病、骨髄腫、固形腫瘍、II型糖尿病、および骨代謝、ならびに他のいくつかの遺伝的に決定される状態のマーカーである。特に、CD38タンパク質は白血病の予後マーカーとして用いられてきた（Ibrahim, S. et al. （2001） CD38 expression as an important prognostic factor in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 98：181-186）。

CD38、ならびにCD70およびCS1などの表1に示した他の多くの腫瘍抗原マーカーを発現する細胞はCARの魅力的な標的だと考えることができるが、このような抗原マーカーが、ほとんどのT細胞の表面にも発現しているという事実があるため、免疫療法を行うために、これらのマーカーを選択することが大きく妨げられてきた。

本発明者らは、本明細書において、例えば、白血病の原因となる悪性CD38陽性B細胞、CD70、およびCS1のような、T細胞の表面にも存在する特定の抗原マーカーを発現する病的細胞が関与する、免疫療法のための戦略を示す。

本発明は、病的細胞を標的とすることが意図されたT細胞を操作する方法を開示し、前記病的細胞は、T細胞表面にも存在する1種類または数種類の抗原マーカーを発現する。このような抗原マーカーの例を表1に示した。このような抗原マーカーの一例はCD38である。他の例はCD70およびCS1である。抗原マーカーとはタンパク質全体またはその免疫反応性断片を意味する。

本発明によれば、T細胞は、このような抗原マーカーをコードする遺伝子、または細胞表面における、このような抗原マーカーの提示に関与する遺伝子の発現を不活化するように操作される。

この不活化は、好ましくは、ゲノム改変によって、さらに具体的には、前記抗原マーカーの産生またはT細胞表面における提示に直接的または間接的に関与する遺伝子座を標的とすることができる特異的レアカットエンドヌクレアーゼをT細胞において発現させることによって行われる。メガヌクレアーゼ、TAL-ヌクレアーゼ、ジンクフィンガー（zing-finger）ヌクレアーゼ（ZFN）、またはCas9/クリスパーもしくはアルゴノート（Argonaute）のようなRNA/DNAガイドエンドヌクレアーゼなどの様々なタイプのレアカットエンドヌクレアーゼを使用することができる。

好ましい態様によれば、T細胞は、前記標的となる抗原マーカーをもつ前記細胞との特異的結合と可能にする少なくとも1種類のキメラ抗原受容体（CAR）を備える。

別の態様によれば、特に、自己認識に関与する遺伝子、例えば、T細胞受容体（TCR）またはHLA複合体の成分をコードする遺伝子を欠失させることによって、T細胞が同種異系になるようにT細胞をさらに操作することができる。

本発明は、詳細な説明、実施例、および図面に示した遺伝子組換えを含む、単離された細胞または細胞株、ならびに前記T細胞を操作するのに有用なタンパク質、ポリペプチド、またはベクターの全てを包含する。

本発明の結果として、操作されたT細胞は、癌、感染症、または自己免疫疾患を処置または予防するための方法において、治療製品として、理想的には、「既製の（off the shelf）」製品として使用することができる。

本発明による好ましい免疫細胞は、治療製品として使用するための、好ましくは、同種異系治療製品として使用するための、以下の表現型：
・ [表1の抗原マーカーを標的とするCAR]⁺[表1の抗原マーカー]^-
になる免疫細胞、
例えば、以下の表現型になる免疫細胞である：
・ [CAR CD38]⁺[CD38]^-、好ましくは、[TCR]ネガティブでもある、
・ [CAR CD70]⁺[CD70]^-、好ましくは、[TCR]ネガティブでもある、
・ [CAR CS1]⁺[CS1]^-、好ましくは、[TCR]ネガティブでもある。

表1：T細胞エレクトロポレーションに使用した様々なcytopulseプログラム
表2：T細胞においてCas9を用いるガイドRNAの適切な標的配列
表3：免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子のリスト
表4：様々なタイプの腫瘍に特有であると同時に、T細胞表面に発現していることが見出された分化クラスター（CD）抗原マーカー
表5〜13：様々なタイプの癌に由来する固形腫瘍細胞では過剰発現していると同時に、T細胞において発現している主な表面抗原マーカー。列挙した抗原マーカーを、実施例1で説明したように特定した。
表5：結腸腫瘍細胞
表6：乳房腫瘍細胞
表7：消化管腫瘍細胞
表8：腎臓腫瘍細胞
表9：肝臓腫瘍細胞
表10：肺腫瘍細胞
表11：卵巣腫瘍細胞
表12：膵臓腫瘍細胞
表13：前立腺腫瘍細胞
表14：様々なタイプの癌（ALL、AML、CML、MDS、CLL、CTRL）に由来する液性腫瘍（liquid tumor）細胞では過剰発現していると同時に、T細胞において発現している主な表面抗原マーカー。列挙した抗原マーカーを、実施例1で説明したように特定した。
表15：試験したCD38標的およびCD38抗原を不活化するためのTALENの配列
表16：他の2つのCD38標的およびこれらを不活化するための対応するTALENの配列
表17：scFv抗CD38抗体ダラツムマブおよびMOR202のVH鎖およびVL鎖の配列、ならびにVH鎖およびVL鎖の特定のCDRの配列
表18：scFvダラツムマブベースの抗CD38 CARの3つの異なる構造および使用した個々の成分のポリペプチド配列
表19：scFv抗CS1抗体のVH鎖およびVL鎖の配列
表20：図11AのV1、V2、およびV3バージョンに基づく抗CS1 CARのポリペプチド配列
表21：CS1標的およびCS1標的を不活化するためのTALENの配列
表22：CD70標的およびCD70標的を不活化するためのTALENの配列
表23：scFv抗CD70 Ab4、Ab8、および1F6抗体のVH鎖およびVL鎖のポリヌクレオチド配列および核酸配列
表24：図11AのV1、V2およびV3バージョンに基づく抗CD70 CARのポリペプチド配列

CD38が破壊され、かつ抗原マーカーCD38をもつ悪性細胞を標的とするキメラ抗原受容体（単鎖CARで表される）を備える本発明による操作されたT細胞の模式図。マルチサブユニットキメラ抗原受容体の模式図。マルチサブユニットCARを備えるT細胞と循環二重特異性抗体を組み合わせた本発明による治療方針の模式図。この特定の局面では、マルチサブユニットCARの細胞外鎖に存在する受容体は、二重特異性抗体によって認識されるエピトープで構成される。二重特異性抗体は、T細胞と病的細胞との結合を容易にするように、一方では前記エピトープに結合し、他方では抗原マーカーに結合することが意図される。マルチサブユニットCARを備えるT細胞と循環モノクローナル抗体を組み合わせた本発明による治療方針の模式図。この特定の局面では、マルチサブユニットCARの細胞外鎖に存在する受容体は、例えば、抗原マーカーに対して向けられたモノクローナル抗体に結合するように意図されたFc受容体で構成される。このモノクローナル抗体は、T細胞が病的細胞に結合する機会を増やす。 2種類の細胞外細胞ドメインを含むマルチサブユニットCARを備えるT細胞と、1種類の循環二重特異性抗体を組み合わせた本発明による治療方針の模式図。この特定の局面では、細胞外細胞ドメインは別々のサブユニットに配置されている。これらのドメインはそれぞれ、二重特異性抗体によって認識されるエピトープと、抗原を標的とする受容体で構成される。前記受容体は第1の抗原マーカーに対して向けられているのに対して、二重特異性抗体は、エピトープおよび第2の抗原マーカーに結合することが意図される。この表示は、表面に第1の抗原マーカーと第2の抗原マーカーを両方とももつ病的細胞を選択的に標的とすることをねらっている。表示は図5と似ているが、キメラ抗原受容体と病的細胞との結合に起因するT細胞活性化の強度を調整するために、刺激ドメインおよび共刺激ドメイン（それぞれ、4-1BBドメインおよびCD3ζタンパク質ドメイン）が交換されている。表示は図5と似ているが、刺激ドメインおよび共刺激ドメイン（それぞれ、4-1BBドメインおよびCD3ζタンパク質ドメイン）が交換されており、キメラ抗原受容体と病的細胞との結合に起因するT細胞活性化の強度を高めるために1つのCD3ζドメインが加えられている。 2種類の細胞外細胞ドメインを含むマルチサブユニットCARを備えるT細胞と、1種類の循環モノクローナル抗体を組み合わせた本発明による治療方針の模式図。この特定の局面では、細胞外細胞ドメインは別々のサブユニットに配置されている。これらのドメインはそれぞれ、抗原マーカーを標的とする抗原結合ドメインと、第2の抗原マーカーに対して向けられたモノクローナル抗体に結合することが意図されたFc受容体で構成される。この表示は、表面に第1の抗原マーカーと第2の抗原マーカーを両方とももつ病的細胞を選択的に標的とすることをねらっている。活性化T細胞によるCD38発現。A.CD3/CD28コーティングビーズ+IL2を用いた活性化後、6日目のT細胞によるCD38発現。B.活性化後、17日間にわたるT細胞によるCD38発現の縦断的分析。 CD38遺伝子に対するノックアウト（KO）。T細胞においてCd38をノックアウトするように設計された3つの異なるTALEN（T2、T4、およびT5）のCD38エキソン1配列上での位置。。 CD38遺伝子に対するノックアウト（KO）。TALEN CD38ex1_T2を用いたトランスフェクション後のT細胞におけるCD38発現。 CD38遺伝子に対するノックアウト（KO）。CD38 KO T細胞を精製するための対照と比べたCD38染色。 CD38 CAR。A.設計した3つのバージョンのCARの表示。B.標的細胞株によるCD38発現レベル。 CAR CS1+細胞およびKO CS1 T細胞を操作するための実験のタイミング、ならびにこれらの後の試験。 CS1遺伝子のKOに使用したTAL反復を有するT01、T02、およびT03の構築物。 CS1（SLAMF7）遺伝子内にある、TAL T01、T02、およびT03の標的場所。T01およびT02はエキソン1を標的とするのに対して（図14A）、T03はエキソン2を標的とする（図14B）。 CS1（SLAMF7）遺伝子内にある、TAL T01、T02、およびT03の標的場所。T01およびT02はエキソン1を標的とするのに対して（図14A）、T03はエキソン2を標的とする（図14B）。図15A：TALEnトランスフェクションあり、またはTALEnトランスフェクションなしと、CAR+形質導入あり、または形質導入なしを組み合わせた細胞の標的細胞生存率のパーセントの測定。CS1（+）細胞がCAR+T細胞と共培養されたときに、CS1（+）細胞の細胞生存率の低下が示された。これに対して、CS1（-）細胞の生存率に及ぼす影響は観察されなかった。図15B：フローサイトメトリーデータを用いて計算した特異的細胞溶解（CS1+）のパーセントの測定。T細胞を、CS1遺伝子を標的とするTALEnでトランスフェクトした後に、CARを形質導入したときに、特異的細胞溶解は2倍高くなることが示された。細胞傷害（cytoxic）活性実験からのFACS分析結果。この結果から、モックトランスフェクトした細胞の形質導入効率は、CS1遺伝子を標的とするTALEnでトランスフェクトした細胞より高いことが分かる（NTD：形質導入されていない）。形質導入後、11日目に様々な試料をCD3/CD28ビーズで再活性化したときのFACS分析結果。この結果は、各試料における形質導入効率およびCD8/CS1発現レベルを示す。再活性化時に、モックトランスフェクトした細胞ではCS1レベルの増加が観察されたのに対して、TALEnでトランスフェクトした集団では、少量の細胞がCS1を発現することができる。図17-1の続きの図である。

発明の詳細な説明
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語は、全て、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の領域の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。

適当な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である全ての方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得る。本明細書において言及された刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照は全て、特に、参照が引用されている隣接する文章、段落、またはセクションにおける主題に関する各参照によって開示される主題について、参照によってその全体が組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、他に特記されない限り、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。

本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を利用するであろう。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology（Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA）；Molecular Cloning： A Laboratory Manual,Third Edition,（Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press）；Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait ed.,1984）；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization（B.D.Harries & S.J.Higgins eds.1984）；Transcription And Translation（B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984）；Culture Of Animal Cells（R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987）；Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press,1986）；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning（1984）；the series,Methods In ENZYMOLOGY（J.Abelson and M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York）、特に、第154巻および第155巻（Wu et al.eds.）および第185巻、"Gene Expression Technology"（D.Goeddel,ed.）；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells（J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory）；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology（Mayer and Walker, eds., Academic Press,London,1987）；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV（D. M. Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986）；ならびにManipulating the Mouse Embryo,（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.,1986）を参照されたい。

一般的な局面において、本発明は、癌、感染症、および自己免疫疾患などの病的細胞の発生と関連する疾患の処置における新たな養子免疫療法戦略のための方法に関する。

本発明の主な目的は、T細胞と共通して見られる特定の抗原マーカーをもつ病的細胞を標的とする可能性である。病的細胞とは、健康の悪化を引き起こすと考えられる、患者に存在する、あらゆるタイプの細胞を意味する。

一般的に、病的細胞は、患者の軽快を得るために低減または排除することが必要な悪性細胞または感染細胞である。

第1の態様において、本発明の方法は、免疫療法のための適切な免疫細胞、好ましくは、T細胞を調製する方法に関し、本方法は、
（a）免疫細胞において、抗原マーカーの発現もしくは提示に関与する遺伝子を遺伝子不活化するかまたは変異させる工程であって、前記抗原マーカーが前記T細胞の表面と病的細胞の表面の両方に存在することが知られている、工程、；
（b）前記免疫細胞の中で、前記病的細胞の表面に存在する前記抗原マーカーに対して向けられたキメラ抗原受容体をコードするトランスジーンを発現させる工程
を含む。

本発明による免疫細胞は、病的細胞と免疫細胞が共通して発現するか、または前記T細胞の表面に存在することが知られている抗原マーカーに対して向けられたキメラ抗原受容体を備える。「存在することが知られている」という表現は、抗原マーカーが、インビボで天然の状態で、特に、血中で増殖した免疫細胞の表面に見出されるが、インビトロで培養されたときには必ず見出されるとは限らないと報告されたことを意味する。いずれにしても、本発明の方法を用いると、免疫細胞の表面に抗原マーカーが存在しなくなり、それによって、キメラ抗原受容体は、操作されたT細胞表面と反応しなくなるという結果になる。この点において、前記方法は、前記マーカー抗原を細胞表面に提示する細胞を排除することによって、結果として得られたT細胞を精製するさらなる工程を含んでもよい。

表4に示したように、本発明は、腫瘍細胞において発現しており、T細胞においても発現していると報告された、かなりの数の抗原マーカー候補に関する。CD38のような、これらの抗原マーカー候補のいくつかが、診断方法、特に、白血病病的細胞に関する診断方法における特異的マーカーとして、しばらく用いられていたが、療法では用いられたことがなかった。実際には、これらのマーカーは、かなり特異的なマーカーだと当技術分野において特定されたが、免疫療法の標的として使用することができなかった。なぜなら、これらのマーカーに対して向けられた抗体は患者のT細胞を破壊するか、または妨害すると予想されたからである。本発明者らは、CS1およびCD70もT細胞表面に存在し、このようなT細胞にあるCS1およびCD70を標的とするCARを発現させると、CS1およびCD70が枯渇することを立証した（実施例2を参照されたい）。

