JP2024029218A - ゲノムエンジニアリング - Google Patents
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Abstract
【課題】反復配列を欠くTALENまたはCas9を用いる、細胞におけるゲノムエンジニアリングの方法を提供する。【解決手段】細胞内で反復配列を100bp以上欠くTALENとドナー核酸配列とを組み合わせることを含む、細胞内で標的DNAを改変する方法を含み、ここで前記TALENは標的DNAを切断し、前記ドナー核酸配列は前記細胞内で当該DNAに挿入される方法を開示する。また、標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素を発現する、幹細胞内で標的DNAを改変する方法も開示する。【選択図】なし
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本願は2013年7月26日に出願された米国仮特許出願番号第61/858866号の優先権を主張するものであり、全ての目的のためにここにその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本願は2013年7月26日に出願された米国仮特許出願番号第61/858866号の優先権を主張するものであり、全ての目的のためにここにその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
政府権益の説明
本発明は米国国立ヒトゲノム研究所ゲノム科学中核研究拠点の助成金番号P50 HG003170の国庫補助により行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は米国国立ヒトゲノム研究所ゲノム科学中核研究拠点の助成金番号P50 HG003170の国庫補助により行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
配列特異的ヌクレアーゼを介したゲノム編集が知られている。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献1、2、および3を参照されたい。ゲノム中のヌクレアーゼ介在性二本鎖DNA(dsDNA)切断は2つの主要な機構、すなわち、非特異的な挿入や欠失(インデル)が導入されることが多い非相同末端結合(Non-Homologous End Joining:NHEJ)または修復鋳型として相同鎖を取り入れる相同性修復(homology directed repair:HDR)によって修復され得る。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献4を参照されたい。配列特異的ヌクレアーゼが所望の変異を含む相同ドナーDNAコンストラクトと共に送達されると、ドナーコンストラクト単独の場合と比べて、遺伝子ターゲティング効率が1000倍上昇する。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献5を参照されたい。DNAドナーとして一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド(「ssODN」)を使用することが報告されている。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献21および22を参照されたい。
遺伝子編集ツールにおける大きな進歩にもかかわらず、カスタム設計されたヌクレアーゼをヒト人工多能性幹細胞(ヒトiPS細胞:「hiPSC」)エンジニアリングにおいて使用することに関しては多くの課題と疑問が残っている。第一に、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)は、そのデザインが単純であるにもかかわらず、反復可変性二残基(RVD)ドメインのタンデムコピーによって特定のDNA配列を標的とする。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献6を参照されたい。RVDのモジュール性がTALENのデザインを単純にする一方で、RVDの反復配列はそのDNAコンストラクトの合成方法を複雑にしており(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献2、9、および15~19を参照されたい)、また、それをレンチウイルス遺伝子送達ビヒクルと共に使用することを妨げている。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献13を参照されたい。
現在の実務では、非相同末端結合(NHEJ)と相同性修復(HDR)は別々のアッセイを用いて評価されることが多い。非相同末端結合(NHEJ)を評価するためにはミスマッチ感受性エンドヌクレアーゼアッセイ(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献14を参照されたい)が多くの場合に使用されているが、この方法の定量的精度はばらつき得るもので、感度は約3%を超える非相同末端結合(NHEJ)頻度に限定される。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献15を参照されたい。相同性修復(HDR)は、完全に異なっておりかつ多くの場合に面倒な手法であるクローニングおよびシークエンシングによって評価されることが多い。U2OSおよびK562のような幾つかの細胞種について50%程度の高い編集頻度がしばしば報告されているが(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献12および14を参照されたい)、ヒトiPS細胞では頻度が概してそれより低いので、感度が依然として問題である。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献10を参照されたい。最近、ヒトiPS細胞およびヒトES細胞において、TALENを使用して高い編集頻度が報告されており(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献9を参照されたい)、CRISPR Cas9-gRNAシステムを使用してさらに高い頻度が報告されている(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献16~19を参照されたい)。しかしながら、異なる部位における編集率は大幅にばらつくようであり(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献17を参照されたい)、幾つかの部位では編集を全く検出できないこともある(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献20を参照されたい)。
細菌および古細菌のCRISPR-Casシステムは、Casタンパク質と複合体になっている短鎖ガイドRNAに依存して侵入性外来核酸内に存在する相補配列を分解する。Deltcheva, E.ら著、CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature誌、第471巻、602~607頁(2011年); Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P.およびSiksnys, V.著、Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America誌、第109巻、E2579~2586頁(2012年); Jinek, M.ら著、A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science誌、第337巻、816~821頁(2012年); Sapranauskas, R.ら著、The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research誌、第39巻、9275~9282頁、(2011年);およびBhaya, D., Davison, M.およびBarrangou, R.著、CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics誌、第45巻、273~297頁(2011年)を参照されたい。最近の化膿レンサ球菌(S. pyogenes)II型CRISPRシステムのインビトロ再構成により、通常はトランスにコードされているtracrRNA(「トランス活性化CRISPR RNA」)に融合したcrRNA(「CRISPR RNA」)は、Cas9タンパク質に前記crRNAに一致する標的DNA配列を配列特異的に切断させるのに充分であることが示された。標的部位に相同であるgRNA(ガイドRNA)の発現によってCas9の動員およびその標的DNAの分解が起こる。H. Deveauら著、Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology誌、第190巻、1390頁(2008年2月)を参照されたい。
本開示のいくつかの態様は、細胞(体細胞または幹細胞など)を遺伝的に改変するために改変型転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を使用することに関する。TALENは反復配列を含むことが知られている。本開示のいくつかの態様は、反復配列を100bp以上欠くTALENを細胞に導入することを含む、細胞内で標的DNAを改変する方法に関し、ここで前記TALENは標的DNAを切断し、前記細胞で非相同末端結合が起こり、前記細胞内に改変DNAを産生する。ある態様によると、所望の長さの反復配列がTALENから取り除かれている。ある態様によると、TALENはある所望の長さの反復配列を欠いている。ある態様によると、所望の長さの反復配列が取り除かれたTALENが提供される。ある態様によると、所望の長さの反復配列を取り除くためにTALENを改変する。ある態様によると、TALENは所望の長さの反復配列を除くように設計される。
本開示のいくつかの態様は、細胞内で反復配列を100bp以上欠くTALENとドナー核酸配列とを組み合わせることを含む、細胞内で標的DNAを改変する方法を含み、ここで前記TALENは標的DNAを切断し、前記ドナー核酸配列は前記細胞内で当該DNAに挿入される。本開示のいくつかの態様は反復配列を100bp以上欠くTALENをコードする核酸配列を含むウイルスに関する。本開示のいくつかの態様は反復配列を100bp以上欠くTALENをコードする核酸配列を含む細胞に関する。本明細書に記載されるある態様によると、前記TALENは反復配列を100bp以上、90bp以上、80bp以上、70bp以上、60bp以上、50bp以上、40bp以上、30bp以上、20bp以上、19bp以上、18bp以上、17bp以上、16bp以上、15bp以上、14bp以上、13bp以上、12bp以上、11bp以上、または10bp以上欠いている。
本開示のいくつかの態様は、エンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、エクソヌクレアーゼ、反復可変性二残基ドメインをコードする複数の核酸ダイマーブロック、およびエンドヌクレアーゼ切断部位を含むTALE-N/TFバックボーンベクターを組み合わせること、前記エンドヌクレアーゼを活性化して前記エンドヌクレアーゼ切断部位において前記TALE-N/TFバックボーンベクターを切断することにより第1末端および第2末端を作製すること、前記エクソヌクレアーゼを活性化して前記TALE-N/TFバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックに3’オーバーハングおよび5’オーバーハングを生じさせて前記TALE-N/TFバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックを所望の順序でアニールすること、前記DNAポリメラーゼおよび前記DNAリガーゼを活性化して前記TALE-N/TFバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックを連結すること、を含む、TALEの作製に関する。当業者は本開示に基づいて適切なエンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、エクソヌクレアーゼ、反復可変性二残基ドメインをコードする核酸ダイマーブロック、およびTALE-N/TFバックボーンベクターを容易に特定することができるであろう。
本開示のいくつかの態様は、標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、を発現する、幹細胞内で標的DNAを改変する方法に関し、該方法は、(a)標的DNAに相補的であり前記酵素を標的DNAまで誘導(guide)するRNA、をコードする第1外来性核酸を、幹細胞に導入すること-ここで、前記RNAおよび前記酵素は前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである;ドナー核酸配列をコードする第2外来性核酸を前記幹細胞に導入すること-ここで、前記RNAおよび前記ドナー核酸配列が発現し、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに共局在し、前記酵素が前記標的DNAを切断し、前記ドナー核酸が前記標的DNAに挿入されて、前記幹細胞内で改変DNAを産生する、を含む。
本開示のいくつかの態様は、標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、をコードする第1外来性核酸、を含む幹細胞に関する。
本開示のいくつかの態様は、標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、をコードする第1外来性核酸を含み、且つ、前記酵素の発現を促進するための誘導性プロモーターを含む、細胞に関する。このようにして発現を制御することができ、例えば、発現を開始することができ、発現を停止させることができる。
本開示のいくつかの態様は、標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、をコードする第1外来性核酸、を含む細胞であって、ここで、前記第1外来性核酸は、トランスポゼース(transposase)などの除去酵素を使用して、前記細胞のゲノムDNAから除去可能である、前記細胞に関する。
本開示のいくつかの態様は、標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、を発現する細胞内で、前記標的DNAを改変する方法に関し、該方法は、(a)ドナー核酸配列をコードする第1外来性核酸を前記細胞に導入すること、前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAを前記細胞の周囲の媒体から前記細胞に導入すること、を含み、ここで、前記RNAおよび前記酵素は前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーであり、前記ドナー核酸配列が発現し、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに共局在し、前記酵素が前記標的DNAを切断し、前記ドナー核酸が前記標的DNAに挿入されて、前記細胞内で改変DNAを産生する。
本開示のいくつかの態様は幹細胞を遺伝的に改変するためのRNA誘導型(RNA guided)DNA結合タンパク質の使用に関する。1つの態様において、前記幹細胞は前記RNA誘導型DNA結合タンパク質をコードする核酸を含むように遺伝的に改変されており、前記幹細胞は前記RNA誘導型DNA結合タンパク質を発現する。ある態様によると、特定の変異を導入するためのドナー核酸は、前記改変型TALENあるいは前記RNA誘導型DNA結合タンパク質を使用するゲノム編集について最適化される。
本開示のいくつかの態様は、幹細胞によって発現されるヌクレアーゼ活性を有する酵素(例えばヌクレアーゼ活性を有するDNA結合タンパク質)をDNA(デオキシリボ核酸)上の標的部位に誘導(guide)する1種類以上のガイドRNA(リボ核酸)を使用する、前記幹細胞におけるDNAの改変(例えばDNAの多重改変)に関し、ここで、前記酵素が前記DNAを切断し、外来性ドナー核酸が例えば相同組換えにより前記DNAに挿入される。本開示のいくつかの態様は、幹細胞においてDNA改変の工程を循環(cycle)させて、または繰り返して、細胞内にDNAの多重改変を有する幹細胞を作製することを含む。改変は外来性ドナー核酸の挿入を含んでいてもよい。
複数のRNAおよび複数の外来性ドナー核酸をコードする核酸を、前記酵素を発現する幹細胞に、一回の工程によって導入(例えば共形質転換によって導入)することで、複数の外来性核酸の挿入を達成することができる。ここでは、前記複数のRNAが発現し、前記複数に含まれる各RNAが前記酵素を前記DNAの特定の部位に誘導(guide)し、前記酵素が前記DNAを切断し、そして前記複数の外来性核酸のうちの1つが前記切断部位において前記DNAに挿入される。この態様によると、前記細胞内における前記DNAの多数の変化または改変が一回のサイクルで作製される。
1種類以上のRNAまたは複数のRNAおよび1種類以上の外来性核酸または複数の外来性核酸をコードする1種類以上の核酸を、前記酵素を発現する前記幹細胞に導入する工程またはサイクルを繰り返すことによって、複数の外来性核酸の挿入を細胞内において達成することができる。ここでは、前記RNAが発現して前記酵素を前記DNAの特定の部位に誘導(guide)し、前記酵素が前記DNAを切断し、前記外来性核酸が前記切断部位において前記DNAに挿入される。その結果、幹細胞のDNA中に複数の改変または外来性DNAの複数の挿入を有する細胞が生じる。1つの態様によると、前記酵素を発現する前記幹細胞は、前記酵素を発現するように遺伝的に改変されており、例えば前記酵素をコードし前記幹細胞によって発現され得る核酸を前記細胞に導入することにより遺伝的に改変されている。これにより、本開示のいくつかの態様は、前記酵素を発現する幹細胞にRNAを導入し、前記幹細胞に外来性ドナー核酸を導入し、前記RNAを発現し、前記RNAと前記酵素と前記DNAとの共局在複合体を形成し、前記酵素により前記DNAを酵素切断し、前記DNAに前記ドナー核酸を挿入する工程を循環させることを含む。上記工程を循環させるまたは繰り返すことにより、複数の座位における幹細胞の多重遺伝的改変が生じる。すなわち、複数の遺伝的改変を有する幹細胞が生じる。
ある態様によると、本開示の範疇のDNA結合タンパク質または酵素は、前記ガイドRNAと複合体を形成するタンパク質であって、前記ガイドRNAが前記複合体を二本鎖DNA配列まで誘導(guide)し、前記複合体が前記DNA配列に結合するタンパク質を含む。1つの態様によると、前記酵素はRNA誘導型DNA結合タンパク質、例えば、前記DNAに結合しRNAによって誘導(guide)されるII型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質、であってもよい。1つの態様によると、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質はCas9タンパク質である。
本開示のこの態様を、前記RNAおよびDNA結合タンパク質の、二本鎖DNAへのまたは二本鎖DNAとの、共局在と呼ぶことができる。このように、DNA結合タンパク質-ガイドRNA複合体を使用して、二本鎖DNAの複数の部位を切断して、外来性ドナーDNAの複数の挿入などの複数の遺伝的改変を有する幹細胞を作製してもよい。
ある態様によると、標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、を発現する幹細胞内で、前記標的DNAに複数の改変を行う方法が提供され、該方法は、(a)前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAに誘導(guide)する1種類以上のRNAをコードする第1外来性核酸を前記幹細胞に導入すること-ここで、前記1種類以上のRNAおよび前記酵素は前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである;1種類以上のドナー核酸配列をコードする第2外来性核酸を前記幹細胞に導入すること-ここで、前記1種類以上のRNAおよび前記1種類以上のドナー核酸配列が発現し、前記1種類以上のRNAおよび前記酵素が前記標的DNAに共局在し、前記酵素が前記標的DNAを切断し、前記ドナー核酸が前記標的DNAに挿入されて前記幹細胞内で改変DNAを産生する;および、工程(a)を複数回繰り返して前記幹細胞内で前記DNAに複数の改変を生じさせること、を含む。
1つの態様によると、前記RNAは約10ヌクレオチドから約500ヌクレオチドの間である。1つの態様によると、前記RNAは約20ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの間である。
1つの態様によると、前記1種類以上のRNAはガイドRNAである。1つの態様によると、前記1種類以上のRNAはtracrRNA-crRNA融合体である。
1つの態様によると、前記DNAはゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、または外来性DNAである。
1つの態様によると、酵素を使用して容易に除去することができるベクターを使用して、DNA結合性酵素をコードする核酸を可逆的に含むように細胞を遺伝的に改変することができる。有用なベクターおよび方法が当業者に知られており、それらにはレンチウイルス、アデノ関連ウイルス、ヌクレアーゼおよびインテグレース介在性標的挿入法、ならびにトランスポゾン介在性挿入法が含まれる。1つの態様によると、DNA結合性酵素をコードする核酸、例えばカセットまたはベクターを使用して付加されたDNA結合性酵素をコードする核酸、は、その全体を除去することが出来る-例えば、ゲノムDNA中に、例えば前記核酸、カセット、またはベクターの一部を残すことなく、前記カセットおよびベクターと共にその全体を除去することができる。そのような除去は、前記ゲノムが前記核酸、カセット、またはベクターの付加前と同じであるので、当技術分野において「無痕性」(scarless)除去と呼ばれる。挿入および無痕性除去の1つの例示的実施形態はSystem Biosciences社から市販されているPiggyBacベクターである。
本発明の特定の実施形態のさらなる特徴および利点が下記の実施形態およびそれらの図面の説明において、ならびに特許請求の範囲から、さらに十分に明らかになる。
本実施形態の前述および他の特徴および利点は、添付図面と併せた下記の例示的実施形態の詳細な説明からさらに十分に理解される。
本発明のいくつかの態様は、ある特定の反復配列を欠くTALENの、核酸エンジニアリングのための使用に関し、該核酸エンジニアリングは、例えば二本鎖核酸を切断することによる。二本鎖核酸を切断するための前記TALENの使用により、非相同末端結合(NHEJ)または相同組換え(HR)が生じ得る。本開示のいくつかの態様は、ドナー核酸の存在下における、反復配列を欠くTALENの核酸エンジニアリング、例えば二本鎖核酸を切断することによる核酸エンジニアリング、のための使用も想定しており、また、該ドナー核酸の該二本鎖核酸への挿入、例えば非相同末端結合(NHEJ)または相同組換え(HR)による挿入も想定している。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)は当技術分野において知られており、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合することにより作製された人工制限酵素を含む。制限酵素はDNA鎖を特定の配列のところで切断する酵素である。所望のDNA配列に結合するように転写活性化因子様エフェクター(TALE)を改変することができる。ここでその全体が参照により取り込まれるBoch, Jens著(2011年2月)「TALEs of genome targeting」 Nature Biotechnology誌、第29巻(第2号):135~6頁を参照されたい。そのような改変TALEを(DNA鎖を切断する)DNA切断ドメインと組み合わせることにより、あらゆる所望のDNA配列に特異的な制限酵素であるTALENが作製される。ある態様によると、in situでの標的核酸編集、例えばin situでのゲノム編集、のために細胞に前記TALENを導入する。
1つの態様によると、FokIエンドヌクレアーゼの末端に由来する非特異的DNA切断ドメインを使用して酵母細胞、植物細胞、および動物細胞において活性が有るハイブリッドヌクレアーゼを構築することができる。FokIドメインは二量体として機能し、それぞれ固有のDNA結合ドメインを有する2つのコンストラクトを必要とするが、該DNA結合ドメインそれぞれは、適切な方向性および間隔を有する標的ゲノム中の部位それぞれに対するものである。TALE DNA結合ドメインとFokI切断ドメインとの間のアミノ酸残基数および2つの個々のTALEN結合部位の間の塩基数の両方が活性に影響する。
TALE結合ドメインのアミノ酸配列とDNA認識との間の関係により、タンパク質が設計可能である。DNAワークスなどのソフトウェアプログラムを使用してTALEコンストラクトを設計することができる。TALEコンストラクトを設計する他の方法は当業者に知られている。その全体がここに参照により取り込まれる参考文献Cermak, T.; Doyle, E.L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C; Bailer, J.A.; Somia, N.V.ら著、(2011年)「Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting」、 Nucleic Acids Research誌.doi:10.1093/nar/gkr218; Zhang, Fengら著、(2011年2月)「Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription」、 Nature Biotechnology誌、第29巻(第2号):149~53頁; Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T.著、(2011年)「Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning」、 Nucleic Acids Research誌.doi:10’1093/nar/gkr151; Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D.A.; Carpenter, S.; Spalding, M.H.; Weeks, D.P.; Yang, B.著、(2011年)「Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes」、 Nucleic Acids Research誌.doi’’10.1093/nar/gkr188;
Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C; Marillonnet, S.著、(2011年)「Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning」、Bendahmane, Mohammed内、PLoS ONE誌、第6巻(第5号):e19722を参照されたい。
例示的態様によると、前記TALEN遺伝子が作製されると、ある特定の実施形態によれば、TALEN遺伝子はプラスミドに挿入されてもよい;そして該プラスミドを用いて標的細胞に形質移入を行い、該標的細胞において遺伝子産物が発現して細胞核に入り、ゲノムに到達する。例示的態様によると、本明細書に記載されるTALENは、二本鎖切断(DSB)を誘導し、該二本鎖切断に対して細胞が修復機構により反応することにより、ゲノムなどの標的核酸を編集するのに使用することができる。例示的修復機構には、アニーリングのための配列の重複が非常にわずかまたは存在しない、二本鎖切断の両側のDNAを再連結する非相同末端結合(NHEJ)が含まれる。この修復機構は挿入または欠失(インデル)によりゲノム中にエラーを誘導するか、または染色体再構成を誘導し、そのようなエラーにより当該箇所にコードされる遺伝子産物が機能的なものでなくなり得る。その全体がここに参照により取り込まれるMiller, Jeffreyら著、(2011年2月).「A TALE nuclease architecture for efficient genome editing」 Nature Biotechnology誌、第29巻(第2号):143~8頁を参照されたい。この活性は使用する種、細胞種、標的遺伝子、およびヌクレアーゼによってまちまちであり得るので、PCRにより増幅された2つのアレルの間のあらゆる差を検出するヘテロ二本鎖切断アッセイを用いることによって前記活性をモニターすることができる。単純なアガロースゲルまたはスラブゲルシステムで切断産物を可視化することができる。
あるいは、外来性二本鎖DNA断片の存在下で、非相同末端結合(NHEJ)によりゲノムにDNAを導入することができる。相同組換え修復も、形質移入された二本鎖配列が修復酵素の鋳型として使用されると二本鎖切断(DSB)のところで外来性DNAを導入することができる。ある態様によると、本明細書に記載されるTALENを使用して安定的に改変されたヒト胚性幹細胞クローンおよび人工多能性幹細胞(IPS細胞)クローンを作製することができる。ある態様によると、本明細書に記載されるTALENを使用してエレガンス線虫(C. elegans)などのノックアウト種、ノックアウトラット、ノックアウトマウスまたはノックアウトゼブラフィッシュを作製することができる。
本開示の1つの態様によると、実施形態は、幹細胞内でDNAに共局在し、DNAを消化もしくは切断して外来性DNAを挿入するための、外来性DNA、DNA結合タンパク質などのヌクレアーゼ酵素、およびガイドRNA、の使用に関する。様々な目的のためにDNAに結合するそのようなDNA結合タンパク質は、当業者に容易に知られるであろう。そのようなDNA結合タンパク質は天然のものであってもよい。本開示の範囲内に含まれるDNA結合タンパク質には、本明細書においてガイドRNAと呼ばれるRNAによって誘導(guide)され得るものが含まれる。この態様によると、該ガイドRNAと該RNA誘導型DNA結合タンパク質とは、DNAのところで共局在複合体を形成する。ヌクレアーゼ活性を有するそのようなDNA結合タンパク質が当業者に知られており、それらにはヌクレアーゼ活性を有する天然のDNA結合タンパク質、例えばII型CRISPRシステム中に存在する、Cas9タンパク質などが含まれる。そのようなCas9タンパク質およびII型CRISPRシステムは当技術分野において文献によく記載されている。その全体がここに参照により取り込まれる、全ての補足情報を含むMakarovaら著、Nature Reviews, Microbiology誌、第9巻、2011年6月、467~477頁を参照されたい。
