JP2009149640A

JP2009149640A - 標的化免疫治療および一般の免疫刺激に対して有用であるヘテロ二量体融合タンパク質

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Publication number: JP2009149640A
Application number: JP2008317739A
Authority: JP
Inventors: Stephen D Gillies; ディー．ギリーズステファン; Kin-Ming Lo; ロキン−ミン; Yan Lan; ランヤン
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1997-12-08
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2009-07-09
Also published as: JP2001525423A; US20100015089A1; ES2221717T3; ATE267215T1; CA2312188C; JP4336452B2; US20020193570A1; DE69824039D1; EP1489100A3; EP1037927A2; WO1999029732A2; DE69824039T2; US7226998B2; EP1037927B1; US6838260B2; PT1037927E; US20080311655A1; CA2312188A1; EP1489100A2; US20050137384A1

Abstract

【課題】ヘテロ二量体のサイトカインとサイトカインの天然のヘテロ二量体構造を維持する、抗体または抗原との融合タンパク質およびその生産方法を提供。
【解決手段】第１および第２のキメラ鎖を含むヘテロ二量体融合タンパク質であって、該第１のキメラ鎖が、ペプチド結合によりヘテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットに連結されたＩｇ重鎖の部分を含み、該第２のキメラ鎖が、ペプチド結合により該へテロ二量体サイトカインの第２のサブユニットに連結されるＩｇ重鎖の部分を含み、該第１および該第２の鎖がジスルフィド結合によって連結されている、ヘテロ二量体融合タンパク質。
【選択図】図３

Description

（発明の分野）
本発明は、一般に融合タンパク質に関する。より具体的には、本発明は、標的化免疫治療および通常の免疫刺激に有用であるヘテロ二量体融合タンパク質に関する。

（発明の背景）
重要な免疫調節因子の１つは、ＨＬＡクラスＩＩ分子上に提示される抗原に反応するＴヘルパー細胞である。このＣＤ４⁺細胞は、抗原の刺激に応答して分化し、分泌するサイトカインの型に従って、１型または２型ヘルパー（Ｔｈ１またはＴｈ２）になる。（非特許文献１）。Ｔｈ１応答は、細胞内病原体に対する細胞媒介性免疫反応を刺激する、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の分泌を導く。Ｔｈ２応答は、細胞外病原体に対する抗体応答を刺激するＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の分泌を導く。この調節系の最も興味深い要素は、特定の応答が、産生されるサイトカインの負の調節性活性を介して他の応答を阻害することである。従って、ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、Ｔｈ１応答を下方制御し得るが、ＩＦＮ−γは、Ｔｈ２応答を下方制御し得る。

このＴヘルパー細胞および抗原に対する曝露に続くそれらの分化の調節活性は、同様にサイトカインによって調節される。４０ｋＤａサブユニットと３５ｋＤａサブユニットを有するジスルフィド連結ヘテロ二量体のサイトカインである、ＩＬ−１２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発達に強力な正の調節性の影響を発揮する。Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ、Ｂｌｏｏｄ８４：４００８〜４０２７（１９９４）による総説を参照のこと。ＩＬ−１２はまた、Ｔヘルパー細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の両方からのＩＦＮ−γの誘導において強力な相乗効果を有する（欧州特許出願第９０１２３６７０．３号）。次いで、分泌されるＩＦＮ−γは、任意のＴｈ２細胞増殖を阻害し、そして細胞媒介性免疫を助けるようにこの応答を分極化する。

免疫応答の結果を変化させる１つの方法は、抗原刺激時に適切なサイトカインを投与することである。ＩＬ−４が、抗原刺激の間に存在する主要なサイトカインであった場合、このＴｈ２応答は増強され、そしてこのＴｈ１応答は阻害される。対照的に、ＩＬ−１２が抗原刺激の間に存在する主要なサイトカインであった場合、このＴｈ１応答は増強され、そしてこのＴｈ２応答は阻害される。しかし、サイトカインの全身投与は、それらの非常に短い循環半減期およびそれらの有害な副作用のために困難である。

より優れたアプローチは、その抗原に対して特異性および親和性を有する抗体（またはそれに由来するフラグメント）に抗原を融合することによって、細胞表面抗原に対するサイトカインの効果を標的とすることである。Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：１４２８〜１４３２（１９９２）；米国特許第５，６５０，１５０号を参照のこと。この開示は、本明細書中で参考として援用される。あるいは、この刺激性サイトカインは、ペプチド結合を介して、融合タンパク質の形態でタンパク質抗原に連結され得る。Ｈａｚａｍａら、Ｖａｃｃｉｎｅ１１：６２９〜６３６（１９９３）を参照のこと。しかし、ＩＬ−１２の複合体構造は、最終産物において各サブユニットの正確に同一のモル比を発現する必要性のために、融合タンパク質として発現することをより困難とする。実際、ＩＬ−１２はそれ自体、天然に発現され、そしてｐ４０ホモ二量体の混合物として分泌される。Ｄ’Ａｎｄｒｅａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１３８７〜１３９８（１９９２）。

この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３（１９８９）

従って、当該分野において、ヘテロ二量体のサイトカインとサイトカインの天然のヘテロ二量体構造を維持する、抗体または抗原との融合タンパク質を産生する方法が必要とされ、このサブユニットの等モル比である分子を分泌する。