本発明の好ましい態様によれば、上記の方法の工程a）の遺伝子変異または不活化はレアカットエンドヌクレアーゼを用いて行われる。

遺伝子を不活化するとは、関心対象の遺伝子が機能的なタンパク質の形で発現されないことが意図される。特定の態様において、前記方法の遺伝子組換えは、レアカットエンドヌクレアーゼが、標的となるある遺伝子の切断を触媒し、それによって、この標的となる遺伝子を不活化するような、操作しようとする準備された細胞における前記レアカットエンドヌクレアーゼの発現に頼る。エンドヌクレアーゼによって引き起こされる核酸鎖切断は、一般的に、相同組換え末端結合または非相同末端結合（NHEJ）の別々の機構によって修復される。しかしながら、NHEJは、切断部位のDNA配列を変えることが多い不完全な修復プロセスである。機構は、直接的な再連結（Critchlow and Jackson 1998）によって、または、いわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合（Betts, Brenchley et al. 2003；Ma, Kim et al. 2003）を介して2つのDNA末端の残存物を再結合することを伴う。非相同末端結合（NHEJ）を介した修復は小さな挿入または欠失をもたらすことが多く、特異的遺伝子ノックアウトを作り出すことに使用することができる。前記組換えは少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失、または付加でもよい。切断によって誘導される変異誘発事象、すなわち、NHEJ事象に続く変異誘発事象が起こった細胞は、当技術分野において周知の方法によって特定および/または選択することができる。

「レアカットエンドヌクレアーゼ」という用語は、DNA分子またはRNA分子、好ましくは、DNA分子の内部にある、核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる野生型酵素または変種酵素を指す。特に、前記ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ、より好ましくは、高度に特異的であり、長さが10〜45塩基対（bp）、通常、長さが10〜35塩基対、さらに通常、12〜20塩基対の核酸標的部位を認識するレアカットエンドヌクレアーゼでもよい。本発明によるエンドヌクレアーゼは特定のポリヌクレオチド配列を認識し、前記エンドヌクレアーゼの分子構造に応じて、これらの標的配列の内部にある核酸、またはこれらの標的配列に隣接する配列の内部にある核酸を切断する。この特定のポリヌクレオチド配列は「標的配列」とさらに呼ばれる。レアカットエンドヌクレアーゼは、特定のポリヌクレオチド配列において一本鎖切断または二本鎖切断を認識および作製することができる。

特定の態様において、本発明による前記レアカットエンドヌクレアーゼは、Cas9/クリスパー複合体などのRNAガイドエンドヌクレアーゼである。RNAガイドエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼがRNA分子と結合する新世代のゲノム操作ツールを構成している。この系では、RNA分子ヌクレオチド配列によって標的特異性が決定され、エンドヌクレアーゼが活性化される（Gasiunas, Barrangou et al. 2012；Jinek, Chylinski et al. 2012；Cong, Ran et al. 2013；Mali, Yang et al. 2013）。

Cas9
Cas9はCsn1（COG3513）とも呼ばれ、crRNAの生合成および侵入DNAの破壊の両方に関与する大きなタンパク質である。Cas9は、S.サーモフィラス（S.thermophiles）、リステリア・イノクア（Listeria innocua）（Gasiunas, Barrangou et al. 2012；Jinek, Chylinski et al. 2012）、およびS.ピヨゲネス（S. Pyogenes）（Deltcheva, Chylinski et al. 2011）などの様々な細菌種において述べられている。この大きなCas9タンパク質（>1200アミノ酸）は、タンパク質の中央にある2つの推定ヌクレアーゼドメイン、すなわち、HNH（McrA様）ヌクレアーゼドメインと、分割されたRuvC様ヌクレアーゼドメイン（RNアーゼHフォールド（RNase H fold））（Makarova, Grishin et al. 2006）を含有する。

「Cas9」とは、標的核酸配列を処理することができる、操作されたエンドヌクレアーゼまたはCas9ホモログを意味する。特定の態様において、Cas9は、二本鎖切断または一本鎖切断のいずれかに対応し得る核酸標的配列の切断を誘導することができる。Cas9変種は、天然で自然界に存在しないCas9エンドヌクレアーゼ、およびタンパク質工学またはランダム変異誘発によって得られるCas9エンドヌクレアーゼでもよい。本発明によるCas9変種は、例えば変異、すなわちS.ピオゲネスCas9エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列（COG3513）内にある、少なくとも1つの残基からの欠失または少なくとも1つの残基の挿入もしくは置換によって得ることができる。本発明のフレーム（frame）局面において、このようなCas9変種は機能的なままである、すなわち標的核酸配列を処理する能力を保持している。Cas9変種はまた、S.ピオゲネスCas9のアミノ酸配列内にある、少なくとも1つの残基からの欠失または少なくとも1つの残基の挿入もしくは置換を含んでもよい、S.ピオゲネスCas9ホモログでもよい。最終構築物が望ましい活性、特にガイドRNAまたは核酸標的配列に結合する能力をもつのであれば、最終構築物に到達するために、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせが作られてもよい。

RuvC/RNアーゼHモチーフは、RNAおよびDNAに両方に働く幅広い核酸分解機能を示すタンパク質（RNアーゼH、RuvC、DNAトランスポザーゼ、およびレトロウイルスインテグラーゼ、およびアルゴノートタンパク質のPIWIドメイン）を含む。本発明では、Cas9タンパク質のRuvC触媒ドメインは、配列モチーフ：D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-Aによって特徴付けることができ、式中、Xは20種類の天然アミノ酸のいずれか1つであり、[I/L]はイソロイシンまたはロイシンである。他の点で、本発明は、少なくともD-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A配列を含み、式中、Xが20種類の天然アミノ酸のいずれか1つであり、[I/L]がイソロイシンまたはロイシンであるCas9変種に関する。

HNHモチーフは、コリシン、制限酵素、およびホーミングエンドヌクレアーゼを含む二本鎖DNAに働く多くのヌクレアーゼに特有のものである。ドメインHNH（SMART ID： SM00507、SCOP名：HNHファミリー）は、広範囲のDNA結合タンパク質と結合し、様々な結合および切断機能を行う。機能が分かっているタンパク質は、細菌毒性、グループIおよびグループIIイントロンならびにインテインにおけるホーミング機能、組換え、発生により制御されるDNA再編成、ファージパッケージング、ならびに制限エンドヌクレアーゼ活性を含む広範囲の細胞プロセスに関与する（Dalgaard, Klar et al. 1997）。これらのタンパク質は、ウイルス、古細菌、真正細菌、および真核生物において発見された。興味深いことに、LAGLI-DADGおよびGIY-YIGモチーフと同様に、HNHモチーフは、インテイン、グループIおよびグループIIイントロンのような自己増殖性エレメントのエンドヌクレアーゼドメインと結合していることが多い（Dalgaard, Klar et al. 1997）。HNHドメインは、保存されたHis（アミノ末端）およびHis/Asp/Glu（カルボキシ末端）残基がある程度の距離をとって隣接する保存されたAsp/His残基の存在によって特徴付けることができる。これらのタンパク質のかなりの数が中央Asp/His残基の両側にCX2Cモチーフも有する場合がある。構造上、HNHモチーフは、ねじれたβ鎖からなる中央ヘアピンとして現れ、その両側にαヘリックスが隣接する（Kleanthous, Kuhlmann et al. 1999）。Cas9の大きなHNHドメインはSEQ ID NO：5によって示される。本発明では、HNHモチーフは、配列モチーフ： Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sによって特徴付けることができ、式中、Xは20種類の天然アミノ酸のいずれか1つを表す。本発明は、少なくともY-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S配列を含むCas9変種に関し、式中、Xは20種類の天然アミノ酸のいずれか1つを表す。

標的とする多重遺伝子組換えを容易に行うために、およびガイドRNAをCas9細胞に導入することによって誘導性ヌクレアーゼ系を作り出すために、本発明は特に関心が高い可能性がある。本発明の目的のために、本発明者らは、ガイドRNAと一緒に、または別々に標的核酸配列を処理することができる2つの別個のスプリット（split）Cas9 RuvCドメインとHNHドメインに、Cas9タンパク質を分けることができると証明した。

ヌクレアーゼ効率または特異性を改善するために、異なるRNAガイドエンドヌクレアーゼまたはCasホモログに由来するRuvCドメインおよびHNHドメインも集められ得る。異なる種に由来するドメインは2つのタンパク質に分割されてもよく、互いに融合して変種Casタンパク質を形成してもよい。Cas9スプリット系は、誘導性のゲノム標的化方法に特に適しており、細胞内でのCas9過剰発現の潜在的な毒性作用を回避すると考えられる。実際に、第1のスプリットCas9ドメインを細胞に導入してもよく、好ましくは、前記スプリットドメインをコードするトランスジーンで前記細胞を安定に形質転換することによって導入してもよい。次いで、2つのスプリット部分が望ましい時間で細胞内に再び集まって、機能的Cas9タンパク質を再構成するように、Cas9の相補スプリット部分を細胞に導入してもよい。

野生型Cas9と比較してスプリットCas9のサイズを小さくすると、例えば、細胞透過性ペプチドを用いることによって、細胞に向けること（vectorization）および送達することが容易になる。異なるCasタンパク質に由来する再編成ドメイン（re-arranging domain）を用いると、例えば、S.ピオゲネスCas9とわずかに異なるPAMモチーフを標的とすることによって、特異性およびヌクレアーゼ活性を調節することが可能になる。

スプリットCas9系
RuvCドメインおよびHNHドメインの以前の特徴付けに促されて、本発明者らはスプリットCas9タンパク質を作り出すようにCas9タンパク質を操作した。驚いたことに、本発明者らは、これらの2つのスプリットCas9が一緒になって、または別々に、核酸標的を処理できることを示した。この観察から、スプリットCas9タンパク質を用いて新たなCas9系を開発することが可能になる。それぞれのスプリットCas9ドメインは別々に調製および使用することができる。従って、このスプリット系は、さらに短い、および/または不活性のタンパク質の送達を可能にする、RNAガイドエンドヌクレアーゼをT細胞に向けかつ送達するための、いくつかの利点を示し、かつ望ましい時間でT細胞においてゲノム操作を誘導するのに特に適しており、従って、組み込まれたCas9ヌクレアーゼの潜在的な毒性を制限する。

「スプリットCas9」とは、ここでは、RuvCドメインまたはHNHドメインのいずれかを含むCas9タンパク質またはCas9変種の短縮型または切断型を意味し、これらの両ドメインを含むCas9タンパク質またはCas9変種の短縮型または切断型を意味しない。このような「スプリットCas9」は独立してガイドRNAと共に用いられてもよく、例えば、1つのスプリットCas9がRuvCドメインを提供し、別のスプリットCas9がHNHドメインを提供するように補完的に用いられてもよい。RuvCドメインおよび/またはNHNドメインのいずれかを有する異なるスプリットRNAガイドエンドヌクレアーゼが一緒に用いられてもよい。

それぞれのCas9スプリットドメインは同じCas9ホモログに由来してもよく、異なるCas9ホモログに由来してもよい。多くのCas9ホモログがゲノムデータベースにおいて特定されている。

前記Cas9スプリットドメイン（RuvCドメインおよびHNHドメイン）は細胞内の標的核酸配列を処理するように細胞に同時に導入されてもよく、または連続して導入されてもよい。前記Cas9スプリットドメインおよびガイドRNAは、他に記載するように、細胞透過性ペプチドまたは他のトランスフェクション方法を用いることによって細胞に導入されてもよい。

本発明の別の局面において、コンパクト（compact）Cas9と呼ばれる、たった1つのスプリットCas9ドメインが前記細胞に導入される。実際に、驚いたことに、本発明者らは、前記のRuvCモチーフを含むスプリットCas9ドメインが、HNHモチーフを含むスプリットドメインとは独立して標的核酸配列を切断できることを示した。従って、本発明者らは、ガイドRNAが標的核酸配列に結合するのにHNHドメインの存在を必要とせず、RuvCスプリットドメインが結合するのに十分に安定していると証明することができた。好ましい態様において、前記スプリットCas9ドメインは単独で前記標的核酸配列をニッキングすることができる。

それぞれのスプリットドメインは、N末端および/またはC末端において少なくとも1つの活性ドメインと融合されてもよい。前記活性ドメインは、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、転写活性化因子（例えば、VP64、VP16）、転写阻害剤（例えば、KRAB）、DNA末端処理酵素（例えば、Trex2、Tdt）、レポーター分子（例えば、蛍光タンパク質、lacZ、ルシフェラーゼ）からなる群より選択されてもよい。

HNHドメインは標的二本鎖DNAの一方の鎖のニッキングを担い、RuvC様RNアーゼHフォールドドメインは二本鎖核酸標的の（PAMモチーフを含む）他方の鎖のニッキングに関与する（Jinek, Chylinski et al. 2012）。しかしながら、野生型Cas9では、これらの2つのドメインは、PAMのすぐ近くにある、侵入DNAの同じ標的配列（プロトスペーサー）内に平滑末端切断をもたらす（Jinek, Chylinski et al. 2012）。Cas9はニッカーゼでもよく、様々な標的配列内においてニック事象を誘導する。

非限定的な例として、様々な標的配列内でニック事象を誘導するために、Cas9またはスプリットCas9はHNHドメインまたはRuvC様ドメインのいずれかの触媒残基に変異を含んでもよい。非限定的な例として、Cas9タンパク質の触媒残基は、アミノ酸D10、D31、H840、H868、N882、およびN891、またはCasファミリーメンバーのホモログにあるCLUSTALW法を用いてアラインメントされた位置に対応する触媒残基である。これらの残基はいずれも、他の任意のアミノ酸、好ましくはアラニン残基と交換することができる。触媒残基の変異とは、cas9の触媒ドメインの少なくとも1つの不活性化を誘導する、別のアミノ酸による置換またはアミノ酸の欠失もしくは付加を意味する。（参照）。特定の態様において、Cas9またはスプリットCas9は前記変異の1つまたはいくつかを含んでもよい。別の特定の態様において、スプリットCas9は2つのRuvC触媒ドメインおよびHNH触媒ドメインのうち1つしか含まない。本発明では、異なる種に由来するCas9、Cas9ホモログ、操作されたCas9、およびその機能的変種を使用することができる。本発明は、関心対象の遺伝子配列における核酸切断を行うために、任意のRNAガイドエンドヌクレアーゼまたはスプリットRNAガイドエンドヌクレアーゼ変種の使用を考える。

好ましくは、本発明によるCas9変種は、S.ピヨゲネス（S. Pyogenes）（COG3513）と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは90％、さらにより好ましくは95％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

メガヌクレアーゼ
レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名前でも知られるホーミングエンドヌクレアーゼでもよい。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは当業者に周知である（Stoddard 2005）。ホーミングエンドヌクレアーゼは高度に特異的であり、長さが12〜45塩基対（bp）、通常、長さが14〜40bpのDNA標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ、またはGIY-YIGエンドヌクレアーゼに対応してもよい。本発明による好ましいホーミングエンドヌクレアーゼはI-CreI変種でもよい。「変種」エンドヌクレアーゼ、すなわち、自然界で天然には存在せず、遺伝子工学またはランダム変異誘発によって得られるエンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼが認識するDNA配列とは異なるDNA配列に結合することができる（国際出願WO2006/097854を参照されたい）。

