JP2014505007A - タンパク質をコードするｒｎａのリポソームによる送達に適した脂質 - Google Patents

タンパク質をコードするｒｎａのリポソームによる送達に適した脂質 Download PDF

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Abstract

ＲＮＡを、インビボ送達のためにリポソーム内に被包する。上記ＲＮＡは、目的のポリペプチド（例えば、免疫化目的のための免疫原）をコードする。上記リポソームは、式（Ｉ）の化合物および式（ＸＩ）の化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む。本発明はまた、ＲＮＡ含有リポソームを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、ＲＮＡと、式（Ｉ）の化合物および式（ＸＩ）の化合物からなる群より選択される化合物とを、上記化合物が、上記ＲＮＡを中に被包しているリポソームを形成するような条件下で混合する工程を包含する。上記ＲＮＡおよび上記化合物は、他の化合物（例えば、さらなる脂質）の存在下で混合され得、他の化合物はまた、上記リポソームに組み込まれる。

Description

本出願は、２０１０年８月３１日に出願された米国仮出願第６１／３７８，８３３号の利益を主張し、上記米国仮出願の全容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。
（技術分野）
本発明は、動物へのＲＮＡの非ウイルス性送達の分野にある。
（背景技術）
コードされたタンパク質のインビボ発現のための核酸の送達は、遺伝子治療および免疫化の両方のために有用である。良好な送達についての種々のアプローチが試されてきた（ＤＮＡもしくはＲＮＡの使用、ウイルス性もしくは非ウイルス性送達ビヒクル（もしくはさらに送達ビヒクルなし（「裸の」ワクチンにおいて））の使用、複製もしくは非複製ベクターの使用、またはウイルス性もしくは非ウイルス性ベクターの使用が挙げられる）。
コードされたタンパク質のインビボ発現に関して、動物に核酸を送達するためのさらなる改善された方法が、未だに必要である。
（発明の開示）
本発明によれば、ＲＮＡは、リポソーム内に被包されて送達される。上記ＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードする。上記リポソームは、式（Ｉ）の化合物および式（ＸＩ）の化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む。これらリポソームは、インビボ発現のために、ＲＮＡを効率的に送達し得る。本発明は、免疫化のために特に有用であり、ここで、コードされたポリペプチドは、免疫原である。
従って、本発明は、目的のポリペプチドをコードするＲＮＡを中に被包しているリポソームを提供し、ここで上記リポソームは、式（Ｉ）の化合物および式（ＸＩ）の化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む。
式（Ｉ）は、以下：
であり、ここで：
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ５−２０−ヘテロアリール基を形成し；
ａは、存在しないか、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−４アルキレンであり；
ｂは、存在しないか、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−４アルキレンであり；
ｃは、存在しないか、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−４アルキレンであり；
Ｘ１は、ＯもしくはＳであり；
Ｘ２は、ＯもしくはＳであり；
Ｙ１は、必要に応じて置換された、Ｃ１０−３０アルケニル、Ｃ１０−３０アルキニル、Ｃ１０−３０ヘテロアルケニルもしくはＣ１０−３０ヘテロアルキニルであり；
Ｌは、存在しないか、もしくは−（Ｌａ）ｄ−（Ｌｂ）ｅ−（Ｌｃ）ｆ−であり、ここで
Ｌａは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
Ｌｂは、必要に応じて置換された、Ｃ６−１４アリーレンもしくはＣ５−１３ヘテロアリーレンであり；
Ｌｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
ｄは、０もしくは１であり；
ｅは、０もしくは１であり；そして
ｆは、０もしくは１であり；そして
Ｙ２は、必要に応じて置換されたステロイドである。
式（ＸＩ）は、以下：
Ｒａ−（ＡＡ）ｚ−Ｒｂ
であり、ここで
Ｒａは、Ｎ末端アルキルアミドであり；
ｚは、２〜１０の整数であり；
各ＡＡは、アミノ酸であり、ここで、少なくとも１個のヒスチジンおよび少なくとも１個のカチオン性アミノ酸が存在することを条件とし；
Ｒｂは、−Ｈもしくは−ＮＨ２である。
本発明はまた、ＲＮＡ含有リポソームを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、ＲＮＡと、式（Ｉ）の化合物および式（ＸＩ）の化合物からなる群より選択される化合物とを、上記化合物が、上記ＲＮＡを中に被包しているリポソームを形成するような条件下で混合する工程を包含する。上記ＲＮＡおよび上記化合物は、他の化合物（例えば、さらなる脂質）の存在下で混合され得、他の化合物はまた、上記リポソームに組み込まれる。
（リポソーム）
本発明は、ポリペプチドをコードするＲＮＡを中に被包しているリポソームを利用する。従って、上記ＲＮＡは、任意の外部の媒体から分離している（天然ウイルスにおけるのと同様）。上記リポソーム内への被包は、ＲＮＡをＲＮａｓｅ消化から保護することが見いだされた。上記リポソームは、いくつかの外部ＲＮＡを（例えば、それらの表面上に）含み得るが、上記ＲＮＡのうちの少なくとも半分（および理想的には、そのうちの全て）は、上記リポソームのコア中に被包される。リポソーム内での被包は、例えば、参考文献１に開示される脂質／ＲＮＡ複合体とは異なる（ここでＲＮＡは、予め形成されたリポソームと混合される）。
種々の両親媒性脂質は、水性環境中で二重層を形成して、リポソームとして、ＲＮＡ含有水性コアを被包し得る。これら脂質は、アニオン性、カチオン性、もしくは両性イオン性の親水性頭部（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）を有し得る。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、１９６０年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、１９９０年代から研究されてきた。あるリン脂質はアニオン性であるのに対して、他のものは両性イオン性であり、そして他のものはカチオン性である。リン脂質の適切なクラスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロール。そしていくつかの有用なリン脂質は、表１に列挙される。先行技術における有用なカチオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤｌｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。両性イオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質。有用な両性イオン性脂質の例は、以下である：ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、ドデシルホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１，２−ジフィタノイル（ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）。本発明のリポソーム中の脂質は、飽和であってもよいし、不飽和であってもよい。リポソームを調製するための少なくとも１種の不飽和脂質の使用が好ましい。不飽和脂質が２つのテールを有する場合、両方のテールが不飽和であり得、またはそれは、１つの飽和テールおよび１つの不飽和テールを有し得る。脂質は、例えば、ＲＶ０５におけるように、１つのテールにステロイド基を含み得る。
本発明のリポソームは、単一の脂質から、またはより通常には、脂質の混合物から形成され得る。混合物は、（ｉ）カチオン性脂質の混合物、（ｉｉ）アニオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、（ｉｉｉ）両性イオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質と、カチオン性脂質と、両性イオン性脂質との混合物を含み得る。同様に、混合物は、飽和脂質および不飽和脂質の両方を含み得る。脂質の混合物が使用される場合、上記混合物中の成分の脂質の全てが、両親媒性である必要はない（例えば、１種以上の両親媒性脂質が、コレステロールと混合され得る）。
本発明のリポソームは、式（Ｉ）の少なくとも１種の化合物および／もしくは式（ＸＩ）の少なくとも１種の化合物を含む。好ましい本発明のリポソームは、式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む。実施例において示されるように、このようなリポソームは、タンパク質発現のためのＲＮＡのインビボ送達のために特に有用である。他の好ましい本発明のリポソームは、式（ＸＩ）のリポペプチドを含む。リポソームは、式（Ｉ）のリポソームおよび式（ＸＩ）のリポペプチドの両方を含み得るが、通常は、カチオン性化合物のこれら２つのクラスのうちの一方のみを含み得る。
本発明のリポソームが脂質の混合物から形成される場合、式（Ｉ）もしくは式（ＸＩ）を有する脂質の割合は、好ましくは、脂質の全量のうちの２０〜８０％（例えば、３０〜７０％、もしくは４０〜６０％）であるべきである。例えば、有用なリポソームは、以下に示され、ここで、全脂質のうちの４０％もしくは６０％が、式（Ｉ）の脂質である。その残りは、例えば、コレステロール（例えば、３５〜５０％ コレステロール）および／もしくはＤＭＧ（必要に応じて、ＰＥＧ化される）および／もしくはＤＳＰＣから構成され得る。このような混合物は以下で使用される。これらパーセンテージの値は、モルパーセンテージである。
リポソームは、両親媒性脂質を含み得、その親水性部分は、ＰＥＧ化される（すなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって改変される）。この改変は、上記リポソームの安定化を増大させ得、かつ非特異的吸着を妨げ得る。例えば、脂質は、参考文献２および３に開示されるもののような技術を使用して、ＰＥＧに結合体化され得る。有用なＰＥＧ化脂質としては、ＰＥＧ−ＤＭＧ、および参考文献８の式（ＸＩ）の脂質が挙げられる。ＰＥＧは、上記リポソームに、都合の良い薬物動態特性を付与し得るコーティングを提供する。種々の長さのＰＥＧが使用され得る（例えば、０．５〜８ｋＤａ）。
本発明のリポソームを形成するための有用な脂質の混合物は、以下を含む：式（Ｉ）のカチオン性脂質；コレステロール；およびＰＥＧ化脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ、すなわち、ＰＥＧ結合体化１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）。この混合物はまた、中性の両性イオン性脂質、例えば、ＤＳＰＣ（１，２−ジアステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）もしくはＤＰｙＰＥを含み得る。これら（および他の）混合物は、以下の実施例において使用される。
リポソームは、通常、３つの群に分けられる：多層小胞（ＭＬＶ）；小さな単層小胞（ＳＵＶ）；および大きな単層小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、各小胞において複数の二重層を有し、いくつかの別個の水性区画を形成する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアを被包する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、代表的には、直径≦５０ｎｍを有し、ＬＵＶは、直径＞５０ｎｍを有する。本発明のリポソームは、理想的には、６０〜１８０ｎｍの範囲、好ましくは、８０〜１６０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。
本発明のリポソームは、複数のリポソームを含む組成物の一部であり得、上記複数の中のリポソームは、ある範囲の直径を有し得る。異なる直径を有するリポソームの集団を含む組成物に関して：（ｉ）上記リポソームの数で少なくとも８０％は、６０〜１８０ｎｍの範囲、および好ましくは、８０〜１６０ｎｍの範囲の直径を有するべきであり、そして／または（ｉｉ）上記集団の平均直径（強度で、例えば、Ｚ平均）は、理想的には、６０〜１８０ｎｍの範囲、および好ましくは、８０〜１６０ｎｍの範囲にある。上記複数において直径は、理想的には、多分散性指数＜０．２を有するはずである。参考文献１のリポソーム／ＲＮＡ複合体は、６００〜８００ｎｍの範囲の直径、および高い多分散性を有すると予測される。集団における直径は、動的光散乱を使用して測定され得る。
適切なリポソームを調製するための技術は、当該分野で周知である（例えば、参考文献４〜６を参照のこと）。１つの有用な方法は、参考文献７に記載され、（ｉ）脂質のエタノール性溶液、（ｉｉ）核酸の水性溶液、および（ｉｉｉ）緩衝液を混合する工程、続く、混合、平衡化、希釈および精製を包含する。好ましい本発明のリポソームは、この混合プロセスによって得られ得る。
所望の直径を有するリポソームを得るために、混合は、ＲＮＡ水性溶液の２つの供給ストリームが１つの混合ゾーンにおいて、脂質のエタノール性溶液の１つのストリームと、全て同じ流量において、例えば、以下に記載されるとおりのマイクロ流体チャネルにおいて合わされるプロセスを使用して行われ得る。
（式（Ｉ））
式（Ｉ）のカチオン性脂質は、以下のとおりである：
ここで：
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ５−２０−ヘテロアリール基を形成し；
ａは、存在しないか、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−４アルキレンであり；
ｂは、存在しないか、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−４アルキレンであり；
ｃは、存在しないか、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−４アルキレンであり；
Ｘ１は、ＯもしくはＳであり；
Ｘ２は、ＯもしくはＳであり；
Ｙ１は、必要に応じて置換された、Ｃ１０−３０アルケニル、Ｃ１０−３０アルキニル、Ｃ１０−３０ヘテロアルケニルもしくはＣ１０−３０ヘテロアルキニルであり；
Ｌは、存在しないか、もしくは−（Ｌａ）ｄ−（Ｌｂ）ｅ−（Ｌｃ）ｆ−であり、ここで
Ｌａは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
Ｌｂは、必要に応じて置換された、Ｃ６−１４アリーレンもしくはＣ５−１３ヘテロアリーレンであり；
Ｌｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
ｄは、０もしくは１であり；
ｅは、０もしくは１であり；そして
ｆは、０もしくは１であり；そして
Ｙ２は、必要に応じて置換されたステロイドである。
従って、Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、三級アミンを有する環式の「頭部」を形成する。これらの化合物は、参考文献８（その完全な内容が、本明細書に参考として援用される）により詳細に記載される。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：
を有し、ここで：
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ５−２０−ヘテロアリール基を形成し；
ａは、存在しないか、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−４アルキレンであり；
ｂは、存在しないか、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−４アルキレンであり；
ｃは、存在しないか、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−４アルキレンであり；
Ｘ１は、ＯもしくはＳであり；
Ｘ２は、ＯもしくはＳであり；
Ｙ１は、必要に応じて置換された、Ｃ１０−３０アルケニル、Ｃ１０−３０アルキニル、Ｃ１０−３０ヘテロアルケニルもしくはＣ１０−３０ヘテロアルキニルであり；
Ｌは、−（Ｌａ）ｄ−（Ｌｂ）ｅ−（Ｌｃ）ｆ−であり、ここで
Ｌａは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
Ｌｂは、必要に応じて置換された、Ｃ６−１４アリーレンもしくはＣ５−１３ヘテロアリーレンであり；
Ｌｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
ｄは、０もしくは１であり；
ｅは、０もしくは１であり；そして
ｆは、０もしくは１であり；
ここで、Ｌは１個以上のヘテロ原子を含むことを条件とし、そして
Ｙ２は、必要に応じて置換されたステロイドである。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩ）：
を有し、ここで：
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ５−２０−ヘテロアリール基を形成し；
ａは、メチレンであり；
ｂは、メチレンであり；
ｃは存在せず；
Ｘ１は、ＯもしくはＳであり；
Ｘ２は、ＯもしくはＳであり；
Ｙ１は、必要に応じて置換された、Ｃ１０−３０アルケニル、Ｃ１０−３０アルキニル、Ｃ１０−３０ヘテロアルケニルもしくはＣ１０−３０ヘテロアルキニルであり；
Ｌは、−（Ｌａ）ｄ−（Ｌｂ）ｅ−（Ｌｃ）ｆ−であり、ここで
Ｌａは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
Ｌｂは、必要に応じて置換された、Ｃ６−１４アリーレンもしくはＣ５−１３ヘテロアリーレンであり；
Ｌｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
ｄは、０もしくは１であり；
ｅは、０もしくは１であり；そして
ｆは、０もしくは１であり；そして
Ｙ２は、必要に応じて置換されたステロイドである。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＶ）：
を有し、ここで：
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ５−２０−ヘテロアリール基を形成し；
ａは、メチレンであり；
ｂは、メチレンであり；
ｃは、存在せず；
Ｘ１は、ＯもしくはＳであり；
Ｘ２は、ＯもしくはＳであり；
Ｙ１は、必要に応じて置換された、Ｃ１０−３０アルケニル、Ｃ１０−３０アルキニル、Ｃ１０−３０ヘテロアルケニルもしくはＣ１０−３０ヘテロアルキニルであり；
Ｌは、−（Ｌａ）ｄ−（Ｌｂ）ｅ−（Ｌｃ）ｆ−であり、ここで
Ｌａは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
Ｌｂは、必要に応じて置換された、Ｃ６−１４アリーレンもしくはＣ５−１３ヘテロアリーレンであり；
Ｌｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
ｄは、０もしくは１であり；
ｅは、０もしくは１であり；そして
ｆは、０もしくは１であり；
ここで、Ｌは１個以上のヘテロ原子を含むことを条件とし、そして
Ｙ２は、必要に応じて置換されたステロイドである。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｖ）：
を有し、ここで：
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ５−２０−ヘテロアリール基を形成し；
ａは、メチレンであり；
ｂは、メチレンであり；
ｃは存在せず；
Ｘ１は、Ｏであり；
Ｘ２は、Ｏであり；
Ｙ１は、必要に応じて置換された、Ｃ１０−３０アルケニル、Ｃ１０−３０アルキニル、Ｃ１０−３０ヘテロアルケニルもしくはＣ１０−３０ヘテロアルキニルであり；
Ｌは、−（Ｌａ）ｄ−（Ｌｂ）ｅ−（Ｌｃ）ｆ−であり、ここで
Ｌａは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
Ｌｂは、必要に応じて置換された、Ｃ６−１４アリーレンもしくはＣ５−１３ヘテロアリーレンであり；
Ｌｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
ｄは、０もしくは１であり；
ｅは、０もしくは１であり；そして
ｆは、０もしくは１であり；
ここで、Ｌは１個以上のヘテロ原子を含むことを条件とし、そして
Ｙ２は、必要に応じて置換されたステロイドである。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＶＩ）：
を有し、ここで：
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ５−２０−ヘテロアリール基を形成し；
ａは、メチレンであり；
ｂは、メチレンであり；
ｃは存在せず；
Ｘ１は、Ｏであり；
Ｘ２は、Ｏであり；
Ｙ１は、必要に応じて置換された、Ｃ１０−３０アルケニル、Ｃ１０−３０アルキニル、Ｃ１０−３０ヘテロアルケニルもしくはＣ１０−３０ヘテロアルキニルであり；
Ｌは、−Ｌｃ−であり、ここでＬｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；そして
Ｙ２は、必要に応じて置換されたステロイドである。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＶＩＩ）：
を有し、ここで：
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ５−２０−ヘテロアリール基を形成し；
ａは、メチレンであり；
ｂは、メチレンであり；
ｃは存在せず；
Ｘ１は、Ｏであり；
Ｘ２は、Ｏであり；
Ｙ１は、必要に応じて置換されたＣ１６−２２アルケニル基であり；
Ｌは、−Ｌｃ−であり、ここでＬｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；そして
Ｙ２は、必要に応じて置換されたステロイドである。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ）：
を有し、ここで：
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ５−２０−ヘテロアリール基を形成し；
ａは、メチレンであり；
ｂは、メチレンであり；
ｃは存在せず；
Ｘ１は、Ｏであり；
Ｘ２は、Ｏであり
Ｙ１は、必要に応じて置換されたＣ１６−２２アルケニル基であり；
Ｌは、−Ｌｃ−であり、ここでＬｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；そして
Ｙ２は、Ａステロイド環の３位においてヒドロキシ基を介して繋がれたコレステロールであり、上記ヒドロキシ基の水素原子は、存在しない。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＸ）：
を有し、ここで：
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ５−２０−ヘテロアリール基を形成し；
ａは、メチレンであり；
ｂは、メチレンであり；
ｃは存在せず；
Ｘ１は、ＯもしくはＳであり；
Ｘ２は、ＯもしくはＳであり；
Ｙ１は、必要に応じて置換された、Ｃ１０−３０アルケニル、Ｃ１０−３０アルキニル、Ｃ１０−３０ヘテロアルケニルもしくはＣ１０−３０ヘテロアルキニルであり；
Ｌは、−（Ｌａ）ｄ−（Ｌｂ）ｅ−（Ｌｃ）ｆ−であり、ここで
Ｌａは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
Ｌｂは、必要に応じて置換された、Ｃ６−１４アリーレンもしくはＣ５−１３ヘテロアリーレンであり；
Ｌｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
ｄは、０もしくは１であり；
ｅは、０もしくは１であり；そして
ｆは、０もしくは１であり；
ここで、Ｌは１個以上のヘテロ原子を含むことを条件とし、
Ｙ２は、必要に応じて置換されたステロイドであり；そして
上記化合物のｐＫａは、約５．９〜約７である。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｘ）：
を有し、ここで：
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ５−２０−ヘテロアリール基を形成し；
ａは、メチレンであり；
ｂは、メチレンであり；
ｃは存在せず；
Ｘ１は、ＯもしくはＳであり；
Ｘ２は、ＯもしくはＳであり；