本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）第１および第２のキメラ鎖を含むヘテロ二量体融合タンパク質であって、該第１のキメラ鎖が、ペプチド結合によりヘテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットに連結されたＩｇ重鎖の部分を含み、該第２のキメラ鎖が、ペプチド結合により該へテロ二量体サイトカインの第２のサブユニットに連結されるＩｇ重鎖の部分を含み、該第１および該第２の鎖がジスルフィド結合によって連結されている、ヘテロ二量体融合タンパク質。
（項目２）融合タンパク質であって、ペプチド結合によってヘテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットに連結されたＩｇ重鎖の部分を含む第１のキメラＩｇ鎖を含み、該サイトカインの該第１のサブユニットが、該サイトカインの第２のサブユニットに連結されている、融合タンパク質。
（項目３）項目２に記載の融合タンパク質であって、ペプチド結合によってヘテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットに連結されたＩｇ重鎖の部分を含む第２のキメラＩｇ鎖をさらに含み、該サイトカインの該第１のサブユニットが、該サイトカインの第２サブユニットに連結されており、該第１の鎖および該第２の鎖がジスルフィド結合により連結されている、融合タンパク質。
（項目４）三量体融合タンパク質であって、ジスルフィド結合によって連結された、第１および第２のキメラ鎖を含み、該第１のキメラ鎖が、ペプチド結合によってヘテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットに連結されたＩｇ重鎖の部分を含み、該第２のキメラ鎖が、ペプチド結合によって該サイトカインの第２のサブユニットに連結されたＩｇ重鎖の部分を含み、該第２のサブユニットがジスルフィド結合によって該サイトカインの別の該第１のサブユニットに結合されている、三量体融合タンパク質。
（項目５）融合タンパク質であって、ペプチド結合によってヘテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットに連結されたＩｇ軽鎖の部分を含むキメラＩｇ鎖を含み、該サイトカインの該第１のサブユニットが該サイトカインの第２のサブユニットに連結されている融合タンパク質。
（項目６）前記融合タンパク質がサイトカイン生物学的活性を示す、項目１、２、３、４または５に記載の融合タンパク質。
（項目７）前記融合タンパク質が抗原結合特異性を示す、項目１，２，３，４または５に記載の融合タンパク質
（項目８）前記融合タンパク質が、非連結へテロ二量体サイトカインよりも長い循環半減期を有する、項目１、２、３、４または５に記載の融合タンパク質。
（項目９）前記Ｉｇ重鎖の部分がさらにＣＨ１ドメインを含む、項目１、２、３または４に記載の融合タンパク質。
（項目１０）前記Ｉｇ重鎖の部分がさらにＣＨ２ドメインを含む、項目９に記載の融合タンパク質。
（項目１１）前記Ｉｇ重鎖の部分がさらにＣＨ３ドメインを含む、項目１０に記載の融合タンパク質。
（項目１２）前記Ｉｇ重鎖の部分がさらにＣＨ２およびＣＨ３ドメインをさらに含む、項目１、２、３または４に記載の融合タンパク質。
（項目１３）前記へテロ二量体サイトカインがＩＬ−１２である、項目１、２、３、４または５に記載の融合タンパク質。
（項目１４）ヘテロ二量体融合タンパク質であって、第１および第２のキメラ鎖を含み、該第１のキメラ鎖が、ヘテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットに連結された抗原を含み、該第２のキメラ鎖が該ヘテロ二量体サイトカインの第２サブユニットに連結された抗原を含み、該第１および第２の鎖がジスルフィド結合によって連結されている、融合タンパク質。
（項目１５）融合タンパク質であって、ヘテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットに連結された抗原を含む第１のキメラＩｇ鎖を含み、該サイトカインの該第１のサブユニットが、該サイトカインの第２サブユニットに連結されている、融合タンパク質。
（項目１６）項目１５に記載の融合タンパク質であって、第２のキメラＩｇ鎖が、ヘテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットに連結された抗原を含む第２のキメラＩｇ鎖をさらに含み、該サイトカインの第１のサブユニットが、該サイトカインの第２のサブユニットに連結されており、該第１および第２の鎖がジスルフィド結合によって連結されている、融合タンパク質。
（項目１７）三量体融合タンパク質であって、ジスルフィド結合によって連結された第１および第２のキメラ鎖を含み、該第１のキメラ鎖がヘテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットに連結された抗原を含み、該第２のキメラ鎖が該サイトカインの第２のサブユニットに連結された抗原を含み、該第２のサブユニットがジスルフィド結合によって該サイトカインの別の該第１のサブユニットに連結されている、三量体融合タンパク質。
（項目１８）ヘテロ二量体サイトカインを選択的に標的とする方法であって、ペプチド結合によって該へテロ二量体サイトカインの少なくとも１つのサブユニットをＩｇ重鎖の部分に連結する工程を含み、それによって、予め決定された抗原およびサイトカイン生物学的活性に対して特異的な結合を示す融合タンパク質を形成するための、方法。
（項目１９）ヘテロ二量体サイトカインを選択的に標的とする方法であって、以下：
（ａ）ペプチド結合によって該へテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットを第１のＩｇ重鎖の部分に連結し、それによって第１のキメラ鎖を形成する工程：
（ｂ）ペプチド結合によって該へテロ二量体サイトカインの第２のサブユニットを第２のＩｇ重鎖の部分に連結し、それによって第２のキメラ鎖を形成する工程；および
（ｃ）ジスルフィド結合によって該第１および該第２のキメラ鎖を連結し、それによってヘテロ二量体融合タンパク質を形成する工程、
を包含し、該融合タンパク質が、予め決定された抗原およびサイトカイン生物学的活性に対する結合特異性を示す、方法。
（項目２０）ヘテロ二量体サイトカインを選択的に標的とする方法であって、以下：
（ａ）ペプチド結合によって、該へテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットをポリペプチドに連結し、それによって該サイトカインの該第１サブユニットが、ジスルフィド結合によって該サイトカインの第２サブユニットに連結されている、第１のキメラ鎖を形成する工程；
（ｂ）ペプチド結合によって、該へテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットをポリペプチドに連結し、それによって該サイトカインの該第１のサブユニットが、ジスルフィド結合によって該サイトカインの第２のサブユニットに連結されている、第２のキメラ鎖を形成する工程；および
（ｃ）ジスルフィド結合によって、該第１および該第２のキメラ鎖を連結し、それによってヘテロ二量体融合タンパク質を形成する工程、
を含み、該融合タンパク質が、予め決定された抗原およびサイトカイン生物学的活性に対して結合特異性を示す、方法。
（項目２１）ヘテロ二量体サイトカインの循環半減期を増加する方法であって、ポリペプチドに対して該へテロ二量体サイトカインの少なくとも１つのサブユニットを連結する工程を含み、それによって非連結性へテロ二量体サイトカインよりも長い循環半減期を有する融合タンパク質を形成する、方法。
（項目２２）項目２１に記載の方法であって、前記ポリペプチドが、Ｉｇ重鎖の部分、Ｉｇ軽鎖の部分、抗原、および血清アルブミンからなる群から選択される、方法。
（項目２３）ヘテロ二量体サイトカインの循環半減期を上昇する方法であて、以下：
（ａ）ペプチド結合によって、該へテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットをポリペプチドに連結し、それによって該サイトカインの該第１サブユニットが、ジスルフィド結合によって該サイトカインの第２のサブユニットに連結されている、第１のキメラ鎖を形成する工程；
（ｂ）ペプチド結合によって、該へテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットをポリペプチドに連結し、それによって該サイトカインの該第１のサブユニットが、ジスルフィド結合によって該サイトカインの第２のサブユニットに連結されている、第２のキメラ鎖を形成する工程；および
（ｃ）ジスルフィド結合によって、該第１および該第２のキメラ鎖を連結し、それによってヘテロ二量体融合タンパク質を形成する工程、
を含み、該融合タンパク質が、連結されていない第１および第２のヘテロ二量体サイトカインよりも長い循環半減期を有する、方法。
（項目２４）項目２３に記載の方法であって、前記第１および第２のポリペプチドが、Ｉｇ重鎖の部分、Ｉｇ軽鎖の部分、抗原、および血清アルブミンからなる群から選択される、方法。