前記レアカットエンドヌクレアーゼはモジュラーDNA結合ヌクレアーゼでもよい。モジュラーDNA結合ヌクレアーゼとは、エンドヌクレアーゼの少なくとも1つの触媒ドメインと、少なくとも1つのDNA結合ドメインまたは核酸標的配列を特定するタンパク質を含む任意の融合タンパク質を意味する。DNA結合ドメインは、一般的に、二本鎖ポリヌクレオチドまたは一本鎖ポリヌクレオチドを認識する少なくとも1つのモチーフを含有する、独立して折りたたまれたポリペプチドまたはタンパク質ドメインによって形成されるRNA結合ドメインまたはDNA結合ドメインである。多くのこのようなポリペプチドは、当技術分野において、特定の核酸配列に結合する能力があると述べられている。このような結合ドメインは、非限定的な例として、ヘリックスターンヘリックスドメイン、ロイシンジッパードメイン、翼状（winged）ヘリックスドメイン、ヘリックス-ループ-ヘリックスドメイン、HMGボックスドメイン、イムノグロビン（Immunoglobin）ドメイン、B3ドメイン、または操作されたジンクフィンガードメインを含むことが多い。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ
当初、インビトロでDNAを切断するために開発された「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」（ZFN）は、IIS型制限酵素であるFokIの切断ドメインと、3つ以上のC2H2ジンクフィンガーモチーフを含有するDNA認識ドメインとの融合である。2つのZFNそれぞれが正確な方向および間隔でDNAの特定の位置でヘテロ二量体化すると、DNAの二本鎖切断（DSB）が起こる。このようなキメラエンドヌクレアーゼの使用は、Urnov et al.（Genome editing with engineered zinc finger nucleases（2010） Nature reviews Genetics 11：636-646）により概説されるように当技術分野において広範囲にわたて報告されている。

標準的なZFNは切断ドメインと各ジンクフィンガードメインのC末端とを融合する。2つの切断ドメインが二量体化して、DNAを切断できるようになるために、2つのZFNがそれぞれDNAの反対鎖に結合する。これらのC末端は、ある一定の距離をあけて離れている。ジンクフィンガードメインと切断ドメインとの間にある、最も一般的に用いられるリンカー配列は、それぞれの結合部位の5'末端が5〜7bp隔てられていることを必要とする。

新たなジンクフィンガーアレイを作製する最も簡単な方法は、特異性が分かっている小さなジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。最も一般的なモジュール集合プロセスは、それぞれが3塩基対DNA配列を認識することができる3つの別個のジンクフィンガーを組み合わせて、9塩基対標的部位を認識することができる3フィンガーアレイを作製することを伴う。望ましい配列を標的とすることができるジンクフィンガーアレイを作製するために、非常に多くの選択方法が用いられてきた。初期の選択の取り組みでは、部分的にランダム化されたジンクフィンガーアレイの大きなプールから、ある特定のDNA標的に結合したタンパク質を選択するためにファージディスプレイが利用された。つい最近の取り組みでは、酵母1ハイブリッド系、細菌1ハイブリッド系および2ハイブリッド系、ならびに哺乳動物細胞が利用された。

TAL-ヌクレアーゼ
「TALE-ヌクレアーゼ」または「MBBBD-ヌクレアーゼ」とは、典型的には転写アクチベーター様エフェクタータンパク質（TALE）に由来するDNA結合ドメインまたはモジュラー塩基対塩基結合ドメイン（MBBBD）と、エンドヌクレアーゼ活性を有する触媒ドメインとの融合に起因する操作されたタンパク質を指す。このような触媒ドメインは、通常、例えばI-TevI、ColE7、NucA、およびFok-Iなどの酵素に由来する。TALE-ヌクレアーゼは、選択された触媒ドメインに応じて単量体または二量体の形で形成することができる（WO2012138927）。このような操作されたTALE-ヌクレアーゼは、商品名TALEN（商標）（Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France）で市販されている。

本発明の好ましい態様によれば、DNA結合ドメインは、配列特異性が、非限定的な例としてザントモナス属（Xanthomonas）またはラルストニア属（Ralstonia）の細菌タンパク質AvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1cに由来する一連の33〜35アミノ酸の反復によって動かされる転写アクチベーター様エフェクター（TALE）に由来する。

これらの反復は、本質的に、塩基対との相互作用を特定する2つのアミノ酸位置だけ異なる（Boch, Scholze et al. 2009；Moscou and Bogdanove 2009）。DNA標的内にあるそれぞれの塩基対には1個の反復が接触し、この特異性は反復の2つの変種アミノ酸（いわゆる反復可変ジペプチド（repeat variable dipeptide）、RVD）に起因する。TALE結合ドメインは、標的となる配列の1番目のチミン塩基（T0）の要求を担うN末端移行ドメイン（translocation domain）、および核移行シグナル（NLS）を含有するC末端ドメインをさらに含んでもよい。TALE核酸結合ドメインは、一般的に、複数のTALE反復配列を含む操作されたコアTALEスキャフォールドに対応し、それぞれの反復が、TALE認識部位のそれぞれのヌクレオチド塩基に特異的なRVDを含む。本発明において、前記コアスキャフォールドのそれぞれのTALE反復配列は、30〜42個のアミノ酸、より好ましくは33個または34個のアミノ酸で作られ、位置12および13に配置された2つの重要なアミノ酸（いわゆる反復可変ジペプチド、RVD）が、前記TALE結合部位配列の1つのヌクレオチドの認識を媒介する。特に、33アミノ酸長または34アミノ酸長より長いTALE反復配列では、12および13以外の位置に等価な2つの重要なアミノ酸が配置されてもよい。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するRVDは、Cを認識する場合はHD、Tを認識する場合はNG、Aを認識する場合はNI、GまたはAを認識する場合はNNである。別の態様において、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対する特異性を調整するために、特に、この特異性を増強するために、重要なアミノ酸12および13は他のアミノ酸残基に変異されてもよい。TALE核酸結合ドメインは、通常、8〜30個のTALE反復配列を含む。より好ましくは、本発明の前記コアスキャフォールドは8〜20個のTALE反復配列を含み、より好ましくは15個のTALE反復配列を含む。本発明の前記コアスキャフォールドはまた、前記TALE反復配列セットのC末端に配置された20個のアミノ酸で作られた、さらなる1個の切断型TALE反復配列、すなわち、さらなるC末端半TALE反復配列も含んでもよい。

他の操作されたDNA結合ドメインは、WO2014/018601に記載のように、いわゆる、モジュラー塩基対塩基特異的核酸結合ドメイン（MBBBD）を形成するために代替配列として使用することができる。前記MBBBDは、例えば、内部共生体菌類であるブルクホルデリア・リゾキシニカ（Burkholderia Rhizoxinica）の最近、配列決定されたゲノムに由来する新たに特定されたタンパク質、すなわち、EAV36_BURRH、E5AW43_BURRH、E5AW45_BURRH、およびE5AW46_BURRHタンパク質から操作されてもよい（Lackner, Moebius et al. 2011）。これらの核酸結合ポリペプチドは、塩基特異的な約31〜33個のアミノ酸のモジュールを含む。これらのモジュールはザントモナス属TALE共通反復と40％未満の配列同一性を示し、ザントモナス属TALE共通反復より大きなポリペプチド配列可変性を示す。特定の核酸配列に対して結合特性を有する新たなタンパク質またはスキャフォールドを操作するために、ブルクホルデリア属（Burkholderia）およびザントモナス属に由来する上記タンパク質に由来する異なるドメイン（モジュール、N末端およびC末端）が有用であり、キメラTALE-MBBBDタンパク質を形成するために組み合わされてもよい。

例として、本発明は、特異的TALE-ヌクレアーゼを用いることによって、CD38、CS1、およびCD70などの抗原マーカーをコードする遺伝子の発現を不活化するためにT細胞を操作するための方法を包含する。

TALE-ヌクレアーゼ、例えば、CD38遺伝子についてはSEQ ID NO：2〜3；5〜6；8〜9、CS1遺伝子についてはSEQ ID NO：64〜65；67〜68；70〜71、CD70遺伝子についてはSEQ ID NO：73〜74；76〜77；79〜80に示したTALE-ヌクレアーゼが本発明を実現するのに特に適している。これらの特異的TALE-ヌクレアーゼ、その配列標的、および使用したプロトコールを以下の実施例1〜3にさらに詳細に示した。

送達方法
本発明者らは、エンドヌクレアーゼを発現するポリヌクレオチド、この可能性のあるコエフェクター（例えば、Cas9またはアルゴノートヌクレアーゼに結合するガイドRNAまたはガイドDNA）、ならびにキメラ抗原受容体を細胞内に、または前記細胞の細胞下区画に送達するために当技術分野において公知の、あらゆる手段を考えた。これらの手段には、非限定的な例として、ウイルス形質導入、エレクトロポレーションが含まれ、リポソーム送達手段、ポリマー担体、化学的担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、ナノ粒子、エマルジョン、天然のエンドサイトーシスまたはファゴサイトース（phagocytose）経路も含まれる。

本発明の好ましい態様として、一過的に発現させて、外来DNAの染色体組込みを回避するために、本発明のエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、mRNAの形で、例えば、エレクトロポレーションによってトランスフェクトされる。本発明者らは、表1に示した、T細胞におけるmRNAエレクトロポレーションに最適な様々な条件を確かめた。本発明者は、パルス電場を用いることで、材料を細胞に送達するために生細胞を一過的に透過処理するのを可能にするcytoPulse技術を使用した（米国特許第6,010,613号およびWO2004/083379）。高いトランスフェクション効率と最低限の死のための最高条件に達するために、パルス持続期間、強度、ならびにパルス間の間隔を変更することができる。基本的には、最初の高電場パルスによって孔が形成するのに対して、その後の低電場パルスによってポリヌクレオチドは細胞内に移動する。本発明の一局面において、本発明者は、T細胞におけるmRNAの>95％トランスフェクション効率の達成につながった工程、およびT細胞において様々な種類のタンパク質を一過的に発現させるためのエレクトロポレーションプロトコールの使用について説明する。特に、本発明は、T細胞を形質転換する方法に関し、本方法は、前記T細胞をRNAと接触させる工程と、
（a）電圧範囲が2250〜3000V/センチメートルであり、パルス幅が0.1msであり、工程（a）の電気パルスと（b）の電気パルスとの間のパルス間隔が0.2〜10msである、1回の電気パルス、
（b）電圧範囲が2250〜3000Vであり、パルス幅が100msであり、工程（b）の電気パルスと工程（c）の最初の電気パルスとの間のパルス間隔が100msである、1回の電気パルス、；および
（c）電圧が325Vであり、パルス幅が0.2msであり、4回それぞれの電気パルス間のパルス間隔が2msである、4回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスをT細胞に適用する工程を含む。

特定の態様において、T細胞を形質転換する方法は、前記T細胞をRNAと接触させる工程と、
（a）電圧が2250V、2300V、2350V、2400V、2450V、2500V、2550V、2400V、2450V、2500V、2600V、2700V、2800V、2900V、または3000V/センチメートルであり、パルス幅が0.1msであり、工程（a）の電気パルスと（b）の電気パルスとの間のパルス間隔が0.2ms、0.5ms、1ms、2ms、3ms、4ms、5ms、6ms、7ms、8ms、9ms、または10msである、1回の電気パルス、
（b）電圧範囲が2250V、2250V、2300V、2350V、2400V、2450V、2500V、2550V、2400V、2450V、2500V、2600V、2700V、2800V、2900V、または3000Vであり、パルス幅が100msであり、工程（b）の電気パルスと工程（c）の最初の電気パルスとの間のパルス間隔が100msである、1回の電気パルス、および
（c）電圧が325Vであり、パルス幅が0.2msであり、4回それぞれの電気パルス間のパルス間隔が2msである、4回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスをT細胞に適用する工程とを含む。

前記の値の範囲に含まれる任意の値が本願において開示される。エレクトロポレーション培地は当技術分野において公知の任意の適切な培地でよい。好ましくは、エレクトロポレーション培地の伝導率は0.01〜1.0ミリシーメンスの範囲である。

（表１）PBMC由来T細胞におけるエレクトロポレーションに必要な最低電圧を求めるために使用した様々なcytopulseプログラム

ウイルス形質導入
本発明によれば、キメラ抗原受容体をT細胞に入れて発現させるには、レトロウイルスベクター、より好ましくはレンチウイルスベクターの使用が特に適している。ウイルス形質導入のための方法は当技術分野において周知である（Walther et al.（2000） Viral Vectors for Gene Transfer. Drugs. 60（2）：249-271）。組込みウイルスベクターを用いると、T細胞ゲノムにポリヌクレオチドを安定して組み込み、長期間にわたってキメラ抗原受容体を発現させることが可能になる。

非アロ反応性T細胞
本発明の方法は、遺伝子療法の一環として、例えば、血液循環中で、特異的レアカットエンドヌクレアーゼを発現する遺伝子配列と、CARを発現する他の遺伝子配列を含む、T細胞を標的とするウイルスベクターを用いることによってインビボで行うことができるが、本発明の方法は、さらに一般的には、患者またはドナーから入手可能な培養T細胞に対してエクスビボで実施されることが意図される。エクスビボで操作された、操作されたT細胞は、自家処置の一環として、これが得られた患者に再移植されてもよく、同種異系処置の一環として用いられてもよい。この後者の場合では、細胞が確実に正しく生着するように非アロ反応性になるように細胞をさらに操作することが好ましい。従って、本発明の方法は、ドナーからT細胞を獲得し、例えば、WO2013/176915に記載のように、MHC認識に関与する、および/または免疫抑制薬物の標的であるT細胞遺伝子を不活化する、さらなる工程を含んでもよい。

T細胞受容体（TCR）は、抗原提示に応答したT細胞活性化に関与する細胞表面受容体である。TCRは、一般的に、集合してヘテロ二量体を形成する2本のα鎖およびβ鎖から作られ、CD3伝達サブユニットと結合して、細胞表面に存在するT細胞受容体複合体を形成する。TCRのα鎖およびβ鎖はそれぞれ、免疫グロブリンに似たN末端可変（V）領域および定常（C）領域、疎水性膜貫通ドメイン、ならびに短い細胞質領域からなる。免疫グロブリン分子と同様に、α鎖およびβ鎖の可変領域は、T細胞集団内に抗原特異性の大きな多様性を生み出すV（D）J組換えによって生じる。しかしながら、インタクトな抗原を認識する免疫グロブリンとは対照的に、T細胞は、MHC分子と結合した処理ペプチド断片によって活性化される。これによって、MHC拘束と知られる、T細胞による抗原認識にさらなる要素が導入される。T細胞受容体を介してドナーとレシピエントとのMHC不一致が認識されると、T細胞が増殖し、場合によってはGVHDが発症する。正常なTCR表面発現は、複合体の7つ全ての成分の協調した合成および集合に依存することが示されている（Ashwell and Klusnor 1990）。TCRαまたはTCRβを不活化するとT細胞表面からTCRが無くなり、それによって、アロ抗原の認識が阻止され、従って、GVHDが阻止される。

従って、さらに本発明によれば、T細胞の生着は、TCR成分をコードする少なくとも1つの遺伝子を不活化することによって改善され得る。TCRα遺伝子および/またはTCRβ遺伝子を不活化することによって、TCRは細胞内で機能しなくなる。

Cas9/クリスパー系の使用に関して、本発明者らは、TCRをコードする3つのエキソンの中に適切な標的配列を確かめており、そのため、切断効率を保持しながら、生細胞において毒性を大幅に低減することが可能になった。好ましい標的配列を表2に示した（TCR陰性細胞の比が低い場合は+、比が中間の場合は++、比が高い場合は+++）。

