JP2001074740A - 免疫クロマトグラフ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】粒子の凝集および非特異的な発色が抑制され、
かつ高感度な免疫クロマトグラフ法およびそれを可能に
する免疫クロマトグラフ用キットを提供すること。 【解決手段】ペルオキシダーゼを使用する酵素免疫測定
において、塩基の存在下に酵素免疫測定を行なう免疫ク
ロマトグラフ法並びに塩基を配合した発色基質溶液及び
／又は塩基を配合した洗浄液を含有してなる免疫クロマ
トグラフ用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、高感度な免疫クロ
マトグラフ法および該免疫クロマトグラフ法を可能にす
る免疫クロマトグラフ用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素発色を利用した免疫測定法は、抗体
などの免疫成分の標識に用いられた酵素とその発色基質
成分との反応によりシグナルを増幅させ、高感度な測定
を可能としている。酵素標識免疫成分として酵素標識抗
体が一般的に知られているが、さらに高感度化を実現す
るために、水分散性高分子粒子を酵素、抗体等の担体と
する酵素標識特異的結合体を利用した免疫クロマトグラ
フ法が開発されている。この場合、酵素として、ペルオ
キシダーゼを用いる場合、該ペルオキシダーゼの至適ｐ
Ｈが酸性側にあるため、発色基質溶液等の展開溶液を酸
性にする必要があるが、ペルオキシダーゼ標識特異的結
合体を含む溶液と酸性の発色基質溶液とを接触させた場
合、酸性条件下では、該粒子の凝集または非特異的な発
色を引き起こし、測定が困難になる場合がある。そこ
で、水分散性高分子粒子の凝集または非特異的な発色を
抑制するため、中性〜アルカリ性の条件下に前記標識特
異的結合体と発色基質溶液とを接触させることが必要と
なる。

【０００３】しかしながら、中性〜アルカリ性の条件下
では、ペルオキシダーゼの活性が低下するため、被検物
質の検出が困難になる場合がある。したがって、粒子の
凝集および非特異的な発色を抑制し、かつ高感度な検出
を可能にする技術が求められている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、粒子の凝集
および非特異的な発色が抑制され、かつ高感度な免疫ク
ロマトグラフ法およびそれを可能にする免疫クロマトグ
ラフ用キットを提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、〔１〕
ペルオキシダーゼを使用する酵素免疫測定において、
塩基の存在下に酵素免疫測定を行なう免疫クロマトグラ
フ法、並びに〔２〕 塩基を配合してなる発色基質溶液
及び／又は塩基を配合してなる洗浄液を含有してなる免
疫クロマトグラフ用キット、に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の免疫クロマトグラフ法
は、ペルオキシダーゼを使用する酵素免疫測定におい
て、塩基の存在下に行なうことを１つの特徴とする。本
発明の免疫クロマトグラフ法においては、ペルオキシダ
ーゼを使用する酵素免疫測定において、塩基を配合した
発色基質溶液や塩基を配合した洗浄液などを用いること
により、中性〜アルカリ性条件下においても、該ペルオ
キシダーゼの活性を常に発揮させることができるため、
高ｐＨの発色基質溶液を用いることができ、それによ
り、粒子の凝集および非特異的な発色が抑制され、かつ
高感度な被検物質の検出を可能にする。ペルオキシダー
ゼの活性が高ｐＨ下で活性が低下するのは、ペルオキシ
ダーゼの活性中心に存在するヒスチジン残基のプロトン
授受が高ｐＨで支障をきたし、基質への電子供与が低下
することに起因すると思われるが、本発明ではペルオキ
シダーゼの活性の向上は、塩基の存在により該ペルオキ
シダーゼの活性中心のヒスチジン残基による基質への電
子供与を安定化するためであると推定される。

【０００７】免疫クロマトグラフ法とは、例えば、以下
のような工程を含む方法をいうが、かかる方法に限定さ
れない。すなわち、被検物質に対する特異的結合物質
（例えば、抗体など）を固定化した固定相を有する吸水
性基材からなる試験片の一端より、該被検物質に特異的
に結合し得る特異的結合物質（本発明においては、ペル
オキシダーゼ標識特異的結合体）と被検液との混合物を
吸収させて展開すると、該混合物中で形成された複合体
（被検物質−ペルオキシダーゼ標識特異的結合体）は固
定相に固定化された特異的結合物質と結合して捕捉され
る。したがって、固定相に結合した複合体中のペルオキ
シダーゼ標識特異的結合体の酵素反応により生じる色素
を測定することにより被検液中の被検物質の検出を行な
うことができる。