ヌクレアーゼ活性を有する例示的DNA結合タンパク質は、二本鎖DNAにニックを入れるように、または二本鎖DNAを切断するように機能する。そのようなヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼ活性を示す1つ以上のポリペプチド配列を有するDNA結合タンパク質から生じ得る。そのような例示的DNA結合タンパク質は、二本鎖DNAの特定の鎖の切断またはニック形成をそれぞれ担っている、2つの別々のヌクレアーゼドメインを有し得る。当業者に知られているヌクレアーゼ活性を有する例示的ポリペプチド配列には、McrA-HNHヌクレアーゼ関連ドメインおよびRuvC様ヌクレアーゼドメインが含まれる。したがって、例示的DNA結合タンパク質は、McrA-HNHヌクレアーゼ関連ドメインおよびRuvC様ヌクレアーゼドメインのうちの1つ以上を本質的に含むDNA結合タンパク質である。
例示的DNA結合タンパク質は、II型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質である。例示的DNA結合タンパク質は、Cas9タンパク質である。
化膿レンサ球菌(S.pyrogenes)において、Cas9はプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の3bp上流に平滑末端の二本鎖切断を形成するが、該形成は、タンパク質中の2つの触媒ドメインである、DNAの相補鎖を切断するHNHドメインおよび非相補鎖を切断するRuvC様ドメインが介在する過程によってなされる。その全体がここに参照により取り込まれるJinkeら著、Science誌、第337巻、816~821頁(2012年)を参照されたい。Cas9タンパク質は、Makarovaら著、Nature Reviews, Microbiology誌、第9巻、2011年6月、467~477頁の補足情報の中に特定されている以下のものを含む、多数のII型CRISPRシステムに存在することが知られている:メタノコッカス・マリパルディスC7;コリネバクテリウム・ジフテリアエ;コリネバクテリウム・エフィシエンスYS-314;コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 Kitasato;コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 Bielefeld;コリネバクテリウム・グルタミカムR;コリネバクテリウム・クロッペンステッティイDSM44385;マイコバクテリウム・アブセサスATCC19977;ノカルディア・ファルシニカIFM10152;ロドコッカス・エリスロポリスPR4;ロドコッカス・ジョスティイRHA1;ロドコッカス・オパカスB4 uid36573;アシドサーマス・セルロリティカス11B;アルスロバクター・クロロフェノリカスA6;クリベラ・フラビダDSM17836 uid43465;サーモノスポラ・カーバタDSM43183;ビフィドバクテリウム・デンティウムBd1;ビフィドバクテリウム・ロングムDJO10A;スラッキア・ヘリオトリニレデューセンスDSM20476;パーセフォネラ・マリナEX H1;バクテロイデス・フラギリスNCTC9434;カプノサイトファガ・オクラセアDSM7271;フラボバクテリウム・サイクロフィルムJIP02 86;アッカーマンシア・ムシニフィラATCC BAA835;ロゼイフレクサス・キャステンホルツィイDSM13941;ロゼイフレクサスRSI;シネコシスティスPCC6803;エルシミクロビウム・ミヌトゥムPei191;非培養性シロアリ1群細菌系統型Rs D17;フィブロバクター・サクシノゲネスS85;バチルス・セレウスATCC10987;リステリア・イノキュア;ラクトバチルス・カゼイ;ラクトバチルス・ラムノーサスGG;ラクトバチルス・サリバリウスUCC118;ストレプトコッカス・アガラクティアエA909;ストレプトコッカス・アガラクティアエNEM316;ストレプトコッカス・アガラクティアエ2603;ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ・エクイシミリスGGS124;ストレプトコッカス・エクイ・ズーエピデミカスMGCS10565;ストレプトコッカス・ガロリティカスUCN34 uid46061;ストレプトコッカス・ゴルドニイChallis subst CH1;ストレプトコッカス・ミュータンスNN2025 uid46353;ストレプトコッカス・ミュータンス;ストレプトコッカス・ピオゲネスM1 GAS;ストレプトコッカス・ピオゲネスMGAS5005;ストレプトコッカス・ピオゲネスMGAS2096;ストレプトコッカス・ピオゲネスMGAS9429;ストレプトコッカス・ピオゲネスMGAS10270;ストレプトコッカス・ピオゲネスMGAS6180;ストレプトコッカス・ピオゲネスMGAS315;ストレプトコッカス・ピオゲネスSSI-1;ストレプトコッカス・ピオゲネスMGAS10750;ストレプトコッカス・ピオゲネスNZ131;ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophiles)CNRZ1066;ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophiles)LMD-9;ストレプトコッカス・サーモフィルスLMG18311;クロストリジウム・ボツリヌムA3 Loch Maree;クロストリジウム・ボツリヌムB Eklund 17B;クロストリジウム・ボツリヌムBa4 657;クロストリジウム・ボツリヌムF Langeland;クロストリジウム・セルロリティカムH10;フィネゴルディア・マグナATCC29328;ユウバクテリウム・レクターレATCC33656;マイコプラズマ・ガリセプティカム;マイコプラズマ・モービレ163K;マイコプラズマ・ペネトランス;マイコプラズマ・シノビアエ53;ストレプトバチルス・モニリフォルミスDSM12112;ブラディリゾビウムBTAil;ニトロバクター・ハンブルゲンシスX14;ロドシュードモナス・パルストリスBisB18;ロドシュードモナス・パルストリスBisB5;バルビバクラム・ラバメンティボランスDS-1;ディノロセオバクター・シバエDFL12;グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスPal 5 FAPERJ;グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスPal 5 JGI;アゾスピリルムB510 uid46085;ロドスピリラム・ルブラムATCC11170;ジアフォロバクターTPSY uid29975;フェルミネフォロバクター・エイセニアエEF01-2;ナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)053442;ナイセリア・メニンギティデスα14;ナイセリア・メニンギティデス(Neisseria meningitides)Z2491;デスルホビブリオ・サレキシゲンスDSM2638;カンピロバクター・ジェジュニ・ドイレイ269 97;カンピロバクター・ジェジュニ81116;カンピロバクター・ジェジュニ;カンピロバクター・ラリRM2100;ヘリコバクター・ヘパティカス;ウォリネラ・サクシノゲネス;トルモナス・アウエンシスDSM9187;シュードアルテロモナス・アトランティカT6c;シュワネラ・ペアレアナATCC700345;レジオネラ・ニューモフィラParis;アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z;パスツレラ・ムルトシダ;フランシセラ・ツラレンシス・ノビシダU112;フランシセラ・ツラレンシス・ホラルクティカ;フランシセラ・ツラレンシスFSC198;フランシセラ・ツラレンシス・ツラレンシス;フランシセラ・ツラレンシスWY96-3418;およびトレポネーマ・デンティコーラATCC35405。したがって、本開示のいくつかの態様は、II型CRISPRシステム中に存在するCas9タンパク質に関する。
Cas9タンパク質は、文献中で、当業者によってCsn1と呼ばれる場合がある。化膿レンサ球菌(S.pyrogenes)Cas9タンパク質が下に示されている。その全体がここに参照により取り込まれるDeltchevaら著、Nature誌、第471巻、602~607頁(2011年)を参照されたい。
1つの態様によると、前記RNA誘導型DNA結合タンパク質には、DNAに結合し、RNAによって誘導(guide)され、且つDNAを切断する当該タンパク質の能力を保持している、Cas9のホモログおよびオーソログが含まれる。1つの態様によると、Cas9タンパク質は化膿レンサ球菌(S.pyrogenes)由来の天然Cas9について示した配列、および該配列に対して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%または99%の相同性を有し、且つDNA結合タンパク質(例えばRNA誘導型DNA結合タンパク質)であるタンパク質配列を含む。
1つの態様によると、所望により幹細胞内で部位特異的にRNA誘導性ゲノム切断、および外来性ドナー核酸の挿入による幹細胞ゲノムの改変、を可能にする改変されたCas9-gRNAシステムが提供される。ガイドRNAはDNA上の標的部位または標的座位に相補的である。ガイドRNAはcrRNA-tracrRNAキメラであってもよい。前記細胞の周囲の媒体からガイドRNAを導入することができる。このようにして、種々のガイドRNAが周囲の媒体に供給され、細胞によって該ガイドRNAが取り込まれ、追加のガイドRNAが媒体に補給される限りにおいて、細胞を連続的に改変する方法が提供される。前記補給は連続的であってもよい。前記Cas9は標的ゲノムDNAまたはその近傍に結合する。1つ以上のガイドRNAが標的ゲノムDNAまたはその近傍に結合する。前記Cas9は該標的ゲノムDNAを切断し、当該切断部位において外来性ドナーDNAが前記DNAに挿入される。
したがって、ある方法は、ガイドRNAをコードする核酸の挿入(または周囲の媒体からのRNAの提供)および外来性ドナー核酸の挿入、前記RNAの発現(または前記RNAの取込み)、DNAを切断する様式での前記RNA、Cas9および該DNAの共局在化、および前記外来性ドナー核酸の挿入、を循環させることにより、Cas9を発現する幹細胞内のDNAへ外来性ドナー核酸を多重挿入するため、Cas9タンパク質および外来性ドナー核酸と共にガイドRNAを使用すること、に関する。任意の所望数のDNA改変を生じさせるために、任意の所望回数、前記方法の工程を循環させることができる。したがって、本開示のいくつかの方法は、本明細書に記載されるCas9タンパク質およびガイドRNAを使用して標的遺伝子を編集し、幹細胞の多重化ジェネティックエンジニアリングおよびエピジェネティックエンジニアリングを提供することに関する。
本開示のさらなる態様は、幹細胞(例えばヒト幹細胞)のDNA(例えばゲノムDNA)への外来性ドナー核酸の多重挿入のための、DNA結合タンパク質またはDNA結合システム(本明細書に記載される改変型TALENSまたはCas9など)一般の使用に関する。当業者は本開示に基づいて例示的DNA結合システムを容易に特定するであろう。
本開示に従う細胞には、別途明示されない限り、本明細書に記載されるように外来性核酸を導入することができ、発現させることができる任意の細胞が含まれる。本明細書に記載される本開示の基本概念は細胞種によって制限されないことが理解されるべきである。本開示に係る細胞には体細胞、幹細胞、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、古細菌細胞、真正細菌細胞などが含まれる。細胞には酵母細胞、植物細胞、および動物細胞などの真核細胞が含まれる。具体的な細胞にはヒト細胞などの哺乳類細胞が含まれる。さらに、細胞には、DNAを改変することが有益であるまたは望ましい任意の細胞が含まれる。
標的核酸には、本明細書に記載されるヌクレアーゼ活性を有するTALENまたはRNA誘導型DNA結合タンパク質がニックを入れるまたは切断する上で有用であり得る、任意の核酸配列が含まれる。標的核酸には、本明細書に記載される共局在複合体がニックを入れるまたは切断する上で有用であり得る任意の核酸配列が含まれる。標的核酸は遺伝子を含む。本開示の目的のためには、二本鎖DNAなどのDNAは標的核酸を含むことができ、共局在複合体またはTALENが該標的核酸に対して所望の作用を有し得るように、該標的核酸のところで、もしくは該標的核酸に隣接して、もしくは該標的核酸の近傍で、共局在複合体が前記DNAに結合するもしくは前記DNAと別の様式で共局在する、またはTALENが前記DNAに結合する。そのような標的核酸は内在性(あるいは天然)核酸および外来性(あるいは外来)核酸を含み得る。当業者は、本開示に基づいて、標的核酸を含むDNAに共局在するガイドRNAおよびCas9タンパク質、または標的核酸を含むDNAに結合するTALEN、を容易に特定または設計することができるであろう。当業者は、標的核酸を含むDNAに同様に共局在する転写調節因子タンパク質またはドメイン(例えば転写活性化因子または転写抑制因子)を特定することも、さらに可能であろう。DNAにはゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNAまたは外来性DNAが含まれる。1つの態様によると、本開示の実施に有用な材料および方法には、例示的株および培地、プラスミド構築、プラスミドの形質転換、過渡的(transcient)gRNAカセットおよびドナー核酸のエレクトロポレーション、Cas9発現細胞へのドナーDNAおよびgRNAプラスミドの形質転換、Cas9のガラクトース誘導、酵母ゲノム内でのCRISPR-Cas標的の特定などをはじめとする、全ての目的のためにその全体がここに参照により取り込まれるDi Carloら著、Nucleic Acids Research誌、2013年、第41巻、第7号、4336~4343頁に記載されているものが含まれる。本発明を実施する上で当業者に有用な情報、材料、および方法を含む追加の参考文献が、各々全ての目的のためにその全体がここに参照により取り込まれるMali, P., Yang, L., Esvelt, K.M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo, J.E., Norville, J.E.およびChurch, G.M.(2013年)、RNA-Guided human genome engineering via Cas9. Science誌、10.1126fscience.1232033;Storici, F., Durham, C.L., Gordenin, D.A.およびResnick, M.A.(2003年)、Chromosomal site-specific double-strand breaks are efficiently targeted for repair by oligonucleotides in yeast. PNAS誌、第100巻、14994~14999頁、およびJinek, M., Chylinski, K., Fonfara, l., Hauer, M., Doudna, J.A.およびCharpentier, E.(2012年)、A programmable dual-RNA-Guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science誌、第337巻、816~821頁に提供されている。
外来性核酸(すなわち、細胞の天然の核酸組成物の部分ではない核酸)の細胞への導入は、そのような導入のための当業者に知られている任意の方法を用いて行ってよい。そのような方法には形質移入、形質導入、ウイルス形質導入、微量注入、リポフェクション、ヌクレオフェクション、ナノ粒子ボンバードメント、形質転換、接合などが含まれる。当業者は容易に特定可能な文献資料を用いて容易にそのような方法を理解および適応化(adapt)するであろう。
ドナー核酸には、本明細書に記載される核酸配列に挿入される任意の核酸が含まれる。
後述の実施例は本開示を代表しているものとして示される。これら実施形態およびその他の等価な実施形態は、本開示、図面、および添付の特許請求の範囲に照らせば明らかであるので、これらの実施例は本開示の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
実施例1
ガイドRNAのアセンブリー
選択した標的配列のうちの19bp(すなわち、5’-N19-NGG-3’のうちの5’-N19)を、2つの相補的な100merのオリゴヌクレオチド(TTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGN19GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC)に組み込んだ。100merオリゴヌクレオチドそれぞれを100mMの濃度で水に懸濁し、等量で混合し、サーモサイクルマシーンでアニールした(95℃、5分、4℃までの勾配、0.1℃/秒)。デスティネーションベクターを調製するため、AfIIIを使用してgRNAクローニングベクター(Addgeneプラスミド番号41824)を直線化し、該ベクターを精製した。10ngのアニールした100bp断片、100ngのデスティネーションバックボーン、1×Gibsonアセンブリー反応ミックス(New England Biolabs社)により、50℃で30分間(10ulの)gRNAアセンブリー反応を行った。その反応産物を、直接的に細菌の形質転換用に処理して、個々のアセンブリーをコロニー化することができる。
ガイドRNAのアセンブリー
選択した標的配列のうちの19bp(すなわち、5’-N19-NGG-3’のうちの5’-N19)を、2つの相補的な100merのオリゴヌクレオチド(TTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGN19GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC)に組み込んだ。100merオリゴヌクレオチドそれぞれを100mMの濃度で水に懸濁し、等量で混合し、サーモサイクルマシーンでアニールした(95℃、5分、4℃までの勾配、0.1℃/秒)。デスティネーションベクターを調製するため、AfIIIを使用してgRNAクローニングベクター(Addgeneプラスミド番号41824)を直線化し、該ベクターを精製した。10ngのアニールした100bp断片、100ngのデスティネーションバックボーン、1×Gibsonアセンブリー反応ミックス(New England Biolabs社)により、50℃で30分間(10ulの)gRNAアセンブリー反応を行った。その反応産物を、直接的に細菌の形質転換用に処理して、個々のアセンブリーをコロニー化することができる。
実施例2
再編集(recoded)TALEの設計およびアセンブリー
アセンブリーを容易にし、発現を改善するために、様々なレベルでre-TALEを最適化した。まず、re-TALE DNA配列を、ヒトコドン使用頻度および5’末端における低mRNAフォールディングエネルギー(GeneGA、Bioconductor)について共最適化した。得られた配列を幾つかのサイクルにより進化させて、11bpより長い(順方向または逆方向)リピートを除去した(図12を参照のこと)。各サイクルにおいて、各リピートについての同義配列を評価する。進化中のDNAに対して最大ハミング距離を有する配列を選択する。16.5モノマーを有するre-TALEのうちの1つの配列は次の通り。
再編集(recoded)TALEの設計およびアセンブリー
アセンブリーを容易にし、発現を改善するために、様々なレベルでre-TALEを最適化した。まず、re-TALE DNA配列を、ヒトコドン使用頻度および5’末端における低mRNAフォールディングエネルギー(GeneGA、Bioconductor)について共最適化した。得られた配列を幾つかのサイクルにより進化させて、11bpより長い(順方向または逆方向)リピートを除去した(図12を参照のこと)。各サイクルにおいて、各リピートについての同義配列を評価する。進化中のDNAに対して最大ハミング距離を有する配列を選択する。16.5モノマーを有するre-TALEのうちの1つの配列は次の通り。
ある態様によると、上の配列に対して少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、または少なくとも99%の配列同一性、を有するTALEを使用することができる。当業者は、上の配列のうちのどの箇所が当該TALEのDNA結合活性を維持しつつも変化しうるかを、容易に理解するであろう。
1ラウンド目のPCRがRVDコード配列を導入し、2ラウンド目のPCRが隣接するブロックと36bpの重複を有するダイマーブロック全体を作製する、標準的なKapa HIFI(KPAP)PCR条件の下での2ラウンドのPCRにより、2つのRVDをコードするre-TALEダイマーブロック(図6Aを参照のこと)を作製した。QIAquick 96 PCR精製キット(QIAGEN社)を使用してPCR産物を精製し、Nanoドロップにより濃度を測定した。プライマーおよび鋳型の配列が下の表1および表2に記載されている。
TALE-TFおよびTALENクローニングバックボーンを改変することにより、re-TALENおよびre-TALE-TFデスティネーションベクターを構築した(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献24を参照されたい)。それらのベクター上の0.5RVD領域を再編集し、指定されたre-TALEクローニング部位にSapI切断部位を組み込んだ。re-TALENおよびre-TALE-TFバックボーンの配列が図20に提供されている。製造業者が推奨する条件で、SapI(New England Biolabs社)を用いてプラスミドを前処理することができ、QIAquick PCR精製キット(QIAGEN社)を用いてそれらのプラスミドを精製することができる。
200ngの各ブロック、500ngのデスティネーションバックボーン、1×TASA酵素混合物(2UのSapI、100Uのアンプリガーゼ(Epicentre社)、10mUのT5エクソヌクレアーゼ(Epicentre社)、2.5UのPhusion DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社))および以前に記載された1×等温アセンブリー反応バッファー(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献25を参照されたい)(5%のPEG-8000、100mMのトリス塩酸pH7.5、10mMのMgCl2、10mMのDTT、0.2mMずつの4種類のdNTP、および1mMのNAD)を用いて、(10ulの)1ポットTASAアセンブリー反応を行った。インキュベーションを、37℃で5分間、および50℃で30分間行った。TASAアセンブリー反応産物を直接的に細菌の形質転換用に処理して、個々のアセンブリーをコロニー化することができる。全長コンストラクトを得る効率は、このアプローチでは約20%である。あるいは、3ステップアセンブリーにより、90%を超える効率を達成することができる。まず、200ngの各ブロック、1×re-TALE酵素混合物(100Uのアンプリガーゼ、12.5mUのT5エクソヌクレアーゼ、2.5UのPhusion DNAポリメラーゼ)および1×等温アセンブリーバッファーを50℃で30分間用いて、10ulのre-TALEアセンブリー反応を行い、続いて標準化されたKapa HIFI PCR反応、アガロースゲル電気泳動、およびQIAquickゲル抽出(Qiagen社)を行って、全長のre-TALEを濃縮する。次に、200ngのre-TALEアンプリコンを、500ngのSap1前処理されたデスティネーションバックボーン、1×re-TALEアセンブリー混合物および1×等温アセンブリー反応バッファーと混合し、50℃で30分間インキュベートすることができる。re-TALE最終アセンブリー反応産物を直接的に細菌の形質転換用に処理して、個々のアセンブリーをコロニー化することができる。当業者は、本明細書に記載される方法を実施するために、公知のものの中からエンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、ポリメラーゼおよびリガーゼを容易に選択することができるであろう。例えば、FokI、BtsI、EarI、SapIなどのII型エンドヌクレアーゼを使用することができるであろう。ラムダエクソヌクレアーゼ、T5エクソヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼIIIなどの滴定可能(titralable)なエクソヌクレアーゼを使用することができる。Phusion DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼおよびVentR DNAポリメラーゼなどの非ホットスタートポリメラーゼを使用することができる。アンプリガーゼ、Pfu DNAリガーゼ、Taq DNAリガーゼなどの熱安定性リガーゼをこの反応に使用することができる。加えて、使用する特定の種に応じて、そのようなエンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、ポリメラーゼおよびリガーゼを活性化するためにさまざまな反応条件を用いることができる。
実施例3
細胞株および細胞培養物
マトリゲル(BD Biosciences社)コートプレート上、mTeSR1(Stemcell Technologies社)でPGP1 iPS細胞を維持した。TrypLEエクスプレス(Invitrogen社)を使用して、培養物を5~7日毎に継代した。10%のウシ胎児血清(FBS、Invitrogen社)、ペニシリン/ストレプトマイシン(pen/strep、Invitrogen社)および非必須アミノ酸(NEAA、Invitrogen社)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Invitrogen社)高グルコースの中で、293T細胞および293FT細胞を培養し、維持した。10%のウシ胎児血清(FBS、Invitrogen社、15%)およびペニシリン/ストレプトマイシン(pen/strep、Invitrogen社)を添加したRPMI(Invitrogen社)の中でK562細胞を培養し、維持した。加湿インキュベーターの中で、全ての細胞を37℃および5%のCO2で維持した。
細胞株および細胞培養物
マトリゲル(BD Biosciences社)コートプレート上、mTeSR1(Stemcell Technologies社)でPGP1 iPS細胞を維持した。TrypLEエクスプレス(Invitrogen社)を使用して、培養物を5~7日毎に継代した。10%のウシ胎児血清(FBS、Invitrogen社)、ペニシリン/ストレプトマイシン(pen/strep、Invitrogen社)および非必須アミノ酸(NEAA、Invitrogen社)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Invitrogen社)高グルコースの中で、293T細胞および293FT細胞を培養し、維持した。10%のウシ胎児血清(FBS、Invitrogen社、15%)およびペニシリン/ストレプトマイシン(pen/strep、Invitrogen社)を添加したRPMI(Invitrogen社)の中でK562細胞を培養し、維持した。加湿インキュベーターの中で、全ての細胞を37℃および5%のCO2で維持した。
その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献26に記載されるように、相同性修復(HDR)効率の検出用の安定した293T細胞株を構築した。具体的には、それらのレポーター細胞株は、終止コドンおよびAAVS1座位に由来する68bpのゲノム断片の挿入により破壊されているゲノム上に組み込まれたGFPコード配列を保持する。
実施例4
re-TALEN活性の検査
24ウェルプレートのウェル当たり2×105細胞の密度で293Tレポーター細胞を播種し、製造業者のプロトコルに従ってリポフェクタミン2000を使用して、1μgの各re-TALENプラスミドおよび2μgのDNAドナープラスミドをそれらの細胞に形質移入した。形質移入から約18時間後に、TrypLEエクスプレス(Invitrogen社)を使用して細胞を回収し、LSRフォルテッサ細胞分析機(BD Biosciences社)を使用するフローサイトメトリー分析用の200μlの媒体に再懸濁した。FlowJo(FlowJo社)を使用してフローサイトメトリーデータを分析した。各形質移入試料について少なくとも25,000イベントを分析した。293Tにおける内在性AAVS1座位ターゲティング実験について、形質移入法は上に記載されたものと同じであり、形質移入から1週間後に3μg/mlの薬品濃度でピューロマイシン選択を実施した。
re-TALEN活性の検査
24ウェルプレートのウェル当たり2×105細胞の密度で293Tレポーター細胞を播種し、製造業者のプロトコルに従ってリポフェクタミン2000を使用して、1μgの各re-TALENプラスミドおよび2μgのDNAドナープラスミドをそれらの細胞に形質移入した。形質移入から約18時間後に、TrypLEエクスプレス(Invitrogen社)を使用して細胞を回収し、LSRフォルテッサ細胞分析機(BD Biosciences社)を使用するフローサイトメトリー分析用の200μlの媒体に再懸濁した。FlowJo(FlowJo社)を使用してフローサイトメトリーデータを分析した。各形質移入試料について少なくとも25,000イベントを分析した。293Tにおける内在性AAVS1座位ターゲティング実験について、形質移入法は上に記載されたものと同じであり、形質移入から1週間後に3μg/mlの薬品濃度でピューロマイシン選択を実施した。
実施例5
機能的レンチウイルス生成評価