（発明の要旨）
本発明は、標的化免疫治療および一般の免疫刺激に有用であるヘテロ二量体融合タンパク質、ならびにこれらのヘテロ二量体融合タンパク質を産生する方法を提供する。具体的には、本発明は、その天然へテロ二量体構造を維持するＩＬ−１２との融合タンパク質を産生するための方法を提供し、そして等モル比のＩＬ−１２サブユニットを有する分子の分泌を提供する。

本発明の１つの局面において、この融合タンパク質は、抗体、またはその部分に連結されたヘテロ二量体のサイトカインを含む。好ましい実施態様において、この融合タンパク質は、ジスルフィド結合により連結された２つのキメラ鎖を含む。各々のキメラ鎖は、ペプチド結合を介して、Ｉｇ重鎖の部分に連結されたヘテロ二量体のサイトカインの異なるサブユニットを含む。

代替的な好ましい実施態様において、この融合タンパク質は、ペプチド結合によってＩｇ重鎖の部分に連結されたヘテロ二量体サイトカインのサブユニットの１つを含む第１のキメラ鎖を含む。このサブユニットは、このヘテロ二量体サイトカインの他のサブユニットにジスルフィド結合によって連結される。別の代替的な好ましい実施態様において、この第１のキメラ鎖は、ペプチド結合によってＩｇ重鎖の部分に、かつジスルフィド結合によってヘテロ二量体サイトカインの他のサブユニットに連結されたヘテロ二量体サイトカインのサブユニットの１つを含む第２のキメラ鎖に、ジスルフィド結合によって連結される。

さらに別の代替的な好ましい実施態様において、この融合タンパク質は、ジスルフィド結合によって連結された第１のキメラ鎖および第２のキメラ鎖を含む三量体融合タンパク質である。各々のキメラ鎖は、ペプチド結合によってＩｇ重鎖の部分に連結されたヘテロ二量体サイトカインのサブユニットを含む。このキメラ鎖の１つのサブユニットは、さらにジスルフィド結合によってヘテロ二量体サイトカインの異なるサブユニットに連結される。

本発明の融合タンパク質は、それらの構造の２つの局面によりキメラとみなされ得る。第１に、この融合タンパク質は、所定のヘテロ二量体サイトカインに融合された適切な抗原結合特異性の免疫グロブリン鎖（代表的には重鎖であるが、これに限定されない）を含むという点でキメラである。第２に、本発明の免疫結合体は、可変領域、ならびに通常はその可変領域と、または異なる可変領域に結合される定常領域であり得る、定常領域を含むという意味でキメラであり、従って、Ｖ／Ｃキメラ（例えば、異なる種からの可変領域および定常領域）であり得る。異なる種からのフレームワーク領域および可変領域（すなわち、相補性決定領域）を含む結合ドメインを有する構築物（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、ＧＢ２、１８８、６３８により開示される）はまた、用語「融合タンパク質」の範囲内に含まれる。

