JP2016528894A5

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Info

Publication number: JP2016528894A5
Application number: JP2016530062A
Authority: JP
Filing date: 2014-07-25
Publication date: 2017-07-20
Anticipated expiration: 2034-07-25

Claims

標的ＤＮＡに相補的なガイドＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断するＣａｓ酵素、を含む幹細胞内で、前記標的ＤＮＡを改変する方法であって、前記方法は、
前記標的ＤＮＡに相補的であり前記Ｃａｓ酵素を前記標的ＤＮＡまで誘導（ｇｕｉｄｅ）するガイドＲＮＡ、をコードする第１外来性核酸を、前記幹細胞に導入すること；ここで前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ酵素は前記標的ＤＮＡに対する共局在複合体のメンバーである、
ドナー核酸配列を前記幹細胞に導入すること、
を含み、
前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ酵素が前記標的ＤＮＡに共局在し、前記Ｃａｓ酵素が前記標的ＤＮＡを切断し、前記ドナー核酸配列が前記標的ＤＮＡに挿入されて前記幹細胞内で改変ＤＮＡを産生する、前記方法。
前記Ｃａｓ酵素がＣａｓ９である、請求項１に記載の方法。
前記ガイドＲＮＡが１０ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
前記ガイドＲＮＡが２０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
前記ガイドＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項１に記載の方法。
前記標的ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
前記ドナー核酸配列が相同組換えにより挿入される、請求項１に記載の方法。
前記ドナー核酸配列が非相同末端結合により挿入される、請求項１に記載の方法。
前記Ｃａｓ酵素または前記ガイドＲＮＡが、前記幹細胞によって発現される外来性核酸として前記幹細胞に導入される、請求項１に記載の方法。
複数のドナー核酸および複数のガイドＲＮＡを導入して、前記幹細胞内で前記標的ＤＮＡに複数の改変を生じさせることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
幹細胞内で改変ＤＮＡを作製した後に、前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸が、前記幹細胞のゲノムから除去される、請求項１に記載の方法。
前記ガイドＲＮＡが、前記幹細胞の周囲の媒体から前記幹細胞内へと導入される、請求項１に記載の方法。
前記ガイドＲＮＡが５’キャップ構造を含む、請求項１２に記載の方法。
前記ガイドＲＮＡがホスフェート基を欠く、請求項１２に記載の方法。
前記ガイドＲＮＡが前記幹細胞の周囲の媒体から連続的に供給される、請求項１に記載の方法。
前記幹細胞は、前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸を含み且つ酵素により除去可能なベクターまたはカセットを前記幹細胞のゲノムＤＮＡに挿入することにより、遺伝的に改変されている、請求項１に記載の方法。
前記ベクターがＰｉｇｇｙｂａｃベクターである、請求項１６に記載の方法。
前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸が、酵素を用いて除去される、請求項１６に記載の方法。
前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸を含む前記酵素により除去可能なベクターまたはカセットは、酵素を用いて除去される、請求項１６に記載の方法。
前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸を含む前記酵素により除去可能なベクターまたはカセットは、酵素を用いて挿入される、請求項１６に記載の方法。
前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸を含む前記酵素により除去可能なベクターまたはカセットは、トランスポゼースを用いて除去される、請求項１６に記載の方法。
前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸は誘導可能である、請求項１６に記載の方法。
前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸は、ドキシサイクリン誘導性プロモータの影響下にある、請求項１６に記載の方法。
前記Ｃａｓ酵素をコードする核酸は、ドキシサイクリンを用いて誘導可能である、請求項１６に記載の方法。
標的ＤＮＡに相補的なガイドＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的ＤＮＡを切断するＣａｓ酵素、をコードする第１外来性核酸を含む、幹細胞。
前記標的ＤＮＡに相補的であり前記Ｃａｓ酵素を前記標的ＤＮＡまで誘導（ｇｕｉｄｅ）するガイドＲＮＡ、をコードする第２外来性核酸をさらに含み、前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ酵素が前記標的ＤＮＡに対する共局在複合体のメンバーである、請求項２５に記載の幹細胞。
ドナー核酸配列をコードする第３外来性核酸をさらに含む、請求項２６に記載の幹細胞。
前記Ｃａｓ酵素の発現を促進するための誘導性プロモーターをさらに含む請求項２５に記載の幹細胞。
前記第１外来性核酸が前記幹細胞のゲノムＤＮＡからトランスポゼースを使用して除去可能である、請求項２５に記載の幹細胞。
前記Ｃａｓ酵素がＣａｓ９である、請求項２５に記載の幹細胞。
前記ガイドＲＮＡが１０ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドである、請求項２５に記載の幹細胞。
前記ガイドＲＮＡが２０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドである、請求項２５に記載の幹細胞。
前記ガイドＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項２５に記載の幹細胞。
前記標的ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項２５に記載の幹細胞。