CN201302571Y - 人血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及一种人血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒,其是试纸条由在塑料支撑板一端搭接上样垫,上样垫的一端搭接含有标记抗人血清铁蛋白抗体有纳米免疫磁珠垫,在磁珠垫的一端搭接硝酸纤维素NC膜,NC膜包被有相互分离的检测线T线和质控线C线,T线为配对的铁蛋白抗体,C线为抗鼠IgG,NC膜另一端搭接吸样垫组成试纸条,试纸条装入两个上角为圆弧形状的长条形状的盒盖、盒底构成的试剂盒中构成,检测时将被检样品加在上样垫上,然后在规定的时间内用磁力检测仪检测试纸条上数据,根据所读取的数据判定结果,用于铁蛋白检测,具有灵敏度高、特异性强、检测快速、操作简便、适合现场检测和实时记录保存结果等优点。
Description
技术领域
本实用新型是涉及生物应用技术领域,特别是涉及一种以纳米免疫磁珠技术检测人血清铁蛋白的免疫层析快速诊断试剂-人血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒。
背景技术
血清铁蛋白(Serum ferritin,SF),是一种贮藏铁的蛋白质,正常情况下微量存在于血液中,其含量是判定体内缺铁及铁负荷过多的有效指标。铁蛋白在内质网合成,具有L、H两种亚基,由24个亚基组成一个中空的蛋白外壳,中间为容纳铁离子的腔,每个铁蛋白最多可携带4000个铁离子。研究表明,血清铁蛋白含量变化直接反应机体的贮铁状态,正常的情况下,血清中每1ng/ml的铁蛋白,约相当于身体8~10mg之铁蛋白贮存量。血清铁蛋的含量男女存在差异,正常值参考值一般定义为男性:15~200ng/ml,女性:12~150ng/ml,儿童:7~140ng/ml。由于检测方法的不同和地区差异,参考值略有变化。
铁蛋白含量减少是机体缺铁性贫血的最重要的指标,但一般低于30ng/ml则有缺铁性贫血的倾向,需要相应的铁补充。缺铁性贫血是妇女和儿童常见的疾病。血清铁蛋白增高也是机体异常的表现,血清铁蛋在肝细胞中大量合成,而循环中的铁蛋被白肝细胞吸收清除,所以肝细胞异常会造成血清铁蛋白增高,肝炎,特别是原发性肝癌常表现为血清铁蛋白异常增高。此外肺癌、胰癌、白血病等时,癌细胞合成的铁蛋白增加,使血清铁蛋白升高。当铁蛋白含量大于300ng/ml时应考虑是否患有以上疾病。
20世纪70年代起在临床诊断上就开始进行血清铁蛋白的检测,目前主要的诊断方法为酶联免疫法ELISA或化学发光法等技术进行检测。
纳米免疫磁珠快速检测试剂是一新型的检测方法。纳米免疫磁珠是含有铁元素的超顺磁纳米颗粒,外面包覆着聚乙烯类高分子物质,并可带有羧基或氨基,用于和蛋白质分子偶联。纳米免疫磁珠和蛋白偶联后,可以制备成免疫层析类诊断试剂,并运用专用的微量磁性物质的检测仪MICT进行检验,具有具有检测快速、操作简便、适合现场检测和实时记录保存结果等优点。运用纳米免疫磁珠进行血清铁蛋白的检测试剂尚未有报道。
发明内容
本实用新型是提供一种检测快速、操作简便、适合现场检测和实时记录保存结果的人血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒,技术方案如下:
一种人血清铁蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒10,其特征是试纸条9由在塑料支撑板7一端搭接上样垫1,上样垫1的一端搭接含有标记抗人血清铁蛋白抗体有纳米免疫磁珠垫2,在磁珠垫2的一端搭接硝酸纤维素NC膜3,NC膜3包被有相互分离的检测线T5和质控线C6,T线为配对的铁蛋白抗体,C线为抗鼠IgG,NC膜3另一端搭接吸样垫4组成,将试纸条9装入两个上角为圆弧形状的长条形状的盒盖11、盒底20构成的试剂盒10中。
试剂盒标记和包被用抗体为抗人血清铁蛋白抗体,为配对的单克隆抗体或单抗-多抗配对。
纳米免疫磁珠为含铁的超顺磁乳胶颗粒,直径为100-250nm,表面富含羧基或氨基;优选为200nm,表面含羧基的颗粒。塑料支撑板厚度小于0.3mm;NC膜的宽度为35mm;上样垫为玻璃纤维膜或无纺布,吸样垫由吸水滤纸构成。
抗体的包被方法为:以0.01M磷酸盐缓冲液PBS将抗血清铁蛋白抗体配制成0.1-1.0mg/ml的包被液,优选浓度为0.1-0.3mg/ml,用喷膜仪在NC膜下部以1ul/cm的参数划线,包被T线,;同时在NC膜上部包被抗鼠IgG抗体作为C线。两包被线之间的距离为5-10mm,划线后将NC膜在干燥间温度20-25℃,湿度小于30%干燥8-10小时。