【０００８】本発明において塩基を配合するのは、発色
基質溶液、洗浄液、被検液、ペルオキシダーゼ標識特異
的結合体を含有する液体などのいずれでもよく、酵素免
疫測定時に反応系内に塩基が存在するような態様であれ
ば特に限定されない。なかでも所望の濃度に予め調製す
るのが容易であるという点から発色基質溶液や洗浄液に
塩基を配合するのが好ましい。従って、さらに本発明は
塩基を配合してなる発色基質溶液及び／又は塩基を配合
してなる洗浄液を含有してなる免疫クロマトグラフ用キ
ットを提供するものである。

【０００９】塩基としては、塩基性窒素を有する化合物
であればよく、例えばイミダゾール、２−メチルイミダ
ゾール、４−アミノピリジンが挙げられる。かかる塩基
は、ペルオキシダーゼ反応を阻害しないものであれば、
単独でまたは２種以上を混合して用いてもよい。本発明
においては、イミダゾール、２−メチルイミダゾールお
よび４−アミノピリジンからなる群より選ばれた少なく
とも１種が好ましい。

【００１０】塩基の配合量は、０．０００１〜５Ｍ、好
ましくは０．０００５〜１Ｍであることが望ましい。

【００１１】塩基を配合してなる発色基質溶液として
は、前記の塩基を含有し、ペルオキシダーゼの発色基
質、緩衝成分などを含有する溶液である。ペルオキシダ
ーゼの発色基質は、検出可能な基質であればよく、具体
的には、過酸化水素と、２，２’−アジノ−ビス（３−
エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸、ｏ−フェニ
レンジアミン、３，３’，５，５’−テトラメチルベン
ジジン、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリサイクリッ
クアシッド、３，３’−ジアミノベンジシン、３−アミ
ノ−９−エチルカルバゾール、４−クロロ−１−ナフト
ール等の化合物との組合せが挙げられる。本発明におい
ては、前記発色基質は、検出感度や発色性の観点から、
ベンジジン誘導体が好ましく、３，３’，５，５’−テ
トラメチルベンジジンが特に好ましい。発色基質溶液に
おける発色基質の濃度は、特に限定されるものではない
が、０．１〜０．５重量％、好ましくは０．２重量％前
後の濃度が望ましい。

【００１２】発色基質溶液における緩衝成分としては、
標識特異的結合体のペルオキシダーゼとの接触の際に、
標識特異的結合体に用いる担体の凝集の抑制および／ま
たはペルオキシダーゼ活性の発現に適するｐＨに維持し
うる成分であればよい。発色基質溶液における緩衝液と
しては、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝
液、トリス塩酸緩衝液、イミダゾール緩衝液などが挙げ
られる。

【００１３】発色基質溶液における緩衝成分の濃度は、
特に限定されるものではないが、０．００１〜０．５Ｍ
程度が好ましい。

【００１４】塩基を配合してなる洗浄液としては、前記
の塩基を含有する緩衝液等が使用される。緩衝液の具体
例としては上述に例示のものが使用される。

【００１５】本発明の免疫クロマトグラフ法により検出
されうる被検物質としては、免疫化学的反応（すなわち
抗原抗体反応）により、該被検物質に対する特異的結合
物質と結合してサンドイッチ免疫複合体を形成し得るも
のであれば特に制限されない。例えば、細菌（特に大腸
菌Ｏ−１５７、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌等の病原
性細菌）、放線菌、酵母、かび、ウイルス（特に、ＨＩ
Ｖ、ＨＢＶ、ＨＣＶ等）などの微生物またはそれらに対
する抗体、細菌等が産生する毒素、あるいは腫瘍マーカ
ー抗原などの生体試料中の抗原性ペプチドなどが挙げら
れる。

【００１６】本発明に用いられるペルオキシダーゼは、
過酸化水素やｍ−クロロ過安息香酸、過酢酸などの過酸
化物を基質として有機化合物を酸化させるものであれば
よく、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、大豆ペル
オキシダーゼ、モミガラペルオキシダーゼ等が挙げら
れ、西洋ワサビペルオキシダーゼが好ましい。