Ｙ１は、必要に応じて置換された、Ｃ１０−３０アルケニル、Ｃ１０−３０アルキニル、Ｃ１０−３０ヘテロアルケニルもしくはＣ１０−３０ヘテロアルキニルであり；
Ｌは、−（Ｌａ）ｄ−（Ｌｂ）ｅ−（Ｌｃ）ｆ−であり、ここで
Ｌａは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
Ｌｂは、必要に応じて置換された、Ｃ６−１４アリーレンもしくはＣ５−１３ヘテロアリーレンであり；
Ｌｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
ｄは、０もしくは１であり；
ｅは、０もしくは１であり；そして
ｆは、０もしくは１であり；
ここで、Ｌは１個以上のヘテロ原子を含むことを条件とし、
Ｙ２は、必要に応じて置換されたステロイドであり；そして
上記化合物のｐＫａは、約４．５〜約６．２である。
（ａ、ｂおよびｃ）
一実施形態において、ａは、必要に応じて置換されたＣ１−２アルキレンである。さらなる実施形態において、ａは、必要に応じて置換されたＣ１アルキレンである。
一実施形態において、ｂは、必要に応じて置換されたＣ０−２アルキレンである。さらなる実施形態において、ｂは、必要に応じて置換されたＣ１アルキレンである。
一実施形態において、ｃは、存在しないか、もしくは必要に応じて置換されたＣ１アルキレンである。さらなる実施形態において、ｃは存在しない。
一実施形態において、ａ、ｂおよびｃは、存在する場合、置換されない。
（頭部）
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニル基、Ｃ５−ヘテロアリールもしくはＣ６−ヘテロアリール基を形成する。一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニルもしくはＣ３−２０−ヘテロシクロアルキニル基を形成する。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたＣ３−２０−ヘテロシクロアルキル基を形成する。
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたＣ５−１６基を形成する。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたＣ５−１２基を形成する。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたＣ５基、Ｃ６基もしくはＣ７基を形成する。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたＣ５基もしくはＣ６基を形成する。
本発明の好ましい実施形態のうちの１つにおいて、Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、少なくとも１個の酸素原子を含む種を形成する。
一実施形態において、結合する窒素原子と一緒になったＲ１およびＲ２は、表１に提供されるように、Ｈ１〜Ｈ４８から選択される。
（Ｘ１およびＸ２）
一実施形態において、Ｘ１は、Ｏである。別の実施形態において、Ｘ２は、Ｏである。さらなる実施形態において、Ｘ１およびＸ２はともに、Ｏである。
（リンカー）
好ましい実施形態において、Ｌは、少なくとも１個のヘテロ原子を含む。これは、Ｘ２とＹ２との間の直接連結を提供する鎖が、少なくとも１個のヘテロ原子を有すること、言い換えると、Ｌ上の置換基におけるいかなるヘテロ原子も、これらの目的に関して、数に入れられないことを意味する。さらなる実施形態において、Ｌは、少なくとも１個のＯ原子を含む。
一実施形態において、Ｌは、少なくとも２個のヘテロ原子を含む。さらなる実施形態において、Ｌは、少なくとも２個のＯ原子を含む。
一実施形態において、Ｌｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキレンである。一実施形態において、Ｌｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキレンであり、ｄおよびｅは、ともに０である。
一実施形態において、Ｌｃは、式Ｌｃ−ｉ〜Ｌｃ−ｘｘｉｉｉのうちの１個から選択される。一実施形態において、Ｌｃは、式Ｌｃ−ｉ〜Ｌｃ−ｘｘｉｉｉのうちの１個から選択され、ｄおよびｅは、ともに０である。
Ｌｃ−ｘｘｉｉｉ −（ＣＨ２）２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ（側鎖−１）ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ここで側鎖−１は、基：
を表し、上記破線は、分子の残りへの結合を表す）。
Ｌが少なくとも１個のヘテロ原子を含む基が好ましいので、Ｌｃは、好ましくは、Ｌｃ−ｉ、Ｌｃ−ｖ〜Ｌｃ−ｖｉｉおよびＬｃ−ｉｘ〜Ｌｃ−ｘｘｉｉｉから選択される。
一実施形態において、Ｌｃは、必要に応じて置換されたＣ１−１５ヘテロアルキレンである。
一実施形態において、Ｌｃは、必要に応じて置換されたＣ１−１１基である。さらなる実施形態において、Ｌｃは、必要に応じて置換されたＣ１−９基である。さらなる実施形態において、Ｌｃは、必要に応じて置換されたＣ３−８基である。さらなる実施形態において、Ｌｃは、必要に応じて置換されたＣ４−７基である。さらなる実施形態において、Ｌｃは、必要に応じて置換されたＣ５、Ｃ６もしくはＣ７基である。
好ましい実施形態において、ｄは、０であり；ｅは、０であり、ｆは、１である。好ましい実施形態において、ｄは、０であり；ｅは、０であり、ｆは、１であり、Ｌｃは、上記に示される鎖長内において、ヘテロアルキレンである。
（Ｙ１）
一実施形態において、Ｙ１は、Ｃ１２−２８基である。さらなる実施形態において、Ｙ１は、Ｃ１４−２６基である。さらなる実施形態において、Ｙ１は、Ｃ１６−２４基である。さらなる実施形態において、Ｙ１は、Ｃ１６−２２基である。さらなる実施形態において、上記Ｙ１鎖は、１８、１９、２０もしくは２１個の原子長である。
上記に示される炭素範囲内で、Ｙ１は、好ましくは、アルケニルもしくはヘテロアルケニルである。
一実施形態において、Ｙ１は、少なくとも１個のアルケン基を有する。さらなる実施形態において、Ｙ１は、１個、２個もしくは３個のアルケン基を有する。
一実施形態において、Ｙ１は、ω−３位においてアルケン基を有する。別の実施形態において、Ｙ１は、ω−６位においてアルケン基を有する。別の実施形態において、Ｙ１は、ω−９位においてアルケン基を有する。さらなる実施形態において、Ｙ１は、ω−３位、ω−６位およびω−９位のうちの２カ所もしくは３カ所においてアルケン基を有する。一実施形態において、Ｙ１は、ω−６位およびω−９位において不飽和である。別の実施形態において、Ｙ１は、ω−３位、ω−６位およびω−９位において不飽和である。一実施形態において、Ｙ１は、ω−９位において不飽和である。
一実施形態において、Ｙ１は、少なくとも１個のｃｉｓ不飽和アルケン基を有する。さらなる実施形態において、Ｙ１は、少なくとも２個のｃｉｓ不飽和アルケン基を有する。さらなる実施形態において、Ｙ１は、少なくとも３個のｃｉｓ不飽和アルケン基を有する。上記少なくとも１個のｃｉｓ不飽和アルケン基は、ω−３位、ω−６位およびω−９位のうちの１カ所、２カ所もしくは３カ所に存在し得る。脂質鎖における不飽和は、ＭａｃＬａｃｈｌａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７ （２００５） ２７６−２８７において考察されている。
一実施形態において、Ｙ１は、表２に提供されるように、Ｙ１−ｉ〜Ｙ１−ｖｉから選択される。
（Ｙ２）
一実施形態において、Ｙ２は、必要に応じて置換されたステロイド上の酸素原子を介して、Ｌに連結される。さらなる実施形態において、Ｙ２は、Ａステロイド環の３位上の酸素原子を介してＬに連結される。さらなる実施形態において、Ｙ２は、Ａステロイド環の３位におけるヒドロキシ基の水素原子が除去されたステロールである（およびＬへの連結は、上記ヒドロキシ基の酸素原子を介する）。
一実施形態において、上記ステロールは、以下からなる群より選択される：アナステロール（ａｎｎａｓｔｅｒｏｌ）；アベナステロール；β−シトステロール；ブラシカステロール；カルシフェロール；カンペステロール；カリノステロール（ｃｈａｌｉｎｏｓｔｅｒｏｌ）；キナステロール（ｃｈｉｎａｓｔｅｒｏｌ）；コレスタノール；コレステロール；コプロスタノール；シクロアルテノール；デヒドロコレステロール；デスモステロール；ジヒドロカルシフェロール；ジヒドロコレステロール；ジヒドロエルゴステロール；ジノステロール；エピコレステロール；エルゴステロール；フコステロール；ヘキサヒドロルミステロール；ヘキサオール；ヒドロキシコレステロール；ラノステロール；ルミステロール；パルケオール；ポリフェラステロール；サリンゴステロール；シトスタノール；シトステロール；スチグマスタノール；スチグマステロール；ウェインベルステロール；チモステロール；ステロール胆汁酸（例えば、コール酸；ケノデオキシコール酸；グリココール酸；タウロコール酸；デオキシコール酸、およびリトコール酸）；ならびにこれらの塩。
さらなる実施形態において、上記ステロールは、コレステロールである。
（ｐＫａ）
脂質のｐＫａは、上記脂質のうちの５０％が荷電されるｐＨであり、上記脂質が完全に荷電される点と、上記脂質が完全に荷電されない点との間の中間点にある。それは、種々の方法において測定され得るが、好ましくは、以下で開示される方法を使用して測定される。上記ｐＫａは、代表的には、他の脂質も含む混合物の状況における脂質ではなく（例えば、参考文献２において行われるとおりではなく（ここでは、個々の脂質ではなくＳＮＡＬＰのｐＫａを調べている））、単独の脂質について測定されるべきである。
脂質のｐＫａは、以下の技術を使用して、標準的な温度および圧力において、水の中で測定される：
・エタノール中の脂質の２ｍＭ溶液を、脂質を秤量し、エタノール中に溶解することによって調製する。エタノール：メタノール ９：１中の蛍光プローブトルエンニトロスルホン酸（ＴＮＳ）の０．３ｍＭ溶液を、まず、メタノール中のＴＮＳの３ｍＭ溶液を作製し、次いで、エタノールで０．３ｍＭへと希釈することによって調製する。
・濃度２０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭおよび１５０ｍＭにおいて、それぞれ、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含む水性緩衝液を調製する。上記緩衝液を８つに分け、そのｐＨを、１２Ｎ ＨＣｌもしくは６Ｎ ＮａＯＨのいずれかで、４．４４〜４．５２、５．２７、６．１５〜６．２１、６．５７、７．１０〜７．２０、７．７２〜７．８０、８．２７〜８．３３および１０．４７〜１１．１２へと調節した。２ｍＭ脂質溶液４００μＬおよび０．３ｍＭ ＴＮＳ溶液８００μＬを混合する。
・７．５μＬのプローブ／脂質ミックスを、１ｍＬ ９６ウェルプレートにおいて、２４２．５μＬの緩衝液に添加する。これは、８つ全ての緩衝液で行う。混合の後、１００μＬの各プローブ／脂質／緩衝液混合物を、２５０μＬの黒い透明底の９６ウェルプレート（例えば、モデルＣＯＳＴＡＲ ３９０４，Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移す。
・各プローブ／脂質／緩衝液混合物の蛍光を（例えば、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５分光光度計およびＳｏｆｔＭａｘ ｐｒｏ ５．２ソフトウェアで、３２２ｎｍ励起、４３１ｎｍ発光（オートカットオフ４２０ｎｍ））測定する。
・測定後、上記９６ウェルプレートの空のウェルのバックグラウンド蛍光値を、各プローブ／脂質／緩衝液混合物から差し引く。次いで、上記蛍光強度値を、最低ｐＨにおける値に対して正規化する。次いで、上記正規化した蛍光強度を、ｐＨに対してプロットし、最良適合の線を提供する。
・正規化した蛍光強度が０．５に等しい、最良適合の線上の点を見いだす。０．５に等しい正規化した蛍光強度に対応するｐＨが見いだされ、上記脂質のｐＫａとみなされる。
最良の免疫学的結果は、５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有する脂質で認められる。このｐＫａ範囲内で、好ましい脂質は、５．５〜６．７のｐＫａ（例えば、５．６〜６．８、５．６〜６．３、５．６〜６．０、５．５〜６．２、もしくは５．７〜５．９）を有する。
（式（Ｉ）の具体的化合物）
本発明で有用な式（Ｉ）の具体的化合物は、参考文献８において開示される。例えば、上記化合物は、
であり得る。上記化合物は、「ＲＶ０３」〜「ＲＶ１２」リポソームにおいて、もしくは「ＲＶ１５」リポソームにおいて使用された、以下で示される脂質であり得る。好ましい化合物は、Ｅ００２６、Ｅ００６９およびＥ００７８である。好ましい化合物は、「ＲＶ０５」、「ＲＶ０８」および「ＲＶ０９」リポソームにおいて使用された、以下で示される脂質である。
代替の実施形態において、本発明のリポソームは、式（Ｉ）の化合物を使用するのではなく、化合物「ＲＶ０２」（以下で示される構造）を使用する。この置換を除いて、ＲＶ０２含有リポソームの全ての他の局面は、本明細書中の他の箇所で記載されるとおりである。
（式（ＸＩ））
式（ＸＩ）の化合物は、Ｎ末端アルキルアミドおよび２〜１０個のアミノ酸を含むカチオン性リポペプチドである。式（ＸＩ）は、
Ｒａ−（ＡＡ）ｚ−Ｒｂ
であり、ここで
Ｒａは、Ｎ−末端アルキルアミドであり、
ｚは、２〜１０の整数であり；
各ＡＡは、アミノ酸であり、ここで、少なくとも１個のヒスチジンおよび少なくとも１個のカチオン性アミノ酸が存在することを条件とし；
Ｒｂは、−Ｈ、−ＯＨもしくは−ＮＨ２である。
上記Ｒａ部分は、式Ｒｃ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲｄ−を有し、ここでＲｃは、Ｃ２〜Ｃ２４アルキルであり、Ｒｄは、−ＨもしくはＣ１〜Ｃ４アルキルである。適切なＲｃ基としては、ラウリル（「Ｌａｕ」；Ｃ１２）およびパルミトイル（「Ｐａｌ」；Ｃ１６）が挙げられる。
上記Ｒａ部分のアミドは、２〜１０アミノ酸（例えば、３〜８アミノ酸）のオリゴペプチド鎖に結合される。この鎖は、少なくとも１個（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個）のヒスチジンを含む。それはまた、少なくとも１個のカチオン性アミノ酸（例えば、少なくとも１個のアルギニン、リジンもしくはオルニチン残基）を含む。少なくとも１個のリジンの包含が好ましく、理想的には、２個もしくは３個のリジンの包含が好ましい。ヒスチジンは、その側鎖が弱塩基性であり、生理学的ｐＨにおいて主に非イオン化状態であるが、エンドソームの弱酸性環境において高度にプロトン化されるので、含まれる。カチオン性アミノ酸（例えば、リジンもしくはアルギニン）は、中性ｐＨにおいて上記リポペプチド上に単位正電荷を提供する。有用なオリゴペプチドは、アミノ酸配列−Ｃ−Ｋｉ−Ｈｊ−を有する：ｉは、１、２もしくは３であり；そしてｊは、１、２、３、４もしくは５である。
上記オリゴペプチド鎖のＣ末端は、−ＣＯＯＨとして残り得るか、または代わりにアミドを形成し得る。
式（ＸＩ）の化合物は、それらのアルキル鎖、それらのアミノ酸配列、およびそれらのＣ末端基の点から記載され得る。例えば、上記リポペプチド「Ｌａｕ−（Ｃ−Ｋ−Ｈ−Ｈ）−ＮＨ２」は、Ｎ末端ラウリル鎖、次いで、システイン、次いで、リジン、次いで２個のヒスチジン、およびＣ末端アミンを有する。従って、式（ＸＩ）の適切なリポペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
これらおよび他の化合物は、参考文献９に開示され、以下を含む：
（ＲＮＡ）
本発明のリポソームは、ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子（参考文献２におけるような、ｓｉＲＮＡとは異なる）を含む。上記粒子のインビボ投与後、ＲＮＡは、上記粒子から放出され、上記ポリペプチドをインサイチュで提供するように、細胞の中で翻訳される。
上記ＲＮＡは、プラス鎖であるので、任意の介在複製工程（例えば、逆転写）を必要とすることなく、細胞によって翻訳され得る。それは、免疫細胞によって発現されるＴＬＲ７レセプターにも結合し得、それによって、免疫化目的に有用なアジュバント効果を開始する。
好ましいプラス鎖ＲＮＡは、自己複製性である。自己複製ＲＮＡ分子（レプリコン）は、いかなるタンパク質もなしに脊椎動物細胞に送達される場合に、それ自体からの転写によって（それ自体から生成するアンチセンスコピーを介して）、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらし得る。自己複製ＲＮＡ分子は、従って、代表的には、細胞への送達後に直接翻訳され得るプラス鎖分子であり、そしてこの翻訳は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供し、これは次に、上記送達されたＲＮＡからアンチセンスおよびセンス両方の転写物を生成する。従って、上記送達されるＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらす。これら娘ＲＮＡ、ならびに同一線状の（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）サブゲノム転写物は、コードされた目的のポリペプチドのインサイチュ発現を提供するようにそれら自体が翻訳されてもよいし、上記送達されたＲＮＡと同じセンスを有するさらなる転写物を提供するように転写されてもよい（これは、翻訳されて上記目的のポリペプチドのインサイチュ発現を提供する）。この一連の転写の全体的な結果は、上記導入されるレプリコンＲＮＡの非常に多くの増幅であり、よって上記コードされた目的のポリペプチドは、上記細胞の主な生成物になる。
自己複製を達成するための１つの適した系は、アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを使用することである。これらプラス鎖レプリコンは、細胞への送達後に翻訳されて、レプリカーゼ（もしくはレプリカーゼ−転写酵素）をもたらす。上記レプリカーゼは、ポリプロテインとして翻訳され、これは、上記プラス鎖の送達されたＲＮＡのゲノムマイナス鎖コピーを作り出す複製複合体を提供するように自己切断する。これらマイナス鎖転写物は、それ自体、転写されて、上記プラス鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを与え得、さらに、上記目的のポリペプチドをコードするサブゲノム転写物を与え得る。上記サブゲノム転写物の翻訳は、従って、上記感染細胞による上記ポリペプチドのインサイチュ発現をもたらす。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用し得る。変異型もしくは野生型のウイルス配列が使用され得、例えば、ＶＥＥＶの弱毒化ＴＣ８３変異型は、レプリコンにおいて使用されてきた［１０］。
好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、従って、（ｉ）ＲＮＡを上記自己複製ＲＮＡ分子から転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）目的のポリペプチドをコードする。上記ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４のうちの１種以上を含む、アルファウイルスレプリカーゼであり得る。
天然のアルファウイルスゲノムは、上記非構造的レプリカーゼポリプロテインに加えて、構造的ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。従って、好ましい自己複製ＲＮＡは、細胞においてそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの生成をもたらし得るが、ＲＮＡ含有ビリオンの生成をもたらさない。これらビリオンを生成できないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、上記自己複製ＲＮＡ分子が、感染性形態として永続できないことを意味する。野生型ウイルスとして永続するために必要な上記アルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡにおいて存在せず、上記目的のポリペプチドをコードする遺伝子によってそれらの場所が占められている。その結果、上記サブゲノム転写物は、上記構造的アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく、そのポリペプチドをコードする。
従って、本発明で有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２個のオープンリーディングフレームを有し得る。第１の（５’）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードする；第２の（３’）オープンリーディングフレームは、目的のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、例えば、さらなる目的のポリペプチド（以下を参照のこと）をコードするかもしくはアクセサリポリペプチドをコードするために、さらなる（例えば、下流の）オープンリーディングフレームを有し得る。
自己複製ＲＮＡ分子は、コードされたレプリカーゼと適合性である５’配列を有し得る。
自己複製ＲＮＡ分子は、種々の長さを有し得るが、それらは、代表的には、５０００〜２５０００ヌクレオチド長（例えば、８０００〜１５０００ヌクレオチド、もしくは９０００〜１２０００ヌクレオチド）である。従って、上記ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ送達において認められるものより長い。
本発明で有用なＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、７−メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、上記ＲＮＡのインビボ翻訳を増強し得る。
本発明で有用なＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドは、５’トリホスフェート基を有し得る。キャップされたＲＮＡにおいて、これは、５’から５’への架橋を介して、７−メチルグアノシンに連結され得る。５’トリホスフェートは、ＲＩＧ−Ｉ結合を増強し得るので、アジュバント効果を促進し得る。
ＲＮＡ分子は、３’ポリ−Ａテールを有し得る。それはまた、その３’末端付近にポリ−Ａポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。
本発明で有用なＲＮＡ分子は、代表的には、一本鎖である。一本鎖ＲＮＡは、一般に、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＲＮＡヘリカーゼおよび／もしくはＰＫＲへの結合によって、アジュバント効果を開始し得る。二本鎖形態において送達されるＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＴＬＲ３に結合し得、このレセプターはまた、一本鎖ＲＮＡの複製の間もしくは一本鎖ＲＮＡの二次構造内のいずれかで形成されるｄｓＲＮＡによって誘発され得る。
本発明で有用ＲＮＡ分子は、便宜上、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって調製され得る。ＩＶＴは、細菌においてプラスミド形態において作られ、増やされたか、または合成で作製された（例えば、遺伝子合成および／もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操作法によって）（ｃＤＮＡ）テンプレートを使用し得る。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）は、ＤＮＡテンプレートからＲＮＡを転写するために使用され得る。適切なキャッピングおよびポリＡ付加反応は、必要時に使用され得る（しかし、上記レプリコンのポリＡは、通常、上記ＤＮＡテンプレート内にコードされる）。これらＲＮＡポリメラーゼは、転写される５’ヌクレオチドについてストリンジェントな要件を有し得、いくつかの実施形態において、これらの要件は、上記ＩＶＴ転写ＲＮＡが、自己がコードするレプリカーゼの基質として効率的に機能し得ることを確実にするために、上記コードされたレプリカーゼの要件とマッチしなければならない。
