BR112016001721B1 - Método in vitro de alteração do dna-alvo em célula-tronco tendo ácido nucleico que codifica enzima cas9 - Google Patents

Método in vitro de alteração do dna-alvo em célula-tronco tendo ácido nucleico que codifica enzima cas9 Download PDF

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Abstract

engenharia genômica. métodos de engenharia genômica em células utilizando um talen destituido de sequências de repetição ou cas9 é provido.

Description

Dados de pedido relacionado
[001]Este pedido de patente reivindica a prioridade ao pedido de patente provisório americano No. 61/858,866 depositado em 26 de julho de 2013 e é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todas as finalidades.
DECLARAÇÃO DE INTERESSES DO GOVERNO
[002]Esta invenção foi feita com suporte governamental sob P50 HG003170 do National Human Genome Research Center (Centro Nacional de Pesquisa de Genoma Humano) para Excelência em Ciência Genômica. o governo possui determinados direitos na invenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003]Edição de genoma via nucleases sequência-específicas é conhecida. consulte referências 1, 2, e 3 aqui incorporadas por referência em seus textos integrais. Uma quebra de DNA (dsDNA) de dupla fita nuclease-mediada no genoma pode ser reparada por dois mecanismos principais: União terminal não-homóloga (NHEJ), que frequentemente resulta na introdução de inserções não-específicas e deleções (indels), ou reparo direcionado por homologia (HDR), que incorpora uma fita homóloga com um padrão de reparo. consulte a referência 4 aqui incorporada por referência em sua totalidade. Quando uma nucleasse sequência-específica é fornecida junto com um construto de DNA doador homólogo contendo mutações desejadas, eficiências de edição gênica são aumentadas em 1000 vezes em comparação ao construto doador isoladamente. vide referência 5 aqui incorporada por referência em sua totalidade. Uso de oligodeoxiribonucleotídeos de fita simples ("ssoDNs") como doadores de DNA foi descrito. vide referências 21 e 22 aqui incorporadas por referência em seus textos integrais.
[004]Apesar de grandes avanços em ferramentas de reconhecimento gênico, ainda existem muitos desafios e questões com relação ao uso de nucleases projetadas de modo personalizado em engenharia de célula-tronco pluripotente humano-induzida ("hiPSC"). Primeiramente, apesar de sua simplicidade de projeto, Nucleases Efetoras de Ativador de Transcrição (TALENs) direciona sequências de DNA específicas com cópias tandem de domínios de diresíduo variável de repetição (RVD). Vide referência 6 aqui incorporada por referência em sua totalidade. Enquanto a natureza modular de RVDs simplifica a configuração TALEN, suas sequências repetitivas complicam métodos para a sintetização de seus construtos de DNA (vide referências 2, 9, e 15-19 aqui incorporadas por referência em seus textos integrais) e também prejudicam seu uso com veículos de entrega gênica lentiviral. Vide referência 13 aqui incorporada por referência em sua totalidade. Na prática corrente, NHEJ e HDR são frequentemente analisados com uso de ensaios separados. Ensaios de endonuclease sensível a incompatibilidade (vide referência 14 aqui incorporada por referência em sua totalidade) são muitas vezes usados para analisar NHEJ, mas a precisão quantitativa deste método é variável e a sensibilidade é limitada a frequências NHEJ superiores a ~3%. Vide referência 15 aqui incorporada por referência em sua totalidade. HDR é frequentemente analisado pela clonagem e sequenciamento, um procedimento completamente diferente e muitas vezes difícil. Sensibilidade é ainda uma questão, embora frequências elevadas de reconhecimento na ordem de 50% sejam frequentemente relatadas para alguns tipos de célula tais como U20S e K562 (vide referências 12 e 14 aqui incorporadas por referência em seus textos integrais), frequências em geral são menores em hiPSCs. Vide referência 10 aqui incorporada por referência em sua totalidade. recentemente, frequências elevadas de reconhecimento foram relatadas em hiPSC e hESC com uso de TALENs (vide referência 9 aqui incorporada por referência em sua totalidade), e frequências ainda mais elevadas com o sistema CRISPR Cas9-gRNA (vide referências 16-19 aqui incorporadas por referência em seus textos integrais. Porém, taxas de reconhecimento em diferentes sítios parecem variar muito (vide referência 17 aqui incorporada por referência em sua totalidade), e reconhecimento as vezes não é detectável afinal em alguns sítios (vide referência 20 aqui incorporada por referência em sua totalidade).
[005]Sistemas CRISPR-Cas bacterianos e arqueais contam com RNAs guias-curto em complexo com proteínas Cas para degradação de sequências complementares presentes dentro do ácido nucleico exógeno invasor. Vide Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA e host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (201 1); Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Procedimentos da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América 109, E2579-2586 (2012); Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012); Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic Acid research 39, 9275-9282 (201 1); e Bhaya, D., Davison, M. & Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics 45, 273-297 (201 1). Uma recente reconstituição in vitro do Sistema tipo II S. pyogenes demonstrou que crRNA ("CRISPR RNA") fundiu-se com um tracrRNA normalmente transcodificado ("CRISPR RNA transativador") é suficiente para direcionar a proteína Cas9 para clivar com especificidade de sequência as sequências de DNA alvo relacionadas com crRNA. A expressão de um gRNA homólogo a um sítio-alvo resulta em recrutamento de Cas9 e degradação do DNA-alvo. Vide H. Deveau et al., Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008).
DESCRIÇÃO RESUMIDA DE INVENÇÃO
[006]Aspectos da presente descrição referem-se ao uso de Nucleases Efetoras semelhantes a Ativadores de Transcrição modificadas (TALENs) para a modificação genética de uma célula tal como uma célula somática ou uma célula- tronco. TALENs são conhecidos por incluírem sequências de repetição. Aspectos da presente descrição referem-se a um método de alteração de DNA-alvo em uma célula incluindo a introdução em uma célula de um TALEN sem sequências de repetição 100 bp ou mais sendo que o TALEN cliva o DNA-alvo e a célula sofre ligação de pontas não-homólogas para produzir DNA alterado na célula. De acordo com certos aspectos, sequências de repetição de comprimento desejado foram removidas do TALEN. De acordo com certos aspectos, o TALEN é destituído de sequências de repetição de certo comprimento desejado. De acordo com certos aspectos, um TALEN é provido com sequências de repetição de comprimento desejado removido. De acordo com certos aspectos, um TALEN é modificado para remover sequências de repetição de comprimento desejado. De acordo com certos aspectos, um TALEN é projetado para remover sequências de repetição de comprimento desejado.
[007]Aspectos da presente descrição incluem métodos de alteração do DNA- alvo em uma célula incluindo a combinação dentro de uma célula de um TALEN destituído de repetição 100 bp ou mais e uma sequência de ácido nucleico doador sendo que o TALEN cliva o DNA-alvo e a sequência de ácido nucleico doador é inserida no DNA na célula. Aspectos da presente descrição referem-se a um vírus incluindo uma sequência de ácido nucleico que codifica um TALEN destituído de sequências de repetição 100 bp ou mais. Aspectos da presente descrição referem- se a uma célula incluindo uma sequência de ácido nucleico que codifica um TALEN destituído de sequências de repetição 100 bp ou mais. De acordo com certos aspectos aqui descritos, o TALEN é destituído de sequências de repetição 100 bp ou mais, 90 bp ou mais, 80 bp ou mais, 70 bp ou mais, 60 bp ou mais, 50 bp ou mais, 40 bp ou mais, 30 bp ou mais, 20 bp ou mais, 19 bp ou mais, 18 bp ou mais, 17 bp ou mais, 16 bp ou mais, 15 bp ou mais, 14 bp ou mais, 13 bp ou mais, 12 bp ou mais, 11 bp ou mais, ou 10 bp ou mais.
[008]Aspectos da presente descrição referem-se à produção de um TALE incluindo a combinação de uma endonuclease, uma DNA polimerase, uma DNA ligase, uma exonuclease, uma pluralidade de blocos de dímeros de ácido nucleico que codificam que codificam domínios de diresíduos variáveis de repetição e um vetor de estrutura do TALE-N/TF incluindo um sítio de corte de endonuclease, a ativação da endonuclease para cortar o vetor de estrutura do TALE-N/TF no sítio de corte de endonuclease a fim de produzir uma primeira ponta e uma segunda ponta, ativação da exonuclease para criar uma protrusão 3' (overhang) e uma protrusão 5' (overhang) no Vetor de estrutura de TALE-N/TF e a pluralidade de blocos de dímeros de ácido nucleico e para parear o Vetor de estrutura de TALE-N/TF e a pluralidade de blocos de dímeros de ácido nucleico em uma ordem desejada, ativação da DNA polimerase e da DNA ligase a fim de conectar o Vetor de estrutura de TALE-N/TF e a pluralidade de blocos de dímeros de ácido nucleico. O versado na técnica poderá identificar prontamente com base na presente descrição endonucleases adequadas, DNA polimerases, DNA ligases, exonucleases, blocos de dímeros de ácido nucleico que codificam domínios de diresíduos variáveis de repetição e Vetores de estrutura do TALE-N/TF s. Aspectos da presente descrição referem-se a um método de alteração do DNA-alvo em uma célula-tronco que expressa uma enzima que forma um complexo de co-localização com RNA complementar ao DNA-alvo e que cliva o DNA-alvo de modo específico ao sítio incluindo (a) introdução na célula-tronco de um primeiro ácido nucleico exógeno que codifica um RNA complementar ao DNA-alvo que guia a enzima ao DNA-alvo, sendo que o RNA e a enzima são membros de um complexo de co-localização para o DNA-alvo, a introdução na célula-tronco um segundo ácido nucleotídeo exógeno que codifica uma sequência de ácido nucleico doador, sendo que o RNA e a sequência de ácido nucleico doador são expressados, sendo que o RNA e a enzima co- localizam o DNA-alvo, a enzima cliva o DNA-alvo e o ácido nucleico doador é inserido no DNA-alvo para produzir DNA alterado na célula-tronco.
[009]Aspectos da presente descrição referem-se a uma célula-tronco que inclui um primeiro ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima que forma um complexo de co-localização com RNA complementar ao DNA-alvo e que cliva o DNA-alvo de modo sítio-específico.
[0010]Aspectos da presente descrição referem-se a uma célula que inclui um primeiro ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima que forma um complexo de co-localização com RNA complementar ao DNA-alvo e que cliva o DNA-alvo de modo sítio-específico, e inclui um promotor induzível para promoção da expressão da enzima. Desse modo, a expressão pode ser regulada, por exemplo, ela pode ser iniciada e pode ser interrompida.
[0011]Aspectos da presente descrição referem-se a uma célula incluindo um primeiro ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima que forma um complexo de co-localização com RNA complementar ao DNA-alvo e que cliva o DNA-alvo de modo sítio-específico, sendo que o primeiro ácido nucleico exógeno é removível do DNA genômico da célula utilizando uma enzima de remoção, tal como uma transposase.
[0012]Aspectos da presente descrição referem-se a um método de alteração do DNA-alvo em uma célula expressando uma enzima que forma um complexo de co-localização com RNA complementar ao DNA-alvo e que cliva o DNA-alvo de modo sítio-específico incluindo (a) introdução na célula de um primeiro ácido nucleico exógeno que codifica uma sequência de ácido nucleico doador, introdução na célula do meio que circunda a célula de um RNA complementar ao DNA-alvo que guia a enzima ao DNA-alvo, sendo que o RNA e a enzima são membros de um complexo de co-localização para o DNA-alvo, sendo que a sequência de ácido nucleico doador é expressada em que o RNA e a enzima co-localizam o DNA-alvo, a enzima cliva o DNA-alvo e o ácido nucleico doador é inserido no DNA-alvo para produzir DNA alterado na célula.
[0013]Aspectos da presente descrição referem-se ao uso de uma proteína de ligação de DNA guiado por RNA para modificação genética de uma célula-tronco. Em um aspecto, a célula-tronco havia sido geneticamente modificada para incluir um ácido nucleico que codifica a proteína de ligação de DNA guiado por RNA e a célula- tronco expressa a proteína de ligação de DNA guiado por RNA. De acordo com um determinado aspecto, ácidos nucleicos doadores para introdução de mutações específicas são otimizados s para edição de genoma utilizando ou os TALENs modificados ou a proteína de ligação de DNA guiado por RNA.
[0014]Aspectos da presente descrição referem-se à modificação de DNA, tal como modificação de DNA multiplex, em uma célula-tronco utilizando um ou mais RNAs guia (ácidos ribonucleicos) para dirigir uma enzima com atividade de nuclease expressa pela célula-tronco, tal como proteína de ligação de DNA com atividade de nuclease, a um local-alvo no DNA (ácido desoxirribonucleico) sendo que a enzima corta o DNA e um ácido nucleico doador exógeno é inserido no DNA, tal como pela recombinação homóloga. Aspectos da presente descrição incluem etapas de ciclagem ou de repetição de modificação de DNA em uma célula-tronco para criar uma célula-tronco com múltiplas modificações de DNA na célula. Modificações podem incluir a inserção de ácidos nucleicos doadores exógenos.
[0015]Inserções de ácido nucleico exógeno múltiplas podem ser realizadas por uma única etapa de introdução em uma célula-tronco, que expressa a enzima, ácidos nucleicos que codificam uma pluralidade de RNAs e uma pluralidade de ácidos nucleicos doadores exógenos, tais como pela co-transformação, sendo que os RNAs são expressados e sendo que cada RNA na pluralidade guia a enzima a um sítio específico do DNA, a enzima corta o DNA e um dos inúmeros ácidos nucleicos exógenos é inserido no DNA no sítio de corte. De acordo com este aspecto, muitas alterações ou modificações do DNA na célula são criadas em um único ciclo.
[0016]Inserções de ácido nucleico exógeno múltiplas podem ser realizadas em uma célula através de etapas repetidas ou ciclos de introdução em uma célula- tronco, que expressa a enzima, um ou mais ácidos nucleicos que codificam um ou mais RNAs ou uma pluralidade de RNAs e um ou mais ácidos nucleicos exógenos ou uma pluralidade de ácidos nucleicos exógenos sendo que o RNA é expressado e guia a enzima a um sítio específico do DNA, a enzima corta o DNA e o ácido nucleico exógeno é inserido no DNA no sítio de corte, de modo a resultar uma célula com múltiplas alterações ou inserções de DNA exógeno no DNA na célula-tronco. De acordo com um aspecto, a célula-tronco que expressa a enzima havia sido geneticamente alterada para expressar a enzima tal como pela introdução na célula de um ácido nucleico que codifica a enzima e que pode ser expresso pela célula- tronco. Desse modo, aspectos da presente descrição incluem a ciclagem das etapas de introdução do RNA em uma célula-tronco que expressa a enzima, introdução do ácido nucleico doador exógeno na célula-tronco, expressão do RNA, formação de um complexo de co-localização do RNA, da enzima e do DNA, corte enzimático do DNA pela enzima, e inserção do ácido nucleico doador no DNA. Ciclagem ou repetição das etapas acima resulta em modificação genética multiplexada de uma célula-tronco at multiple loci, i.e., uma célula-tronco com múltiplas modificações genéticas.
[0017]De acordo com certos aspectos, proteínas de ligação de DNA ou enzimas dentro do escopo da presente descrição incluem uma proteína que forma um complexo com o RNA guia e com o RNA guia que direciona o complexo para uma sequência de DNA de fita dupla sendo que o complexo se liga à sequência de DNA. De acordo com um aspecto, a enzima pode ser uma proteína de ligação de DNA guiado por RNA, tal como uma proteína de ligação de DNA guiado por RNA de um Sistema CRISPR tipo II que se liga ao DNA e é guiado por RNA. De acordo com um aspecto, a proteína de ligação de DNA guiado por RNA é uma Proteína Cas9.