標準的なPCRおよびクローニング技術により、レンチウイルスベクターを作製した。レンチウイルスパッケージングミックス(Invitrogen社)を用いて、リポフェクタミン2000によってレンチウイルスプラスミドを293FT培養細胞(Invitrogen社)に形質移入して、レンチウイルスを作製した。形質移入から48時間後および72時間後に上清を回収し、滅菌濾過し、100ulの濾過上清をポリブレンと共に5×105個の新しい293T細胞に添加した。次の式:ウイルス感染価=(GFP陽性293T細胞のパーセンテージ×形質導入時の初期細胞数)/(形質導入実験に使用された元のウイルス回収上清の体積) に基づいてレンチウイルス感染価を計算した。レンチウイルスの機能性を検査するため、形質導入から3日後に、30ngのmCherryレポーターを有するプラスミドおよび500ngのpUC19プラスミドを、レンチウイルスで形質導入した293T細胞に、リポフェクタミン2000(Invitrogen社)を使用して形質移入した。形質移入から18時間後に、アクシオ・オブザーバーZ.1(Zeiss社)を使用して細胞像を分析し、TrypLEエクスプレス(Invitrogen社)を使用して細胞を回収し、LSRフォルテッサ細胞分析機(BD Biosciences社)を使用するフローサイトメトリー分析用の200μlの媒体に再懸濁した。BD FACSディーバ(BD Biosciences社)を使用してフローサイトメトリーデータを分析した。
機能的レンチウイルス生成評価
標準的なPCRおよびクローニング技術により、レンチウイルスベクターを作製した。レンチウイルスパッケージングミックス(Invitrogen社)を用いて、リポフェクタミン2000によってレンチウイルスプラスミドを293FT培養細胞(Invitrogen社)に形質移入して、レンチウイルスを作製した。形質移入から48時間後および72時間後に上清を回収し、滅菌濾過し、100ulの濾過上清をポリブレンと共に5×105個の新しい293T細胞に添加した。次の式:ウイルス感染価=(GFP陽性293T細胞のパーセンテージ×形質導入時の初期細胞数)/(形質導入実験に使用された元のウイルス回収上清の体積) に基づいてレンチウイルス感染価を計算した。レンチウイルスの機能性を検査するため、形質導入から3日後に、30ngのmCherryレポーターを有するプラスミドおよび500ngのpUC19プラスミドを、レンチウイルスで形質導入した293T細胞に、リポフェクタミン2000(Invitrogen社)を使用して形質移入した。形質移入から18時間後に、アクシオ・オブザーバーZ.1(Zeiss社)を使用して細胞像を分析し、TrypLEエクスプレス(Invitrogen社)を使用して細胞を回収し、LSRフォルテッサ細胞分析機(BD Biosciences社)を使用するフローサイトメトリー分析用の200μlの媒体に再懸濁した。BD FACSディーバ(BD Biosciences社)を使用してフローサイトメトリーデータを分析した。
実施例6
re-TALENおよびCas9-gRNAのゲノム編集効率の検査
ヌクレオフェクションの2時間前に、PGP1 iPS細胞をRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632(Calbiochem社)の中で培養した。P3プライマリー・セル4DヌクレオフェクターXキット(Lonza社)を使用して形質移入を行った。具体的には、TrypLEエクスプレス(Invitrogen社)を使用して細胞を回収し、16.4μlのP3ヌクレオフェクター溶液、3.6μlのサプリメント、1μgの各re-TALENプラスミドもしくは1ugのCas9および1ugのgRNAコンストラクト、2μlの100μΜの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを含む20μlのヌクレオフェクション混合物中に、2×106個の細胞を再懸濁した。その後、該混合物を20μlヌクレオキュベットストリップに移し、CB150プログラムを用いてヌクレオフェクションを行った。最初の24時間、マトリゲルコートプレート上の、ROCK阻害剤を添加したmTeSR1培地中に、細胞を播種した。二本鎖DNAドナーを使用する内在性AAVS1座位ターゲティング実験については、2μgの二本鎖DNAドナーを使用し、且つ、形質移入から1週間後にmTeSR1培地に0.5ug/mLの濃度でピューロマイシンを添加したことを除いて、同じ方法に従った。
re-TALENおよびCas9-gRNAのゲノム編集効率の検査
ヌクレオフェクションの2時間前に、PGP1 iPS細胞をRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632(Calbiochem社)の中で培養した。P3プライマリー・セル4DヌクレオフェクターXキット(Lonza社)を使用して形質移入を行った。具体的には、TrypLEエクスプレス(Invitrogen社)を使用して細胞を回収し、16.4μlのP3ヌクレオフェクター溶液、3.6μlのサプリメント、1μgの各re-TALENプラスミドもしくは1ugのCas9および1ugのgRNAコンストラクト、2μlの100μΜの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを含む20μlのヌクレオフェクション混合物中に、2×106個の細胞を再懸濁した。その後、該混合物を20μlヌクレオキュベットストリップに移し、CB150プログラムを用いてヌクレオフェクションを行った。最初の24時間、マトリゲルコートプレート上の、ROCK阻害剤を添加したmTeSR1培地中に、細胞を播種した。二本鎖DNAドナーを使用する内在性AAVS1座位ターゲティング実験については、2μgの二本鎖DNAドナーを使用し、且つ、形質移入から1週間後にmTeSR1培地に0.5ug/mLの濃度でピューロマイシンを添加したことを除いて、同じ方法に従った。
この実施例において使用したreTALEN、gRNAおよび一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの情報が、下の表3および表4に記載されている。
実施例7
ターゲティング領域のアンプリコンライブラリーの調製
ヌクレオフェクションから6日後に細胞を回収し、0.1μlのprepGEM組織プロテアーゼ酵素(ZyGEM社)および1μlのprepGEMゴールドバッファー(ZyGEM社)を、8.9μlの培地中の2~5×105個の細胞に添加し、次に5μlの2×KAPA HIFIホットスタート・レディミックス(KAPA Biosystems社)および100nΜの対応する増幅プライマーペアを含む9μlのPCRミックスに、1ulの前記反応産物を添加した。反応産物を95℃で5分間インキュベートし、続いて98℃で20秒、65℃で20秒、そして72℃で20秒のサイクルを15サイクル行った。使用するイルミナシークエンスアダプターを付加するため、次に12.5μlの2×KAPA HIFIホットスタート・レディミックス(KAPA Biosystems社)および200nMのイルミナシークエンスアダプターを有するプライマーを含む20μlのPCRミックスに、5μlの反応産物を添加した。反応産物を95℃で5分間インキュベートし、続いて98℃で20秒、65℃で20秒、そして72℃で20秒のサイクルを25サイクル行った。PCR産物をQIAquick PCR精製キットにより精製し、概ね同じ濃度で混合し、MiSeqパーソナルシーケンサーでシークエンシングした。PCRプライマーは、下の表5に記載されている。
ターゲティング領域のアンプリコンライブラリーの調製
ヌクレオフェクションから6日後に細胞を回収し、0.1μlのprepGEM組織プロテアーゼ酵素(ZyGEM社)および1μlのprepGEMゴールドバッファー(ZyGEM社)を、8.9μlの培地中の2~5×105個の細胞に添加し、次に5μlの2×KAPA HIFIホットスタート・レディミックス(KAPA Biosystems社)および100nΜの対応する増幅プライマーペアを含む9μlのPCRミックスに、1ulの前記反応産物を添加した。反応産物を95℃で5分間インキュベートし、続いて98℃で20秒、65℃で20秒、そして72℃で20秒のサイクルを15サイクル行った。使用するイルミナシークエンスアダプターを付加するため、次に12.5μlの2×KAPA HIFIホットスタート・レディミックス(KAPA Biosystems社)および200nMのイルミナシークエンスアダプターを有するプライマーを含む20μlのPCRミックスに、5μlの反応産物を添加した。反応産物を95℃で5分間インキュベートし、続いて98℃で20秒、65℃で20秒、そして72℃で20秒のサイクルを25サイクル行った。PCR産物をQIAquick PCR精製キットにより精製し、概ね同じ濃度で混合し、MiSeqパーソナルシーケンサーでシークエンシングした。PCRプライマーは、下の表5に記載されている。
実施例8
ゲノム編集評価システム(GEAS)
稀なゲノム変化を検出するために次世代シークエンシングが活用されている。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献27~30を参照されたい。ヒトiPS細胞における相同性修復(HDR)効率および非相同末端結合(NHEJ)効率を迅速に評価するためのこのアプローチの幅広い使用を可能にするため、ゲノムエンジニアリングデータを分析するための「パイプライン」と称されるソフトウェアを作成した。このパイプラインは単一のUnixモジュールに統合されており、該モジュールはR、BLAT、およびFASTXツールキットなどの様々なツールを使用する。
ゲノム編集評価システム(GEAS)
稀なゲノム変化を検出するために次世代シークエンシングが活用されている。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献27~30を参照されたい。ヒトiPS細胞における相同性修復(HDR)効率および非相同末端結合(NHEJ)効率を迅速に評価するためのこのアプローチの幅広い使用を可能にするため、ゲノムエンジニアリングデータを分析するための「パイプライン」と称されるソフトウェアを作成した。このパイプラインは単一のUnixモジュールに統合されており、該モジュールはR、BLAT、およびFASTXツールキットなどの様々なツールを使用する。
バーコード・スプリッティング:一群の試料を一つにまとめ、MiSeq 150bpペアードエンド(PE150)(イルミナ・次世代シークエンシング)を使用してシークエンシングし、後にFASTXツールキットを使用してDNAバーコードに基づく分離を行った。
品質フィルタリング:低い配列品質(phredスコア<20)を有するヌクレオチドを除去した。除去の後に80ヌクレオチドよりも短いリードを除いた。
マッピング:BLATを使用して対になったリードを独立して基準ゲノムにマップし、出力として.pslファイルを作成した。
インデルコーリング:アラインメント中に2ブロックのマッチを含む全長リードとして、インデルを定義した。両ペアードエンドリードにおいて、このパターンに従うリードだけを考慮した。品質管理として、それらのインデルリードは基準ゲノムと最小で70ntのマッチを有することが必要とされ、両方のブロックが少なくとも20nt長であることが必要とされた。基準ゲノムに対する各ブロックの位置によってインデルのサイズおよび位置を計算した。非相同末端結合(NHEJ)はインデルを含むリードのパーセンテージとして評価されている(下の式1を参照のこと)。非相同末端結合(NHEJ)事象の大部分が、ターゲティング部位の近傍で検出されている。
相同性修復(HDR)効率:二本鎖切断(DSB)上を中央とする12bpのウインドウ内でのパターンマッチング(grep)を使用して、基準配列を含むリード、基準配列の改変(2bpの意図されたミスマッチ)を含むリード、および2bpの意図されたミスマッチ内に1bpだけ変異を含むリード、に対応する特異的なシグネチャを数えた(下の式1を参照のこと)。
式1.非相同末端結合(NHEJ)および相同性修復(HDR)の評価
A=基準と同一のリード:XXXXXABXXXXX
B=一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドによってプログラムされた2bpのミスマッチを含むリード:XXXXXabXXXXX
C=標的部位内に変異を1bpだけを含むリード:例えばXXXXXaBXXXXXまたはXXXXXAbXXXXX
D=上に記載されたインデルを含むリード
A=基準と同一のリード:XXXXXABXXXXX
B=一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドによってプログラムされた2bpのミスマッチを含むリード:XXXXXabXXXXX
C=標的部位内に変異を1bpだけを含むリード:例えばXXXXXaBXXXXXまたはXXXXXAbXXXXX
D=上に記載されたインデルを含むリード
実施例9
コロニー化したヒトiPS細胞の遺伝子型スクリーニング
FACS選別前に、SMC4(5uMのチアゾビビン、1uMのCHIR99021、0.4uMのPD0325901、2uMのSB431542)(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献23を参照されたい)を添加したmTesr-1培地で、無フィーダー培養上のヒトiPS細胞を少なくとも2時間にわたって前処理した。アキュターゼ(Millipore社)を使用して培養物を解離させ、SMC4および生死判定色素ToPro-3(Invitrogen社)を添加したmTesr-1培地に1~2×107個/mLの濃度で再懸濁した。100umのノズルを有するBD FACSアリアII SORP UV(BD Biosciences社)を用いて、滅菌条件下で、生存しているヒトiPS細胞を、照射済み(irradiated)CF-1マウス胚性線維芽細胞でコーティングされた96ウェルプレート(Global Stem社)へとシングルセルソートした。各ウェルは、SMC4と5μg/mlのフィブロネクチン(Sigma社)とが添加された100ng/mlの組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(Millipore社)を含むヒトES細胞培地(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献31を参照されたい)を含んでいた。選別後に、プレートを70×gで3分間遠心分離した。選別から4日後にコロニー形成が見られ、培地をSMC4が添加されたヒトES細胞培地と交換した。選別から8日後に、SMC4をヒトES細胞培地から除去することができる。
コロニー化したヒトiPS細胞の遺伝子型スクリーニング
FACS選別前に、SMC4(5uMのチアゾビビン、1uMのCHIR99021、0.4uMのPD0325901、2uMのSB431542)(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献23を参照されたい)を添加したmTesr-1培地で、無フィーダー培養上のヒトiPS細胞を少なくとも2時間にわたって前処理した。アキュターゼ(Millipore社)を使用して培養物を解離させ、SMC4および生死判定色素ToPro-3(Invitrogen社)を添加したmTesr-1培地に1~2×107個/mLの濃度で再懸濁した。100umのノズルを有するBD FACSアリアII SORP UV(BD Biosciences社)を用いて、滅菌条件下で、生存しているヒトiPS細胞を、照射済み(irradiated)CF-1マウス胚性線維芽細胞でコーティングされた96ウェルプレート(Global Stem社)へとシングルセルソートした。各ウェルは、SMC4と5μg/mlのフィブロネクチン(Sigma社)とが添加された100ng/mlの組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(Millipore社)を含むヒトES細胞培地(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献31を参照されたい)を含んでいた。選別後に、プレートを70×gで3分間遠心分離した。選別から4日後にコロニー形成が見られ、培地をSMC4が添加されたヒトES細胞培地と交換した。選別から8日後に、SMC4をヒトES細胞培地から除去することができる。
蛍光活性化細胞選別(FACS)から8日後に数千個の細胞を回収し、0.1ulのprepGEM組織プロテアーゼ酵素(ZyGEM社)および1ulのprepGEMゴールドバッファー(ZyGEM社)を8.9μlの培地中の細胞に添加した。次に、その反応産物を、35.5mlのプラチナ1.1×スーパーミックス(Invitrogen社)、250nMの各dNTPおよび400nMのプライマーを含む、40μlのPCRミックスに添加した。反応産物を95℃で3分間インキュベートし、続いて95℃で20秒、65℃で30秒、そして72℃で20秒のサイクルを30サイクル行った。表5の中のPCRプライマーのうちのいずれか1つを使用して産物をサンガーシークエンシングし、DNASTAR(DNASTAR社)を使用して配列を分析した。
実施例10
ヒトiPS細胞の免疫染色およびテラトーマアッセイ
次の抗体を使用して、細胞をKnockOut DMEM/F-12培地中で37℃で60分インキュベートした:抗SSEA-4 PE(Millipore社)(1:500に希釈);Tra-1-60(BD Pharmingen社)(1:100に希釈)。インキュベーション後に、細胞をKnockOut DMEM/F-12で3回洗浄し、アクシオ・オブザーバーZ.1(ZIESS社)で画像を得た。
ヒトiPS細胞の免疫染色およびテラトーマアッセイ
次の抗体を使用して、細胞をKnockOut DMEM/F-12培地中で37℃で60分インキュベートした:抗SSEA-4 PE(Millipore社)(1:500に希釈);Tra-1-60(BD Pharmingen社)(1:100に希釈)。インキュベーション後に、細胞をKnockOut DMEM/F-12で3回洗浄し、アクシオ・オブザーバーZ.1(ZIESS社)で画像を得た。
テラトーマ形成分析を行うため、IV型コラゲナーゼ(Invitrogen社)を使用してヒトiPS細胞を回収し、それらの細胞を200μlのマトリゲルに再懸濁し、Rag2γノックアウトマウスの後肢に筋肉内注射した。その注射後4~8週間の間にテラトーマを単離し、ホルマリン中に固定した。その後に該テラトーマをヘマトキシリン・エオシン染色により分析した。
実施例11
reTALENSを使用するヒト体細胞およびヒト幹細胞におけるゲノム座位へのターゲティング
ある態様によると、反復配列を除去するために、当業者に知られているTALEを改変または再編集する。ウイルス性送達ビヒクルおよび本明細書に記載される様々な細胞株および生物におけるゲノム編集方法における改変および使用に適切なそのようなTALEは、その全体がここに参照により本明細書に取り込まれる参考文献2、7~12に開示されている。反復性TALE RVDアレイ配列をアセンブリーするために、幾つかの戦略が開発されている(その全体がここに参照により本明細書に取り込まれる参考文献14および32~34を参照のこと)。しかしながら、アセンブリーしても、TALE配列リピートは不安定なままであり、このため、このツールの広範な有用性、特にウイルス遺伝子送達ビヒクルへの有用性、が制限される(その全体がここに参照により本明細書に取り込まれる参考文献13および35を参照のこと)。したがって、本開示の1つの態様は、リピートを欠く、例えばリピートを完全に欠く、TALEに関する。そのような再編集TALEは、伸長したTALE RVDアレイのより速くてより簡易な合成を可能にするので利点が有る。
reTALENSを使用するヒト体細胞およびヒト幹細胞におけるゲノム座位へのターゲティング
ある態様によると、反復配列を除去するために、当業者に知られているTALEを改変または再編集する。ウイルス性送達ビヒクルおよび本明細書に記載される様々な細胞株および生物におけるゲノム編集方法における改変および使用に適切なそのようなTALEは、その全体がここに参照により本明細書に取り込まれる参考文献2、7~12に開示されている。反復性TALE RVDアレイ配列をアセンブリーするために、幾つかの戦略が開発されている(その全体がここに参照により本明細書に取り込まれる参考文献14および32~34を参照のこと)。しかしながら、アセンブリーしても、TALE配列リピートは不安定なままであり、このため、このツールの広範な有用性、特にウイルス遺伝子送達ビヒクルへの有用性、が制限される(その全体がここに参照により本明細書に取り込まれる参考文献13および35を参照のこと)。したがって、本開示の1つの態様は、リピートを欠く、例えばリピートを完全に欠く、TALEに関する。そのような再編集TALEは、伸長したTALE RVDアレイのより速くてより簡易な合成を可能にするので利点が有る。
リピートを除去するため、TALE RVDアレイのヌクレオチド配列を計算的に進化させて、アミノ酸組成を維持しつつ配列リピートの数を最少にした。16個のタンデムRVD DNA認識モノマーおよび最後の半分のRVDリピートをコードする再編集TALE(Re-TALE)は、12bpのリピートを全く欠いている(図5aを参照のこと)。特筆すべきことに、このレベルの再編集は、全長re-TALEコンストラクトに由来するあらゆる特定のモノマーまたは小区分のPCR増幅を可能にするのに充分である(図5bを参照のこと)。高度に反復した配列に伴う追加の費用または方法を招くことなく、標準的なDNA合成技術を用いて改善されたデザインのre-TALEを合成することができる(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献36を参照されたい)。さらに、その再編集配列デザインにより、本明細書内の方法に記載され図6を参照して記載される改変等温アセンブリー反応を用いて、re-TALEコンストラクトの効率的なアセンブリーが可能になる。
ゲノム編集NGS(次世代シークエンシング)データを次のように統計分析した。相同性修復(HDR)特異度分析について、正確二項検定を用いて、2bpミスマッチを含む様々な数の配列リードを観察する確率を計算した。ターゲティング部位前後の10bpウインドウのシークエンシング結果に基づいて、2つのウインドウ(P1およびP2)の最大塩基変化率を評価した。2標的塩基ペアのそれぞれの変化が独立しているという帰無仮説を用いて、これらの2つの確率の積(P1×P2)としてのそのターゲティング部位において2bpミスマッチを偶然に観察する期待確率を計算した。N個の全リードとn個の相同性修復(HDR)リードを含むデータセットを基に、我々は観察された相同性修復(HDR)効率のp値を計算した。相同性修復(HDR)感度分析について、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドDNAドナーはターゲティングゲノムに対する2bpのミスマッチを含んでおり、該一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが該ターゲティングゲノムに組み込まれた場合に、それによって前記2標的塩基のペアにおいて塩基の変化が共存在する蓋然性が高いものとなった。他の想定外の観察された配列の変化が同時に変化する蓋然性は低い。したがって、想定外の変化の相互依存性はよりずっと低いものであった。これらの仮定に基づき、相互情報量(MI)を使用して、他の全てのペア位置における同時に2塩基ペアが変化することの相互依存性を測定し、ターゲットとなっている2bpの部位のMIがこれ以外の位置のペア全てのMIよりも多い場合における最小の相同性修復(HDR)として、相同性修復(HDR)検出限界を評価した。所与の実験について、元のfastqファイルからの、所定の2bpミスマッチを有する相同性修復(HDR)リードを特定し、元のデータセットから様々な数の相同性修復(HDR)リードを体系的に除去することにより、希釈された相同性修復(HDR)効率を有する一組のfastqファイルをシミュレートした。ターゲティング部位上を中央とした20bpウインドウ内の位置の全てのペアの間で、相互情報量(MI)を計算した。これらの計算において、あらゆる2つの位置の間における塩基組成の相互情報量を計算する。上に記載される相同性修復(HDR)特異度測定と異なり、この測定は、位置ペアが特定の標的塩基のペアに変化する傾向を評価せず、それらの位置ペアが同時に変化する傾向だけを評価する(図8Aを参照のこと)。表6は、CCR5を標的とするre-TALEN/一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの相同性修復(HDR)および非相同末端結合(NHEJ)の効率、ならびにCas9-gRNAのNHEL効率を示している。我々は、我々の分析をRでコード化し、パッケージinfotheoを使用してMIを計算した。
ゲノム編集効率とエピジェネティック状態との間の相関は次のように対処された。エピジェネティックパラメーター(DNaseI HS(高感受性部位)またはヌクレオソーム占有)とゲノムエンジニアリング効率(相同性修復(HDR)、非相同末端結合(NHEJ))との間のあり得る関係を試験するために、ピアソン相関係数を計算した。DNAaseI超感受性のデータセットをUCSCゲノムブラウザーからダウンロードした。hiPSCs DNase I HS: /gbdb/hg19/bbi/wgEncodeOpenChromDnaseIpsnihi7Sig.bigWig
P値を計算するため、エピジェネティックパラメーターの位置をランダム化することにより構築されたシミュレートされた分布に対して、観察された相関を比較した(N=100000)。95%目よりも高い、または5%目よりも低い、観察された相関を潜在的な関係と考えた。
対応する非再編集TALENと比較しての、reTALENのヒト細胞における機能を決定した。フレームシフト性挿入を有するGFPレポーターカセットを含むHEK293細胞株を、その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献37に記載されるように使用した。図1aも参照されたい。その挿入配列を標的とするTALENまたはreTALENを、プロモーターを有しないGFPドナーコンストラクトと一緒に送達することにより、GFPカセットの二本鎖切断(DSB)誘導性相同性修復(HDR)修復が起こり、その結果、GFP修復効率を用いてヌクレアーゼ切断効率を評価することができる。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献38を参照されたい。reTALENは、形質移入細胞の1.4%においてGFP修復を誘導し、TALENによって達成されたものと類似していた(1.2%)(図1bを参照のこと)。PGP1 ヒトiPS細胞中のAAVS1座位におけるreTALENの活性を検査したが(図1cを参照のこと)、該活性によって特定の挿入を含む細胞クローンの回復に成功し(図1d、eを参照のこと)、reTALENがヒト体細胞とヒト多能性細胞の両方において活性を有することが確認された。
リピートの除去によって、re-TALEカーゴによる機能的レンチウイルスの生成が可能になった。具体的には、re-TALE-2A-GFPをコードするレンチウイルス粒子のパッケージングを行い、レンチ-reTALE-2A-GFP感染293T細胞のプールにmCherryレポーターを形質移入することによって、ウイルス粒子によりコードされるre-TALE-TFの活性について前記レンチウイルス粒子を検査した。レンチ-re-TALE-TFによって形質導入された293T細胞は、レポーターのみの陰性と比べて、36倍のレポーター発現活性化を示した(図7a、b、cを参照のこと)。レンチウイルス感染細胞におけるre-TALE-TFの配列完全性を検査し、検査したクローンの全10クローンで全長reTALEが検出された(図7dを参照のこと)。
実施例12
ゲノム編集評価システム(GEAS)によるヒトiPS細胞におけるReTALE効率とCas9-gRNA効率の比較
ヒトiPS細胞におけるre-TALENの編集効率とCas9-gRNAの編集効率を比較するため、次世代シークエンシングプラットフォーム(ゲノム編集評価システム)を開発して、非相同末端結合(NHEJ)遺伝子編集事象と相同性修復(HDR)遺伝子編集事象の両方を特定および定量した。どちらもCCR5の上流領域を標的としたre-TALENペアおよびCas9-gRNA(表3中のre-TALEN、Cas9-gRNAペア番号3)を、2bpミスマッチを除いて標的部位と同一である90ntの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナー(図2aを参照のこと)と共に設計および構築した。このヌクレアーゼコンストラクトおよびドナー一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドをヒトiPS細胞に形質移入した。遺伝子編集効率を定量するため、形質移入から3日後に、標的ゲノム領域に対するペアードエンド・ディープシークエンシングを行った。正確な2bpミスマッチを含むリードのパーセンテージによって相同性修復(HDR)効率を測定した。インデルを有するリードのパーセンテージによって非相同末端結合(NHEJ)効率を測定した。
ゲノム編集評価システム(GEAS)によるヒトiPS細胞におけるReTALE効率とCas9-gRNA効率の比較
ヒトiPS細胞におけるre-TALENの編集効率とCas9-gRNAの編集効率を比較するため、次世代シークエンシングプラットフォーム(ゲノム編集評価システム)を開発して、非相同末端結合(NHEJ)遺伝子編集事象と相同性修復(HDR)遺伝子編集事象の両方を特定および定量した。どちらもCCR5の上流領域を標的としたre-TALENペアおよびCas9-gRNA(表3中のre-TALEN、Cas9-gRNAペア番号3)を、2bpミスマッチを除いて標的部位と同一である90ntの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナー(図2aを参照のこと)と共に設計および構築した。このヌクレアーゼコンストラクトおよびドナー一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドをヒトiPS細胞に形質移入した。遺伝子編集効率を定量するため、形質移入から3日後に、標的ゲノム領域に対するペアードエンド・ディープシークエンシングを行った。正確な2bpミスマッチを含むリードのパーセンテージによって相同性修復(HDR)効率を測定した。インデルを有するリードのパーセンテージによって非相同末端結合(NHEJ)効率を測定した。