（表２）T細胞においてCas9を用いるガイドRNAの適切な標的配列

MHC抗原はまた、移植反応において主な役割を果たすタンパク質でもある。拒絶反応は、T細胞が、移植された組織の表面にある組織適合抗原と反応することによって媒介され、これらの抗原の大きなグループは主要組織適合抗原（MHC）である。これらのタンパク質は全ての高等脊椎動物の表面に発現しており、ヒト細胞ではHLA抗原（ヒト白血球抗原）と呼ばれる。TCRと同様に、MHCタンパク質はT細胞刺激において重要な役割を果たしている。抗原提示細胞（多くの場合、樹状細胞）は、細胞表面にあるMHCに載せて、外来タンパク質の分解産物であるペプチドを呈する。共刺激シグナルの存在下でT細胞は活性化され、同様に同じペプチド/MHC複合体を呈する標的細胞に作用する。例えば、刺激されたTヘルパー細胞が、抗原をMHCと共に呈するマクロファージを標的とするか、または細胞傷害性T細胞（CTL）が、外来ウイルスペプチドを呈するウイルス感染細胞に作用する。

従って、アロ反応性の低いT細胞を提供するために、本発明の方法は、あるHLA遺伝子を不活化する、または変異させる工程をさらに含んでもよい。

ヒトのクラスI HLA遺伝子クラスターは3つのメジャー遺伝子座B、C、およびAと、いくつかのマイナー遺伝子座を含む。クラスII HLAクラスターも3つのメジャー遺伝子座DP、DQ、およびDRを含み、クラスI遺伝子クラスターおよびクラスII遺伝子クラスターは両方とも、集団内にクラスI遺伝子およびクラスII遺伝子両方のいくつかの異なるアレルがある点で多型である。同様にHLA機能において役割を果たす、いくつかのアクセサリータンパク質もある。Tap1およびTap2サブユニットは、ペプチド抗原をクラスI HLA複合体に装填するのに必要不可欠なTAP輸送体複合体の一部である。LMP2およびLMP7プロテオソームサブユニットは、HLAに載せて呈するために抗原からペプチドへのタンパク質分解において役割を果たしている。LMP7の低減は、おそらく、安定化の欠如により、細胞表面にあるMHCクラスIの量を低減することが示されている（Fehling et al. （1999） Science 265：1234-1237）。TAPおよびLMPの他に、その産物がTAP複合体とHLAクラスI鎖との架橋を形成し、ペプチドの装填を増強するタパシン遺伝子がある。タパシンが低減すると、MHCクラスI集合が損なわれ、MHCクラスIの細胞表面発現が低減し、免疫応答が損なわれた細胞が生じる（Grandea et al. （2000） Immunity 13：213-222 and Garbi et al. （2000） Nat. Immunol. 1：234-238）。上記の遺伝子はいずれも、開示されたように、例えば、WO2012/012667に開示されたように本発明の一部として不活化することができる。

薬物耐性T細胞を操作する方法
癌療法および同種異系T細胞の選択的生着を改善するために、操作されたT細胞に薬物耐性を付与して、操作されたT細胞を化学療法または免疫抑制剤の毒性副作用から保護することができる。実際に、本発明者らは、ほとんどの患者が、T細胞免疫療法を受ける前に治療の標準として化学療法および免疫枯渇剤（immune depleting agent）による処置を受けたことを観察した。本発明者らは、処置前に細胞をエクスビボで増殖させるために培養培地中に化学療法薬物を添加すること、または化学療法もしくは免疫抑制処置を受けている患者においてインビボで操作されたT細胞の選択的増殖物を得ることのいずれかによって、これらの処理を利用して操作されたT細胞の選択を助けることができることも発見した。

薬物感受性細胞と比べて、薬物耐性遺伝子を発現するT細胞が生き残り、増殖するので、T細胞の薬物耐性はインビボまたはエクスビボでT細胞の濃縮も可能にする。特に、本発明は、
（a）T細胞を準備する工程、
（b）少なくとも1種類の薬物を選択する行程、
（c）薬物耐性を前記T細胞に付与するようにT細胞を改変する工程、
（d）前記操作されたT細胞を前記薬物の存在下で増殖させる工程
を含む、免疫療法のために同種異系かつ薬物耐性のT細胞を操作する方法に関し、任意で、前述の工程は、以前に述べたように、本方法の工程と組み合わせてもよい。

薬物耐性は、薬物に対する細胞の感受性を担う1種または複数種の遺伝子（薬物感受性遺伝子）、例えばヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子（GenBank： M26434.1）を不活性化することによって、T細胞に付与することができる。特に、細胞分裂停止性の代謝産物である6-チオグアニン（6TG）に対する耐性を付与するために、操作されたT細胞においてHPRTを不活性化することができる。6-チオグアニン（6TG）は、HPRTによって、現在、癌患者、特に白血病患者を処置するのに用いられている細胞傷害性チオグアニンヌクレオチドに変換される（Hacke, Treger et al. 2013）。別の例では、通常、T細胞表面に発現しているCD3を不活性化すると、テプリズマブなどの抗CD3抗体に対する耐性を付与することができる。

薬物耐性はまた、薬物耐性遺伝子を発現させることによってT細胞に付与することができる。前記薬物耐性遺伝子とは、化学療法剤（例えば、メトトレキセート）などの薬剤に対する「耐性」をコードする核酸配列を指す。言い換えると、細胞内で薬物耐性遺伝子を発現させると、薬物耐性遺伝子のない対応する細胞を増殖させるより多量に、薬剤の存在下で細胞を増殖させることが可能になる。本発明の薬物耐性遺伝子は、代謝拮抗物質、メトトレキセート、ビンブラスチン、シスプラチン、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞傷害性抗生物質、抗イムノフィリン、その類似体または誘導体などに対する耐性をコードしてもよい。

薬物耐性を細胞に付与する、いくつかの遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ2（IMPDH2）、カルシニューリン、またはメチルグアニントランスフェラーゼ（MGMT）の変種対立遺伝子が同定されている。前記薬物耐性遺伝子は、前記遺伝子をコードするトランスジーンを細胞に導入することによって細胞内で発現されてもよく、相同組換えによって前記薬物耐性遺伝子を細胞ゲノムに組み込むことによって細胞内で発現されてもよい。標的とする細胞に薬物耐性を付与するのに潜在的に使用することができる、いくつかの他の薬物耐性遺伝子が同定されている（Takebe, Zhao et al. 2001；Sugimoto, Tsukahara et al. 2003；Zielske, Reese et al. 2003；Nivens, Felder et al. 2004；Bardenheuer, Lehmberg et al. 2005；Kushman, Kabler et al. 2007）。

DHFRは、細胞内のテトラヒドロ葉酸量の調節に関与し、DNA合成に必須の酵素である。メトトレキセート（MTX）などの葉酸類似体は、DHFRを阻害し、従ってクリニックにおいて抗悪性腫瘍剤として用いられる。療法において用いられる葉酸代謝拮抗剤による阻害に対する耐性を高めた様々なDHFR変異型が述べられている。特定の態様において、本発明による薬物耐性遺伝子は、葉酸代謝拮抗剤処置、例えば、メトトレキセートに対する耐性を付与する少なくとも1つの変異を含む、ヒト野生型DHFRの変異型をコードする核酸配列（GenBank： AAH71996.1）でもよい。特定の態様において、DHFR変異型は、位置G15、L22、F31、またはF34、好ましくは、位置L22またはF31に少なくとも1つの変異アミノ酸を含む（（Schweitzer, Dicker et al. 1990）；国際出願 W094/24277；米国特許第6,642,043号）。

本明細書で使用する「葉酸代謝拮抗剤」または「葉酸類似体」は、ある程度のレベルで葉酸代謝経路を妨害するように向けられた分子を指す。葉酸代謝拮抗剤の例には、例えば、メトトレキセート（MTX）；アミノプテリン；トリメトレキセート（Neutrexin（商標））；エダトレキサート；N10-プロパルギル-5,8-ジデアザ葉酸（CB3717）；ZD1694（Tumodex）、5,8-ジデアザイソ葉酸（IAHQ）；5,10-ジデアザテトラヒドロ葉酸（DDATHF）；5-デアザ葉酸；PT523（Nα-（4-アミノ-4-デオキシプテロイル）-Nδ-ヘミフタロイル-L-オルニチン）；10-エチル-10-デアザアミノプテリン（DDATHF、ロマトレキソール（lomatrexol））；ピリトレキシム；10-EDAM；ZD1694；GW1843；ペメトレキサート（Pemetrexate）およびPDX（10-プロパルギル-10-デアザアミノプテリン）が含まれる。

薬物耐性遺伝子の別の例はまた、グアノシンヌクレオチド新規合成における律速酵素であるイオニシン（ionisine）-5'-一リン酸デヒドロゲナーゼII（IMPDH2）の変異型または改変型でもよい。IMPDH2の変異型または改変型はIMPDH阻害剤耐性遺伝子である。IMPDH阻害剤はミコフェノール酸（MPA）またはそのプロドラッグであるミコフェノール酸モフェチル（MMF）でもよい。変異IMPDH2は、野生型ヒトIMPDH2（NP_000875.2）のMAP結合部位に、IMPDH阻害剤耐性を大幅に高める少なくとも1つの変異、好ましくは2つの変異を含んでもよい。変異は、好ましくは、位置T333および/またはS351（Yam, Jensen et al. 2006；Sangiolo, Lesnikova et al. 2007；Jonnalagadda, Brown et al. 2013）にある。特定の態様において、位置333のスレオニン残基はイソロイシン残基と交換され、位置351のセリン残基はチロシン残基と交換される。

別の薬物耐性遺伝子は変異型カルシニューリンである。カルシニューリン（PP2B）は、多くの生物学的プロセスに関与し、T細胞活性化の中心をなす広範に発現しているセリン/スレオニンプロテインホスファターゼである。カルシニューリンは、触媒サブユニット（CnA；3種類のアイソフォーム）および調節サブユニット（CnB；2種類のアイソフォーム）からなるヘテロ二量体である。T細胞受容体が結合した後に、カルシニューリンは転写因子NFATを脱リン酸化し、転写因子NFATは核およびIL2などの活発な重要標的遺伝子に移動できるようになる。FKBP12と複合体化したFK506、またはCyPAと複合体化したシクロスポリンA（CsA）は、カルシニューリン活性部位にNFATが接近するのをブロックし、NFATの脱リン酸を阻止し、それによってT細胞活性化を阻害する（Brewin, Mancao et al. 2009）。本発明の薬物耐性遺伝子は、FK506および/またはCsAなどのカルシニューリン阻害剤に対して耐性のカルシニューリン変異型をコードする核酸配列でもよい。特定の態様において、前記変異型は、野生型カルシニューリンヘテロ二量体aの位置：V314、Y341、M347、T351、W352、L354、K360に少なくとも1つの変異アミノ酸、好ましくは、位置T351およびL354またはV314およびY341に二重変異を含んでもよい。本明細書に記載のアミノ酸位置の対応は、野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体のアミノ酸の位置で表されることが多い（GenBank： ACX34092.1）。

別の特定の態様において、前記変異型は、野生型カルシニューリンヘテロ二量体bの位置：V120、N123、L124、またはK125に少なくとも1つの変異アミノ酸、好ましくは、位置L124およびK125に二重変異を含んでもよい。本明細書に記載のアミノ酸位置の対応は、野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体bポリペプチドのアミノ酸の位置で表されることが多い（GenBank： ACX34095.1）。

別の薬物耐性遺伝子は、ヒトアルキルグアニントランスフェラーゼ（hAGT）をコードするO（6）-メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（MGMT）である。AGTは、アルキル化剤、例えば、ニトロソ尿素およびテモゾロミド（TMZ）の細胞傷害作用に対する耐性を付与するDNA修復タンパク質である。6-ベンジルグアニン（6-BG）は、ニトロソ尿素の毒性を増強し、この薬剤の細胞傷害作用を増強するためにTMZと同時投与されるAGT阻害剤である。AGT変種をコードするいくつかのMGMT変異型は、6-BGによる不活性化に対して高度に耐性があるが、DNA損傷を修復する能力を保持している（Maze, Kurpad et al. 1999）。特定の態様において、AGT変異型は野生型AGT位置P140の変異アミノ酸を含んでもよい（UniProtKB： P16455）。

別の薬物耐性遺伝子は多剤耐性タンパク質1（MDR1）遺伝子でもよい。この遺伝子は、細胞膜を通過する代謝副産物の輸送に関与するP-糖タンパク質（P-GP）として知られる膜糖タンパク質をコードする。P-Gpタンパク質は、構造が関係しない数種類の化学療法剤に対して広い特異性を示す。従って、MDR-1（NP_000918）をコードする核酸配列を発現させることによって薬物耐性を細胞に付与することができる。

薬物耐性遺伝子はまた、ble遺伝子またはmcrA遺伝子などの細胞傷害性抗生物質でもよい。免疫細胞におけるble遺伝子またはmcrAの異所的発現は、それぞれ、化学療法剤であるブレオマイシンまたはマイトマイシンCに曝露されたときに選択上の利点をもたらす。

T細胞は、免疫抑制剤に対して耐性にすることもできる。
免疫抑制剤は、いくつかの作用機序の1つによって免疫機能を抑制する薬剤である。言い換えると、免疫抑制剤は、免疫応答の程度および/または貪食を減らす能力によって示される化合物が果たす役割である。非限定的な例として、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシン標的、インターロイキン-2α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、コルチコステロイド、または免疫抑制性代謝拮抗物質でもよい。古典的な細胞傷害性免疫抑制剤はDNA合成を阻害することによって作用する。その他の免疫抑制剤はT細胞を活性化することによって作用してもよく、ヘルパー細胞の活性化を阻害することによって作用してもよい。本発明による方法を用いると、T細胞内にある免疫抑制剤の標的を不活性化することによって、免疫療法のためにT細胞に免疫抑制耐性を付与することが可能になる。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、免疫抑制剤の受容体、例えば、CD52、グルココルチコイド受容体（GR）、FKBPファミリー遺伝子メンバー、およびシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーでもよい。

免疫能力のある宿主では、同種異系細胞は通常、宿主免疫系によって素早く拒絶される。放射線照射されていない血液製剤に存在する同種異系白血球はわずか5〜6日間しか残らないことが証明されている。従って、同種異系細胞の拒絶反応を阻止するためには、宿主免疫系を効果的に抑制しなければならない。免疫抑制のためにグルココルチコイドステロイドが治療に広く用いられる。このクラスのステロイドホルモンは、T細胞サイトゾルに存在するグルココルチコイド受容体（GR）に結合し、その結果、核に移行し、免疫プロセスに関与する多数の遺伝子の発現を調節する特定のDNAモチーフに結合する。T細胞をグルココルチコイドステロイドで処理するとサイトカイン産生レベルが低下し、それによって、T細胞アネルギーが発生し、T細胞活性化が妨害される。アレムツズマブはCAMPATH1-Hとしても知られ、12アミノ酸のグリコシルホスファチジル-イノシトール-（GPI）結合糖タンパク質であるCD52を標的とするヒト化モノクローナル抗体である（Waldmann and Hale, 2005）。CD52はTリンパ球およびBリンパ球において高レベルで発現し、単球では低レベルで発現しているのに対して、顆粒球および骨髄前駆体には存在しない。CD52に対して向けられたヒト化モノクローナル抗体であるアレムツズマブによる処置は循環リンパ球および単球の急速な枯渇を誘導することが示されている。アレムツズマブは、T細胞リンパ腫の処置において、ある特定の場合では移植のための移植前処置の一環として頻繁に用いられる。しかしながら、養子免疫療法の場合、免疫抑制薬物の使用は、導入された治療用T細胞に悪影響も及ぼすことがある。従って、これらの条件で養子免疫療法アプローチを効果的に使用するには、導入された細胞は免疫抑制処置に対して耐性になる必要があるだろう。