【００１７】本発明の免疫クロマトグラフ法において、
ペルオキシダーゼは、前記被検物質に対する特異的結合
物質を有する担体からなる標識特異的結合体に固定され
る。

【００１８】前記標識特異的結合体において、担体とし
て、水分散性高分子粒子が用いられる。水分散性高分子
粒子は、前記特異的結合物質、ペルオキシダーゼなどを
固定できる物質であればよい。前記水分散性高分子粒子
は、不飽和二重結合を有する少なくとも１種の単量体の
乳化重合によって調製される。かかる単量体としては、
例えば、エチレン、プロピレンなどのオレフィン系単量
体、酢酸ビニル、塩化ビニルなどのビニル系単量体、ス
チレン、メチルスチレン、クロロスチレンなどのスチレ
ン系単量体、アクリル酸メチルなどのメタクリル酸エス
テル系単量体、ブタジエンなどのジエン系単量体などが
挙げられる。

【００１９】本発明に用いる水分散性高分子粒子は、単
量体の単独重合体または共重合体に改質用単量体を共重
合して得られた重合体でもよい。このような改質用単量
体としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、２，
２，２−トリフルオロエチルメチルメタクリレートなど
のフッ素化メタクリル酸エステル、アクリロニトリル、
メタクリロニトリル、アクリルアミド、スチレンスルホ
ン酸ナトリウム、スルホプロピル（メタ）アクリレート
ナトリウム塩、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、２−ヒド
ロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタ
クリレート、グリシジルメタクリレートなどが挙げられ
る。

【００２０】また本発明においては、市販されている水
分散性高分子粒子でもよい。市販されている水分散性高
分子粒子としては、例えば、スチレン−ブタジエン共重
合体、スチレン−アクリロニトリル−ブタジエン共重合
体などの種々のスチレン共重合体からなるエマルジョン
などのスチレンまたはその誘導体を単量体成分とする単
独重合体や共重合体のエマルジョン；（メタ）アクリル
酸の長鎖アルキルエステルまたはその誘導体を単量体成
分とする単独重合体、該単量体成分と（メタ）アクリル
酸メチルやエチル、グリシジル（メタ）アクリレートな
どとの共重合体；前記したスチレンまたはその誘導体
と、（メタ）アクリレートエステルやその誘導体との共
重合体；ゴム；ナイロン；ポリウレタン；微結晶質セル
ロースなどが挙げられる。本発明においては、ラテック
ス粒子が好ましい。

【００２１】個々の単量体の具体的な種類は、得られる
水分散性高分子粒子を特異的結合物質とともにペルオキ
シダーゼを固定して用いる場合に、その使用時や保存時
に融着、凝集を起こさないように、当該水分散性高分子
粒子が所要のガラス転移点を有するように選ばれる。水
分散性高分子粒子のガラス転移点は、好ましくは１０℃
以上、特に室温以上が好ましい。

【００２２】前記水分散性高分子粒子の平均粒子径は、
水性媒体中における粒子の分散性および沈降抑制を十分
に発揮する観点ならびに特異的結合物質およびペルオキ
シダーゼの固定を十分に行なう観点から、好ましくは３
μｍ以下、さらに好ましくは２μｍ以下であり、固定後
の当該粒子の精製が容易となるようにする観点から、好
ましくは０．０１μｍ以上、さらに好ましくは０．１μ
ｍ以上である。

【００２３】特異的結合物質としては、被検物質に特異
的に結合する物質であればよく、例えば、抗原、ハプテ
ン、抗体、オリゴヌクレオチド、エフェクター、レセプ
ター、酵素、酵素補助因子、酵素阻害剤などが挙げられ
る。前記特異的結合物質は、検査すべき被検物質に応じ
て、サンドイッチ法等の通常の検出方法で用いられる公
知の物質を少なくとも１種選択すればよい。本発明にお
いては、抗原、ハプテン、抗体が好ましい。即ち、水分
散性高分子粒子の表面に抗原、ハプテンおよび抗体から
なる群より選ばれた１種を有し、ペルオキシダーゼによ
る標識を有する複合体をペルオキシダーゼ標識特異的結
合体として用いるのが好ましい。なお、被検物質が、核
酸の場合、核酸を除く特異的結合物質が用いられる。