一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドのみをヒトiPS細胞に送達したところ、最小の相同性修復(HDR)率および非相同末端結合(NHEJ)率となったが、re-TALENおよび一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを送達したところ、1.7%の相同性修復(HDR)効率および1.2%の非相同末端結合(NHEJ)効率が得られた(図2bを参照のこと)。Cas9-gRNAを一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドと共に導入することにより、1.2%の相同性修復(HDR)効率および3.4%の非相同末端結合(NHEJ)効率が得られた。特筆すべきことに、ゲノム欠失と挿入の率は、2つのreTALEN結合部位間のスペーサー領域の中央でピークに達したが、一方、Cas9-gRNAターゲティング部位のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列の3~4bp上流でピークに達した(図2bを参照のこと)。二本鎖切断がこれらの領域で起こるので、この結果は予期される通りであった。re-TALENによって生じた6bpというゲノム欠失サイズと3bpという挿入サイズの中央値が観察され、また、Cas9-gRNAによって7bpという欠失サイズおよび1bpという挿入の中央値が観察され(図2bを参照のこと)、非相同末端結合(NHEJ)によって通常生じるDNA損傷パターンと一貫性があった(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献4を参照されたい)。次世代シークエンシングプラットフォームの幾つかの分析により、ゲノム編集評価システム(GEAS)は0.007%という低い相同性修復(HDR)検出率を検出することができ、それは非常に再現性に富み(複製(replicates)間の変動係数=±15%×測定された効率)、且つ、最も一般的に用いられるミスマッチ感受性エンドヌクレアーゼアッセイよりも400倍敏感である(図8を参照のこと)ことが明らかになった。
CCR5ゲノム座位における15か所の部位を標的とするre-TALENペアおよびCas9-gRNAを構築して、編集効率を測定した(図2cを参照のこと、表3を参照のこと)。これらの部位は、広範囲のDNaseI感受性を表すために選択された(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献39を参照されたい)。ヌクレアーゼコンストラクトを、対応する一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナー(表3を参照のこと)と共に、PGP1 ヒトiPS細胞へ形質移入した。形質移入から6日後に、これらの部位におけるゲノム編集効率のプロファイルを作成した(表6)。15種類のre-TALENペア+一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーのうちの13種類について、統計的検出閾値よりも上のレベルで非相同末端結合(NHEJ)および相同性修復(HDR)が検出され、平均非相同末端結合(NHEJ)効率は0.4%であり、平均相同性修復(HDR)効率は0.6%であった(図2cを参照のこと)。加えて、同じターゲティング座位において相同組換え(HR)効率と非相同末端結合(NHEJ)効率との間に統計的に有意な正の相関(r2=0.81)が見いだされ(P<1×10-4)(図9aを参照のこと)、相同性修復(HDR)と非相同末端結合(NHEJ)の両方に共通する上流工程である二本鎖切断(DSB)生成が、reTALEN介在性ゲノム編集の律速工程であることが示唆された。
対照的に、15種類全てのCas9-gRNAペアが有意なレベルの非相同末端結合(NHEJ)および相同組換え(HR)を示し、平均非相同末端結合(NHEJ)効率が3%であり、平均相同性修復(HDR)効率が1.0%であった(図2cを参照のこと)。加えて、Cas9-gRNAによって誘導された非相同末端結合(NHEJ)と相同性修復(HDR)の効率の間でも正の相関が検出され(図9bを参照のこと)(r2=0.52、p=0.003)、reTALENについての観察結果と一貫性があった。Cas9-gRNAによって達成された非相同末端結合(NHEJ)効率は、reTALENによって達成されたものよりも有意に高かった(t検定、ペアードエンド、P=0.02)。非相同末端結合(NHEJ)効率とgRNAターゲティング配列の融点との間に、ほどほどではあるが統計的に有意な相関が観察され(図9cを参照のこと)(r2=0.28、p=0.04)、Cas9-gRNA介在性二本鎖切断(DSB)生成効率における28%ものばらつきをgRNAとそのゲノム標的との間の塩基対合の強度によって説明することができることが示唆された。Cas9-gRNAは、対応するreTALENよりも平均して7倍高い非相同末端結合(NHEJ)レベルを生じさせたにもかかわらず、Cas9-gRNAは対応するreTALENの相同性修復(HDR)レベル(平均値=0.6%)と類似した相同性修復(HDR)レベル(平均値=1.0%)を達成しただけであった。科学理論に捉われることを望むものではないが、二本鎖切断(DSB)における一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド濃度が相同性修復(HDR)の律速因子であること、または、Cas9-gRNAによって作られるゲノム切断構造が有効な相同性修復(HDR)にとって好ましくないことが、これらの結果より示唆され得る。DNaseI HS(高感受性部位)とゲノムターゲティング効率との間の相関は、どちらの方法についても観察されなかった(図10を参照のこと)。
実施例13
相同性修復(HDR)用一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーの設計の最適化
ヒトiPS細胞における高性能一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを次のように設計した。どれもCCR5 re-TALENペア第3番の標的部位のスペーサー領域の中央に同一の2bpのミスマッチを有する、異なる長さ(50~170nt)の一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーのセットを設計した。一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド長と共に変化する相同性修復(HDR)効率が観察され、90ntの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドで約1.8%の最適相同性修復(HDR)効率が観察され、一方でより長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドによって相同性修復(HDR)効率が低下した(図3aを参照のこと)。二本鎖DNAドナーがヌクレアーゼと共に使用されるときに、相同領域が長いほど相同性修復(HDR)率が改善されるので(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献40を参照されたい)、この結果についてのあり得る理由は、二本鎖DNAドナーと比べて、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドは代替的なゲノム修復過程において使用されること、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが長くなるほどゲノム修復装置による利用可能性が低下すること、またはより長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドはより長い相同性によって得られるあらゆる改善を相殺してしまう負の効果を招くこと、であり得る(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献41を参照されたい)。しかし、最初の2つの理由のうちのどちらかが当てはまる場合、非相同末端結合(NHEJ)修復には一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーが関与しないので、非相同末端結合(NHEJ)率は影響されないか、または一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが長くなるほど増加はずである。しかしながら、非相同末端結合(NHEJ)率は相同性修復(HDR)と共に低下することが観察されるため(図3aを参照のこと)、より長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが相殺効果を示すことが示唆された。より長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドほど細胞にとって有毒である(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献42を参照されたい)か、またはより長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの形質移入がDNAプロセシング装置を飽和状態にして、モルDNA取込量を減少させ、細胞がre-TALENプラスミドを取り込むまたは発現する能力を低下させる、というのがあり得る仮説である。
相同性修復(HDR)用一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーの設計の最適化
ヒトiPS細胞における高性能一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを次のように設計した。どれもCCR5 re-TALENペア第3番の標的部位のスペーサー領域の中央に同一の2bpのミスマッチを有する、異なる長さ(50~170nt)の一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーのセットを設計した。一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド長と共に変化する相同性修復(HDR)効率が観察され、90ntの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドで約1.8%の最適相同性修復(HDR)効率が観察され、一方でより長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドによって相同性修復(HDR)効率が低下した(図3aを参照のこと)。二本鎖DNAドナーがヌクレアーゼと共に使用されるときに、相同領域が長いほど相同性修復(HDR)率が改善されるので(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献40を参照されたい)、この結果についてのあり得る理由は、二本鎖DNAドナーと比べて、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドは代替的なゲノム修復過程において使用されること、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが長くなるほどゲノム修復装置による利用可能性が低下すること、またはより長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドはより長い相同性によって得られるあらゆる改善を相殺してしまう負の効果を招くこと、であり得る(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献41を参照されたい)。しかし、最初の2つの理由のうちのどちらかが当てはまる場合、非相同末端結合(NHEJ)修復には一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーが関与しないので、非相同末端結合(NHEJ)率は影響されないか、または一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが長くなるほど増加はずである。しかしながら、非相同末端結合(NHEJ)率は相同性修復(HDR)と共に低下することが観察されるため(図3aを参照のこと)、より長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが相殺効果を示すことが示唆された。より長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドほど細胞にとって有毒である(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献42を参照されたい)か、またはより長い一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの形質移入がDNAプロセシング装置を飽和状態にして、モルDNA取込量を減少させ、細胞がre-TALENプラスミドを取り込むまたは発現する能力を低下させる、というのがあり得る仮説である。
一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーが有するミスマッチの組込み率が、ミスマッチから二本鎖切断(「DSB」)までの距離によってどのように変化するかを調査した。どれもre-TALENペア第3番のスペーサー領域の中央に同一の2bpのミスマッチ(A)を有する、一連の90ntの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを設計した。各一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドは、中央から様々な距離に2つ目の2bpミスマッチ(B)を含むものであった(図3bを参照のこと)。中央の2bpミスマッチだけを有する一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを対照として使用した。これらの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドのそれぞれをre-TALENペア第3番と共に個々に導入し、ゲノム編集評価システム(GEAS)によって結果を分析した。我々は、Aミスマッチが組み込まれた率(Aのみ、またはA+B)によって測定される全体の相同性修復(HDR)は、Bミスマッチが中央から離れるほど、減少することを発見した(図3bを参照のこと、図11aを参照のこと)。BがAからわずかに10bp離れているときに観察されたより高い全体の相同性修復(HDR)率は、二本鎖DNA切断の近傍のゲノムDNAに対して一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドがアニーリングする必要性がより低いことを反映しているものであり得る。
AからBの距離それぞれについて、ある割合の相同性修復(HDR)事象はAミスマッチを組み込んだだけであり、別の割合の相同性修復(HDR)事象はAミスマッチとBミスマッチの両方を組み込むものであった(図3bを参照のこと(Aのみ、およびA+B))。これらの2つの結果は、一本鎖DNAオリゴの長さに沿った遺伝子変換トラクトに起因するものであり得(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献43を参照されたい)、それによってAミスマッチ+Bミスマッチの組込みがBミスマッチを越えて延びる長い変換トラクトから生じ、Aミスマッチのみの組込みがBに到達しないより短いトラクトから生じた。この解釈の下で、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドに沿った両方向の遺伝子変換長の分布を評価した(図11bを参照のこと)。その評価された分布は、遺伝子変換トラクトの長さが増加するにつれてそれらの頻度が徐々に低下することを示しており、それは二本鎖DNAドナーについて見られる遺伝子変換トラクト分布と非常に類似する結果であるが、二本鎖DNAドナーの場合の数百塩基と比べると、一本鎖DNAドナーの場合数十塩基という非常に圧縮された距離スケールでのことである。この結果と整合して、中央の2bpミスマッチ「A」のどちらの側にも10ntの間隔で3対の2bpミスマッチを含む一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーを使用する実験により、A単独は場合数のうち86%で組み込まれ、複数のBミスマッチは他の場合に組み込まれるパターンが生じた(図11cを参照のこと)。B単独の組込み事象の数は10bp未満のトラクト長の分布を評価するには少なすぎたが、ヌクレアーゼ部位の10bp以内の短いトラクト領域が優勢であることは明らかである(図11bを参照のこと)。最後に、単一のBミスマッチによる全ての実験において、少ない割合のB単独組込み事象が見られ(0.04%~0.12%)、これはAからのBの距離がどの距離であっても大体において一定である。
さらに、組込みを観察したままre-TALEN誘導性二本鎖DNA切断からどれ位離れて一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーを配置することができるかについての分析を実施した。re-TALEN誘導性二本鎖DNA切断部位からより大きな距離(-600bp~+400bp)離れた範囲を標的とし、中央の2bpミスマッチを有する90ntの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドのセットを検査した。一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが40bp以上離れたところにマッチする場合、我々は、切断領域上にと中央に位置した対照一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドと比較して、30分の1未満と低い相同性修復(HDR)効率を観察した(図3cを参照のこと)。観察された低いレベルの組込みは、二本鎖DNA切断と無関係の過程に起因し得、このことは、一本鎖DNAドナー単独によってゲノムが改変される実験に見ることができる(その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献42を参照されたい)。一方、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが約40bp離れているときに存在する相同性修復(HDR)の低いレベルは、二本鎖DNA切断のミスマッチ含有側のホモロジー低下と二本鎖DNA切断の反対側の不充分な一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドオリゴ長の組合せに起因し得る。
Cas9-gRNA介在性ターゲティング用の一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド
DNAドナーデザインを検査した。AAVS1座位を標的とするCas9-gRNA(C2)を構築し、方向性(Oc:gRNAに対して相補的、およびOn:gRNAに対して非相補的)および長さ(30、50、70、90、110nt)が様々であり得る一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーを設計した。OcはOnよりも優れた効率を達成し、70merのOcは1.5%という最適相同性修復(HDR)率を達成した(図3dを参照のこと)。一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを伴うCas9由来ニッケース(Cc:Cas9_D10A)が介在した相同性修復(HDR)効率はC2よりも有意に低い(t検定、ペアードエンド、P=0.02)という事実にもかかわらず、Ccを使用しても同じ一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド鎖バイアスが検出された(図12を参照のこと)。
DNAドナーデザインを検査した。AAVS1座位を標的とするCas9-gRNA(C2)を構築し、方向性(Oc:gRNAに対して相補的、およびOn:gRNAに対して非相補的)および長さ(30、50、70、90、110nt)が様々であり得る一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーを設計した。OcはOnよりも優れた効率を達成し、70merのOcは1.5%という最適相同性修復(HDR)率を達成した(図3dを参照のこと)。一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを伴うCas9由来ニッケース(Cc:Cas9_D10A)が介在した相同性修復(HDR)効率はC2よりも有意に低い(t検定、ペアードエンド、P=0.02)という事実にもかかわらず、Ccを使用しても同じ一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド鎖バイアスが検出された(図12を参照のこと)。
実施例14
修正された細胞のヒトiPS細胞クローン単離
re-TALENペア第3番がヒトiPS細胞内で正確なゲノム編集を約1%の効率で達成することがゲノム編集評価システム(GEAS)により明らかになったが、この効率は、正確に編集された細胞をクローンのスクリーニングにより通常単離することが可能なレベルである。単一細胞としては、ヒトiPS細胞は低い生存度を有する。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献23に記載の最適化プロトコルを単一細胞FACS選別法と共に用いて、25%を超える生存率でヒトiPS細胞クローンを回収することができる単一ヒトiPS細胞の選別および維持のための頑健なプラットフォームを構築した。この方法を急速高効率遺伝子型判定システムと組み合わせて、1時間の単一試験管反応において染色体DNA抽出および標的ゲノム増幅を行い、編集されたヒトiPS細胞の大規模遺伝子型判定を可能にした。まとめると、これらの方法は、ゲノム編集されたヒトiPS細胞を選択無しに強力に得るためのパイプラインを含む。
修正された細胞のヒトiPS細胞クローン単離
re-TALENペア第3番がヒトiPS細胞内で正確なゲノム編集を約1%の効率で達成することがゲノム編集評価システム(GEAS)により明らかになったが、この効率は、正確に編集された細胞をクローンのスクリーニングにより通常単離することが可能なレベルである。単一細胞としては、ヒトiPS細胞は低い生存度を有する。その全体が参照により本明細書に取り込まれる参考文献23に記載の最適化プロトコルを単一細胞FACS選別法と共に用いて、25%を超える生存率でヒトiPS細胞クローンを回収することができる単一ヒトiPS細胞の選別および維持のための頑健なプラットフォームを構築した。この方法を急速高効率遺伝子型判定システムと組み合わせて、1時間の単一試験管反応において染色体DNA抽出および標的ゲノム増幅を行い、編集されたヒトiPS細胞の大規模遺伝子型判定を可能にした。まとめると、これらの方法は、ゲノム編集されたヒトiPS細胞を選択無しに強力に得るためのパイプラインを含む。
この系を実証するため(図4aを参照のこと)、第3部位における、CCR5を標的とするre-TALENのペアおよび一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドをPGP1 ヒトiPS細胞に形質移入した(表3を参照のこと)。形質移入された細胞の一部を用いてゲノム編集評価システム(GEAS)を行い、1.7%という相同性修復(HDR)頻度を見出した(図4bを参照のこと)。選別された単一細胞クローンの25%の回収度と共にこの情報によって、98%のポワソン確率(μ=0.017×0.25×φθ×5×2と仮定)で、5枚の96ウェルプレートから少なくとも1つの正確に編集されたクローンが得られるという評価が可能になる。形質移入から6日後にヒトiPS細胞をfacs選別し、選別から8日後に100個のヒトiPS細胞クローンをスクリーニングした。これらの選択されていないヒトiPS細胞コロニーのうちの100個につき2個が、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーによって導入される2bpの変異を有するヘテロ接合性の遺伝子型を含むことが、サンガーシークエンシングにより明らかになった(図4cを参照のこと)。1%というターゲティング効率(1%=2/2×100、スクリーニングされた100個の細胞のうちの2個の単アレル性修正クローン)は、次世代シークエンシング解析(1.7%)と一致した(図4bを参照のこと)。結果生じたヒトiPS細胞の多能性が、SSEA4およびTRA-1-60についての免疫染色によって確認された(図4dを参照のこと)。ターゲティングに成功したヒトiPS細胞クローンは、3種類全ての胚葉の特徴を有する成熟テラトーマを形成することができた(図4eを参照のこと)。
実施例15
連続的細胞ゲノム編集の方法
ある態様によると、細胞(ヒト細胞など、例えばヒト幹細胞)におけるゲノム編集のための方法であって、標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素をコードする核酸を含むように、細胞を遺伝的に改変する方法が提供される。そのような酵素には、RNA誘導型DNA結合タンパク質、例えばII型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質、が含まれる。例示的酵素の一つはCas9である。この態様によると、前記細胞は前記酵素を発現し、前記細胞の周囲の媒体から前記細胞へガイドRNAが提供される。ガイドRNAと前記酵素は共局在複合体を前記標的DNAのところで形成し、そこで前記酵素は該DNAを切断する。所望により、該切断部位において前記DNAに挿入されるためのドナー核酸が存在してもよく、前記挿入は、例えば非相同末端結合または相同組換えによる。1つの態様によると、前記標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素(例えばCas9)をコードする核酸は、プロモーターの影響下にあり、例えば前記核酸が活性化および発現抑制(silence)され得る。そのようなプロモーターは当業者によく知られている。1つの例示的プロモーターはdox(ドキシサイクリン)誘導性プロモーターである。1つの態様によると、前記細胞は、前記標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素をコードする核酸が、細胞のゲノムに可逆的に挿入されていることにより、遺伝的に改変されている。挿入されると、トランスポゼースなどの試薬を使用してその核酸を除去することができる。このように該核酸は使用後に容易に除去することができる。
連続的細胞ゲノム編集の方法
ある態様によると、細胞(ヒト細胞など、例えばヒト幹細胞)におけるゲノム編集のための方法であって、標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素をコードする核酸を含むように、細胞を遺伝的に改変する方法が提供される。そのような酵素には、RNA誘導型DNA結合タンパク質、例えばII型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質、が含まれる。例示的酵素の一つはCas9である。この態様によると、前記細胞は前記酵素を発現し、前記細胞の周囲の媒体から前記細胞へガイドRNAが提供される。ガイドRNAと前記酵素は共局在複合体を前記標的DNAのところで形成し、そこで前記酵素は該DNAを切断する。所望により、該切断部位において前記DNAに挿入されるためのドナー核酸が存在してもよく、前記挿入は、例えば非相同末端結合または相同組換えによる。1つの態様によると、前記標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素(例えばCas9)をコードする核酸は、プロモーターの影響下にあり、例えば前記核酸が活性化および発現抑制(silence)され得る。そのようなプロモーターは当業者によく知られている。1つの例示的プロモーターはdox(ドキシサイクリン)誘導性プロモーターである。1つの態様によると、前記細胞は、前記標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素をコードする核酸が、細胞のゲノムに可逆的に挿入されていることにより、遺伝的に改変されている。挿入されると、トランスポゼースなどの試薬を使用してその核酸を除去することができる。このように該核酸は使用後に容易に除去することができる。
1つの態様によると、CRISPRシステムを使用するヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)における連続ゲノム編集システムが提供される。例示的態様によると、前記方法は、ゲノムに可逆的に挿入されたCas9を有するヒトiPS細胞株(Cas9-hiPSC)、および前記Cas9と共に使用されるために前記細胞の周囲の媒体から前記細胞中への移行を可能にするよう天然型から改変されたgRNA、の使用を含む。そのようなgRNAは、ホスフェート基を取り除くようにホスファターゼで処理されている。組織培養培地中にホスファターゼ処理されたgRNAを添加することにより、Cas9を用いて前記細胞におけるゲノム編集を行う。このアプローチにより、一日の処理によって最大50%の効率でヒトiPS細胞における無痕性ゲノム編集が可能となり、これはこれまでに報告されている最良の効率の2~10倍効率的である。さらに、前記方法は使いやすく、細胞毒性が著しく少なくなっている。本開示の実施形態は生物学的研究用途および治療用途のためのヒトiPS細胞の単一編集、生物学的研究用途および治療用途のためのヒトiPS細胞の多重編集、指向性ヒトiPS細胞進化、ならびにヒトiPS細胞およびその派生細胞の表現型スクリーニングを含む。
ある態様によると、幹細胞に加え、本明細書に記載される他の細胞株および生物も使用することができる。例えば、本明細書に記載される方法をマウス細胞またはラット細胞などの動物細胞に用いることができ、それにより、Cas9が安定に組み込まれたマウス細胞およびラット細胞を作製することができ、また、ホスファターゼ処理されたgRNAを前記細胞の周囲の媒体から局所的に導入することにより、組織特異的ゲノム編集を行うことができる。また、多数の細胞株および生物に他のCas9誘導体を挿入することができ、配列特異的ニック形成、遺伝子活性化、抑制、およびエピジェネティック改変などの標的化ゲノム改変を行うことができる。