参考文献１１において考察されるように、上記自己複製ＲＮＡは、（任意の５’キャップ構造に加えて）改変された核酸塩基を有する１個以上のヌクレオチドを含み得る。従って、上記ＲＮＡは、以下を含み得る：ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（ｌ−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６．−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１１（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−ホルミル（ｆｏｎｎｙｌ）シチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（改変未満（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（キューオシン）；ｏＱ（エポキシキューオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル（ｇａｌｔａｃｔｏｓｙｌ）−キューオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−キューオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ＊（アルカエオシン（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ））；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン（ｍｅｔｈｙｌｕｒｉｃｊｉｎｅ））；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−Ｏメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン）；ｉｍＧ−１４（４−デメチルグアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；もしくはａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、７−置換されたその誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換された７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デアザ−８−置換プリン、または無塩基ヌクレオチド。例えば、自己複製ＲＮＡは、１つ以上の改変されたピリミジン核酸塩基（例えば、シュードウリジンおよび／もしくは５−メチルシトシン残基）を含み得る。しかし、いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、改変された核酸塩基を含まず、改変されたヌクレオチドを含まなくてもよい（すなわち、上記ＲＮＡ中のヌクレオチドのすべては、標準的なＡ、Ｃ、ＧおよびＵというリボヌクレオチドである（任意の５’キャップ構造を除く。これは、７’−メチルグアノシンを含み得る））。他の実施形態において、上記ＲＮＡは、７’−メチルグアノシンを含む５’キャップを含み得、最初の１個、２個もしくは３個の５’リボヌクレオチドは、リボースの２’位においてメチル化され得る。
本発明で使用されるＲＮＡは、理想的には、ヌクレオチド間にホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態において、それは、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、および／もしくはメチルホスホネート結合を含み得る。
理想的には、リポソームは、１０より少ない種の異なるＲＮＡ（例えば、５種、４種、３種、もしくは２種の異なる種）を含み；最も好ましくは、リポソームは、単一のＲＮＡ種を含み、すなわち、上記リポソーム中の全てのＲＮＡ分子は、同じ配列および同じ長さを有する。
リポソーム１つあたりのＲＮＡの量は、変動し得る。リポソーム１つあたりの個々の自己複製ＲＮＡ分子の数は、代表的には、リポソーム１つあたり≦５０（例えば、リポソーム１つあたり＜２０、＜１０、＜５、もしくは１〜４）である。
（コードされた目的のポリペプチド）
本発明で使用されるＲＮＡ分子は、目的のポリペプチドをコードする。上記リポソームの投与後に、上記ＲＮＡは、インビボで翻訳され、得られたタンパク質は、その所望の効果を発揮し得る（例えば、それは、レシピエントにおいて免疫応答を誘発し得るか、または目的の機能（例えば、酵素活性）を提供し得る）。
上記ＲＮＡ分子は、単一の目的のポリペプチドもしくは複数のポリペプチドをコードし得る。複数のポリペプチドは、単一のポリペプチド（融合ポリペプチド）として、もしくは別個のポリペプチドとして、提示され得る。ポリペプチドが、レプリコンから別個のポリペプチドとして発現される場合、これらのうちの１種以上は、上流のＩＲＥＳもしくはさらなるウイルスプロモーターエレメントと共に提供され得る。あるいは、複数のポリペプチドは、短い自己触媒性プロテアーゼ（例えば、口蹄疫ウイルス２Ａタンパク質）に融合された個々のポリペプチドをコードするポリプロテインから、またはインテインとして発現され得る。
参考文献１および１２とは異なり、上記ＲＮＡは、有用なインビボ機能を有するポリペプチドをコードする。不確かさを避けるために、本発明は、ホタルルシフェラーゼをコードするか、またはＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼの融合タンパク質をコードするか、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡを含まない。このようなポリペプチドは、マーカーとして有用であり得るが、本発明は、有用な治療応答もしくは免疫学的応答を提供し得るポリペプチドのインビボ発現のためのＲＮＡの送達に関する。また、上記ＲＮＡは、全マウス胸腺ＲＮＡではない。
（免疫原）
いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、ポリペプチド免疫原をコードする。上記リポソームの投与後に、上記ＲＮＡは、インビボで翻訳され、上記免疫原は、レシピエントにおいて免疫応答を誘発し得る。上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対して（または、いくつかの実施形態において、アレルゲンに対して；および他の実施形態においては、腫瘍抗原に対して）免疫応答を誘発し得る。上記免疫応答は、抗体応答（通常は、ＩｇＧを含む）および／もしくは細胞媒介性免疫応答を含み得る。上記ポリペプチド免疫原は、代表的には、その対応する細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物（またはアレルゲンもしくは腫瘍）のポリペプチドを認識する免疫応答を誘発するが、いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物のサッカリドを認識する免疫応答を誘発するミモトープとして作用し得る。上記免疫原は、代表的には、表面ポリペプチド（例えば、アドヘシン、ヘマグルチニン、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質など）である。
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これら細菌のうちの１種に対して免疫応答を誘発する：
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ：有用な免疫原としては、膜タンパク質、例えば、アドヘシン、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、およびＨ因子結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。３種の有用なポリペプチドの組み合わせが、参考文献１３に開示される。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用なポリペプチド免疫原は、参考文献１４に開示される。これらとしては、ＲｒｇＢ線毛サブユニット、β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ前駆体（ｓｐｒ００５７）、ｓｐｒ００９６、一般的なストレスタンパク質（ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＧＳＰ−７８１（ｓｐｒ２０２１、ＳＰ２２１６）、セリン／スレオニンキナーゼＳｔｋＰ（ＳＰ１７３２）、および肺炎球菌表面アドヘシンＰｓａＡが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ：有用な免疫原としては、参考文献１５および１６に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：有用な百日咳免疫原としては、百日咳毒素もしくはトキソイド（ＰＴ）、線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、ペルタクチン、ならびに凝集原２および３が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：有用な免疫原としては、参考文献１７に開示されるポリペプチド（例えば、溶血素、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＢ、フェリクロム結合タンパク質（ｓｔａ００６）および／もしくはｓｔａ０１１リポプロテイン）が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ：代表的な免疫原は、破傷風トキソイドである。
Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ：代表的な免疫原は、ジフテリアトキソイドである。
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ：有用な免疫原としては、参考文献１８および１９に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献１５に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：有用な免疫原としては、ＰｅｐＡ、ＬｃｒＥ、ＡｒｔＪ、ＤｎａＫ、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様、Ｌ７／Ｌ１２、ＯｍｃＡ、ＡｔｏＳ、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ、ＨｔｒＡおよびＭｕｒＧ（例えば、参考文献２０に開示されるとおり）が挙げられるが、これらに限定されない。ＬｃｒＥ［２１］およびＨｔｒＡ［２２］は、２つの好ましい免疫原である。
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献２３に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ：有用な免疫原としては、ＣａｇＡ、ＶａｃＡ、ＮＡＰ、および／もしくはウレアーゼ［２４］が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：有用な免疫原としては、腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性（ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ ａｄｈｅｒｉｎｇ）Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）および／もしくは腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）に由来する免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。ＥｘＰＥＣ株としては、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）および髄膜炎／敗血症関連Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＮＥＣ）が挙げられる。有用なＵＰＥＣポリペプチド免疫原は、参考文献２５および２６に開示される。有用なＭＮＥＣ免疫原は、参考文献２７に開示される。いくつかのＥ．ｃｏｌｉタイプに有用な免疫原は、ＡｃｆＤである［２８］。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ
Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ：有用な免疫原としては、参考文献２９および３０に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これらウイルスのうちの１種に対して免疫応答を誘発する：
オルソミクソウイルス：有用な免疫原は、インフルエンザＡ、ＢもしくはＣウイルスに由来し得る（例えば、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼもしくはマトリクスＭ２タンパク質）。上記免疫原がインフルエンザＡウイルスヘマグルチニンである場合、それは、任意のサブタイプ（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６）に由来し得る。
パラミクソウイルス科のウイルス：ウイルス免疫原としては、肺炎ウイルス（例えば、ＲＳウイルス、ＲＳＶ）、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザ・ウイルス）、メタニューモウイルスおよびモルビリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
ポックスウイルス科：ウイルス免疫原としては、オルトポックスウイルス（例えば、真正痘瘡（大痘瘡および小痘瘡が挙げられるが、これらに限定されない））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
ピコルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルスおよびアフトウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、上記エンテロウイルスは、ポリオウイルス（例えば、１型、２型、および／もしくは３型のポリオウイルス）である。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、ＥＶ７１エンテロウイルスである。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、コクサッキーＡもしくはＢウイルスである。
ブンヤウイルス：ウイルス免疫原としては、オルソブンヤウイルス（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス（例えば、リフトバレー熱ウイルス）、もしくはナイロウイルス（例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
ヘパルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパルナウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
フィロウイルス：ウイルス免疫原としては、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス（ザイールエボラウイルス、アイボリーコーストエボラウイルス、レストンエボラウイルスもしくはスーダンエボラウイルスを含む））またはマールブルグウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
トガウイルス：ウイルス免疫原としては、トガウイルス（例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、もしくはアルテリウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。これは、風疹ウイルスを含む。
フラビウイルス：ウイルス免疫原としては、フラビウイルス（例えば、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング（１、２、３もしくは４型）ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ウエストナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
ペスチウイルス：ウイルス免疫原としては、ペスチウイルス（例えば、牛ウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、豚コレラ（ＣＳＦＶ）もしくはボーダー病（ＢＤＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
ヘパドナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含み得る。
他の肝炎ウイルス：組成物は、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、もしくはＧ型肝炎ウイルスに由来する免疫原を含み得る。
ラブドウイルス：ウイルス免疫原としては、ラブドウイルス（例えば、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
カリシウイルス科：ウイルス免疫原としては、カリシウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）、およびノーウォーク様ウイルス（例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルス））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
コロナウイルス：ウイルス免疫原は、ＳＡＲＳコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチドであり得る。
レトロウイルス：ウイルス免疫原としては、オンコウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２）またはスプマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
レオウイルス：ウイルス免疫原としては、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、もしくはコルチウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
パルボウイルス：ウイルス免疫原としては、パルボウイルスＢ１９に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
ヘルペスウイルス：ウイルス免疫原としては、ヒトヘルペスウイルス（例えば、例示に過ぎないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
パポバウイルス：ウイルス免疫原としては、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記（ヒト）パピローマウイルスは、血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３もしくは６５のもの（例えば、血清型６、１１、１６および／もしくは１８のうちの１種以上に由来する）であり得る。
アデノウイルス：ウイルス免疫原としては、アデノウイルス血清型３６（Ａｄ−３６）に由来するものが挙げられる。
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、魚類に感染するウイルス（例えば：伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、アメリカナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（大西洋サケピコルナ様ウイルスとしても公知）、ヤマメウイルス（ＬＳＶ）、大西洋サケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（ＴＳＤ）、銀ザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、もしくはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ））に対する免疫応答を誘発する。
真菌免疫原は、皮膚糸状菌類（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）（以下が挙げられる：
に由来し得る。
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅもしくはＰ．ｏｖａｌｅ）に由来する寄生生物に対する免疫応答を誘発する。従って、本発明は、マラリアに対して免疫化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科に由来する寄生生物、特に、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属およびＣａｌｉｇｕｓ属に由来する寄生生物（例えば、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ ｓａｌｍｏｎｉｓもしくはＣａｌｉｇｕｓ ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉのようなフナムシ）に対する免疫応答を誘発する。
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下に対する免疫応答を誘発する：花粉アレルゲン（樹木花粉、草本花粉、雑草の花粉、および草の花粉のアレルゲン）；昆虫もしくは蛛形類のアレルゲン（吸入、唾液および毒液のアレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲンおよび小虫アレルゲン、膜翅類毒液アレルゲン（ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ ｖｅｎｏｍ ａｌｌｅｒｇｅｎ））；動物の毛およびふけのアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどに由来する）；ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）。樹木、草および草本に由来する重要な花粉アレルゲンは、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓの分類学上の目およびスズカケノキ科（ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）（カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、シーダー（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない）、Ｐｏａｌｅｓの目（属Ｌｏｌｉｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ、およびＳｏｒｇｈｕｍの草が挙げられる）、ＡｓｔｅｒａｌｅｓおよびＵｒｔｉｃａｌｅｓの目（属Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、およびＰａｒｉｅｔａｒｉａの草本が挙げられる）から由来するそのようなものである。他の重要な吸入アレルゲンは、属ＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓおよびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓのチリダニ類、コナダニ類（ｓｔｏｒａｇｅ ｍｉｔｅ）（例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、ＧｌｙｃｙｐｈａｇｕｓおよびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓ）、ゴキブリ、小虫およびノミに由来するもの（例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、ＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓおよびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ）、ならびに哺乳動物（例えば、ネコ、イヌおよびウマ）に由来するもの、毒液のアレルゲン（刺咬昆虫（ｓｔｉｎｇｉｎｇ ｏｒ ｂｉｔｉｎｇ ｉｎｓｅｃｔ）に由来するようなもの、例えば、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａの分類学上の目（蜂（Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）が挙げられる）が挙げられる）に由来するものである。