【００２４】前記特異的結合物質が抗原またはハプテン
の場合、当該抗原およびハプテンとしてはクラミジア・
トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・
ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキ
ソプラズマ・ゴンディ、ボレリア等の各種微生物抗原、
マイコプラズマ脂質抗原、ＨＡ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢ
ｅ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原および前
記抗原に由来するハプテン等が挙げられる。

【００２５】前記特異的結合物質が抗体の場合、当該抗
体としてはモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を
使用することができる。具体的には、抗大腸菌抗体、抗
大腸菌Ｏ１５７抗体、抗サルモネラ菌抗体、抗ブドウ球
菌抗体、抗カンピロバクター菌抗体、抗ウェルシュ菌抗
体、抗腸炎ビブリオ菌抗体、抗ベロトキシン抗体、抗ヒ
トトランスフェリン抗体、抗ヒトアルブミン抗体、抗ヒ
ト免疫グロブリン抗体、抗マイクログロブリン抗体、抗
ＣＲＰ抗体、抗トロポニン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗クラ
ミジア・トラコマティス抗体、抗ストレプトリジンＯ抗
体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗β−グルカン抗
体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗アデノウイルス抗
体、抗ＨＩＶ抗体、抗ロタウイルス抗体、抗ＲＦ抗体等
が挙げられる。

【００２６】前記特異的結合物質が核酸の場合、当該オ
リゴヌクレオチドとしては、前記抗原として例示された
各種微生物、マイコプラズマ、各種ウイルスに由来する
核酸成分に相補的なオリゴヌクレオチド等が挙げられ
る。

【００２７】本発明において用いられる水分散性高分子
粒子に特異的結合物質およびペルオキシダーゼを固定す
る方法としては、疎水結合（物理的吸着）、イオン結
合、共有結合等が利用できる。安定性の観点から、共有
結合により強力に固定することが好ましい。

【００２８】また、本発明においては、水分散性高分子
粒子に特異的結合物質およびペルオキシダーゼを共有結
合によって結合する際に、必要に応じて、特異的結合物
質およびペルオキシダーゼの当該高分子粒子上での自由
度を高めるために、スペーサー基を介在させることがで
きる。スペーサー基は、予め水分散性高分子粒子に結合
させた後、特異的結合物質およびペルオキシダーゼと結
合させてもよく、予め特異的結合物質およびペルオキシ
ダーゼに結合させ、これを水分散性高分子粒子に結合さ
せてもよい。更に、必要に応じて、水分散性高分子粒
子、特異的結合物質およびペルオキシダーゼの全てに予
めスペーサー基を結合させ、これらを相互に結合させる
こともできる。

【００２９】１種類の特異的結合物質を固定する場合に
加え、必要に応じて、数種類の被検物質とそれぞれ特異
的に結合する数種類の特異的結合物質を混合して固定す
ることも可能である。

【００３０】ペルオキシダーゼ標識特異的結合体中に含
まれる特異的結合物質とペルオキシダーゼの総固定量
は、上記の範囲内で使用する特異的結合物質やペルオキ
シダーゼの種類、活性の程度等によって適宜変更し得
る。前記特異的結合物質とペルオキシダーゼの総固定量
は、水分散性高分子粒子の乾燥重量１ｇあたり２００ｍ
ｇ以下が好ましく、さらに好ましくは１５０ｍｇ以下で
あり、被検物質の検出の迅速性、感度および再現性の観
点から、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ以上がさらに
好ましい。

【００３１】ここで、水分散性高分子粒子の「乾燥重
量」とは、一定量の水分散性高分子粒子を１２０℃で２
時間乾燥した後の重量をいう。

【００３２】ペルオキシダーゼの固定量は、特異的結合
物質１モルあたり０．６モル以上が好ましく、当該水分
散性高分子粒子の表面積との関係およびバックグランド
を低くするという観点から、６０モル以下が好ましい。

【００３３】なお、特異的結合物質およびペルオキシダ
ーゼの固定量の測定は、色素結合法等を用いて測定し、
タンパク質の量として算出する。特異的結合物質がオリ
ゴヌクレオチドの場合は、固定後の遊離のオリゴヌクレ
オチドを２６０ｎｍの吸光度を測定することにより算出
する。

