CN201331526Y - 人类免疫缺陷病毒抗体免疫磁珠快速检测试剂盒 - Google Patents

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杨发青
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Abstract

本实用新型是涉及生物应用技术领域，涉及一种运用纳米免疫磁珠检测人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体的快速检测剂盒。检测时将被检样品从加样孔加在试纸条上样垫上，使样品溶解标记磁珠并在NC膜上层析，然后在规定的时间内用磁力检测仪检(MICT)测试纸条上数据，根据所读取的数据判定结果，本试剂盒用于HIV感染的筛查或临床诊断，具有灵敏度高、特异性强、检测快速、操作简便、适合现场检测和实时记录保存结果等优点。

Description

人类免疫缺陷病毒抗体免疫磁珠快速检测试剂盒
技术领域
本实用新型是涉及生物应用技术领域，本实用新型涉及HIV抗体诊断试剂，特别是涉及一种以纳米免疫磁珠技术检测抗体的免疫层析快速诊断试剂。
背景技术
获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immunodeficiency syndrome，AIDS)简称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiencyvirus，HIV)感染引起的一种严重传染病。自美国1981年诊断出首例艾滋病患者以来，据最新的WHO数据评估，至2007年底，全球估计共有3300万艾滋病病毒感染者，中国国内有艾滋病病毒感染者约70万。
艾滋病病毒的传播途径主要包括血液传播、性接触、毒品注射和母婴传播。在人体内的潜伏期平均为7～10年。HIV感染潜伏期病人没有明显的临床症状，但具有高度的传染性。对HIV进行检测以发现传染源和切断传播途经是防制AIDS最有效的手段。HIV免疫学检测是最有效和最广泛使用的方法，HIV抗体筛查是我国法定的的四个血源性筛查项目之一。
HIV抗体检测最常用的试剂为HIV抗体酶联免疫试剂(ELISA)和胶体金类试剂，采用双抗原夹心法的第三代HIV抗体诊断试剂盒，灵敏度达到99％以上，特异性大于97％，目前得到广泛使用。两类试剂的基本特点如下：ELISA试剂需要专用的实验室和专业人员进行检验，操作复杂，但灵敏度更高；胶体金类试剂操作简便、快速、适于现场检测，但灵敏度稍低，结果用肉眼直接观察，会产生误差，亦不能记录。
纳米免疫磁珠是含有铁元素的超顺磁纳米颗粒，外面包覆着聚乙烯类高分子物质，并可带有羧基或氨基，用于和蛋白质分子交联。免疫磁珠在细胞和大分子分离、纯化及诊断上都已得到应用。但在免疫层析诊断试剂上还鲜有运用。美国Quantum Design公司最新推出了测定层析试纸上微量磁性物质的检测仪(MICT)，能定量检测到微量(pg级)的磁性物质，为纳米免疫磁珠检测试剂的研制提供了可能。
纳米免疫磁珠检测试剂基本原理如下：利用免疫磁珠标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，标记磁珠颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，聚集在检测线
纳米免疫磁珠检测试剂基本原理如下：利用免疫磁珠标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，标记磁珠颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，聚集在检测线上，通过MICT测定检测线上捕获磁珠的含量实现结果的判定。和胶体金试类剂相比，免疫磁珠检测试剂最大的不同在于将标记胶体金改为标记磁珠，检测结果时用MICT对检测线上的磁珠含量进行检测，而不是依靠肉眼去总判定，使结果判定更为精确、灵敏、客观和便于记录保存。利用纳米免疫磁珠研制HIV抗体检测快速诊断试剂尚无报道。
发明内容
本实用新型是提供一种灵敏度高、特异性强、检测快速、操作简便、适合现场检测和实时记录保存结果的HIV抗体纳米免疫磁珠快速检测试剂盒技术方案如下：