[0018]Este aspecto da presente descrição pode ser chamado de co- localização do RNA e da proteína de ligação de DNA a ou com o DNA de fita dupla. Desse modo, a proteína de ligação de complexo de RNA guiado a DNA pode ser usada para cortar sítios múltiplos do DNA de fita dupla de modo a criar uma célula- tronco com múltiplas modificações genéticas tais como inserções múltiplas de DNA doador exógeno.
[0019]De acordo com certos aspectos, um método de produção de múltiplas alterações ao DNA-alvo em uma célula-tronco que expressa uma enzima que forma um complexo de co-localização com RNA complementar ao DNA-alvo e que cliva o DNA-alvo de modo sítio-específico, é provido incluindo (a) introdução na célula- tronco de um primeiro ácido nucleico exógeno que codifica um ou mais RNAs complementares ao DNA-alvo e que guia a enzima ao DNA-alvo, sendo que um ou mais RNAs e a enzima são membros de um complexo de co-localização do DNA- alvo, introdução na célula-tronco de um segundo ácido nucleico exógeno que codifica uma ou mais sequências de ácido nucleico doador, sendo que um ou mais RNAs e uma ou mais sequências de ácido nucleico doador são expressados, sendo que um ou mais RNAs e uma enzima co-localizam o DNA-alvo, a enzima cliva o DNA-alvo e o ácido nucleico doador é inserido no DNA-alvo para produzir DNA alterado na célula-tronco, e repetição da etapa (a) múltiplas vezes para produzir múltiplas alterações ao DNA na célula-tronco.
[0020]De acordo com um aspecto, o RNA situa-se entre aproximadamente 10 a aproximadamente 500 nucleotídeos. De acordo com um aspecto, o RNA situa- se entre aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nucleotídeos.
[0021]De acordo com um aspecto, um ou mais RNAs é um RNA guia. De acordo com um aspecto, um ou mais RNAs é uma fusão tracrRNA-crRNA.
[0022]De acordo com um aspecto, o DNA é DNA genômico, DNA mitocondrial, DNA viral, ou DNA exógeno.
[0023]De acordo com um aspecto, uma célula pode ser geneticamente modificada para incluir reversamente um ácido nucleico que codifica um DNA que se liga a enzima com uso de um vetor que pode ser facilmente removido utilizando-se uma enzima. Métodos de vetores úteis são conhecidos pelo versado na técnica e incluem lentivirus, vírus adeno-associado, métodos de inserção de alvo nuclease e integrasse-mediada e métodos de inserção transposon-mediada. De acordo com um aspecto, o ácido nucleico que codifica um DNA que se liga a enzima que havia sido adicionada tal como pelo uso de um cassete ou vetor pode ser removido em sua totalidade junto com o cassete e vetor e sem deixar uma porção de tal ácido nucleico, cassete ou vetor no DNA genômico, por exemplo. Tal remoção é chamada no estado da técnica de remoção "sem cicatriz" já que o genoma é o mesmo de quando era antes da adição do ácido nucleico, cassete ou vetor. Uma concretização representativa de inserção e remoção sem cicatriz é um vetor PiggyBac comercialmente disponível pela System Biosciences.
[0024]Outras características e vantagens de determinadas concretizações da presente invenção se tornarão mais integralmente claras na descrição a seguir de concretizações e desenhos destas, e a partir das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0025]As características e vantagens acima referidas das presentes concretizações serão a seguir mais integralmente compreendidas através da seguinte descrição detalhada de concretizações ilustrativas em conjunção com os desenhos de acompanhamento onde:
[0026]A figura 1 refere-se a testes funcionais de re-TALENs em células humanas somáticas e células-tronco.
[0027](a) Representação esquemática de configuração de teste para testar a eficiência de alvejamento de genoma. Uma sequência codificadora de GFP genomicamente integrado é interrompida pela inserção de um códon de terminação e um fragmento genômico 68bp derivado do locus AAVS 1 (de baixo). Restauração da sequência GFP através da recombinação homóloga nuclease-mediada com doador tGFP (de cima) resulta em GFP+ células que podem ser quantificadas por FACS. Re-TALENs e TALENs atingem sequências idênticas dentro de fragmentos AAVS1.
[0028](b) Gráfico de barras que descreve porcentagem de GFP+ célula introduzidas por doador tGFP unicamente, TALENs com doador tGFP e re-TALENs com doador tGFP no locus alvo, conforme medido pela FACS. (N=3, barra de erro =SD) Gráficos FACS representativos são a seguir mostrados.
[0029](c) Visão geral esquemática que descreve a estratégia de alvejamento para o locus AAVS1 nativo. O plasmídeo doador, contendo aceitador de recomposição (splicing) (SA)- 2A (peptídeos de auto-clivagem), gene resistente a puromicina (PURO) e GFP foram descritos (vide referência 10 aqui incorporada por referência em sua totalidade. Os locais de primers PCR usados para detectar eventos de edição bem-sucedidos são descritos como setas azuis. (d) Clones direcionados com êxito de PGPl hiPSCs foram selecionados com puromicina (0.5ug/mL) por 2 semanas. Imagens de microscopia de três GFP+ clones representativos são mostrados. As células também foram tingidas para os marcadores de pluripotência TRA-1-60.Barra de escala : 200 μm.
[0030](e) Ensaios PCR realizados nesses clones GFP+ hiPSC monoclonais demonstraram inserções bem sucedidas dos cassetes doadores no sitio AAVSl (faixa 1,2,3), enquanto hiPSCs simples não mostram evidências de inserção bem sucedida (faixa C).
[0031]A figura 2 refere-se a uma comparação de eficiência de alvejamento de genoma de reTALENs e Cas9-gRNAs em CCR5 em iPSCs.
[0032](a) A representação esquemática de configuração de teste de engenharia genômica. No par re-TALEN ou sítio de alvejamento Cas9-gRNA, um ssODN de 90 mer que porta um pareamento incompatível 2bp em relação ao DNA genômico foi fornecido junto com os construtos reTALEN ou Cas9-gRNA em PGPl hiPSCs. Os sítios de corte das nucleases são descritos como setas vermelhas na figura. (b) Análise de sequenciamento profundo de eficiências HDR e NHEJ para os pares re-TALEN (CCR5 #3) e ssODN, ou os Cas9-gRNA e ssODN. Alterações no genoma de hiPSCs foram analisadas a partir de dados de sequência de elevada capacidade por GEAS. De cima: HDR foi quantificado a partir da fração de reads (fragmentos curtos de sequência) que continham uma mutação pontual 2bp estabelecida no centro do ssODN (azul), e atividade NHEJ foi quantificada a partir da fração de deleções (cinza)/inserções (vermelho) em cada posição específica no genoma. Para os grafos reTALEN e ssODN, linhas pontilhadas verdes são plotadas para marcar o limiar externo dos sítios de ligação de par re-TALEN que estão nas posições -26bp e +26bp com relação ao centro dos dois sítios de ligação re-TALEN. Para grafos Cas9-gRNA e ssODN, as linhas pontilhadas em verde marcam o limiar externo do sítio de alvejamento gRNA que estão nas posições -20 e - 1 bp com relação à sequência PAM. De baixo: Distribuição de tamanho de deleção/inserção em hiPSCs analisados a partir de toda a população NHEJ com tratamento acima indicados.
[0033](c) A eficiência de edição de genoma de re-TALENs e Cas9-gRNAs que alvejam CCR5 em PGP1 hiPSCs.
[0034]De cima: representação esquemática dos sítios de edição de genoma alvejados em CCR5. Os 15 sítios de alvejamentos são ilustrados por setas azuis a seguir. Para cada sítio as células foram co-transferidas com um par de reTALENs e seus pareamentos incompatíveis 2bp portadores de doador de ssODN correspondentes em relação ao DNA genômico. Eficiências de edição de genoma foram testadas 6 dias após transfecção. De modo semelhante, 15 Cas9- gRNAs foram transfectados com seus ssODNs correspondentes individualmente em PGP 1 -hiPSCs para mirar os mesmos 15 sítios e analisada a eficiência 6 dias após transfecção. De baixo: a eficiência de edição de genoma de re-TALENs e Cas9- gRNAs que alvejam CCR5 em PGP1 hiPSCs. Painel 1 e 2 indicam eficiências NHEJ e HDR mediadas por reTALENs. Painel 3 e 4 indicam eficiências NHEJ e HDR mediadas por Cas9-gRNAs. Taxas de NHEJ foram calculadas pela frequência de alelos genômicos que carregam deleções ou inserções na região de alvejamento; taxas HDR foram calculadas pela frequência de alelos genômicos que sustentam pareamentos incompatíveis 2bp. Painel 5, o perfil DNasel HS de uma linhagem celular a hiPSC a partir da base de dados m ENCODE (Duke DNase HS, iPS NIHI7 DS). Note que s escalas de diferentes painéis são diferentes.
[0035](f) Sequenciamento de Sanger do amplicon PCR a partir das três colônias hiPSC visadas confirmou que as bases de DNA esperadas no limiar de inserção de genoma estão presentes. M: DNA ladder. C: Controle com DNA genômico hiPSCs liso.
[0036]A figura 3 refere-se a um estudo de parâmetros funcionais que governam HDR ssODN-mediado com re-TALENs ir Cas9-gRNAs em PGP1 hiPSCs.
[0037](a) PGP1 hiPSCs foram co-transfectados com par re-TALENs (#3) e ssODNs de diferentes comprimentos (50, 70, 90, 1 10, 130,150,170 nts). Todos ssODNs possuíam um pareamento incompatível 2bp idêntico em relação ao DNA genômico no meio da sequência. Um 90mer ssODN obteve HDR ideal no genoma visado. A avaliação de HDR, deleção NHEJ-incorrida e eficiência de inserção foi conforme aqui descrito. (b) ssODNs de 90mer que corresponde ao par re-TALEN #3 cada um contendo um pareamento incompatível 2bp (A) no centro e um pareamento incompatível 2bp adicional (B) em deslocamentos de diferentes posições de A (onde os deslocamentos variaram de -30bp->30bp) foram usados para testar os efeitos de desvios de homologia ao longo do ssODN. Eficiência de edição de genoma de cada ssODN foi analisada em PGP1 hiPSCs. O grafo de barra inferior mostra a frequência de incorporação de A apenas, B apenas, e A + B no genoma visado. Taxas HDR diminuíram conforme a distância de desvios de homologia do aumento de centro.
[0038](c) ssODNs apontados para sítios com distâncias variáveis (-620bp~ 480bp) longe do sítio-alvo de re-TALEN pair #3 foram testados para analisar a distância máxima dentro da qual ssODNs podem ser colocados para introduzir mutações. Todos ssODNs carregavam um pareamento incompatível 2bp no meio de suas sequências. Eficiência HDR mínima (<=0.06%) foi observada quando o pareamento incompatível ssODN foi posicionado 40bp longe do meio do sítio de ligação do par re-TALEN.
[0039](d) PGP1 hiPSCs foram co-transfectados com Cas9-gRNA (AAVS1) e ssODNs de diferente orientação (Oc: complemento a gRNA; On: sem complemento a gRNA) e diferentes comprimentos (30, 50, 70, 90, 110 nt). Todos ssODNs possuíam um pareamento incompatível 2bp idêntico em relação ao DNA genômico no meio de sua sequência. Um 70mer Oc atingiu HDR ideal no genoma visado.
[0040]A figura 4 refere-se ao uso de re-TALENs e ssODNs a fim de obter hiPSC com edição de genoma monoclonais, sem seleção.
[0041](a) Cronograma do teste.
[0042](b) Eficiência de engenharia genômica de par re-TALENs e ssODN (#3) analisados pela plataforma NGS descrita na figura 2b.
[0043](c) Resultados de sequenciamento de Sanger de colônias de hiPSC monoclonal após edição de genoma. O genótipo 2bp heterogêneo (CT/CT->TA/CT) foi introduzido com êxito no genoma de colônias PGP 1- iPS-3-1 1, PGPl-iPS-3-13.
[0044](d) Coloração por imunofluorescência de PGPl-iPS-3- 11 visado. As células foram manchadas para os marcadores de pluripotência Tra-1-60 and SSEA4.
[0045](e) Coloração por Hematoxilina e coloração por eosina de seções de teratoma geradas a partir de células monoclonais PGPl-iPS-3- 1 1 cells.
[0046]Figura 5. Configuração do reTALE. (a) Alinhamento de sequência do monômero TALE RVD original monômeros em re-TALE- 16.5 (re-TALE-Ml ->re- TALE-M17). Alterações de nucleotídeos da sequência original são destacadas em cinza, (b) teste de repetitividade de re-TALE por PCR. Painel de tipo ilustra a estrutura de re-TALE/TALE e posições dos primers na reação PCR. Painel de fundo ilustra bandas PCR com condição a seguir indicada. O escalonamento PCR apresenta o padrão TALE original (faixa direita).
[0047]Figura 6. Configuração e prática de montagem de incubação única TALE (TASA). (a) Representação esquemática do banco de blocos de dímeros reTALE para montagem TASA. Existe um banco de 10 blocos de dímero re-TALE que codificam dois RVDs. Dentro de cada bloco, todos 16 dímeros compartilham a mesma sequência DNA exceto as sequências de codificação RVD; Dímeros em diferentes blocos apresentam sequências distintas, mas são projetados de tal forma que eles compartilhem sobreposições 32bp com os blocos adjacentes. DNA e sequência de aminoácido de um dímero ( bloco6_AC) estão listados à direita.
[0048](b) Representação esquemática do Montagem TASA. O painel esquerdo ilustra o método de Montagem TASA: uma reação de incubação “one -pot” é conduzida com uma mistura de enzimas /blocos re-TALE / Vetores de estrutura de re-TALE-N/TFs. O produto de reação pode ser usado diretamente para transformação bacteriana. O painel direito ilustra o mecanismo de TASA. O vetor de destinação é linearizado por uma endonuclease a 37°C para cortar cassete de contra-seleção ccdB; a exonuclease, que processa a ponta de blocos e vetores linearizados, expõe protrusões ssDNA na ponta de fragmentos a fim de permitir eu blocos e estruturas de vetor sejam aneladas em uma ordem designada. Quando a temperatura aumenta para 50°C, polimerases e ligases trabalham juntas para vedar a lacuna produzindo os construtos finais prontos para transformação.
[0049](c) Eficiência de Montagem TASA para re-TALEs que possuem diferentes comprimentos de monômero. Os blocos usados para montagem são ilustrados à esquerda e a eficiência de montagem é apresentada à direita.
[0050]Figura 7. A funcionalidade e integridade de sequência de Lenti- reTALEs.
[0051]Figura 8. A sensibilidade e reprodutibilidade de GEAS.
[0052](A) Análise com base na informação de limite de detecção HDR. Dado o jogo de dados de re-TALENs (#10)/ssODN, os reads (fragmentos curtos de sequência) contendo a edição esperada (HDR) foram identificados e esses reads HDR foram sistematicamente removidos para gerar diferentes montagens de dados artificiais com um sinal de edição "diluído". Montagens de dados com 100, 99.8, 99.9, 98.9, 97.8, 89.2, 78.4, 64.9, 21.6, 10.8, 2.2, 1.1, 0.2, 0.1, 0.02, e 0% de remoção de reads HDR foram gerados para gerar montagens de dados artificiais com eficiência HR variando de 0-0.67%. Para cada conjunto de dados individual, informação mútua (MI) do sinal de fundo (em roxo) e o sinal obtido no sítio de alvejamento (em verde) foi estimado. MI no sítio de alvejamento é bem mais elevado do que o fundo quando a Eficiência HDR fica acima de 0.0014%. Um limite de Detecção HDR entre 0.0014% e 0.0071% foi estimado. Cálculo de MI foi aqui descrito.