【００３４】水分散性高分子粒子におけるペルオキシダ
ーゼの量は、酵素活性としても表すことができる。酵素
活性として表されるペルオキシダーゼの量は、ペルオキ
シダーゼの種類、基質、温度等の条件によって異なる。
水分散性高分子粒子中のペルオキシダーゼの活性は、例
えば、以下のように測定することができる：基質であ
る、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジン）０．２ｍｇ／ｍｌと過酸化水素０．０１％を含む
０．１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）３．３ｍｌ中
に、ペルオキシダーゼ標識特異的結合体０．０１２５％
懸濁液を１００μｌ混合して、２５℃で反応、５８０ｎ
ｍの波長での吸光度を経時的に測定し、１分間に当該吸
光度を１増加させる酵素活性を１Ｕ（ユニット）として
換算する。

【００３５】ペルオキシダーゼ標識特異的結合体が、水
分散性高分子粒子の乾燥重量１ｇあたり、５，０００〜
３００，０００Ｕ、好ましくは１０，０００〜３００，
０００Ｕ、より好ましくは５０，０００〜３００，００
０Ｕの酵素活性を有するように当該ペルオキシダーゼが
固定されていることが望ましい。

【００３６】本発明の免疫クロマトグラフ法において
は、発色基質溶液、ペルオキシダーゼ標識特異的結合
体、被検物質等の展開に際して、吸水性基材からなる試
験片が用いられる。

【００３７】本発明において用いる吸水性基材は、被検
液を吸収できる基材、またはこれらを緩衝液によって希
釈した希釈液を吸収する基材であれば特に限定されな
い。本発明においては、被検液中の被検物質が特異的結
合物質や後述の固定相の特異的結合物質と充分な反応を
行うための時間を確保できるような吸水性基材が用いら
れる。好ましい具体例としては、適度な吸水速度を有す
る観点から、例えば、不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガ
ラスフィルター、ニトロセルロース、多孔質材料等が挙
げられる。

【００３８】吸水性基材の吸水性の程度は、５ｍｍ幅の
短冊状に裁断した吸水性基材の片端部に水を浸漬し、１
分間経過後の吸水距離が０．５〜５ｃｍ程度のものが好
ましい。親水性重合体を使用して吸水性基材の吸水性を
調整することもできる。

【００３９】本発明において、吸水性基材の形状は、被
検液を展開できる形状であれば特に限定されるものでは
なく、例えば、矩形のシート状（片状）やロッド状等が
好ましい。

【００４０】本発明において、前記試験片には、被検物
質−標識特異的結合体の複合体を捕捉する固定相を設け
ることができる。

【００４１】固定相には、前記特異的結合物質と同様
に、抗体、抗原、ハプテンおよびオリゴヌクレオチドか
らなる群より選ばれた少なくとも１種が用いられ、かか
る固定相は、該特異的結合物質に応じて適宜選択され
る。

【００４２】例えば、標識特異的結合体中の特異的結合
物質が抗体の場合、固定相には、同じ抗体または同一抗
原の別のエピトープを認識する抗体を使用することがで
きる。標識特異的結合体中の特異的結合物質が抗原やハ
プテンの場合、固定相には、同一の抗原、ハプテンある
いは標識特異的結合体中の特異的結合物質とは異なるが
被検物質と特異的に結合する抗原、抗体、ハプテンなど
が用いられる。

【００４３】固定相は、公知の物理吸着法、共有結合法
などにより作製されうる。また、固定相に使用する特異
的結合物質と親水性重合体とを含む溶液を吸水性基材に
塗布した後、該親水性重合体を凝固させる凝固溶剤に浸
漬することで固定相を作製することもできる。親水性重
合体としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、
ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロースな
どが挙げられる。凝固溶剤としては、アセトン、エタノ
ール、メタノール、エーテルなどが挙げられる。

【００４４】固定相は、被検液の吸液によって展開し移
動してきた複合体を捕捉するために、吸水性基材上に特
異的結合物質を好ましくは０．００５〜５ｍｇ／ｃｍ²
になるように塗布することが望ましい。

【００４５】固定後の吸水性基材は、不用なタンパク質
の基材への非特異的吸着の防止、展開の容易性、特異的
結合物質の安定性の観点から、慣用のブロッキング剤、
界面活性剤および糖を含有する溶液で処理されることが
好ましい。

【００４６】本発明に用いられる試験片は、適宜、試料
受領部、前記標識特異的結合体を展開できるように固定
させた標識相を有する試験片であってもよい。

【００４７】前記標識相を有する試験片の場合、標識特
異的結合体を固定させる方法としては、例えば、標識特
異的結合体の溶液を吸水性基材に塗布したのち、適当な
条件にて乾燥させる方法が挙げられる。

