JP2017503180A

JP2017503180A - ナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法

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Publication number: JP2017503180A
Application number: JP2016547006A
Authority: JP
Inventors: 錫薀閻; 徳民段; 徳璽張; 東玲楊; 静馮; 建彬桑
Original assignee: Institute of Biophysics of CAS
Current assignee: Institute of Biophysics of CAS
Priority date: 2014-01-14
Filing date: 2014-10-14
Publication date: 2017-01-26
Anticipated expiration: 2034-10-14
Also published as: EP3096140A4; EP3096140A1; CN103808926B; US20160334397A1; CN103808926A; WO2015106588A1; JP6449309B2

Abstract

本発明は液体サンプルにおける被測定物を検出するためのナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法を提供し、前記方法は順に以下のステップを含む。１）磁性ナノ粒子を前記被測定物と特異的に結合できる第一分子とカップリングすることによって調製される検出プローブを提供する。２）固定化した、前記被測定物と特異的に結合できる第二分子である捕獲プローブを提供する。３）前記液体サンプルを前記検出プローブと接触させる。４）前記検出プローブと接触した前記液体サンプルを前記捕獲プローブと接触させる。５）ステップ４）を通った前記捕獲プローブに、水素供与基質と過酸化物を加え、発色反応を行う。本発明はさらに液体サンプルにおける被測定物を検出するためのナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出装置を提供する。【選択図】図２

Description

本発明は、ナノ材料及び生物医学ナノ技術分野に属す。本発明は、磁性ナノ粒子モデル酵素に関し、且つそれが免疫クロマトグラフィー生物分子検出に応用する方法を提供する。

金コロイド免疫クロマトグラフィー法は２０世紀９０年代初に発展された金コロイドをマーカーとする検出方法であり、それは免疫親和技術、インプリンティング技術とドット薄層クロマトグラフィー技術を組み合わせたものである。このクロマトグラフィー試験片で検出する時、全てのサンプルはいずれも狭いセルロース膜の持続性反応を経るため、実際に被測定物質に対して濃縮、凝集作用を奏し、反応の感度を高め、反応速度を加速し、全体の操作時間は僅かに３〜１５分間しか必要としない。その原理は特異的な抗体（又は抗原）を先に硝酸セルロース膜のある領域に固定し、乾燥した硝酸セルロース膜の一端がサンプルに浸入した後、毛細管作用によって、サンプルはこの膜に沿って先へ移動し（クロマトグラフィー）、抗体や抗原が固定されている領域に移動したとき、サンプルにおける対応する抗原は当該抗体と特異的に結合を生じ、免疫金コロイドをマーカーとして用いれば、この領域は一定の色を示し、特異性の免疫診断を実現することができる。伝統的な金コロイド免疫クロマトグラフィー技術は操作しやすく、経済的、高速等の特徴を有するが、感度が比較的に低いため、その生物分子検出分野への広い応用を厳しく制限し、シグナル拡大は免疫クロマトグラフィー技術感度が低いことを解決するための重要なポイントである。

磁性ナノ粒子は良好な生物適合性を有し、それはナノ材料に特有な性質も有し（例えば粒径が小さく、比表面積が大きく、カップリング容量が高い）、磁気応答性及び超常磁性も有する。定磁場において集中や定位することができ、交番磁場において電磁波を吸収して発熱し、これらの特性を利用し、磁性ナノ粒子は磁気共鳴造影剤、磁気標的薬物キャリアー、細胞と生物分子分離、生物検知と検出、及び磁気誘導腫瘍熱療法等の生物学分野に広く応用されている。

近年、磁性免疫クロマトグラフィー（ＭａｇｎｅｔｉｃＩｍｍｕｎｏＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃＴｅｓｔ、ＭＩＣＴ）は新世代の一人分高速定量検出技術として徐々に発展してきて、それは、伝統的なマーカー（金コロイド、エマルジョン粒子等）の代わりに、超常磁性ナノ粒子で免疫クロマトグラフィーを行い、最後に磁気信号読取装置により、テストラインに結合している磁気粒子の磁場強度を読み取ることによって、測定するサンプルに対して定性定量判断を行う。現在では、国内でできた磁気信号読取装置は未だに発売されておらず、国際的にも少数の国外会社（例えば、アメリカＭａｇｎａＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社）しかこの技術を有しないが、高価であるため、磁性免疫クロマトグラフィーの発展と普及が制限された。