本開示のいくつかの態様は、ゲノムに挿入されたCas9を用いて安定なヒトiPS細胞を作製することに関する。本開示のいくつかの態様は、RNAが、細胞の免疫応答を回避しつつ、細胞壁を通じて細胞に侵入およびCas9と共局在することを可能にするようRNAを改変することに関する。そのような改変型ガイドRNAは、最小の毒性で、最適形質移入効率を達成することができる。本開示のいくつかの態様は、ホスファターゼ処理されたgRNAを使用する、Cas9-ヒトiPS細胞における最適化ゲノム編集に関する。本開示のいくつかの態様は、無痕性ゲノム編集を達成するためのヒトiPS細胞からのCas9の除去を含み、その場合にCas9をコードする核酸は前記細胞ゲノム内に可逆的に配置されている。本開示のいくつかの態様は、ゲノムに挿入されたCas9を有するヒトiPS細胞を使用して所望の遺伝的変異を形成する、生体医学エンジニアリングを含む。そのような改変されたヒトiPS細胞は多能性を維持し、患者細胞株の表現型を完全に再現する様々な細胞種(心筋細胞など)へ成功裏に分化することができる。
本開示のいくつかの態様は、多重ゲノム編集用のホスファターゼ処理されたgRNAのライブラリーを含む。本開示のいくつかの態様は、それぞれ1個から数個の指定された変異をゲノム中に有し、薬品スクリーニング用のリソースとして機能し得る、PGP細胞株のライブラリーを作製することを含む。本開示のいくつかの態様は、レトロトランスエレメントの位置および活性を追跡するため、全てのレトロトランスエレメントが種々の配列でバーコード化された、PGP1細胞株を作製することを含む。
実施例16
ゲノムに挿入されたCas9を有する安定なヒトiPS細胞の作製
Cas9がdox誘導性プロモーターの下にコードされ、Piggybacトランスポゼースの助けによってゲノムに挿入除去可能なPiggybacベクター内にコンストラクトを配置した。PCR反応によって、該ベクターの安定な挿入を確認した(図14を参照のこと)。RT-QPCRにより誘導性Cas9発現を判定した。Cas9のmRNAレベルは、培地中に1ug/mLのDOXを添加してから8時間後に1000倍に増加し、Cas9のmRNAのレベルはDOXの除去から約20時間後に正常レベルまで低下した(図15を参照のこと)。
ゲノムに挿入されたCas9を有する安定なヒトiPS細胞の作製
Cas9がdox誘導性プロモーターの下にコードされ、Piggybacトランスポゼースの助けによってゲノムに挿入除去可能なPiggybacベクター内にコンストラクトを配置した。PCR反応によって、該ベクターの安定な挿入を確認した(図14を参照のこと)。RT-QPCRにより誘導性Cas9発現を判定した。Cas9のmRNAレベルは、培地中に1ug/mLのDOXを添加してから8時間後に1000倍に増加し、Cas9のmRNAのレベルはDOXの除去から約20時間後に正常レベルまで低下した(図15を参照のこと)。
1つの態様によると、前記Cas9-ヒトiPS細胞システムベースのゲノム編集は、ヒトiPS細胞における形質移入効率が通常は1%未満である大きなコンストラクトであるCas9プラスミド/RNAの形質移入手順、を迂回する。本Cas9-ヒトiPS細胞システムは、ヒト幹細胞において高効率のゲノムエンジニアリングを実施するためのプラットフォームとして役立ち得る。加えて、Piggybacシステムを使用してヒトiPS細胞に導入された前記Cas9カセットは、トランスポゼースの導入によって容易にゲノムから除去することができる。
実施例17
ホスファターゼ処理されたガイドRNA
Cas9-ヒトiPS細胞での連続ゲノム編集を可能にするため、gRNAをコードする一連の改変RNAを作製し、リポソームと複合してCas9-iPS培養培地に添加した。どのようなキャッピングも有しないホスファターゼ処理された未改変RNAは、13%という最適相同性修復(HDR)効率を達成したが、これは、これまでに報告された5’キャップ付加改変RNAよりも30倍高いものである(図16を参照のこと)。
ホスファターゼ処理されたガイドRNA
Cas9-ヒトiPS細胞での連続ゲノム編集を可能にするため、gRNAをコードする一連の改変RNAを作製し、リポソームと複合してCas9-iPS培養培地に添加した。どのようなキャッピングも有しないホスファターゼ処理された未改変RNAは、13%という最適相同性修復(HDR)効率を達成したが、これは、これまでに報告された5’キャップ付加改変RNAよりも30倍高いものである(図16を参照のこと)。
1つの態様によると、ガイドRNAは物理的にドナーDNAに結合している。これにより、Cas9介在性ゲノム切断と一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド介在性相同性修復(HDR)を連結し、そうして配列特異的ゲノム編集を促進する方法が提供される。最適な濃度のDNA 一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドドナーと結合したgRNAは、44%の相同性修復(HDR)および2%の非特異的非相同末端結合(NHEJ)を達成した(図17を参照のこと)。この方法がヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションで観察されるような目に見える毒性を招かないことは、特筆すべきことである。
1つの態様によると、本開示はgRNAをコードし、ゲノム中に挿入されたCas9と協同して高い形質移入効率、ゲノム編集効率を達成する、インビトロ改変RNA構造体を提供する。加えて本開示は、ゲノム切断事象を相同性指向性組換え反応と結びつけるgRNA-DNAキメラコンストラクトを提供する。
実施例18
無痕性ゲノム編集を達成するための、可逆的に改変されたCas9のヒトiPS細胞からの除去
ある態様によると、可逆的ベクターを使用してヒトiPS細胞のゲノムにCas9カセットが挿入される。したがって、PiggyBacベクターを使用してヒトiPS細胞のゲノムにCas9カセットを可逆的に挿入した。ゲノム編集されたヒトiPS細胞にトランスポゼースをコードするプラスミドを形質移入することにより前記細胞からCas9カセットを除去した。したがって、本開示のいくつかの態様は、当業者に知られた可逆的ベクターの使用を含んでいる。可逆的ベクターは、例えばゲノムに挿入可能であり、後に対応するベクター除去酵素によって除去可能であるベクターである。そのようなベクターおよび対応するベクター除去酵素は当業者に知られている。コロニー化iPS細胞に対してスクリーニングを行い、PCR反応によって確認されるように、Cas9カセットを欠くコロニーを回収した。したがって、本開示は、細胞に存在する恒久的なCas9カセットを有することにより、ゲノムの残りの部分に影響を与えることが無いゲノム編集方法を提供する。
無痕性ゲノム編集を達成するための、可逆的に改変されたCas9のヒトiPS細胞からの除去
ある態様によると、可逆的ベクターを使用してヒトiPS細胞のゲノムにCas9カセットが挿入される。したがって、PiggyBacベクターを使用してヒトiPS細胞のゲノムにCas9カセットを可逆的に挿入した。ゲノム編集されたヒトiPS細胞にトランスポゼースをコードするプラスミドを形質移入することにより前記細胞からCas9カセットを除去した。したがって、本開示のいくつかの態様は、当業者に知られた可逆的ベクターの使用を含んでいる。可逆的ベクターは、例えばゲノムに挿入可能であり、後に対応するベクター除去酵素によって除去可能であるベクターである。そのようなベクターおよび対応するベクター除去酵素は当業者に知られている。コロニー化iPS細胞に対してスクリーニングを行い、PCR反応によって確認されるように、Cas9カセットを欠くコロニーを回収した。したがって、本開示は、細胞に存在する恒久的なCas9カセットを有することにより、ゲノムの残りの部分に影響を与えることが無いゲノム編集方法を提供する。
実施例19
iPGP1細胞におけるゲノム編集
心筋症の発病の研究は適切なモデル系の欠如によって歴史的に妨げられてきた。患者由来人工多能性幹細胞(iPS細胞)の心筋細胞分化がこの障壁を乗り越える1つの有望な道筋を提示しており、心筋症のiPS細胞モデリングの報告が現れ始めたところである。しかしながら、この見込みの実現には、患者由来iPS細胞株の遺伝的異質性を克服するためのアプローチが必要とされる。
iPGP1細胞におけるゲノム編集
心筋症の発病の研究は適切なモデル系の欠如によって歴史的に妨げられてきた。患者由来人工多能性幹細胞(iPS細胞)の心筋細胞分化がこの障壁を乗り越える1つの有望な道筋を提示しており、心筋症のiPS細胞モデリングの報告が現れ始めたところである。しかしながら、この見込みの実現には、患者由来iPS細胞株の遺伝的異質性を克服するためのアプローチが必要とされる。
Cas9-iPGP1細胞株およびDNAに結合したホスファターゼ処理されたガイドRNAを使用して、バース症候群患者における単一ヌクレオチド欠失を担持すると特定されたTAZエクソン6の配列を除いて同質遺伝子系統である3つのiPS細胞株を作製した。一回のRNA形質移入により、約30%の相同性修復(HDR)効率が達成された。所望の変異を有する改変Cas9-iPGP1細胞をコロニー化し(図18を参照のこと)、前記細胞株を心筋細胞に分化させた。前記改変Cas9-iPGP1に由来する心筋細胞は、患者由来iPS細胞および新生児期ラットTAZノックダウンモデルにおいて観察されるカルジオリピン、ミトコンドリアおよびATPの欠陥を充分に再現した(図19を参照のこと)。したがって、多能性細胞において疾患の原因となる変異を修正し、引き続いて該細胞を所望の細胞種に分化させる方法が提供される。
実施例20
材料および方法
1. PiggyBac Cas9 dox誘導性安定ヒトiPS/ES株の構築
1. 細胞が70%の集密に達した後に、培養物を10uMの終濃度のROCK阻害剤Y27632で一晩前処理する。
2. 翌日、1.5mlの滅菌エッペンドルフチューブ中で82μlのヒト幹細胞ヌクレオフェクター溶液と18ulの添加物1を混合してヌクレオフェクション溶液を調製する。よく混合する。溶液を37℃で5分間保温する。
3. mTeSR1を吸引し、6ウェルプレートのウェル当たり2mLのDPBSで前記細胞を穏やかに洗浄する。
4. DPBSを吸引し、2mL/ウェルのヴェルセン(Versene)を添加し、細胞が丸みを帯びて接着が緩くなるが、離れてはいない状態になるまでその培養物を37℃のインキュベーターに戻す。これには3~7分が必要とされる。
5. ヴェルセン(Versene)を穏やかに吸引し、mTeSR1を添加する。1mlのmTeSR1を添加し、1,000uLのマイクロピペットにより前記細胞の上でmTeSR1を穏やかに流動させることでそれらの細胞を剥がす。
6. 剥がされた細胞を回収し、該細胞を単一細胞懸濁液へと穏やかにすりつぶし(triturate)て、そして血球計算板により定量し、そして細胞密度をml当たり100万細胞に調節する。
7. 1mlの細胞懸濁液を1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、卓上遠心機で1100RPMで5分間遠心分離する。
8. 工程2の100μlのヒト幹細胞ヌクレオフェクター溶液中に細胞を再懸濁する。9. 1mlのピペットチップを使用して細胞をヌクレオフェクターキュベットに移す。前記キュベット中の細胞懸濁液に、1μgのプラスミドトランスポゾナーゼおよび5ugのPB Cas9プラスミドを添加する。穏やかに回旋して細胞とDNAを混合する。
10. 前記キュベットをヌクレオフェクターに入れる。プログラムB-016が選択された。ボタンXを押して細胞をヌクレオフェクトする。
11. ヌクレオフェクション後に、ROCK阻害剤を有する500ulのmTeSR1培地を前記キュベット中に添加する。
12. 提供されたパスツールプラスチックピペットを使用して、前記キュベットからヌクレオフェクトされた細胞を吸引する。そしてROCK阻害剤を含むmTeSR1培地の6ウェルプレートのマトリゲルコートウェルに細胞を滴下して移す。それらの細胞を37℃で一晩培養する。
13. 翌日および形質移入から72時間後に、培地をmTesr1に変える。1ug/mlの終濃度でピューロマイシンを添加する。そして株は7日以内に樹立される。
材料および方法
1. PiggyBac Cas9 dox誘導性安定ヒトiPS/ES株の構築
1. 細胞が70%の集密に達した後に、培養物を10uMの終濃度のROCK阻害剤Y27632で一晩前処理する。
2. 翌日、1.5mlの滅菌エッペンドルフチューブ中で82μlのヒト幹細胞ヌクレオフェクター溶液と18ulの添加物1を混合してヌクレオフェクション溶液を調製する。よく混合する。溶液を37℃で5分間保温する。
3. mTeSR1を吸引し、6ウェルプレートのウェル当たり2mLのDPBSで前記細胞を穏やかに洗浄する。
4. DPBSを吸引し、2mL/ウェルのヴェルセン(Versene)を添加し、細胞が丸みを帯びて接着が緩くなるが、離れてはいない状態になるまでその培養物を37℃のインキュベーターに戻す。これには3~7分が必要とされる。
5. ヴェルセン(Versene)を穏やかに吸引し、mTeSR1を添加する。1mlのmTeSR1を添加し、1,000uLのマイクロピペットにより前記細胞の上でmTeSR1を穏やかに流動させることでそれらの細胞を剥がす。
6. 剥がされた細胞を回収し、該細胞を単一細胞懸濁液へと穏やかにすりつぶし(triturate)て、そして血球計算板により定量し、そして細胞密度をml当たり100万細胞に調節する。
7. 1mlの細胞懸濁液を1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、卓上遠心機で1100RPMで5分間遠心分離する。
8. 工程2の100μlのヒト幹細胞ヌクレオフェクター溶液中に細胞を再懸濁する。9. 1mlのピペットチップを使用して細胞をヌクレオフェクターキュベットに移す。前記キュベット中の細胞懸濁液に、1μgのプラスミドトランスポゾナーゼおよび5ugのPB Cas9プラスミドを添加する。穏やかに回旋して細胞とDNAを混合する。
10. 前記キュベットをヌクレオフェクターに入れる。プログラムB-016が選択された。ボタンXを押して細胞をヌクレオフェクトする。
11. ヌクレオフェクション後に、ROCK阻害剤を有する500ulのmTeSR1培地を前記キュベット中に添加する。
12. 提供されたパスツールプラスチックピペットを使用して、前記キュベットからヌクレオフェクトされた細胞を吸引する。そしてROCK阻害剤を含むmTeSR1培地の6ウェルプレートのマトリゲルコートウェルに細胞を滴下して移す。それらの細胞を37℃で一晩培養する。
13. 翌日および形質移入から72時間後に、培地をmTesr1に変える。1ug/mlの終濃度でピューロマイシンを添加する。そして株は7日以内に樹立される。
2. RNAの調製
1. gRNAコード配列の上流にT7プロモーターを有するDNA鋳型を調製する。
2. メガクリア・ピューリフィケーションを使用して前記DNAを精製し、濃度を標準化(normalize)する。
3. 様々なgRNA作製のためのオーダーメイド(custom)のNTP混合物を調製する。
1. gRNAコード配列の上流にT7プロモーターを有するDNA鋳型を調製する。
2. メガクリア・ピューリフィケーションを使用して前記DNAを精製し、濃度を標準化(normalize)する。
3. 様々なgRNA作製のためのオーダーメイド(custom)のNTP混合物を調製する。
4. インビトロ転写ミックスを室温で調製する。
5. 37℃(サーモサイクラー)で4時間(3~6時間でok)インキュベートする。6. 各試料に2μlのTurbo DNAse(Ambion社のMEGAscriptキット)を添加する。穏やかに混合し、37℃で15分間インキュベートする。
7. Ambion社のメガクリアを製造業者の指示に従って使用して、DNAse処理反応産物を精製する。
8. メガクリアを使用してRNAを精製する(精製したRNAは、-80℃で数ヶ月保存することができる)。
9. 宿主細胞のToll2免疫反応を回避するために、ホスフェート基を除去する。
7. Ambion社のメガクリアを製造業者の指示に従って使用して、DNAse処理反応産物を精製する。
8. メガクリアを使用してRNAを精製する(精製したRNAは、-80℃で数ヶ月保存することができる)。
9. 宿主細胞のToll2免疫反応を回避するために、ホスフェート基を除去する。
3. RNA形質移入
1. 抗生物質を使用せずに48ウェル当たり10~20Kの細胞を播種する。形質移入用に、細胞は30~50%コンフルエントであるべきである。
2. 形質移入の少なくとも2時間前に、前記細胞培地をB18R(200ng/ml)、DOX(1ug/ml)、ピューロマイシン(2ug/ml)を含むものに変更する。3. gRNA(0.5ug~2ug)、ドナーDNA(0.5ug~2ug)およびRNAiMaxを含む形質移入試薬を調製し、その混合物を室温で15分間インキュベートし、そして前記細胞に移入する。
1. 抗生物質を使用せずに48ウェル当たり10~20Kの細胞を播種する。形質移入用に、細胞は30~50%コンフルエントであるべきである。
2. 形質移入の少なくとも2時間前に、前記細胞培地をB18R(200ng/ml)、DOX(1ug/ml)、ピューロマイシン(2ug/ml)を含むものに変更する。3. gRNA(0.5ug~2ug)、ドナーDNA(0.5ug~2ug)およびRNAiMaxを含む形質移入試薬を調製し、その混合物を室温で15分間インキュベートし、そして前記細胞に移入する。
4. 単一ヒトiPS細胞播種および単一クローンピックアップ
1. dox誘導から4日後およびdox除去から1日後に培地を吸引し、DPBSで穏やかに洗浄する。2mL/ウェルのヴェルセン(Versene)を添加し、細胞が丸みを帯びて接着が緩くなるが、離れてはいない状態になるまでその培養物を37℃のインキュベーターに戻す。これには3~7分が必要である。
2. ヴェルセン(Versene)を穏やかに吸引し、mTeSR1を添加する。1mlのmTeSR1を添加し、前記細胞の上で1,000uLのマイクロピペットによりmTeSR1を穏やかに流動させることでそれらの細胞を剥がす。
3. 剥がされた細胞を回収し、それらの細胞を単一細胞懸濁液へと穏やかにすりつぶし、血球計算板により定量し、そして細胞密度をml当たり100Kの細胞となるよう調節する。
4. mTeSR1およびROCK阻害剤を含むマトリゲルコート10cmディッシュに、前記細胞を、10cmディッシュ当たり50K、100K、および400Kの細胞密度で播種する。
1. dox誘導から4日後およびdox除去から1日後に培地を吸引し、DPBSで穏やかに洗浄する。2mL/ウェルのヴェルセン(Versene)を添加し、細胞が丸みを帯びて接着が緩くなるが、離れてはいない状態になるまでその培養物を37℃のインキュベーターに戻す。これには3~7分が必要である。
2. ヴェルセン(Versene)を穏やかに吸引し、mTeSR1を添加する。1mlのmTeSR1を添加し、前記細胞の上で1,000uLのマイクロピペットによりmTeSR1を穏やかに流動させることでそれらの細胞を剥がす。
3. 剥がされた細胞を回収し、それらの細胞を単一細胞懸濁液へと穏やかにすりつぶし、血球計算板により定量し、そして細胞密度をml当たり100Kの細胞となるよう調節する。
4. mTeSR1およびROCK阻害剤を含むマトリゲルコート10cmディッシュに、前記細胞を、10cmディッシュ当たり50K、100K、および400Kの細胞密度で播種する。
5. 単一細胞形成クローンのスクリーニング
1. 10cmディッシュで12日間培養してクローンが肉眼で特定するのに十分に大きくなった後に、大腸マーカーでクローンを標識する。クローンが大きくなりすぎて相互に接着しないようにすること。
2. 培養フードに前記10cmディッシュを配置し、フィルターチップ付きのP20ピペットを(10ulに設定して)使用して24ウェルプレートの1つのウェルについて10ulの培地を吸引する。クローンを引っ掻いて細かくすることによりクローンをピックアップし、24ウェルプレートの1つのウェルに移す。クローン毎にフィルターチップを変える。
3. 4~5日後に、24ウェルプレートの1つのウェルの中のクローンが分割するのに十分なほど大きくなる。
4. 培地を吸引し、2mL/ウェルのDPBSで洗浄する。
5. DPBSを吸引し、250ul/ウェルのディスパーゼ(0.1U/mL)と置き換え、前記細胞をディスパーゼ中において37℃で7分間インキュベートする。
6. ディスパーゼを2mlのDPBSで置き換える。
7. 250ulのmTeSR1を添加する。セルスクレーパーを使用して前記細胞を剥がし、前記細胞を回収する。
8. マトリゲルコート24ウェルプレートのウェルに、125ulの細胞懸濁液を移す。
9. ゲノムDNA抽出用に、125ulの細胞懸濁液を1.5mlのエッペンドルフチューブに移す。
1. 10cmディッシュで12日間培養してクローンが肉眼で特定するのに十分に大きくなった後に、大腸マーカーでクローンを標識する。クローンが大きくなりすぎて相互に接着しないようにすること。
2. 培養フードに前記10cmディッシュを配置し、フィルターチップ付きのP20ピペットを(10ulに設定して)使用して24ウェルプレートの1つのウェルについて10ulの培地を吸引する。クローンを引っ掻いて細かくすることによりクローンをピックアップし、24ウェルプレートの1つのウェルに移す。クローン毎にフィルターチップを変える。
3. 4~5日後に、24ウェルプレートの1つのウェルの中のクローンが分割するのに十分なほど大きくなる。
4. 培地を吸引し、2mL/ウェルのDPBSで洗浄する。
5. DPBSを吸引し、250ul/ウェルのディスパーゼ(0.1U/mL)と置き換え、前記細胞をディスパーゼ中において37℃で7分間インキュベートする。
6. ディスパーゼを2mlのDPBSで置き換える。
7. 250ulのmTeSR1を添加する。セルスクレーパーを使用して前記細胞を剥がし、前記細胞を回収する。
8. マトリゲルコート24ウェルプレートのウェルに、125ulの細胞懸濁液を移す。
9. ゲノムDNA抽出用に、125ulの細胞懸濁液を1.5mlのエッペンドルフチューブに移す。
6. クローンのスクリーニング
1. 工程7.7のチューブを遠心分離する。
2. 培地を吸引し、ウェル当たり250ulの溶解バッファー(10mMのトリスpH7.5(または8.0)、10mMのEDTA、10mM)を添加する。
3.NaCl+10%のSDS+40ug/mLのプロテイナーゼK(前記バッファーを使用する前に新しく添加)。
4. 一晩55でインキュベートする。
5. 250ulのイソプロパノールを添加してDNAを沈殿させる。
6. 高速で30分間遠心分離する。70%のエタノールで洗浄する。
7. エタノールを穏やかに除去する。5分間風乾する。
8. 100~200ulのdH2OでgDNAを再懸濁する。
9. 特定のプライマーを用いる標的ゲノム領域のPCR増幅。
10. 各プライマーを用いるPCR産物のサンガーシークエンシング。
11. サンガー配列データの分析および標的クローンの増殖。
1. 工程7.7のチューブを遠心分離する。
2. 培地を吸引し、ウェル当たり250ulの溶解バッファー(10mMのトリスpH7.5(または8.0)、10mMのEDTA、10mM)を添加する。
3.NaCl+10%のSDS+40ug/mLのプロテイナーゼK(前記バッファーを使用する前に新しく添加)。
4. 一晩55でインキュベートする。
5. 250ulのイソプロパノールを添加してDNAを沈殿させる。
6. 高速で30分間遠心分離する。70%のエタノールで洗浄する。
7. エタノールを穏やかに除去する。5分間風乾する。
8. 100~200ulのdH2OでgDNAを再懸濁する。
9. 特定のプライマーを用いる標的ゲノム領域のPCR増幅。
10. 各プライマーを用いるPCR産物のサンガーシークエンシング。
11. サンガー配列データの分析および標的クローンの増殖。
7. Piggybacベクターの除去
1. 工程2.1~2.9を反復する。
2. 1mlのピペットチップを使用して細胞をヌクレオフェクターキュベットに移す。前記キュベット中の細胞懸濁液に2μgのトランスポゾナーゼのプラスミドを添加する。穏やかに回旋して細胞とDNAを混合する。
3. 工程2.10~2.11を反復する。
4. 提供されたパスツールプラスチックピペットを使用して前記キュベットからヌクレオフェクトされた細胞を吸引する。そしてmTeSR1培地およびROCK阻害剤を含む10cmディッシュのマトリゲルコートウェルに細胞を滴下して移す。該細胞を37℃で一晩培養する。
5. 翌日、培地をmTesr1に変え、後続の4日間培地を毎日交換する。
6. クローンが充分に大きくなった後で20~50クローンをピックアップし、24ウェルに播種する。
7. PB Cas9 PiggyBacベクタープライマーおよび増殖陰性クローンを用いて、それらのクローンの遺伝子型を判定する。
1. 工程2.1~2.9を反復する。
2. 1mlのピペットチップを使用して細胞をヌクレオフェクターキュベットに移す。前記キュベット中の細胞懸濁液に2μgのトランスポゾナーゼのプラスミドを添加する。穏やかに回旋して細胞とDNAを混合する。
3. 工程2.10~2.11を反復する。
4. 提供されたパスツールプラスチックピペットを使用して前記キュベットからヌクレオフェクトされた細胞を吸引する。そしてmTeSR1培地およびROCK阻害剤を含む10cmディッシュのマトリゲルコートウェルに細胞を滴下して移す。該細胞を37℃で一晩培養する。
5. 翌日、培地をmTesr1に変え、後続の4日間培地を毎日交換する。
6. クローンが充分に大きくなった後で20~50クローンをピックアップし、24ウェルに播種する。
7. PB Cas9 PiggyBacベクタープライマーおよび増殖陰性クローンを用いて、それらのクローンの遺伝子型を判定する。
参考文献
参考文献は、本明細書を通じて以下の番号によって指定され、あたかも本明細書において完全に説明されたかのように本明細書に取り込まれる。後続の参考文献の各々は、その全体がここに参照により取り込まれる。
1. Carroll,D. (2011) Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics, 188, 773-82.
2. Wood,A.J., Lo,T.-W., Zeitler,B., Pickle,C.S., Ralston,E.J., Lee,A.H., Amora,R., Miller,J.C., Leung,E., Meng,X., et al. (2011) Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science (New York, N.Y.), 333, 307.
3. Perez-Pinera,P., Ousterout,D.G. and Gersbach,C.A. (2012) Advances in targeted genome editing. Current opinion in chemical biology, 16, 268-77.
4. Symington,L.S. and Gautier,J. (2011) Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics, 45, 247-71.
参考文献は、本明細書を通じて以下の番号によって指定され、あたかも本明細書において完全に説明されたかのように本明細書に取り込まれる。後続の参考文献の各々は、その全体がここに参照により取り込まれる。
1. Carroll,D. (2011) Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics, 188, 773-82.
2. Wood,A.J., Lo,T.-W., Zeitler,B., Pickle,C.S., Ralston,E.J., Lee,A.H., Amora,R., Miller,J.C., Leung,E., Meng,X., et al. (2011) Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science (New York, N.Y.), 333, 307.
3. Perez-Pinera,P., Ousterout,D.G. and Gersbach,C.A. (2012) Advances in targeted genome editing. Current opinion in chemical biology, 16, 268-77.
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6. Boch,J., Scholze,H., Schornack,S., Landgraf,A., Hahn,S., Kay,S., Lahaye,T., Nickstadt,A. and Bonas,U. (2009) Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science (New York, N.Y.), 326, 1509-12.
7. Cell,P., Replacement,K.S., Talens,A., Type,A., Collection,C, Ccl-,A. and Quickextract,E. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.
8. Mussolino,C., Morbitzer,R., Lutge,F., Dannemann,N., Lahaye,T. and Cathomen,T. (2011) A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity. Nucleic acids research, 39, 9283-93.
6. Boch,J., Scholze,H., Schornack,S., Landgraf,A., Hahn,S., Kay,S., Lahaye,T., Nickstadt,A. and Bonas,U. (2009) Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science (New York, N.Y.), 326, 1509-12.
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10. Hockemeyer,D., Wang,H., Kiani,S., Lai,C.S., Gao,Q., Cassady,J.P., Cost,G.J., Zhang,L., Santiago,Y., Miller, J. C., et al. (2011) Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology, 29, 731-4.
11. Bedell,V.M., Wang,Y., Campbell,J.M., Poshusta,T.L., Starker,C.G., Krug Ii,R.G., Tan,W., Penheiter,S.G., Ma,A.C., Leung,A.Y.H., et al. (2012) In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature, 490, 114-118.