一种人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体免疫磁珠快速检测试剂盒10，其特征是试纸条(9)由在塑料支撑板(8)一端搭接上样垫(1)，上样垫(1)的一端搭接含有标记HIV抗原gp41、gp36的纳米免疫磁珠垫(2)，在磁珠垫(2)的一端搭接硝酸纤维素NC膜(3)，NC膜(3)包被有相互分离的gp41检测线(T1)检测线(T1)(5)gp36检测线(T2)(6)和质控线(C)(7)，NC膜(3)另一端搭接吸样垫(4)组成，将试纸条(9)装入塑料试剂盒10中构成。
所述的人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于所述的标记和包被用抗原为重组表达HIV抗原gp41、gp36，亦可再增加或替换为HIV其它特异性抗原gp160、gp120、P24及0亚型gp41。
所述的人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于纳米免疫磁珠为含铁的超顺磁乳胶颗粒，直径为200±50nm，表面富含羧基；塑料支撑板厚度小于0.3mm；NC膜的宽度为35mm；上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。
所述的人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于，抗原的包被方法为：以0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)分别将gp41、gp36抗原配制成1mg/ml、0.5mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以1ul/cm的参数分别划线，包被T1、T2线，分别用于检测gp41、gp36抗体；同时在NC膜上部包被抗HIV抗体作为C线。各包被线之间的距离为5mm，划线后将NC膜在干燥间(温度20-25℃，湿度小于30％)干燥8-10小时。
所述的人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于抗原的标记方法为：取10mg磁珠，用50mM 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES，pH5.7)配制成1％的磁珠溶液，加入0.5mg水溶性碳二亚胺(EDC)，37℃10min，再加入200ug HIV gp41，gp36融合或混合抗原，37℃孵育2小时，期间不断摇晃，然后用磁力架吸附磁珠，将缓冲液更换至0.01mPBS(pH7.2)，含0.5％牛血清白蛋白(BSA)，0.5％吐温，完成标记。再用工作液将磁珠配制成0.5mg/ml的溶液，按1ml溶液铺22cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间
(温度20-25℃，湿度小于30％)干燥2-4小时，制成纳米免疫磁垫。
所述的人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于，试剂盒的装配方法为：在干燥室内(温度20-25℃，湿度小于30％)，取塑料支撑板板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接免疫磁珠垫(搭免疫磁珠垫的1/3)粘贴，在免疫磁珠垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭免疫磁珠垫的1/5)；在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10)；最上面贴一层标志膜，然后用裁剪机将贴好塑料支撑卡切成5mm宽的试纸条，然后将切好的试纸装入塑料卡，完成试剂盒的组装。
所述的人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于，检测方法为：将被检血清或血浆平衡至温室，将试剂盒平放，在上样垫上加入40ul被检样品，然后再加入60-100ul样品稀释液(0.01MPBS)，样品将溶解胶体金并在NC膜上层析，加样后25-40分钟内用磁力检测仪检(MICT)测试纸条上数据，根据所读取的数据判定结果。若读取的数据大于设定的标准值，说明样品中含有抗HIV抗体，若低于设定的标准值，说明样品为阴性或含量低于试剂盒的最低检测限。