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下から選択される腫瘍抗原である：（ａ）がん−精巣（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ）抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＭＡＧＥファミリーのポリペプチド（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２）、これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用され得る；（ｂ）変異した抗原、例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍（例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん）と関連）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓がんおよび結腸直腸がんと関連）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫と関連）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫と関連）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部がんと関連）、ＣＩＡ ０２０５（例えば、膀胱がんと関連）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、β−カテニン（例えば、黒色腫と関連）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫と関連）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＫＩＡ ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病と関連）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、ＷＴ １（例えば、種々の白血病と関連）、炭酸脱水酵素（例えば、腎がんと関連）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんと関連）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫と関連）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんと関連）、マンマグロビン、α−フェトプロテイン（例えば、肝がんと関連）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガストリン（例えば、膵臓がんおよび胃がんと関連）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳がんおよび卵巣がんと関連）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞がんと関連）、ｐ５３（例えば、乳がん、結腸がんと関連）、ならびにがん胎児性抗原（例えば、乳がん、肺がん、および胃腸管のがん（例えば、結腸直腸がん）と関連）；（ｄ）共通抗原（ｓｈａｒｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫と関連）；（ｅ）前立腺関連抗原（例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２（例えば、前立腺がんと関連））；（ｆ）イムノグロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫と関連）。特定の実施形態において、腫瘍免疫原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バー・ウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原（Ｅ６およびＥ７を含む）、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの抗原、ヒトＴリンパ球向性ウイルス抗原、
（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなど。
（遺伝子治療）
いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、遺伝子治療の状況において有用であるポリペプチドをコードする。このコードされるタンパク質は、ＲＮＡが自己複製する能力に関してコードされる任意のポリペプチドに加えて、提供される。従って、上記ＲＮＡは、酵素（例えば、ＲＮＡに結合しない酵素）、サイトカイン、膜貫通レセプター、イオンチャネル、ホルモン、血液タンパク質、もしくは抗体をコードし得る。上記ＲＮＡは、好ましくは、これらカテゴリーの中のヒトポリペプチドをコードする。
目的の酵素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼδ。
目的のサイトカインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：：インターロイキン１；インターロイキン２；インターロイキン４；インターロイキン６；インターロイキン７；インターロイキン１２；インターロイキン１７；ＧＭ−ＣＳＦ；Ｇ−ＣＳＦ；ＴＮＦ−α；インターフェロンα；インターフェロンβ；インターフェロンγ；およびセクレトニューリン（ｓｅｃｒｅｔｏｎｅｕｒｉｎ）。
目的のレセプターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：レプチンレセプター；低密度リポタンパク質レセプター；骨形態形成タンパク質タイプ２レセプター；ＴＮＦレセプター；ゴナドトロピン放出ホルモンレセプター；ドパミンレセプター；ソマトスタチンレセプター；ビタミンＤレセプター；ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーターレセプター；トランスフェリンレセプターなど。
目的のイオンチャネルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＨＣＮ２；ＨＣＮ４；ＣＦＴＲ；Ｍａｘｉ−Ｋチャネルのα−サブユニット；ＫＣＮＱ２；ＫＣＮＱ３；およびＫｖ１．５。
目的のホルモンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：絨毛性ゴナドトロピン；コルチコトロピン；エリスロポエチン；グルカゴン；ＩＧＦ−１；オキシトシン；血小板由来増殖因子；カルシトニン；卵胞刺激ホルモン；黄体形成ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；インスリン；ゴナドトロピン放出ホルモン；バソプレシン；ソマトスタチン；プロラクチン；副腎皮質刺激ホルモン；抗利尿ホルモン；甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン；オクトレオチド；ヒト成長ホルモン；リラキシン；成長ホルモン放出ホルモン；副甲状腺ホルモン；カルシトリオール（ｃａｌｃｉｔｒｏｌ）；カルシフェロール；心房性ナトリウム利尿ペプチド；ガストリン；セクレチン；コレシストキニン；レプチン；神経ペプチドＹ；グレリン；アンギオテンシノーゲン；ドパミン；およびトロンボポエチン。ホルモンが、活性に複数のポリペプチドサブユニットを要する場合、上記ＲＮＡは、このようなサブユニットのうちの１個以上をコードし得る。例えば、上記ＲＮＡは、卵胞刺激ホルモンのαサブユニットおよび／もしくはβサブユニットをコードし得る。
目的の血液タンパク質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヘモグロビン；フィブリノゲン；第ＶＩＩ因子；第ＶＩＩａ因子；第ＶＩＩＩ因子；第ＩＸ因子；フィブリノゲン；トロンビン；フォンビルブラント因子。
（薬学的組成物）
本発明のリポソームは、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物中の成分として有用である。これらの組成物は、代表的には、上記リポソームに加えて、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアの詳細な考察は、参考文献３１において入手可能である。
本発明の薬学的組成物は、１種以上の低分子免疫強化因子を含み得る。例えば、上記組成物は、ＴＬＲ２アゴニスト（例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（例えば、Ｅ６０２０））、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、イミキモド）、ＴＬＲ８アゴニスト（例えば、レシキモド）および／もしくはＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＩＣ３１）を含み得る。任意のこのようなアゴニストは、理想的には、分子量＜２０００Ｄａを有する。いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、リポソーム内に上記ＲＮＡと共に被包されるが、他の実施形態において、それらは、被包されない。
本発明の薬学的組成物は、上記リポソームを、ただの水（ｐｌａｉｎ ｗａｔｅｒ）（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）もしくは緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、もしくはクエン酸緩衝液）中に含み得る。緩衝塩は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲において含まれる。
本発明の薬学的組成物は、５．０〜９．５（例えば、６．０〜８．０）のｐＨを有し得る。
本発明の組成物は、張度を与えるために、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌの濃度が代表的である（例えば、約９ｍｇ／ｍｌ）。
本発明の組成物は、金属イオンキレート化剤を含み得る。これらは、ホスホジエステル加水分解を加速し得るイオンを除去することによって、ＲＮＡ安定性を延長し得る。従って、組成物は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ペンテト酸などのうちの１種以上を含み得る。このようなキレート化剤は、代表的には、１０〜５００μＭ（例えば、０．１ｍＭ）で存在する。クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）はまた、キレート化剤として作用し得るのと同時に、有利なことには、緩衝化活性も提供し得る。
本発明の薬学的組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、もしくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の重量オスモル濃度を有し得る。
本発明の薬学的組成物は、１種以上の保存剤（例えば、チオメルサールもしくは２−フェノキシエタノール）を含み得る。水銀非含有組成物が好ましく、保存剤非含有ワクチンが調製され得る。
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、無菌である。
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準尺度）、および好ましくは、１用量あたり＜０．１ ＥＵを含む）。
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
本発明の薬学的組成物は、単位用量形態において調製され得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、０．１〜１．０ｍｌ（例えば、約０．５ｍｌ）の容積を有し得る。
上記組成物は、注射物として調製され得る（溶液もしくは懸濁物のいずれかとして）。上記組成物は、微細スプレーを使用する、肺投与（例えば、吸入器による）のために調製され得る。上記組成物は、鼻、耳もしくは眼への投与（例えば、スプレーもしくは滴剤として）のために調製され得る。筋肉内投与のための注射物が、代表的である。
組成物は、免疫学的に有効量のリポソーム、ならびに任意の他の成分（必要であれば）を含む。「免疫学的に有効な量」とは、個体への投与量が、単一用量においてもしくはシリーズのうちの一部としてのいずれかで、処置もしくは予防に有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康状態および身体的状態、処置されるべき個体の年齢、分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、上記個体が抗体を合成する免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、その処置している医師の医学的状況の評価、および他の関連因子に依存して変動する。上記量は、慣用的な治験を通じて決定され得る比較的広い範囲に入ると予測される。本発明の組成物のリポソームおよびＲＮＡ含有量は、一般に、１用量あたりのＲＮＡの量に関して表される。好ましい用量は、≦１００μｇ ＲＮＡ（例えば、１０〜１００μｇ（例えば、約１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇもしくは１００μｇ））を有するが、発現は、遙かに低いレベル、例えば、≦１μｇ／用量、≦１００ｎｇ／用量、≦１０ｎｇ／用量、≦１ｎｇ／用量などにおいてみられ得る。
本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含む送達デバイス（例えば、シリンジ、ネブライザ、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなど）を提供する。このデバイスは、上記組成物を脊椎動物被験体に投与するために使用され得る。
本発明のリポソームは、リボソームを含まない。
（処置方法および医学的使用）
参考文献１２において開示される粒子とは対照的に、本発明のリポソームおよび薬学的組成物は、目的の免疫原に対する免疫応答を誘発するために、もしくは遺伝子治療のために、インビボでの使用に関する。
本発明は、脊椎動物における免疫応答を惹起するための方法を提供し、上記方法は、本発明のリポソームもしくは薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する。上記免疫応答は、好ましくは、防御的であり、好ましくは、抗体および／もしくは細胞媒介性免疫を伴う。上記方法は、ブースター応答を惹起し得る。
本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための方法において使用するための、本発明のリポソームもしくは薬学的組成物を提供する。
本発明はまた、脊椎動物における遺伝子治療の方法において使用するための、本発明のリポソームもしくは薬学的組成物を提供する。
本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明のリポソームの使用を提供する。
これら使用および方法により上記脊椎動物における免疫応答を惹起することによって、上記脊椎動物は、上記で考察されるように、種々の疾患および／もしくは感染から（例えば、細菌疾患および／もしくはウイルス疾患から）防御され得る。上記リポソームおよび組成物は、免疫原性であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従うワクチンは、予防的である（すなわち、感染を妨ぐ）か、もしくは治療的である（すなわち、感染を処置する）のいずれかであり得るが、代表的には、予防的である。
上記脊椎動物は、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトもしくは大型の獣医学的哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ）である。上記ワクチンが予防的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、小児（例えば、幼児もしくは乳児）またはティーンエイジャーである；上記ワクチンが治療的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、ティーンエイジャーもしくは成人である。小児用に意図されたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。従って、ヒト患者は、１歳未満、５歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院患者、ヘルスケアワーカー、軍従事者、および軍職員、妊婦、慢性疾患患者、もしくは免疫不全患者である。しかし、上記ワクチンは、これらの群にのみ適切であるわけではなく、より一般に、集団において使用され得る。
本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射によって達成され得る（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、もしくは組織の間隙空間に；参考文献１とは異なり、舌内（ｉｎｔｒａｇｌｏｓｓａｌ）注射は、代表的には、本発明で使用されない）。代替の送達経路としては、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、口内、舌下、膣、局所、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻内、眼、耳、肺もしくは他の粘膜投与が挙げられる。皮内および筋肉内投与は、２つの好ましい経路である。注射は、針を介してであってもよい（例えば、皮下針）が、針なしの注射が、代わりに使用され得る。代表的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。
本発明は、全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、好ましくは、増強された全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、使用され得る。
投与量は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、一次免疫スケジュールにおいて、および／もしくはブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同じ経路もしくは異なる経路（例えば、非経口の一次と粘膜のブースト、粘膜の一次と非経口のブーストなど）によって与えられ得る。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間間隔を空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。一実施形態において、複数用量は、生後約６週間、１０週間、および１４週間で（例えば、世界保健機関のＥｘｐａｎｄｅｄ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ（「ＥＰＩ」）においてしばしば使用されるように、６週齢、１０週齢および１４週齢において）投与され得る。代替の実施形態において、２回の一次用量が、約２ヶ月間間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター用量が、２回目の一次用量の約６ヶ月から１年後に（例えば、２回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後）投与される。さらなる実施形態において、３回の一次用量が、約２ヶ月間間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター用量が、３回目の一次用量の約６ヶ月後から１年後に（例えば、３回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後）投与される。
（化学用語および定義）
（ハロ）
用語「ハロゲン」（もしくは「ハロ」）は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を含む。
（アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルなど）
用語「アルキル」、「アルキレン」、「アルケニル」および「アルキニル」とは、直鎖および分枝鎖の両方の非環式形態に言及するために本明細書で使用される。その環式類似体は、シクロアルキルなどといわれる。
用語「アルキル」は、一価の直鎖状もしくは分枝状の、飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルキルは、Ｃ１−１０アルキルであり、別の実施形態において、Ｃ１−６アルキルであり、別の実施形態において、Ｃ１−４アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピルもしくはｔ−ブチル基）である。
用語「シクロアルキル」とは、一価で飽和の環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、シクロアルキルは、Ｃ３−１０シクロアルキルであり、別の実施形態において、Ｃ３−６シクロアルキル（例えば、シクロペンチルおよびシクロヘキシル）である。
用語「アルコキシ」とは、アルキル−Ｏ−を意味する。
用語「アルケニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有し、そして一実施形態において、炭素−炭素三重結合を有さない、一価で、直鎖状もしくは分枝状の、不飽和の非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルケニルは、Ｃ２−１０アルケニルであり、別の実施形態において、Ｃ２−６アルケニルであり、別の実施形態において、Ｃ２−４アルケニルである。
用語「シクロアルケニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有し、そして一実施形態において、炭素−炭素三重結合を有さない、一価の、部分不飽和の環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、シクロアルケニルは、Ｃ３−１０シクロアルケニルであり、別の実施形態において、Ｃ５−１０シクロアルケニル（例えば、シクロヘキセニルもしくはベンゾシクロヘキシル）である。
用語「アルキニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有し、そして一実施形態において、炭素−炭素二重結合を有さない、一価の、直鎖状もしくは分枝状の、不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルキニルは、Ｃ２−１０アルキニルであり、別の実施形態において、Ｃ２−６アルキニルであり、別の実施形態において、Ｃ２−４アルキニルである。
用語「シクロアルキニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有し、そして一実施形態において、炭素−炭素二重結合を有さない、一価の、部分不飽和の環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、シクロアルキニルは、Ｃ３−１０シクロアルケニルであり、別の実施形態において、Ｃ５−１０シクロアルキニルである。
用語「アルキレン」は、二価の、直鎖状もしくは分枝状の、飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルキレンは、Ｃ１−１０アルキレンであり、別の実施形態において、Ｃ１−６アルキレンであり、別の実施形態において、Ｃ１−４アルキレン（例えば、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、ｉ−プロピレンもしくはｔ−ブチレン基）である。
用語「アルケニレン」は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有し、そして一実施形態において、炭素−炭素三重結合を有さない、二価の、直鎖状もしくは分枝状の、不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルケニレンは、Ｃ２−１０アルケニレンであり、別の実施形態において、Ｃ２−６アルケニレンであり、別の実施形態において、Ｃ２−４アルケニレンである。
用語「アルキニレン」は、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有し、そして一実施形態において、炭素−炭素二重結合を有さない、二価の、直鎖状もしくは分枝状の不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルキニレンは、Ｃ２−１０アルキニレンであり、別の実施形態において、Ｃ２−６アルキニレンであり、別の実施形態において、Ｃ２−４アルキニレンである。
（ヘテロアルキルなど）
用語「ヘテロアルキル」は、最大６個までの炭素原子、一実施形態においては、最大５個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大４個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大３個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大２個までの炭素原子、別の実施形態においては、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑ、Ｎ、Ｐ（Ｏ）ｒもしくはＳｉ（そして好ましくは、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑもしくはＮ）で独立して各々置換されているが、アルキル炭素原子のうちの少なくとも１個は残っている、アルキル基を含む。上記ヘテロアルキル基は、Ｃ連結もしくはヘテロ連結され得る。すなわち、上記ヘテロアルキル基は、炭素原子を介して、またはＯ、Ｓ（Ｏ）ｑ、Ｎ、Ｐ（Ｏ）ｒもしくはＳｉを介して、分子の残りに連結され得る。