【００４８】前記ペルオキシダーゼ標識特異的結合体の
溶液として、水溶性重合体またはサッカロースを含有し
た溶液を用いることにより、液体成分と接触したとき
に、ペルオキシダーゼ標識特異的結合体を速やかに基材
から脱離させうる。水溶性重合体としては、例えばポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレ
ングリコール、セルロースエーテル（例えば、メチルセ
ルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ース、カルボキシエチルセルロース、オキシエチルセル
ロース、シアノエチルセルロース）、ゼラチンなどが好
ましい。

【００４９】標識相を有する（即ち、ペルオキシダーゼ
標識特異的結合体を固定した）吸水性基材を用いること
により、吸水性基材上での展開中に被検物質を含有する
被検液とペルオキシダーゼ標識特異的結合体を接触させ
ることにより複合体を形成させることができる。

【００５０】標識相に固定させるペルオキシダーゼ標識
特異的結合体の量は、例えば、０．５〜５０μｇである
ことが望ましい。

【００５１】また、本発明に用いられる試験片におい
て、展開移動距離は、固定相での発色の均一性および発
色感度の観点から、０．５ｃｍ以上、好ましくは１ｃｍ
以上となり、固定相までの被検液の到達性、発色感度お
よび測定時間の観点から、６ｃｍ以下、好ましくは４ｃ
ｍ以下となるように設定されていることが好ましい。本
発明に用いる試験片は、前記展開移動距離を得るよう
に、試料受領部、固定相などを配置すればよい。

【００５２】以下、本発明の免疫クロマトグラフ法の一
例を挙げる。 （１） ペルオキシダーゼ標識特異的結合体と被検物質
との複合体を形成させ、吸水性基材に展開する工程 ペルオキシダーゼ標識特異的結合体と被検物質との複合
体は、ペルオキシダーゼ標識特異的結合体を含有する液
体を用いて吸水性基材に展開する前に予め形成させても
よいし、吸水性基材での展開中に被検物質を含有した被
検液とペルオキシダーゼ標識特異的結合体を含有する液
体とを接触させることにより吸水性基材上で複合体を形
成させてもよい。

【００５３】展開方法としては、吸水性基材の一端側か
ら、上記の方法で調製した複合体の溶液を加え、毛細管
現象によって自然展開させる。また、試料受領部の反対
端に吸水パッドを設けることによって吸水性基材中を展
開する液体成分を吸収するので展開が容易に進行する。

【００５４】また、吸水性基材上にペルオキシダーゼ標
識特異的結合体を有する場合、標識相の上流または同じ
箇所に位置する試料受領部へ被検物質溶液を添加する。
また、被検物質を試料受領部に直接塗布する場合は、試
料受領部へ被検物質を溶解しうる溶媒を添加する。溶液
は吸水性基材中を毛細管現象によって展開する。

【００５５】（２） 被検物質に対する特異的結合物質
を含む固定相にて、工程（１）の複合体を捕捉する工程 工程（２）においては、被検物質に対する特異的結合物
質を固定した吸水性基材上の固定相により工程（１）の
複合体を捕捉する。

【００５６】複数の被検物質を同時に検出する場合に
は、各被検物質に対応する固定相をそれぞれ設ければよ
い。

【００５７】（３） 発色基質溶液を展開し、捕捉した
複合体を検出する工程 工程（３）においては、発色基質溶液を展開させる。展
開時間は、発色基質がペルオキシダーゼ標識特異的結合
体−被検物質の複合体と反応して発色するに十分な時間
であればよい。

【００５８】また、工程（３）においては、標識に用い
たペルオキシダーゼの反応に十分な反応温度で展開する
ことが好ましい。

【００５９】また、発色基質溶液の使用量は、吸水性基
材上の固定相へ到達して複合体と反応し、発色するのに
充分な量であればよい。

【００６０】洗浄液は被検物質と未結合のペルオキシダ
ーゼ標識特異的結合体を除去する際に使用される。

【００６１】本発明の免疫クロマトグラフ法において
は、上記工程における発色基質溶液、洗浄液、被検液、
ペルオキシダーゼ標識特異的結合体を含有する液体など
の１以上の液体に塩基が配合されており、塩基の存在下
での酵素免疫測定を行なうため、高感度で、かつ非特異
的発色が抑制された免疫クロマトグラフ法を可能にす
る。