本発明のヘテロ二量体サイトカイン−抗体融合タンパク質は、好ましくは、抗原結合特異性を示す。好ましい実施態様において、このヘテロ二量体サイトカイン−抗体融合タンパク質は、重鎖を含む。この重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメインを含み得る。代替的な好ましい実施態様において、このヘテロ二量体サイトカイン−抗体融合タンパク質は、軽鎖を含む。従って、本発明は、この抗原結合特異性および抗体の活性が、ヘテロ二量体サイトカインの強力な生物学的活性と組み合わされた、融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、ヘテロ二量体サイトカインが局在化生物学的効果を発揮し得るように、インビボにおいて、標的細胞にヘテロ二量体サイトカインを選択的に送達するために使用され得る。

好ましくは、本発明の融合タンパク質は、サイトカインの生物学的活性を示す。この融合タンパク質の好ましいヘテロ二量体サイトカインは、ＩＬ−１２である。抗原に結合し得る抗体との融合は、標的細胞または標的タンパク質抗原のいずれかに対するＩＬ−１２の免疫刺激活性を同時局在（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ）するために有用である。

さらに、本発明の融合タンパク質は、好ましくは、未連結のヘテロ二量体サイトカインより長い循環半減期を有する。抗体のＦｃ部分とＩＬ−１２との融合は、その循環半減期およびＦｃレセプターを有する細胞（例えば、抗原提示細胞）に対するその親和性を増加することにより、その分子の薬理および体内分布を変化するために有用である。体内分布の変化はまた、その循環から体内分布を明らかにするその機構を変化することによって、その全身性の毒性を変化し得る。

本発明の別の局面は、その融合タンパク質は、抗原に結合するヘテロ二量体サイトカインを含む。本発明の好ましいヘテロ二量体サイトカイン−抗原融合タンパク質は、サイトカインの生物学的活性および抗原性活性を示す。さらに、本発明の融合タンパク質は、好ましくは、未連結のヘテロ二量体サイトカインより長い循環半減期有する。この融合タンパク質の好ましいヘテロ二量体タンパク質は、ＩＬ−１２である。

好ましい実施態様において、その融合タンパク質は、ジスルフィド結合により連結される２つのキメラ鎖を含む。各キメラ鎖は、ヘテロ二量体サイトカインの異なるサブユニットを含み、いずれかの一方が抗原に対してペプチド結合を介して連結される。

代替的な好ましい実施態様において、その融合タンパク質は、抗原に対してペプチド結合によって連結されるヘテロ二量体サイトカインの一つのサブユニットを含む第一のキメラ鎖を含む。このサブユニットは、そのヘテロ二量体サイトカインのもう一方のサブユニットにジスルフィド結合により連結される。別の代替的な好ましい実施態様において、この第一のキメラ鎖は、抗原にペプチド結合により連結されるヘテロ二量体サイトカインの１つのサブユニットを含む第二のキメラ鎖にジスルフィド結合によって連結され、そしてそのヘテロ二量体サイトカインのもう一方のサブユニットにジスルフィド結合によって連結される。

別の代替的な好ましい実施態様において、その融合タンパク質は、ジスルフィド結合で連結される第一および第二のキメラ鎖を含む三量体融合タンパク質である。各キメラ鎖は、抗原にペプチド結合で連結するヘテロ二量体サイトカインのサブユニットを含む。一つのキメラ鎖のサブユニットはさらに、ヘテロ二量体サイトカインの異なるサブユニットにジスルフィド結合で連結される。

本発明はまた、上記の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物およびこれらの構築物をトランスフェクトさせた細胞系統（例えば、骨髄腫）を特徴とする。

本発明はまた、ヘテロ二量体サイトカインを選択的に標的化するための方法を含む。好ましい実施態様において、その方法は、ヘテロ二量体サイトカインの少なくとも１つのサブユニットをＩｇ重鎖の一部にペプチド結合で連結する工程を含む。別の好ましい実施態様において、その方法は、ヘテロ二量体サイトカインの各々２つのサブユニットをＩｇ重鎖の一部にペプチド結合で連結し、それにより、２つのキメラ鎖を形成する工程を含む。それら２つのキメラ鎖は、ジスルフィド結合で連結され、それにより、ヘテロ二量体融合タンパク質を形成する。さらに別の好ましい実施態様において、その方法は、（１）第一のヘテロ二量体サイトカインの２つのサブユニットの１つをＩｇ重鎖にペプチド結合で連結し、それにより、第一のキメラ鎖を形成する工程；（２）第二のヘテロ二量体サイトカインの２つのサブユニットの１つをＩｇ重鎖にペプチド結合で連結し、それにより、第二のキメラ鎖を形成する工程；および（３）第一および第二のキメラ鎖をジスルフィド結合で連結し、それにより、融合タンパク質を形成する工程を含む。得られた融合タンパク質は、予め決定された抗原およびサイトカインの生物学的活性に対する結合特異性を示し得る。