用語「ヘテロシクロアルキル」は、最大６個までの炭素原子、一実施形態においては、最大５個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大４個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大３個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大２個までの炭素原子、別の実施形態においては、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑもしくはＮで各々独立して置換されているが、シクロアルキル炭素原子のうちの少なくとも１個は残っている、シクロアルキル基を含む。ヘテロシクロアルキル基の例としては、以下が挙げられる：オキシラニル、チアラニル、アジリジニル、オキセタニル、チアタニル、アゼチジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジニル、１，４−ジオキサニル、１，４−オキサチアニル、モルホリニル、１，４−ジチアニル、ピペラジニル、１，４−アザチアニル、オキセパニル、チエパニル、アゼパニル、１，４−ジオキセパニル、１，４−オキサチエパニル、１，４−オキサアゼパニル、１，４−ジチエパニル、１，４−チエアゼパニルおよび１，４−ジアゼパニル。上記ヘテロシクロアルキル基は、Ｃ連結されてもよいし、Ｎ連結されてもよい。すなわち、上記ヘテロシクロアルキル基は、炭素原子を介して、もしくは窒素原子を介して、分子の残りに連結され得る。
用語「ヘテロアルケニル」は、最大３個までの炭素原子、一実施形態においては、最大２個までの炭素原子、別の実施形態においては、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑもしくはＮで各々独立して置換されているが、アルケニル炭素原子のうちの少なくとも１個は残っている、アルケニル基を含む。上記ヘテロアルケニル基は、Ｃ連結されてもよいし、ヘテロ連結されてもよい。すなわち、上記ヘテロアルケニル基は、炭素原子を介して、またはＯ、Ｓ（Ｏ）ｑもしくはＮを介して、分子の残りに連結され得る。
用語「ヘテロシクロアルケニル」は、最大３個までの炭素原子、一実施形態においては、最大２個までの炭素原子、別の実施形態においては、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑもしくはＮで各々独立して置換されているが、シクロアルケニル炭素原子のうちの少なくとも１個は残っている、シクロアルケニル基を含む。ヘテロシクロアルケニル基の例としては、以下が挙げられる：３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、５−６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、２Ｈ−ピラニル、１，２，３，４−テトラヒドロピリジニルおよび１，２，５，６−テトラヒドロピリジニル。上記ヘテロシクロアルケニル基は、Ｃ連結されてもよいし、Ｎ連結されてもよい。すなわち、上記ヘテロシクロアルケニル基は、炭素原子を介して、もしくは窒素原子を介して、分子の残りに連結され得る。
用語「ヘテロアルキニル」は、最大３個までの炭素原子、一実施形態においては、最大２個までの炭素原子、別の実施形態においては、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑもしくはＮで各々独立して置換されているが、アルキニル炭素原子のうちの少なくとも１個は残っている、アルキニル基を含む。上記ヘテロアルキニル基は、Ｃ連結されてもよいし、ヘテロ連結されてもよい。すなわち、上記ヘテロアルキニル基は、炭素原子を介して、またはＯ、Ｓ（Ｏ）ｑもしくはＮを介して、分子の残りに連結され得る。
用語「ヘテロシクロアルキニル」は、最大３個までの炭素原子、一実施形態においては、最大２個までの炭素原子、別の実施形態においては、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑもしくはＮで各々独立して置換されているが、シクロアルキニル炭素原子のうちの少なくとも１個は残っている、シクロアルキニル基を含む。上記ヘテロシクロアルケニル基は、Ｃ連結されてもよいし、Ｎ連結されてもよい。すなわち、上記ヘテロシクロアルケニル基は、炭素原子を介して、もしくは窒素原子を介して、分子の残りに連結され得る。
用語「ヘテロアルキレン」は、最大３個までの炭素原子、一実施形態において、最大２個までの炭素原子、別の実施形態において、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑもしくはＮで各々独立して置換されているが、アルキレン炭素原子のうちの少なくとも１個は残っている、アルキレン基を含む。
用語「ヘテロアルケニレン」は、最大３個までの炭素原子、一実施形態においては、最大２個までの炭素原子、別の実施形態においては、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑもしくはＮで各々独立して置換されているが、アルケニレン炭素原子のうちの少なくとも１個は残っている、アルケニレン基を含む。
用語「ヘテロアルキニレン」は、最大３個までの炭素原子、一実施形態においては、最大２個までの炭素原子、別の実施形態においては、１個の炭素原子が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑもしくはＮで各々独立して置換されているが、アルキニレン炭素原子のうちの少なくとも１個は残っている、アルキニレン基を含む。
（アリール）
用語「アリール」は、一価の芳香族環式ヒドロカルビル基（例えば、フェニルもしくはナフチル（例えば、１−ナフチルもしくは２−ナフチル））を含む。一般に、上記アリール基は、単環式もしくは多環式の縮合環芳香族基であり得る。好ましいアリールは、Ｃ６−Ｃ１４アリールである。
アリール基の他の例は、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インデン、ナフタレン、オバレン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレンおよびルビセンの一価誘導体である。
用語「アリールアルキル」は、アリール基（例えば、ベンジル）で置換されたアルキルを意味する。
用語「アリーレン」は、二価の芳香族環式ヒドロカルビル基（例えば、フェニレン）を含む。一般に、上記アリーレン基は、単環式もしくは多環式の縮合環芳香族基であり得る。好ましいアリーレンは、Ｃ６−Ｃ１４アリーレンである。アリーレン基の他の例は、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インデン、ナフタレン、オバレン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレンおよびルビセンの二価誘導体である。
（ヘテロアリール）
用語「ヘテロアリール」は、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＮＲＮから独立して選択される１個以上のヘテロ原子を追加的に含む、一価ヘテロ芳香族の環式ヒドロカルビル基であって、ここでＲＮは、以下に定義される（および一実施形態においては、Ｈもしくはアルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）である）。
一般に、上記ヘテロアリール基は、単環式もしくは多環式（例えば、二環式）縮合環ヘテロ芳香族基であり得る。一実施形態において、ヘテロアリール基は、５〜１３個の環員（好ましくは、５〜１０員）、ならびにＯ、Ｓ、ＮおよびＮＲＮから独立して選択される１個、２個、３個もしくは４個の環ヘテロ原子を含む。一実施形態において、ヘテロアリール基は、５員、６員、９員もしくは１０員、例えば、５員の単環式、６員の単環式、９員の縮合二環式環もしくは１０員の縮合二環式環であり得る。
単環式ヘテロ芳香族基は、５〜６環員、ならびにＯ、Ｓ、ＮもしくはＮＲＮから選択される１個、２個、３個もしくは４個のヘテロ原子を含むヘテロ芳香族基を包含する。
一実施形態において、５員の単環式ヘテロアリール基は、−ＮＲＮ−基、−Ｏ−原子もしくは−Ｓ−原子である１個の環員、および必要に応じて、＝Ｎ−原子である１〜３個の環員（例えば、１個もしくは２個の環員）を含む（ここで上記５個の環員のうちの残りは、炭素原子である）。
５員の単環式ヘテロアリール基の例は、ピロリル、フラニル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、１，２，３ トリアゾリル、１，２，４ トリアゾリル、１，２，３ オキサジアゾリル、１，２，４ オキサジアゾリル、１，２，５ オキサジアゾリル、１，３，４ オキサジアゾリル、１，３，４ チアジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、１，３，５ トリアジニル、１，２，４ トリアジニル、１，２，３ トリアジニルおよびテトラゾリルである。
６員の単環式ヘテロアリール基の例は、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニルおよびピラジニルである。
一実施形態において、６員の単環式ヘテロアリール基は、＝Ｎ−原子である１個もしくは２個の環員を含む（ここで上記６個の環員のうちの残りは、炭素原子である）。
二環式のヘテロ芳香族基としては、９〜１３個の環員およびＯ、Ｓ、ＮもしくはＮＲＮから選択される１個、２個、３個もしくは４個以上のヘテロ原子を含む縮合環のヘテロ芳香族基が挙げられる。
一実施形態において、９員の二環式ヘテロアリール基は、−ＮＲＮ−基、−Ｏ−原子もしくは−Ｓ−原子である１個の環員、および必要に応じて、＝Ｎ−原子である１〜３個の環員（例えば、１個もしくは２個の環員）を含む（ここで上記９個の環員のうちの残りは、炭素原子である）。
９員の縮合環の二環式ヘテロアリール基の例は、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニル、ピロロ［２，３−ｃ］ピリジニル、ピロロ［３，２−ｃ］ピリジニル、ピロロ［３，２−ｂ］ピリジニル、イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジニル、イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジニル、ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリジニル、ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジニル、ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジニル、ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジニル、イソインドリル、インダゾリル、プリニル、インドリニニル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、イミダゾ［１，５−ａ］ピリジニル、ピラゾロ［１，２−ａ］ピリジニル、ピロロ［１，２−ｂ］ピリダジニルおよびイミダゾ［１，２−ｃ］ピリミジニルである。
一実施形態において、１０員の二環式ヘテロアリール基は、＝Ｎ−原子である１〜３個の環員を含む（ここで上記１０個の環員のうちの残りは、炭素原子である）。
１０員の縮合環の二環式ヘテロアリール基の例は、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、１，６−ナフチリジニル、１，７−ナフチリジニル、１，８−ナフチリジニル、１，５−ナフチリジニル、２，６−ナフチリジニル、２，７−ナフチリジニル、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジニル、ピリド［４，３−ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピリド［２，３−ｄ］ピリミジニル、ピリド［２，３−ｂ］ピラジニル、ピリド［３，４−ｂ］ピラジニル、ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジニル、ピラジノ［２，３−ｂ］ピラジニルおよびピリミド［４，５−ｄ］ピリミジニルである。
用語「ヘテロアリールアルキル」とは、ヘテロアリール基で置換されたアルキルを意味する。
用語「ヘテロアリーレン」は、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＮＲＮから独立して選択される１個以上のヘテロ原子を追加的に含む、二価のヘテロ芳香族の環式ヒドロカルビル基を含み、ここでＲＮは、以下で定義される（および一実施形態においては、Ｈもしくはアルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）である）。一般に、上記ヘテロアリーレン基は、単環式もしくは多環式（例えば、二環式）縮合環ヘテロ芳香族基であり得る。一実施形態において、ヘテロアリーレン基は、５〜１３個の環員（好ましくは、５〜１０員）、ならびにＯ、Ｓ、ＮおよびＮＲＮから独立して選択される１個、２個、３個もしくは４個の環ヘテロ原子を含む。一実施形態において、ヘテロアリーレン基は、５員、６員、９員もしくは１０員、例えば、５員の単環式、６員の単環式、９員の縮合環二環式もしくは１０員の縮合環二環式であり得る。用語「ヘテロアリーレン」は、上記で考察されるヘテロアリール基の各々の二価の誘導体を含む。
用語「アリール」、「芳香族」、「ヘテロアリール」および「ヘテロ芳香族」はまた、部分的に還元されている基を含む。従って、例えば、「ヘテロアリール」は、環のうちの１個が、飽和環へと還元された縮合種（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）を含む。
（存在しない基）
式（Ｉ）中の基ａ、ｂもしくはｃが「存在しない」場合、単結合が代わりに存在すること、すなわち、基ａ、ｂもしくはｃのうちのいずれかの側にある２個の基が、互いに直接結合されることを意味する。
（一般）
別段明示的に示されなければ、基の組み合わせが、１個の部分として本明細書で言及される場合（例えば、アリールアルキル）、その最後に言及される基は、上記部分を分子の残りに結合する原子を含む。
Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑ、ＮもしくはＰ（Ｏ）ｒで置換されているアルキル基もしくは他の基の炭素原子に対して言及がなされる場合、
が、
（ここでＥは、Ｈではない場合がある）
によって置換されているか；
−ＣＨ＝が、−Ｎ＝もしくは−Ｐ（Ｏ）ｒ＝によって置換されているか；
≡Ｃ−Ｈが、≡Ｎもしくは≡Ｐ（Ｏ）ｒによって置換されているか；または
−ＣＨ２−が、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｑ−、−ＮＲＮ−もしくは−Ｐ（Ｏ）ｒＲＮ−によって置換されていることが意図され、ここでＲＮは、Ｈ、あるいは必要に応じて置換された、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ヘテロアルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ３−６ヘテロシクロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６ヘテロアルケニル、Ｃ３−６シクロアルケニル、Ｃ３−６ヘテロシクロアルケニル、フェニル、または５個もしくは６個の環員を含むヘテロアリールである。ＲＮは、好ましくは、Ｈ、Ｃ１−６アルキルもしくはＣ３−６シクロアルキルである。
ｑは、独立して、０、１もしくは２である。一実施形態において、ｑは、０である。
ｒは、独立して、０もしくは１である。一実施形態において、ｒは、０である。
Ｓｉで置換されている炭素原子に対して言及がなされる場合、上記炭素原子が、ケイ素原子で交換されているが、他の点で、結合は同じままであることが意図される。従って、例えば、−ＣＨ２−は、−ＳｉＨ２−で置換され；−ＣＨ＝は、−ＳｉＨ＝で置換され；そして≡Ｃ−Ｈは、≡Ｓｉ−Ｈで置換される。
明瞭にするために、上記のヘテロ原子含有基（例えば、ヘテロアルキルなど）に関して、炭素原子の数が与えられる場合（例えば、Ｃ３−６ヘテロアルキル）、３〜６個の鎖炭素原子のうちの１個以上が、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑもしくはＮで置換されているＣ３−６アルキルに基づく基が意図される。よって、Ｃ３−６ヘテロアルキル基は、例えば、３〜６個未満の鎖炭素原子を含む。別の例として、ピリジル基は、これが５個の炭素原子を含むとしても、Ｃ６ヘテロアリール基として分類される。
（置換）
本発明の化合物の基（例えば、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンアリール、アリールアルキル、アリールヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキルもしくはヘテロアリールヘテロアルキル基など）は、置換されていてもよいし、置換されていなくてもよく、一実施形態においては、置換されていない。代表的には、置換は、置換基での水素原子の観念上の置換（もしくは＝Ｏによる置換の場合には、２個の水素原子）を含む。
置換される場合、一般に、各基には、１〜５個の置換基が存在し、一実施形態においては、１〜３個の置換基、一実施形態においては、１個もしくは２個の置換基、一実施形態においては、１個の置換基が存在する。一実施形態は、同じ原子上に１個超の置換基を含む（例えば、アセタール基）。
一実施形態において、上記置換基は、独立して、Ｓｕｂ１もしくはＳｕｂ２（一実施形態においては、Ｓｕｂ２）であり、ここで：
Ｓｕｂ１は、独立して、ハロゲン、トリハロメチル、トリハロエチル、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ＋（Ｒｓ）２Ｏ−、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒｓ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯＲｓ、−ＳＯ２Ｒｓ、−ＳＯ３Ｒｓ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲｓ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｓ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｓ、＝Ｏ、−ＮＲｓ ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｓ ２、−Ｎ（Ｒｓ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｓ、−Ｎ（Ｒｓ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｓ ２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｓ ２、−Ｎ（Ｒｓ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒｓ、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲｓ ２、−ＮＲｓＣ（＝Ｓ）Ｒｓ、−ＳＯ２ＮＲｓ ２、−ＮＲｓＳＯ２Ｒｓ、−Ｎ（Ｒｓ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＲｓ ２、−Ｎ（Ｒｓ）ＳＯ２ＮＲｓ ２、−Ｒｓもしくは−ＺｓＲｓであり、ここで；
Ｚｓは、独立して、Ｏ、ＳもしくはＮＲｓであり；
Ｒｓは、独立して、Ｈ、またはＣ１−６アルキル、Ｃ１−６ヘテロアルキル、−（Ａｌｋａ）ｆ−Ｃ３−６シクロアルキル、−（Ａｌｋａ）ｆ−Ｃ３−６ヘテロシクロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６ヘテロアルケニル、−（Ａｌｋａ）ｆ−Ｃ３−６シクロアルケニル、−（Ａｌｋａ）ｆ−Ｃ３−６ヘテロシクロアルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ２−６ヘテロアルキニル、−（Ａｌｋａ）ｆ−Ｃ６−１４アリール、−（Ａｌｋａ）ｆ−Ｃ６−１４アリールもしくは−（Ａｌｋａ）ｆ−ヘテロアリール（ここでヘテロアリールは、５〜１３個の環員を含む）であり、ここで
ｆは、０もしくは１であり；
Ａｌｋａは、Ｃ１−６アルキレンもしくはＣ１−６ヘテロアルキレンであり；そして
Ｒｓは、１〜３個の置換基Ｓｕｂ２によってそれ自体が必要に応じて置換され（一実施形態においては、置換されていない）；
Ｓｕｂ２は、独立して、ハロゲン、トリハロメチル、トリハロエチル、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ＋（Ｃ１−６アルキル）２Ｏ−、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯＣ１−６アルキル、−ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、−ＳＯ３Ｃ１−６アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ１−６アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ１−６アルキル、＝Ｏ、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｓ）Ｃ１−６アルキル、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ１−６ヘテロアルキル、−Ｃ３−６シクロアルキル、−Ｃ３−６ヘテロシクロアルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６ヘテロアルケニル、−Ｃ３−６シクロアルケニル、−Ｃ３−６ヘテロシクロアルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、−Ｃ２−６ヘテロアルキニル、−Ｃ６−１４アリール、−Ｃ５−１３ヘテロアリール、−Ｚｔ−Ｃ１−６アルキル、−Ｚｔ−Ｃ３−６シクロアルキル、−Ｚｔ−Ｃ２−６アルケニル、−Ｚｔ−Ｃ３−６シクロアルケニル、もしくは−Ｚｔ−Ｃ２−６アルキニルであり；そして
Ｚｔは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨもしくはＮ（Ｃ１−６アルキル）である。
Ｓｕｂ１におけるＲｓは、１〜３個の置換基Ｓｕｂ２によって必要に応じて置換され得る一方、Ｓｕｂ２は、置換されない。しかし、一実施形態において、Ｒｓは、置換されない。
一実施形態において、Ｒｓは、ＨもしくはＣ１−６アルキル（１〜３個の置換基Ｓｕｂ２で必要に応じて置換される）である。
一実施形態において、Ｓｕｂ２は、独立して、ハロゲン、トリハロメチル、トリハロエチル、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ＋（Ｃ１−６アルキル）２Ｏ−、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯＣ１−６アルキル、−ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ１−６アルキル、＝Ｏ、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ３−６シクロアルキル、−Ｃ３−６ヘテロシクロアルキル、−Ｚｔ−Ｃ１−６アルキルもしくは−Ｚｔ−Ｃ３−６シクロアルキルである。
一実施形態において、置換される基が非環式（例えば、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニルなど）である場合、Ｓｕｂ１は、−Ｒｓではなく、Ｓｕｂ２は、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ１−６ヘテロアルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６ヘテロアルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、−Ｃ２−６ヘテロアルキニルではない。