[0053](B) O teste de reprodutibilidade de Sistema de análise de edição de genoma. Os pares de gráficos (de cima e de baixo) mostram os resultados de análise HDR e NHEJ de duas replicações com par re-TALENs e tipo de célula acima indicado. Para cada teste, nucleofecção, amplificação de genoma visado, sequenciamento profundo e análise de dados foram conduzidos independentemente. A variação de análise de edição de genoma de replicações foi calculada como v2 (|HDRl-HDR2|)/((HDR+HDR2)/2) =AHDR/HDR e v2 (|NHEJ1- NHEJ2|) /((NHEJl+NHEJ2)/2) =ANHEJ/NHEJ e os resultados de variação estão listados abaixo dos gráficos. A variação média do Sistema foi (19%+1 1%+4%+9%+10%+35%)/6=15%. Fatores que podem contribuir para as variações incluem a posição de células sob nucleofecção, eficiência de nucleofecção e cobertura e qualidade de sequenciamento.
[0054]Figura 9. Análise estatística de eficiências NHEJ e HDR por reTALENs e Cas9- gR As em CCR5.
[0055](a) A correlação de eficiências HR e NHEJ mediadas por reTALENs em sítios idênticos em iPSCs (i=0.91, P< IX 10-5).
[0056](b) a correlação de eficiências HR e NHEJ mediadas por Cas9-gRNA em sítios idênticos em iPSCs (i=0.74, P=0.002).
[0057](c) a correlação de eficiências NHEJ mediadas por Cas9-gRNA e a temperatura Tm de sítio de alvejamento gRNA em iPSCs (r=0.52, P=0.04)
[0058]Figura 10. A análise de correlação de eficiência de edição de genoma e estado epigenético.
[0059]Correlação de Pearson foi usada para estudar possíveis associações entre sensibilidade DNase I e eficiências de engenharia genômica (HR, NHEJ). A correlação observada foi comparada a um montagem randomizado (N= 100000). Correlações observadas superiores ao 95 percentil, ou inferior ao 5 percentil da distribuição simulada foram consideradas como associações em potencial. Não se observou correlação significativa entre sensibilidade DNase 1 e eficiências NHEJ/HR.
[0060]Figura 11. O impacto de pareamento de homólogos da edição ssODN- mediada de genoma.
[0061](a) No teste descrito na figura 3b, no geral HDR conforme medido pela taxa na qual o pareamento incompatível 2b do meio (A) foi incorporado reduzido já que os pareamentos incompatíveis secundários B aumentaram sua distância de A (posição relativa de B para A varia de -30->30bp). As taxas mais elevadas de incorporação quando B é apenas lObp distante de A (-lObp e +10b) pode refletir uma menor necessidade de pareamento do ssODN em relação ao DNA genômico proximal à quebra dsDNA.
[0062](b) Distribuição de comprimento de conversão gênica ao longo de ssODN. Em cada distância de B a partir de A, uma fração de eventos of HDR incorpora apenas A enquanto outra fração incorpora tanto A como B. Esses dois eventos podem ser interpretáveis em termos de tratos de conversão gênica (Elliott et al., 1998), sendo que eventos A+B representam longos tratos de conversão que se estendem para além de B e eventos A somente representam menos do que aquele que não chega até B. Sob esta interpretação, uma distribuição de comprimentos de conversão gênica em ambas as direções ao longo do oligo poderá ser estimada (o meio de ssODN é definido como 0, tratos de conversão na direção da ponta 5' de ssODN como - direção e ponta 3' como + direção). Tratos de conversão gênica diminuem progressivamente em incidência já que seus comprimentos aumentam, um resultado muito similar às distribuições de trato de conversão gênica vistos com doadores dsDNA mas em uma escala de distância altamente comprimida de dezenas de bp para o oligo ssDNA vs. Centenas de bases para doadores dsDNA.
[0063](c) Testes para tratos de conversão gênica com uso de uma único ssODN que contém uma série de mutações e série contígua de medição de incorporações. Um doador ssODN com três pares de pareamento incompatível 2bpes (laranja) espaçados em intervalos de 1 Ont em um ou outro lado do pareamento incompatível 2bp central (De cima) foi usado. Poucos reads de sequenciamento genômico foram detectados (vide referência 62 aqui incorporada por referência em sua totalidade) carregando >=1 pareamentos incompatíveis definidos por ssODN entre >300,000 reads sequenciando esta região. Todos estes reads foram plotados (de baixo) e a sequência dos reads foi codificada em cores. Laranja: pareamentos incompatíveis definidos; verde: sequência tipo selvagem. Edição de genoma com este ssODN deu origem a um padrão no qual mutação central unicamente foi incorporada 85% (53/62) do intervalo, com múltiplos pareamentos incompatíveis B incorporados em outros intervalos. Embora números de eventos de incorporação B fossem baixos demais para estimular uma distribuição de comprimentos de trato > 1 Obp, verificou-se que predominava a região de trato curto de - 10- 1 Obp.
[0064]Figura 12. Eficiências de edição de genoma de Cas9-gR A nuclease e niquases.
[0065]PGP1 iPSCs foram co-transfectados com combinação de nuclease (C2) (Cas9-gR A) ou niquase (Cc) (Cas9D10A-gRNA) e ssODNs de diferente orientação (Oc e On). Todos ssODNs possuíam um pareamento incompatível 2bp idêntico em relação ao DNA genômico no meio de sua sequência. A análise de HDR é aqui descrita.
[0066]Figura 13. A configuração e otimização de sequência re-TALE.
[0067]A sequência re-TALE foi desenvolvida em diversos ciclos de configuração a fim de eliminar repetições. Em cada ciclo, sequências sinônimas de cada repetição foram analisadas. Aquelas com a distância maior de Hamming em relação ao DNA evolutivo são selecionadas. A sequência final com cai = 0.59 AG= - 9.8 kcal/mol. Um pacote R foi provido para realizar esta estrutura geral para configuração de proteína sintética.
[0068]Figura 14 é uma imagem de gel mostrando validação PCR da inserção genômica de Cas 9 em células PGP1. Linhagem 3, 6, 9, 12 são produto PCR de linhagens celulares PGP1 planas.
[0069]Figura 15 é um grafo do nível de expressão mRNA de Cas9 mRNA sob a indução.
[0070]Figura 16 é um grafo que mostra eficiência de alvejamento de genoma por diferentes configurações de RNA.
[0071]Figura 17 é um grafo que mostra eficiência de alvejamento de genoma de 44% recombinação homóloga obtida por uma fusão DNA doador - RNA guia.
[0072]Figura 18 é um diagrama que mostra o genótipo de linhagens celulares de PGP 1 isogênico geradas pelo sistema descrito aqui. PGPl-iPS-BTHH apresenta o fenótipo de deleção de nucleotídeos simples como paciente BTHH. PGP1-NHEJ apresenta deleções 4bp que geraram mutações frame-shift (com alteração da grelha de leitura) em um modo diferente.
[0073]Figura 19 é um grafo mostrando que cardiomiócito derivado de PGP1 iPS isogênico recapitulou produção ATP efetiva e atividade específica FIFO ATPase conforme demonstrado em células específicas ao paciente.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0074]Aspectos da presente invenção referem-se ao uso de um TALEN que não tem certas sequências de repetição, para engenharia de ácido nucleico, por exemplo pelo corte de ácido nucleico de fita dupla. O uso do TALEN para cortar ácido nucleico de fita dupla pode resultar na ligação de pontas não-homólogas (NHEJ) ou recombinação homóloga (HR). Aspectos da presente descrição também contemplam o uso de um TALEN que não tem sequências de repetição para engenharia de ácido nucleico, por exemplo pelo corte de ácido nucleico de fita dupla, na presença de um ácido nucleico doador e inserção do ácido nucleico doador no ácido nucleico de fita dupla, tal como pela ligação de pontas não-homólogas (NHEJ) ou recombinação homóloga (HR). Nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs) são conhecidas no estado da técnica e incluem enzimas de restrição artificiais geradas pela fusão de um domínio de ligação de DNA de efetor TAL a um domínio de clivagem de DNA. Enzimas de restrição são enzimas que cortam fitas de DNA em uma sequência específica. Efetores semelhantes a ativadores de transcrição (TALEs) podem ser projetados para se ligarem a uma sequência de DNA desejada. Vide Boch, Jens (fevereiro de 2011). "TALEs of genoma targeting". Nature Biotechnology 29 (2): 135-6 aqui incorporada por referência em sua totalidade. Através da combinação de tam tal TALE projetado com um domínio de clivagem de DNA (que corta fitas de DNA), um TALEN é produzido o qual é uma enzima de restrição que é específica para qualquer sequência de DNA desejada. De acordo com certos aspectos, o TALEN é introduzido em uma célula para edição de ácido nucleico alvo in situ, tal como edição de genoma in situ. De acordo com um aspecto, o domínio de clivagem DNA não específico a partir da ponta da Fokl endonuclease pode ser usado para construir nucleases híbridas que são ativas em células de levedura, células de planta e células de animal. O domínio Fokl funciona como um dímero, exigindo dois construtos com domínios de ligação de DNA exclusivo para sítios no genoma alvo com orientação apropriada e espaçamento. Tanto o número de resíduos de aminoácido entre o domínio de ligação TALE DNA e o domínio de clivagem Fokl e o número de bases entre os dois sítios de ligação TALEN individuais afetam a atividade.
[0075]A relação entre sequência de aminoácido e reconhecimento de DNA do domínio de ligação TALE permite proteínas configuráveis. Programas de Software tais como DNA Works podem ser usados para configurar construtos TALE. Outros métodos de configuração de construtos TALE são conhecidos pelo versado na técnica. Vide Cermak, T.; Doyle, E. L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C; Bailer, J. A.; Somia, N. V. et al. (201 1). "Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting". Nucleic Acid Research. doi: 10.1093/nar/gkr218; Zhang, Feng; et.al. (February 2011). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription", Nature Biotechnology 29 (2): 149-53; Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T. (201 1). "Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning". Nucleic Acid Research. doi: 10' 1093/nar/gkrl51; Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D. A.; Carpenter, S.; Spalding, M. H.; Weeks, D. P.; Yang, B. (201 1). "Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes". Nucleic Acid Research. doi"10.1093/nar/gkrl 88; Gei ier, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (201 1). "Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity". In Shiu, Shin-Han. PLoS ONE 6 (5): el9509; Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C; Marillonnet, S. (201 1). "Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning". In Bendahmane, Mohammed. PLoS ONE 6 (5): el 9722 aqui incorporadas por referência em seus textos integrais. De acordo comum aspecto representativo, uma vez que os genes TALEN tenham sido montados eles podem ser inseridos em plasmídeos de cordo com certas concretizações; os plasmídeos são em seguida transfectados à célula alvo os produtos gênicos são expressos e inserem no núcleo para acessar o genoma. De acordo com aspectos representativos, TALENs conforme aqui descritos podem ser usados para editar ácidos nucleicos alvo, tais como genomas, pela indução de quebras de fita-dupla (DSB), cujas células respondem com mecanismos de reparo. Mecanismos de reparo representativos incluem união de ponta não- homóloga (NHEJ) que reconecta DNA a partir de um lado ou de outro de uma quebra de fita dupla onde existe pouquíssima sobreposição de sequência ou nenhuma sobreposição de sequência para pareamento. Este mecanismo de reparo induz a erros no genoma via inserção ou deleção (indels), ou rearranjo cromossomal quaisquer erros desse tipo podem fornecer os produtos gênicos codificados naquele local não-funcional. Vide Miller, Jeffrey; et.al. (February 201 1). "A TALE nuclease architecture for efficient genome editing". Nature Biotechnology 29 (2): 143-8 aqui incorporada por referência em sua totalidade. Tendo em vista o fato desta atividade poder variar em função das espécies, tipo de célula, gene-alvo e nuclease usada, a atividade pode ser monitorada pelo uso de um ensaio de clivagem heteroduplex que detecta qualquer diferença entre dois alelos amplificados por PCR. Produtos de clivagem podem ser visualizados em géis de agarose simples ou sistemas de gel empregado em eletroforese de placa (slab gel). Alternativamente, DNA pode ser introduzido em um genoma através de NHEJ na presença de fragmentos de DNA de fita dupla exógeno. Reparo direcionado por homologia também pode introduzir DNA exógeno no DSB conforme as sequências de fita dupla transfectadas são usadas como padrões para as enzimas de reparo. De acordo com certos aspectos os TALENs aqui descritos podem ser usados para gerar célula-tronco embrionária humana estavelmente modificada e clones de célula-tronco pluripotente induzida (IPSCs). De acordo com certos aspectos os TALENs aqui descritos podem ser usados para gerar espécies nocaute tais como C. elegans, ratos nocaute, camundongo nocaute ou peixe-zebra nocaute.
[0076]De acordo com um aspecto da presente descrição, concretizações referem-se ao uso de DNA exógeno, enzimas de nucleasse tais como proteína de ligação de DNAse RNA guias para colocalizar o DNA dentro de uma célula-tronco e digerir ou cortar o DNA com inserção do DNA exógeno. Tais proteínas de ligação de DNA são prontamente conhecidas pelo versado na técnica para ligar ao DNA para diversos fins. Tais proteínas de ligação de DNA podem ser de ocorrência natural, proteínas de ligação de DNA incluídas dentro do escopo da presente descrição incluem aquelas que podem ser guiadas por RNA, aqui denominadas como RNA guia. De acordo com este aspecto, o RNA guia e a proteína de ligação de DNA guiado por RNA formam um complexo de co-localização no DNA. Tais proteínas de ligação de DNA com atividade de nuclease são conhecidas no estado da técnica, e incluem proteínas de ligação de DNA de ocorrência natural com atividade de nuclease, tal como Proteína Cas9 s presente, por exemplo, em Sistemas CRISPR tipo II. Tais proteínas Cas9 e Sistemas CRISPR tipo II são bem documentados no estado da técnica. Vide Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, junho 201 1, pp. 467-477 incluindo informação suplementar aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[0077]Proteínas de ligação de DNA representativas com atividade de nuclease funcionam para entalhar ou cortar DNA de fita dupla. Tal atividade de nucleasse pode resultar da proteína de ligação de DNA com uma ou mais sequências de polipeptídeo exibindo atividade de nuclease. Tais proteínas de ligação de DNA representativas podem apresentar dois domínios de nucleasse separados sendo cada domínio responsável pelo corte ou entalhe de uma fita específica do DNA de fita dupla. Sequências de polipeptídeo representativas com atividade de nuclease conhecida pelo versado na técnica incluem domínio relacionado a nuclease McrA-HNH e o domínio de nuclease tipo RuvC. Correspondentemente, proteínas de ligação de DNA representativas são aquelas que contêm in natura um ou mais do domínio relacionado a nucleasse McrA-HNH e domínio de nuclease tipo RuvC.
[0078]Uma proteína de ligação de DNA representativa é um sistema CRISPR do tipo II de proteína de ligação de DNA guiado por RNA. Uma proteína de ligação de DNA representativa é uma Proteína Cas9 .