本発明はまた、ヘテロ二量体サイトカインを標的細胞に選択的に送達する方法を含む。その方法は、標的細胞上のエピトープに対して特異的な可変領域およびそのカルボキシ末端でサイトカインにペプチド結合で結合される定常領域を有するＩｇ重鎖を含むキメラＩｇ鎖、ならびにキメラＩｇ重鎖に結合される、Ｉｇ軽鎖を含むヘテロ二量体サイトカイン融合タンパク質を提供する工程、機能的抗原結合部位を形成する工程、および標的細胞に到達するのに有効な量のその融合タンパク質をその標的細胞を有する被検体に対して投与する工程を含む。

さらに、本発明はヘテロ二量体サイトカインの循環半減期を増加する方法を特徴とする。好ましい実施態様において、その方法は、ヘテロ二量体サイトカインの少なくとも１つのサブユニットを、ポリペプチドにペプチド結合で連結する工程を含む。もう一方の好ましい実施態様において、その方法は、ヘテロ二量体サイトカインの各々２つのサブユニットをポリペプチドにペプチド結合で連結し、それにより、２つのキメラ鎖を形成する工程を含む。それら２つのキメラ鎖は、ジスルフィド結合で連結され、それにより、ヘテロ二量体融合タンパク質を形成する。さらに別の好ましい実施態様において、その方法は、（１）第一のヘテロ二量体サイトカインの２つのサブユニットの一つをポリペプチドにペプチド結合で連結し、それにより、第一のキメラ鎖を形成する工程；（２）第二のヘテロ二量体サイトカインの２つのサブユニットの一つをポリペプチドにペプチド結合で連結し、それにより、第二のキメラ鎖を形成する工程；および（３）第一および第二のキメラをジスルフィド結合で連結し、それにより、融合タンパク質を形成する工程を含む。そのポリペプチドは，血清アルブミン、抗原、およびＩｇ重鎖の一部であり得る。得られた融合タンパク質は、サイトカインの生物学的活性を示す。

本発明のＩＬ−１２融合タンパク質は、癌の免疫治療または抗ウイルス応答におけるような、細胞媒介免疫応答を生成することが重要である場合、特異的な標的化または免疫刺激に有用である。それらはまた、しばしばＩＬ−４の過剰産生を導くＴｈ２応答を特異的にダウンレギュレートするために有用である。このサイトカインは、Ｔｈ２応答の誘導および生じるＩｇＥ抗体の過剰産生を通して、アレルギーの発生に必須であることを示した。

（発明の詳細な説明）
本発明は、ヘテロ二量体サイトカインと他のタンパク質との間の融合タンパク質を記載する。ヘテロ二量体サイトカインは、例えば、標的化特性または抗原特性を有するタンパク質に融合され得る。ヘテロ二量体サイトカインと標的化特性または抗原特性を有するタンパク質との間の融合タンパク質は、未連結のヘテロ二量体サイトカインより、長い循環半減期を有し得る。この特性はまた、ヘテロ二量体サイトカインを標的化特性または抗原特性を欠如するタンパク質（例えば、血清アルブミン）と融合することにより達成され得ることから、標的化特性または抗原特性は、循環半減期の増加に必要でない。

本発明の融合タンパク質は、遺伝子工学技術により作製され得る。図１に示されるように、種々の融合タンパク質構築物は、本発明の方法により作製され得る。１つの実施態様において、ポリペプチドに融合されたヘテロ二量体サイトカインの１つのサブユニットは、他の型の遊離のサブユニットと同時発現される。一旦発現されると、そのキメラ鎖は、遊離のサブユニットにジスルフィド結合で連結される（図１Ｂ）。別の実施態様において、サブユニットの１つと融合されるポリペプチドは、別のそのようなポリペプチドと連結され得る。各ポリペプチドは、ヘテロ二量体サイトカインに連結されるため、その生じる構築物は、２分子のヘテロ二量体サイトカインを有する（図１Ｃ）。さらに別の実施態様において、ヘテロ二量体サイトカインの各サブユニットは、ポリペプチドに対して融合され、そして２つのキメラ鎖は、ジスルフィド結合で連結される。生じる構築物は、ただ１分子のヘテロ二量体サイトカインを有する（図１Ｄ）。さらに別の実施態様において、ポリペプチドに融合されるヘテロ二量体サイトカインの２つのサブユニットは、遊離のサブユニットと同時発現される。生じる構築物は、ヘテロ二量体サイトカインの３つのサブユニットを有する（図１Ｅ）。

現在、公知のヘテロ二量体サイトカインは、ＩＬ−１２のみである。しかし、新規のヘテロ二量体サイトカインが、同定され、そして配列決定されると、当業者は、本発明の方法を使用して、これらの新規なヘテロ二量体サイトカインとの融合タンパク質を作製し得る。

本発明の有用な実施態様を合成するための方法、ならびにインビトロおよび前臨床のインビボ動物モデルの両方における、それらの薬理学的活性を試験するために有用なアッセイが記載される。キメラ鎖をコードする好ましい遺伝子構築物（すなわち、ポリペプチドに融合されるヘテロ二量体サイトカインのサブユニット）は、５’から３’の方向で、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントおよびヘテロ二量体サイトカインの１つのサブユニットをコードするＤＮＡを含む。もう１つの好ましい遺伝子構築物は、５’から３’の方向で、ヘテロ二量体サイトカインの１つのサブユニットをコードするＤＮＡセグメントおよびポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。融合遺伝子は、それが発現される適切なレシピエント細胞のトランスフェクションのための発現ベクターに構築されるか、または発現ベクター内に挿入される。