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本発明の実施形態は以下を含む。
<1>
反復配列を100bp以上欠くTALENを細胞に導入することを含み、前記TALENが標的DNAを切断し、前記細胞が非相同末端結合を起こして前記細胞内で改変DNAを産生する、細胞内で標的DNAを改変する方法。
<2>
前記TALENが反復配列を90bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<3>
前記TALENが反復配列を80bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<4>
前記TALENが反復配列を70bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<5>
前記TALENが反復配列を60bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<6>
前記TALENが反復配列を50bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<7>
前記TALENが反復配列を40bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<8>
前記TALENが反復配列を30bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<9>
前記TALENが反復配列を20bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<10>
前記TALENが反復配列を19bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<11>
前記TALENが反復配列を18bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<12>
前記TALENが反復配列を17bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<13>
前記TALENが反復配列を16bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<14>
前記TALENが反復配列を15bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<15>
前記TALENが反復配列を14bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<16>
前記TALENが反復配列を13bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<17>
前記TALENが反復配列を12bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<18>
前記TALENが反復配列を11bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<19>
前記TALENが反復配列を10bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<20>
前記細胞が真核細胞である、<1>に記載の方法。
<21>
前記細胞が酵母細胞、植物細胞または動物細胞である、<1>に記載の方法。
<22>
前記細胞が体細胞である、<1>に記載の方法。
<23>
前記細胞が幹細胞である、<1>に記載の方法。
<24>
前記細胞がヒト幹細胞である、<1>に記載の方法。
<25>
前記TALENをコードする第1外来性核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<1>に記載の方法。
<26>
前記TALENをコードする第1外来性核酸を含むウイルスを前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<1>に記載の方法。
<27>
CTAACCCCTGAACAGGTAGTCGCTATAGCTTCAAATATCGGGGGCAAGCAAGCACTTGAGACCGTTCAACGACTCCTGCCAGTGCTCTGCCAAGCCCATGGATTGACTCCGGAGCAAGTCGTCGCGATCGCGAGCAACGGCGGGGGGAAGCAGGCGCTGGAAACTGTTCAGAGACTGCTGCCTGTACTTTGTCAGGCGCATGGTCTCACCCCCGAACAGGTTGTCGCAATAGCAAGTAATATAGGCGGTAAGCAAGCCCTAGAGACTGTGCAACGCCTGCTCCCCGTGCTGTGTCAGGCTCACGGTCTGACACCTGAACAAGTTGTCGCGATAGCCAGTCACGACGGGGGAAAACAAGCTCTAGAAACGGTTCAAAGGTTGTTGCCCGTTCTGTGCCAAGCACATGGGTTAACACCCGAACAAGTAGTAGCGATAGCGTCAAATAACGGGGGTAAACAGGCTTTGGAGACGGTACAGCGGTTATTGCCGGTCCTCTGCCAGGCCCACGGACTTACGCCAGAACAGGTGGTTGCAATTGCCTCCAACATCGGCGGGAAACAAGCGTTGGAAACTGTGCAGAGACTCCTTCCTGTTTTGTGTCAAGCCCACGGCTTGACGCCTGAGCAGGTTGTGGCCATCGCTAGCCACGACGGAGGGAAGCAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGACTTCTCCCAGTTTTGTGCCAAGCTCACGGGCTAACCCCCGAGCAAGTAGTTGCCATAGCAAGCAACGGAGGAGGAAAACAGGCATTAGAAACAGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTACTCTGTCAGGCACACGGTCTAACTCCGGAACAGGTCGTAGCCATTGCTTCCCATGATGGCGGCAAACAGGCGCTAGAGACAGTCCAGAGGCTCTTGCCTGTGTTATGCCAGGCACATGGCCTCACCCCGGAGCAGGTCGTTGCCATCGCCAGTAATATCGGCGGAAAGCAAGCTCTCGAAACAGTACAACGGCTGTTGCCAGTCCTATGTCAAGCTCATGGACTGACGCCCGAGCAGGTAGTGGCAATCGCATCTCACGATGGAGGTAAACAAGCACTCGAGACTGTCCAAAGATTGTTACCCGTACTATGCCAAGCGCATGGTTTAACCCCAGAGCAAGTTGTGGCTATTGCATCTAACGGCGGTGGCAAACAAGCCTTGGAGACAGTGCAACGATTACTGCCTGTCTTATGTCAGGCCCATGGCCTTACTCCTGAGCAAGTCGTAGCTATCGCCAGCAACATAGGTGGGAAACAGGCCCTGGAAACCGTACAACGTCTCCTCCCAGTACTTTGTCAAGCACACGGGTTGACACCGGAACAAGTGGTGGCGATTGCGTCCAACGGCGGAGGCAAGCAGGCACTGGAGACCGTCCAACGGCTTCTTCCGGTTCTTTGCCAGGCTCATGGGCTCACGCCAGAGCAGGTGGTAGCAATAGCGTCGAACATCGGTGGTAAGCAAGCGCTTGAAACGGTCCAGCGTCTTCTGCCGGTGTTGTGCCAGGCGCACGGACTCACACCAGAACAAGTGGTTGCTATTGCTAGTAACAACGGTGGAAAGCAGGCCCTCGAGACGGTGCAGAGGTTACTTCCCGTCCTCTGTCAAGCGCACGGCCTCACTCCAGAGCAAGTGGTTGCGATCGCTTCAAACAATGGTGGAAGACCTGCCCTGGAAのTALE配列または該TALE配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有する前記TALENをコードする第1外来性核酸を、前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<1>に記載の方法。
<28>
CTAACCCCTGAACAGGTAGTCGCTATAGCTTCAAATATCGGGGGCAAGCAAGCACTTGAGACCGTTCAACGACTCCTGCCAGTGCTCTGCCAAGCCCATGGATTGACTCCGGAGCAAGTCGTCGCGATCGCGAGCAACGGCGGGGGGAAGCAGGCGCTGGAAACTGTTCAGAGACTGCTGCCTGTACTTTGTCAGGCGCATGGTCTCACCCCCGAACAGGTTGTCGCAATAGCAAGTAATATAGGCGGTAAGCAAGCCCTAGAGACTGTGCAACGCCTGCTCCCCGTGCTGTGTCAGGCTCACGGTCTGACACCTGAACAAGTTGTCGCGATAGCCAGTCACGACGGGGGAAAACAAGCTCTAGAAACGGTTCAAAGGTTGTTGCCCGTTCTGTGCCAAGCACATGGGTTAACACCCGAACAAGTAGTAGCGATAGCGTCAAATAACGGGGGTAAACAGGCTTTGGAGACGGTACAGCGGTTATTGCCGGTCCTCTGCCAGGCCCACGGACTTACGCCAGAACAGGTGGTTGCAATTGCCTCCAACATCGGCGGGAAACAAGCGTTGGAAACTGTGCAGAGACTCCTTCCTGTTTTGTGTCAAGCCCACGGCTTGACGCCTGAGCAGGTTGTGGCCATCGCTAGCCACGACGGAGGGAAGCAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGACTTCTCCCAGTTTTGTGCCAAGCTCACGGGCTAACCCCCGAGCAAGTAGTTGCCATAGCAAGCAACGGAGGAGGAAAACAGGCATTAGAAACAGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTACTCTGTCAGGCACACGGTCTAACTCCGGAACAGGTCGTAGCCATTGCTTCCCATGATGGCGGCAAACAGGCGCTAGAGACAGTCCAGAGGCTCTTGCCTGTGTTATGCCAGGCACATGGCCTCACCCCGGAGCAGGTCGTTGCCATCGCCAGTAATATCGGCGGAAAGCAAGCTCTCGAAACAGTACAACGGCTGTTGCCAGTCCTATGTCAAGCTCATGGACTGACGCCCGAGCAGGTAGTGGCAATCGCATCTCACGATGGAGGTAAACAAGCACTCGAGACTGTCCAAAGATTGTTACCCGTACTATGCCAAGCGCATGGTTTAACCCCAGAGCAAGTTGTGGCTATTGCATCTAACGGCGGTGGCAAACAAGCCTTGGAGACAGTGCAACGATTACTGCCTGTCTTATGTCAGGCCCATGGCCTTACTCCTGAGCAAGTCGTAGCTATCGCCAGCAACATAGGTGGGAAACAGGCCCTGGAAACCGTACAACGTCTCCTCCCAGTACTTTGTCAAGCACACGGGTTGACACCGGAACAAGTGGTGGCGATTGCGTCCAACGGCGGAGGCAAGCAGGCACTGGAGACCGTCCAACGGCTTCTTCCGGTTCTTTGCCAGGCTCATGGGCTCACGCCAGAGCAGGTGGTAGCAATAGCGTCGAACATCGGTGGTAAGCAAGCGCTTGAAACGGTCCAGCGTCTTCTGCCGGTGTTGTGCCAGGCGCACGGACTCACACCAGAACAAGTGGTTGCTATTGCTAGTAACAACGGTGGAAAGCAGGCCCTCGAGACGGTGCAGAGGTTACTTCCCGTCCTCTGTCAAGCGCACGGCCTCACTCCAGAGCAAGTGGTTGCGATCGCTTCAAACAATGGTGGAAGACCTGCCCTGGAAのTALE配列または該TALE配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有する前記TALENをコードする第1外来性核酸を含むウイルスを、前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<1>に記載の方法。
<29>
細胞内で反復配列を100bp以上欠くTALENとドナー核酸配列とを組み合わせることを含み、前記TALENが標的DNAを切断し、前記ドナー核酸配列が前記細胞内で前記DNAに挿入される、細胞内で標的DNAを改変する方法。
<30>
前記細胞が非相同末端結合を起こして前記細胞内で改変DNAを産生する、<29>に記載の方法。
<31>
前記細胞が相同組換えを起こして前記細胞内で改変DNAを産生する、<29>に記載の方法。
<32>
前記TALENが反復配列を90bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<33>
前記TALENが反復配列を80bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<34>
前記TALENが反復配列を70bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<35>
前記TALENが反復配列を60bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<36>
前記TALENが反復配列を50bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<37>
前記TALENが反復配列を40bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<38>
前記TALENが反復配列を30bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<39>
前記TALENが反復配列を20bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<40>
前記TALENが反復配列を19bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<41>
前記TALENが反復配列を18bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<42>
前記TALENが反復配列を17bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<43>
前記TALENが反復配列を16bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<44>
前記TALENが反復配列を15bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<45>
前記TALENが反復配列を14bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<46>
前記TALENが反復配列を13bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<47>
前記TALENが反復配列を12bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<48>
前記TALENが反復配列を11bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<49>
前記TALENが反復配列を10bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<50>
前記細胞が真核細胞である、<29>に記載の方法。
<51>
前記細胞が酵母細胞、植物細胞または動物細胞である、<29>に記載の方法。
<52>
前記細胞が体細胞である、<29>に記載の方法。
<53>
前記細胞が幹細胞である、<29>に記載の方法。
<54>
前記細胞がヒト幹細胞である、<29>に記載の方法。
<55>
前記TALENをコードする第1外来性核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<29>に記載の方法。
<56>
前記TALENをコードする第1外来性核酸を含むウイルスを前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<29>に記載の方法。
<57>
CTAACCCCTGAACAGGTAGTCGCTATAGCTTCAAATATCGGGGGCAAGCAAGCACTTGAGACCGTTCAACGACTCCTGCCAGTGCTCTGCCAAGCCCATGGATTGACTCCGGAGCAAGTCGTCGCGATCGCGAGCAACGGCGGGGGGAAGCAGGCGCTGGAAACTGTTCAGAGACTGCTGCCTGTACTTTGTCAGGCGCATGGTCTCACCCCCGAACAGGTTGTCGCAATAGCAAGTAATATAGGCGGTAAGCAAGCCCTAGAGACTGTGCAACGCCTGCTCCCCGTGCTGTGTCAGGCTCACGGTCTGACACCTGAACAAGTTGTCGCGATAGCCAGTCACGACGGGGGAAAACAAGCTCTAGAAACGGTTCAAAGGTTGTTGCCCGTTCTGTGCCAAGCACATGGGTTAACACCCGAACAAGTAGTAGCGATAGCGTCAAATAACGGGGGTAAACAGGCTTTGGAGACGGTACAGCGGTTATTGCCGGTCCTCTGCCAGGCCCACGGACTTACGCCAGAACAGGTGGTTGCAATTGCCTCCAACATCGGCGGGAAACAAGCGTTGGAAACTGTGCAGAGACTCCTTCCTGTTTTGTGTCAAGCCCACGGCTTGACGCCTGAGCAGGTTGTGGCCATCGCTAGCCACGACGGAGGGAAGCAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGACTTCTCCCAGTTTTGTGCCAAGCTCACGGGCTAACCCCCGAGCAAGTAGTTGCCATAGCAAGCAACGGAGGAGGAAAACAGGCATTAGAAACAGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTACTCTGTCAGGCACACGGTCTAACTCCGGAACAGGTCGTAGCCATTGCTTCCCATGATGGCGGCAAACAGGCGCTAGAGACAGTCCAGAGGCTCTTGCCTGTGTTATGCCAGGCACATGGCCTCACCCCGGAGCAGGTCGTTGCCATCGCCAGTAATATCGGCGGAAAGCAAGCTCTCGAAACAGTACAACGGCTGTTGCCAGTCCTATGTCAAGCTCATGGACTGACGCCCGAGCAGGTAGTGGCAATCGCATCTCACGATGGAGGTAAACAAGCACTCGAGACTGTCCAAAGATTGTTACCCGTACTATGCCAAGCGCATGGTTTAACCCCAGAGCAAGTTGTGGCTATTGCATCTAACGGCGGTGGCAAACAAGCCTTGGAGACAGTGCAACGATTACTGCCTGTCTTATGTCAGGCCCATGGCCTTACTCCTGAGCAAGTCGTAGCTATCGCCAGCAACATAGGTGGGAAACAGGCCCTGGAAACCGTACAACGTCTCCTCCCAGTACTTTGTCAAGCACACGGGTTGACACCGGAACAAGTGGTGGCGATTGCGTCCAACGGCGGAGGCAAGCAGGCACTGGAGACCGTCCAACGGCTTCTTCCGGTTCTTTGCCAGGCTCATGGGCTCACGCCAGAGCAGGTGGTAGCAATAGCGTCGAACATCGGTGGTAAGCAAGCGCTTGAAACGGTCCAGCGTCTTCTGCCGGTGTTGTGCCAGGCGCACGGACTCACACCAGAACAAGTGGTTGCTATTGCTAGTAACAACGGTGGAAAGCAGGCCCTCGAGACGGTGCAGAGGTTACTTCCCGTCCTCTGTCAAGCGCACGGCCTCACTCCAGAGCAAGTGGTTGCGATCGCTTCAAACAATGGTGGAAGACCTGCCCTGGAAのTALE配列または該TALE配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有する前記TALENをコードする第1外来性核酸を、前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<29>に記載の方法。
<58>
CTAACCCCTGAACAGGTAGTCGCTATAGCTTCAAATATCGGGGGCAAGCAAGCACTTGAGACCGTTCAACGACTCCTGCCAGTGCTCTGCCAAGCCCATGGATTGACTCCGGAGCAAGTCGTCGCGATCGCGAGCAACGGCGGGGGGAAGCAGGCGCTGGAAACTGTTCAGAGACTGCTGCCTGTACTTTGTCAGGCGCATGGTCTCACCCCCGAACAGGTTGTCGCAATAGCAAGTAATATAGGCGGTAAGCAAGCCCTAGAGACTGTGCAACGCCTGCTCCCCGTGCTGTGTCAGGCTCACGGTCTGACACCTGAACAAGTTGTCGCGATAGCCAGTCACGACGGGGGAAAACAAGCTCTAGAAACGGTTCAAAGGTTGTTGCCCGTTCTGTGCCAAGCACATGGGTTAACACCCGAACAAGTAGTAGCGATAGCGTCAAATAACGGGGGTAAACAGGCTTTGGAGACGGTACAGCGGTTATTGCCGGTCCTCTGCCAGGCCCACGGACTTACGCCAGAACAGGTGGTTGCAATTGCCTCCAACATCGGCGGGAAACAAGCGTTGGAAACTGTGCAGAGACTCCTTCCTGTTTTGTGTCAAGCCCACGGCTTGACGCCTGAGCAGGTTGTGGCCATCGCTAGCCACGACGGAGGGAAGCAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGACTTCTCCCAGTTTTGTGCCAAGCTCACGGGCTAACCCCCGAGCAAGTAGTTGCCATAGCAAGCAACGGAGGAGGAAAACAGGCATTAGAAACAGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTACTCTGTCAGGCACACGGTCTAACTCCGGAACAGGTCGTAGCCATTGCTTCCCATGATGGCGGCAAACAGGCGCTAGAGACAGTCCAGAGGCTCTTGCCTGTGTTATGCCAGGCACATGGCCTCACCCCGGAGCAGGTCGTTGCCATCGCCAGTAATATCGGCGGAAAGCAAGCTCTCGAAACAGTACAACGGCTGTTGCCAGTCCTATGTCAAGCTCATGGACTGACGCCCGAGCAGGTAGTGGCAATCGCATCTCACGATGGAGGTAAACAAGCACTCGAGACTGTCCAAAGATTGTTACCCGTACTATGCCAAGCGCATGGTTTAACCCCAGAGCAAGTTGTGGCTATTGCATCTAACGGCGGTGGCAAACAAGCCTTGGAGACAGTGCAACGATTACTGCCTGTCTTATGTCAGGCCCATGGCCTTACTCCTGAGCAAGTCGTAGCTATCGCCAGCAACATAGGTGGGAAACAGGCCCTGGAAACCGTACAACGTCTCCTCCCAGTACTTTGTCAAGCACACGGGTTGACACCGGAACAAGTGGTGGCGATTGCGTCCAACGGCGGAGGCAAGCAGGCACTGGAGACCGTCCAACGGCTTCTTCCGGTTCTTTGCCAGGCTCATGGGCTCACGCCAGAGCAGGTGGTAGCAATAGCGTCGAACATCGGTGGTAAGCAAGCGCTTGAAACGGTCCAGCGTCTTCTGCCGGTGTTGTGCCAGGCGCACGGACTCACACCAGAACAAGTGGTTGCTATTGCTAGTAACAACGGTGGAAAGCAGGCCCTCGAGACGGTGCAGAGGTTACTTCCCGTCCTCTGTCAAGCGCACGGCCTCACTCCAGAGCAAGTGGTTGCGATCGCTTCAAACAATGGTGGAAGACCTGCCCTGGAAのTALE配列または該TALE配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有する前記TALENをコードする第1外来性核酸を含むウイルスを、前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<29>に記載の方法。
<59>
反復配列を100bp以上欠くTALENをコードする核酸配列を含むウイルス。
<60>
前記TALENが反復配列を90bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<61>
前記TALENが反復配列を80bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<62>
前記TALENが反復配列を70bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<63>
前記TALENが反復配列を60bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<64>
前記TALENが反復配列を50bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<65>
前記TALENが反復配列を40bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<66>
前記TALENが反復配列を30bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<67>
前記TALENが反復配列を20bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<68>
前記TALENが反復配列を19bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<69>
前記TALENが反復配列を18bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<70>
前記TALENが反復配列を17bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<71>
前記TALENが反復配列を16bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<72>
前記TALENが反復配列を15bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<73>
前記TALENが反復配列を14bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<74>
前記TALENが反復配列を13bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<75>
前記TALENが反復配列を12bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<76>
前記TALENが反復配列を11bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<77>
前記TALENが反復配列を10bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<78>
レンチウイルスである<59>に記載のウイルス。
<79>
反復配列を100bp以上欠くTALENをコードする核酸配列を含む細胞。
<80>
前記TALENが反復配列を90bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<81>
前記TALENが反復配列を80bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<82>
前記TALENが反復配列を70bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<83>
前記TALENが反復配列を60bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<84>
前記TALENが反復配列を50bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<85>
前記TALENが反復配列を40bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<86>
前記TALENが反復配列を30bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<87>
前記TALENが反復配列を20bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<88>
前記TALENが反復配列を19bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<89>
前記TALENが反復配列を18bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<90>
前記TALENが反復配列を17bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<91>
前記TALENが反復配列を16bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<92>
前記TALENが反復配列を15bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<93>
前記TALENが反復配列を14bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<94>
前記TALENが反復配列を13bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<95>
前記TALENが反復配列を12bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<96>
前記TALENが反復配列を11bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<97>
前記TALENが反復配列を10bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<98>
真核細胞である<70>に記載の細胞。
<99>
酵母細胞、植物細胞または動物細胞である<70>に記載の細胞。
<100>
体細胞である<70>に記載の細胞。
<101>
幹細胞である<70>に記載の細胞。
<102>
ヒト幹細胞である<70>に記載の細胞。
<103>
エンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、エクソヌクレアーゼ、反復可変性二残基ドメインをコードする複数の核酸ダイマーブロック、およびエンドヌクレアーゼ切断部位を含むTALE-N/TFバックボーンベクターを組み合わせ、
前記エンドヌクレアーゼを活性化して前記エンドヌクレアーゼ切断部位において前記TALE-N/TFバックボーンベクターを切断することにより第1末端および第2末端を作製し、
前記エクソヌクレアーゼを活性化して前記TALE-N/TFバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックに3’オーバーハングおよび5’オーバーハングを作製して前記TALE-N/TFバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックを所望の順序でアニールし、
前記DNAポリメラーゼおよび前記DNAリガーゼを活性化して前記TALE-N/TFバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックを連結することを含む、TALEを作製する方法。
<104>
標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、を発現する幹細胞内で、前記標的DNAを改変する方法であって、前記方法は、
(a)前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAをコードする第1外来性核酸を、前記幹細胞に導入すること;ここで前記RNAおよび前記酵素は前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、
ドナー核酸配列をコードする第2外来性核酸を前記幹細胞に導入すること、
を含み、
前記RNAおよび前記ドナー核酸配列が発現し、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに共局在し、前記酵素が前記標的DNAを切断し、前記ドナー核酸が前記標的DNAに挿入されて前記幹細胞内で改変DNAを産生する、前記方法。
<105>
前記酵素がRNA誘導型DNA結合タンパク質である、<104>に記載の方法。
<106>
前記酵素がII型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質である、<104>に記載の方法。
<107>
前記酵素がCas9である、<104>に記載の方法。
<108>
前記RNAが約10ヌクレオチドから約500ヌクレオチドの間である、<104>に記載の方法。
<109>
前記RNAが約20ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの間である、<104>に記載の方法。
<110>
前記RNAがガイドRNAである、<104>に記載の方法。
<111>
前記RNAがtracrRNA-crRNA融合体である、<104>に記載の方法。<112>
前記DNAがゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、または外来性DNAである、<104>に記載の方法。
<113>
前記ドナー核酸配列が組換えにより挿入される、<104>に記載の方法。
<114>
前記ドナー核酸配列が相同組換えにより挿入される、<104>に記載の方法。
<115>
前記ドナー核酸配列が非相同末端結合により挿入される、<104>に記載の方法。
<116>
前記RNAおよび前記ドナー核酸配列が1つ以上のプラスミド上に存在する、<104>に記載の方法。
<117>
工程(a)を複数回繰り返して前記細胞内で前記DNAに複数の改変を生じさせることをさらに含む、<104>に記載の方法。
<118>
幹細胞内で改変DNAを作製した後に、前記標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する前記酵素をコードする核酸が、前記幹細胞のゲノムから除去される、<104>に記載の方法。
<119>
前記RNAおよび前記ドナー核酸配列が結合した核酸配列として発現する、<104>に記載の方法。
<120>
標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素をコードする第1外来性核酸を含む、幹細胞。
<121>
前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAをコードする第2外来性核酸をさらに含み、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、<120>に記載の幹細胞。
<122>
ドナー核酸配列をコードする第3外来性核酸をさらに含む、<121>に記載の幹細胞。
<123>
前記酵素の発現を促進するための誘導性プロモーターをさらに含む<120>に記載の幹細胞。
<124>
前記第1外来性核酸が前記細胞のゲノムDNAからトランスポゼースを使用して除去可能である、<120>に記載の幹細胞。
<125>
前記酵素がRNA誘導型DNA結合タンパク質である、<120>に記載の幹細胞。
<126>
前記酵素がII型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質である、<120>に記載の幹細胞。
<127>
前記酵素がCas9である、<120>に記載の幹細胞。
<128>
前記RNAが約10ヌクレオチドから約500ヌクレオチドの間である、<120>に記載の幹細胞。
<129>
前記RNAが約20ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの間である、<120>に記載の幹細胞。
<130>
前記RNAがガイドRNAである、<120>に記載の幹細胞。
<131>
前記RNAがtracrRNA-crRNA融合体である、<120>に記載の幹細胞。
<132>
前記標的DNAがゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、または外来性DNAである、<120>に記載の幹細胞。
<133>
標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素をコードし、且つ前記酵素の発現を促進するための誘導性プロモーターを含む第1外来性核酸、を含む細胞。
<134>
前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAをコードする第2外来性核酸をさらに含み、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、<133>に記載の細胞。
<135>
ドナー核酸配列をコードする第3外来性核酸をさらに含む、<134>に記載の幹細胞。
<136>
標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素をコードする第1外来性核酸を含む細胞であって、前記第1外来性核酸が前記細胞のゲノムDNAからトランスポゼースを使用して除去可能である、前記細胞。
<137>
前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAをコードする第2外来性核酸をさらに含み、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、<136>に記載の細胞。
<138>
ドナー核酸配列をコードする第3外来性核酸をさらに含む、<137>に記載の幹細胞。
<139>
標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素をコードする第1外来性核酸を含む細胞であって、前記第1外来性核酸が前記細胞のゲノムDNAに可逆的に挿入されている、前記細胞。
<140>
前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAをコードする第2外来性核酸をさらに含み、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、<139>に記載の細胞。
<141>
ドナー核酸配列をコードする第3外来性核酸をさらに含む、<140>に記載の幹細胞。
<142>
標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、を発現する細胞内で、前記標的DNAを改変する方法であって、前記方法は、
(a)ドナー核酸配列をコードする第1外来性核酸を前記細胞に導入すること、
前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAを前記細胞の周囲の培地から前記細胞に導入すること;ここで、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、
を含み、
前記ドナー核酸配列が発現し、
前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに共局在し、前記酵素が前記標的DNAを切断し、前記ドナー核酸が前記標的DNAに挿入されて前記細胞内で改変DNAを産生する、前記方法。
<143>
前記RNAが5’キャップ構造を含む、<142>に記載の方法。
<144>
前記RNAがホスフェート基を欠く、<142>に記載の方法。
<145>
前記酵素がRNA誘導型DNA結合タンパク質である、<142>に記載の方法。
<146>
前記酵素がII型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質である、<142>に記載の方法。
<147>
前記酵素がCas9である、<142>に記載の方法。
<148>
前記RNAが約10ヌクレオチドから約500ヌクレオチドの間である、<142>に記載の方法。
<149>
前記RNAが約20ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの間である、<142>に記載の方法。
<150>
前記RNAがガイドRNAである、<142>に記載の方法。
<151>
前記RNAがtracrRNA-crRNA融合体である、<142>に記載の方法。<152>
前記DNAがゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、または外来性DNAである、<142>に記載の方法。
<153>
前記ドナー核酸配列が組換えにより挿入される、<142>に記載の方法。
<154>
前記ドナー核酸配列が相同組換えにより挿入される、<142>に記載の方法。
<155>
前記ドナー核酸配列が非相同末端結合により挿入される、<142>に記載の方法。
<156>
工程(a)を複数回繰り返して前記細胞内で前記DNAに複数の改変を生じさせることをさらに含む、<142>に記載の方法。
<157>
細胞内で改変DNAを作製した後、前記標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する前記酵素をコードする核酸が、前記細胞のゲノムから除去される、<142>に記載の方法。
<158>
前記RNAおよび前記ドナー核酸配列が結合した核酸配列として発現する、<142>に記載の方法。
46. Shrivastav,M., De Haro,L.P. and Nickoloff,J. . a (2008) Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell research, 18, 134-47.
47. Kim,Y.G., Cha,J. and Chandrasegaran,S. (1996) Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93, 1156-60.
48. Mimitou,E.P. and Symington,L.S. (2008) Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature, 455, 770-4.
49. Doyon,Y., Choi,V.M., Xia,D.F., Vo,T.D., Gregory,P.D. and Holmes,M.C. (2010) Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease-mediated gene disruption. Nature methods, 7, 459-60.