所述的人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒10是由盒盖11、盒底20构成，盒盖11、盒底20均是采用塑料注塑一体形成的，盒盖11、盒底20均是两个上角为圆弧形状的长条形状且其下边中部设置向上的方形凹陷；
盒盖11的长、宽以试剂条的长、宽配合设置，盒盖11为板形，在盒盖前面左侧设置长方形孔为加样孔13，位于其方形凹陷上方设置多条长、短不同的反应区标示凸起肋12，在盒盖后面左右两侧各设置一个凸柱15，在凸柱15下方左右两侧纵向各设置两个凸起板14，在加样孔13左侧纵向设置两个凸起压板19，凸起压板19的高度比凸起板14的高，在方形凹陷两边里侧各设置一个凸起压板18，凸起板18的高与凸起压板19的高度相同，在左侧凸起板14的右侧横向设置一个凸起压板17，在盒盖后面的边缘及凸起板14、凸起压板17、凸起压板18、凸起压板19的边缘设置多个凸柱16；
盒底20的长度要比盒盖11的长度两侧各要长出盒底翼21，盒底20的宽、高与盒盖11的宽、高配合设置，盒底20为板形，盒底20板上设置凸起肋23、凸起斜肋24、带凹槽凸起肋27、肋28，在凸起肋23、凸起斜肋24、带凹槽凸起肋27、肋28上设置凸起孔25，在盒底20的左右两侧各设置一个凸起孔22
在盒底20的左右两侧带凹槽凸起肋27和肋28之间纵向各设置两个凹槽26将切好的人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体纳米免疫磁珠快速检测试剂条4吸样垫4对应加样孔13的位置装入试剂盒10，即得人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体纳米免疫磁珠快速检测试剂盒。
本实用新型的有益效果如下：研制一种HIV抗体纳米免疫磁珠快速检测试剂盒。和胶体金类试剂相比，继承了胶体金类试剂操作简便、检测快速和适于现场检测等优点，但结果用仪器判读，而不是用肉眼直接观察，避免了人为误差，使结果判定更为精确，同时结果可以实时记录保存。同时用仪器判定结果借鉴了ELISA试剂的特点，使肉眼难以区分的差别能区分出来，同时由于MICT仪器的高灵敏性，使得纳米免疫磁珠快速检测试剂灵敏度提高，达到ELISA试剂的灵敏度。
附图说明：
图1免疫磁珠试剂条结构示意图。
图2免疫磁珠检测试剂塑料盒的盒盖主视图。
图3免疫磁珠检测试剂塑料盒的盒盖后视图。
图4免疫磁珠检测试剂塑料盒的盒底主视图。
附图符号说明：
1：上样垫               2：磁珠垫
3：NC膜                 4：吸样垫
5：gp41检测线(T1)       6：gp36检测线(T2)
7：试纸质控线(C)        8：塑料支撑板
9：试纸条               10：试剂盒；
11：盒盖                12：反应区标示凸起肋
13：加样孔              14：凸起板
15：凸柱                16：凸柱
17：凸起压板            18：凸起压板
19：凸起压板            20：盒底
21：盒底翼              22：凸起孔
23：凸起肋              24：凸起斜肋
25：凸起孔              26：凹槽
27：带凹槽凸起肋        28：肋
具体实施方式
实施例1：制备人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体纳米免疫磁珠快速检测试剂条：
1 主要材料
1.1 重组抗原：HIV gp41、gp36：美国Biotech Atlantic Inc(BAI.)产品，用于试剂的包被和标记；纳米免疫磁珠：法国AdemTech公司产品，直径200nm，表面为羧基修饰；NC膜：Millipore公司产品；EDC、MES、BSA：Sigma公司产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。
1.2 HIV抗体国家参考品(胶体金类)：中国药品生物制品检定所检研制。包括20份阳性血清，20份阴性血清，3份灵敏度血清，1份精密度血清。
1.3 含干扰物血清：包括常见干扰物高血脂、溶血、黄疸血清各10份，含相关传染病HAV、HBV、HIV、TP和HP抗体阳性血清各10份，含不同抗凝剂肝素、EDTA和枸椽酸钠血浆各10份，由本公司在天津地区相关医院收集验证并保存，以上血清或血浆经两种以上ELISA检测均为HIV抗体阴性血清。