本発明はさらに、以下の限定されない実施例により説明される。

（実施例１ヒトおよびマウスＩＬ−１２サブユニットをコードするｃＤＮＡのクローニング）
ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）を、健常な志願者から入手し、そしてＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）勾配上で、遠心分離（１７００ｒｐｍ、２０分間）により精製した。ＰＢＭＣを含む「バフィー」コートを、無血清培養培地（ＳＦ−ＲＰＭＩ）で５０ｍｌの容量まで希釈し、そして１５００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により収集した。細胞を、ＡＩＭ−Ｖ細胞培養培地（ＧＩＢＣＯ）中に５×１０⁶細胞／ｍｌの密度で再懸濁し、そして加湿ＣＯ₂インキュベーター内で３７℃、２日間培養した。付着細胞を、培養フラスコを穏やかに攪拌して選択し、非付着細胞を除去した。ホルボールエステル（１００ｎＭ）およびカルシウムイオノフォア、イオノマイシン（０．１μｇ／ｍｌ）を含む新鮮な培地を添加した。３日後、細胞を、穏やかなスクレーピングおよび遠心分離により収集した。ＰｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡを、オリゴｄＴ被覆ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｉｎｃ．）を使用して調製した。

サブユニットｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してクローン化した。第一鎖のｃＤＮＡを、オリゴｄＴプライマー（５０μｇ／ｍｌ）、反応緩衝液、ＲＮＡｓｉｎ（１０Ｕ／ｍｌ）および逆転写酵素を含む５０μｌ反応において合成した。インキュベーションは４３℃、２時間であり、続いてフェノール、フェノール：クロロホルム（５０：５０）で抽出し、およびエタノール沈殿した。ｃＤＮＡ産物は、Ｔａｑポリメラーゼおよび反応緩衝液（１０×緩衝液；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、センスプライマーおよびアンチセンスプライマー（各０．２〜０．５μＭ）、および１０％のｃＤＮＡ反応物を含む、ＰＣＲ反応のための鋳型として使用した。プライマー配列は、ｐ３５サブユニットｃＤＮＡのセンスプライマーについては５’−ＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＣＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１）、およびアンチセンスプライマーについては５’−ＧＧＡＧＧＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＡＧＧＡＡＧＣＡＴＴＣＡＧ−３’（配列番号２）であった。センスプライマーは、ＸｍａＩ部位のすぐ上流のｐ３５メッセージの５’非翻訳領域中の配列に由来し、一方、アンチセンスプライマーは、翻訳終結コドンと、そのすぐ後に続く、発現ベクターでの直接的なサブクローニングに簡便なＸｈｏＩ部位をコードする。ｐ４０サブユニットｃＤＮＡに対するプライマーは、センスプライマーについては５’−ＣＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＧＡＴＧＴＧＴＣ−３’（配列番号３）、およびアンチセンスプライマーについては５’−ＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧ−３’（配列番号４）である。センスプライマーは、翻訳開始部位の上流のただ１つのＸｂａＩ部位をコードし、一方、アンチセンスプライマーは、終止コドンおよび上記のようなただ１つのＸｈｏＩ部位をコードする。これらのＰＣＲプライマーでクローン化される、両方のサブユニットの配列は、単一のタンパク質として発現され、従って、適切なヘテロ二量体集合および分泌のための天然の（または他の）分泌リーダー配列を必要とする。ＰＣＲ反応は、以下を含む４０サイクルからなる：９４℃、２分間の最初の変性工程に続く、９２℃、１分、５２℃、２分および７２℃、３分。産物をゲル精製し、配列確認のためにＳＫクローニングベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）にクローン化した。市販のキット（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用したＤＮＡ配列決定を、各サブユニットｃＤＮＡについて行った。同様の手順を使用して、コンカナバリンＡ（培養培地中５μｇ／ｍｌ、３日間）で活性化させた脾臓細胞由来のマウスｐ３５サブユニットｃＤＮＡをクローン化し得る。推奨プライマーは、センスプライマーについては５’−ＣＣＴＣＴＡＣＴＡＡＣＡＴＧＴＧＴＣＡＡＴＣＡＣＧＣＴＡＣＣＴＣ−３’（配列番号５）、およびアンチセンスプライマーについては５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＣ−３’（配列番号６）であり、ヒトｐ３５サブユニットについての上記と同様の制限部位をコードしている。

（実施例２トランスフェクトさせた哺乳動物細胞における融合タンパク質の組合せの発現）
各サブユニットの融合させたバージョンを作製するために、各々の成熟タンパク質配列をコードするＤＮＡを、以下のように適応させた。ｐ４０サブユニットＤＮＡを、ＮｄｅＩ（成熟タンパク質およびリーダ配列の接合部に非常に接近して切断する）、およびＸｈｏＩで消化した。アダプターオリゴヌクレオチドを、配列５’−ＴＡＴＧＧＡＣＴＴＧＣ−３’（配列番号８）を有する、第二の、部分的に相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする配列５’−ＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡ−３’（配列番号７）に合成した。その二本鎖ＤＮＡは、５’末端のＸｍａＩ部位および３’末端のＮｄｅＩ部位での連結に適合性のある突出配列を含む。このフラグメントを、ｐ４０のｃＤＮＡのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントに連結し、そしてベクターｐｄＣ−Ｆｃ−ＸにおいてＸｍａＩからＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化し、ＸｍａＩおよびＸｈｏＩで切断した。このベクターはすでに、そのゲノム配座におけるヒトＩｇＧ１ＦｃをコードするＤＮＡフラグメント（イントロンおよびエキソンを含む）を含み、マウス軽鎖由来のリーダー配列の下流に連結される。Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１２５：１９１−２０２（１９８９）を参照のこと。ＤＮＡフラグメントのそのただ１つのＸｍａＩ部位への付加は、Ｆｃのカルボキシル末端に直接的に結合される融合タンパク質の作製を、その２つの配列間のリーディングフレームが維持される場合、可能にし得る（Ｌｏら、米国特許第５，５４１，０８７号）。他のタンパク質（例えば、抗原、血清アルブミン）は、同様の方法で、これらのサブユニットのアミノ末端に融合し得る。この方法の利点は、大量の産物の産生、およびプロテインＡセファロースへの結合およびそれからの抽出による産物の精製の容易さを含む。