上記工程の好ましい態様として、免疫抑制処置に特異的な、工程（b）の前記遺伝子はCD52であり、工程（d）の免疫抑制処置は、CD52抗原を標的とするヒト化抗体を含む。別の態様として、免疫抑制処置に特異的な、工程（b）の前記遺伝子はグルココルチコイド受容体（GR）であり、工程（d）の免疫抑制処置は、コルチコステロイド、例えば、デキサメタゾンを含む。別の態様として、免疫抑制処置に特異的な、工程（b）の前記遺伝子はFKBPファミリー遺伝子メンバーまたはその変種であり、工程（d）の免疫抑制処置は、タクロリムスまたはフジマイシン（fujimycin）としても知られるFK506を含む。別の態様として、前記FKBPファミリー遺伝子メンバーはFKBP12またはその変種である。別の態様として、免疫抑制処置に特異的な、工程（b）の前記遺伝子はシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーまたはその変種であり、工程（d）の免疫抑制処置はシクロスポリンを含む。

本発明の特定の態様において、前記方法の遺伝子組換え工程は、CD52およびGR、CD52およびTCRα、CDR52およびTCRβ、GRおよびTCRα、GRおよびTCRβ、TCRαおよびTCRβからなる群より選択される2種類の遺伝子の不活性化に依拠する。別の態様において、前記方法の遺伝子組換え工程は2種類を超える遺伝子の不活性化に依拠する。遺伝子組換えは、好ましくは異なる遺伝子を標的とする少なくとも2種類のRNAガイドを用いてエクスビボで行われる。

遺伝子を不活性化することによって、関心対象の遺伝子が機能的なタンパク質の形態で発現されないことが意図される。

免疫療法のための高活性T細胞を操作する
本発明によれば、T細胞は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球からなる群より選択することができる。別の態様において、前記細胞はCD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来してもよい。前記細胞は血液から抽出されてもよく、幹細胞に由来してもよい。幹細胞は成人幹細胞、胚性幹細胞、さらに具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞でもよい。代表的なヒト細胞はCD34+細胞である。本発明の細胞の増殖および遺伝子組換えの前に、様々な非限定的な方法によって対象から細胞供給源を得ることができる。T細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む多数の非限定的な供給源から得ることができる。本発明のある特定の態様では、入手可能であり、かつ当業者に公知の任意の数のT細胞株を使用することができる。別の態様において、前記細胞は健常ドナーから得られてもよく、癌と診断された患者または感染症と診断された患者から得られてもよい。別の態様において、前記細胞は、異なる表現型特徴を示す細胞の混合集団の一部である。本発明の範囲には、以前に述べられた方法による形質転換T細胞から得られた細胞株も包含される。

本発明のさらなる局面として、本発明によるT細胞は、特に、「免疫チェックポイント」と呼ばれる、T細胞調節全体に関与するタンパク質の発現を調整することによって、本発明によるT細胞の活性および/または活性化を増強するようにさらに操作されてもよく、好ましくは、遺伝子操作されてもよい。

免疫チェックポイント
「免疫チェックポイント」という用語は、T細胞が発現する分子の一群を意味することが当業者により理解される。これらの分子は、免疫応答を下方制御または阻害するための「ブレーキ」として効果的に働く。免疫チェックポイント分子には、免疫細胞を直接阻害する、Programmed Death1（PD-1。PDCD1またはCD279としても知られる。アクセッション番号：NM_005018）、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4。CD152としても知られる。GenBankアクセッション番号AF414120.1）、LAG3（CD223としても知られる。アクセッション番号：NM_002286.5）、Tim3（HAVCR2としても知られる。GenBankアクセッション番号：JX049979.1）、BTLA（CD272としても知られる。アクセッション番号：NM_181780.3）、BY55（CD160としても知られる。GenBankアクセッション番号：CR541888.1）、TIGIT（IVSTM3としても知られる。アクセッション番号：NM_173799）、LAIR1（CD305としても知られる。GenBankアクセッション番号：CR542051.1 （Meyaard, 1997 #122））、SIGLEC10（GeneBankアクセッション番号：AY358337.1）、2B4（CD244としても知られる。アクセッション番号：NM_001166664.1）、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7（Nicoll, 1999 #123）、SIGLEC9（Zhang, 2000 #124；Ikehara, 2004 #125）、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF（Quigley, 2010 #121）、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3が含まれるが、これに限定されない。例えば、CTLA-4は、ある特定のCD4 T細胞上およびCD8 T細胞上で発現する細胞表面タンパク質であり、抗原提示細胞上に、そのリガンド（B7-1およびB7-2）が結合すると、T細胞活性化およびエフェクター機能が阻害される。従って、本発明は、特に免疫療法のために、T細胞を操作する方法でに関し、本方法は、免疫チェックポイントに関与する少なくとも1種類のタンパク質、特にPD1および/もしくはCTLA-4、または表3において言及した任意の免疫チェックポイントタンパク質を不活性化することによってT細胞を遺伝子組換えする工程を含む。

（表３）免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子のリスト

病的細胞に対するキメラ抗原受容体を発現する操作されたT細胞
本発明に従ってT細胞に導入されるキメラ抗原受容体は、単鎖CARまたは多鎖CARなどの異なる設計を採用することができる。これらの異なる設計を用いると、標的となった病的細胞に対する特異性および結合効率を改善するための様々な戦略が可能になる。これらの戦略の一部を本願の図に示した。単鎖CARは、当技術分野における最も古典的なバージョンである。特異性および強度の点でT細胞の活性の調整が可能になるので、多鎖CAR構造が出願人によって開発された。多サブユニットは、さらなる共刺激ドメインを保護することできるか、またはこのようなドメインを遠ざけることができ、同様に、他のタイプの受容体も保護することできるか、または遠ざけることができるのに対して、古典的な単鎖構造は、時として、多重特異性相互作用に対して感度が高すぎる、および許容性が低すぎるとみなされることがある。

単鎖CAR
養子免疫療法は、エクスビボで作製された抗原特異的自己T細胞の導入を伴い、ウイルス感染症および癌を処置するのに有望な戦略である。養子免疫療法に用いられるT細胞は抗原特異的T細胞の増殖によって作製されてもよく、遺伝子工学によるT細胞の再誘導によって作製されてもよい（Park, Rosenberg et al. 2011）。ウイルス抗原特異的T細胞の導入は、移植に関連するウイルス感染症および稀なウイルス関連悪性疾患の処置に用いられる十分に確立した手順である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および導入は黒色腫の処置においてうまくいくことが示されている。

T細胞における新たな特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）を遺伝子導入することによって首尾良く作製されている（Jena, Dotti et al. 2010）。CARは、1つの融合分子の形をとる、1つまたは複数のシグナル伝達ドメインに結合した標的となる部分からなる合成受容体である。概してCARの結合部分は、可動性リンカーによってつながっているモノクローナル抗体の軽鎖可変断片を含む単鎖抗体（scFv）抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインをベースとする結合部分も首尾良く用いられている。第1世代CAR用のシグナル伝達ドメインはCD3ζまたはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第1世代CARはT細胞の細胞傷害性を首尾良く再誘導することが示されている。しかしながら、それらは、インビボで長期増殖および抗腫瘍活性をもたらさなかった。CAR改変T細胞の生存率を向上させ、増殖を増やすために、CD28、OX-40（CD134）、および4-1BB（CD137）を含む共刺激分子に由来するシグナル伝達ドメインが単独で（第二世代）または組み合わせて（第三世代）加えられている。CARを用いると、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性疾患に由来する腫瘍細胞の表面に発現している抗原にT細胞を首尾良く再誘導することができた（Jena, Dotti et al. 2010）。

病的細胞とT細胞に共通して見られる抗原マーカー、例えば、CD38を標的とするCARに加えて、T細胞特異性を増強するために、必ずT細胞が発現するとは限らない他の抗原マーカーに対して向けられた、さらなるCARを発現させることが考えられる。

多重特異性細胞を作り出すために、T細胞がさらに発現することができるキメラ抗原受容体の例は、多発性骨髄腫またはリンパ芽球性白血病の抗原マーカー、例えば、TNFRSF17（UNIPROT Q02223）、SLAMF7（UNIPROT Q9NQ25）、GPRC5D（UNIPROT Q9NZD1）、FKBP11（UNIPROT Q9NYL4）、KAMP3、ITGA8（UNIPROT P53708）、およびFCRL5（UNIPROT Q68SN8）に対して向けられた抗原受容体である。

さらなる例として、標的の抗原は、分化分子（例えば、CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、およびCD138）、腫瘍関連表面抗原、例えば、ErbB2（HER2/neu）、癌胎児抗原（CEA）、上皮細胞接着分子（EpCAM）、上皮増殖因子受容体（EGFR）、EGFR変種III（EGFRvIII）、CD19、CD20、CD30、CD40、ジシアロガングリオシドGD2、管上皮ムチン（mucine）、gp36、TAG-72、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、チログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2（AS）、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ（prostase）、プロスターゼ特異的抗原（PSA）、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、プロステイン（prostein）、PSMA、生存（surviving）およびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1（PCTA-1）、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インシュリン増殖因子（IGF1）-I、IGF-II、IGFI受容体、メソテリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメイン（extra domain）A（EDA）およびエクストラドメインB（EDB）、ならびにテネイシン-CのA1ドメイン（TnC A1）および線維芽細胞関連タンパク質（fap）、細胞系列特異的抗原または組織特異的抗原、例えば、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、GM-CSF、サイトカイン受容体、エンドグリン、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子、BCMA（CD269、TNFRSF17）、またはウイルス特異的表面抗原、例えば、HIV特異的抗原（例えば、HIV gp120）、EBV特異的抗原、CMV特異的抗原、HPV特異的抗原、ラッセ（Lasse）ウイルス特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原、ならびにこれらの表面マーカーの任意の誘導体または変種の任意のクラスターに由来してもよい。抗原は必ずしも表面マーカー抗原とは限らず、細胞表面においてHLAクラスIが提示する内因性の小さな抗原でもよい。

例として、本発明は、実施例に記載のようにCD38、CS1、および/またはCD70などの細胞表面マーカーを特異的に標的とする単鎖CARと、前記CARを発現する細胞における、CD38コードする遺伝子、CS1をコードする遺伝子、および/またはCD70をコードする遺伝子の不活化を包含する。

具体例として、scFv抗CD38のVH鎖およびVL鎖は、それぞれ、SEQ ID NO：10および12ならびにSEQ ID NO：11および13と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％の同一性を有する。

具体例として、前記抗体またはCD38抗原上でのエピトープ結合は、前記抗体またはそのエピトープ結合断片が少なくとも1つの重鎖および少なくとも1つの軽鎖を含み、前記重鎖が、SEQ ID NO：14〜17によって表されるアミノ酸配列を有する3つの連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、SEQ ID NO：21〜23によって表されるアミノ酸配列を有する3つの連続した相補性決定領域を含むことを特徴とする。

別の具体例として、前記抗体またはCD38抗原上でのエピトープ結合は、前記抗体またはそのエピトープ結合断片が少なくとも1つの重鎖および少なくとも1つの軽鎖を含み、前記重鎖が、SEQ ID NO：18〜20によって表されるアミノ酸配列を有する3つの連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、SEQ ID NO：24〜26によって表されるアミノ酸配列を有する3つの連続した相補性決定領域を含むことを特徴とする。

別の具体例として、scFv抗CS1のVH鎖およびVL鎖は、それぞれ、SEQ ID NO：38-40-42-44-46およびSEQ ID NO：39-41-42-45-46と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％の同一性を有する。

さらに別の具体例として、scFv抗CD70のVH鎖およびVL鎖は、それぞれ、ポリヌクレオチドレベルまたは核酸レベルでSEQ ID NO：81〜82；85〜86；89〜91およびSEQ ID NO：83〜84；87〜88；91〜92と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％の同一性を有する。

一態様において、本発明は、SEQ ID NO：35〜37と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％の同一性を有する、単一のCAR抗CD38をコードするポリヌクレオチドを包含する。別の態様において、本発明は、SEQ ID NO：48〜62と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％の同一性を有する、単一のCAR抗CS1をコードするポリヌクレオチドを包含した。

さらに別の態様において、本発明は、SEQ ID NO：93〜101と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％の同一性を有する、単一のCAR抗CD70をコードするポリヌクレオチドを包含する。

本発明は、さらに具体的には、本願に記載のCARと、いくらかの同一性を示すCARを備え、前記CARの標的である細胞マーカーをコードする遺伝子に、レアカットエンドヌクレアーゼによって誘導された変異をもつ免疫細胞に関する（すなわち、CARは、前記の不活化された遺伝子の産物と親和性を示す）。同一性とは、FASTA、またはGCG配列解析パッケージ（University of Wisconsin, Madison, Wis.）の一部として入手可能なBLASTなどのソフトウェアによって確かめられたときに、少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは90％、さらにより好ましくは95％のポリヌクレオチド同一性またはポリペプチド同一性を意味する。BLASTP「同一性」は、全残基に対する、同一の高スコア配列ペアの数および割合を示す。本明細書において開示されたアミノ酸配列と、これらの程度の同一性もしくは類似性または任意の中間の程度の同一性もしくは類似性を有するアミノ酸配列が本開示により意図され、本開示に包含される。同じことが、BLASTNを用いたポリヌクレオチド配列について適用される。

マルチサブユニットCAR
T細胞に導入される先行技術のキメラ抗原受容体は、シグナル伝達ドメインの連続付加を必要とする単鎖ポリペプチドから形成された。しかしながら、シグナル伝達ドメインがその自然の膜近傍位置から動くと、その機能が妨げられる可能性がある。この欠点を克服するために、出願人は、最近、全ての関係するシグナル伝達ドメインの正常な膜近傍位置を可能にするために、FcεRIに由来する多鎖CARを設計した。この新たな構造では、FcεRIα鎖の高親和性IgE結合ドメインは、T細胞特異性を細胞標的に再誘導するためにscFvなどの細胞外リガンド結合ドメインと交換され、共刺激シグナルを正常な膜近傍位置に配置するためにFcεRIβ鎖のN末端テールおよび/またはC末端テールが用いられる。

従って、本発明による操作されたT細胞が発現するCARは、特に、本発明の操作されたT細胞の作製および増殖に合わせられた多鎖キメラ抗原受容体（CAR）でもよい。このような多鎖CARは、以下の成分：
（a）FcεRIα鎖の膜貫通ドメインおよび細胞外リガンド結合ドメインを含む1つのポリペプチド、
（b）FcεRIβ鎖のN末端細胞質テールおよびC末端細胞質テールの一部ならびに膜貫通ドメインを含む1つのポリペプチド、ならびに/または
（c）それぞれが、FcεRIγ鎖の細胞質内テールの一部および膜貫通ドメイン含み、異なるポリペプチドが自発的に一緒になって多量体化して二量体CAR、三量体CAR、または四量体CARを形成する、少なくとも2つのポリペプチド
の少なくとも2つを含む。