抗体的标记方法为:取10mg磁珠,用50mM 2-N-吗啉乙磺酸MES,pH5.7配制成1%的磁珠溶液,加入2mg水溶性碳二亚胺EDC,37℃10min,再加入100-500ug抗铁蛋白抗体,优选为150-250ug的铁蛋白抗体。37℃孵育2小时,期间不断摇晃,然后用磁力架吸附磁珠,将缓冲液更换至含0.5%牛血清白蛋白BSA,0.5%吐温Tween 20的0.01M PBS,完成标记。再用工作液20mM硼酸盐缓冲液,pH8.5,含1%BSA,0.5%Tween,5%蔗糖将磁珠配制成0.5mg/ml的溶液,按1ml溶液铺22cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上,再置干燥间干燥2-4小时,制成纳米免疫磁珠垫。
试剂条的装配方法为:在干燥间内,取塑料支撑板板,将已包被的NC膜放置在塑料支撑板板的中部粘贴,在NC膜T线一侧搭接免疫磁珠垫搭免疫磁珠垫的1/3粘贴,在免疫磁珠垫另一侧搭接粘贴上样垫搭免疫磁珠垫的1/5;在NC膜C线一侧搭接吸样垫搭吸样垫的1/10;最上面贴一层标志膜,然后用裁剪机将贴好塑料支撑卡切成5mm宽的试纸条。再将试纸条放入专用的塑料卡中压紧,制备成血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒。
检测方法为:将被检血清或血浆平衡至温室,将试剂盒平放,在上样垫上加入20ul被检样品,然后再加入80-100ul样品稀释液0.01M PBS,样品将溶解免疫磁珠并在NC膜上层析,加样后15-25分钟内用磁力检测仪检MICT检测数据,再根据预先测定并设置的计算公式计算出样品中人血清铁蛋白的含量。
试剂盒10的盒盖11、盒底20均是采用塑料注塑一体形成的,盒盖11、盒底20均是两个上角为圆弧形状的长条形状且其下边中部设置向上的方形凹陷;
盒盖11的长、宽以试剂条的长、宽配合设置,盒盖11为板形,在盒盖前面左侧设置长方形孔为加样孔13,位于其方形凹陷上方设置多条长、短不同的反应区标示凸起肋12,在盒盖后面左右两侧各设置一个凸柱15,在凸柱15下方左右两侧纵向各设置两个凸起板14,在加样孔13左侧纵向设置两个凸起压板19,凸起压板19的高度比凸起板14的高,在方形凹陷两边里侧各设置一个凸起压板18,凸起板18的高与凸起压板19的高度相同,在左侧凸起板14的右侧横向设置一个凸起压板17,在盒盖后面的边缘及凸起板14、凸起压板17、凸起压板18、凸起压板19的边缘设置多个凸柱16。
盒底20的长度要比盒盖11的长度两侧各要长出盒底翼21,盒底20的宽、高与盒盖11的宽、高配合设置,盒底20为板形,盒底20板上设置凸起肋23、凸起斜肋24、带凹槽凸起肋27、肋28,在凸起肋23、凸起斜肋24、带凹槽凸起肋27、肋28上设置凸起孔25,在盒底20的左右两侧各设置一个凸起孔22。
在盒底20的左右两侧带凹槽凸起肋27和肋28之间纵向各设置两个凹槽26将切好的血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂条9的上样垫1对应加样孔13的位置装入试剂盒10,即得血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒。
本实用新型的有益效果如下:研制一种血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒。和胶体金类试剂相比,继承了胶体金类试剂操作简便、检测快速和适于现场检测等优点,但结果用仪器判读,而不是用肉眼直接观察,结合了ELISA检测的可定量性,避免了人为误差,使结果判定更为精确,同时结果可以实时记录保存。实现了快速并定量的检测。
附图说明:
图1免疫磁珠试纸条结构示意图。
图2免疫磁珠检测试剂塑料盒的盒盖主视图。
图3免疫磁珠检测试剂塑料盒的盒盖后视图。
图4免疫磁珠检测试剂塑料盒的盒底主视图。
附图符号说明:
1:上样垫 2:磁珠垫
3:NC膜 4:吸样垫
5:检测线T 6:质控线C
7:塑料支撑板 9:试纸条
10:试剂盒; 11:盒盖
12:反应区标示凸起肋 13:加样孔
14:凸起板 15:凸柱
16:凸柱 17:凸起压板
18:凸起压板 19:凸起压板
20:盒底 21:盒底翼
22:凸起孔 23:凸起肋
24:凸起斜肋 25:凸起孔
26:凹槽 27:带凹槽凸起肋
28:肋
具体实施方式
实施例1:制备人血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试纸条
1主要材料