近年、われわれの課題グループの研究により、磁気ナノ粒子は内在的なモデル酵素活性を有し、ペルオキシダーゼの代わりに免疫検出を行えることを見出した（閻錫蘊ら、ＮａｔｕｒｅＮａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００７）。最近、われわれの課題グループはまた、三つの機能（識別、触媒、磁性）を一体化した新型免疫組化検出試薬を開発し、磁気粒子表面にタンパク分子を包んだ後にも酵素活性を有することを見出した（閻錫蘊ら、ＮａｔｕｒｅＮａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１２）。このような触媒活性はホースラディッシュペルオキシダーゼと似ており、過酸化水素の存在下で、磁性ナノ粒子はホースラディッシュペルオキシダーゼの基質を触媒でき、例えば３，３，５，５−テトラメチルベンジダイン（ＴＭＢ）を触媒して青い生成物を生じ、ジアミノベンジダイン（ＤＡＢ）を触媒して茶褐色沈殿を生じ、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を触媒してオレンジ色の生成物を生じることができ、触媒活性はｐＨ値、温度と過酸化水素の濃度に依存し、その触媒メカニズムはピンポン機構に相応しい。さらに、磁性ナノ粒子の触媒活性は粒子粒径が減少するとともに強くなり、粒子の粒径が小さいほど、その触媒活性が高くなることも発見した。磁性粒子の粒径はミクロンレベルになった後、触媒活性はゼロ近くまで低下する。磁性ナノ粒子のモデル酵素活性は、タンパク製剤のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）に比べて、より多くのメリットを有する。つまり、（１）タンパク酵素は極限ｐＨと温度において変性しやすいとともに、タンパク酵素によって分解されやすく、それに対して、磁性ナノ粒子は極限条件下で安定である。（２）タンパク酵素の生産コストは高く、磁性ナノ粒子の調製は簡単で、格安である。（３）磁性ナノ粒子は超常磁性を有するため、磁鉄で回収して繰り返し利用できる。さらに、磁性ナノ粒子の磁気制御可能性に基づいて、モデル酵素としての応用分野を広げた。

本発明の目的は、従来免疫クロマトグラフィー技術に存在する欠陥を解消することにあり、ナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法を提供し、その基本原理は金コロイド試験片と同じであり、まず、ある特定な抗原特異的な抗体Ａを磁性ナノ粒子とカップリングさせ、磁気粒子パッドを調製し、そしてその他のこの抗原に対する抗体Ｂを硝酸セルロース膜の特定領域に固定してテストライン（Ｔライン）を形成し、抗体Ａに抗する抗体（二次抗体）も硝酸セルロース膜の特定領域に固定してコントロールライン（Ｃライン）を形成し、Ｔラインに平行し、磁性免疫クロマトグラフィー試験片を組み立てて調製した。乾燥した硝酸セルロース膜の一端をサンプルに浸入した後、毛細管作用により、サンプルはこの膜に沿って先へ移動し、磁気粒子パッドまで移動した時、磁気粒子における抗体Ａは抗原と反応し、抗原−抗体Ａ−磁気粒子の複合物を生成し、続いて毛細管作用により他の抗体Ｂが固定されているＴライン領域まで移動した時、サンプル中の抗原はこの抗体Ｂと反応し、最終的に抗体Ｂ−抗原−抗体Ａ−磁気粒子複合物を生成する；抗原を結合しなかった磁気粒子抗体プローブは続けて先へ移動し、Ｃラインのところで二次抗体と結合して二次抗体−抗体Ａ−磁気粒子複合物を形成し、磁気粒子はＴラインとＣラインのあたりに集中する。サンプル中の抗原濃度が比較的に高ければ、Ｔラインのところで集中している磁気粒子も多く、磁気粒子の色を示す；サンプル中の抗原濃度がとても低い場合であれば、Ｔラインのところで集中している磁気粒子がとても少なく、磁気粒子の色を示すには十分ではなく、この際に過酸化物と水素供与基質、例えばＴＭＢ、ＤＡＢ等を加え、磁気粒子のペルオキシダーゼ触媒作用により大量な沈殿を生成して検出シグナルを強め、低濃度の抗原物質を検出する。この技術は磁性ナノ粒子ペルオキシダーゼ触媒活性及び磁気分離特性を一体化し、クロマトグラフィーの後に過酸化物と水素供与基質、例えばｏ−フェニレンジアミン（ＤＡＢ）等を加えることにより、磁気粒子の酵素触媒作用により茶褐色沈殿を生じることで、検出シグナルを強め、感度を上げ、検出結果が目視観察により判定できるようにし、機械に対する依存性をなくし、この新技術に基づく生物サンプルの検出は、簡便かつ高速であり、非常に現場使用に適している。

本発明は、以下の技術形態により実現される。

ナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法であって、前記方法は以下を含むものである。１）適当なサイズの磁性ナノ粒子を用いて、特異的に結合測定用抗原の生物分子をその表面にカップリングして特異性ナノ粒子プローブを調製し、磁気粒子パッドを調製する。２）磁性免疫クロマトグラフィー試験片を組み立てて調製する。３）クロマトグラフィー反応、測定用抗原は磁気ナノプローブ、テストライン抗体、コントロールライン抗体と反応してサンドイッチ複合物を形成し、陽性サンプルはＴラインのところで磁気粒子集中を形成する。４）発色反応、過酸化物と水素供与基質、例えばＴＭＢ、ＤＡＢ等を加え、磁気粒子の酵素触媒作用により大量な沈殿が生じて検出シグナルを強める。５）実験結果により、標的分子に対する定性と半定量検出を実現する。