ｐ３５サブユニットＤＮＡをヒトＦｃに融合するために、同じ一般的戦略を使用した。この場合、ＸｍａＩ−ＢａｌＩリンカーをオリゴヌクレオチド５’−ＣＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＣＣＣＣＧＴＧＧ−３’（配列番号９）および５’−ＣＣＡＣＧＧＧＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１０）を使用して合成した。これを上記のようにｐ３５サブユニットＤＮＡに連結し、ＢａｌＩおよびＸｈｏＩで切断し、そしてｐｄＣ−Ｆｃ−ＸベクターにおけるＸｍａＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてサブクローンニングした。ヒトｐ３５サブユニットは、ＩＬ−１２活性の点において、ヒト細胞について活性を示しマウス細胞については活性を示さないが、一方、ヒトｐ４０サブユニットは、種特異性を示さない。従って、ヒトｐ４０サブユニットは、全てのヒトＩＬ−１２融合タンパク質またはハイブリッドヒト／マウス融合タンパク質のいずれかを生成するために使用され得る。

生成した構築物は、１２０ｋＤ（Ｆｃから５０Ｋｄ）および１３０ｋＤのそれぞれのタンパク質へ自発的に二量体化し、そして変性ＳＤＳゲル上での還元の後６０ｋＤおよび６５ｋＤのタンパク質として移動すると期待されるＦｃ−ｐ３５またはＦｃ−４０融合タンパク質をコードする。個々のサブユニットｃＤＮＡを独立したタンパク質としてそれらを発現するためにｐｄＣ発現ベクター（Ｆｃをもたない）中でサブクローニングした。このベクターは、哺乳動物細胞のトランスフェクションの後、ｃＤＮＡ挿入物から転写されたｍＲＮＡの発現についてのプロモーター配列を提供する。これはまた、３’非翻訳領域およびポリＡ付加部位に、すなわち３’ＸｈｏＩ挿入部位の下流に提供される。Ｅ．ｃｏｌｉ内のプラスミドの増殖およびアンピシリンを用いた選択、ならびにメトトレキサートに対する耐性を付与するための選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ））に対して必要な配列がまた、存在する。これらの同じ成分を、融合タンパク質を発現するためのｐｄＣ−Ｆｃ−Ｘベクターにおいても使用する。

生物学的活性ＩＬ−１２融合タンパク質ヘテロ二量体の発現について、サブユニットの融合形態および非融合形態をコードする個々のベクターの異なる組み合せは、ヒト２９３表皮癌細胞の同時トランスフェクションにより一過的に発現された。ＤＮＡを調製用キット（Ｗｉｚａｒｄ，ＰｒｏｍｅｇａＩｎｃ．）を用いて精製し、滅菌および滅菌水中に再懸濁するためにエタノールで沈殿させた。リン酸カルシウムの沈殿物を１０μｇのＤＮＡ／ｍｌ（２つのプラスミドが同時トランスフェクションした場合、各５μｇ）を使用して標準的な方法で調製した。そして０．５ｍｌ／プレートを２９３の培養物に添加し、およそ７０％コンフルエントで６０ｍｍプレートにおいて増殖させた。ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）。１６時間後、沈殿物を含む培地を除去し、そして新しい培地と取り替えた。３日後、上清を除去し、そしてＥＬＩＳＡ、ＩＬ−１２活性の生物学的決定、または免疫沈殿法そして放射性標識化タンパク質のＳＤＳゲル上での分析によりトランスフェクションされた遺伝子の発現の生成を分析した。標識について、メチオニンを含まない培地を使用して、培養２日めに増殖培地に取り替えた。そして³⁵Ｓ−メチオニン（１００μＣｉ／ｍｌ）を添加した。さらなる１６時間の培養の後、培地を採収し、遠心分離（卓上型微量遠心分離機で１３，０００ｒｐｍ、５分）により清澄化し、そしてプロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（１０μｌのビーズ容量／培養上清液のｍｌ）で培養した。室温で１時間後、このビーズを繰り返し遠心分離により洗浄し、そして１％ＮＰ−４０を含むＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。最終ペレットは、ＳＤＳを含むゲル緩衝液中で再懸濁し、そして２分間煮沸した。遠心分離によりビーズを除去した後、上清を２つのアリコートに分けた。還元剤（５％２−メルカプトエタノール）を１つのサンプルに添加し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドでロードする前に両方を５分間煮沸した。電気泳動の後、このゲルをＸ線写真（オートラジオグラフィー）に供した。