1.4 临床血清HIV阴性血清600份，由公司在天津地区相关医院收集，为门诊采集检验用血清，经两种以上ELISA检测均为HIV抗体阴性血清。HIV阳性血清20份，由公司在相关AIDS专科医院获得，确证为HIV抗体阳性血清，已灭活。
2 方法
2.1 HIV抗原标记：取10mg磁珠，用50mM MES(pH5.7)配制成1％的纳米磁珠溶液，加入0.5mg水溶性EDC，37℃10min，再加入200ug HIV gp41，gp36融合或混合抗原，37℃孵育2小时，期间不断摇晃，然后用磁力架吸附磁珠，将缓冲液更换至0.01m PBS(pH7.2)，含0.5％BSA(牛血清白蛋)，0.5％吐温20，完成标记。再用工作液(20mM硼酸盐缓冲液，pH8.5，含1％BSA，0.5％吐温，5％蔗糖)制成0.5mg/ml的溶液，按1ml溶液铺22cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间(温度20-25℃，湿度小于30％)干燥2-4小时，制成纳米免疫磁垫，干燥备用。
2.2 HIV抗原包被  以0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)分别将gp41、gp36抗原配制成1mg/ml、0.5mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以1ul/cm的参数分别划线，包被T1、T2线，分别用于检测gp41、gp36抗体。同时在NC膜上部包被抗HIV抗体作为C线。各包被线之间的距离为5mm，划线后将NC膜在干燥间(温度20-25℃，湿度小于30％)干燥8-10小时，备用。
2.3 图1免疫磁珠试剂条结构示意图，如图1所示，HIV抗体快速诊断试剂条9的组装在干燥室内(温度20-25℃，湿度小于30％)，取塑料支撑板8，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板8的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接免疫磁珠垫2(搭免疫磁珠垫的1/3)粘贴，在免疫磁珠垫2另一侧搭接粘贴上样垫1(搭免疫磁珠垫的1/5)；在NC膜C线一侧搭接吸样垫4(搭吸样垫的1/10)；最上面贴一层标志膜，膜上标志gp41检测线(T1)5、gp36检测线(T2)6、试纸A质控线(C)7然后用裁剪机将贴好塑料支撑卡切成5mm宽的试剂条，然后将切好的试剂条装入试剂盒，完成试剂盒的组装即可。
2.4 检测方法将被检血清或血浆平衡至温室，将试剂盒平放，通过加样孔在上样垫上加入40ul被检样品，然后再加入60-100ul样品稀释液(0.01M PBS)，样品将溶解胶体金并在NC膜上层析，加样后25-40分钟内用磁力检测仪检(MICT)测试纸条上数据，根据所读取的数据判定结果。若T1线读取的数据大于设定的标准值，说明样品中含有抗HIV1抗体，若T2线读取的数据大于设定的标准值，说明样品中含有抗HIV2抗体，T1或(和)T2大于设定的标准，结果为阳性，若T1和T2都低于设定的标准值，说明样品为阴性或含量低于试剂盒的最低检测限。C线作为产品的质控，需大于设定的标准，若小于设定标准，检测无效，需重新检测。
2.5 样本检测  按检测方法，用组装好的试剂对HIV抗体国家参考品(胶体金类)，含干扰物血清和临床血清进行检测。
3 结果
3.1 HIV抗体国家参考品(胶体金类)检测对国家参考品血清盘进行测试，结果和预期完全一致(表1)，通过国家标准规定。
表1 本试剂盒对HIV抗体国家参考品(胶体金类)的测试结果
Figure Y20082007459800091
*检测由MICT仪器测定读数，设定T1、T2设定值＝75.0
3.2 干扰物血清检测  检测结果表明本试纸对常见干扰物高血脂、溶血、黄疸血清检测均为阴性，对含相关传染病HAV、HBV、HIV、TP和HP抗体阳性血清检测均为阴性，对含不同抗凝剂肝素、EDTA和枸椽酸钠血浆检测均为阴性。说明对以上物质没有非特异性反应。
3.3 临床样品试验：对临床血清的检测结果见表2：
表2：本试剂对临床血清的检测结果
Figure Y20082007459800101
特异性＝591/600＝98.5％，灵敏度为＝20/20＝100％；总符合率＝611/260＝98.