1.1抗铁蛋白配对抗体:芬兰MedixMAB公司产品,用于试剂的包被和标记;纳米免疫磁珠:法国AdemTech公司产品,直径200nm,表面为羧基修饰;NC膜:Millipore公司产品;EDC、MES、BSA:Sigma公司产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。铁蛋白标准品:从中国药品生物制品鉴定所购买。
1.2临床血清:从相关医院采集,共50份。用商用的铁蛋白ELISA试剂检测,含量从2-500ng/ml不等。
2方法
2.1抗体标记:取10mg磁珠,用50mM MESpH5.7配制成1%的纳米磁珠溶液,加入2mg水溶性EDC,37℃10min,再加入200ug抗血清铁蛋白抗体,37℃孵育2小时,期间不断摇晃,然后用磁力架吸附磁珠,将缓冲液更换至0.01m PBSpH7.2,含0.5%BSA,0.5%Tween 20,完成标记。再用工作液20mM硼酸盐缓冲液,pH8.5,含1%BSA,0.5%Tween,5%蔗糖制成0.5mg/ml的溶液,按1ml溶液铺22cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上,再置干燥间干燥2-4小时,制成纳米免疫磁垫,干燥备用。
2.2抗体包被 以0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液PBS将配对抗体配制成0.2mg/ml的溶液,用喷膜仪在NC膜下部以1ul/cm的参数分别划线,包被T线。同时在NC膜上部包被抗羊抗鼠抗体作为C线。各包被线之间的距离为5mm,划线后将NC膜在干燥间干燥8-10小时,备用。
2.3血清铁蛋白快速诊断试剂盒的组装 在干燥间内,取塑料支撑板,将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴,在NC膜T线一侧搭接免疫磁珠垫2搭免疫磁珠垫的1/3粘贴,在免疫磁珠垫2另一侧搭接粘贴上样垫1搭免疫磁珠垫的1/5;在NC膜C线一侧搭接吸样垫4搭吸样垫的1/10;最上面贴一层标志膜。用裁剪机将贴好塑料支撑卡切成5mm宽的试剂条,然后将切好的试剂条装入试剂盒,完成试剂盒的组装。
2.4检测方法 将被检样品平衡至温室,将试剂盒平放,通过加样孔在上样垫上加入20ul被检样品,然后再加入80-100ul样品稀释液0.01M PBS,加样后20分钟时用磁力检测仪检MICT测试纸条上数据。
2.4标准曲线公式计算 将血清铁蛋白标准品配制成10、20、40、80、160、320、640ng/ml的系列标准浓度,用试试剂盒进行检测,绘制出标准曲线,再拟合出标准曲线公式。为增加检测的准确性,对每一批制备的试剂进行检测并制定出相应的标准曲线。
2.5试剂的性能分析 按标准方法对试剂的分析灵敏度、分析特异性、不精密度和稳定性进行分析。
2.6临床样本检测 按检测方法,对临床收集的血清进行检测,并比较检测的误差。
3结果
3.1标准曲线公式 制备出人血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速诊断试剂盒,对标准品进行检测后,拟合出本批次标准曲线公式:y=0.074x2+1.2243x+10.082,R2=0.9985。R2=0.9985说明检测试剂回归关系良好,检测精确性高。
3.2性能分析 检测表明试剂在5-300ng/ml铁蛋白浓度范围内线性关系良好,最低可检测到2.5/ml的铁蛋白浓度。对一般性血清干扰物如高血脂、溶血、黄疸无非特异性反应,对HIV、HBsAg、HCV、TP等传染病血清样本无非特异性反应,对肝素、EDTA和枸橼酸纳等抗凝剂亦无非特异性反应。对同一样品重复检测的变异系数CV在15%以内。
3.3临床样本检测 对50例含量从2-500ng/ml不等血清铁蛋白样品检测,结果表明和ELISA值比,结果表明检测的误差基本在20%以内,和ELISA值一致性较好,为合理的检测误差,基本不影响临床的判定结果。配对T检验得p=0.731>0.05,说明两种检测方法无显著性差异。
实施例2:制备人血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒10:
图2免疫磁珠检测试剂塑料盒的盒盖主视图。图3免疫磁珠检测试剂塑料盒的盒盖后视图。图4免疫磁珠检测试剂塑料盒的盒底主视图。如图2、图3、图4所示,血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒10是由盒盖11、盒底20、血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂条构成,盒盖11、盒底20均是采用塑料注塑一体形成的,盒盖11、盒底20均是两个上角为圆弧形状的长条形状且其下边中部设置向上的方形凹陷。