Ｓｕｂ２以外の基が、置換されてもよい少なくとも２個の位置を有する場合、上記基は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンもしくはヘテロアルキニレン鎖（一実施形態において、１〜６個の原子、さらなる実施形態においては、３〜６個の原子、およびさらなる実施形態においては、３個もしくは４個の原子を含む）の両方の末端によって置換されて、環式部分を形成してもよい。その鎖は、１〜３個の置換基Ｓｕｂ２で必要に応じて置換される。一実施形態において、その鎖は、置換されない。従って、用語、必要に応じて置換された、「シクロアルキル」、「シクロアルケニル」、「シクロアルキニル」、「ヘテロシクロアルキル」、「ヘテロシクロアルケニル」、「ヘテロシクロアルキニル」、「アリール」および「ヘテロアリール」は、縮合種を含む。例えば、「必要に応じて置換されたシクロアルキル」は、２個のシクロアルキル環が縮合している種を含み、「必要に応じて置換されたヘテロアリール」は、ヘテロシクロアルキル環が上記芳香族環に縮合されている種を含む（例えば、５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）。
Ｓｕｂ２以外の基が、２回置換され得る原子を有する場合、その原子は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンもしくはヘテロアルキニレン鎖（一実施形態においては、２〜８個の原子、さらなる実施形態においては、３〜６個の原子、およびさらなる実施形態においては、４個もしくは５個の原子を含む）の両方の末端によって置換されて、環式部分を形成し得る。その鎖は、１〜３個の置換基Ｓｕｂ２によって必要に応じて置換される。一実施形態において、その鎖は、置換されない。従って、用語、必要に応じて置換された、「シクロアルキル」、「シクロアルケニル」、「シクロアルキニル」、「ヘテロシクロアルキル」、「ヘテロシクロアルケニル」、「ヘテロシクロアルキニル」、「アリール」および「ヘテロアリール」は、スピロ種を含む。
明瞭さのために、基がヘテロ原子を含む場合、置換基は、上記ヘテロ原子に結合され得る。従って、例えば、「必要に応じて置換されたヘテロアルキル」は、−ＣＨ２−Ｎ（Ｓｕｂ１）−ＣＨ２−、−ＣＨ（Ｓｕｂ１）−ＮＨ−ＣＨ２−および−ＣＨ（Ｓｕｂ１）−Ｎ（Ｓｕｂ１）−ＣＨ２−などを含む。
（修飾語句（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）の用語）
列挙の前に修飾語句が置かれている場合、上記修飾語句は、上記列挙中の項目の各々に適用されると理解されるべきであると解釈される。例えば、語句「必要に応じて改変された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ５−２０−ヘテロアリール基」とは、上記列挙中の４つの項目の各々、すなわち、上記Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル基、上記Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル基、上記Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニル基および上記Ｃ６−２０−ヘテロアリール基が、必要に応じて置換されていてもよいことを意味する。
第１の修飾語句によって基が特徴付けられ、続いて、後ろで、同じ基が、続く修飾語句によって特徴付けられる場合、上記基は、両方の修飾語句によって同時に特徴付けられることが意味される。例えば、基が、「Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニル」（第１の修飾語句）基として記載され、その後、同じ基が、「Ｃ５−１６」（続く修飾語句）基として記載される場合、Ｃ５−１６ヘテロシクロアルキニル基であることが意味される。
（ステロイド）
本明細書で使用される場合、用語「ステロイド」とは、以下の構造を含む任意の基に言及する（その構造は、「ステロイド骨格」として本明細書で言及される）。
単に例示目的で、ステロイド骨格を、完全飽和として上記で描いた。しかし、用語ステロイドはまた、上記ステロイド骨格中に不飽和が存在する場合を包含すると解釈される。例えば、用語ステロイドは、完全不飽和（マンキュード）基本骨格を含む基を包含する（１５Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン）。
用語ステロイドはまた、部分不飽和ステロイド骨格を含む基を包含する。
用語ステロイドはまた、上記ステロイド骨格の「ｓｅｃｏ」誘導体、すなわち、開環がもたらされた基；それぞれ、環縮小および環拡大を伴う上記ステロイド骨格の「ノル」および「ホモ」誘導体（Ｄ． Ｈｅｌｌｗｉｎｋｅｌ，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ発行， ２００１， ＩＳＢＮ： ３−５４０−４１１３８−０，「ｓｅｃｏ」については２０３ページ、ならびに「ノル」および「ホモ」については２０４ページを参照のこと）を包含する。しかし、一実施形態において、このようなｓｅｃｏ誘導体は、用語「ステロイド」によっては包含されない。別の実施形態において、このようなノル誘導体は、用語「ステロイド」によっては包含されない。別の実施形態において、このようなホモ誘導体は、用語「ステロイド」によっては包含されない。従って、一実施形態において、このようなｓｅｃｏ、ノルおよびホモ誘導体は、用語「ステロイド」によっては包含されない。
用語ステロイドはまた、ステロイド骨格と表示された構造における炭素原子のうちの１個以上が、ヘテロ原子によって置換されている場合を包含する。１つのこのような実施形態において、最大６個までの炭素原子、一実施形態においては、最大５個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大４個までの炭素原子、別の実施形態において、最大３個までの炭素原子、別の実施形態において、最大２個までの炭素原子、別の実施形態においては、１個の炭素原子は、各々、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑ、Ｎ、Ｐ（Ｏ）ｒもしくはＳｉ（および好ましくは、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｑもしくはＮ）によって独立して置換されている。しかし、一実施形態において、用語「ステロイド」は、上記「ステロイド基本骨格」が、ヘテロ原子を含まない種を包含する。
ステロイド環系は、以下に示される慣例に従って番号づけられる。
用語ステロイドは、ステロール、ステロイドホルモン、胆汁酸および胆汁酸塩を包含する。ステロールは、Ａ環の３位においてヒドロキシル基を有する任意のステロイドである。
（不飽和）
標準的使用によれば、ω−３位とは、鎖の（メチル）末端からの３番目の結合に言及する；ω−６位とは、鎖の（メチル）末端からの６番目の結合に言及し、ω−９位は、鎖の（メチル）末端からの９番目の結合に言及する。
（一般）
本発明の粒子は、別段示されなければ、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の、当該分野の技術内の従来の方法を使用する。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、参考文献３２〜３８などを参照のこと。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから専らなってもよいし、何かさらなるものを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
数値ｘに関して用語「約」とは、選択的であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
語句「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。必要な場合、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
電荷、カチオン、アニオン、両性性イオンなどへの言及は、ｐＨ７において取り扱われる。
ＴＬＲ３は、Ｔｏｌｌ様レセプター３である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ３アゴニストは、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。「ＴＬＲ３」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１１８４９である。ヒトＴＬＲ３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２４５９６２５である。
ＴＬＲ７は、Ｔｏｌｌ様レセプター７である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ７アゴニストは、例えば、イミキモドを含む。「ＴＬＲ７」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３１である。ヒトＴＬＲ７遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：６７９４４６３８である。
ＴＬＲ８は、Ｔｏｌｌ様レセプター８である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ８アゴニストは、例えば、レシキモドを含む。「ＴＬＲ８」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３２である。ヒトＴＬＲ８遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０３０２１６５である。
ＲＩＧ−Ｉ様レセプター（「ＲＬＲ」）ファミリーは、先天的免疫系において重要な役割を果たす種々のＲＮＡヘリカーゼを含む［３９］。ＲＬＲ−１（ＲＩＧ−Ｉもしくはレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉとしても公知）は、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。上記ＲＬＲ−１ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＤＤＸ５８」（ＤＥＡＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）ボックスポリペプチド５８（ＤＥＡＤ （Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ） ｂｏｘ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ５８）について）であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１９１０２である。ヒトＲＬＲ−１遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：７７７３２５１４である。ＲＬＲ−２（ＭＤＡ５もしくは黒色腫分化関連遺伝子５（ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ５）としても公知）はまた、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。ＲＬＲ−２ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＩＦＩＨ１」（ヘリカーゼＣドメイン１で誘導されるインターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｌｉｃａｓｅ Ｃ ｄｏｍａｉｎ １）について）であり、特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１８８７３である。ヒトＲＬＲ−２遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ： ２７８８６５６７である。ＲＬＲ−３（ＬＧＰ２もしくは遺伝学および生理学研究室２（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２）としても公知）は、カスパーゼリクルートドメインを有さない。ＲＬＲ−３ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、 「ＤＨＸ５８」（ＤＥＸＨ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｈｉｓ）ボックスポリペプチド５８について）であり、特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：２９５１７である。ヒトＲＬＲ−３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：１４９４０８１２１である。
ＰＫＲは、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼである。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす。「ＥＩＦ２ＡＫ２」（真核生物翻訳開始因子２−αキナーゼ２（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ａｌｐｈａ ｋｉｎａｓｅ ２）について）は、この酵素をコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：９４３７である。ヒトＰＫＲ遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０８４３１８２５である。
図１は、染色されたＲＮＡを有するゲルを示す。レーンは、（１）マーカー、（２）裸のレプリコン、（３）ＲＮａｓｅ処理後のレプリコン、（４）リポソームに被包されたレプリコン、（５）ＲＮａｓｅ処理後のリポソーム、（６）ＲＮａｓｅで処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出に供したリポソーム、を示す。 図２は、リポソームの電子顕微鏡写真である。 図３は、様々なカチオン性脂質を用いたリポソームにおいてＲＮＡを送達した後、６日目でのタンパク質発現（相対光単位、ＲＬＵとして）を示す。 図４は、染色されたＲＮＡを有するゲルを示す。レーンは、（１）マーカー、（２）裸のレプリコン、（３）リポソームに被包されたレプリコン、（４）ＲＮａｓｅで処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出に供したリポソームを示す。 図５は、ビリオンパッケージングされたレプリコン（四角）として、裸のＲＮＡ（菱形）として、もしくはリポソーム中（＋＝０．１μｇ、×＝１μｇ）においてＲＮＡを送達した後、１日目、３日目および６日目でのタンパク質発現を示す。 図６は、リポソーム被包ＲＮＡの４種の異なる用量を送達した後、１日目、３日目および６日目でのタンパク質発現を示す。 図７は、ビリオンパッケージングされたレプリコン（ＶＲＰもしくはＶＳＲＰ）、１μｇ 裸のＲＮＡ、および１μｇ リポソーム被包ＲＮＡを与えられた動物における抗Ｆ ＩｇＧ力価を示す。 図８は、ＶＲＰ、１μｇ 裸のＲＮＡ、および０．１ｇもしくは１μｇのリポソーム被包ＲＮＡを与えられた動物における抗Ｆ ＩｇＧ力価を示す。 図９は、ＶＲＰ、または０．１ｇもしくは１μｇのリポソーム被包ＲＮＡのいずれかを与えられた動物における中和抗体力価を示す。 図１０は、裸のＲＮＡ（丸）、リポソーム被包ＲＮＡ（三角および四角）、またはリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）（逆三角）としてレプリコンを送達した後の発現レベルを示す。 図１１は、レプリコンを裸のＲＮＡとして（０．０１〜１μｇ）、リポソーム被包ＲＮＡとして（０．０１〜１０μｇ）、またはビリオンとしてパッケージングされたものとして（ＶＲＰ、１０６ 感染単位もしくはＩＵ）、送達した後のＦ特異的ＩｇＧ力価（２回目の用量後２週間）を示す。 図１２は、レプリコンを裸のＲＮＡとして（１μｇ）、リポソーム被包ＲＮＡとして（０．１もしくは１μｇ）、またはビリオンとしてパッケージングされたものとして（ＶＲＰ、１０６ ＩＵ）、送達した後のＦ特異的ＩｇＧ力価（丸）およびＰＲＮＴ力価（四角）を示す。ナイーブマウスの力価もまた、示す。実線は、幾何平均を示す。 図１３は、２回目の用量の４週間後、Ｆタンパク質中の主要なエピトープを表す合成ペプチドで再刺激した後の細胞内サイトカイン生成を示す。ｙ軸は、ＣＤ８＋ＣＤ４−の％サイトカイン＋を示す。 図１４は、０日目および２１日目での雌ウシの免疫化後６３日間にわたる、Ｆ特異的ＩｇＧ力価（平均ｌｏｇ１０力価±標準偏差）を示す。
（発明を実施するための態様）
（ＲＮＡレプリコン）
種々のレプリコンは、以下で使用される。一般に、これらは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に由来する非構造タンパク質、シンドビス・ウイルス由来のパッケージングシグナル、およびシンドビス・ウイルスもしくはＶＥＥＶ変異体に由来する３’ＵＴＲを有するハイブリッドアルファウイルスゲノムに基づく。上記レプリコンは、約１０ｋｂ長であり、ポリＡテールを有する。
アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドＤＮＡ（名称：ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＦＬ．ＲＳＶＦもしくはＡ３１７；ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＳＥＡＰもしくはＡ３０６；ｐＳＰ６−ＶＣＲ−ＧＦＰもしくはＡ５０）を、インビボでのＲＮＡ合成のテンプレートとして供した。上記レプリコンは、ＲＮＡ複製に必要とされるアルファウイルス遺伝的エレメントを含むが、粒子アセンブリに必要な遺伝子産物をコードするエレメントを欠いている；構造タンパク質は、代わりに、目的のタンパク質（レポーター（例えば、ＳＥＡＰもしくはＧＦＰ）または免疫原（例えば、全長ＲＳＶ Ｆタンパク質）のいずれか）によって置き換えられるので、上記レプリコンは、感染性粒子の生成を誘導できない。上記アルファウイルスｃＤＮＡの上流にあるバクテリオファージ（Ｔ７もしくはＳＰ６）プロモーターは、インビトロで上記レプリコンＲＮＡの合成を促進し、上記ポリ（Ａ）テールの直ぐ下流にあるデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムは、その自己切断活性を介して正確な３’末端を生成する。
適切な制限エンドヌクレアーゼで上記ＨＤＶリボザイムの下流で上記プラスミドＤＮＡを直線状にした後に、ランオフ転写物（ｒｕｎ−ｏｆｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を、Ｔ７もしくはＳＰ６バクテリオファージ由来ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロで合成した。転写を、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ）によって提供される指示書に従って、ヌクレオシドトリホスフェート（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）の各々の７．５ｍＭ（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）もしくは５ｍＭ（ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）の存在下で、３７℃において２時間にわたって行った。転写の後、上記テンプレートＤＮＡを、ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で消化した。上記レプリコンＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。キャップのないＲＮＡを、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇキャッピングシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ユーザーマニュアルに概説されるとおり、ワクシニアキャッピング酵素（ＶＣＥ）で転写後にキャップした；このようにキャップしたレプリコンに、「ｖ」の接頭文字を付ける（例えば、ｖＡ３１７は、ＶＣＥによってキャップされたＡ３１７レプリコンである）。転写後キャップされたＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。上記ＲＮＡサンプルの濃度を、ＯＤ２６０ｎｍを測定することによって決定した。上記インビトロ転写物の完全性を、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。
（ＤｌｉｎＤＭＡベースのリポソームにおける被包）
ＲＮＡを、実質的に、参考文献７および４０の方法によって作製したリポソーム中に被包した。上記リポソームを、１０％ ＤＳＰＣ（両性イオン性）、４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性）、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ結合体化ＤＭＧ（２ｋＤａ ＰＥＧ）から作製した。これら割合は、総リポソーム中の％モルに言及する。
ＤｌｉｎＤＭＡ（１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン）を、参考文献２の手順を使用して合成した。ＤＳＰＣ（１，２−ジアステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）を、Ｇｅｎｚｙｍｅから購入した。コレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ＰＥＧ結合体化ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール），アンモニウム塩）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン，塩化物塩）およびＤＣ−ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールヒドロクロリド）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓからであった。
簡潔には、脂質をエタノール（２ｍｌ）中に溶解し、ＲＮＡレプリコンを、緩衝液（２ｍｌ，１００ｍＭ クエン酸ナトリウム，ｐＨ６）中に溶解し、これらを２ｍｌの緩衝液と混合し、続いて、１時間平衡化させた。上記混合物を６ｍｌの緩衝液で希釈し、次いで、濾過した。得られた生成物は、リポソームを含み、約９５％の被包効率であった。図２は、これらの方法によって調製されるリポソームの例示的な電子顕微鏡写真である。これらリポソームは、全長ＲＳＶ Ｆ抗原をコードする被包化ＲＮＡを含む。１つのバッチの動的光散乱は、平均直径１４１ｎｍ（強度によるＺａｖ）もしくは７８ｎｍ（数で）を示した。
１つの特定の被包の方法において、新鮮な脂質ストック溶液を、エタノール中で調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ−結合体化ＤＭＧを秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中に溶解した。３種の異なる結合体化ＰＥＧを使用した：ＰＥＧ−１０００、ＰＥＧ−２０００、もしくはＰＥＧ−３０００。新たに調製した脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、２２６．７μＬの上記ストックを、１．７７３ｍＬ エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。ＲＮＡの２ｍＬ 作業溶液をまた、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の約１μｇ／μＬのストック溶液から調製した。３つの２０ｍＬ ガラスバイアル（撹拌子有り）を、ＲＮａｓｅ Ａｗａｙ溶液ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、上記バイアルのＲＮＡｓｅの汚染を除去した。上記バイアルのうちの１つを、上記ＲＮＡ作業溶液に使用し、他のものを脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した（後に記載されるとおり）。作業脂質溶液およびＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ ルアーロックシリンジに入れた。２ｍＬ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃ シリンジに入れた。ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、ＦＥＰチューブ（フッ素化エチレン−プロピレン；使用したすべてのＦＥＰチューブは、２ｍｍ内径および３ｍｍ外径を有した；Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅから得た）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫＴＭ ５００μｍ ＩＤ接合部）に接続した。上記Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第３のシリンジを、別個の１つのチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量７ｍＬ／分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、２０ｍＬ ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。上記混合物のうちの４ｍｌを、５ｃｃ シリンジに入れ、これを、ＦＥＰチューブの１つに接続し、別の５ｃｃ シリンジを、等しい長さのＦＥＰチューブに接続し、等量の１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、上記シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流量において作動させ、最終の混合物を、２０ｍＬ ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、第２の混合工程（リポソーム）から集めた上記混合物を、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体）を通過させた。上記リポソームに関してこの膜を使用する前に、４ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ、４ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＬの１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）が、連続してこの膜を通過した。リポソームを、１０分間にわたって３７℃において加温し、その後、上記膜を通過させた。次に、接線流濾過を使用することによって、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記ＴＦＦシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ（Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ）から購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび８ｃｍ２ 表面積を有するポリスルホン中空ファイバー濾過膜を使用した。インビトロおよびインビボ実験に関しては、処方物を、１×ＰＢＳで、必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。