このような構造によれば、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインは、別個のポリペプチドに載って運ばれる。異なるポリペプチドは近接して膜内に固定されるので、互いに相互作用することが可能になる。このような構造では、シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインは、膜近傍位置にあってもよい（すなわち、細胞膜に隣接し、細胞膜の内側にあってもよい）。これは、共刺激ドメインの機能の改善を可能にすると考えられる。このマルチサブユニット構造はまた、さらに大きな融通性と、T細胞活性化をさらに厳密に制御するCARを設計する可能性ももたらす。例えば、多重特異性CAR構造を得るために、異なる特異性を有するいくつかの細胞外抗原認識ドメインを含めることも可能である。多鎖CARの中に入る異なるサブユニット間の相対比を制御することも可能である。このタイプの構造は、最近、本出願人によってPCT/US2013/058005（WO2014/039523）で説明された。

1つの多鎖CARの一部として異なる鎖を集合することは、例えば、シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインと融合した、IgEの高親和性受容体（FcεRI）（Metzger, Alcaraz et al. 1986）の異なるα鎖、β鎖、およびγ鎖を用いることによって可能になる。γ鎖は、膜貫通領域と、1個の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ITAM）（Cambier 1995）を含有する細胞質テールを含む。

標的の中にある異なるエレメントに同時結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を増強するために、多鎖CARは数種類の細胞外リガンド結合ドメインを含んでもよい。一態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチド上で縦列に配置されてもよく、任意でリンカーによって分けられてもよい。別の態様において、前記異なる細胞外リガンド結合ドメインは、多鎖CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチドに配置されてもよい。別の態様において、本発明は、それぞれが1つの異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多鎖CARからなる集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を操作する方法に関し、本方法は、免疫細胞を準備する工程、および前記細胞の表面に、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多鎖CARからなる集団を発現させる工程を含む。別の特定の態様において、本発明は、免疫細胞を操作する方法に関し、本方法は、、免疫細胞を準備する工程、およびそれぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多鎖CARからなる集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含む。特定の態様において、前記免疫細胞を操作する方法は、前記細胞の表面に、少なくとも、シグナル伝達ドメインと融合したFcεRIβ鎖および/またはγ鎖の一部、ならびに異なる細胞外リガンド結合ドメインと融合したFcεRIα鎖のいくつかの部分を発現させる工程を含む。さらに詳細な態様において、前記方法は、シグナル伝達ドメインと融合したFcεRIβ鎖および/またはγ鎖の一部、ならびに異なる細胞外リガンド結合ドメインと融合したいくつかのFcεRIα鎖をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含む。多鎖CARからなる集団とは、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個の、またはそれより多い多鎖CARを意味する。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的内の異なるエレメントに同時結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を増強してもよい。

本発明はまた、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多鎖CAR集団を含む、単離された免疫細胞に関する。

本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインが標的に結合した後に、免疫細胞および免疫応答の活性化をもたらす細胞内シグナル伝達を担う。言い換えると、シグナル伝達ドメインは、多鎖CARが発現している免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも1つの活性化を担う。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカイン分泌を含むヘルパー活性でもよい。

本願において、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を実行するように細胞を誘導するタンパク質部分を指す。

単鎖CARまたは多鎖CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するために協調して働く、Fc受容体またはT細胞受容体および補助受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変種、および同じ機能をもつ任意の合成配列でもよい。シグナル伝達ドメインは、抗原依存的一次活性化を開始する細胞質シグナル伝達配列、および二次シグナルまたは共刺激シグナルを供給するように抗原非依存的に働く細胞質シグナル伝達配列である2つの別々のクラスの細胞質シグナル伝達配列を含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、ITAMの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフとして知られるシグナル伝達モチーフを含んでもよい。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼの結合部位として役立つ、様々な受容体の細胞質内テールにおいて発見された、詳細に明らかにされているシグナル伝達モチーフである。本発明において用いられるITAMの例には、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するITAMが含まれ得る。好ましい態様において、多鎖CARのシグナル伝達ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインを含んでもよく、FcεRIβ鎖またはγ鎖の細胞質内ドメインを含んでもよい。

特定の態様において、本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。

リガンド結合ドメインは、文献において言及された単鎖CARに関して、以前に使用および言及された任意の抗原受容体、特に、モノクローナル抗体に由来するscFvであってもよい。WO2014/4011988に記載の二重特異性CARまたは多重特異性CARは、参照により組み込まれる。

単鎖CARについて前述されたものと同様に、本発明は、CD38、CS1、またはCD70などの細胞表面マーカーを特異的に標的とする多鎖CARを備える免疫細胞を包含する。本発明の好ましい態様によれば、前記のCARは免疫細胞において発現されるのに対して、レアカットエンドヌクレアーゼの発現によって、前記表面マーカーをコードする内因性遺伝子の不活化が誘導される。

T細胞の活性化および増殖
本発明による方法は、一般的に、T細胞を活性化および/または増殖させる、さらなる工程を含む。これは、例えば、米国特許第6,352,694号；同第6,534,055号；同第6,905,680号；同第6,692,964号；同第5,858,358号；同第6,887,466号；同第6,905,681号；同第7,144,575号；同第7,067,318号；同第7,172,869号；同第7,232,566号；同第7,175,843号；同第5,883,223号；同第6,905,874号；同第6,797,514号；同第6,867,041号；および米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を用いて、T細胞の遺伝子組換えの前または後に行われてもよい。これらの方法によれば、本発明のT細胞は、CD3 TCR複合体関連シグナルを刺激する薬剤およびT細胞表面にある共刺激分子を刺激するリガンドが取り付けられた表面と接触させることによって増殖させることができる。

特に、T細胞集団は、インビトロでは、例えば、表面に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片または抗CD2抗体との接触によって刺激されてもよく、プロテインキナーゼCアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）とカルシウムイオノフォアとの接触によって刺激されてもよい。T細胞表面にあるアクセサリー分子を同時刺激するために、アクセサリー分子に結合するリガンドが用いられる。例えば、T細胞増殖を刺激するのに適した条件下で、T細胞集団を抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+T細胞またはCD8+T細胞の増殖を刺激するために、抗CD3抗体および抗CD28抗体。例えば、それぞれのシグナルを供給する薬剤が、溶解状態にあってもよく、表面に結合されてもよい。当業者が容易に理解することができるように、粒子と細胞との比は、標的細胞に対する粒径によって決まる場合がある。本発明のさらなる態様において、T細胞などの細胞は、薬剤コーティングビーズと組み合わされ、ビーズおよび細胞は後で分離され、次いで、細胞は培養される。別の態様では、培養前に薬剤コーティングビーズおよび細胞は分離されず、一緒に培養される。抗CD3および抗CD28が取り付けられている常磁性ビーズ（3x28ビーズ）がT細胞と接触するのを可能にすることで、細胞表面タンパク質が連結される場合がある。一態様では、細胞（例えば、4〜10個のT細胞）およびビーズ（例えば、1：1比のDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T常磁性ビーズ）が、緩衝液中、好ましくは、PBS（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを含まない）の中で組み合わされる。これもまた、任意の細胞濃度を使用できることを当業者は容易に理解することができる。混合物は、数時間（約3時間）〜約14日間、培養されてもよく、その間の任意の整数値の時間にわたって培養されてもよい。別の態様では、混合物は21日間、培養されてもよい。T細胞培養に適した条件には、血清（例えば、胎仔ウシ血清ウシまたは胎児ヒト血清）、インターロイキン-2（IL-2）、インシュリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、およびTNF-、または当業者に公知の細胞増殖のための他の任意の添加物を含む、増殖および生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 5（Lonza））が含まれる。細胞増殖のための他の添加物には、界面活性剤、プラスマネート（plasmanate）、および還元剤、例えば、N-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールが含まれるが、これに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、無血清の、あるいは適量の血清（もしくは血漿）、または規定された一組のホルモン、ならびに/またはT細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカインが加えられた、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、およびX-Vivo 20、Optimizerが含まれ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養物にだけ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気+5％CO2）の下で維持される。異なる刺激時間に曝露されたT細胞は異なる特徴を示す場合がある。

別の特定の態様において、前記細胞は、組織または細胞と共培養することによって増殖させることもできる。前記細胞はまた、インビボで増殖させてもよく、例えば、前記細胞を対象に投与した後に対象の血液中で増殖させることもできる。

治療用途
上記の様々な方法によって得られたT細胞は、中でも癌、感染症、または免疫疾患を、必要とする患者において処置するための医薬として使用することが意図される。

前記処置は、寛解させる処置でもよく、根治的処置でもよく、予防的処置でもよい。前記処置は自己由来免疫療法の一環でもよく、同種異系免疫療法処置の一環でもよい。自己由来とは、患者の処置に用いられる細胞、細胞株、または細胞集団が前記患者またはヒト白血球抗原（HLA）適合ドナーに由来することを意味する。同種異系とは、患者の処置に用いられる細胞または細胞集団が前記患者に由来しないが、ドナーに由来することを意味する。

前記方法の1つに従って操作されたT細胞はプールされてもよく、凍結されてもよく、1人または数人の患者に投与されてもよい。これらのT細胞が非アロ反応性にされたとき、「既製の」治療製品として利用することができる。これは、これらのT細胞が、広く、これを必要とする患者に注入できることを意味する。

前記処置は、主として、癌、ウイルス感染症、自己免疫障害、または移植片対宿主病（GvHD）と診断された患者を対象とする。癌は、好ましくは、液性腫瘍を有するが、固形腫瘍にも関係することがある白血病およびリンパ腫である。本発明のCARを用いて処置される癌のタイプには、癌腫、芽腫、および肉腫、ならびにある特定の白血病またはリンパ系腫瘍、良性腫瘍および悪性腫瘍、ならびに悪性疾患、例えば、肉腫、癌腫、および黒色腫が含まれるが、これに限定されない。成人腫瘍/癌および小児科腫瘍/癌も含まれる。

本発明は、表4〜14に、様々なタイプの癌を処置するために、本発明の操作された細胞を用いて標的とすることができる抗原マーカーの例を示す。

本発明の免疫療法に用いられる好ましい抗原マーカーは、さらに具体的には、CD38、CD319（CS1）、およびCD70である。

本発明のT細胞は、患者自身の免疫細胞、特に、T細胞に対して向けられた特異的CARで武装されたときに、リウマチ性多発関節炎（rheumatoid polyarthritis）、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、硬皮症、線維筋痛症、筋炎、強直性脊椎炎、インシュリン依存性I型糖尿病、橋本甲状腺炎、アジソン病、クローン病、セリアック病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、および多発性硬化症（MS）などの自己免疫疾患を処置するのに重要な工程である、前記細胞の阻害または調節を可能にする。従って、本発明は、前記の操作されたT細胞を、患者自身のT細胞に方向付けることによって免疫疾患を処置するための方法を包含する。

上記の処置は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、および放射線療法の群より選択される1つまたは複数の療法と組み合わせて行うことができる。

前記の操作されたT細胞は、治療標準として用いられる化学療法薬物および免疫抑制薬物、特に、メトトレキセートならびにフルダラビンおよびシクロホスファミドの組み合わせに対して耐性にされたときに、様々な形の癌を処置するのに特に適している。実際には、本発明は、好ましくは、細胞または細胞の集団に頼る。この局面において、化学療法および/または免疫抑制処置は、操作されたT細胞のインビボでの選択および増殖を助けるはずだと予想される。

本発明のある種の態様において、細胞は、抗ウイルス治療、シドホビル、およびインターロイキン2、シタラビン（ARA-Cとしても公知）のような薬剤による処置、またはMS患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のためのその他の処置を含むが、これらに限定されない、多数の関連する処置モダリティと共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびFK506のような免疫抑制剤、抗体、またはCAMPATH、抗CD3抗体、もしくはその他の抗体治療のようなその他の免疫除去（immunoablative）剤、シトキシン（cytoxin）、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用されてもよい。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66：807-815, 1 1；Henderson et al., Immun. 73：316-321, 1991；Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5：763-773, 93）。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外部照射治療（XRT）、シクロホスファミドのような化学療法剤、またはOKT3もしくはCAMPATHのような抗体のいずれかを使用したT細胞除去治療と共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなB細胞除去治療の後に投与される。例えば、一つの態様において、対象は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある種の態様において、移植の後、対象は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。付加的な態様において、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。本明細書に記載の方法のいずれか1つによって得られた前記改変された細胞は、宿主対移植片（HvG）拒絶反応および移植片対宿主病（GvHD）に対する処置を必要とする患者を処置するために本発明の特定の局面において使用することができる。従って、宿主対移植片（HvG）拒絶反応および移植片対宿主病（GvHD）に対する処置を必要とする患者を処置する方法であって、不活性化されたTCRα遺伝子および/またはTCRβ遺伝子を含む有効量の改変された細胞を前記患者に投与することによって、前記患者を処置する工程を含む方法が本発明の範囲にある。

一態様によれば、本発明の前記T細胞は患者に投与されると活発にインビボでT細胞増殖することができ、長期間にわたって、好ましくは1週間、より好ましくは2週間、さらにより好ましくは少なくとも1ヶ月間、体液中で持続することができる。本発明によるT細胞はこれらの期間にわたって持続すると予想されるが、患者の体内での寿命は、1年を超えない、好ましくは6ヶ月、より好ましくは2ヶ月、さらにより好ましくは1ヶ月を超えないことが意図される。

本発明による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口、輸液、植え込み、または移植を含む、便利な様式で実施され得る。本明細書に記載された組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者へ投与され得る。一つの態様において、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈注射によって投与される。

細胞または細胞の集団の投与は、これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む、体重1kg当たり10⁴〜10⁹個の細胞、好ましくは、体重1kg当たり10⁵〜10⁶個の細胞の投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の態様において、有効量の細胞が、単回投与される。別の態様において、有効量の細胞が、ある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断にあり、患者の臨床状態に依る。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の起源から入手され得る。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内にある。有効量とは、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存するであろう。

別の態様において、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。投与は、静脈内投与であり得る。投与は、腫瘍内への注射によって直接行われてもよい。

様々なタイプの癌に関与する固形腫瘍において過剰発現していると同時に、T細胞表面に発現している表面抗原マーカーの特定（表5〜13）
本発明者らは、細胞下局在を含むBioGPS（Human Primary Tumors（U95））uniprotデータからもダウンロードすることができる、1パネルの正常組織（Human U133A/GNF1H Gene Atlas）癌マイクロアレイデータからBioGPSマイクロアレイデータを使用した。

本発明者らは、正常組織に由来する値の分布を描き、相対発現を得るために閾値5を決定した。

本発明者らは、マイクロアレイ（約13000の遺伝子に相当する44.000のプローブ）を用いてアッセイされた全遺伝子にざっと目を通し、これらの膜局在をチェックした（膜タンパク質であると言及されていないタンパク質は捨てた）。CD8+T細胞における発現をBioGPSデータベースからチェックした。これらの遺伝子を、対応する発現が最も高い癌のタイプに従って列挙した（表5〜13）。

様々な液性血液腫瘍において過剰発現していると同時に、T細胞表面に発現している表面抗原マーカーの特定（表14）
この研究のために、RNA-seqデータは利用できず、従って、本発明者らは、11の研究所が参加したMILE（Microarray Innovations in Leukemia）コンソーシアムによる大規模研究から得られたマイクロアレイデータを使用した（http：//www.ngrl.org.uk/wessex/downloads/tm08/TM08-S4-1_KenMills.pdf-Haferlach et al. 2010、http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20406941）。この生データには、ALL（急性リンパ芽球性白血病）、AML（急性骨髄性白血病）、CLL（慢性リンパ芽球性白血病）およびCML（慢性骨髄性白血病）およびMDS（骨髄異形成症候群）の結果が含まれる。本発明者らは、細胞下局在については、いつものようにuniprotデータも使用した。