[0079]M S. pyogenes, Cas9 gera uma quebra de fita dupla de ponta arredondada 3bp a montante do motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) via um processo mediado por dois domínios catalíticos na proteína: um domínio HNH que cliva a fita complementar do DNA e um domínio tipo RuvC que cliva a fita não- complementar. Vide Jinke et al., Science 337, 816-821 (2012) aqui incorporada por referência em sua totalidade. Proteínas Cas9 são conhecidas por existirem em muitos Sistemas CRISPR tipo II incluindo os seguintes conforme identificados na informação suplementar a Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, Junho 2011, pp. 467-477: Methanococcus maripaludis C7; Corynebacterium diphtheriae; Corynebacterium efficiens YS-314; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Kitasato; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Bielefeld; Corynebacterium glutamicum R; Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385; Mycobacterium abscessus ATCC 19977; Nocardia farcinica IFM10152; Rhodococcus erythropolis PR4; Rhodococcus jostii RHAl; Rhodococcus opacus B4 uid36573; Acidothermus cellulolyticus 1 1B; Arthrobacter chlorophenolicus A6; Kribbella flavida DSM 17836 uid43465; Thermomonospora curvata DSM 43183; Bifidobacterium dentium Bdl; Bifidobacterium longum DJO10A; Slackia heliotrinireducens DSM 20476; Persephonella marina EX HI; Bacteroides fragilis NCTC 9434; Capnocytophaga ochracea DSM 7271; Flavobacterium psychrophilum JIP02 86; Akkermansia muciniphila ATCC BAA 835; Roseiflexus castenholzii DSM 13941; Roseiflexus RSI; Synechocystis PCC6803; Elusimicrobium minutum Peil91; uncultured Termite group 1 bacterium phylotype Rs D17; Fibrobacter succinogenes S85; Bacillus cereus ATCC 10987; Listeria innocua; Lactobacillus casei; Lactobacillus rhamnosus GG; Lactobacillus salivarius UCC1 18; Streptococcus agalactiae A909; Streptococcus agalactiae NEM316; Streptococcus agalactiae 2603; Streptococcus dysgalactiae equisimilis GGS 124; Streptococcus equi zooepidemicus MGCS 10565; Streptococcus gallolyticus UCN34 uid46061; Streptococcus gordonii Challis subst CHI; Streptococcus mutans NN2025 uid46353; Streptococcus mutans; Streptococcus pyogenes Ml GAS; Streptococcus pyogenes MGAS5005; Streptococcus pyogenes MGAS2096; Streptococcus pyogenes MGAS9429; Streptococcus pyogenes MGAS 10270; Streptococcus pyogenes MGAS6180; Streptococcus pyogenes MGAS315; Streptococcus pyogenes SSI-1; Streptococcus pyogenes MGAS 10750; Streptococcus pyogenes NZ131; Streptococcus thermophiles CNRZ1066; Streptococcus thermophiles LMD-9; Streptococcus thermophiles LMG 1831 1; Clostridium botulinum A3 Loch Maree; Clostridium botulinum B Eklund 17B; Clostridium botulinum Ba4 657; Clostridium botulinum F Langeland; Clostridium cellulolyticum H10; Finegoldia magna ATCC 29328; Eubacterium rectale ATCC 33656; Mycoplasma gallisepticum; Mycoplasma mobile 163K; Mycoplasma penetrans; Mycoplasma synoviae 53; Streptobacillus moniliformis DSM 12112; Bradyrhizobium BTAil; Nitrobacter hamburgensis X14; Rhodopseudomonas palustris BisB18; Rhodopseudomonas palustris BisB5; Parvibaculum lavamentivorans DS-1; Dinoroseobacter shibae DFL 12; Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 FAPERJ; Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 JGI; Azospirillum B510 uid46085; Rhodospirillum rubrum ATCC 1 1 170; Diaphorobacter TPSY uid29975; Verminephrobacter eiseniae EF01-2; Neisseria meningitides 053442; Neisseria meningitides alphal4; Neisseria meningitides Z2491; Desulfovibrio salexigens DSM 2638; Campylobacter jejuni doylei 269 97; Campylobacter jejuni 81 1 16; Campylobacter jejuni; Campylobacter lari RM2100; Helicobacter hepaticus; Wolinella succinogenes; Tolumonas auensis DSM 9187; Pseudoalteromonas atlantica T6c; Shewanella pealeana ATCC 700345; Legionella pneumophila Paris; Actinobacillus succinogenes 130Z; Pasteurella multocida; Francisella tularensis novicida U1 12; Francisella tularensis holarctica; Francisella tularensis FSC 198; Francisella tularensis tularensis; Francisella tularensis WY96- 3418; e Treponema denticola ATCC 35405. Correspondentemente, aspectos da presente descrição referem-se a uma Proteína Cas9 presente em um Sistema CRISPR tipo II.
[0080]A Proteína Cas9 pode ser referida pelo versado na técnica na literatura como Csnl. A proteína S. pyogenes Cas9 é mostrada a seguir. Vide Deltcheva et al., Nature 471, 602-607 (2011) aqui incorporada por referência em sua totalidade. MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLF DSGETAE ATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHP IFG NIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNS D VDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLF GN LIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSD AI LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNG YA GYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGE LH AILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNF EE VVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTE GMRKPAFL SGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLL KI IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTG WG RLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQG DSL HEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNS RER MKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYD VDH IVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKF DNL TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITL KS KLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYD VR K MIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVW DKGRDF ATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDS PTVA YSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLP K YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQ LFVE QHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGA PAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD-
[0081]De acordo com um aspecto, a proteína de ligação de DNA guiado por RNA inclui homólogos e ortólogos de Cas9 que apresenta a capacidade da proteína se ligar ao DNA, ser guiada pelo RNA e cortar o DNA. De acordo com um aspecto, a Proteína Cas9 inclui a sequência conforme estabelecida para Cas9 de ocorrência natural de S. pyogenes e sequências de proteína com pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% de homologia a isso e sendo uma proteína de ligação de DNA, tal como uma proteína de ligação de DNA guiado por RNA.
[0082]De acordo com um aspecto, um sistema Cas9-gRNA projetado é provido o qual permite o corte de genoma guiado por RNA de modo sítio-específico em uma célula-tronco, se desejado e modificação do genoma da célula-tronco pela inserção de ácidos nucleicos doadores exógenos. Os RNAs guia são complementares aos sítios-alvo ou locus-alvo no DNA. Os RNAs guia podem ser quimeras crRNA- tracrRNA. Os RNAs guia podem ser introduzidos do meio que circunda a célula. Desse modo um método de modificação contínua de uma célula é provido na medida em que vários RNAs guia são providos a meios circundantes com captação pela célula dos RNAs guia e com suplementação dos meios com RNAs guia adicionais. Suplementação pode ser de modo contínuo. O Cas9 se liga ao ou próximo ao DNA genômico-alvo. Um ou mais RNAs guia se ligam ao ou próximo ao DNA genômico alvo. O Cas9 corte o DNA genômico alvo e DNA doador exógeno é inserido no DNA no sítio de corte.
[0083]Correspondentemente, métodos referem-se ao uso de um RNA guia com uma Proteína Cas9 e um ácido nucleico doador exógeno para inserções multiplex de ácidos nucleicos doadores exógenos no DNA dentro de uma célula- tronco que expressa Cas9 pela ciclagem da inserção de ácido nucleico que codifica o RNA (ou provê RNA a partir do meio circundante) e ácido nucleico doador exógeno, expressando o RNA (ou captando o RNA), colocalizando o RNA, Cas9 e DNA de modo a cortar o DNA, e inserção do ácido nucleico doador exógeno. As etapas de método podem ser cicladas em um número desejado para resultar em qualquer número desejado de Modificação de DNAs. Métodos da presente descrição são correspondentemente direcionados à edição de genes-alvo utilizando as Proteínas Cas9 e RNAs guia aqui descritos a fim de prover genética multiplex e engenharia genética de células-troncos.
[0084]Outros aspectos da presente descrição referem-se ao uso de proteína de ligação de DNAs ou sistemas (tais como o TALENS modificado ou Cas9 aqui descritos) em geral para a inserção multiplex de ácidos nucleicos doadores exógenos no DNA, tal como DNA genômico, de uma célula-tronco, tal como uma célula-tronco humana. O versado na técnica identificará prontamente sistemas de ligação de DNA representativos com base na presente descrição.
[0085]Células de acordo com a presente descrição, a menos que conste indicação diferente, incluem qualquer célula na qual ácidos nucleicos exógenos podem ser introduzidos e expressados conforme aqui descritos. Naturalmente que os conceitos básicos da presente descrição aqui descritos não estão limitados por qualquer tipo de célula. Células de acordo com a presente descrição incluem células somáticas, células-tronco, células eucarióticas, célula procarióticas, células de animal, células de planta, células fúngicas, células arqueais, células eubacteriana e similares. Células incluem células eucarióticas tais como células de levedura, células de planta e células de animal. Células específicas incluem células de mamíferos, tais como células humanas. Além disso, células incluem qualquer uma que fosse benéfica e desejada para fins de modificação do DNA.
[0086]Ácidos nucleicos alvo incluem qualquer sequência de ácido nucleico para a qual um TALEN ou proteína de ligação de DNA guiado por RNA com atividade de nuclease conforme aqui descrito possa ser útil a fim de entalhar ou cortar. Ácidos nucleicos alvo incluem qualquer sequência de ácido nucleico para a qual um complexo de co-localização conforme aqui descrito possa ser útil para entalhar ou cortar. Ácidos nucleicos alvo incluem genes. Para fins da presente descrição, DNA, tal como DNA de fita dupla, pode incluir o ácido nucleico alvo e um complexo de co-localização pode se ligar ao ou de outra forma colocalizar o DNA ou um TALEN pode de outra forma se ligar ao DNA em ou adjacente ou próximo ao ácido nucleico alvo e de forma que o complexo de co-localização ou o TALEN possa apresentar um efeito desejado sobre o ácido nucleico alvo. Tais ácidos nucleicos alvo podem incluir ácidos nucleicos endógenos (ou de ocorrência natural) e ácidos nucleicos exógenos (ou exógeno). O versado na técnica com base na presente descrição poderá prontamente identificar ou configurar RNAs guia e Proteínas Cas9 que colocalizam um DNA ou um TALEN que se liga a um DNA, incluindo um ácido nucleico alvo. O versado na técnica poderá ainda identificar proteínas de regulador transcricional ou domínios tais como ativadores transcricionais ou repressores transcricionais que igualmente colocalizam um DNA incluindo um ácido nucleico alvo. DNA inclui DNA genômico, DNA mitocondrial, DNA viral ou DNA exógeno. De acordo com um aspecto, materiais e métodos úteis na prática da presente descrição incluem aqueles descritos em Di Carlo, et al., Nucleic Acid Research, 2013, vol. 41, No. 7 4336-4343 aqui incorporada por referência em sua totalidade para fins de inclusão de cepas representativas e meios, construção de plasmídeo, transformação de plasmídeos, eletroporação de cassete gRNA transciente e doadores de ácido nucleico, transformação de plasmídeo de gRNA com DNA doador em células que expressam Cas9, indução por galactose de Cas9, identificação de alvos CRISPR- Cas em genoma de levedura, etc. Referências adicionais incluindo informação, materiais e métodos úteis ao técnico no assunto na realização da invenção são providos em Mali,P., Yang,L., Esvelt,K.M., Aach,J., Guell,M., DiCarlo,J.E., Norville,J.E. e Church,G.M. (2013) RNA-Guided human genoma engineering via Cas9. Science, 10.1 126fscience.1232033; Storici, F., Durham,C.L., Gordenin,D.A. e Resnick,M.A. (2003) Chromosomal site-specific double-strand breaks are efficiently targeted for repair by oligonucleotídeos in yeast. PNAS, 100, 14994-14999 and Jinek, M., Chylinski,K., Fonfara,l., Hauer,M., Doudna,J.A. e Charpentier,E. (2012) A programmable dual-RNA-Guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337, 816-821 cada um sendo aqui incorporado por referência em seus textos integrais para todos os fins. Ácidos nucleicos exógenos (i.e., aqueles que não são parte de uma composição de ácido nucleico natural de célula) podem ser introduzidos em uma célula usando qualquer método conhecido pelo versado na técnica para tal introdução. Tais métodos incluem transfecção, transdução, transdução viral, micro injeção, lipofecção, nucleofecção, bombardeamento de nanopartícula, transformação, conjugação e similar. O versado na técnica entenderá prontamente e adaptará tais métodos utilizando fontes de literatura prontamente identificáveis.
[0087]Ácidos nucleicos doadores incluem qualquer ácido nucleico a ser inserido em uma sequência de ácido nucleico conforme aqui descrito.
[0088]Os exemplos a seguir são estabelecidos como sendo representativos da presente descrição. Esses exemplos não são concebidos como limitativos do escopo da presente descrição já que eles e outras concretizações equivalentes ficarão aparentes com base na presente descrição, figuras e reivindicações de acompanhamento.
EXEMPLO I Montagem de RNA guia
[0089]19 bp da sequência alvo selecionada (i.e. 5'-N19 of 5'-N19-NGG-3') foram incorporados em dois oligonucleotídeos de 100mer (TTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGN 19GTTTTAGAGCTAGAA ATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC). Cada oligonucleotídeo de 100mer foi suspenso em 100mM em água, misturado com igual volume e anelado em máquina de termociclo (95°C, 5min; rampa a 4°C, 0.1°C/seg). Para preparar o vetor de destinação, o vetor de clonagem gRNA (plasmídeo Addgene ID 41824) foi linearizado utilizando-se Aflll e o vetor foi purificado. A reação de montagem de gRNA (10ul) foi realizada com 10ng de fragmento com 100bp anelado, 100ng de estrutura de destinação, mistura de reação de montagem IX Gibson (New England Biolabs) a 50°C por 30min. A reação pode ser processada diretamente para transformação bacteriana a fim de colonizar montagens individuais.
EXEMPLO II Configuração e montagem de TALEs recodificados
[0090]re-TALEs foram otimizados em diferentes níveis a fim de facilitar a montagem, e melhorar a expressão. Sequências de DNA re-TALE foram primeiramente co-otimizadas para um uso de códon humano e baixa energia de dobramento de mRNA na ponta 5' (GeneGA, Bioconductor). A sequência obtida foi desenvolvida através de diversos ciclos a fim de eliminar repetições (diretas ou invertidas) mais do que 11 bp (Vide figura 12). Em cada ciclo, sequências sinônimas para cada repetição foram analisadas. Aquelas com a distância Hamming máxima em relação ao DNA em desenvolvimento DNA são selecionadas. A sequência de um dos 16.5 monômeros que possuem re-TALE é a seguinte CTAACCCCTGAACAGGTAGTCGCTATAGCTTCAAATATCGGGGGCAAGC AAGCACTTG AGACCGTTCAACGACTCCTGCCAGTGCTCTGCCAAGCCCATGGATTGACTCCG GAGCA AGTCGTCGCGATCGCGAGCAACGGCGGGGGGAAGCAGGCGCTGGAAACTGTT CAGAG ACTGCTGCCTGTACTTTGTCAGGCGCATGGTCTCACCCCCGAACAGGTTGTCGC AATA GCAAGTAATATAGGCGGTAAGCAAGCCCTAGAGACTGTGCAACGCCTGCTCCC CGTGC TGTGTCAGGCTCACGGTCTGACACCTGAACAAGTTGTCGCGATAGCCAGTCAC GACGG GGGAAAACAAGCTCTAGAAACGGTTCAAAGGTTGTTGCCCGTTCTGTGCCAAGC ACAT GGGTTAACACCCGAACAAGTAGTAGCGATAGCGTCAAATAACGGGGGTAAACA GGCT TTGGAGACGGTACAGCGGTTATTGCCGGTCCTCTGCCAGGCCCACGGACTTAC GCCAG AACAGGTGGTTGCAATTGCCTCCAACATCGGCGGGAAACAAGCGTTGGAAACT GTGC AGAGACTCCTTCCTGTTTTGTGTCAAGCCCACGGCTTGACGCCTGAGCAGGTTG TGGC CATCGCTAGCCACGACGGAGGGAAGCAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGACTTC TCCCA GTTTTGTGCCAAGCTCACGGGCTAACCCCCGAGCAAGTAGTTGCCATAGCAAG CAACG GAGGAGGAAAACAGGCATTAGAAACAGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTACTCTGTC AGG CACACGGTCTAACTCCGGAACAGGTCGTAGCCATTGCTTCCCATGATGGCGGC AAACA GGCGCTAGAGACAGTCCAGAGGCTCTTGCCTGTGTTATGCCAGGCACATGGCC TCACC CCGGAGCAGGTCGTTGCCATCGCCAGTAATATCGGCGGAAAGCAAGCTCTCGA AACA GTACAACGGCTGTTGCCAGTCCTATGTCAAGCTCATGGACTGACGCCCGAGCA GGTAG TGGCAATCGCATCTCACGATGGAGGTAAACAAGCACTCGAGACTGTCCAAAGAT TGTT ACCCGTACTATGCCAAGCGCATGGTTTAACCCCAGAGCAAGTTGTGGCTATTGC ATCT AACGGCGGTGGCAAACAAGCCTTGGAGACAGTGCAACGATTACTGCCTGTCTTA TGTC AGGCCCATGGCCTTACTCCTGAGCAAGTCGTAGCTATCGCCAGCAACATAGGT GGGAA ACAGGCCCTGGAAACCGTACAACGTCTCCTCCCAGTACTTTGTCAAGCACACGG GTTG ACACCGGAACAAGTGGTGGCGATTGCGTCCAACGGCGGAGGCAAGCAGGCAC TGGAG ACCGTCCAACGGCTTCTTCCGGTTCTTTGCCAGGCTCATGGGCTCACGCCAGA GCAGG TGGTAGCAATAGCGTCGAACATCGGTGGTAAGCAAGCGCTTGAAACGGTCCAG CGTCT TCTGCCGGTGTTGTGCCAGGCGCACGGACTCACACCAGAACAAGTGGTTGCTA TTGCT AGTAACAACGGTGGAAAGCAGGCCCTCGAGACGGTGCAGAGGTTACTTCCCGT CCTCT GTCAAGCGCACGGCCTCACTCCAGAGCAAGTGGTTGCGATCGCTTCAAACAAT GGTGG AAGACCTGCCCTGGAA
[0091]De acordo com certos aspectos, TALEs podem ser usados com pelo menos 80% de identidade de sequência, pelo menos 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, pelo menos 98% de identidade de sequência, ou pelo menos 99% de identidade de sequência em relação à sequência acima. O versado na técnica entenderá prontamente onde a sequência acima poderá variar mantendo ao mesmo tempo a atividade de ligação de DNA do TALE.