さらに、本発明はナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法を提供し、前記磁性免疫クロマトグラフィー試験片を組み立てて調製することは、コーティング膜、測定用抗原に対応する抗体を結合した磁気粒子パッド、サンプルパッド、吸水パッドを互いに交錯するように基板上に順次貼り付け、そして上層に透明なプラスチック密封膜を被覆して組み立てることであり、前記コーティング膜には、測定用抗原のテストラインとコントロールラインをコーティングしておいた。

またさらに、上述したナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法の特徴は以下の通りである。前記磁性ナノ粒子は球状、棒状、立方体、三角形、多角形等の形状のいずれかの一種であってもよい。その粒径は１０ｎｍから５００ｎｍまでの範囲内にある。それが露出している磁気粒子であってもよく、タンパク外被、例えばウイルス外被、トランスフェリン外被、フェリチン外被でコーティングされた磁気粒子であってもよい。それがＦｅ_３Ｏ_４磁気粒子であってもよく、外層に二価鉄イオン試薬で修飾されているＦｅ_２Ｏ_３磁気粒子であってもよい。

またさらに、上述したナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法の特徴は以下の通りである。前記水素供与基質は、テトラメチルベンジダイン（ＴＭＢ）、テトラメチルベンジダイン硫酸塩（ＴＭＢＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、ジアミノベンジダイン（ＤＡＢ）、ジアミノベンジダイン四塩酸（ＤＡＢ−４ＨＣｌ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、ｏ−トリジン（ＯＴ）又は２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を含む。前記過酸化物は、過酸化水素又は過酸化尿素等を含む。

またさらに、上述したナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法の特徴は以下の通りである。前記特異性生物分子は、タンパク、核酸、ポリペプチドを含む。前記標的分子は、溶液又は体液中に存在する。

本発明の技術形態の際立った実質的な特徴と顕著な進歩は主に以下のように表される。

本発明は、現在の金コロイドはシグナル拡大機能を有さず、感度が比較的に低いような欠陥に対し、最新の科学発見に基づいて、ナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法を提供し、この技術は磁性ナノ粒子ペルオキシダーゼ触媒活性及び磁気分離特性を一体化し、クロマトグラフィーの後に過酸化物と水素供与基質、例えばｏ−フェニレンジアミン（ＤＡＢ）等を加えることにより、磁気粒子の酵素活性により大量な茶褐色沈殿を生じ、検出シグナルを１０−１００倍拡大し、検出結果は目視観察により判定できるようになって、機器に対する依存性をなくし、この新技術に基づく生物サンプルの検出は、簡便かつ高速であり、感度が高く、非常に現場使用に適しており、新規性、創造性、実用性を有する新技術である。

より具体的に、本発明は以下のものを提供する。
１．液体サンプルにおける被測定物を検出するためのナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法であって、前記方法は順に以下のステップを含む：
１）磁性ナノ粒子を前記被測定物と特異的に結合できる第一分子とカップリングすることによって調製される検出プローブを提供する；
２）固定化した、前記被測定物と特異的に結合できる第二分子である捕獲プローブを提供する；
３）前記液体サンプルを前記検出プローブと接触させる；
４）前記検出プローブと接触した前記液体サンプルを前記捕獲プローブと接触させる；
５）ステップ４）を通った前記捕獲プローブに、水素供与基質と過酸化物を加え、発色反応を行う。
２．前記磁性ナノ粒子の粒径は１０ｎｍから５００ｎｍまでの範囲内にある項目１に記載の方法。
３．前記磁性ナノ粒子はＦｅ_３Ｏ_４磁性ナノ粒子である項目１に記載の方法。
４．前記被測定物はタンパク質、ポリペプチド又は核酸である項目１に記載の方法。
５．前記被測定物はタンパク質であり、且つ前記第一分子と前記第二分子は前記タンパク質に対する特異性抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である項目１に記載の方法。
６．前記第一分子と前記磁性ナノ粒子はＥＤＣ−ＮＨＳ法によりカップリングする項目５に記載の方法。
７．前記水素供与基質は、テトラメチルベンジダイン（ＴＭＢ）、テトラメチルベンジダイン硫酸塩（ＴＭＢＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、ジアミノベンジダイン（ＤＡＢ）、ジアミノベンジダイン四塩酸（ＤＡＢ−４ＨＣｌ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、ｏ−トリジン（ＯＴ）又は２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を含む項目１に記載の方法。
８．前記過酸化物は過酸化水素と過酸化尿素を含む項目１に記載の方法。
９．前記液体サンプルを受け入れ、且つ前記サンプルにおける不純物をろ過するためのサンプルパッド、と
前記被測定物と特異的に結合できる第一分子とカップリングする磁性ナノ粒子を含む磁性ナノ粒子パッド、と
前記被測定物と特異的に結合できる第二分子を含むテストライン、と
一般的に比較的に厚いろ紙、又は類似したような吸水材料から作成され、クロマトグラフィーの動力を提供するための吸収パッド、と
を順に基板上に設けられている各ものを含むナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出装置であって、
前記磁性ナノ粒子の粒径は、１０ｎｍから５００ｎｍまでの範囲内にあることが好ましく、
前記磁性ナノ粒子はＦｅ_３Ｏ_４磁性ナノ粒子であることが好ましく、
前記被測定物は、タンパク質、ポリペプチド又は核酸であることが好ましく、そしてより好ましくは、前記被測定物はタンパク質であって前記第一分子と前記第二分子は前記タンパク質に対する特異性抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体であり、
前記第一分子と前記磁性ナノ粒子はＥＤＣ−ＮＨＳ法によりカップリングすることが好ましく、
前記水素供与基質は、テトラメチルベンジダイン（ＴＭＢ）、テトラメチルベンジダイン硫酸塩（ＴＭＢＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、ジアミノベンジダイン（ＤＡＢ）、ジアミノベンジダイン四塩酸（ＤＡＢ−４ＨＣｌ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、ｏ−トリジン（ＯＴ）又は２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を含むことが好ましく、且つ
前記過酸化物は過酸化水素と過酸化尿素を含むことが好ましい液体サンプル中の被測定物を検出するためのナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出装置。
１０．前記テストラインの後に、さらにコントロールラインが設けられており、前記コントロールラインには前記第一分子と特異的に結合できる第三分子が固定されている項目９に記載の検出装置。