最初に、本発明者らは、研究した全組織における全遺伝子からの値の全分布を描いた。次いで、発現に必要なレベルを理解するために、本発明者らは、治療抗体が入手可能な、いくつかの液性腫瘍において発現している遺伝子（CD52、CD20、CD33、CD19、CD25、CD44、CD47、CD96、CD116、CD117、CD135、TIM-3）のリストを取得した。各遺伝子について、本発明者らは、前記遺伝子が発現している腫瘍において得られた値を調べた。次いで、本発明者らは、前記遺伝子が細胞膜タンパク質を生じるように思われる、それぞれの腫瘍と遺伝子のペアについて平均を計算した（細胞膜局在+タンパク質にある少なくとも1つの膜貫通ドメインの説明）。本発明者らは、全組織における発現がこの閾値0.15より低い遺伝子を捨てた。本発明者らは、表14に、T細胞における相対発現が0.2を上回る遺伝子を列挙し、ランク付けした。従って、表4は、本発明に従って液性腫瘍細胞を標的とするための、特に、ALL、AML、CLL、CML、およびMDSを処置するための推定抗原マーカー候補を示す。

免疫療法のために本発明によるT細胞を操作する工程の例
本発明をさらに深く理解するために、白血病CD38陽性細胞に対して向けられたT細胞を生成するために従う工程の一例を以下に示した。
1．患者1人1人または血液バンクからの細胞培養物または血液試料からT細胞を準備し、抗CD3/C28アクチベータービーズ（Dynabeads（登録商標））を用いて前記T細胞を活性化する。このビーズは、T細胞の活性化および増殖に必要な一次シグナルおよび共刺激シグナルを両方とも供給する。
2．前記細胞に、抗CD38抗体の可変鎖をコードする配列と融合した、CD3ζ活性化ドメイン、4-1BB共刺激ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD28に由来するヒンジの融合からなるキメラ抗原受容体をコードするトランスジーンを含むレトロウイルスベクターを形質導入する。形質転換されたT細胞の安全性を改善するために、リツキシマブに対して感受性のある自殺遺伝子が、WO2013/153391に記載のように、レンチウイルスベクターに、T2A分割配列で分けられて、さらに導入されてもよい。
3．（任意で）非アロ反応性および/または耐性のT細胞を操作する：
（a）WO2013/176915に示したプロトコールを従うことによって、前記細胞のTCRαを不活化して、TCRを前記細胞の表面から無くし、同種異系のTCRにより宿主組織が異物と認識されるのを阻止し、従って、GvHDを回避することができる。
（b）移植されたT細胞に影響を及ぼすことなく移植片拒絶反応を阻止するために、前記細胞が免疫抑制処置または化学療法処置に対して耐性になるように、免疫抑制剤または化学療法薬物の標的をコードする1種類の遺伝子を不活化することもできる。本実施例では、免疫抑制剤の標的はCD52であり、免疫抑制剤は、WO2013/176915に記載のようなヒト化モノクローナル抗CD52抗体（例えば、アレムツズマブ）である。
4．特異的TAL-エンドヌクレアーゼ（TALEN（商標）-Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, France）をコードするmRNAを用いてT細胞をエレクトロポレーション処理することによって、遺伝子不活化が行われる。不活化されたT細胞を、磁気ビーズを用いて分別する。例えば、標的にされた遺伝子（例えば、CD38、CD70、およびCD70）を依然として発現するT細胞は固体表面に固定されることで除去することができ、不活化された細胞は、カラムを通過するストレスに曝露されない。この穏やかな方法によって、適切に操作されたT細胞の濃度が上昇する。
5．CD3複合体刺激によって、操作されたT細胞を患者に投与する前にインビトロで増殖させるか、または患者に投与した後にインビボで増殖させる。投与工程前に、患者は、ヒト化モノクローナル抗CD52抗体であるCAMPATH1-Hなどの免疫抑制治療剤に供することができる。
6．任意で、操作された細胞を標的抗原に接近させるために、患者に投与する前に、前記細胞を二重特異性抗体にエクスビボで曝露するか、または患者に投与した後に、前記細胞を二重特異性抗体にインビボで曝露する。

抗CD38単鎖キメラ抗原受容体（CAR CD38）をコードするモノシストロニックmRNAを用いてエレクトロポレーション処理した操作されたT細胞の機能分析
特に、キメラ抗原受容体（CAR CD38）が提供されたときに、操作されたT細胞の抗腫瘍活性を示す能力がゲノム操作によって影響を受けなかったことを検証するために、操作されたT細胞を、表面にCD38を発現するダウジ細胞と4時間インキュベートした。Tリンパ球による細胞傷害性顆粒放出（脱顆粒と呼ぶ）のマーカーであるCD107aの細胞表面アップレギュレーションをフローサイトメトリー分析によって測定した（Betts, Brenchley et al. 2003）。

エレクトロポレーションの24時間後に、細胞を、固定可能な生死判別色素eFluor-780、および生細胞上のCARの細胞表面発現を評価するために特異的なPE結合ヤギ抗マウスIgG F（ab'）2断片で染色した。CD38が遺伝子破壊された生T細胞の圧倒的多数が表面にCARを発現する。T細胞をダウジ（CD38⁺）細胞と6時間、共培養し、表面における脱顆粒マーカーCD107aの発現を検出するためにフローサイトメトリーによって分析した（Betts, Brenchley et al. 2003）。

これらの結果から、CD38が破壊されたT細胞は、PMA/イオノマイシン（正の対照）またはCD38+ダウジ細胞に応答して脱顆粒する能力が同じであることが分かった。CD107アップレギュレーションはCD38+の存在に依存する。これらのデータから、T細胞の、制御された抗腫瘍応答を開始する能力は、本発明のT細胞のゲノム操作によって悪影響を受けなかったことが示唆される。

（表４）T細胞表面に発現していることが見出された、様々な癌の分化クラスター（CD）抗原マーカー

（表５）結腸腫瘍細胞表面とT細胞表面の両方で発現している抗原マーカー

（表６）乳房腫瘍細胞表面とT細胞表面の両方で発現している抗原マーカー

（表７）消化管腫瘍細胞表面とT細胞表面の両方で発現している抗原マーカー

（表８）腎臓腫瘍細胞表面とT細胞表面の両方で発現している抗原マーカー

（表９）肝臓腫瘍細胞表面とT細胞表面の両方で発現している抗原マーカー

（表１０）肺腫瘍細胞表面とT細胞表面の両方で発現している抗原マーカー

（表１１）卵巣腫瘍細胞表面とT細胞表面の両方で発現している抗原マーカー

（表１２）膵臓腫瘍細胞表面とT細胞表面の両方で発現している抗原マーカー

（表１３）前立腺腫瘍細胞表面とT細胞表面の両方で発現している抗原マーカー

（表１４）T細胞表面に発現しており、液性腫瘍細胞（ALL、AML、CML、MDS、CLL、CTRL）において過剰発現している抗原マーカー

実施例1-CD38遺伝子に対するノックアウト（KO）および抗CD38 CARの発現
CD38標的-サイクリックADPリボース加水分解酵素の提示
CD38は、大多数の患者において高レベルのCD38を発現する多発性骨髄腫（MM）細胞を含む、多くの免疫細胞の表面に見出される糖タンパク質である。多くの研究によって、抗CD38 mAbを用いて、CDCおよびADCCによって患者由来CD38+MM細胞およびCD38+MM細胞株が効率的に死滅することが示されているので（Ellis, J. H. K. et al, Journal of Immunology, 1995, 155 （2）, 925-937）、CD38はMMの検証された標的である。ダラツムマブは、多発性骨髄腫および他の血液腫瘍の死滅を誘導する治療用ヒトCD38モノクローナル抗体である（De Weers, M. et al, J Immunol 2011 186：1840-1848）。いくつかの研究において、CD38は活性化T細胞によって高発現されることも示されている（Sandoval-Montes CJ et a：, 2005, Leukoc Biol. 77（4）：513-21）。

T細胞によるCD38発現
CD3/CD28ビーズおよびIL-2を用いた刺激後のT細胞によるCD38発現を、17日間にわたって3〜4日毎にFACSによって分析した。活性化後、6日目と17日目との間に、90％を超えるT細胞が発現することが観察された（図10B）。

従って、抗CD38 CAR+T細胞による活性化T細胞の死滅を回避するために、T細胞におけるCD38表面発現を阻止する必要がある。これは、TALE-ヌクレアーゼを用いてCD38遺伝子を不活化することによって達成され得る。TALENは、注文に応じて作られる形式のTALヌクレアーゼを示す、出願人（Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 PARIS）が所有する登録商標である。

CD38ノックアウト（KO）のための戦略
CD38遺伝子内にある、13pbスペーサーで分けられた2つの17pb長配列を標的とするヘテロ二量体TALE-ヌクレアーゼを設計および作製した。それぞれの半標的は、以下の表15および図10Aに列挙した半TALE-ヌクレアーゼの反復によって認識される。

CD38ex1_T2標的に対する左TALENの反復配列は、

であり、右TALENの反復配列は、

であった。

（表１５）試験したCD38標的およびCD38抗原を不活化するためのTALENの配列

それぞれのTALE-ヌクレアーゼ構築物を、制限酵素消化を用いて、T7プロモーターの制御下で哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。T7プロモーターの下流にコード配列を有するプラスミドから、CD38を切断するTALE-ヌクレアーゼをコードするmRNAを合成した。

抗CD3/CD28コーティングビーズおよび組換えIL-2を用いて72時間にわたって活性化した精製T細胞を、半CD38ex1_T2 TALE-ヌクレアーゼを両方ともコードする2種類のmRNA（各10μg）をそれぞれエレクトロポレーション（Cytopulse）によってトランスフェクトした。CD38 KOを調べるために、TALEN mRNAトランスフェクション後、3日目、6日目、10日目、および13日目に、CD38陰性T細胞のパーセントをフローサイトメトリーによっつて評価した。トランスフェクトされたT細胞の15％はCD38を欠損していることが観察され（図10C）、この欠損は、トランスフェクション後、13日間にわたって安定していた。

さらに、CD38遺伝子を標的とする2つの代替TALE-ヌクレアーゼを設計した。それぞれの半標的は、以下の表16および図10Aに列挙した半TALE-ヌクレアーゼの反復によって認識される。CD38ex1_T4標的に対する左TALENの反復配列は、

であり、右TALENの反復配列は、

であった。CD38ex1_T5標的に対する左TALENの反復配列は、

であり、右TALENの反復配列は、

であった。

（表１６）他の2つのCD38標的およびこれらを不活化するための対応するTALENの配列

CAR抗CD38を発現させるための戦略
CAR抗CD38の構造および組成物
表17には、scFv抗CD38のVH鎖およびVL鎖を示した。SEQ ID NO：10〜11はヒト化抗CD38抗体ダラツムマブ（Genmab）に対応し、SEQ ID NO：12〜13は、米国特許第8,263,746B号に記載のようなMOR202（またはMOR03087）に対応する。

SEQ ID NO：14〜20およびSEQ ID NO：21〜26は、それぞれ、WO2008/047242出願に記載のような、VH鎖のCDR配列（HCDR）およびVL鎖のCDR配列（LCDR）に対応する。

（表１７）scFv抗CD38抗体ダラツムマブおよびMOR202のVH鎖およびVL鎖の配列、ならびにVH鎖およびVL鎖の特定のCDRの配列

ダラツムバブ（daratumumbab）scFvについては、図11Aに示したように、3つの異なるCAR構築物（GMB005-V1＆V2＆V3）を設計した。これらの配列を以下の表18に示した。3つの構築物は全て、シグナルペプチド（CD8α）、GSリンカー（scFv VH鎖とVL鎖との間にある）、膜貫通ドメイン（TM）、4-1BB共刺激ドメイン、およびCD3ζ活性化ドメイン（配列を以下の表18に示した）の点で同じ成分を有する。これらの違いは、ヒンジの選択
V1：FcRIIaヒンジ
V2：CD8aヒンジ
V3：IgG1ヒンジ
から来ている（表18）。

（表１８）scFvダラツムマブベースの抗CD38 CARの3つの異なる構造および使用した個々の成分のポリペプチド配列

スクリーニング
活性化後、4日目に、CD38 TALENをトランスフェクトする。3日後に、CD38欠損細胞を負の選択によって分別し、3日後に、抗CD38 CAR mRNAを用いてトランスフェクトする。次いで、CAR mRNAを一過的にトランスフェクトしたら、作製されたCAR分子を、発現および標的細胞株発現CD38に対する脱顆粒活性についてスクリーニングする。活性試験にには、異なる発現レベルのCD38を発現する標的細胞株（図11B）：
-抗CD38マイクロビーズを用いた磁気分離によって入手したU266 CD38+およびU266 CD38-
-中間レベルのCD38を発現する多発性骨髄腫細胞株であるL363
-高レベルのCD38を発現するバーキットリンパ腫由来細胞株であるダウジ
-慢性骨髄性白血病に由来する細胞株CD38陰性細胞株であるK562
を使用する。

この1回目のスクリーニングの後に、多数の選択された候補が、選択された標的細胞株に対する脱顆粒、IFNγ放出、および特異的細胞傷害活性を誘導する能力について試験される第2のスクリーニング工程を行う。次いで、候補選択を絞り、いくつかの候補をレンチウイルスベクター産生について選択し、CAR活性を、CARを安定に発現するCD38 KO T細胞において評価する。

実施例2 CS1 KOの状況での抗CS1 CAR活性
CS1標的の提示
多発性骨髄腫（MM）は、骨髄内でのプラズマ細胞（PC）の異常なクローン増殖を特徴とするB細胞悪性疾患であり、2012年に米国ではMMにより推定21,700件の新規症例と、10,710件の死亡が特定されている（Siegel R, et al. Cancer J Clin 2012 62：10-29）。2013年には、米国において22,350人の個体がMMと新たに診断され、10,710人がMMで死亡したと見積もられており、これは全血液悪性腫瘍による死亡の20％を占める。全生存期間を改善したプロテアソーム阻害剤および免疫調節薬物の使用にもかかわらず（Palumbo A, et al. Leukemia 2009 23：449-456）、MMは、新規の治療アプローチが緊急に必要な不治の悪性疾患のままである（Podar K, et al. Leukemia 2009 23：10-24）。

細胞表面糖タンパク質であるCS1（文献ではSLAMF7、CD319、またはCRACCとも呼ばれる-NCBI参照配列： NP_067004.3）は骨髄腫細胞の表面に大量かつ遍在して発現している（Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14：2775-84）。CS1は、ナチュラルキラー（NK）細胞、いくつかのT細胞サブセット、および正常B細胞を含む免疫エフェクター細胞の大半において非常に低いレベルで発現しており、骨髄系細胞では、ほとんど検出することができない（Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14：2775-84）。特に、CS1は、MMを含む血液悪性腫瘍を処置する目的で幹細胞移植に使用することができるヒト造血幹細胞では、ごくわずかしか発現していない（Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14：2775-84）。MMにおけるCS1の機能は依然として完全に理解されておらず、CS1は骨髄腫細胞接着、クローン形成性増殖、および腫瘍形成能において役割を果たしている可能性があると記録に残されている（Benson DM Jr, et al. J Clin Oncol 2012 30：2013-5；Tai YT, et al. Blood 2009 113：4309-18）。