[0092]Blocos de dímero re-TALE que codificam dois RVDs (vide Fig. 6A) foram gerados por duas rodadas de PCR sob condições padrão Kapa HIFI (KPAP) PCR nas quais a primeira rodada de PCR introduziu a sequência codificadora de RVD e a segunda rodada de PCR gerou os blocos de dímero totais com sobreposições 36bp com os blocos adjacentes. Produtos PCR foram purificados utilizando-se QIAquick 96 PCR Purification Kit (QIAGEN) e as concentrações foram medidas por Nano-drop. O primer e sequências padrão estão listados na tabela 1 e tabela 2 a seguir.Tabela 1. Sequências de blocos re-TALE Tabela 2 - Sequências de primers de blocos de re-TALE
[0093]Vetores de destinação re-TALENs e re-TALE-TF foram construídos pela modificação das estruturas de clonagem TALE-TF e TALEN (vide referência 24 aqui incorporada por referência em sua totalidade). As regiões 0.5 RVD nos vetores foram recodificadas e sítios de corte Sapl foram incorporados no sítio de clonagem de re-TALE designado. As sequências de estruturas de re-TALENs e re-TALE-TF são providas na figura 20. Plasmídeos podem ser previamente tratados com Sapl (New England Biolabs) com condições recomendadas por fabricantes e purificadas com kit de purificação QIAquick PCR (QIAGEN).
[0094]Uma reação de montagem TASA(lOul) de uma só etapa foi realizada com 200ng de cada bloco, 500ng de estrutura de destinação, mistura de enzima IX TASA (2U Sapl, 100U Ampligase (Epicentre), lOmU T5 exonuclease (Epicentre), 2.5U Phusion DNA polimerase (New England Biolabs)) e tampão de reação de montagem isotérmica IX conforme descrito anteriormente (vide referência 25 aqui incorporada por referência em sua totalidade) (5% PEG-8000, 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgC12, 10 mM DTT, 0.2 mM cada um dos quatro dNTPs e 1 mM NAD). Incubações foram realizadas a 37°C por 5minutos e 50 °C por 30 minutos. Reação de montagem TASA pode ser processada diretamente para transformação bacteriana a fim de colonizar montagens individuais. A eficiência na obtenção de construto de comprimento integral é de -20% com este método. Alternativamente, >90% de eficiência pode ser atingida através de uma montagem de três etapas. Primeiramente, reações de montagem lOul re-TALE são feitos com 200ng de cada bloco, mistura de enzima IX re- TALE (100U Ampligase, 12.5mU T5 exonuclease, 2.5U Phusion DNA polimerase) e tampão de montagem isotérmica IX a 50°C por 30minutos, seguido por reação Kapa HIFI PCR padronizada, eletroforese em gel agarose, e extração de QIAquick Gel (Qiagen) para enriquecer os re-TALEs de comprimento integral. 200ng de Amplicons re-TALE podem ser em seguida misturados com 500ng de estrutura de destinação previamente tratada com Sapl, mistura de montagem IX re-TALE e tampão de mistura de montagem isotérmica IX e incubada a 50 °C por 30 minutos. A reação de montagem re-TALE final pode ser processada diretamente para transformação bacteriana para colonizar montagens individuais. O versado na técnica poderá selecionar prontamente endonucleases, exonucleases, polimerases e ligases de entre aquelas conhecidas para a prática dos métodos aqui descritos. Por exemplo, tipo lis endonucleases podem ser usados tais como: Fok 1, Bts I, Ear I, Sap I. Exonucleases que são tituláveis posem ser usadas tal como lambda exonuclease, T5 exonuclease e Exonuclease III. Polimerases do tipo não-hotstart podem ser usadas, tais como polimerase de DNA de fusão, polimerase de DNA Taq e polimerase de DNA VentR. Ligases termoestáveis podem ser usadas nesta reação tais como Ampligase, ligase de pfu DNA, ligase de Taq DNA. Além disso diferentes condições de reação poderão ser usadas para ativar tais endonucleases, exonucleases, polimerases e ligases dependendo das espécies específicas usadas.
EXEMPLO III Linhagem celular e cultura celular
[0095]Células PGP1 iPS foram mantidas em placas revestidas com Matrigel (BD Biosciences) em mTeSRl (Stemcell Technologies). Culturas foram passadas a cada 5-7 dias com TrypLE Express (Invitrogen). Células 293T e 293FT foram desenvolvidas e mantidas no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Invitrogen) suplementada com elevada glucose com soro de feto bovino a 10% (FBS, Invitrogen), penicilina/estreptomicina (pen/strep, Invitrogen), e aminoácidos não-essenciais (NEAA, Invitrogen). Células K562 foram desenvolvidas e mantidas em RPMI (Invitrogen) suplementada com 10% de soro de feto bovino (FBS, Invitrogen 15%) e penicilina/estreptomicina (pen/strep, Invitrogen). Todas as células foram mantidas a 37°C e de C02 a 5% em incubador umidificado.
[0096]Uma linhagem celular 293T estável para detecção de Eficiência HDR foi estabelecida conforme descrito na referência 26 aqui incorporada por referência em sua totalidade. Especificamente, as linhagens celulares repórteres suportam sequências codificadoras de GFP genomicamente integradas interrompidas pela inserção de um códon de terminação e um fragmento genômico 68bp derivado do locus AAVS l.
EXEMPLO IV Teste de atividade de re-TALENs
[0097]Células repórteres 293T foram semeadas em densidades de 2 x 105 células por cavidade em placa de 24 cavidades e a transfectaram com cada plasmídeo de re-TALENse 2μg de plasmídeo de DNA doador utilizando Lipofectamina 2000 seguindo os protocolos de fabricante. As células foram colhidas utilizando-se TrypLE Express (Invitrogen) —18 h após a transfecção e resuspensas em 200 μl de meios para análise de citometria de fluxo utilizando-se i, analisador de célula LSRFortessa (BD Biosciences). Os dados de citometria de fluxo foram analisados utilizando-se FlowJo (FlowJo). Pelo menos 25,000 eventos foram analisados para cada amostra de transfecção. Para teste de alvejamento de locus AAVSl endógeno em 293T, os procedimentos de transfecção foram iguais conforme descrito acima e seleção de puromicina foi conduzida com concentração de fármaco a 3μg/ml 1 semana após transfecção.
EXEMPLO V Análise de geração Lentivirus funcional
[0098]Os vetores lentivirais foram criados pela técnica padrão PCR e de clonagem. Os plasmídeos lentivirais foram transfectados por Lipofectamina 2000 com mistura de embalagem lentiviral (Invitrogen) em células 293FT cultivadas (Invitrogen) para produzir lentivirus. Sobrenadante foi coletado 48 e 72hs pós- transfecção, filtrado por via estéril e 100ul de sobrenadante filtrado foram adicionados a 5 x 105 de células 293T jovens com polibreno. Titulação de Lentivirus foi calculada com base na seguinte formula : titulação de vírus = (porcentagem de GFP+ célula 293T * números de célula inicial sob transdução) / (o volume de sobrenadante coletor de vírus original usado no teste de transdução). Para testar a funcionalidade do lentivirus, 3 dias após transdução, células 293T com transdução lentiviral foram transfectadas com 30 ng de plasmídeos portando plasmídeos mCherry repórteres e 500ng de plasmídeos pUC19 utilizando-se Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Imagens de célula foram analisadas utilizando-se observador Axio Z. l (Zeiss) 18 horas após a transfecção e colhidas utilizando-se TrypLE Express (Invitrogen) e resuspensas em 200 μl de meio para análise de citometria de fluxo utilizando-se um analisador de célula LSRFortessa (BD Biosciences). Os dados de citometria de fluxo foram analisadas utilizando-se BD FACSDiva (BD Biosciences).
EXEMPLO VI Teste de eficiência de edição de genoma de re-TALENs e de Cas9-gRNA
[0099]PGP1 iPSCs foram cultivadas em inibidor Rho quinase (ROCK) Y- 27632 (Calbiochem) 2h antes da nucleofecção. Transfecções foram feitas utilizando- se 4D-Nucleofector de célula primária P3 X Kit (Lonza). Especificamente, as células foram colhidas utilizando-se TrypLE Express (Invitrogen) e células 2x 106 foram resuspensas em 20 μl de mistura de nucleofecção contendo 16.4 μl de solução P3 Nucleofector, 3.6 μl de suplemento, 1μg de cada plasmídeo de re-TALENs ou construto lug Cas9 e lug gRNA, 2μl de 100 μM de ssODN. Subsequentemente, as misturas foram transferidas para 20μl de tiras de Nucleocuvette e nucleofecção foi conduzida utilizando-se programa CB 150. As células foram transferidas para placas revestidas com Matrigel em meio mTeSRl suplementado com inibidor ROCK para as primeiras 24 horas. Para teste de direcionamento ao locus I AAVS endógeno com doador dsDNA, o mesmo procedimento foi feito exceto que 2 μg de doador dsDNA foram usados e o meio mTeSRl foi suplementado com puromicina na concentração de 0.5ug/mL 1 semana após transfecção.
[00100]As informações de reTALENs, gRNA e ssODNs usados neste exemplo estão listadas na tabela 3 e 4 a seguir.Tabela 3. In formação de pares re-TA LEN /Cas9-gR NA que alvejam CCR5
[00101] Tabela 4 - Configuração ssODN para estudo de edição de genoma ssODN- mediada
EXEMPLO VII Preparação de Banco de Amplicon das regiões de alvejamento
[00102]Células foram colhidas 6 dias após a nucleofecção e 0.1 μl de enzima protease tecidual prepGEM (ZyGEM) e 1 μl de tampão prepGEM gold (ZyGEM) foram adicionadas a 8.9 μl das células 2-5 X 105 no meio, 1ul das reações foi em seguida adicionado a 9 μl de mistura PCR contendo 5ul de 2X KAPA Hifi Hotstart Readymix (KAPA Biosystems) e 100nM de pares primer de amplificação correspondentes. Reações foram incubadas a 95°C por 5 minutos seguidas por 15 ciclos de 98°C, 20 s; 65°C, 20 s e 72°C, 20 s. Para adicionar o adaptador de sequência Illumina usado, 5 μl de produtos de reação foram em seguida adicionados a 20 μl de mistura PCR contendo 12.5 μl de 2X KAPA HIFI Hotstart Readymix (KAPA Biosystems) e 200 nM de primers carreando adaptadores de sequência Illumina. As reações foram incubadas a 95°C por 5min seguidas por 25 ciclos de 98°C, 20s; 65°C, 20s e 72°C, 20s. Produtos PCR foram purificados pelo kit de purificação QIAquick PCR misturados na mesma concentração aproximadamente e sequenciados com sequenciador MiSeq Personal. Os primers PCR estão listados na tabela 5 a seguir.Tabela 5. Sequências de primer PCR de sítio de alvejamento CCR5 *Índice - Primers PCR são adquiridos de epicentro (ScriptSeq™ índice primers PCR)
EXEMPLO VIII Sistema de Análise de Edição de genoma (GEAS)
[00103]O sequenciamento de próxima geração havia sido utilizado para detectar alterações genômicas. Vide referências 27-30 aqui incorporadas por referência em seus textos integrais. Para permitir amplo uso desta abordagem para acessar rapidamente eficiência HDR e NHEJ em hiPSCS, foi criado software, referido como um "conduto" para analisar os dados de engenharia genômica. Este conduto é integrado em um único modulo Unix que usa diferentes ferramentas tais como R, BLAT, e FASTX Toolkit.
[00104]Divisão de código de barra: Grupos de amostras foram agrupados e sequenciados utilizando-se ponta pareada MiSeq 150bp (PE150) (sequenciamento de próxima geração Illumina), e mais tarde separados com base em códigos de barra DNA utilizando-se FASTX Toolkit.
[00105]Filtração de qualidade: Nucleotídeos com qualidade de sequência inferior (escala phred <20) foram trimados. Após a trimagem, reads mais curtos do que 80 nucleotídeos foram descartados.
[00106]Mapeamento: BLAT foi usado para mapear os reads pareados independentemente do genoma de referência e arquivos .psl foram gerados como saída.
[00107]Chamada Indel: Indels foram definidos como os reads de comprimento total contendo 2 blocos de combinações no alinhamento. Apenas reads que seguem este padrão em ambos reads terminais pareados foram considerados. Como controle de qualidade, os reads indel foram necessários para possuir 70 nt mínimos combinando com o genoma de referência e ambos os blocos serem pelo menos 20 nt de comprimento. Tamanho e posição de indels foram calculados pelas posições de cada bloco em relação ao genoma de referência. União de ponta não- homóloga (NHEJ) havida sido estimada como a porcentagem de reads contendo indels (vide equação 1 a seguir). A maioria de eventos NHEJ havia sido detectada nas proximidades de sítio de alvejamento.
[00108]Eficiência de recombinação dirigida por homologia (HDR): combinação de padrão (grep) dentro de uma janela 12bp centrando DSB foi usada para contar assinaturas específicas correspondente a reads contendo a sequência de referência, modificações da sequência de referência (pareamentos incompatíveis pretendidos 2bp), e reads contendo apenas mutação lbp dentro dos pareamentos incompatíveis 2bp pretendidos (vide equação 1 a seguir).