以下、本発明の技術形態につき図面を参照しつつさらに説明する。
金コロイド免疫クロマトグラフィー法の概略図である。本発明のナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー法のある実施形態による概略図である。酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法で高い親和力のトウアズキ毒素モノクローナル抗体を選別する。トウアズキ毒素モノクローナル抗体のサブタイプ判定。抗体によって識別されたトウアズキ毒素の抗原エピトープを、免疫ブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）方法で判定する。二重抗体サンドイッチ酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）方法でトウアズキ毒素の抗体ペアを選別する。磁性ナノ粒子の調製。磁気粒子抗体プローブの調製及びドットブロット（Ｄｏｔｂｌｏｔ）検証。磁気粒子ナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー方法と金コロイド免疫クロマトグラフィー方法でトウアズキ毒素を検出する感度の比較。ナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー法と伝統的な金コロイド法がインフルエンザウイルス検出に対する感度の比較。

以下、具体的な実施例につき本発明を説明するが、本発明の範囲は具体的な実施例に限定されるものではない。

［実施例１］ナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法でトウアズキ毒素を検出する。
１）交雑腫細胞の調製
トウアズキ毒素は豆科植物トウアズキの種における成分であり、今まで発見された毒性の最も強い植物毒素の一種であり、人、動物と昆虫のいずれに対しても大きな毒性を有し、一粒のトウアズキの種は十分に人を致死でき、本発明はトウアズキ毒素（トウアズキ毒素及び後述するリシンは、いずれも軍事医学科学院より提供される）を検出することを例として、ナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法の感度と実用性を説明した。実験に使用する抗トウアズキ毒素のモノクローナル抗体Ａｂｒｉｎ−１、Ａｂｒｉｎ−２、Ａｂｒｉｎ−３、Ａｂｒｉｎ−４はそれぞれモノクローナル抗体Ａｂｒｉｎ−１、Ａｂｒｉｎ−２、Ａｂｒｉｎ−３、Ａｂｒｉｎ−４を分泌する交雑腫細胞に由来し（モノクローナル抗体の調製方法は本分野において既知なものであり、例えばＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５、１９７５；Ｙｅｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９７９；Ｙｅｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９８２に参照することができる）、具体的に、硫酸アンモニウム沈殿法によりトウアズキ種における粗毒素を取得し、さらに分子篩クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、冷凍乾燥等のステップにより高純度な毒素を得た；ホルムアルデヒドで不活化したトウアズキ毒素のホロ毒素を免疫原としてＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫接種を行い、毎回２０μｇタンパク／マウス１匹、二週間に一回、計三回経皮注射した。脾細胞を取る前に免疫を一回高める。免疫を高めてから三日目に、脾臓を取り、脾細胞をＲＰＭＩ培地に懸濁させる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下で、脾細胞とＳＰ２／０−Ａｇ１４マウス骨髓腫細胞を融合させ、且つＨＡＴ選択性培地（ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎ）、アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）とチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎ）を含む培地）で交雑腫に対して選別を行い、交雑腫細胞を得る。ＥＬＩＳＡの方法で天然トウアズキ毒素と強い結合能力を有する抗体を選別し、４株の抗体を得て、それぞれＡｂｒｉｎ−１、Ａｂｒｉｎ−２、Ａｂｒｉｎ−３、Ａｂｒｉｎ−４と命名し、同時にこれらの抗体を分泌する交雑腫細胞を得て、順にＡｂｒｉｎ−１、Ａｂｒｉｎ−２、Ａｂｒｉｎ−３、Ａｂｒｉｎ−４である。