本発明の実施形態は以下を含む。
<1>
反復配列を100bp以上欠くTALENを細胞に導入することを含み、前記TALENが標的DNAを切断し、前記細胞が非相同末端結合を起こして前記細胞内で改変DNAを産生する、細胞内で標的DNAを改変する方法。
<2>
前記TALENが反復配列を90bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<3>
前記TALENが反復配列を80bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<4>
前記TALENが反復配列を70bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<5>
前記TALENが反復配列を60bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<6>
前記TALENが反復配列を50bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<7>
前記TALENが反復配列を40bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<8>
前記TALENが反復配列を30bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<9>
前記TALENが反復配列を20bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<10>
前記TALENが反復配列を19bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<11>
前記TALENが反復配列を18bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<12>
前記TALENが反復配列を17bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<13>
前記TALENが反復配列を16bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<14>
前記TALENが反復配列を15bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<15>
前記TALENが反復配列を14bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<16>
前記TALENが反復配列を13bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<17>
前記TALENが反復配列を12bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<18>
前記TALENが反復配列を11bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<19>
前記TALENが反復配列を10bp以上欠く、<1>に記載の方法。
<20>
前記細胞が真核細胞である、<1>に記載の方法。
<21>
前記細胞が酵母細胞、植物細胞または動物細胞である、<1>に記載の方法。
<22>
前記細胞が体細胞である、<1>に記載の方法。
<23>
前記細胞が幹細胞である、<1>に記載の方法。
<24>
前記細胞がヒト幹細胞である、<1>に記載の方法。
<25>
前記TALENをコードする第1外来性核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<1>に記載の方法。
<26>
前記TALENをコードする第1外来性核酸を含むウイルスを前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<1>に記載の方法。
<27>
CTAACCCCTGAACAGGTAGTCGCTATAGCTTCAAATATCGGGGGCAAGCAAGCACTTGAGACCGTTCAACGACTCCTGCCAGTGCTCTGCCAAGCCCATGGATTGACTCCGGAGCAAGTCGTCGCGATCGCGAGCAACGGCGGGGGGAAGCAGGCGCTGGAAACTGTTCAGAGACTGCTGCCTGTACTTTGTCAGGCGCATGGTCTCACCCCCGAACAGGTTGTCGCAATAGCAAGTAATATAGGCGGTAAGCAAGCCCTAGAGACTGTGCAACGCCTGCTCCCCGTGCTGTGTCAGGCTCACGGTCTGACACCTGAACAAGTTGTCGCGATAGCCAGTCACGACGGGGGAAAACAAGCTCTAGAAACGGTTCAAAGGTTGTTGCCCGTTCTGTGCCAAGCACATGGGTTAACACCCGAACAAGTAGTAGCGATAGCGTCAAATAACGGGGGTAAACAGGCTTTGGAGACGGTACAGCGGTTATTGCCGGTCCTCTGCCAGGCCCACGGACTTACGCCAGAACAGGTGGTTGCAATTGCCTCCAACATCGGCGGGAAACAAGCGTTGGAAACTGTGCAGAGACTCCTTCCTGTTTTGTGTCAAGCCCACGGCTTGACGCCTGAGCAGGTTGTGGCCATCGCTAGCCACGACGGAGGGAAGCAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGACTTCTCCCAGTTTTGTGCCAAGCTCACGGGCTAACCCCCGAGCAAGTAGTTGCCATAGCAAGCAACGGAGGAGGAAAACAGGCATTAGAAACAGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTACTCTGTCAGGCACACGGTCTAACTCCGGAACAGGTCGTAGCCATTGCTTCCCATGATGGCGGCAAACAGGCGCTAGAGACAGTCCAGAGGCTCTTGCCTGTGTTATGCCAGGCACATGGCCTCACCCCGGAGCAGGTCGTTGCCATCGCCAGTAATATCGGCGGAAAGCAAGCTCTCGAAACAGTACAACGGCTGTTGCCAGTCCTATGTCAAGCTCATGGACTGACGCCCGAGCAGGTAGTGGCAATCGCATCTCACGATGGAGGTAAACAAGCACTCGAGACTGTCCAAAGATTGTTACCCGTACTATGCCAAGCGCATGGTTTAACCCCAGAGCAAGTTGTGGCTATTGCATCTAACGGCGGTGGCAAACAAGCCTTGGAGACAGTGCAACGATTACTGCCTGTCTTATGTCAGGCCCATGGCCTTACTCCTGAGCAAGTCGTAGCTATCGCCAGCAACATAGGTGGGAAACAGGCCCTGGAAACCGTACAACGTCTCCTCCCAGTACTTTGTCAAGCACACGGGTTGACACCGGAACAAGTGGTGGCGATTGCGTCCAACGGCGGAGGCAAGCAGGCACTGGAGACCGTCCAACGGCTTCTTCCGGTTCTTTGCCAGGCTCATGGGCTCACGCCAGAGCAGGTGGTAGCAATAGCGTCGAACATCGGTGGTAAGCAAGCGCTTGAAACGGTCCAGCGTCTTCTGCCGGTGTTGTGCCAGGCGCACGGACTCACACCAGAACAAGTGGTTGCTATTGCTAGTAACAACGGTGGAAAGCAGGCCCTCGAGACGGTGCAGAGGTTACTTCCCGTCCTCTGTCAAGCGCACGGCCTCACTCCAGAGCAAGTGGTTGCGATCGCTTCAAACAATGGTGGAAGACCTGCCCTGGAAのTALE配列または該TALE配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有する前記TALENをコードする第1外来性核酸を、前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<1>に記載の方法。
<28>
CTAACCCCTGAACAGGTAGTCGCTATAGCTTCAAATATCGGGGGCAAGCAAGCACTTGAGACCGTTCAACGACTCCTGCCAGTGCTCTGCCAAGCCCATGGATTGACTCCGGAGCAAGTCGTCGCGATCGCGAGCAACGGCGGGGGGAAGCAGGCGCTGGAAACTGTTCAGAGACTGCTGCCTGTACTTTGTCAGGCGCATGGTCTCACCCCCGAACAGGTTGTCGCAATAGCAAGTAATATAGGCGGTAAGCAAGCCCTAGAGACTGTGCAACGCCTGCTCCCCGTGCTGTGTCAGGCTCACGGTCTGACACCTGAACAAGTTGTCGCGATAGCCAGTCACGACGGGGGAAAACAAGCTCTAGAAACGGTTCAAAGGTTGTTGCCCGTTCTGTGCCAAGCACATGGGTTAACACCCGAACAAGTAGTAGCGATAGCGTCAAATAACGGGGGTAAACAGGCTTTGGAGACGGTACAGCGGTTATTGCCGGTCCTCTGCCAGGCCCACGGACTTACGCCAGAACAGGTGGTTGCAATTGCCTCCAACATCGGCGGGAAACAAGCGTTGGAAACTGTGCAGAGACTCCTTCCTGTTTTGTGTCAAGCCCACGGCTTGACGCCTGAGCAGGTTGTGGCCATCGCTAGCCACGACGGAGGGAAGCAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGACTTCTCCCAGTTTTGTGCCAAGCTCACGGGCTAACCCCCGAGCAAGTAGTTGCCATAGCAAGCAACGGAGGAGGAAAACAGGCATTAGAAACAGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTACTCTGTCAGGCACACGGTCTAACTCCGGAACAGGTCGTAGCCATTGCTTCCCATGATGGCGGCAAACAGGCGCTAGAGACAGTCCAGAGGCTCTTGCCTGTGTTATGCCAGGCACATGGCCTCACCCCGGAGCAGGTCGTTGCCATCGCCAGTAATATCGGCGGAAAGCAAGCTCTCGAAACAGTACAACGGCTGTTGCCAGTCCTATGTCAAGCTCATGGACTGACGCCCGAGCAGGTAGTGGCAATCGCATCTCACGATGGAGGTAAACAAGCACTCGAGACTGTCCAAAGATTGTTACCCGTACTATGCCAAGCGCATGGTTTAACCCCAGAGCAAGTTGTGGCTATTGCATCTAACGGCGGTGGCAAACAAGCCTTGGAGACAGTGCAACGATTACTGCCTGTCTTATGTCAGGCCCATGGCCTTACTCCTGAGCAAGTCGTAGCTATCGCCAGCAACATAGGTGGGAAACAGGCCCTGGAAACCGTACAACGTCTCCTCCCAGTACTTTGTCAAGCACACGGGTTGACACCGGAACAAGTGGTGGCGATTGCGTCCAACGGCGGAGGCAAGCAGGCACTGGAGACCGTCCAACGGCTTCTTCCGGTTCTTTGCCAGGCTCATGGGCTCACGCCAGAGCAGGTGGTAGCAATAGCGTCGAACATCGGTGGTAAGCAAGCGCTTGAAACGGTCCAGCGTCTTCTGCCGGTGTTGTGCCAGGCGCACGGACTCACACCAGAACAAGTGGTTGCTATTGCTAGTAACAACGGTGGAAAGCAGGCCCTCGAGACGGTGCAGAGGTTACTTCCCGTCCTCTGTCAAGCGCACGGCCTCACTCCAGAGCAAGTGGTTGCGATCGCTTCAAACAATGGTGGAAGACCTGCCCTGGAAのTALE配列または該TALE配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有する前記TALENをコードする第1外来性核酸を含むウイルスを、前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<1>に記載の方法。
<29>
細胞内で反復配列を100bp以上欠くTALENとドナー核酸配列とを組み合わせることを含み、前記TALENが標的DNAを切断し、前記ドナー核酸配列が前記細胞内で前記DNAに挿入される、細胞内で標的DNAを改変する方法。
<30>
前記細胞が非相同末端結合を起こして前記細胞内で改変DNAを産生する、<29>に記載の方法。
<31>
前記細胞が相同組換えを起こして前記細胞内で改変DNAを産生する、<29>に記載の方法。
<32>
前記TALENが反復配列を90bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<33>
前記TALENが反復配列を80bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<34>
前記TALENが反復配列を70bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<35>
前記TALENが反復配列を60bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<36>
前記TALENが反復配列を50bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<37>
前記TALENが反復配列を40bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<38>
前記TALENが反復配列を30bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<39>
前記TALENが反復配列を20bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<40>
前記TALENが反復配列を19bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<41>
前記TALENが反復配列を18bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<42>
前記TALENが反復配列を17bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<43>
前記TALENが反復配列を16bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<44>
前記TALENが反復配列を15bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<45>
前記TALENが反復配列を14bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<46>
前記TALENが反復配列を13bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<47>
前記TALENが反復配列を12bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<48>
前記TALENが反復配列を11bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<49>
前記TALENが反復配列を10bp以上欠く、<29>に記載の方法。
<50>
前記細胞が真核細胞である、<29>に記載の方法。
<51>
前記細胞が酵母細胞、植物細胞または動物細胞である、<29>に記載の方法。
<52>
前記細胞が体細胞である、<29>に記載の方法。
<53>
前記細胞が幹細胞である、<29>に記載の方法。
<54>
前記細胞がヒト幹細胞である、<29>に記載の方法。
<55>
前記TALENをコードする第1外来性核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<29>に記載の方法。
<56>
前記TALENをコードする第1外来性核酸を含むウイルスを前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<29>に記載の方法。
<57>
CTAACCCCTGAACAGGTAGTCGCTATAGCTTCAAATATCGGGGGCAAGCAAGCACTTGAGACCGTTCAACGACTCCTGCCAGTGCTCTGCCAAGCCCATGGATTGACTCCGGAGCAAGTCGTCGCGATCGCGAGCAACGGCGGGGGGAAGCAGGCGCTGGAAACTGTTCAGAGACTGCTGCCTGTACTTTGTCAGGCGCATGGTCTCACCCCCGAACAGGTTGTCGCAATAGCAAGTAATATAGGCGGTAAGCAAGCCCTAGAGACTGTGCAACGCCTGCTCCCCGTGCTGTGTCAGGCTCACGGTCTGACACCTGAACAAGTTGTCGCGATAGCCAGTCACGACGGGGGAAAACAAGCTCTAGAAACGGTTCAAAGGTTGTTGCCCGTTCTGTGCCAAGCACATGGGTTAACACCCGAACAAGTAGTAGCGATAGCGTCAAATAACGGGGGTAAACAGGCTTTGGAGACGGTACAGCGGTTATTGCCGGTCCTCTGCCAGGCCCACGGACTTACGCCAGAACAGGTGGTTGCAATTGCCTCCAACATCGGCGGGAAACAAGCGTTGGAAACTGTGCAGAGACTCCTTCCTGTTTTGTGTCAAGCCCACGGCTTGACGCCTGAGCAGGTTGTGGCCATCGCTAGCCACGACGGAGGGAAGCAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGACTTCTCCCAGTTTTGTGCCAAGCTCACGGGCTAACCCCCGAGCAAGTAGTTGCCATAGCAAGCAACGGAGGAGGAAAACAGGCATTAGAAACAGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTACTCTGTCAGGCACACGGTCTAACTCCGGAACAGGTCGTAGCCATTGCTTCCCATGATGGCGGCAAACAGGCGCTAGAGACAGTCCAGAGGCTCTTGCCTGTGTTATGCCAGGCACATGGCCTCACCCCGGAGCAGGTCGTTGCCATCGCCAGTAATATCGGCGGAAAGCAAGCTCTCGAAACAGTACAACGGCTGTTGCCAGTCCTATGTCAAGCTCATGGACTGACGCCCGAGCAGGTAGTGGCAATCGCATCTCACGATGGAGGTAAACAAGCACTCGAGACTGTCCAAAGATTGTTACCCGTACTATGCCAAGCGCATGGTTTAACCCCAGAGCAAGTTGTGGCTATTGCATCTAACGGCGGTGGCAAACAAGCCTTGGAGACAGTGCAACGATTACTGCCTGTCTTATGTCAGGCCCATGGCCTTACTCCTGAGCAAGTCGTAGCTATCGCCAGCAACATAGGTGGGAAACAGGCCCTGGAAACCGTACAACGTCTCCTCCCAGTACTTTGTCAAGCACACGGGTTGACACCGGAACAAGTGGTGGCGATTGCGTCCAACGGCGGAGGCAAGCAGGCACTGGAGACCGTCCAACGGCTTCTTCCGGTTCTTTGCCAGGCTCATGGGCTCACGCCAGAGCAGGTGGTAGCAATAGCGTCGAACATCGGTGGTAAGCAAGCGCTTGAAACGGTCCAGCGTCTTCTGCCGGTGTTGTGCCAGGCGCACGGACTCACACCAGAACAAGTGGTTGCTATTGCTAGTAACAACGGTGGAAAGCAGGCCCTCGAGACGGTGCAGAGGTTACTTCCCGTCCTCTGTCAAGCGCACGGCCTCACTCCAGAGCAAGTGGTTGCGATCGCTTCAAACAATGGTGGAAGACCTGCCCTGGAAのTALE配列または該TALE配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有する前記TALENをコードする第1外来性核酸を、前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<29>に記載の方法。
<58>
CTAACCCCTGAACAGGTAGTCGCTATAGCTTCAAATATCGGGGGCAAGCAAGCACTTGAGACCGTTCAACGACTCCTGCCAGTGCTCTGCCAAGCCCATGGATTGACTCCGGAGCAAGTCGTCGCGATCGCGAGCAACGGCGGGGGGAAGCAGGCGCTGGAAACTGTTCAGAGACTGCTGCCTGTACTTTGTCAGGCGCATGGTCTCACCCCCGAACAGGTTGTCGCAATAGCAAGTAATATAGGCGGTAAGCAAGCCCTAGAGACTGTGCAACGCCTGCTCCCCGTGCTGTGTCAGGCTCACGGTCTGACACCTGAACAAGTTGTCGCGATAGCCAGTCACGACGGGGGAAAACAAGCTCTAGAAACGGTTCAAAGGTTGTTGCCCGTTCTGTGCCAAGCACATGGGTTAACACCCGAACAAGTAGTAGCGATAGCGTCAAATAACGGGGGTAAACAGGCTTTGGAGACGGTACAGCGGTTATTGCCGGTCCTCTGCCAGGCCCACGGACTTACGCCAGAACAGGTGGTTGCAATTGCCTCCAACATCGGCGGGAAACAAGCGTTGGAAACTGTGCAGAGACTCCTTCCTGTTTTGTGTCAAGCCCACGGCTTGACGCCTGAGCAGGTTGTGGCCATCGCTAGCCACGACGGAGGGAAGCAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGACTTCTCCCAGTTTTGTGCCAAGCTCACGGGCTAACCCCCGAGCAAGTAGTTGCCATAGCAAGCAACGGAGGAGGAAAACAGGCATTAGAAACAGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTACTCTGTCAGGCACACGGTCTAACTCCGGAACAGGTCGTAGCCATTGCTTCCCATGATGGCGGCAAACAGGCGCTAGAGACAGTCCAGAGGCTCTTGCCTGTGTTATGCCAGGCACATGGCCTCACCCCGGAGCAGGTCGTTGCCATCGCCAGTAATATCGGCGGAAAGCAAGCTCTCGAAACAGTACAACGGCTGTTGCCAGTCCTATGTCAAGCTCATGGACTGACGCCCGAGCAGGTAGTGGCAATCGCATCTCACGATGGAGGTAAACAAGCACTCGAGACTGTCCAAAGATTGTTACCCGTACTATGCCAAGCGCATGGTTTAACCCCAGAGCAAGTTGTGGCTATTGCATCTAACGGCGGTGGCAAACAAGCCTTGGAGACAGTGCAACGATTACTGCCTGTCTTATGTCAGGCCCATGGCCTTACTCCTGAGCAAGTCGTAGCTATCGCCAGCAACATAGGTGGGAAACAGGCCCTGGAAACCGTACAACGTCTCCTCCCAGTACTTTGTCAAGCACACGGGTTGACACCGGAACAAGTGGTGGCGATTGCGTCCAACGGCGGAGGCAAGCAGGCACTGGAGACCGTCCAACGGCTTCTTCCGGTTCTTTGCCAGGCTCATGGGCTCACGCCAGAGCAGGTGGTAGCAATAGCGTCGAACATCGGTGGTAAGCAAGCGCTTGAAACGGTCCAGCGTCTTCTGCCGGTGTTGTGCCAGGCGCACGGACTCACACCAGAACAAGTGGTTGCTATTGCTAGTAACAACGGTGGAAAGCAGGCCCTCGAGACGGTGCAGAGGTTACTTCCCGTCCTCTGTCAAGCGCACGGCCTCACTCCAGAGCAAGTGGTTGCGATCGCTTCAAACAATGGTGGAAGACCTGCCCTGGAAのTALE配列または該TALE配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有する前記TALENをコードする第1外来性核酸を含むウイルスを、前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、<29>に記載の方法。
<59>
反復配列を100bp以上欠くTALENをコードする核酸配列を含むウイルス。
<60>
前記TALENが反復配列を90bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<61>
前記TALENが反復配列を80bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<62>
前記TALENが反復配列を70bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<63>
前記TALENが反復配列を60bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<64>
前記TALENが反復配列を50bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<65>
前記TALENが反復配列を40bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<66>
前記TALENが反復配列を30bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<67>
前記TALENが反復配列を20bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<68>
前記TALENが反復配列を19bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<69>
前記TALENが反復配列を18bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<70>
前記TALENが反復配列を17bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<71>
前記TALENが反復配列を16bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<72>
前記TALENが反復配列を15bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<73>
前記TALENが反復配列を14bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<74>
前記TALENが反復配列を13bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<75>
前記TALENが反復配列を12bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<76>
前記TALENが反復配列を11bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<77>
前記TALENが反復配列を10bp以上欠く、<59>に記載のウイルス。
<78>
レンチウイルスである<59>に記載のウイルス。
<79>
反復配列を100bp以上欠くTALENをコードする核酸配列を含む細胞。
<80>
前記TALENが反復配列を90bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<81>
前記TALENが反復配列を80bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<82>
前記TALENが反復配列を70bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<83>
前記TALENが反復配列を60bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<84>
前記TALENが反復配列を50bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<85>
前記TALENが反復配列を40bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<86>
前記TALENが反復配列を30bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<87>
前記TALENが反復配列を20bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<88>
前記TALENが反復配列を19bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<89>
前記TALENが反復配列を18bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<90>
前記TALENが反復配列を17bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<91>
前記TALENが反復配列を16bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<92>
前記TALENが反復配列を15bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<93>
前記TALENが反復配列を14bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<94>
前記TALENが反復配列を13bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<95>
前記TALENが反復配列を12bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<96>
前記TALENが反復配列を11bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<97>
前記TALENが反復配列を10bp以上欠く、<70>に記載の細胞。
<98>
真核細胞である<70>に記載の細胞。
<99>
酵母細胞、植物細胞または動物細胞である<70>に記載の細胞。
<100>
体細胞である<70>に記載の細胞。
<101>
幹細胞である<70>に記載の細胞。
<102>
ヒト幹細胞である<70>に記載の細胞。
<103>
エンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、エクソヌクレアーゼ、反復可変性二残基ドメインをコードする複数の核酸ダイマーブロック、およびエンドヌクレアーゼ切断部位を含むTALE-N/TFバックボーンベクターを組み合わせ、
前記エンドヌクレアーゼを活性化して前記エンドヌクレアーゼ切断部位において前記TALE-N/TFバックボーンベクターを切断することにより第1末端および第2末端を作製し、
前記エクソヌクレアーゼを活性化して前記TALE-N/TFバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックに3’オーバーハングおよび5’オーバーハングを作製して前記TALE-N/TFバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックを所望の順序でアニールし、
前記DNAポリメラーゼおよび前記DNAリガーゼを活性化して前記TALE-N/TFバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックを連結することを含む、TALEを作製する方法。
<104>
標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、を発現する幹細胞内で、前記標的DNAを改変する方法であって、前記方法は、
(a)前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAをコードする第1外来性核酸を、前記幹細胞に導入すること;ここで前記RNAおよび前記酵素は前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、
ドナー核酸配列をコードする第2外来性核酸を前記幹細胞に導入すること、
を含み、
前記RNAおよび前記ドナー核酸配列が発現し、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに共局在し、前記酵素が前記標的DNAを切断し、前記ドナー核酸が前記標的DNAに挿入されて前記幹細胞内で改変DNAを産生する、前記方法。
<105>
前記酵素がRNA誘導型DNA結合タンパク質である、<104>に記載の方法。
<106>
前記酵素がII型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質である、<104>に記載の方法。
<107>
前記酵素がCas9である、<104>に記載の方法。
<108>
前記RNAが約10ヌクレオチドから約500ヌクレオチドの間である、<104>に記載の方法。
<109>
前記RNAが約20ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの間である、<104>に記載の方法。
<110>
前記RNAがガイドRNAである、<104>に記載の方法。
<111>
前記RNAがtracrRNA-crRNA融合体である、<104>に記載の方法。<112>
前記DNAがゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、または外来性DNAである、<104>に記載の方法。
<113>
前記ドナー核酸配列が組換えにより挿入される、<104>に記載の方法。
<114>
前記ドナー核酸配列が相同組換えにより挿入される、<104>に記載の方法。
<115>
前記ドナー核酸配列が非相同末端結合により挿入される、<104>に記載の方法。
<116>
前記RNAおよび前記ドナー核酸配列が1つ以上のプラスミド上に存在する、<104>に記載の方法。
<117>
工程(a)を複数回繰り返して前記細胞内で前記DNAに複数の改変を生じさせることをさらに含む、<104>に記載の方法。
<118>
幹細胞内で改変DNAを作製した後に、前記標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する前記酵素をコードする核酸が、前記幹細胞のゲノムから除去される、<104>に記載の方法。
<119>
前記RNAおよび前記ドナー核酸配列が結合した核酸配列として発現する、<104>に記載の方法。
<120>
標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素をコードする第1外来性核酸を含む、幹細胞。
<121>
前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAをコードする第2外来性核酸をさらに含み、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、<120>に記載の幹細胞。
<122>
ドナー核酸配列をコードする第3外来性核酸をさらに含む、<121>に記載の幹細胞。
<123>
前記酵素の発現を促進するための誘導性プロモーターをさらに含む<120>に記載の幹細胞。
<124>
前記第1外来性核酸が前記細胞のゲノムDNAからトランスポゼースを使用して除去可能である、<120>に記載の幹細胞。
<125>
前記酵素がRNA誘導型DNA結合タンパク質である、<120>に記載の幹細胞。
<126>
前記酵素がII型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質である、<120>に記載の幹細胞。
<127>
前記酵素がCas9である、<120>に記載の幹細胞。
<128>
前記RNAが約10ヌクレオチドから約500ヌクレオチドの間である、<120>に記載の幹細胞。
<129>
前記RNAが約20ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの間である、<120>に記載の幹細胞。
<130>
前記RNAがガイドRNAである、<120>に記載の幹細胞。
<131>
前記RNAがtracrRNA-crRNA融合体である、<120>に記載の幹細胞。
<132>
前記標的DNAがゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、または外来性DNAである、<120>に記載の幹細胞。
<133>
標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素をコードし、且つ前記酵素の発現を促進するための誘導性プロモーターを含む第1外来性核酸、を含む細胞。
<134>
前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAをコードする第2外来性核酸をさらに含み、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、<133>に記載の細胞。
<135>
ドナー核酸配列をコードする第3外来性核酸をさらに含む、<134>に記載の幹細胞。
<136>
標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素をコードする第1外来性核酸を含む細胞であって、前記第1外来性核酸が前記細胞のゲノムDNAからトランスポゼースを使用して除去可能である、前記細胞。
<137>
前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAをコードする第2外来性核酸をさらに含み、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、<136>に記載の細胞。
<138>
ドナー核酸配列をコードする第3外来性核酸をさらに含む、<137>に記載の幹細胞。
<139>
標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素をコードする第1外来性核酸を含む細胞であって、前記第1外来性核酸が前記細胞のゲノムDNAに可逆的に挿入されている、前記細胞。
<140>
前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAをコードする第2外来性核酸をさらに含み、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、<139>に記載の細胞。
<141>
ドナー核酸配列をコードする第3外来性核酸をさらに含む、<140>に記載の幹細胞。
<142>
標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、を発現する細胞内で、前記標的DNAを改変する方法であって、前記方法は、
(a)ドナー核酸配列をコードする第1外来性核酸を前記細胞に導入すること、
前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAを前記細胞の周囲の培地から前記細胞に導入すること;ここで、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、
を含み、
前記ドナー核酸配列が発現し、
前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに共局在し、前記酵素が前記標的DNAを切断し、前記ドナー核酸が前記標的DNAに挿入されて前記細胞内で改変DNAを産生する、前記方法。
<143>
前記RNAが5’キャップ構造を含む、<142>に記載の方法。
<144>
前記RNAがホスフェート基を欠く、<142>に記載の方法。
<145>
前記酵素がRNA誘導型DNA結合タンパク質である、<142>に記載の方法。
<146>
前記酵素がII型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質である、<142>に記載の方法。
<147>
前記酵素がCas9である、<142>に記載の方法。
<148>
前記RNAが約10ヌクレオチドから約500ヌクレオチドの間である、<142>に記載の方法。
<149>