实施例2：制备人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体纳米免疫磁珠快速检测试剂盒10：
图2免疫磁珠检测试剂塑料盒的盒盖主视图。图3免疫磁珠检测试剂塑料盒的盒盖后视图。图4免疫磁珠检测试剂塑料盒的盒底主视图。如图2、图3、图4所示，人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体纳米免疫磁珠快速检测试剂盒10是由盒盖11、盒底20、人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体纳米免疫磁珠快速检测试剂条构成，盒盖11、盒底20均是采用塑料注塑一体形成的，盒盖11、盒底20均是两个上角为圆弧形状的长条形状且其下边中部设置向上的方形凹陷。
盒盖11的长、宽以试剂条的长、宽配合设置，盒盖11为板形，在盒盖前面左侧设置长方形孔为加样孔13，位于其方形凹陷上方设置多条长、短不同的反应区标示凸起肋12，在盒盖后面左右两侧各设置一个凸柱15，在凸柱15下方左右两侧纵向各设置两个凸起板14，在加样孔13左侧纵向设置两个凸起压板19，凸起压板19的高度比凸起板14的高，在方形凹陷两边里侧各设置一个凸起压板18，凸起板18的高与凸起压板19的高度相同，在左侧凸起板14的右侧横向设置一个凸起压板17，在盒盖后面的边缘及凸起板14、凸起压板17、凸起压板18、凸起压板19的边缘设置多个凸柱16。
盒底20的长度要比盒盖11的长度两侧各要长出盒底翼21，盒底20的宽、高与盒盖11的宽、高配合设置，盒底20为板形，盒底20板上设置凸起肋23、凸起斜肋24、带凹槽凸起肋27、肋28，在凸起肋23、凸起斜肋24、带凹槽凸起肋27、肋28上设置凸起孔25，在盒底20的左右两侧各设置一个凸起孔22在盒底20的左右两侧带凹槽凸起肋27和肋28之间纵向各设置两个凹槽26将切好的人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体纳米免疫磁珠快速检测试剂条9的上样垫1对应加样孔13的位置装入试剂盒10，即得人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体纳米免疫磁珠快速检测试剂盒。

Claims (4)

1、一种人类免疫缺陷病毒抗体免疫磁珠快速检测试剂盒(10)，其特征是试纸条(9)由在塑料支撑板(8)一端搭接上样垫(1)，上样垫(1)的一端搭接含有标记HIV抗原gp41、gp36的纳米免疫磁珠垫(2)，在磁珠垫(2)的一端搭接硝酸纤维素NC膜(3)，NC膜(3)包被有相互分离的gp41检测线(T1)检测线(T1)(5)gp36检测线(T2)(6)和质控线(C)(7)，NC膜(3)另一端搭接吸样垫(4)组成，将试纸条(9)装入两个上角为圆弧形状的长条形状的盒盖(11)、盒底(20)构成的试剂盒(10)中。
2、根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒抗体免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于所述的标记和包被用抗原为重组表达HIV抗原gp41、gp36，亦可再增加或替换为HIV其它特异性抗原gp160、gp120、P24及O亚型gp41。
3、根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒抗体免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于纳米免疫磁珠为含铁的超顺磁乳胶颗粒，直径为200±50nm，表面富含羧基；塑料支撑板厚度小于0.3mm；NC膜的宽度为35mm；上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。
4、根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒抗体免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒(10)的盒盖(11)、盒底(20)均是采用塑料注塑一体形成的，盒盖(11)、盒底(20)均是两个上角为圆弧形状的长条形状且其下边中部设置向上的方形凹陷；
盒盖(11)的长、宽以试剂条的长、宽配合设置，盒盖(11)为板形，在盒盖前面左侧设置长方形孔为加样孔(13)，位于其方形凹陷上方设置多条长、短不同的反应区标示凸起肋(12)，在盒盖后面左右两侧各设置一个凸柱(15)，在凸柱(15)下方左右两侧纵向各设置两个凸起板(14)，在加样孔(13)左侧纵向设置两个凸起压板(19)，凸起压板(19)的高度比凸起板(14)的高，在方形凹陷两边里侧各设置一个凸起压板(18)，凸起板(18)的高与凸起压板19的高度相同，在左侧凸起板(14)的右侧横向设置一个凸起压板(17)，在盒盖后面的边缘及凸起板(14)、凸起压板(17)、凸起压板(18)、凸起压板(19)的边缘设置多个凸柱(16)；
盒底(20)的长度要比盒盖(11)的长度两侧各要长出盒底翼(21)，盒底(20)的宽、高与盒盖(11)的宽、高配合设置，盒底(20)为板形，盒底(20板上设置凸起肋(23)、凸起斜肋(24)、带凹槽凸起肋(27)、肋(28，在凸起肋(23)、凸起斜肋(24)、带凹槽凸起肋(27)、肋(28)上设置凸起孔(25)，在盒底(20)的左右两侧各设置一个凸起孔(22)在盒底(20)的左右两侧带凹槽凸起肋(27)和肋(28)之间纵向各设置两个凹槽(26)将切好的人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体纳米免疫磁珠快速检测试剂条(9)的上样垫(1)对应加样孔(13)的位置装入试剂盒(10)，即得人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体纳米免疫磁珠快速检测试剂盒。
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