２）ＥＬＩＳＡ方法でモノクローナル抗体Ａｂｒｉｎ−１、Ａｂｒｉｎ−２、Ａｂｒｉｎ−３、Ａｂｒｉｎ−４のトウアズキ毒素に対する親和力を判定する
具体的な方法は以下の通りである。まずは９６穴のＥＬＩＳＡ板において５０μｌの２μｇ／ｍｌトウアズキ毒素タンパクを一晩コーティングした；ＰＢＳＴで三回洗浄し、５％ＢＳＡ−ＰＢＳを加え１時間密封した；それぞれモノクローナル抗体の交雑腫細胞を加えて上澄みを培養し、３７℃で１時間インキュベートした；ＰＢＳＴで三回洗浄し、ＨＲＰで標記したヒツジ抗マウス抗体を加えて１時間インキュベートした；ＰＢＳＴで三回洗浄し、ＴＭＢ発色基質（２００ｎｇ／ｍｌのＴＭＢ、０．０３％のＨ_２Ｏ_２、ｐＨ４．５）を加えて発色させ、５０μｌ／穴、３７℃で１５分間反応し、５０μｌ／穴２Ｍの硫酸溶液を加えて反応を終了させ、マイクロプレートリーダー４５０ｎｍで読み取った。ＥＬＩＳＡ結果からわかるように、Ａｂｒｉｎ−３、Ａｂｒｉｎ−４の親和力は１：５０００に達したが、Ａｂｒｉｎ−１、Ａｂｒｉｎ−２の親和力は１：５００００と高い（図３）。

３）アフィニティークロマトグラフィーでモノクローナル抗体を精製する
具体的な方法は以下の通りである。交雑腫細胞Ａｂｒｉｎ−１、Ａｂｒｉｎ−２、Ａｂｒｉｎ−３、Ａｂｒｉｎ−４を大量に培養して増殖させ、それぞれ細胞懸濁液に調製し、６週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスを取ってプリスタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）０．５ｍｌ／匹を腹腔内注射し、約十日間後に、腹水を収集し、遠心して上澄みを取った。タンパクＧアフィニティークロマトグラフィー（Ｒｏｃｈｅ）により、腹水からモノクローナル抗体を精製した。精製できたモノクローナル抗体を無菌ろ過し、冷蔵又は冷凍保存した。

４）モノクローナル抗体サブタイプの判定
マウス抗体サブタイプ判定キット（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、説明書に従って操作し、抗体Ａｂｒｉｎ−１はＩｇＧ２ａに属し、Ａｂｒｉｎ−２、Ａｂｒｉｎ−３、Ａｂｒｉｎ−４はＩｇＧ１サブタイプに属すことを判定した（図４）。

５）免疫ブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）方法で、抗体がトウアズキ毒素抗原のエピトープを識別することに対する判定
具体的な方法は、０．１Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）でトウアズキ毒素Ａ、Ｂ鎖のジチオ結合を還元して切断し、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ方法により抗体がトウアズキ毒素のエピトープを識別することを判定する。結果より、Ａｂｒｉｎ−１、Ａｂｒｉｎ−２、Ａｂｒｉｎ−３、Ａｂｒｉｎ−４はいずれも２６ｋＤの位置でバンドが現れたが、３４ｋＤの位置ではバンドがなかったことを見出し（図５）、これら四種類の抗体はいずれもトウアズキ毒素のＡ鎖（分子量は約３０ｋＤである）を識別したことを証明した。

６）二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ方法で抗体ペアを選別する
具体的な方法は、まず、ペルオキシダーゼＨＲＰをグルタルアルデヒド二段法又は過ヨウ素酸ナトリウム法により抗体Ａｂｒｉｎ−１に標記し、そしてＡｂｒｉｎ−２、Ａｂｒｉｎ−３、Ａｂｒｉｎ−４抗体を０．０２ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２μｇ／ｍｌまで希釈し、そして５０μｌ／穴の量で９６穴板に加え、４℃で一晩コーティングした；ＰＢＳＴで三回洗浄し、５％ＢＳＡ−ＰＢＳを加えて１時間密封した；それぞれ１００、１０、１、０．１ｎｇ／ｍｌのトウアズキ毒素及び１０ｎｇ／ｍｌのリシンを陰性対照（Ｃｔｒｌ）として加え、３７℃で１時間インキュベートした；ＰＢＳＴで三回洗浄し、１μｇ／ｍｌ濃度のＨＲＰで標記したＡｂｒｉｎ−１抗体を加えて１時間インキュベートした；ＰＢＳＴで三回洗浄し、ＴＭＢ発色基質（２００ｎｇ／ｍｌのＴＭＢ、０．０３％のＨ_２Ｏ_２、ｐＨ４．５）を加えて発色させ、５０μｌ／穴、３７℃で１５分間反応し、５０μｌ／穴２Ｍの硫酸溶液を加えて反応を終了させ、マイクロプレートリーダー４５０ｎｍで読み取った。ＥＬＩＳＡ結果からわかるように（図６）、Ａｂｒｉｎ−１とＡｂｒｉｎ−２がペアリングした後の効果が最も良い。