【００６２】

【実施例】実施例１〜３ 発色基質溶液の調製 ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）溶液〔ＫＰＬ社製、商品名：TMB membrane peroxid
ase substrate kit 〕５ｍｌと、前記TMB membrane per
oxidase substrate kit のＥｎｈａｎｃｅｒ １ｍｌ
と、過酸化水素〔０．１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）中０．００２％〕５ｍｌとを混合し、ついで、得ら
れた混合物にイミダゾールを０．００１Ｍ、０．０１Ｍ
および０．１Ｍの各濃度になるように添加し、発色基質
溶液（それぞれ実施例１〜３）を調製した。

【００６３】比較例１ 実施例１〜３において、イミダゾールを無添加にした他
は、同様に調製した。

【００６４】調製例１ 標識特異的結合体の作製 １）水分散性高分子粒子懸濁液の作製 スチレン５０ｇ、アクリル酸０．５ｇ、トリエチレング
リコールジメタクリレート０．２ｇ、蒸留水４４０ｇか
らなる混合液を窒素ガス雰囲気下で７５℃に維持、攪拌
しながら、重合開始剤としての過硫酸カリウム０．２５
ｇを蒸留水１０ｇに溶解した水溶液を加え、１０時間重
合を行った。その結果、カルボキシル化された水分散性
高分子粒子としてカルボキシル化ポリスチレンラテック
ス粒子（平均粒子径：約０．２μｍ）を得た。得られた
カルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子を０．０１
Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）に固形分濃度が５重量
％になるように分散した。

【００６５】２）固定化 前記１）で得たラテックス粒子懸濁液３ｍｌに、水溶性
カルボジイミド〔DOJIN 社製、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１０
ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
２）〕０．６ｍｌ、抗ベロトキシン１型（以下、ＶＴ１
という）マウスモノクロナール抗体〔トキシンテクノロ
ジー社製、５ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．２）〕２．１ｍｌを加えて１０℃で３時間反
応させた後、洗浄液として０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐ
Ｈ８．２を用いて遠心分離洗浄を行った。同緩衝液で固
形分濃度５重量％に調整し、抗体固定化ラテックス粒子
の分散液を得た。

【００６６】ついで、上記で作製した、抗体固定化ラテ
ックス粒子の分散液３ｍｌに、水溶性カルボジイミド
（DOJIN 社製、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍｌ、
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．２）１ｍｌ、西洋ワ
サビ由来ペルオキシダーゼ〔以下ＨＲＰと略す；和光純
薬社製、１２ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．２）〕２ｍｌを加えて１０℃で３時間反応さ
せたのち、洗浄液として０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．２）を用いて遠心分離洗浄を行い、同緩衝液で固
形分濃度０．００３１重量％に調整し、ＨＲＰおよび抗
ＶＴ１抗体を固定化した標識特異的結合体の分散液を得
た。

【００６７】標識特異的結合体について、抗体（分子量
約１６万）の固定量は２．５ｍｇ、酵素（分子量約４
万）の固定量は２０ｍｇであった。また、この結果より
抗体１分子あたりの酵素数を算出すると、３．２分子で
あった。また、標識特異的結合体ペルオキシダーゼ活性
は、５８０ｎｍにおける吸光度を１分間に１上昇させる
活性を１Ｕ（ユニット）と定義して、ラテックス粒子の
乾燥重量１ｇあたり４３，３００Ｕであった。

【００６８】調製例２：免疫クロマトグラフ型試験片の
作製 ニトロセルロースメンブレン（孔径８μｍ、６ｍｍ×６
０ｍｍ）の一端から３０ｍｍの箇所に抗ＶＴ１抗体（１
ｍｇ／ｍｌ、ホウ酸緩衝液ｐＨ８．２）を１．５μｌ、
ディスペンサーを用いてライン状（幅１ｍｍ）に塗布し
た（固定相）。

【００６９】このメンブレンをウシ血清アルブミン（オ
リエンタル酵母社製、１重量％）およびポリオキシエチ
レン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業
社製、０．１重量％）、サッカロース（和光純薬工業社
製、１重量％）からなる水溶液中に１０分間浸漬させて
のち、４０℃で２時間乾燥させた。次いで、このメンブ
レンの裏側（抗体塗布面の反対側）にポリエステルフィ
ルム（１００μｍ厚）をスプレー糊を用いて貼り合わせ
た。