被包されたＲＮＡのパーセンテージおよびＲＮＡの濃度を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、製造業者の指示書に従って決定した。上記キット中に提供されたリボソームＲＮＡ標準を使用して、標準曲線を作成した。リポソームを、１×ＴＥ緩衝液（キットから）中で、１０×もしくは１００×に希釈し、その後、色素を添加した。別個に、リポソームを、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘを含む１×ＴＥ緩衝液中で１０×もしくは１００×に希釈し、その後、色素を添加した（上記リポソームを破壊するため。従って、総ＲＮＡをアッセイするため）。その後、等量の色素を各溶液に添加し、次いで、色素添加後の約１８０μＬの各溶液を、二連において、９６ウェル組織培養プレートに入れた。蛍光（励起４８５ｎｍ，発光５２８ｎｍ）を、マイクロプレートリーダーで読み取った。すべてのリポソーム処方物を、被包されたＲＮＡの量に基づいて、インビボで投与した。
より小さなリポソームを得るために、シリンジ／チューブ法は、脂質およびＲＮＡ溶液がマイクロ流体チップ上のチャネルにおいて混合される方法によって置き換えられた。エタノール中の新たな脂質ストック溶液を、調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ−ＤＭＧを秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中に溶解した。上記新たに調製した脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、２２６．７μＬの上記ストックを、１．７７３ｍＬ エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。ＲＮＡの４ｍＬ 作業溶液をまた、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中約１μｇ／μＬのストック溶液から調製した。４本の２０ｍＬ ガラスバイアル（撹拌子有り）を、ＲＮａｓｅ Ａｗａｙ溶液ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、バイアルのＲＮＡｓｅの汚染を除去した。上記バイアルのうちの２本を、上記ＲＮＡ作業溶液（各バイアル中２ｍＬ）のために使用し、他を、脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した。作業脂質溶液およびＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ ルアーロックシリンジに入れた。ＲＮＡおよび上記脂質を含むシリンジを、４方向エッジコネクタを使用するＰＴＦＥチューブ（０．０３インチＩＤ×１／１６インチＯＤ（Ｓｙｒｒｉｓ））を使用して、Ｍｉｔｏｓ Ｄｒｏｐｌｅｔ接合チップ（Ｓｙｒｒｉｓから得られるガラスマイクロ流体デバイス（部品番号３０００１５８））に繋いだ。２本のＲＮＡストリームおよび１本の脂質ストリームを、シリンジポンプによって作動させ、上記エタノール相および水相の混合を、上記チップのＸ接合部（１００μｍ×１０５μｍ）において行った。３本全てのストリームの流量を、１．５ｍＬ／分において維持したので、全ての水性の流量 対 エタノール性の流量の比は、２：１であった。上記チューブの出口を、２０ｍＬ ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を、５ｃｃ シリンジに入れ、これを、ＰＴＦＥチューブ（０．０３インチ ＩＤ×１／１６インチ ＯＤ）の１つに接続し、別の５ｃｃ シリンジを等しい長さのＰＴＦＥチューブに接続し、等量の１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、シリンジポンプを使用して３ｍＬ／分の流量において作動させ、最終混合物を、２０ｍＬ ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、リポソームを、ＴＦＦシステムを使用して、２ｍＬへと濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。１００ｋＤａ 孔サイズカットオフおよび２０ｃｍ２表面積を有する中空ファイバー濾過膜を使用した。インビトロ実験およびインビボ実験のために、処方物を、１×ＰＢＳで、必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。上記シリンジ／チューブ法を使用して、７５μｇ ＲＮＡで調製したリポソームは、Ｚ平均直径１４８ｎｍおよび多分散性指数０．１２２を有したのに対して、上記チップ混合は、Ｚ平均直径９７ｎｍおよび多分散性指数０．０８６のリポソームを与えた。被包ＲＮＡの割合は、９０％から８７％へとわずかに減少した。
リポソームにおける被包は、ＲＮａｓｅ消化からＲＮＡを保護することを示した。実験では、３．８ｍＡＵのＲＮａｓｅ Ａ／μｇ ＲＮＡを使用し、３０分間にわたって室温においてインキュベートした。ＲＮａｓｅを、プロテイナーゼＫで、５５℃において１０分間にわたって不活性化した。次いで、サンプル 対 ２５：２４：１ ｖ／ｖ／ｖ，フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの１：１ ｖ／ｖ混合物を添加して、上記ＲＮＡを上記脂質から水相へと抽出した。サンプルを、数秒間にわたってボルテックスすることによって混合し、次いで、１２ｋ ＲＰＭにおける１５分間にわたる遠心分離に置いた。上記水相（上記ＲＮＡを含む）を取り出し、上記ＲＮＡを分析するために使用した。ローディング前に（４００ｎｇ ＲＮＡ／ウェル）、上記サンプルすべてを、ホルムアルデヒドローディング色素と共にインキュベートし、１０分間にわたって６５℃において変性させ、室温へと冷却した。Ａｍｂｉｏｎ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍマーカーを使用して、上記ＲＮＡ構築物の分子量を概算した。上記ゲルを、９０Ｖにおいて泳動した。上記ゲルを、室温において１時間にわたって振盪することによって、製造業者のガイドラインに従って、水中の０．１％ ＳＹＢＲゴールドを使用して染色した。図１は、被包の非存在下でＲＮａｓｅがＲＮＡを完全に消化することを示す（レーン３）。ＲＮＡは、被包後に検出不能であり（レーン４）、これらリポソームがＲＮａｓｅで処理されても全く変化が認められない（レーン４）。ＲＮａｓｅ処理リポソームをフェノール抽出に供した後、消化されていないＲＮＡが認められる（レーン６）。４℃において１週間後ですら、上記ＲＮＡを、いかなるフラグメント化もなしに認めることができた（図４，矢印）。インビボでのタンパク質発現は、４℃において６週間および１回の凍結融解サイクル後にも変化しなかった。従って、リポソーム被包ＲＮＡは安定である。
上記ＲＮＡのインビボ発現を評価するために、免疫原ではなく、レポーター酵素（ＳＥＡＰ；分泌型アルカリホスファターゼ）を、上記レプリコン中にコードさせた。発現レベルを、化学発光アルカリホスファターゼ基質を使用して、１×Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ希釈緩衝液中で１：４希釈した血清中で測定した。８〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）に、０日目に、０．１μｇもしくは１μｇ ＲＮＡ用量で５０μｌ／脚を筋肉内に注射した。同じベクターを、１μｇにおいて上記リポソームなしで（ＲＮａｓｅ非含有１×ＰＢＳ中で）も投与した。ビリオンパッケージングされたレプリコンもまた、試験した。本明細書で使用したビリオンパッケージングされたレプリコン（「ＶＲＰ」と呼ぶ）を、参考文献４１の方法によって得た。ここでアルファウイルスレプリコンは、変異ＶＥＥＶに由来するか、またはシンドビスウイルスの３’ＵＴＲおよびシンドビスウイルスパッケージングシグナル（ＰＳ）を含むように操作されたＶＥＥＶのゲノムから得られるキメラであり、シンドビスウイルスキャプシドおよび糖タンパク質遺伝子をコードする欠損性ヘルパーＲＮＡと共にＢＨＫ細胞へと共エレクトロポレーション（ｃｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｎｇ）することによってパッケージングした。
図５に示されるように、被包は、１μｇ用量においてＳＥＡＰレベルを約１／２対数増大させ、６日目において、０．１μｇ 被包用量からの発現は、１μｇ 非被包用量で認められたレベルに匹敵した。３日目までに、発現レベルは、ＶＲＰで達成されたものを超えた（四角）。従って、発現は、裸のＲＮＡコントロールと比較して、１０×低用量においてすら、上記ＲＮＡが上記リポソーム中に処方された場合に増大された。発現はまた、上記ＶＲＰコントロールと比較して高かったが、発現の動態は、非常に異なっていた（図５を参照のこと）。エレクトロポレーションを用いた上記ＲＮＡの送達は、上記裸のＲＮＡコントロールと比較して増大した発現を生じたが、これらレベルは、リポソームでのものより低かった。
上記リポソーム群において認められる効果が、上記リポソーム成分にのみ起因するのか、または上記被包に関連するのかを評価するために、上記レプリコンを、被包形態（２つの異なる精製プロトコルで、０．１μｇ ＲＮＡ）において、または形成後に上記リポソームと混合して（非被包化「リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）」，０．１μｇ ＲＮＡ）、または裸のＲＮＡ（１μｇ）として投与した。図１０は、上記リポプレックスが、最低レベルの発現を与えたことを示し、このことは、被包が、強力な発現に必須であることを示す。
さらなるＳＥＡＰ実験から、インビボで明らかな用量応答が示された。発現は、１ｎｇほどのＲＮＡの送達後にも認められた（図６）。被包レプリコンからの発現と裸のレプリコンからの発現とを比較するさらなる実験から、０．０１μｇ 被包ＲＮＡは、１μｇの裸のＲＮＡに等しいことが示された。ＲＮＡの０．５μｇ用量において、上記被包物質は、６日目において１２倍高い発現を与えた；０．１μｇ用量レベルでは、６日目において２４倍高かった。
上記群において平均レベルで調べるだけでなく、個々の動物もまた研究した。いくらかの動物は、裸のレプリコンに対して非応答者であったのに対して、被包は、非応答者を排除した。
さらなる実験では、ＤｌｉｎＤＭＡをＤＯＴＡＰ（「ＲＶ１３」）で置換した。ＤＯＴＡＰリポソームは、裸のレプリコンより良好な発現を与えたが、それらは、ＤｌｉｎＤＭＡリポソームより劣っていた（１日目において２〜３倍の差異）。
インビボでの免疫原性を評価するために、レプリコンを構築して、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に由来する全長Ｆタンパク質を発現させた。これを、裸（１μｇ）、リポソーム中に被包（０．１もしくは１μｇ）、またはビリオン中でパッケージング（１０６ ＩＵ；「ＶＲＰ」）で、０日目および２１日目に送達した。図７は、２回目の用量の２週間後の抗ＦのＩｇＧ力価を示す。上記リポソームは、明らかに免疫原性を増強する。図８は、２週間後の力価を示す。この時点までに、０．１μｇの上記被包ＲＮＡと、１μｇの上記被包ＲＮＡと、上記ＶＲＰ群との間に統計学的差異は何らなかった。中和力価（６０％のプラーク減少として測定，「ＰＲＮＴ６０」）は、２回目の用量の２週間後に、これら３群において有意差はなかった（図９）。図１２は、２回目の用量の４週間後のＩｇＧ力価およびＰＲＮＴ力価の両方を示す。
図１３は、上記ＲＮＡが堅調なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発することを確認する。
さらなる実験において、ＶＲＰ、０．１μｇ リポソーム被包ＲＮＡ、もしくは１μｇ リポソーム被包ＲＮＡを与えられたマウスにおけるＦ特異的ＩｇＧ力価を比較した。２回目の用量の後の種々の時点での力価比（ＶＲＰ：リポソーム）は、以下のとおりであった：
従って、上記リポソーム被包ＲＮＡは、ビリオン送達で認められるのと本質的に同程度の免疫応答を誘導する。
さらなる実験から、優れたＦ特異的ＩｇＧ応答が１０μｇ用量で示され、これは、１μｇおよび０．１μｇ用量についての応答と等しく、０．０１μｇ用量ではより低い応答が示された。図１１は、３種の異なる用量における裸の形態において、４種の異なる用量におけるリポソームにおいて、もしくはＶＲＰ（１０６ ＩＵ）として、上記レプリコンを与えられた動物におけるＩｇＧ力価を示す。１μｇ リポソーム被包ＲＮＡで認められた応答は、ＶＲＰと比較した場合に統計的に有意ではなかった（ＡＮＯＶＡ）が、１０μｇ リポソーム被包ＲＮＡで認められたより高い応答は、これらの群の両方と比較した場合、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
さらなる研究から、上記０．１μｇのリポソーム被包ＲＮＡは、０．１μｇの送達されたＤＮＡより遙かに高い抗Ｆ ＩｇＧ応答を与え（２回目の用量の１５日後）、さらに、エレクトロポレーション（ＥｌｇｅｎＴＭ ＤＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｉｎｏｖｉｏ）によって送達された、上記Ｆ抗原をコードする２０μｇ プラスミドＤＮＡより免疫原性であることが確認された。
さらなる研究を、マウスの代わりにコットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｉｓ）において行った。１μｇ 用量において、リポソーム被包は、裸のＲＮＡと比較して、Ｆ特異的ＩｇＧ力価を８．３倍増大させ、中和力価（ＰＲＮＴ６０として測定）を９．５倍増大させた。上記抗体応答の大きさは、５×１０６ ＩＵ ＶＲＰによって誘導されたものに等しかった。裸のＲＮＡおよびリポソーム被包ＲＮＡはともに、上記コットンラットをＲＳＶチャレンジ（１×１０５ プラーク形成単位）から保護することができ、肺のウイルス負荷を少なくとも３．５対数低下させた。被包は、上記低下を約２倍増大させた。
大型動物研究を、ウシにおいて行った。雌ウシを、リポソームの内部に処方した、全長ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする６６μｇのレプリコンで、０日目および２１日目に免疫化した。ＰＢＳ単独を、陰性コントロールとして使用し、認可されたワクチンを、陽性コントロールとして使用した（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ製の「Ｔｒｉａｎｇｌｅ ４」，死滅ウイルスを含む）。図１４は、第１の免疫化から始まって６３日間の期間にわたる、Ｆ特異的ＩｇＧ力価を示した。上記ＲＮＡレプリコンは、上記雌ウシにおいて免疫原性であったが、それは、上記認可されたワクチンより低い力価を与えた。全てのワクチン接種した雌ウシは、第２の用量の後にＦ特異的抗体を示し、力価は、上記第２の用量後の２〜６週の期間、非常に安定であった（そして、上記ＲＮＡワクチンに関しては、特に安定であった）。
（代替のカチオン性脂質を使用するリポソームにおける被包）
ＤｌｉｎＤＭＡを使用する代わりとして、参考文献８のカチオン性脂質を使用する。これらの脂質は、参考文献８において開示されるように合成され得る。
ＤｌｉｎＤＭＡを使用して上記で形成される上記リポソームを、本明細書において、以降「ＲＶ０１」シリーズという。上記ＤｌｉｎＤＭＡを、以下に記載されるように、シリーズ「ＲＶ０２」〜「ＲＶ１２」において種々のカチオン性脂質で置換した。各リポソームの２つの異なるタイプを、２％ ＰＥＧ２０００−ＤＭＧと、（０１）上記カチオン性脂質が４０％、１０％ ＤＳＰＣ、および４８％ コレステロール、または（０２）上記カチオン性脂質が６０％および３８％ コレステロールのいずれかとを使用して形成した。従って、（０１）リポソームと（０２）リポソームの比較は、中性両性イオン性脂質の効果を示す。
ＲＶ０２リポソームを、以下のカチオン性脂質を使用して作製した：
ＲＶ０３リポソームを、以下のカチオン性脂質を使用して作製した：
ＲＶ０４リポソームを、以下のカチオン性脂質を使用して作製した：
ＲＶ０５リポソームを、以下のカチオン性脂質を使用して作製した：
ＲＶ０６リポソームを、以下のカチオン性脂質を使用して作製した：
ＲＶ０７リポソームを、以下のカチオン性脂質を使用して作製した：
ＲＶ０８リポソームを、以下のカチオン性脂質を使用して作製した：
ＲＶ０９リポソームを、以下のカチオン性脂質を使用して作製した：
ＲＶ１０リポソームを、以下のカチオン性脂質を使用して作製した：
ＲＶ１１リポソームを、以下のカチオン性脂質を使用して作製した：
ＲＶ１２リポソームを、以下のカチオン性脂質を使用して作製した：
ＲＶ１３リポソームを、以下のカチオン性脂質（比較目的で、ＤＯＴＡＰ）を使用して作製した：
ＲＶ１４リポソームを、以下のカチオン性脂質（比較のために、ＤＣ−コレステロール）を使用して作製した：
ＲＶ１５リポソームを、以下のカチオン性脂質を使用して作製した：
これらリポソームを、上記のＳＥＡＰレポーターで試験した。以下の表は、上記リポソームのサイズ（Ｚ平均および多分散性指数）、各リポソームにおけるＲＮＡ被包の％と共に、注射後１日目および６日目に検出されたＳＥＡＰ活性を示す。ＳＥＡＰ活性は、ＤｌｉｎＤＭＡ、コレステロールおよびＰＥＧ−ＤＭＧから作製した「ＲＶ０１（０２）」リポソームに対する比較である：
図３は、６日目において認められたＳＥＡＰ発現レベルを図示する。最良の結果は、ＲＶ０４、ＲＶ０５、ＲＶ０７、ＲＶ０８、ＲＶ０９、およびＲＶ１１で認められた。
種々のこれらリポソームをまた、全長ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするレプリコンを送達するために使用した。ある研究は、ＲＶ０１、ＲＶ０５およびＲＶ１３を比較した；最高のＦ特異的血清ＩｇＧ力価はＲＶ０１で認められ、最低のものは、ＲＶ１３で認められた。別の研究は、ＲＶ０１、ＲＶ０２、ＲＶ０４およびＲＶ０７を比較した；最良の結果は、再び、ＲＶ０１で認められ、ＲＶ０７は、不十分にしか機能しなかった。別の研究は、ＲＶ０１、ＲＶ０３、ＲＶ０８、ＲＶ０９およびＲＶ１４を比較した；最良の結果は、ＲＶ０１で再び認められ、ＲＶ０３およびＲＶ１４は、不十分にしか機能しなかった。別の研究は、ＲＶ０１、ＲＶ１０、ＲＶ１１およびＲＶ１５を比較した；最良の結果は、再び、ＲＶ０１で認められた。全体として、最良の結果は、ＲＶ０１、ＲＶ０５、ＲＶ０８およびＲＶ０９で認められたのに対して、ＲＶ１３（ＤＯＴＡＰ）およびＲＶ１４（ＤＣ−コレステロール）は、不十分であった。
従って、上記リポソームのうちの全てが、免疫応答を誘発するのに有効であるわけではなかった。しかし、一般に、最良の免疫学的効力は、上記リポソーム中のカチオン性脂質が、５．０〜７．６の範囲、特に、５．５〜６．７の範囲、５．６〜６．３、５．６〜６．０、もしくは５．７〜５．９のｐＫａを有する場合に認められることが観察された。
（ＢＨＫ発現）
様々な脂質でのリポソームを、ＢＨＫ細胞と共に一晩インキュベートし、タンパク質発現能力について評価した。ＲＶ０５脂質でのベースラインから、発現を、１０％ １，２−ジフィタノイル（ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）を上記リポソームに添加することによって１８×に増大させることができ、または１０％ １８：２（ｃｉｓ） ホスファチジルコリンを添加することによって１０×に増大させることができた。一般に、インビボ研究は、不飽和脂質テールが、コードされた抗原に対して惹起されるＩｇＧ力価を増強する傾向にあることを示した。
（ＲＳＶ免疫原性）
ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするｖＡ３１７自己複製レプリコンを、上記レプリコン（１μｇ）単独で、またはＲＶ０５でリポソームとして処方して、または（比較のために）ＲＶ０１もしくはＲＶ１３でリポソームとして処方して、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり４匹もしくは８匹の動物）に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）によって、０日目および２１日目に投与した。上記ＲＶ０１リポソームは、ＲＮＡの量が異なることを除いて、４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＳＰＣ、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ−ＤＭＧを有した。上記ＲＶ０５リポソームは、４０％ ＲＶ０５、１０％ ＤＳＰＣ、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ−ＤＭＧ、もしくは６０％ ＲＶ０５、３８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ−ＤＭＧのいずれかを有した。上記ＲＶ１３リポソームは、４０％ ＤＯＴＡＰ、１０％ ＤＯＰＥ、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ−ＤＭＧを有した。上記リポソームを、種々の技術を使用して調製した。比較のために、同じＲＳＶ−Ｆ抗原を発現する裸のプラスミドＤＮＡ（２０μｇ）を、エレクトロポレーションを使用して、もしくはＲＶ０１（１０）リポソーム（０．１μｇ ＤＮＡ）と共にのいずれかで送達した。４匹のマウスを、ナイーブコントロール群として使用した。
Ｚ平均粒子直径および多分散性指数は、以下であった：
血清を、１４日目、３６日目および４９日目に抗体分析のために集めた。脾臓を、４９日目に、Ｔ細胞分析のためにマウスから採取した。
Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：
サイトカイン陽性であり、かつＲＳＶ Ｆ５１−６６ペプチドに対して特異的なＴ細胞の割合は、以下のとおりであり、統計的に有意にゼロを上回る数字のみを示す：
従って、上記リポソーム処方物は、増大したＦ特異的ＩｇＧ力価およびＴ細胞頻度によって決定される場合、上記裸のＲＮＡコントロールと比較して免疫原性を顕著に増大した。リポソームとともに処方したか、またはエレクトロポレーションを使用して裸で送達されたプラスミドＤＮＡは、リポソーム処方された自己複製ＲＮＡより顕著に免疫原性が低かった。
（様々なマウス系統におけるＲＳＶ免疫原性）
レプリコン「ｖＡ１４２」は、ＲＳＶの全長野生型表面融合（Ｆ）糖タンパク質をコードするが、その融合ペプチドは欠失しており、その３’末端は、リボザイム媒介性切断によって形成される。これを、３種の異なるマウス系統において試験した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目および２２日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた。動物を、８つの試験群（１群あたり５匹の動物）およびナイーブコントロール（２匹の動物）へと分けた：
群１には、裸のレプリコン（１μｇ）を与えた。