７）Ｆｅ_３Ｏ_４磁性ナノ粒子の調製
王水で浸漬されたビーカーにおいて、それぞれＣｏＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏを０．３ｇ、ＦｅＣｌ_３−６Ｈ_２Ｏを０．６７５ｇ、及びエチレングリコールを２０ｍＬ加え、完全に溶解するまで攪拌した；無水ＮａＡｃを１．５ｇ、ＰＡＡを０．１５ｇ加え、続いて３０分間攪拌した；反応器の中に置き２００℃で１４時間反応した；温度を下げ、中の溶液を遠心管に入れ、磁気分離して上澄みを除去し、エタノールを加えて超音波で４回洗浄し、５０−６０℃で乾燥し、調製した磁気粒子ＭＮＰｓの粒径は約３５０ｎｍ程度である（図７）。

８）磁気粒子プローブの調製
まず、ＥＤＣ−ＮＨＳ（ＥＤＣ：炭化ジイミン塩酸塩、ＮＨＳ：ヒドロキシスクシンイミド）を用いて、磁気粒子表面のカルボキシ基を活性化し、そしてトウアズキ毒素モノクローナル抗体Ａｂｒｉｎ−１を３５０ｎｍの四酸化三鉄磁性粒子にカップリングしてＭＮＰｓ＠Ａｂｒｉｎ−１を形成した。具体的なステップは以下の通りである。適量な四酸化三鉄磁性粒子を秤量し、５０ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ、ＥＤＣにそれぞれ５０μｌを加え、室温で３０分間インキュベートし、脱イオン水で洗浄し、余分なＮＨＳ／ＥＤＣを除去した。ｐＨ６．０の酢酸ナトリウム溶液を１ｍｌ加え、Ａｂｒｉｎ−１抗体を１００μｇ加え、均一に混合し、４℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳ洗浄し、ｐＨ７．４Ｔｒｉｓ−Ｃｌを５０ｍＭ加えて活性化したカルボキシ基を封じ、ＰＢＳ再懸濁し、４℃で保存した；カップリング効果はドットブロット（Ｄｏｔｂｌｏｔ）方法で検出し、即ち硝酸セルロース膜上にそれぞれ１ｍｇ／ｍｌのヒツジ抗マウス抗体、トウアズキ毒素Ａｂｒｉｎ、リシンを各々１μｌの点を打ち、乾燥した後にＭＮＰｓ＠Ａｂｒｉｎ−１溶液を加え、反応後の実験結果より、このような磁気粒子プローブはヒツジ抗マウス抗体、トウアズキ毒素Ａｂｒｉｎだけと結合し、リシンと結合しないことを示し、これは、カップリングしたＭＮＰｓ＠Ａｂｒｉｎ−１抗体プローブの特異性はとても良いことを証明した（図８）。

９）ナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー法試験片の組み立て（図２）
ａ．コーティング膜の調製：コーティング緩衝液（０．０２Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．２）でトウアズキ毒素の抗体Ａｂｒｉｎ−２、会社から購入したヒツジ抗マウス抗体（二次抗体）をそれぞれ０．５ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌに希釈し、定量噴膜装置を用いて１μｌ／ｃｍの量で順番に両者を０．８ｃｍの間隔で３．５ｃｍ幅の硝酸セルロース膜上に均一にスプレーし、テストライン（Ｔライン）抗体バンドとコントロールライン（Ｃライン）抗体バンドをそれぞれ形成した。室温で３０分間乾かしてからブロッキング溶液（０．５％ＢＳＡの０．０２ＭＰＢＳを含む、ｐＨ７．２）において１０分間浸漬した後に２５−３５℃で８時間乾燥し、乾燥剤を加えて密封保存した。

ｂ．磁気粒子プローブパッドの調製：噴膜機の専用ノズルを用いて、処理できた磁気粒子プローブ（例えば８）に調製されたもの）を５０μｌ／ｃｍの量で０．８ｃｍ幅のガラス繊維パッドに均一にスプレーし、一晩冷凍乾燥し、乾燥剤を加えて密封保存した。

ｃ．サンプルパッドの処理：１．８ｃｍ幅のサンプルパッド（親水性のガラス繊維）をサンプルパッド処理液（１−５％Ｃａｓｅｉｎ（カゼイン）、０．１−１％ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、０．０１−０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２ＭＰＢＳ、ｐＨ７．２）に浸入して１時間処理し、取り出してから２５−３５℃で８時間乾燥した。