【００７０】抗体塗布箇所から２４〜３０ｍｍの箇所に
ポリエステル製不織布（６ｍｍ×６ｍｍ、厚さ１ｍｍ）
を貼り合わせ、試料受領部を作製した。また、抗体塗布
箇所の上流側５〜１１ｍｍの箇所にポリエステル製不織
布（６ｍｍ×６ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を貼り合わせ、発色
基質溶液受領部を作製した。

【００７１】さらに、抗体塗布箇所の下流側１０〜３０
ｍｍの箇所にガラス繊維製吸水材（１５ｍｍ×３０ｍ
ｍ、厚さ１ｍｍ）を貼り合わせた。

【００７２】実験例 ０．１Ｍリン酸緩衝液（０．９重量％ＮａＣｌ含有、ｐ
Ｈ７．４）に、ＶＴ１を５、１および０ｎｇ／ｍｌとな
るように溶解し、それぞれの被検試料を調製した。

【００７３】前記各被検試料１００μｌに、それぞれ標
識特異的結合体が０．０６重量％となるように、調製例
１で得た標識特異的結合体の分散液を混合した。得られ
た各混合液６０μｌを、調製例２で得た試験片の試料受
領部にそれぞれ供し、５分間展開した。ついで、洗浄用
緩衝液〔組成：０．２Ｍ−塩化アンモニウム緩衝液＋
０．９重量％ＮａＣｌ（ｐＨ８．２）〕６０μｌを試料
受領部に供した。５分間展開させた後、各試験片のそれ
ぞれの発色基質溶液受領部に実施例１〜３および比較例
１で調製した発色基質溶液６０μｌを供し、１５分間展
開させた。展開後、それぞれの試験片の固定相における
発色の有無を目視観察した。結果を表１に示す。なお、
判定基準は、以下の通りである。

【００７４】対照および被検試料を用いた測定 ＋：固定相に発色が見られる −：固定相に発色が見られない

【００７５】

【表１】

【００７６】イミダゾール濃度０．００１、０．０１Ｍ
および０．１Ｍの発色基質溶液を用いた場合、１ｎｇ／
ｍｌのＶＴ１濃度の被検試料においても良好に検出でき
た。また、標識特異的結合体の凝集は観察されなかっ
た。

【００７７】一方、イミダゾール濃度０Ｍの発色基質溶
液を用いた場合、ペルオキシダーゼによる基質の発色の
確認が困難であり、１ｎｇ／ｍｌのＶＴ１濃度の被検試
料は検出できなかった。

【００７８】尚、イミダゾール濃度０Ｍの発色基質溶液
を用い、イミダゾール濃度０．００１、０．０１および
０．１Ｍの洗浄用緩衝液をそれぞれ用いて実施例１〜３
の発色基質溶液を用いた場合と同様に行なう実験によ
り、同様の結果が得られる。

【００７９】

【発明の効果】本発明の免疫クロマトグラフ法によれ
ば、ペルオキシダーゼを使用する酵素免疫測定におい
て、塩基を配合した発色基質溶液や洗浄液などを用いる
ことにより、中性〜アルカリ性条件下においても該ペル
オキシダーゼの活性を向上させるため、粒子の凝集およ
び非特異的な発色が抑制され、かつ高感度な被検物質の
検出を可能にするという優れた効果を奏する。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペルオキシダーゼを使用する酵素免疫測
   定において、塩基の存在下に酵素免疫測定を行なう免疫
   クロマトグラフ法。
2. 【請求項２】 塩基を配合した発色基質溶液及び／又は
   塩基を配合した洗浄液を用いる請求項１記載の免疫クロ
   マトグラフ法。
3. 【請求項３】 塩基が、イミダゾール、２−メチルイミ
   ダゾールおよび４−アミノピリジンからなる群より選ば
   れた少なくとも１種である請求項１又は２記載の免疫ク
   ロマトグラフ法。
4. 【請求項４】 塩基を配合してなる発色基質溶液及び／
   又は塩基を配合してなる洗浄液を含有してなる免疫クロ
   マトグラフ用キット。
5. 【請求項５】 塩基が、イミダゾール、２−メチルイミ
   ダゾールおよび４−アミノピリジンからなる群より選ば
   れた少なくとも１種である請求項４記載の免疫クロマト
   グラフ用キット。