盒盖11的长、宽以试剂条的长、宽配合设置,盒盖11为板形,在盒盖前面左侧设置长方形孔为加样孔13,位于其方形凹陷上方设置多条长、短不同的反应区标示凸起肋12,在盒盖后面左右两侧各设置一个凸柱15,在凸柱15下方左右两侧纵向各设置两个凸起板14,在加样孔13左侧纵向设置两个凸起压板19,凸起压板19的高度比凸起板14的高,在方形凹陷两边里侧各设置一个凸起压板18,凸起板18的高与凸起压板19的高度相同,在左侧凸起板14的右侧横向设置一个凸起压板17,在盒盖后面的边缘及凸起板14、凸起压板17、凸起压板18、凸起压板19的边缘设置多个凸柱16。
盒底20的长度要比盒盖11的长度两侧各要长出盒底翼21,盒底20的宽、高与盒盖11的宽、高配合设置,盒底20为板形,盒底20板上设置凸起肋23、凸起斜肋24、带凹槽凸起肋27、肋28,在凸起肋23、凸起斜肋24、带凹槽凸起肋27、肋28上设置凸起孔25,在盒底20的左右两侧各设置一个凸起孔22在盒底20的左右两侧带凹槽凸起肋27和肋28之间纵向各设置两个凹槽26将切好的血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂条9的上样垫1对应加样孔13的位置装入试剂盒10,即得血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒。
Claims (4)
1、一种人血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒,其特征是试纸条(9)由在塑料支撑板(7)一端搭接上样垫(1),上样垫(1)的一端搭接标记有抗人血清铁蛋白抗体纳米免疫磁珠垫(2),在磁珠垫(2)的一端搭接硝酸纤维素NC膜(3),NC膜(3)包被有相互分离的检测线T线(5)和质控线C线(6),T线为配对的铁蛋白抗体,C线为抗鼠IgG,NC膜(3)另一端搭接吸样垫(4)组成,将试纸条(9)装入两个上角为圆弧形状的长条形状的盒盖(11)、盒底(20)组成的试剂盒(10)中构成。
2、根据权利要求1所述的人血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒,其特征在于所述的标记和包被用抗体为抗人血清铁蛋白抗体,为配对的单克隆抗体或单抗-多抗配对。
3、根据权利要求1所述的人血清铁蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒,其特征在于纳米免疫磁珠为含铁的超顺磁乳胶颗粒,直径为100-250nm,表面富含羧基或氨基;塑料支撑板厚度小于0.3mm;NC膜的宽度为35mm;上样垫为玻璃纤维膜或无纺布,吸样垫由吸水滤纸构成。
4、根据权利要求1所述的血清铁蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒,其特征在于所述的试剂盒(10)的盒盖(11)、盒底(20)均是采用塑料注塑一体形成的,盒盖(11)、盒底(20)均是两个上角为圆弧形状的长条形状且其下边中部设置向上的方形凹陷;
盒盖(11)的长、宽以试剂条的长、宽配合设置,盒盖(11)为板形,在盒盖前面左侧设置长方形孔为加样孔(13),位于其方形凹陷上方设置多条长、短不同的反应区标示凸起肋(12),在盒盖后面左右两侧各设置一个凸柱(15),在凸柱(15)下方左右两侧纵向各设置两个凸起板(14),在加样孔(13)左侧纵向设置两个凸起压板(19),凸起压板(19)的高度比凸起板(14)的高,在方形凹陷两边里侧各设置一个凸起压板(18),凸起板(18)的高与凸起压板19的高度相同,在左侧凸起板(14)的右侧横向设置一个凸起压板(17),在盒盖后面的边缘及凸起板(14)、凸起压板(17)、凸起压板(18)、凸起压板(19)的边缘设置多个凸柱(16);
盒底(20)的长度要比盒盖(11)的长度两侧各要长出盒底翼(21),盒底(20)的宽、高与盒盖(11)的宽、高配合设置,盒底(20)为板形,盒底(20板上设置凸起肋(23)、凸起斜肋(24)、带凹槽凸起肋(27)、肋(28,在凸起肋(23)、凸起斜肋(24)、带凹槽凸起肋(27)、肋(28)上设置凸起孔(25),在盒底(20)的左右两侧各设置一个凸起孔(22);
在盒底(20)的左右两侧带凹槽凸起肋(27)和肋(28)之间纵向各设置两个凹槽(26)将切好的血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂条(9)的上样垫(1)对应加样孔(13)的位置装入试剂盒(10),即得血清铁蛋白纳米免疫磁珠快速检测试剂盒。
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