ｄ．試験片の組み立て及び切断：３．５ｃｍコーティング膜、０．８ｃｍ磁気粒子プローブパッド、１．８ｃｍサンプルパッド、２．５ｃｍ吸水パッドを交互に２ｍｍ交差するように順次バックプレート（基板）に貼り付け（積層順番は図２に示される通りである）、透明なプラスチック密封膜を一枚被覆し、試験片板に組み立てた；ストリップカッターを用いて、組み立てられた試験片板を０．５ｃｍ幅の製品試験片に切り出す；切り出した試験片をプラスチックの低いチャックのチャック内に置き、上蓋をかけ、プレス機を用いて上下二枚のプラスチックのチャックを押しつけ、乾燥剤を加えて室温で密封保存した（上述のコーティング膜、磁気粒子プローブパッド、サンプルパッド、吸水パッドのサイズ及び交互に交差する幅は実際の必要に応じて当業者によって適宜調製できる）。

１０）サンプルを加えて検出する
マイクロピペットで、勾配濃度を有するトウアズキ毒素サンプル溶液（濃度は順に１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０ｎｇ／ｍｌである）を５０μｌ取り、検出カードにおけるサンプルパッドに加え、さらに５０μｌクロマトグラフィー緩衝液（１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ＮＰ−４０、０．０５％ＮａＮ_３、２０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．２）を加え、反応が１５分間進行するのを待った。磁気粒子にトウアズキ毒素のモノクローナル抗体Ａｂｒｉｎ−１がカップリングされているため、それはサンプル溶液におけるトウアズキ毒素と結合した後に形成された複合物は引き続き先へ移動するとき、テストライン（Ｔライン）にあるトウアズキ毒素のもう一方の抗体Ａｂｒｉｎ−２と結合して磁気粒子の集中を形成するが、トウアズキ毒素を結合しなかった磁気粒子Ａｂｒｉｎ−１抗体プローブは引き続きコントロールライン（Ｃライン）に移動して、その二次抗体と作用することによって磁気粒子の集中を形成する。

１１）酵素触媒で検出シグナルを拡大する
テストラインＴライン（Ａｂｒｉｎ−２抗体バンド）とコントロールラインＣライン（ヒツジ抗マウス抗体バンド）のところで５０μｌの発色溶液（過酸化水素Ｈ_２Ｏ_２濃度は５３０ｍＭである；ペルオキシダーゼの発色基質ジアミノベンジダイン（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＤＡＢ）濃度は８１６ｍＭである）を加え、５分間反応した；磁気粒子の過酸化物モデル酵素活性により、磁気粒子が集中するＴラインとＣラインのところで大量な茶褐色の不溶性沈殿物を生じることで、検出シグナルを拡大し、その検出感度は伝統的な金コロイド試験片検出法の１００倍である（図９に示される通りである）。

［実施例２］ナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法でインフルエンザウイルスを検出する

１）抗体源：会社から購入され、番号はＦｌｕＡ−１とＦｌｕＡ−２（生産者：ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ、商品番号：ＦｌｕＡ−１：１０００８１、ＦｌｕＡ−２：１０００８３）。

２）Ｆｅ_３Ｏ_４磁性ナノ粒子の調製は実施例１と同様である。

３）磁気粒子プローブの調製は実施例１と同様であるが、カップリングした抗体をインフルエンザウイルスの抗体ＦｌｕＡ−１に替える必要がある。

４）ナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー法試験片の組み立ては実施例１と同様であるが、テストライン（Ｔライン）にある抗体をインフルエンザウイルスの抗体ＦｌｕＡ−２に替える必要がある。

５）サンプルを加えて検出する
マイクロピペットで、勾配濃度を有するインフルエンザウイルスサンプル溶液（ウイルス価はＰＦＵで順に１．２５×１０^４、６．２５×１０^３、３．１×１０^３、１．５６×１０^３、７．８×１０^２、３．９×１０^２、１．９５×１０^２である）を５０μｌ取り、検出カードにおけるサンプルパッドに加え、さらに５０μｌクロマトグラフィー緩衝液（１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ＮＰ−４０、０．０５％ＮａＮ_３、２０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．２）を加えて、反応が１５分間進行するのを待った。磁気粒子にインフルエンザウイルスのモノクローナル抗体ＦｌｕＡ−１がカップリングされているため、それはサンプル溶液におけるインフルエンザウイルスと結合した後に形成された複合物は引き続き先へ移動するとき、テストライン（Ｔライン）にあるインフルエンザウイルスのもう一方の抗体ＦｌｕＡ−２と結合して磁気粒子の集中を形成するが、インフルエンザウイルスを結合しなかった磁気粒子ＦｌｕＡ−１抗体プローブは引き続きコントロールライン（Ｃライン）に移動して、その二次抗体と作用することによって磁気粒子の集中を形成する。