CAR抗CS1の構造
抗CD38抗原標的単鎖CARについて実施例1で説明したように、ヒンジ、膜貫通ドメイン、同時活性化ドメインおよび伝達ドメイン（例えば、図11Aに図示し、配列を表18に示した）の点で同じ成分を用いて同じ構造V1、V2、およびV3を設計する。

表19には、scFv抗CS1のVH鎖およびVL鎖を示した。SEQ ID NO：38-40-42-44-46は、それぞれ、マウスscFv Luc63、Luc90、Luc34、LucX1、およびLucX2のVH鎖に対応し、SEQ ID NO：39-41-43-45-47は、それぞれ、マウスscFv Luc63、Luc90、Luc34、LucX1、およびLucX2のVL鎖に対応する。

表20には、上記のscFvを有する抗CS1 CARを示した。これらのCARは、図11AのバージョンV1、V2、およびV3に基づいており、それぞれ、短いFcERγヒンジ、中くらいのヒンジCD8αヒンジ、および長いIgG1ヒンジが用いられている。下線を引いた部分は、リンカーによって結合されたscFv VH鎖およびVL鎖に対応する。

（表１９）scFv抗CS1抗体のVH鎖およびVL鎖の配列

（表２０）図11AのV1、V2、およびV3バージョンに基づく抗CS1 CARのポリペプチド配列

CAR CS1+およびKO CS1操作のための戦略
CS1は、多発性骨髄腫患者に由来する形質細胞様細胞において高レベルで発現しており、そのため、CARを開発するための興味深い標的である。T細胞、特に、CD8サブセットは低レベルのCS1を発現する。T細胞、特に、CD8サブセットが抗CS1 CARを発現したときに死滅する可能性があるので、この低レベルのCS1はT細胞CAR開発に不利な点である。

本実施例では、本発明者らは、CAR+T細胞においてCS1遺伝子が破壊されたときにCAR活性が上昇したのかどうか見るために、モックトランスフェクトしたヒトT細胞、またはCS1（SLAMF7）遺伝子を標的とするTALENでトランスフェクトしたヒトT細胞においてLuc90-v2 CAR（配列を表20に示した）の活性を評価した。実験の経過を図12に示した。

T細胞をバフィーコート試料から精製し、CD3/CD28コーティングビーズを用いて活性化した。活性化して72時間後に、10μgのT01 左TALをコードするmRNAおよび10μgのT01_右TALをコードするmRNAを用いて、細胞をコトランスフェクトした。TALの配列を以下の表21に示し、TAL反復を有するプラスミド構築物（T01、T02、およびT03）を図13に示した。

図14は、CS1（SLAMF7）遺伝子内にあるTAL T01、T02、およびT03の標的場所を示す。T01およびT02はエキソン1を標的とするのに対して（図14A）、T03はエキソン2を標的とする（図14B）。

（表２１）CS1標的およびCS1標的を不活化するためのTALENの配列

TALEnトランスフェクションの3日後に、細胞に、EF1aプロモーターからL90-v2 CARを発現させる組換えレンチウイルスベクターを形質導入した。このレンチウイルスベクターは、CAR発現が、リボソームスキップペプチドを介してBFP発現（青色蛍光タンパク質）と一緒になるように組み立てられている。L90-v2 CARは、CS1標的を認識する細胞外結合ドメイン（scFv L90）の後ろに、hCD8αタンパク質に由来するヒンジおよび膜貫通領域が続くことによって構成される。分子の細胞内部分は、41BB由来共刺激ドメインと、それに続く、CD3γシグナル伝達ドメイン（個々の成分、scFv、およびCARの配列については、それぞれ、配列を前の表18〜19〜20に示した）を含有する。

形質導入の6日後に、形質導入効率を、フローサイトメトリーによってBFP発現を追跡することで評価した。細胞を抗CD8抗体および抗CS1抗体でも染色した。

結果
CAR CS1+発現
図16の結果から、モックトランスフェクトした細胞の形質導入効率は、CS1遺伝子を標的とするTALEnでトランスフェクトした細胞より高いことが分かる。これは、おそらく、形質導入されていないCS1発現T細胞の特異的細胞死滅によるものであるが、この集団は、TALENによる遺伝子破壊の結果として細胞がCS1を発現しなくなったときに影響を受けない。

この時点で、TALENでトランスフェクトした細胞とモックトランスフェクトした細胞（負の対照-プラスミドを用いないトランスフェクション）との間でCS1レベルの有意差は観察されなかった。なぜなら、CS1レベルはT細胞の初回活性化後にだんだんと減少するからである。他方で、モックトランスフェクトしたCAR発現細胞では、TALENでトランスフェクトしたCAR+細胞と比較して、CD8+細胞％の大幅な減少が観察された。このことから、高い割合のCD8+細胞がCAR+T細胞によって排除されたことが分かる。

細胞傷害活性の評価
CAR形質導入の8日後に、これらの細胞の細胞傷害活性を、等量のT細胞をCS1発現細胞株（L363細胞）またはCS1発現を欠く負の対照細胞株（MOLM13）と共培養することによって評価した。細胞共培養を開始して4時間後に、標的細胞株の生存率をフローサイトメトリーによって測定した。図15Aに示した結果から、CAR+T細胞と共培養したときにCS1（+）細胞の細胞生存率が低下したのに対して、CS1（-）細胞生存率に及ぼす影響は観察されなかったことが分かる。特異的細胞溶解をフローサイトメトリーデータを用いて計算した。T細胞を、CS1遺伝子を標的とするTALEnでトランスフェクトした後に、CARを形質導入したときに、特異的細胞溶解は2倍高くなった（図15B）。細胞をモックトランスフェクトしたときには、共培養中に存在するCAR+T細胞の量は多いので、この影響は、さらに大きい可能性があると考えるべきである（図16からのフローサイトメトリーデータを参照されたい）。実験結果は以下の通りである。
- モック/NTD試料の場合、BFP+細胞の％は0.1％であり、CD8+細胞の量は53.9％である。
- TALEn/NTD試料の場合、BFP+細胞の％は0.2％であり、CD8+細胞の量は49.5％である。
- モック/L90-2試料の場合、BFP+細胞の％は94％であり、CD8+細胞の量は1.8％である。
- TALEn/L90-2試料の場合、BFP+細胞の％は61％であり、CD8+細胞の量は8.3％である。

モックトランスフェクトした細胞の形質導入効率は、CS1遺伝子を標的とするTALEnでトランスフェクトした細胞より高い（NTD：形質導入なし）。

形質導入後の再活性化
TALEnでトランスフェクトしたT細胞ではCS1遺伝子が破壊されたことを確認するために、形質導入後、11日目に、様々な試料を、CD3/CD28ビーズを用いて再活性化した。再活性化の72時間後に、細胞を抗CD8抗体および抗CS1抗体で染色し、発現をフローサイトメトリーによって分析した。

図17は、各試料における形質導入効率およびCD8/CS1発現レベルを示す。下パネルに示したように、再活性化時に、モックトランスフェクトした細胞ではCS1レベルの増加が観察されたのに対して、TALEnでトランスフェクトした集団では、少量の細胞がCS1を発現することができる。

実験結果は以下の通りである。
- モック/NTD試料の場合、BFP+細胞の％は0.01％であり、CS1は細胞の65.2％で発現しており、CD8+細胞の量は80.7％である。
- TALEn/NTD試料の場合、BFP+細胞の％は0.2％であり、CS1は細胞の9.7％で発現しており、CD8+細胞の量は78.8％である。
- モック/L90-2試料の場合、BFP+細胞の％は94％であり、CS1は細胞の37.5％で発現しており、CD8+細胞の量は16％である。
- TALEn/L90-2試料の場合、BFP強度は61％であり、CS1発現は8.5％であり、CD8発現は68.5％である。

再活性化時に、モックトランスフェクトした細胞ではCS1レベルの増加が観察されたのに対して、TALEnでトランスフェクトした集団では、少量の細胞がCS1を発現することができる。

まとめると、これらの結果から、TALEnでトランスフェクトしたT細胞ではCS1遺伝子は破壊されており、このことが、主に細胞傷害性CD8+T細胞を保存することで抗CS1 CAR+細胞の細胞傷害活性を強化することが分かる。

実施例3： CD70標的
CD70標的の提示
CD70は、CD27に結合するサイトカインであり、TNFファミリーの一部である（Goodwin.G. et al, 1993, Cell 73：447-456）。このタンパク質はT細胞適応応答において役割を果たし、共刺激されたT細胞の増殖を誘導し、細胞溶解性T細胞の生成を強化する。そのアクセッション番号はP32970（Uniprot）である。Schurch, C. et al.（J. Clin. Invest., 2012；doi：10.1172/JCI45977）などの、いくつかの研究から、CD27-CD70相互作用のブロッキングは慢性骨髄性白血病（CML）の処置を助ける可能性があることが示唆されている。

CD70 KOのための戦略
CD70遺伝子をKOするために、実施例1および実施例2と同じ戦略を行う。CD70遺伝子内にある、15pbスペーサーで分けられた2つの49pb長配列を標的とするヘテロ二量体TALE-ヌクレアーゼ、および23pbスペーサーで分けられた57pb長配列を標的とする1種類のTALE-ヌクレアーゼを設計および作製した。それぞれの半標的は、以下の表22に列挙した半TALE-ヌクレアーゼの反復によって認識される。

（表２２）CD70標的およびCD70標的を不活化するためのTALENの配列

抗CD70 CARを発現させるための戦略
CAR抗CD70を発現させるために実施例1および実施例2と同じ戦略を行う。

実施例1〜2のように、シグナルペプチド、VH鎖とVL鎖との間のリンカー、膜貫通ドメイン、同時活性化ドメインおよび伝達ドメインの点で同じ成分を用いて同じ構造V1、V2、およびV3を設計する（一般構造を図11Aに示し、個々の成分の配列を表18に示した）。3つのバージョンV1、V2、およびV3の間でヒンジだけが異なり、それぞれ、短いFcERγヒンジ、中くらいのヒンジCD8αヒンジ、および長いIgG1ヒンジが用いられている。

表23には、scFv抗CD70のVH鎖およびVL鎖を示した。SEQ ID NO：81〜82、85〜86、89〜90は、それぞれ、AMGENのscFv Ab4、Ab8、Seattle Geneticsの1F6のVH鎖に対応し、SEQ ID NO：83〜84、87〜88、91〜92は、それぞれ、AMGENのscFv Ab4、Ab8、Seattle Geneticsの1F6のVL鎖に対応する。

表24には、上記のscFvを有する抗CD70 CARを示した。これらのCARは、図11AのバージョンV1、V2、およびV3に基づいており、それぞれ、短いFcEγヒンジ、中くらいのヒンジCD8、および長いIgG1ヒンジが用いられている。

（表２３）scFv 抗CD70 Ab4、Ab8、および1F6抗体のVH鎖およびVL鎖のポリヌクレオチド配列および核酸配列

（表２４）図11AのV1、V2、およびV3バージョンに基づく抗CD70 CARのポリペプチド配列

参考文献

Claims

（c）免疫細胞において、抗原マーカーの発現または提示に関与する遺伝子を遺伝子不活化するかまたは変異させる工程であって、該抗原マーカーが該免疫細胞の表面と病的細胞の表面の両方に存在する、工程、
（d）該免疫細胞において、該病的細胞の表面に存在する該抗原マーカーに対して向けられたキメラ抗原受容体をコードするトランスジーンを発現させる工程
を含む、病的細胞に対する免疫療法のための免疫細胞、好ましくはT細胞を調製する方法。
抗原マーカーが、表4に列挙した抗原マーカーより選択される、請求項1記載の方法。
抗原マーカーがCD38またはその免疫反応性断片である、請求項1記載の方法。
免疫細胞を活性化させかつ増殖させるさらなる工程を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
細胞表面にマーカー抗原を提示する細胞を排除することによって結果として得られた免疫細胞を精製するさらなる工程を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
ドナーから免疫細胞を獲得する先行する工程を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
病的細胞の発生による影響を受けている患者から免疫細胞を獲得する先行する工程を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
免疫細胞が、初代幹細胞、iPS、またはhES細胞に由来する、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
免疫細胞が、病的細胞の発生による影響を受けている患者に由来するiPS細胞に由来する、請求項8記載の方法。
工程（a）がレアカットエンドヌクレアーゼを用いて行われる、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
工程（a）がTAL-ヌクレアーゼを用いて行われる、請求項10記載の方法。
工程（a）がRNAガイドエンドヌクレアーゼを用いて行われる、請求項10記載の方法。
RNAガイドエンドヌクレアーゼがCas9である、請求項12記載の方法。
RNAガイドエンドヌクレアーゼが少なくとも2つのポリペプチドに分割され、一つのポリペプチドがRuvCを含み、別のポリペプチドがHNHを含む、請求項12記載の方法。
エンドヌクレアーゼが、トランスフェクトされたmRNAから発現される、請求項10記載の方法。
T細胞受容体（TCR）の成分をコードする遺伝子を不活化するさらなる工程を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
T細胞受容体の成分がTCRαである、請求項16記載の方法。
HLAの成分をコードする遺伝子を不活化するさらなる工程を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
β2mをコードする遺伝子を不活化するさらなる工程を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、およびGUCY1B3より選択される免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子を不活化するさらなる工程を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
遺伝子座がPD1遺伝子またはCTLA-4遺伝子の発現に関与する、請求項20記載の方法。
化学療法または免疫抑制薬物に対する免疫細胞の感受性を付与する遺伝子を不活化するさらなる工程を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
さらなる遺伝子がCD52をコードする、請求項22記載の方法。
さらなる遺伝子がヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）である、請求項22記載の方法。
さらなる遺伝子がグルココルチコイド受容体（GR）をコードする、請求項22記載の方法。
さらなる遺伝子がDCK調節経路、特にDCK発現に関与する、請求項22記載の方法。
工程（a）の免疫細胞が、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法。
T細胞がCD4+Tリンパ球および/またはCD8+Tリンパ球に由来する、請求項27記載の方法。
形質転換された免疫細胞をインビトロで増殖させる、請求項1〜28のいずれか一項記載の方法。
形質転換された免疫細胞をインビボで増殖させる、請求項1〜28のいずれか一項記載の方法。
病的細胞が悪性細胞または感染細胞より選択される、請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。
病的細胞がB細胞である、請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。
病的細胞が固形腫瘍細胞である、請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。
医用薬剤として用いるよう免疫細胞を調製するための、請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。
必要とする患者において癌、免疫疾患、または感染症を処置するための免疫細胞を調製するための、請求項31記載の方法。
リンパ腫を処置するための、請求項32記載の方法。
白血病を処置するための、請求項32記載の方法。
慢性リンパ性白血病（CLL）を処置するための、請求項34記載の方法。
請求項1〜35のいずれか一項記載の方法によって入手可能な、操作された免疫細胞。
結果として表現型[CAR CD38]⁺[CD38]^-が得られる、請求項39記載の操作された免疫細胞。
結果として表現型[CAR CD70]⁺[CD70]^-が得られる、請求項39記載の操作された免疫細胞。
結果として表現型[CAR CS1]⁺[CS1]^-が得られる、請求項39記載の操作された免疫細胞。
（a）免疫細胞と共通している特定の抗原マーカーを提示する病的細胞の存在について患者を診断する工程、
（b）請求項38〜42に記載の操作された免疫細胞の集団を調製する工程、または請求項1〜35のいずれか一項記載の方法に従って操作された免疫細胞の集団を調製する工程、および
（c）該操作された免疫細胞を、該病的細胞について診断された該患者に投与する工程
を含む、患者を処置するための方法。