[00109]Equação 1. Estimativa de NHEJ e HDR
[00110]A= reads iguais à referência: XXXXXABXXXXX
[00111]B= reads contendo pareamento incompatível 2bp programado por ssODN: XXXXXabXXXXX
[00112]C= reads contendo apenas mutação 1 bp no sítio-alvo: tal como XXXXXaBXXXXX ou XXXXXAbXXXXX
[00113]D = reads contendo indels conforme descrito acima
EXEMPLO IX Varredura de genótipo de hiPSCs colonizadas
[00114]Células iPS humanas em culturas livres de alimentador foram previamente tratadas com meio mTesr-1 suplementado com SMC4 (5 uM thiazovivin, 1 uM CHIR99021, 0.4 uM PD0325901, 2 uM SB431542) (vide referência 23 aqui incorporada por referência em sua totalidade) por pelo menos 2 hs antes da separação por FACS. Culturas foram dissociadas utilizando-se Accutase (Millipore) e resuspensas em meio mTesr- 1 suplementado com SMC4 e um corante de viabilidade ToPro-3 (Invitrogen) na concentração de 1-2 XI 07 /mL. Células hiPS vivas foram separadas em única-célula utilizando-se um BD FACSAria II SORP UV (BD Biosciences) com bico atomizador 1 OOum sob condições estéreis em placas com 96 cavidades com fibroblastos embrionários de camundongo irradiados (Global Stem). Cada cavidade continha meio celular hES (vide referência 31 aqui incorporada por referência em sua totalidade) com 100 ng / ml de fator de crescimento de fibroblasto humano recombinante (bFGF) (Millipore) suplementado com SMC4 e 5 ug / ml de fibronectina (Sigma). Após separação, placas foram centrifugadas em 70 x g por 3 minutos. Formação de colônia foi vista 4 dias após a separação e o meio de cultura foi substituído com meio de cultura hES com SMC4. SMC4 pode ser removido do meio de cultura hES 8 dias após a separação.
[00115]Alguns milhares de células foram colhidas 8 dias após a separação celular ativada por fluorescência (FACS) e enzima de protease tecidual O. lul prepGEM (ZyGEM) e tampão lul prepGEM gold (ZyGEM) foram adicionados a 8.9 μl de células no meio. As reações foram em seguida adicionadas a 40 μl de mistura PCR contendo 35.5ml de platinum 1.1X Supermix (Invitrogen), 250nM de primers dNTP e 400nM respectivamente. As reações foram incubadas a 95°C por 3minutos seguidas por 30 ciclos de 95°C, 20s; 65°C, 30s e 72°C, 20s. Os produtos eram Sanger sequenciados utilizando-se um dos primers PCR na tabela 5 e sequências foram analisadas utilizando-se DNASTAR (DNASTAR).
EXEMPLO X Imunocoloração e ensaios de Teratoma de hiPSCs
[00116]As células foram incubadas no meio KnockOut DMEM/F-12 a 37°C por 60 minutos utilizando-se o seguinte anticorpo: Anti-SSEA-4 PE (Millipore) (1 : 500 diluídos); Tra-1-60 (BD Pharmingen) (1 : 100 diluídos). Após incubação as células foram lavadas três vezes com KnockOut DMEM/F-12 e imageadas no observador Axio Observer Z.1 (ZIESS).
[00117]Para conduzir uma análise de formação de teratoma, iPSCs humanas foram colhidas utilizando-se colagenase tipo IV (Invitrogen) e as células foram resuspensas em 200 μl de Matrigel e injetadas pro via intramuscular nos membros posteriores do camundongo nocaute Rag2gamma. Teratomas foram isolados e fixados em formalina entre 4 - 8 semanas após a injeção. Os teratomas foram em seguida analisados por hematoxilina e coloração por eosina.
EXEMPLO XI
[00118]Loci genômico de alvejamento em células somáticas humanas e células-tronco humanas utilizando-se reTALENS de acordo com certos aspectos, TALEs conhecidos pelo versado na técnica são modificados e recodificados para eliminar sequências de repetição. Tais TALEs adequados para modificação e uso nos métodos de edição de genoma em veículos de entrega gênica em várias linhagens celulares e organismos aqui descritos são citados em referências 2, 7- 12 aqui incorporadas por referência em seus textos integrais. Diversas estratégias têm sido desenvolvidas para montar as sequências de série TALE RVD repetitivas (vide referências 14 e 32-34 aqui incorporadas por referência em seus textos integrais). Porém uma vez montada repetições de sequência TALE permanecem instáveis o que limita a ampla utilidade desta ferramenta especialmente para veículos de entrega gênica (vide referências 13 e 35 aqui incorporadas por referência em seus textos integrais. Correspondentemente, um aspecto da presente descrição refere-se a TALEs destituídos de repetições. Um TALE desse tipo recodificado é vantajoso pois permite uma síntese mais rápida e mais simples de séries TALE RVD estendidas.
[00119]Para eliminar repetições, as sequências de nucleotídeo de séries TALE RVD foram desenvolvidas por computador a fim de minimizar o número de repetições de sequência mantendo ao mesmo tempo a composição de aminoácido. TALE re-codificado (Re-TALEs) que codifica 16 monômeros de reconhecimento tandem RVD DNA mais a metade final de repetição RVD são desprovidos de quaisquer repetições 12bp (vide Fig. 5a). Notadamente, este nível de recodificação é suficiente para permitir a amplificação de PCR de qualquer monômero específico ou subseção de um construto re-TALE de comprimento total (vide Fig. 5b). A configuração melhorada de re-TALEs pode ser sintetizada utilizando-se tecnologia de síntese de DNA padrão (vide referência 36 aqui incorporada por referência em sua totalidade sem incorrer em custos adicionais ou procedimentos associados a sequências pesadas de repetição. Além disso, a configuração de sequência recodificada permite montagem eficiente de construtos re-TALE utilizando-se reação de montagem isotérmica modificada conforme descrito nos métodos aqui citados e com referência à Fig. 6. Dados de edição de genoma NGS foram analisados estatisticamente como segue. Para análise de especificidade HDR um teste binomial exato foi usado para computar as probabilidades de observação de vários números de reads de sequência contendo pareamento incompatível 2bp. Com base nos resultados de sequenciamento de janelas 1 Obp antes e depois do sítio de alvejamento, as taxas de alteração de base máximas das duas janelas 5 (PI e P2) foram estimadas. Com base na hipótese zero de que alterações de cada um dos dois bp alvos eram independentes, a probabilidade esperada de observação de pareamento incompatível 2bp no sítio de alvejamento por mero acaso como o produto dessas duas probabilidades (P1 *P2) foi computada. Dando um jogo de dados contendo números N de reads totais e número n de reads HDR calculamos o valor p da Eficiência HDR. Para análise de sensibilidade HDR os doadores de DNA ssODN continham 10 pareamentos incompatíveis 2bp em relação ao genoma de alvejamento tornando provável a co-presença das alterações de base nos dois bp- alvo se o ssODN fosse incorporado no genoma de alvejamento. Outras alterações de sequência observadas não-pretendidas não se alterariam provavelmente ao mesmo tempo. Correspondentemente, alterações não-pretendidas eram muito menos interdependentes. Com base nessas premissas informação mútua (MI) foi usada para medir a dependência mútua de simultaneamente duas alterações de par base em todos os outros 15 pares de posições o limite de Detecção HDR foi estimado como o menor HDR onde MI do sítio 2bp de alvejamento é superior ao MI de todos os outros pares de posição. Para um determinado teste, reads HDR com pareamento incompatível 2bp pretendido a partir do arquivo fastq original foram identificados e um conjunto de arquivos fastq com eficiências HDR diluídas foi simulado por diferentes números de remoção sistemática de reads HDR a partir do conjunto de dados original. Informação mútua (MI) foi computada entre todos os 20 pares de posições dentro de uma janela 20bp centrada no sítio de alvejamento. Nesses cálculos a informação mútua da composição base entre quaisquer duas posições é computada. Ao contrário da medida de especificidade HDR acima descrita esta medida não analisa a tendência de pares de posição para alterar quaisquer pares específicos de bases alvo apenas sua tendência a se alterar simultaneamente, (vide Fig. 8A).
[00120]Tabela 6 mostra eficiência HDR e NHEJ de re-TALEN/ssODN que alveja eficiência 25 CCR5 e NHEL de Cas9-gRNA. Codificamos nossa análise em R e MI foi computada utilizando-se o pacote infotheo.Tabela 6 * O grupo onde limite de Detecção HDR ultrapassa o HDR real detectado.
[00121]Correlações entre eficiência de edição de genoma e estado epigenético foram corrigidas como segue. Coeficientes de correlação de Pearson foram computados para estudar possíveis associações entre parâmetros epigenéticos (DNase I HS ou ocupação de nucleossoma) e eficiências de engenharia genômica (HDR, NHEJ). Conjunto de dados de Hipersensibilidade DNAasel foi baixado do browser de UCSC genoma. hiPSCs DNase I HS: /gbdb/hgl9 bbi/wgEncodeOpenChromDnaseIpsnihi7Sig.bigWig.
[00122]Para computar valores P a correlação observada foi comparada a uma distribuição simulada que foi estabelecida pela randomização da posição do parâmetro epigenético (N=l 00000). Correlações observadas superiores ao 95o percentil, ou inferiores ao 5o percentil da distribuição simulada foram consideradas como associações em potencial.
[00123]A função de reTALEN em comparação com o TALEN recodificado correspondente em células humanas foi determinada. Uma linhagem celular HEK 293 contendo um cassete repórter GFP portando uma inserção de deslocamento de estrutura foi usada conforme descrito na referência 37 aqui incorporada por referência em sua totalidade. Vide também Fig. la. Entrega de TALENs ou reTALENs que alvejam a sequência de inserção junto com um construto doador GFP sem promoter produz um reparo HDR DSB-induzido do cassete GFP, de forma que a eficiência de reparo GFP pode ser usada para avaliar a eficiência de corte de nuclease. Vide referência 38 aqui incorporada por referência em sua totalidade. reTALENs induziram reparo GFP em 1.4%das células transfectadas similarmente aquele obtido por TALENs (1.2%) (vide Fig. lb). A atividade de reTALENs no locus AAVS 1 em PGP 1 hiPSCs foi testada (vide Fig. lc) e recuperou com êxito clones de células contendo inserções específicas (vide Fig. ld,e), confirmando que reTALENs são ativos tanto em células somáticas como em células humanas pluripotentes.
[00124]A eliminação de repetições permitiu a geração de lentivirus funcional com um re-TALE cargo. Especificamente, partículas lentivirais foram empacotadas codificando re-TALE-2A-GFP e foram testadas quanto a atividade do re-TALE-TF codificado por partículas virais mediante transfecção de um repórter mCherry em um agrupamento de células 293T infectadas por lenti-reTALE-2A-GFP. Células 293T transduzidas por lenti-re-TALE-TF mostraram 36X ativação de expressão repórter em comparação com o reporter apenas negativo (vide Fig. 7a,b,c). A integridade de sequência do re-TALE-TF nas células infectadas por lentiviral foi checada e reTALEs de comprimento total em 10 dos clones testados foram detectados, (vide Fig. 7d).
EXEMPLO XII Comparação de eficiência ReTALEs e Cas9-gRNA em hiPSCs com análise de Edição de genoma Sistema(GEAS)
[00125]Para comparar as eficiências de edição de re-TALENs versus Cas9- gRNA em hiPSCs, uma plataforma de sequenciamento de próxima geração (Sistema de Análise de Edição de Genoma) foi desenvolvida para identificar e quantificar tantos eventos de edição de genes NHEJ e HDR. Um par re-TALEN e um Cas9- gRNA foram configurados e construídos ambos alvejando a região a montante de CCR5 (re-TALEN, Cas9-gRNA par #3 na tabela 3), junto com um doador ssODN de 90 nt igual ao sítio alvo exceto para um pareamento incompatível 2bp (vide Fig. 2a). Os construtos de nuclease e ssODN doador foram transfectados em hiPSCs. Para quantificar a eficiência de edição gênica, sequenciamento profundo tipo paired-end (de ambas as extremidades) na região genômica alvo foi conduzido 3 dias após a transfecção. Eficiência HDR foi medida pela porcentagem de reads contendo o pareamento incompatível 2bp preciso. Eficiência de NHEJ foi medida pela porcentagem de reads portando indels.
[00126]Entrega do ssODN isoladamente em hiPSCs resultou em taxas mínimas HDR e NHEJ enquanto a entrega dos re-TALENs e do ssODN produziu eficiências de 1.7% HDR e 1.2% NHEJ (vide Fig. 2b). A introdução do Cas9-gRNA com o ssODN produziram eficiências 1.2% HDR e 3.4% NHEJ. Notadamente a taxa de deleções genômicas e inserções culminou no meio da região espaçadora entre os dois sítios de ligação reTALENs, mas culminou 3-4bp a montante da sequência Motivo Associado a Protoespaçador (PAM) de sítio de alvejamento Cas9-gRNA (vide Fig. 2b), como seria esperado uma vez que quebras de fita dupla ocorrem nessas regiões. Um tamanho de deleção genômica mediano de 6bp e tamanho de inserção de 3bp gerado pelos re-TALENs foi observado e um tamanho de deleção mediano de 7bp e inserção de lbp pelo Cas9-gRNA foi observado (vide Fig. 2b), consistente com padrões de lesão DNA usualmente gerados por NHEJ (vide referência 4 aqui incorporada por referência em sua totalidade.) Diversas análises da plataforma de sequenciamento de próxima geração revelaram que GEAS pode detectar taxas de Detecção HDR inferiores a 0.007%, que é tanto altamente reproduzíveis (coeficiente de variação entre replicações = ± 15% * de eficiência medida) e 400X mais sensíveis do que testes de endonuclease sensíveis a pareamentos incompatíveis mais usualmente usados (vide Fig. 8).
[00127]Pares de re-TALEN e Cas9-gRNAs direcionados a quinze sítios no locus genômico CCR5 foram construídos para determinar e eficiência de edição (vide Fig. 2c, vide tabela 3). Esses sítios foram selecionados para representar uma ampla faixa de sensibilidade de DNasel (vide referência 39 aqui incorporada por referência em sua totalidade). Os construtos de nuclease foram transfectados com os doadores ssODNs correspondentes (vide tabela 3) em PGP1 hiPSCs. Seis dias após a transfecção, as eficiências de edição de genoma nesses sítios foram perfiladas ( tabela 6). Para 13 for a de 15 pares re-TALEN com doadores ssODN, NHEJ e HDR foi detectado em níveis acima de limites detecção estatística com uma eficiência NHEJ média de 0.4% e uma Eficiência HDR média de 0.6% (vide Fig. 2c). Além disso, uma correlação positive estatisticamente significativa (r2 =0.81) foi observada entre eficiência HR e NHEJ no mesmo loci de alvejamento (P<1 X 10-4) (vide Fig. 9a), sugerindo que a geração de DSB, a etapa a montante comum tanto de HDR como NHEJ, é uma etapa limitadora de taxa para a edição de genoma reTALEN-mediada.
[00128]Em contrapartida, todos os 15 pares Cas9-gRNA mostraram níveis significativos de NHEJ e HR, com uma eficiência NHEJ média de 3% e uma eficiência média HDR de 1.0% (vide Fig. 2c). Além disso, uma correlação positiva também foi detectada entre a eficiência NHEJ e Eficiência HDR introduzida por Cas9-gRNA (vide Fig. 9b) (r2=0.52, p=0.003), consistente com observações para reTALENs. A eficiência NHEJ obtida por Cas9-gRNA foi significativamente mais elevada do que aquela obtida por reTALENs (t-teste, paired-end, P=0.02). Uma correlação moderada mas estatisticamente significativa entre eficiência NHEJ e a temperatura de fusão da sequência de alvejamento gRNA foi observada (vide Fig. 9c) (r2=0.28, p=0.04), sugerindo que a resistência de pareamento de base entre o gRNA e seu alvo genômico poderia explicar os mais de 28% da variação na eficiência de geração DSB Cas9-gRNA- mediada. Ainda que Cas9-gRNA tenha produzido níveis de NHEJ emu na média 7 vezes mais elevada do que o reTALEN correspondente, Cas9-gRNAsózinho obteve níveis de HDR (média=1.0%) similar àquela dos reTALENs correspondentes (média = 0.6%). Sem pretender estar ligado por teoria científica esses resultados podem sugerir ou que concentração de ssODN no DSB é o fator limitante para HDR ou que a estrutura de quebra genômica criada pelo Cas9-gRNA não é favorável para HDR eficaz. Não se observou nenhuma correlação entre DNasel HS e as eficiências de alvejamento de genoma para o método respectivo, (vide Fig. 10).