６）酵素触媒で検出シグナルを拡大する
テストラインＴライン（ＦｌｕＡ−２抗体バンド）とコントロールラインＣライン（ヒツジ抗マウス抗体バンド）のところで５０μｌの発色溶液（過酸化水素Ｈ_２Ｏ_２濃度は５３０ｍＭである；ペルオキシダーゼの発色基質ジアミノベンジダイン（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＤＡＢ）濃度は８１６ｍＭである）を加え、５分間反応した；磁気粒子の過酸化物モデル酵素活性により、磁気粒子が集中するＴラインとＣラインのところで大量な茶褐色の不溶性沈殿物を生じ、検出シグナルを拡大し、その検出感度は伝統的な金コロイド試験片検出法の８倍である（図１０に示される通りである）。

前記のように、本発明はナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法であり、この技術は磁性ナノ粒子ペルオキシダーゼ触媒活性及び磁気分離特性を一体化し、免疫クロマトグラフィーの後に過酸化物と水素供与基質、例えばｏ−フェニレンジアミン（ＤＡＢ）等を加え、磁気粒子の酵素活性により大量な茶褐色沈殿を生じることにより、検出シグナルを１０−１００倍拡大し、検出結果は目視観察により判定できるようになって、機器に対する依存性をなくした。この方法の操作ステップは簡単で、迅速であり、感度が高く、非常に現場検出での使用に適しており、粒子ペルオキシダーゼの機能、非常に広い応用可能性を有し、新規性、創造性、実用性を有する新技術である。

以上は本発明の具体的な応用範例である。これらの実施例は、本特許を説明するだけに用いられ、本発明の範囲制限するものではない。

Claims

液体サンプルにおける被測定物を検出するためのナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出方法であって、前記方法は順に以下のステップを含む：
１）磁性ナノ粒子を前記被測定物と特異的に結合できる第一分子とカップリングすることによって調製される検出プローブを提供する；
２）固定化した、前記被測定物と特異的に結合できる第二分子である捕獲プローブを提供する；
３）前記液体サンプルを前記検出プローブと接触させる；
４）前記検出プローブと接触した前記液体サンプルを前記捕獲プローブと接触させる；
５）ステップ４）を通った前記捕獲プローブに、水素供与基質と過酸化物を加え、発色反応を行う。
前記磁性ナノ粒子の粒径は１０ｎｍから５００ｎｍまでの範囲内にある請求項１に記載の方法。
前記磁性ナノ粒子はＦｅ_３Ｏ_４磁性ナノ粒子である請求項１に記載の方法。
前記被測定物はタンパク質、ポリペプチド又は核酸である請求項１に記載の方法。
前記被測定物はタンパク質であり、且つ前記第一分子と前記第二分子は前記タンパク質に対する特異性抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である請求項１に記載の方法。
前記第一分子と前記磁性ナノ粒子はＥＤＣ−ＮＨＳ法によりカップリングする請求項５に記載の方法。
前記水素供与基質は、テトラメチルベンジダイン（ＴＭＢ）、テトラメチルベンジダイン硫酸塩（ＴＭＢＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、ジアミノベンジダイン（ＤＡＢ）、ジアミノベンジダイン四塩酸（ＤＡＢ−４ＨＣｌ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、ｏ−トリジン（ＯＴ）又は２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を含む請求項１に記載の方法。
前記過酸化物は過酸化水素と過酸化尿素を含む請求項１に記載の方法。
前記液体サンプルを受け入れ、且つ前記サンプルにおける不純物をろ過するためのサンプルパッドと、
前記被測定物と特異的に結合できる第一分子とカップリングする磁性ナノ粒子を含む磁性ナノ粒子パッドと、
前記被測定物と特異的に結合できる第二分子を含むテストラインと、
吸水材料から作成され、クロマトグラフィーの動力を提供するための吸収パッドと、
いう順に基板上に設けられている各ものを含むナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出装置であって、
前記磁性ナノ粒子の粒径は、１０ｎｍから５００ｎｍまでの範囲内にあることが好ましく、
前記磁性ナノ粒子はＦｅ_３Ｏ_４磁性ナノ粒子であることが好ましく、
前記被測定物は、タンパク質、ポリペプチド又は核酸であることが好ましく、そしてより好ましくは、前記被測定物はタンパク質であって前記第一分子と前記第二分子は前記タンパク質に対する特異性抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体であり、
前記第一分子と前記磁性ナノ粒子はＥＤＣ−ＮＨＳ法によりカップリングすることが好ましく、
前記水素供与基質は、テトラメチルベンジダイン（ＴＭＢ）、テトラメチルベンジダイン硫酸塩（ＴＭＢＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、ジアミノベンジダイン（ＤＡＢ）、ジアミノベンジダイン四塩酸（ＤＡＢ−４ＨＣｌ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、ｏ−トリジン（ＯＴ）又は２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を含むことが好ましく、且つ
前記過酸化物は過酸化水素と過酸化尿素を含むことが好ましい液体サンプルにおける被測定物を検出するためのナノモデル酵素免疫クロマトグラフィー検出装置。
前記テストラインの後に、さらにコントロールラインが設けられており、前記コントロールラインには前記第一分子と特異的に結合できる第三分子が固定されている請求項９に記載の検出装置。