前記RNAが約20ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの間である、<142>に記載の方法。
<150>
前記RNAがガイドRNAである、<142>に記載の方法。
<151>
前記RNAがtracrRNA-crRNA融合体である、<142>に記載の方法。<152>
前記DNAがゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、または外来性DNAである、<142>に記載の方法。
<153>
前記ドナー核酸配列が組換えにより挿入される、<142>に記載の方法。
<154>
前記ドナー核酸配列が相同組換えにより挿入される、<142>に記載の方法。
<155>
前記ドナー核酸配列が非相同末端結合により挿入される、<142>に記載の方法。
<156>
工程(a)を複数回繰り返して前記細胞内で前記DNAに複数の改変を生じさせることをさらに含む、<142>に記載の方法。
<157>
細胞内で改変DNAを作製した後、前記標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する前記酵素をコードする核酸が、前記細胞のゲノムから除去される、<142>に記載の方法。
<158>
前記RNAおよび前記ドナー核酸配列が結合した核酸配列として発現する、<142>に記載の方法。
Claims (158)
- 反復配列を100bp以上欠くTALENを細胞に導入することを含み、前記TALENが標的DNAを切断し、前記細胞が非相同末端結合を起こして前記細胞内で改変DNAを産生する、細胞内で標的DNAを改変する方法。
- 前記TALENが反復配列を90bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を80bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を70bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を60bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を50bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を40bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を30bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を20bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を19bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を18bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を17bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を16bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を15bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を14bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を13bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を12bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を11bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を10bp以上欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が酵母細胞、植物細胞または動物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が体細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞がヒト幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記TALENをコードする第1外来性核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、請求項1に記載の方法。 - 前記TALENをコードする第1外来性核酸を含むウイルスを前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、請求項1に記載の方法。 - CTAACCCCTGAACAGGTAGTCGCTATAGCTTCAAATATCGGGGGCAAGCAAGCACTTGAGACCGTTCAACGACTCCTGCCAGTGCTCTGCCAAGCCCATGGATTGACTCCGGAGCAAGTCGTCGCGATCGCGAGCAACGGCGGGGGGAAGCAGGCGCTGGAAACTGTTCAGAGACTGCTGCCTGTACTTTGTCAGGCGCATGGTCTCACCCCCGAACAGGTTGTCGCAATAGCAAGTAATATAGGCGGTAAGCAAGCCCTAGAGACTGTGCAACGCCTGCTCCCCGTGCTGTGTCAGGCTCACGGTCTGACACCTGAACAAGTTGTCGCGATAGCCAGTCACGACGGGGGAAAACAAGCTCTAGAAACGGTTCAAAGGTTGTTGCCCGTTCTGTGCCAAGCACATGGGTTAACACCCGAACAAGTAGTAGCGATAGCGTCAAATAACGGGGGTAAACAGGCTTTGGAGACGGTACAGCGGTTATTGCCGGTCCTCTGCCAGGCCCACGGACTTACGCCAGAACAGGTGGTTGCAATTGCCTCCAACATCGGCGGGAAACAAGCGTTGGAAACTGTGCAGAGACTCCTTCCTGTTTTGTGTCAAGCCCACGGCTTGACGCCTGAGCAGGTTGTGGCCATCGCTAGCCACGACGGAGGGAAGCAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGACTTCTCCCAGTTTTGTGCCAAGCTCACGGGCTAACCCCCGAGCAAGTAGTTGCCATAGCAAGCAACGGAGGAGGAAAACAGGCATTAGAAACAGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTACTCTGTCAGGCACACGGTCTAACTCCGGAACAGGTCGTAGCCATTGCTTCCCATGATGGCGGCAAACAGGCGCTAGAGACAGTCCAGAGGCTCTTGCCTGTGTTATGCCAGGCACATGGCCTCACCCCGGAGCAGGTCGTTGCCATCGCCAGTAATATCGGCGGAAAGCAAGCTCTCGAAACAGTACAACGGCTGTTGCCAGTCCTATGTCAAGCTCATGGACTGACGCCCGAGCAGGTAGTGGCAATCGCATCTCACGATGGAGGTAAACAAGCACTCGAGACTGTCCAAAGATTGTTACCCGTACTATGCCAAGCGCATGGTTTAACCCCAGAGCAAGTTGTGGCTATTGCATCTAACGGCGGTGGCAAACAAGCCTTGGAGACAGTGCAACGATTACTGCCTGTCTTATGTCAGGCCCATGGCCTTACTCCTGAGCAAGTCGTAGCTATCGCCAGCAACATAGGTGGGAAACAGGCCCTGGAAACCGTACAACGTCTCCTCCCAGTACTTTGTCAAGCACACGGGTTGACACCGGAACAAGTGGTGGCGATTGCGTCCAACGGCGGAGGCAAGCAGGCACTGGAGACCGTCCAACGGCTTCTTCCGGTTCTTTGCCAGGCTCATGGGCTCACGCCAGAGCAGGTGGTAGCAATAGCGTCGAACATCGGTGGTAAGCAAGCGCTTGAAACGGTCCAGCGTCTTCTGCCGGTGTTGTGCCAGGCGCACGGACTCACACCAGAACAAGTGGTTGCTATTGCTAGTAACAACGGTGGAAAGCAGGCCCTCGAGACGGTGCAGAGGTTACTTCCCGTCCTCTGTCAAGCGCACGGCCTCACTCCAGAGCAAGTGGTTGCGATCGCTTCAAACAATGGTGGAAGACCTGCCCTGGAAのTALE配列または該TALE配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有する前記TALEN、をコードする第1外来性核酸を、前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、請求項1に記載の方法。 - CTAACCCCTGAACAGGTAGTCGCTATAGCTTCAAATATCGGGGGCAAGCAAGCACTTGAGACCGTTCAACGACTCCTGCCAGTGCTCTGCCAAGCCCATGGATTGACTCCGGAGCAAGTCGTCGCGATCGCGAGCAACGGCGGGGGGAAGCAGGCGCTGGAAACTGTTCAGAGACTGCTGCCTGTACTTTGTCAGGCGCATGGTCTCACCCCCGAACAGGTTGTCGCAATAGCAAGTAATATAGGCGGTAAGCAAGCCCTAGAGACTGTGCAACGCCTGCTCCCCGTGCTGTGTCAGGCTCACGGTCTGACACCTGAACAAGTTGTCGCGATAGCCAGTCACGACGGGGGAAAACAAGCTCTAGAAACGGTTCAAAGGTTGTTGCCCGTTCTGTGCCAAGCACATGGGTTAACACCCGAACAAGTAGTAGCGATAGCGTCAAATAACGGGGGTAAACAGGCTTTGGAGACGGTACAGCGGTTATTGCCGGTCCTCTGCCAGGCCCACGGACTTACGCCAGAACAGGTGGTTGCAATTGCCTCCAACATCGGCGGGAAACAAGCGTTGGAAACTGTGCAGAGACTCCTTCCTGTTTTGTGTCAAGCCCACGGCTTGACGCCTGAGCAGGTTGTGGCCATCGCTAGCCACGACGGAGGGAAGCAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGACTTCTCCCAGTTTTGTGCCAAGCTCACGGGCTAACCCCCGAGCAAGTAGTTGCCATAGCAAGCAACGGAGGAGGAAAACAGGCATTAGAAACAGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTACTCTGTCAGGCACACGGTCTAACTCCGGAACAGGTCGTAGCCATTGCTTCCCATGATGGCGGCAAACAGGCGCTAGAGACAGTCCAGAGGCTCTTGCCTGTGTTATGCCAGGCACATGGCCTCACCCCGGAGCAGGTCGTTGCCATCGCCAGTAATATCGGCGGAAAGCAAGCTCTCGAAACAGTACAACGGCTGTTGCCAGTCCTATGTCAAGCTCATGGACTGACGCCCGAGCAGGTAGTGGCAATCGCATCTCACGATGGAGGTAAACAAGCACTCGAGACTGTCCAAAGATTGTTACCCGTACTATGCCAAGCGCATGGTTTAACCCCAGAGCAAGTTGTGGCTATTGCATCTAACGGCGGTGGCAAACAAGCCTTGGAGACAGTGCAACGATTACTGCCTGTCTTATGTCAGGCCCATGGCCTTACTCCTGAGCAAGTCGTAGCTATCGCCAGCAACATAGGTGGGAAACAGGCCCTGGAAACCGTACAACGTCTCCTCCCAGTACTTTGTCAAGCACACGGGTTGACACCGGAACAAGTGGTGGCGATTGCGTCCAACGGCGGAGGCAAGCAGGCACTGGAGACCGTCCAACGGCTTCTTCCGGTTCTTTGCCAGGCTCATGGGCTCACGCCAGAGCAGGTGGTAGCAATAGCGTCGAACATCGGTGGTAAGCAAGCGCTTGAAACGGTCCAGCGTCTTCTGCCGGTGTTGTGCCAGGCGCACGGACTCACACCAGAACAAGTGGTTGCTATTGCTAGTAACAACGGTGGAAAGCAGGCCCTCGAGACGGTGCAGAGGTTACTTCCCGTCCTCTGTCAAGCGCACGGCCTCACTCCAGAGCAAGTGGTTGCGATCGCTTCAAACAATGGTGGAAGACCTGCCCTGGAAのTALE配列または該TALE配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有する前記TALEN、をコードする第1外来性核酸を含むウイルスを、前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、請求項1に記載の方法。 - 細胞内で反復配列を100bp以上欠くTALENとドナー核酸配列とを組み合わせることを含み、前記TALENが標的DNAを切断し、前記ドナー核酸配列が前記細胞内で前記DNAに挿入される、細胞内で標的DNAを改変する方法。
- 前記細胞が非相同末端結合を起こして前記細胞内で改変DNAを産生する、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞が相同組換えを起こして前記細胞内で改変DNAを産生する、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を90bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を80bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を70bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を60bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を50bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を40bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を30bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を20bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を19bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を18bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を17bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を16bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を15bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を14bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を13bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を12bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を11bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENが反復配列を10bp以上欠く、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞が酵母細胞、植物細胞または動物細胞である、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞が体細胞である、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞である、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞がヒト幹細胞である、請求項29に記載の方法。
- 前記TALENをコードする第1外来性核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、請求項29に記載の方法。 - 前記TALENをコードする第1外来性核酸を含むウイルスを前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、請求項29に記載の方法。 - CTAACCCCTGAACAGGTAGTCGCTATAGCTTCAAATATCGGGGGCAAGCAAGCACTTGAGACCGTTCAACGACTCCTGCCAGTGCTCTGCCAAGCCCATGGATTGACTCCGGAGCAAGTCGTCGCGATCGCGAGCAACGGCGGGGGGAAGCAGGCGCTGGAAACTGTTCAGAGACTGCTGCCTGTACTTTGTCAGGCGCATGGTCTCACCCCCGAACAGGTTGTCGCAATAGCAAGTAATATAGGCGGTAAGCAAGCCCTAGAGACTGTGCAACGCCTGCTCCCCGTGCTGTGTCAGGCTCACGGTCTGACACCTGAACAAGTTGTCGCGATAGCCAGTCACGACGGGGGAAAACAAGCTCTAGAAACGGTTCAAAGGTTGTTGCCCGTTCTGTGCCAAGCACATGGGTTAACACCCGAACAAGTAGTAGCGATAGCGTCAAATAACGGGGGTAAACAGGCTTTGGAGACGGTACAGCGGTTATTGCCGGTCCTCTGCCAGGCCCACGGACTTACGCCAGAACAGGTGGTTGCAATTGCCTCCAACATCGGCGGGAAACAAGCGTTGGAAACTGTGCAGAGACTCCTTCCTGTTTTGTGTCAAGCCCACGGCTTGACGCCTGAGCAGGTTGTGGCCATCGCTAGCCACGACGGAGGGAAGCAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGACTTCTCCCAGTTTTGTGCCAAGCTCACGGGCTAACCCCCGAGCAAGTAGTTGCCATAGCAAGCAACGGAGGAGGAAAACAGGCATTAGAAACAGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTACTCTGTCAGGCACACGGTCTAACTCCGGAACAGGTCGTAGCCATTGCTTCCCATGATGGCGGCAAACAGGCGCTAGAGACAGTCCAGAGGCTCTTGCCTGTGTTATGCCAGGCACATGGCCTCACCCCGGAGCAGGTCGTTGCCATCGCCAGTAATATCGGCGGAAAGCAAGCTCTCGAAACAGTACAACGGCTGTTGCCAGTCCTATGTCAAGCTCATGGACTGACGCCCGAGCAGGTAGTGGCAATCGCATCTCACGATGGAGGTAAACAAGCACTCGAGACTGTCCAAAGATTGTTACCCGTACTATGCCAAGCGCATGGTTTAACCCCAGAGCAAGTTGTGGCTATTGCATCTAACGGCGGTGGCAAACAAGCCTTGGAGACAGTGCAACGATTACTGCCTGTCTTATGTCAGGCCCATGGCCTTACTCCTGAGCAAGTCGTAGCTATCGCCAGCAACATAGGTGGGAAACAGGCCCTGGAAACCGTACAACGTCTCCTCCCAGTACTTTGTCAAGCACACGGGTTGACACCGGAACAAGTGGTGGCGATTGCGTCCAACGGCGGAGGCAAGCAGGCACTGGAGACCGTCCAACGGCTTCTTCCGGTTCTTTGCCAGGCTCATGGGCTCACGCCAGAGCAGGTGGTAGCAATAGCGTCGAACATCGGTGGTAAGCAAGCGCTTGAAACGGTCCAGCGTCTTCTGCCGGTGTTGTGCCAGGCGCACGGACTCACACCAGAACAAGTGGTTGCTATTGCTAGTAACAACGGTGGAAAGCAGGCCCTCGAGACGGTGCAGAGGTTACTTCCCGTCCTCTGTCAAGCGCACGGCCTCACTCCAGAGCAAGTGGTTGCGATCGCTTCAAACAATGGTGGAAGACCTGCCCTGGAAのTALE配列または該TALE配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有する前記TALEN、をコードする第1外来性核酸を、前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、請求項29に記載の方法。 - CTAACCCCTGAACAGGTAGTCGCTATAGCTTCAAATATCGGGGGCAAGCAAGCACTTGAGACCGTTCAACGACTCCTGCCAGTGCTCTGCCAAGCCCATGGATTGACTCCGGAGCAAGTCGTCGCGATCGCGAGCAACGGCGGGGGGAAGCAGGCGCTGGAAACTGTTCAGAGACTGCTGCCTGTACTTTGTCAGGCGCATGGTCTCACCCCCGAACAGGTTGTCGCAATAGCAAGTAATATAGGCGGTAAGCAAGCCCTAGAGACTGTGCAACGCCTGCTCCCCGTGCTGTGTCAGGCTCACGGTCTGACACCTGAACAAGTTGTCGCGATAGCCAGTCACGACGGGGGAAAACAAGCTCTAGAAACGGTTCAAAGGTTGTTGCCCGTTCTGTGCCAAGCACATGGGTTAACACCCGAACAAGTAGTAGCGATAGCGTCAAATAACGGGGGTAAACAGGCTTTGGAGACGGTACAGCGGTTATTGCCGGTCCTCTGCCAGGCCCACGGACTTACGCCAGAACAGGTGGTTGCAATTGCCTCCAACATCGGCGGGAAACAAGCGTTGGAAACTGTGCAGAGACTCCTTCCTGTTTTGTGTCAAGCCCACGGCTTGACGCCTGAGCAGGTTGTGGCCATCGCTAGCCACGACGGAGGGAAGCAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGACTTCTCCCAGTTTTGTGCCAAGCTCACGGGCTAACCCCCGAGCAAGTAGTTGCCATAGCAAGCAACGGAGGAGGAAAACAGGCATTAGAAACAGTTCAGCGCTTGCTCCCGGTACTCTGTCAGGCACACGGTCTAACTCCGGAACAGGTCGTAGCCATTGCTTCCCATGATGGCGGCAAACAGGCGCTAGAGACAGTCCAGAGGCTCTTGCCTGTGTTATGCCAGGCACATGGCCTCACCCCGGAGCAGGTCGTTGCCATCGCCAGTAATATCGGCGGAAAGCAAGCTCTCGAAACAGTACAACGGCTGTTGCCAGTCCTATGTCAAGCTCATGGACTGACGCCCGAGCAGGTAGTGGCAATCGCATCTCACGATGGAGGTAAACAAGCACTCGAGACTGTCCAAAGATTGTTACCCGTACTATGCCAAGCGCATGGTTTAACCCCAGAGCAAGTTGTGGCTATTGCATCTAACGGCGGTGGCAAACAAGCCTTGGAGACAGTGCAACGATTACTGCCTGTCTTATGTCAGGCCCATGGCCTTACTCCTGAGCAAGTCGTAGCTATCGCCAGCAACATAGGTGGGAAACAGGCCCTGGAAACCGTACAACGTCTCCTCCCAGTACTTTGTCAAGCACACGGGTTGACACCGGAACAAGTGGTGGCGATTGCGTCCAACGGCGGAGGCAAGCAGGCACTGGAGACCGTCCAACGGCTTCTTCCGGTTCTTTGCCAGGCTCATGGGCTCACGCCAGAGCAGGTGGTAGCAATAGCGTCGAACATCGGTGGTAAGCAAGCGCTTGAAACGGTCCAGCGTCTTCTGCCGGTGTTGTGCCAGGCGCACGGACTCACACCAGAACAAGTGGTTGCTATTGCTAGTAACAACGGTGGAAAGCAGGCCCTCGAGACGGTGCAGAGGTTACTTCCCGTCCTCTGTCAAGCGCACGGCCTCACTCCAGAGCAAGTGGTTGCGATCGCTTCAAACAATGGTGGAAGACCTGCCCTGGAAのTALE配列または該TALE配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有する前記TALEN、をコードする第1外来性核酸を含むウイルスを、前記細胞に導入することを含み、
前記TALENが発現し、前記TALENが前記標的DNAを切断して前記細胞内で改変DNAを産生する、請求項29に記載の方法。 - 反復配列を100bp以上欠くTALENをコードする核酸配列を含むウイルス。
- 前記TALENが反復配列を90bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を80bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を70bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を60bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を50bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を40bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を30bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を20bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を19bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を18bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を17bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を16bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を15bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を14bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を13bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を12bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を11bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- 前記TALENが反復配列を10bp以上欠く、請求項59に記載のウイルス。
- レンチウイルスである請求項59に記載のウイルス。
- 反復配列を100bp以上欠くTALENをコードする核酸配列を含む細胞。
- 前記TALENが反復配列を90bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を80bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を70bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を60bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を50bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を40bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を30bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を20bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を19bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を18bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を17bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を16bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を15bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を14bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を13bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を12bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を11bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 前記TALENが反復配列を10bp以上欠く、請求項70に記載の細胞。
- 真核細胞である請求項70に記載の細胞。
- 酵母細胞、植物細胞または動物細胞である請求項70に記載の細胞。
- 体細胞である請求項70に記載の細胞。
- 幹細胞である請求項70に記載の細胞。
- ヒト幹細胞である請求項70に記載の細胞。
- エンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、エクソヌクレアーゼ、反復可変性二残基ドメインをコードする複数の核酸ダイマーブロック、およびエンドヌクレアーゼ切断部位を含むTALE-N/TFバックボーンベクターを組み合わせ、
前記エンドヌクレアーゼを活性化して前記エンドヌクレアーゼ切断部位において前記TALE-N/TFバックボーンベクターを切断することにより第1末端および第2末端を作製し、
前記エクソヌクレアーゼを活性化して前記TALE-N/TFバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックに3’オーバーハングおよび5’オーバーハングを作製して前記TALE-N/TFバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックを所望の順序でアニールし、
前記DNAポリメラーゼおよび前記DNAリガーゼを活性化して前記TALE-N/TFバックボーンベクターおよび前記複数の核酸ダイマーブロックを連結することを含む、TALEを作製する方法。 - 標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、を発現する幹細胞内で、前記標的DNAを改変する方法であって、前記方法は、
(a)前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNA、をコードする第1外来性核酸を、前記幹細胞に導入すること;ここで前記RNAおよび前記酵素は前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、
ドナー核酸配列をコードする第2外来性核酸を前記幹細胞に導入すること、
を含み、
前記RNAおよび前記ドナー核酸配列が発現し、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに共局在し、前記酵素が前記標的DNAを切断し、前記ドナー核酸が前記標的DNAに挿入されて前記幹細胞内で改変DNAを産生する、前記方法。 - 前記酵素がRNA誘導型DNA結合タンパク質である、請求項104に記載の方法。
- 前記酵素がII型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質である、請求項104に記載の方法。
- 前記酵素がCas9である、請求項104に記載の方法。
- 前記RNAが約10ヌクレオチドから約500ヌクレオチドの間である、請求項104に記載の方法。
- 前記RNAが約20ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの間である、請求項104に記載の方法。
- 前記RNAがガイドRNAである、請求項104に記載の方法。
- 前記RNAがtracrRNA-crRNA融合体である、請求項104に記載の方法。
- 前記DNAがゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、または外来性DNAである、請求項104に記載の方法。
- 前記ドナー核酸配列が組換えにより挿入される、請求項104に記載の方法。
- 前記ドナー核酸配列が相同組換えにより挿入される、請求項104に記載の方法。
- 前記ドナー核酸配列が非相同末端結合により挿入される、請求項104に記載の方法。
- 前記RNAおよび前記ドナー核酸配列が1つ以上のプラスミド上に存在する、請求項104に記載の方法。
- 工程(a)を複数回繰り返して前記細胞内で前記DNAに複数の改変を生じさせることをさらに含む、請求項104に記載の方法。
- 幹細胞内で改変DNAを作製した後に、前記標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する前記酵素をコードする核酸が、前記幹細胞のゲノムから除去される、請求項104に記載の方法。
- 前記RNAおよび前記ドナー核酸配列が結合した核酸配列として発現する、請求項104に記載の方法。
- 標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、をコードする第1外来性核酸を含む、幹細胞。
- 前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNA、をコードする第2外来性核酸をさらに含み、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、請求項120に記載の幹細胞。
- ドナー核酸配列をコードする第3外来性核酸をさらに含む、請求項121に記載の幹細胞。
- 前記酵素の発現を促進するための誘導性プロモーターをさらに含む請求項120に記載の幹細胞。
- 前記第1外来性核酸が前記細胞のゲノムDNAからトランスポゼースを使用して除去可能である、請求項120に記載の幹細胞。
- 前記酵素がRNA誘導型DNA結合タンパク質である、請求項120に記載の幹細胞。
- 前記酵素がII型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質である、請求項120に記載の幹細胞。
- 前記酵素がCas9である、請求項120に記載の幹細胞。
- 前記RNAが約10ヌクレオチドから約500ヌクレオチドの間である、請求項120に記載の幹細胞。
- 前記RNAが約20ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの間である、請求項120に記載の幹細胞。
- 前記RNAがガイドRNAである、請求項120に記載の幹細胞。
- 前記RNAがtracrRNA-crRNA融合体である、請求項120に記載の幹細胞。
- 前記標的DNAがゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、または外来性DNAである、請求項120に記載の幹細胞。
- 標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素をコードし、且つ前記酵素の発現を促進するための誘導性プロモーターを含む第1外来性核酸、を含む細胞。
- 前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAをコードする第2外来性核酸をさらに含み、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、請求項133に記載の細胞。
- ドナー核酸配列をコードする第3外来性核酸をさらに含む、請求項134に記載の幹細胞。
- 標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、をコードする第1外来性核酸を含む細胞であって、前記第1外来性核酸が前記細胞のゲノムDNAからトランスポゼースを使用して除去可能である、前記細胞。
- 前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNA、をコードする第2外来性核酸をさらに含み、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、請求項136に記載の細胞。
- ドナー核酸配列をコードする第3外来性核酸をさらに含む、請求項137に記載の幹細胞。
- 標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、をコードする第1外来性核酸を含む細胞であって、前記第1外来性核酸が前記細胞のゲノムDNAに可逆的に挿入されている、前記細胞。
- 前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNA、をコードする第2外来性核酸をさらに含み、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、請求項139に記載の細胞。
- ドナー核酸配列をコードする第3外来性核酸をさらに含む、請求項140に記載の幹細胞。
- 標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する酵素、を発現する細胞内で、前記標的DNAを改変する方法であって、前記方法は、
(a)ドナー核酸配列をコードする第1外来性核酸を前記細胞に導入すること、
前記標的DNAに相補的であり前記酵素を前記標的DNAまで誘導(guide)するRNAを前記細胞の周囲の媒体から前記細胞に導入すること;ここで、前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに対する共局在複合体のメンバーである、
を含み、
前記ドナー核酸配列が発現し、
前記RNAおよび前記酵素が前記標的DNAに共局在し、前記酵素が前記標的DNAを切断し、前記ドナー核酸が前記標的DNAに挿入されて前記細胞内で改変DNAを産生する、前記方法。 - 前記RNAが5’キャップ構造を含む、請求項142に記載の方法。
- 前記RNAがホスフェート基を欠く、請求項142に記載の方法。
- 前記酵素がRNA誘導型DNA結合タンパク質である、請求項142に記載の方法。
- 前記酵素がII型CRISPRシステムのRNA誘導型DNA結合タンパク質である、請求項142に記載の方法。
- 前記酵素がCas9である、請求項142に記載の方法。
- 前記RNAが約10ヌクレオチドから約500ヌクレオチドの間である、請求項142に記載の方法。
- 前記RNAが約20ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの間である、請求項142に記載の方法。
- 前記RNAがガイドRNAである、請求項142に記載の方法。
- 前記RNAがtracrRNA-crRNA融合体である、請求項142に記載の方法。
- 前記DNAがゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、または外来性DNAである、請求項142に記載の方法。
- 前記ドナー核酸配列が組換えにより挿入される、請求項142に記載の方法。
- 前記ドナー核酸配列が相同組換えにより挿入される、請求項142に記載の方法。
- 前記ドナー核酸配列が非相同末端結合により挿入される、請求項142に記載の方法。
- 工程(a)を複数回繰り返して前記細胞内で前記DNAに複数の改変を生じさせることをさらに含む、請求項142に記載の方法。
- 細胞内で改変DNAを作製した後、前記標的DNAに相補的なRNAと共局在複合体を形成し且つ部位特異的に前記標的DNAを切断する前記酵素をコードする核酸が、前記細胞のゲノムから除去される、請求項142に記載の方法。
- 前記RNAおよび前記ドナー核酸配列が結合した核酸配列として発現する、請求項142に記載の方法。
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