群２には、４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＳＰＣ、４８％ Ｃｈｏｌ、２％ ＰＥＧ結合体化ＤＭＧを有するリポソーム「ＲＶ０１（３７）」中で送達した１μｇ レプリコンを与えた。
群３には、群２と同じものを与えたが、０．１μｇ ＲＮＡであった。
群４には、「ＲＶ０５（１１）」リポソーム（４０％ ＲＶ０５脂質、３０％ １８：２ ＰＥ（ＤＬｏＰＥ）、２８％ コレステロール、２％ ＰＥＧ−ＤＭＧ）中、１μｇ レプリコンであった。
群５には、水酸化アルミニウムをアジュバント添加した５μｇ ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質を与えた。
群６は、ナイーブコントロール（２匹の動物）であった。
血清を、１４日目、３５日目および４９日目に、抗体分析のために集めた。Ｆ特異的血清ＩｇＧ ＧＭＴは、以下であった：
３５日目において、Ｆ特異的ＩｇＧ１力価およびＩｇＧ２ａ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：
３５日目および４９日目のＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった（データは、２〜５匹のマウスプール（１群あたり１プール）の６０％ プラーク減少中和力価である）：
４９日目に、Ｔ細胞分析のために脾臓を採取した。平均の正味Ｆ特異的サイトカイン陽性Ｔ細胞頻度（ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋）は、以下のとおりであった（これは、統計的に有意にゼロを上回った（ＣＤ４＋についてはＲＳＶペプチドであるＦ５１−６６、Ｆ１６４−１７８、Ｆ３０９−３２３、またはＣＤ８＋についてはペプチドＦ８５−９３およびＦ２４９−２５８に対して特異的）数字のみを示す）：
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、同じように免疫化したが、第７の群には、ＲＳＶの全長野生型表面融合糖タンパク質（融合ペプチド欠失）を発現するＶＲＰ（１×１０６ ＩＵ）を与えた。
血清を、１４日目、３５日目および４９日目に、抗体分析のために集めた。Ｆ特異的ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下であった：
３５日目において、Ｆ特異的ＩｇＧ１力価およびＩｇＧ２ａ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：
３５日目および４９日目のＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった（データは、２〜５匹のマウスプール（１群あたり１プール）の６０％ プラーク減少中和力価である）：
４９日目に、Ｔ細胞分析のために脾臓を採取した。平均の正味Ｆ特異的サイトカイン陽性Ｔ細胞頻度（ＣＤ８＋）は、以下のとおりであった（これは、統計的に有意にゼロを上回った（ＲＳＶペプチドＦ８５−９３およびＦ２４９−２５８に対して特異的）数字のみを示す）：
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスの９群を、同じようにして免疫化した。Ｆ特異的ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下であった：
３５日目のＦ特異的ＩｇＧ１力価およびＩｇＧ２ａ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：
３５日目および４９日目のＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった：
従って、異なる脂質（ＲＶ０１およびＲＶ０５；ｐＫａは、５．８および５．８５）を、３種の異なる近交系のマウス系統において試験した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ３Ｈ系統に関しては、ＲＶ０５は、ＲＶ０１よりも有効性が低かったが、Ｂ６系統においては、より有効であった。しかし、すべての場合において、上記リポソームは、並行して試験した２種のカチオン性ナノエマルジョンより有効であった。
（コットンラット）
上記ｖＡ１４２レプリコンをまた、以下から形成したリポソームを使用して、コットンラットにおいて試験した：
（ａ）４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＰＳＣ、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ ＤＭＧ ２０００。
（ｂ）４０％ ＲＶ０５、３０％ ＤＬｏＰＥ（１８：２ ＰＥ）、２８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ ＤＭＧ ２０００。
コットンラット（１群あたり４〜８匹の動物）に、以下を、０日目および２１日目に筋肉内にワクチン接種した（一方の脚に１００μＬ）：
群１ リポソーム（ａ）中に処方した自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２，０．１μｇ，ＲＳＶ−Ｆ）
群２ リポソーム（ｂ）中に処方した自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２，０．１μｇ，ＲＳＶ−Ｆ）
群３ リポソーム（ａ）中に処方した自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２，１μｇ，ＲＳＶ−Ｆ）
群４ リポソーム（ｂ）中に処方した自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２，１μｇ，ＲＳＶ−Ｆ）
群５ ＲＳＶの全長野生型表面Ｆ糖タンパク質を発現するＶＲＰ（１×１０６ ＩＵ）
群６ 水酸化アルミニウムをアジュバント添加したＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（５μｇ）
群７ ナイーブコントロール（３匹の動物）。
全てのコットンラット（群７を除く）に、４９日目（第２のワクチン接種の４週間後）に５μｇ Ｆサブユニット＋水酸化アルミニウムをワクチン接種した。
０日目、２１日目、３５日目、４９日目、６４日目に、血清を、抗体分析のために集めた。
Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：
ＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった：
従って、コットンラットに、ＲＶ０１もしくはＲＶ０５で処方したｖＡ１４２レプリコンをワクチン接種し、上記レプリコンを、２種の用量（１．０μｇおよび０．１μｇ）において与えた。第１のレプリコンワクチン接種後、Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価は、ＲＶ０５よりＲＶ０１で高かったが、中和力価は、ほぼ等しかった。全ての群における力価は、２１日目に与えた同種の第２のワクチン接種によってブーストされた。上記第２のレプリコンワクチン接種の後、Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価は、再び、ＲＶ０５よりＲＶ０１で高く、ＲＳＶ中和力価は、概して同じ傾向をたどった。
４９日目におけるタンパク質ワクチン接種は、以前にタンパク質をワクチン接種したコットンラットにおける抗体力価をブーストしなかったが、ＲＮＡを以前にワクチン接種したコットンラットにおける力価の大きなブーストを提供した。上記力価（全ＩｇＧおよび中和）は、ＲＶ０１を使用した場合より、ＲＶ０５を使用した場合に、６４日目に高かった。
（ｖＡ３１７ ＲＳＶレプリコンを有する様々なカチオン性脂質）
さらなる実験から、４種の異なるカチオン性脂質（ＲＶ０１、ＲＶ０２、ＲＶ０４およびＲＶ０７）を比較した。全てのリポソームは、２％ ＰＥＧ−ＤＭＧ ２０００を含んだが、残りの脂質組成は、異なった。組成および物理的特徴は、以下のとおりであった：
免疫原性の比較のために、さらに、ＨＴ、ＳＵＶおよびＭＬＶのリポソームを、ＲＶ０１を用いて、同じ割合の同じ成分を使用して、拡張性がない（ｎｏｎ−ｓｃａｌａｂｌｅ）（が、より迅速である）製造法で、作製した。簡潔には、３７ｍｇ／ｍｌ ＤＬｉｎＤＭＡ、１２ｍｇ／ｍｌ ＤＳＰＣ、２８ｍｇ／ｍｌ コレステロール、および８ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ ＤＭＧ ２０００を含むエタノールストック溶液を作製した。上記ストック溶液１００μｌを、合計１ｍｌのエタノール中に希釈した。リポソームを、１５０ミリトル圧力において、３０分間にわたって、５０℃でロータリーエバポレーターを使用して、上記エタノール溶液を蒸発させることによって調製した。残余エタノールの蒸発を、上記サンプルを、凍結乾燥器の中に減圧下で一晩置いておくことによって確実にした。その脂質フィルムを水和させ、１．０ｍＬの濾過した脱イオン水を添加することによって分散させ、５０℃に置いて、上記脂質をＭＬＶへと完全に懸濁させることを確実にした。上記ＭＬＶからアリコートを取り出し、１００％のパワーにおいて５分間にわたって１秒パルスで、プローブソニケーターで超音波処理して、ＳＵＶを形成した。両方の得られた溶液を、レプリコンＲＮＡと複合体化した。上記ＨＴリポソームは、３７ｍｇ／ｍｌ ＤＬｉｎＤＭＡ、１２ｍｇ／ｍｌ ＤＳＰＣ、２８ｍｇ／ｍｌ コレステロール、および８ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ ＤＭＧ ２０００を含むエタノールストック溶液を使用して作製した。上記ストック溶液１００μｌを、エタノールで４００μｌへと希釈した。得られたエタノール溶液を、４０μｇのＲＮＡを含む１０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）６００μｌへと、絶えず撹拌しながら滴下した。得られた溶液を、１０，０００ ＭＷＣＯ透析膜を使用して、４ＬのＰＢＳ緩衝液に対して一晩透析した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８匹／群）に、０日目および２１日目に、裸のレプリコン（１μｇ）もしくは０．１μｇ 被包化ＲＮＡを両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）で与えた。これら２種の注射の２週間後のＦ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：
ＲＶ０７に関しては、ＤＳＰＣが無いことによって、免疫原性の大きな低下が引き起こされた。
さらなる脂質（ＲＶ０１、ＲＶ０３、ＲＶ０８、ＲＶ０９、ＲＶ１４）を、同じようにして試験した：
リポソームＮ（ＤＣ−コレステロールあり）は、不十分にしか機能せず、上記裸のＲＮＡコントロールよりさらに低かった。対照的に、残りのカチオン性脂質は、有用な結果を与えた。リポソームＯを、リポソームＧとは異なる混合法（マイクロ流体チップ）によって調製したところ、このより小さなリポソームは、ほぼ同じ被包化でより良好な結果を与えた。
さらなる脂質（ＲＶ０１、ＲＶ１０、ＲＶ１１、ＲＶ１５）を、同じようにして試験した：
リポソームＱを除いて、これらリポソームの各々は、上記コントロールより良好に機能した。上記リポソームＱ中のＲＶ１０脂質は、ｐＫａ ７．８６を有する。これは、高すぎて、インビボでは有用でないように思われる。しかし、有用なｐＫａ範囲 ５．０〜７．６内でも、結果は良好であったが、一方がアルキルテールおよび一方がステロイド含有テールを有する脂質はいずれも、ＲＶ０１ほど良好な結果を与えなかった。
さらなるリポソームを、ＲＶ０５で作製した。上記リポソームは全て、４０％ ＲＶ０５および２％ ＰＥＧ化脂質を有したが、残りの成分は異なった（しかし、コレステロールは常に含まれていた）。物理的特徴は、以下であった：
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、前のように試験した：
非対称脂質テール（アルキル＋コレステロール）を有するカチオン性脂質については、中性脂質をＤＳＰＣ（飽和Ｃ１８脂質テール）から１８：２もしくは１８：３ＰＣ（テール１つにつき２個および３個の不飽和二重結合を有する）に変更したところ、全ＩｇＧ力価が増大した。匹敵する結果が、ＤＳＰＣをＤＰｙＰＥで置き換えたことで観察された。
上記ＲＶ０５脂質での最終実験において、リポソームを、４０％ ＲＶ０５、１０％ １８：２ ＰＣ、４０％ ＤＰｙＰＥ、８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ ＤＭＧ ２０００で作製した。これらリポソームは、Ｚａｖ直径１２４．７ｎｍ、ｐｄＩ ０．１７およびＲＮＡ被包 ６１．５％を有した。これらを使用して、裸のＲＮＡ（１μｇ）もしくはＲＶ０１ベースのリポソーム（４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＰＳＣ、４８％ コレステロール、２％ ＰＥＧ ＤＭＧ ２０００）との比較において、前のようにＢＡＬＢ／ｃマウスにワクチン接種した（０．１μｇ ＲＮＡ用量）。Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：
従って、上記ＲＶ０５リポソームは、裸のＲＮＡより免疫原性であったが、ＲＶ０１リポソームより免疫原性は低かった。
４９日目に、Ｔ細胞分析のために、脾臓を採取した。平均の正味Ｆ特異的サイトカイン陽性Ｔ細胞頻度（ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋）は、以下のとおりであった（統計的に有意にゼロを上回った数字のみを示す）（ＣＤ４＋に関しては、ＲＳＶペプチドＦ５１−６６、Ｆ１６４−１７８、Ｆ３０９−３２３に対して特異的、またはＣＤ８＋に関しては、ペプチドＦ８５−９３およびＦ２４９−２５８に対して特異的）：
従って、Ｔ細胞応答の点では、ＲＶ０５は、ＲＶ０１より良好な結果を与えた。
本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、本発明の範囲および趣旨内に留まりながら、改変が行われ得ることは、理解される。
表１：有用なリン脂質
ＤＤＰＣ １，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＡ １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＥＰＣ １，２−エルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＥ １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＥＰＧ １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＯＰＣ １，２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＡ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＬＰＣ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＥ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＬＰＧ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＰＳ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＭＧ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＭＰＡ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＭＰＣ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＭＰＥ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＭＰＧ １，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＭＰＳ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＯＰＡ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＯＰＣ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＯＰＥ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＰＧ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＯＰＳ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＰＰＡ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＰＰＣ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＰＰＥ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＰＰＧ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＰＰＳ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＰｙＰＥ １，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＳＰＡ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＳＰＣ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＳＰＥ １，２−ジステアロイル（Ｄｉｏｓｔｅａｒｐｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＳＰＧ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＳＰＳ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＥＰＣ 卵−ＰＣ
ＨＥＰＣ 水素化卵ＰＣ
ＨＳＰＣ 高純度水素化ダイズＰＣ
ＨＳＰＣ 水素化ダイズＰＣ
ＬＹＳＯＰＣ ＭＹＲＩＳＴＩＣ １−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ ＰＡＬＭＩＴＩＣ １−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ ＳＴＥＡＲＩＣ １−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ミルクスフィンゴミエリンＭＰＰＣ １−ミリストイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ ３−ホスファチジルコリン
ＭＳＰＣ １−ミリストイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＭＰＣ １−パルミトイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＣ １−パルミトイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＥ １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＰＯＰＧ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール）．．．］
ＰＳＰＣ １−パルミトイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＭＰＣ １−ステアロイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＯＰＣ １−ステアロイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＰＰＣ １−ステアロイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン

Claims (11)

  1. 目的のポリペプチドをコードするＲＮＡを中に被包しているリポソームであって、ここで該リポソームは、式（Ｉ）の化合物および式（ＸＩ）の化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含み、ここで
    式（Ｉ）は、以下：
    であり、ここで：
    Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合する窒素原子と一緒になって、必要に応じて置換された、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルケニル、Ｃ３−２０−ヘテロシクロアルキニルもしくはＣ５−２０−ヘテロアリール基を形成し；
    ａは、存在しないか、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−４アルキレンであり；
    ｂは、存在しないか、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−４アルキレンであり；
    ｃは、存在しないか、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−４アルキレンであり；
    Ｘ１は、ＯもしくはＳであり；
    Ｘ２は、ＯもしくはＳであり；
    Ｙ１は、必要に応じて置換された、Ｃ１０−３０アルケニル、Ｃ１０−３０アルキニル、Ｃ１０−３０ヘテロアルケニルもしくはＣ１０−３０ヘテロアルキニルであり；
    Ｌは、存在しないか、もしくは−（Ｌａ）ｄ−（Ｌｂ）ｅ−（Ｌｃ）ｆ−であり、ここで
    Ｌａは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
    Ｌｂは、必要に応じて置換された、Ｃ６−１４アリーレンもしくはＣ５−１３ヘテロアリーレンであり；
    Ｌｃは、必要に応じて置換された、Ｃ１−１５アルキレン、Ｃ１−１５アルケニレン、Ｃ１−１５アルキニレン、Ｃ１−１５ヘテロアルキレン、Ｃ１−１５ヘテロアルケニレンもしくはＣ１−１５ヘテロアルキニレンであり；
    ｄは、０もしくは１であり；
    ｅは、０もしくは１であり；
    ｆは、０もしくは１であり；そして
    Ｙ２は、必要に応じて置換されたステロイドであり、
    式（ＸＩ）は、
    Ｒａ−（ＡＡ）ｚ−Ｒｂ
    であり、ここで
    Ｒａは、Ｎ末端アルキルアミドであり；
    ｚは、２〜１０の整数であり；
    各ＡＡは、アミノ酸であり、ここで、少なくとも１個のヒスチジンが存在すること、および少なくとも１個のカチオン性アミノ酸が存在することを条件とし；
    Ｒｂは、−Ｈもしくは−ＮＨ２である、
    リポソーム。
  2. 請求項１に記載のリポソームであって、８０ｎｍ〜１６０ｎｍの範囲の直径を有する、リポソーム。
  3. 前記ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡである、前述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。
  4. 前記自己複製ＲＮＡ分子は、
    （ｉ）ＲＮＡを該自己複製ＲＮＡ分子から転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および
    （ｉｉ）前記目的のポリペプチド
    をコードする、請求項３に記載のリポソーム。
  5. 前記ＲＮＡ分子は、２個のオープンリーディングフレームを有し、該２個のオープンリーディングフレームのうちの第１のものは、アルファウイルスレプリカーゼをコードし、該２個のオープンリーディングフレームのうちの第２のものは、前記目的のポリペプチドをコードする、請求項４に記載のリポソーム。
  6. 前記ＲＮＡ分子は、９０００〜１２０００ヌクレオチド長である、前述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。
  7. 前記目的のポリペプチドは、免疫原である、前述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。
  8. 前記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘発し得る、請求項７に記載のリポソーム。
  9. 前記免疫原は、ＲＳウイルス糖タンパク質Ｆに対してインビボで免疫応答を誘発し得る、請求項８に記載のリポソーム。
  10. 前述の請求項のいずれかに記載のリポソームを含む、薬学的組成物。
  11. 脊椎動物における防御免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、請求項１〜９に記載のリポソームまたは請求項１０に記載の薬学的組成物の有効量を、該脊椎動物に投与する工程を包含する、方法。
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