EXEMPLO XIII Otimização de configuração ssODN Donor para HDR
[00129]ssODNs de alto-desempenho em hiPSCs foram configurados como segue. Um conjunto de doadores ssODNs de diferentes comprimentos (50-170nt), todos portando o mesmo pareamento incompatível 2bp no meio da região espaçadora do par CCR5 re-TALEN #3 sítios-alvo foi configurado. Eficiência HDR foi observada para variar com comprimento ssODN, e uma eficiência ideal HDR de - 1.8% foi observada com um ssODN de 90 nt, embora ssODNs mais longos tenham diminuído Eficiência HDR (vide Fig. 3 a). Uma vez que regiões de homologia mais longas melhorem taxas de HDR quando doadores dsDNA são usados com nucleases (vide referência 40 aqui incorporada por referência em sua totalidade), possíveis razões para este resultado podem residir no fato de que ssODNs são usados em um processo de reparo de genoma alternativo; ssODNs mais longos são menos disponíveis ao aparelho de reparo de genoma; ou de que ssODNs mais longos incorrem em efeitos negativos que compensam quaisquer aperfeiçoamentos obtidos por homologia mais longa, em comparação com doadores de dsDNA (vide referência 41 aqui incorporada por referência em sua totalidade.) Além disso, se uma ou outra das duas razões tenha sido o caso então taxas de NHEJ ou continuariam inalteradas ou aumentariam com ssODNs mais longos pois o reparo NHEJ não implica o doador ssODN. Porém, taxas NHEJ foram observadas diminuindo junto com HDR (vide Fig. 3a), sugerindo que os ssODNs mais longos apresentam efeitos compensatórios. Possíveis hipóteses seriam que ssODNs mais longos são tóxicos à célula (vide referência 42 aqui incorporada por referência em sua totalidade), ou que transfecção de ssODNs mais longos satura à máquina de processamento de DNA causando assim captação de DNA molar reduzida e reduzindo a capacidade das células em captar ou expressar plasmídeos de re-TALEN.
[00130]Examinou-se como a taxa de incorporação de um pareamento incompatível realizada pelo doador ssODN varia com sua distância em relação à quebra de fita dupla ("DSB"). Uma série de ssODNs de 90 nt possuído o mesmo pareamento incompatível 2bp (A) no centro da região de espaçador de par re- TALEN #3 foi configurada. Cada ssODN também continha um Segundo pareamento incompatível 2bp (B) em distâncias variáveis do centro (vide Fig. 3b). Um ssODN possuindo apenas o pareamento incompatível 2bp central foi usado como um controle. Cada um desses ssODNs foi introduzido individualmente com par re- TALEN #3 e os resultados foram analisados com GEAS. Descobrimos que em geral HDR— conforme medido pela taxa na qual o pareamento incompatível A foi incorporado (A apenas ou A+B)— diminuiu já que os pareamentos incompatíveis B ficaram mais distantes do centro (vide Fig. 3b, vide Fig. 1 1a). A taxa geral HDR mais elevada observada quando B é somente lObp distante de A pode refletir uma menor necessidade por anelamento do ssODN em relação ao DNA genômico imediatamente proximal à quebra de dsDNA.
[00131]Para cada distância de B a partir de A, uma fração de eventos HDR apenas incorporou o pareamento incompatível A enquanto a outra fração incorporou tanto pareamentos incompatíveis A como B (vide Fig. 3b (A apenas e A+B)), Esses dois resultados podem ser devido aos tratos de conversão gênica (vide referência 43 aqui incorporada por referência em sua totalidade) ao longo do comprimento do ssDNA oligo, sendo que incorporação de pareamentos incompatíveis A+B resultou de longos tratos de conversão que se estendem para além do pareamento incompatível B, e incorporação do pareamento incompatível A somente resultou de tratos mais curtos que não atingiram B. Sob esta interpretação uma distribuição de comprimentos de conversão gênica em ambas as direções ao longo de ssODN foram estimadas (vide Fig. l ib). A distribuição estimada implica que tratos de conversão gênica se tornam progressivamente menos frequentes quando seus comprimentos aumentam, um resultado muito similar às distribuições de trato de conversão gênica vistas com doadores dsDNA mas em uma escala de distância altamente comprimida de dezenas de bases para o doador de ssDNA vs. Centenas de bases para doadores de dsDNA. Consistente com este resultado um teste com um ssODN contendo três pares de pareamentos incompatíveis 2bp espaçados em intervalos de 1 Ont em um ou outro lado do pareamento incompatível 2bp central "A" forneceu um padrão no qual A isoladamente tinha incorporado 86% das vezes, com múltiplos pareamentos incompatíveis B incorporados em outras vezes (vide Fig. 1 1c). Embora os números de eventos de incorporação somente B fossem muito baixos para estimar uma distribuição de comprimentos de trato inferiores a lObp, fica claro que a região de trato curto dentro do lObp do sítio de nucleasse predomina (vide Fig. 1 lb). Finalmente, em todos os testes com pareamentos incompatíveis B simples, uma pequena fração de eventos de incorporação B somente é vista (0.04%~0.12%) que é aproximadamente constante por todas as distâncias B a partir de A.
[00132]Além disso, foi feita análise de quão distante o doador ssODN pode ser colocado a partir da quebra de dsDNA re-TALEN-induzida observando ainda ao mesmo tempo a incorporação. Um conjunto de ssODNs de 90 nt com pareamento incompatível 2bp central que alvejam uma faixa de distâncias mais longas (-600bp a +400bp) longe do sítio de quebra de dsDNA re- TALEN-induzida foram testadas. Quando o ssODNs pareou >40bp distante, observou-se eficiências HDR >30x menores em comparação ao ssODN de controle posicionado centralmente sobre a região de corte (vide Fig. 3c). O baixo nível de incorporação que foi observado pode ser devido a processos não relacionados ao corte de dsDNA conforme visto em testes nos quais genomas são alterados por um doador de ssDNA unicamente vide referência 42 aqui incorporada por referência em sua totalidade. Enquanto isso, o baixo nível de HDR presente quando o ssODN está ~40bp distante pode ser devido a uma combinação de homologia enfraquecida no lado contendo pareamento incompatível do corte de dsDNA junto com comprimento insuficiente ssODN no outro lado da quebra de dsDNA.
[00133]A configuração de doador ssODNs DNA para alvejamento mediado por Cas9-gRNA foi testada. Cas9- gRNA (C2) que alveja o locus AAVS 1 foi construído e doadores ssODN de orientações variáveis (Oc: complementar ao gRNA e On: não-complementar ao gRNA) e comprimentos (30, 50, 70, 90, 110 nt) foram configurados. Oc obteve melhor eficiência do que On, com um 70mer Oc obtendo uma taxa HDR ideal de 1.5%. (vide Fig. 3d) A mesma tendência gênica de fita ssODN foi detectada utilizando-se um nickase Cas9-derivado (Cc: Cas9_D10A), apesar do fato de que as eficiências HDR mediadas por Cc com ssODN eram significativamente menos do que C2 (t-teste, paired-end, P=0.02). (vide Fig. 12).
EXEMPLO XIV Isolamento clonal hiPSC de células corrigidas
[00134]GEAS revelou que par de re-TALEN #3 obteve edição de genoma parecida com uma eficiência de ~1% em hiPSCs, um nível no qual células corretamente editadas podem usualmente ser isoladas por triagem de clones. HiPSCs apresentam baixa viabilidade como células únicas. Protocolos otimizados descritos na referência 23 aqui incorporada por referência em sua totalidade junto com um procedimento de separação FACS de célula única foi usado para estabelecer uma plataforma robusta para separação de hiPSCs simples e manutenção, onde clones hiPSC podem ser recuperados com taxas de sobrevivência de >25%. Este método foi combinado com um Sistema de genotipagem rápido e eficiente para conduzir extração de DNA cromossômico e amplificação de genoma alvejado em reações de tubo único de 1 hora, permitindo genotipagem em larga escala de hiPSCs editados. Além disso, esses métodos compreendem um conduto para obtenção robusta de hiPSCs genoma-editado sem seleção.
[00135]Para demonstrar este Sistema (vide Fig. 4a), PGP1 hiPSCs foram transfectados com um par de re- TALENs e um ssODN que alveja CCR5 no sítio #3 (vide tabela 3). GEAS foi realizado com uma porção das células transfectadas encontrando uma frequência HDR de 1.7% (vide Fig. 4b). Esta informação junto com os 25% de recuperação de clones de célula única separados permite estimar a obtenção de pelo menos um clone corretamente editado a partir de cinco placas de 96 cavidades com probabilidade de Poisson de 98% (assumindo μ=§;% * * m * 3 * 2). Seis dias após a transfecção, hiPSCs estavam separados por FACS e oito dias após a separação, 100 clones hiPSC foram triados. O sequenciamento de Sanger revelou que 2 for a de 100 dessas colônias hiPSC não selecionadas continham um genótipo de heterozigotos possuindo a mutação 2bp introduzida pelo doador ssODN (vide Fig. 4c). A eficiência de alvejamento de 1% (l%=2/2* 100, 2 clones corrigidos de forma monoalélica for a de 100 células triadas) era consistente com a análise de sequenciamento de próxima-geração (1.7%) (vide Fig. 4b). A pluripotência dos hiPSCs resultantes foi confirmada com imunocoloração de SSEA4 e TRA-1-60 (vide Fig. 4d). Os clones hiPSCs alvejados com êxito foram capazes de gerar teratomas maduros com características de todas três camadas germinativas (vide Fig. 4e).
EXEMPLO XV Método de Edição de genoma celular contínuo
[00136]De acordo com certos aspectos, um método é provido para edição de genoma em células, incluindo uma célula humana, por exemplo uma célula-tronco humana, sendo que a célula é geneticamente modificada para incluir um ácido nucleico que codifica uma enzima que forma um complexo de co-localização com RNA complementar ao DNA-alvo e que cliva o DNA-alvo de modo sítio-específico. Tal enzima inclui uma proteína de ligação de DNA guiado por RNA, tal como uma proteína guiada por RNA de ligação de DNA de um Sistema CRISPR tipo II. Uma enzima representativa é Cas9. De acordo com este aspecto, a célula expressa a enzima e RNA guia é provido à célula a partir do meio circundante da célula. O RNA guia e a enzima formam um complexo de co-localização no DNA-alvo onde a enzima corta o DNA. Opcionalmente um ácido nucleico doador pode estar presente para inserção no DNA no sítio de corte, por exemplo pela ligação de pontas não- homólogas ou recombinação homóloga. De acordo com um aspecto, o ácido nucleico que codifica uma enzima que forma um complexo de co-localização com RNA complementar ao DNA-alvo e que cliva o DNA-alvo de modo sítio-específico, tal como Cas9, está sob influência de um promotor tal como o ácido nucleico pode ser ativado e silenciado. Tais promotores são bem conhecidos pelo versado na técnica. Um promotor representativo é o doxpromotor induzível. De acordo com um aspecto, a célula é geneticamente modificada tendo reversamente inserido em seu genoma o ácido nucleico que codifica uma enzima que forma um complexo de co- localização com RNA complementar ao DNA-alvo e que cliva o DNA-alvo de modo sítio-específico. Uma vez inserido o ácido nucleico pode ser removido pelo uso de um reagente tal como uma transposase. Desse modo, o ácido nucleico pode ser facilmente removido após o uso.
[00137]De acordo com um aspecto, um sistema de edição de genoma contínuo em células-troncos pluripotentes humano-induzidas (hiPSCs) utilizando-se um sistema CRISPR é provido. De acordo com um aspecto representativo, o método inclui uso de uma linhagem hiPSC com Cas9 reversamente inserido no genoma (Cas9- hiPSCs); e gRNAs que havia sido modificado a partir de sua forma nativa para permitir sua passagem do meio que circunda a célula para dentro das células para uso com o Cas9. Tal gRNA havia sido tratado com uma fosfatase de modo a remover grupos de fosfato. Edição de genoma na célula é realizada com Cas9 pela suplementação de gRNA tratado com fosfatase no meio de cultura tecidual. Este método permite edição de genoma sem cicatriz em HiPSCs com até 50% de eficiências com dias soltos de tratamento, 2-10X vezes mais eficiente do que as melhores eficiências relatadas até agora. Além disso, o método é fácil de usar e com toxicidade celular bem mais baixa. Concretizações da presente descrição incluem edição simples de hiPSCs para pesquisa biológica aplicações terapêuticas, edição multiplex de hiPSCs para pesquisa biológica e aplicações terapêuticas, evolução de hiPSCs direcional e triagem de genótipo de hiPSCs e suas células derivadas.
[00138]De acordo com certos aspectos, outras linhagens celulares e organismos aqui descritos podem ser usados adicionalmente a células-tronco. Por exemplo, o método aqui descrito pode ser usado para células de animal tal como células de camundongo ou de rato de forma que células de camundongo integradas em Cas9 estáveis e células de rato possam ser geradas e edição de genoma tecido- especifica possa ser conduzida por introdução local de g RNA tratado do fosfatase do meio que circunda a célula. Além disso, outros derivados de Cas9 podem ser inseridos em muitas linhagens celulares e organismos, e manipulações genômicas alvejadas, tais como fragmentação sequência específica, ativação gênica, supressão e modificação epigenética podem ser conduzidas.
[00139]Aspectos da presente descrição referem-se uma produção de hiPSCs estáveis com Cas9 inseridas no genoma. Aspectos da presente descrição referem-se a uma modificação de RNA para permitir que entre em uma célula através da parede celular e co-localização com Cas9 evitando assim a resposta imune da célula. Tal RNA guia modificado pode obter eficiências de transfecção ideais com toxicidade mínima. Aspectos da presente descrição referem-se a uma edição de genoma otimizada em Cas9- hiPSCs utilizando-se gRNA tratado com fosfatase. Aspectos da presente descrição incluem a eliminação de Cas9 a partir de hiPSCs para obter edição de genoma sem cicatriz, onde o ácido nucleico que codifica Cas9 havia sido colocado no genoma celular. Aspectos da presente descrição incluem engenharia biomédica utilizando-se hiPSCs com Cas9 inserido no genoma a fim de criar mutações genéticas. Tais hiPSCs projetadas mantém pluripotência e podem ser diferenciadas com êxito em vários tipos de célula incluindo cardiomiócito que recapitula totalmente o fenótipo de linhagens celulares de pacientes.
[00140]Aspectos da presente descrição incluem bancos de gRNAS tratados com fosfatase para edição de genoma multiplex. Aspectos da presente descrição incluem a geração de um banco de linhagens celulares PGP com cada uma portanto 1 a umas poucas mutações configuradas no genoma, que podem servir como recurso para triagem de fármaco. Aspectos da presente descrição incluem geração de linhagens celulares PGP 1 com todos os retranselementos com código de barras com diferentes sequências para rastrear o local e atividade deste elemento.
EXEMPLO XVI Geração de hiPSCs estáveis com Cas9 inserido no Genoma
[00141]Cas9 foi codificado sob o doxpromotor induzível e o construto foi colocado em um vetor Piggybac que pode ser inserido em um ou removido do genoma com a ajuda de Piggybac transposase. A reação PCR validou a inserção estável do vetor (vide Fig. 14). A expressão Cas9 induzível foi determinada via RT- QPCR. O nível mRNA de Cas9 aumentou 1000X após 8 horas de lug/mL de suplementação DOX no meio de cultura e o nível de Cas9 mRNA que caiu para o nível normal ~ 20 horas após retirada do DOX. (Vide Fig. 15).
[00142]De acordo com um aspecto, o sistema Cas9-hiPSC com base na edição de genoma desvia o procedimento de transfecção de Cas9 plasmídeo/RNA, um grande construto usualmente com < 1% de eficiência de transfecção em hiPSCs. O presente Sistema Cas9-hiPSC pode servir como uma plataforma para executar engenharia genômica altamente eficiente em células-tronco humanas. Além disso, o cassete Cas9 introduzido nas hiPSCs utilizando-se Sistema Piggybac pode ser removido do genoma facilmente após introdução de transposases.
EXEMPLO XVII RNA guia tratado do fosfatase
[00143]Para permitir edição de genoma continua em Cas9-hiPSCs, uma série de RNA modificado que codifica gRNA foi gerada e suplementada em meio de cultura de Cas9-iPS em complexo com lipossoma. RNA tratado com fosfatase sem qualquer coroamento de terminal obteve a Eficiência HDR ideal de 13%, 30X mais do que a relatada anteriormente 5'Cap-Mod RNA (vide Fig. 16).
[00144]De acordo com um aspecto, RNA guia é fisicamente ligado ao DNA doador. Desse modo, um método é provido de acoplamento de corte genômico Cas9-mediado e HDR ssODN-mediado, estimulando assim a edição genômica sequência-específica. gRNA ligado com doador de DNA ssODN com concentração otimizada obteve 44% HDR c NHEJ não específico 2% (vide Fig. 17). Note que este procedimento não acarretou toxicidade visível conforme observado com nucleofecção ou eletroporação.
[00145]De acordo com um aspecto, a presente descrição provê uma estrutura de RNA projetada in vitro que codifica gRNA, que obteve eficiência de transfecção elevada, eficiência de edição de genoma em colaboração com Cas9 genomicamente inserido. Além disso, a presente descrição prove um construto quimérico gRNA-DNA para acoplar um corte genômico com a reação de recombinação homologia-direcionada.
EXEMPLO XVIII
[00146]Ao eliminar Cas9 reversivelmente projetado de hiPSCs a fim de obter Edição de genoma sem cicatriz de acordo com certos aspectos, um cassete Cas9 é inserido no genoma de células hiPSC utilizando-se um vetor reversível. Correspondentemente, um cassete Cas9 foi reversivelmente inserido no genoma de células hiPSC utilizando-se um vetor PiggyBac. O cassete Cas9 foi removido das hiPSCs com edição de genoma por transfecção da célula com plasmídeo codificador de transposase. Correspondentemente, aspectos da presente descrição incluem o uso de um vetor reversível que é conhecido pelo versado na técnica. Um vetor reversível é um que pode ser inserido em um genoma, por exemplo, e em seguida ser removido com uma enzima de remoção de vetor correspondente. Tais vetores e enzimas de remoção de vetor correspondentes são conhecidos no estado da técnica. Uma triagem foi feita em células iPS e colônias destituídas de cassete Cas9 foram recuperadas conforme confirmado pela reação PCR. Correspondentemente, a presente descrição provê método de edição de genoma sem afetar o resto do genoma ao ter um cassete Cas9 permanente na célula.
EXEMPLO XIX Edição de genoma em células iPGP 1
[00147]Pesquisa na patogênese de cardiomiopatia tem sido historicamente prejudicada pela falta de sistemas de modelo adequados. Diferenciação de Cardiomiócitos de células-tronco pluripotentes induzidas paciente-derivadas (iPSCs) oferece um caminho promissor para superar esta barreira e relatórios de modelagem por iPSC de cardiomiopatia começaram a emergir. Porém, a realização desta promessa exige abordagens para superar a heterogenecidade genética de linhagens de iPSC paciente-derivadas.
[00148]Linhagens celulares de Cas9-iPGPl e RNA guia tratado com fosfatase ligado a DNA foram usadas para três linhagens iPSC geradas que são isogênias exceto para a sequência em TAZ exon 6, que foi identificada para portar deleção de nucleotídeo simples em pacientes com síndrome de Barth. Rodada simples de transfecção de RNA obteve -30% de Eficiência HDR. Células de Cas9- iPGPl modificadas com mutações desejadas foram colonizadas (vide Fig. 18) e as linhagens celulares foram diferenciadas em cardiomiócitos. Cardiomiócito derivado da Cas9-iPGPl projetada recapitulou totalmente a cardiolipina, mitocondrial, e déficits ATP observados em iPSCs paciente-derivadas no modelo de rato neonatal TAZ nocauteado (vide Fig. 19). Correspondentemente, métodos são providos para correção de mutações causando doenças em células pluripotentes seguida por diferenciação de células em tipos de célula desejados.
EXEMPLO XX Materiais e métodos 1. Estabelecimento de linhagens humanas estáveis induzíveis por iPS/ES PiggyBac Cas9 dox
[00149]l. Após as células atingirem 70% de confluência prepara previamente a cultura com Y27632 inibidor de ROCK numa concentração final de lOuM durante a noite. No dia seguinte preparar a solução de nucleofecção combinando os 82 μl de solução de nucleofector de célula-tronco humana e 18ul de suplemento 1 em um tubo Eppendorf de 1,5 ml esterilizado. Misturar bem. Incubar solução a 37°C por 5 minutos.
[00150]Aspirar mTeSRl; enxaguar suavemente as células com DPBS em 2 mL/cavidade de uma placa de seis cavidades. Aspirar o DPBS, adicionar 2 mL/cavidade de Versene, e colocar a cultura de volta no incubador a 37°C até elas se tornarem arredondadas e folgadamente aderentes, mas não desprendidas. Isso leva 3-7 minutos.
[00151]Aspirar suavemente o Versene e adicionar mTeSRl. Adicionar 1ml de mTeSRl e desalojar as células circulando suavemente mTeSRl sobre elas com uma micropipeta de 1,000 uL.
[00152]Coletar as células desalojadas, triturar suavemente as mesmas emu ma suspensão de única célula e quantificar por hemacitômetro e ajustar a densidade celular para 1 milhão de células por ml.
[00153]Adicionar 1ml de suspensão celular em tubo de 1.5ml de Eppendorf e centrifugar em 1100 RPM por 5 minutos em uma centrífuga bench top.
[00154]Resuspender c células em 100 μl de solução de nucleofector de célula-tronco humana da etapa 2.
[00155]Transferir células a um cuvete de nucleofector utilizando-se um ponta de pipeta de 1 ml. Adicionar 1 μg de plasmídeo Transposonase e 5ug de PB Cas9 plasmídeos na suspensão celular no cuvete. Misturar células e DNA por suave turbulência.
[00156]Colocar o cuvete no nucleofector. Programas B-016 foi selecionado e células nucleofectadas pela tecla de pressão X.
[00157]Adicionar 500ul de meio mTeSRl com inibidor de ROCK no cuvete após nucleofecção. Aspirar as células nucleofectadas do cuvete utilizando-se a pipeta plástica Pasteur. E transferir células por gotejamento para dentro da cavidade revestida com matrigel de placa de 6 cavidades meio mTeSRl com inibidor de ROCK. Incubar as células a 37°C durante a noite.
[00158]Trocar o meio para mTesrl no dia seguinte e após 72 horas de transfecção; adicionar puromicina na concentração final a lug/ml. E a linhagem estabelecida dentro de 7 dias.
Preparação de RNA
[00159]1. Preparar modelo de DNA com promoter T7 a montante da sequência codificadora de gRNA.
[00160]2. Purificar o DNA utilizando-se purificação Mega Clear e normalizar a concentração.
[00161]3. Preparar misturas Custom NTPS para produção de gRNA diferente.
[00162]4. Preparar a mistura de transcrição in vitro sob temperatura ambiente.
[00163]5. Incubar por 4 horas (3-6hs ok)a 37°C (termociclador).
[00164]6. Adicionar 2μl Turbo DNAse (MEGAscript kit da Ambion) para cada amostra. Misturar suavemente e incubar a 37°C por 15'.
[00165]7. Purificar reação tratada com DNAse utilizando-se MegaClear da Ambion conforme instruções do fabricante.
[00166]8. Purificar RNA utilizando-se MEGAclear. (RNA purificado pode ser armazenado a -80 por diversos meses).
[00167]9. Remover grupos fosfato a fim de evitar reação imune Toll 2 da célula hospedeira.
[00168]Misturar suavemente a amostra e incubar a 37°C por 30' (30'- hs ok) .
3.Transfecção de RNA
[00169]1. Colocar em placa células 10 -20K para 48 cavidades sem antibióticos. As células devem ser confluentes em 30-50% para transfecção.
[00170]2. Mudar o meio celular para B18R (200ng/ml), DOX (lug/ml), Puromicina (2ug/ml) pelo menos duas horas antes da transfecção.
[00171]3. Preparar o reagente de transfecção contendo gRNA (0.5ug~2ug), Doador de DNA (0.5ug~2ug)e RNAiMax, incubar a mistura sob temperatura ambiente por 15 minutos e transferir para a célula. Células iPS humanas simples inoculadas e captação de clone simples.
[00172]1. Após 4 dias de indução dox e 1 dia de retirada dox, aspirer o meio, lavar suavemente com o DPBS. Adicionar 2 mL/cavidade de Versene, e colocar a cultura de volta no incubador a 37°C até elas se tornarem arredondadas e folgadamente aderentes, mas não desprendidas. Isso leva 3-7 min.
[00173]2. Aspirar suavemente e adicionar mTeSRl .Adicionar 1ml de mTeSRl e desalojar as células pela circulação suave de mTeSRl sobre as mesmas com uma micropipeta de 1,000 uL.
[00174]3. Coletar as células desalojadas, triturar suavemente as mesmas em uma suspensão de célula simples e quantificar por hemacitômetro e ajustar a densidade celular para células 100K por ml.
[00175]4. Inoculação das células em discos de 10 cm revestidos com matrigel com inibidor mTeSRl plus ROCK em densidade celular de 50K, 100K e 400K por disco de 10 cm.
Triagem de clones formados de célula simples
[00176]1. Após 12 dias fazer cultura em disco de 10 cm e clones são grandes suficientes para serem identificados a olho nu e marcados por marcador colón. Não deixar que os clones se tornem muito grandes e acabem aderindo entre si.
[00177]2. Colocar o disco de 10 cm na cabine de segurança biológica e utilizando uma pipeta P20 (de 10ul) com pontas de filtro. Aspirar 10ul de meio para uma cavidade de placas de 24 cavidades. Captar clone por raspagem do clone em pequenos pedaços e transferir para uma cavidade de placa de 24 cavidades. Cada ponta de filtro para cada clone.
[00178]3. Após 4-5 dias os clones dentro de uma cavidade de placa de 24 cavidades tornaram-se grande só suficiente para se dividirem.
[00179]4. Aspirar o meio and rinsar com 2 mL/cavidade DPBS.
[00180]5. Aspirar DPBS, substituir com 250ul/cavidade dispase (0.1 U/mL). e incubar as células em dispase a 37°C por 7 minutos.
[00181]6. Substituir a dispase com 2ml de DPBS.
[00182]7. Adicionar 250ul de mTeSRl. Utilizando-se um raspador celular desalojar as células e coletá-las.
[00183]8. Transferir 125ul de suspensão celular para uma cavidade de placas de 24 cavidades revestidas com matrigel.
[00184]9. Transferir 125ul de suspensão celular para um tubo Eppendorf de 1.5ml para extração genômica de DNA.
Triagem de clone
[00185]1. Centrifugar o topo da etapa 7.7
[00186]2. Aspirar o meio e adicionar 250ul de tampão lysis por cavidade (10mM+TrispH7.5+(or+8.0), 10mMEDTA, 10mM.
[00187]3. NaCl,+10%SDS,40ug/mL+proteinase K(adicionada antes de utilizar o tampão).
[00188]4. Incubar a 55 durante a noite.
[00189]5. Precipitar DNA pela adição de 250ul de Isopropanol.
[00190]6. Girar por 30 minutos na velocidade máxima. Lavar com 70% de etanol.
[00191]7. Remover suavemente etanol a ar seco por 5 minutos.
[00192]8. Resuspender gDNA com l00-200ul de dH20.
[00193]9. Amplificação de PCR da região genômica alvejada com primers específicos.
[00194]10. Sequenciamento de Sanger do produto PCR com primer respectivo.
[00195]11. Análise de dados de sequência de Sanger e expansão de clones alvejados.
[00196]7. Remover vetor Piggybac
[00197]1.Repetir etapa 2.1-2.9
[00198]2. Transferir células para um cuvete de nucleofector utilizando-se uma ponta de pipeta de 1 ml. Adicionar 2 μg de plasmídeo de Transposonase para a suspensão celular no cuvete. Misturar células e DNA por turbulência suave.
[00199]3. Repetir a etapa 2.10-2.1 1
[00200]4. Aspirar as células nucleofectadas do cuvete utilizando a pipeta plástica Pasteur provida. E transferir células em gotas na cavidade revestida com matrigel de disco de 10 cm com meio mTeSRl plus inibidor de ROCK. Incubar as células a 37°C durante a noite.
[00201]5. No dia seguinte muda o meio para mTesrl e mudar o meio todo dia por 4 dias subsequentes.
[00202]6. Após os clones se tornarem grandes o suficiente captar 20-50 clones e inocular em 24 cavidades.
[00203]7. Genótipo dos clones com primers de vetor PB Cas9 PiggyBac e clones negativos de expansão.
Referências
[00204]As referências são designadas por toda a especificação através de seu número a seguir e incorporadas na especificação como se estivessem totalmente estabelecidas ali. Cada uma das seguintes referências é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
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Claims (24)

1. Método in vitro de alteração do DNA-alvo em uma célula-tronco, em que a célula-tronco é geneticamente modificada para incluir um ácido nucleico codificando uma enzima Cas9 que forma um complexo de co-localização com um RNA guia complementar ao DNA-alvo e que cliva o DNA-alvo em um modo sítio-específico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: introduzir na célula-tronco um RNA guia complementar ao DNA-alvo, em que o RNA guia e a enzima Cas9 são membros de um complexo de co-localização para o DNA-alvo, introduzir na célula-tronco uma sequência de ácido nucleico doador, em que a sequência do ácido nucleico doador é inserida no DNA-alvo para produzir DNA alterado na célula-tronco.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o RNA guia tem entre 10 a 500 nucleotídeos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o RNA guia tem entre 20 a 100 nucleotídeos.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o RNA guia é uma fusão tracrRNA-crRNA.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o DNA é DNA genômico, DNA mitocondrial, DNA viral ou DNA exógeno.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de ácido nucleico doador é inserida por recombinação homóloga.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de ácido nucleico doador é inserida por ligação terminal não- homóloga.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima Cas9 ou o RNA guia é introduzido na célula-tronco como um ácido nucleico exógeno, o qual é expresso pela célula-tronco.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda introduzir múltiplos ácidos nucleico doadores e múltiplos RNAs guia para produzir múltiplas alterações ao DNA na célula.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que, após produção de DNA alterado na célula-tronco, o ácido nucleico que codifica a enzima Cas9 é removido do genoma da célula-tronco.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o RNA guia é introduzido na célula-tronco a partir do meio que envolve a célula.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o RNA guia inclui uma estrutura 5' Cap.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o RNA guia foi tratado com uma fosfatase para remover grupos fosfato.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o RNA guia é fornecido continuamente à célula-tronco a partir do meio que envolve a célula.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula-tronco é geneticamente modificada por inserção de um vetor ou cassete removível por enzima incluindo o ácido nucleico que codifica a enzima Cas9 no DNA genômico da célula-tronco.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor é um vetor piggybac.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a enzima Cas9 é removido utilizando uma enzima.
18. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o cassete ou vetor removível por enzima incluindo o ácido nucleico que codifica a enzima Cas9 é removido utilizando uma enzima.
19. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o cassete ou vetor removível por enzima incluindo o ácido nucleico que codifica a enzima Cas9 é inserido utilizando uma enzima.
20. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o cassete ou vetor removível por enzima incluindo o ácido nucleico que codifica a enzima Cas9 é removido utilizando uma transposase.
21. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a enzima Cas9 é induzível.
22. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a enzima Cas9 está sob influência de um promotor induzível por doxiciclina.
23. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a enzima Cas9 é induzível utilizando doxicicli- na.
24. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o RNA guia e a sequência de ácido nucleico doador são ligados.
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