還元条件下で種々の融合タンパク質および個々に発現したタンパク質の同時発現の分析の例を図２に示す。この結果は、Ｆｃフラグメントを有する融合タンパク質として発現した場合（レーン１）でさえ、ｐ３５サブユニットが細胞から分泌され得ないことを示す。一方、ｐ４０サブユニットは、Ｆｃと融合した場合（レーン２）、容易に分泌される。ｐ３５サブユニットは、ｐ４０サブユニットと対になり得る場合、Ｆｃ−ｐ４０融合タンパク質と対であるＦｃ−ｐ３５融合（レーン３）、遊離のｐ４０と対になっているＦｃ−ｐ３５（レーン４）、またはＦｃ−ｐ４０融合タンパク質と対になっている遊離のｐ３５（レーン５）のいずれかの場合分泌された。遊離のサブユニットの発現の全ての場合において、融合タンパク質と共に、遊離のサブユニットは他方のサブユニットとアッセンブリし、そして共有結合、つまりジスフィルド結合を形成する。これらの種々の組み合せの図式を図１に示す。同じ細胞においてＦｃと融合しそして同時発現された各サブユニットを有する構築物は、１分子のＩＬ−１２／Ｆｃ（図１Ｄ）を有し、一方遊離のサブユニット（他の型の）と対になったＦＣと融合した単一サブユニットを有する構築物は、２分子のＩＬ−１２／Ｆｃを有する（図１Ｃ）ことに注意のこと。安定してトランスフェクトされた細胞での発現は、発現および分泌はｐ３５と独立しているので一過的発現とは異なるよう期待されている。従って、ｐ４０の過剰発現は可能であり、そしてそれが容易に輸送され得るので、細胞に対してより有用である。これは、Ｆｃ−ｐ３５に関するＦｃ−ｐ４０サブユニットの過剰を導き得、そして細胞からのヘテロ二量体分泌物およびｐ４０ホモ二量体分泌物との混合物を生じ得る。これは、効果がなく、そして精製の問題を導く。ｐ３５の発現は、過剰タンパク質は、ｐ４０サブユニットと効率良く対にならない場合、小胞体において分解されるようであるため増殖に不利なようである。従って、ヘテロ二量体融合産物のみのバランスのとれた分泌を確実にするためにこの状況を利用することは、遊離のｐ４０サブユニットと共に融合タンパク質としてｐ３５サブユニットを発現することにより、可能である。ｐ４０サブユニットのモル等量と対になったｐ３５融合タンパク質のみ、分泌され得る。プロテインＡにおけるこの産物の精製は、ヘテロ二量体の均質な調製物を生じる。発現した融合タンパク質の仮定されるタンパク質構造の図式を示したものを図３に提供する。

（実施例３ＩＦＮ−γ誘導アッセイにおける融合タンパク質の活性）
実施例１に記載のように精製したマイトジェン活性化ヒトＰＢＭＣを用いて、生物学的活性をＩＦＮ−γ誘導アッセイにおいて測定した。濃度勾配遠心分離後、細胞を１０％ウシ胎児血清（ＲＰＭＩ−１０）およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；１０μｇ／ｍｌ）を含有する細胞培養培溶液中に５×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、そして加湿ＣＯ₂インキュベーター内で３７℃、３日間培養した。ＰＨＡ活性化細胞を遠心分離により採収し、等量のＳＦ−ＲＰＭＩで３回洗浄し、そして新鮮なＲＰＭＩ−１０中に再懸濁した（１×１０⁶細胞／ｍｌ）。アリコート（１００μｌ）を複数の９６ウェルプレートのウェルへ分配し、最終的な細胞数を、１０⁵／ウェルにした。培養培地からの試験サンプルを新鮮な培養培地で連続的に希釈し、そして９６ウェルプレートのウェルに添加した。１０％血清およびＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）を含む刺激培地（５０μｌ／ウェル）を添加した。コントロールウェルには、ＩＬ−２のみ（陰性コントロール）またはＩＬ−２および市販のＩＬ−１２（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）の両方（サンプルなし）（陽性コントロール）を与えた。このプレートをＣＯ₂インキュベーター内で３７℃４８時間でインキュベーションした。４８時間でアリコート（２０μｌ）をＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−γ濃度の分析ために取り除いた。

マウス形態のＩＬ−１２融合タンパク質の活性を決定するために同じアッセイを使用した。Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓細胞をコンカナバリンＡを用いて３日間活性化したことを除いて、ＰＨＡ活性化ヒトＰＢＭＣの代わりに使用した。マウス細胞由来のヒトｐ４０／マウスｐ３５ハイブリッド分子により誘導されるＩＦＮ−γを定量するために、マウス特異的ＥＬＩＳＡを使用した。

ヒト系について、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ＰｅｓｔｋａＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中のヒトＩＦＮ−γ（１μｇ／ｍｌ）に対するマウスモノクローナル抗体で、４℃で一晩、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏプレートＦ９６Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｂ）をコートし、ＰＢＳで３回非結合抗体を洗浄し、そしてＰＢＳ中１％ウシ胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）および１％ヤギ血清の溶液でブロック（１５０μｌ／ウェル、３７℃２時間）することによって定量的ＥＬＩＳＡを開発した。ブロックしたプレートをＰＢＳで４回洗浄した後、試験サンプルおよびＩＦＮ−γ標準物質の希釈物を、最終容量が１００μｌ／ウェルになるように添加した。４℃で一晩のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、そしてヒトＩＦＮ−γに対するポリクローナルウサギ抗血清（１／１００００希釈；ＰｅｔｓｋａＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。３７℃で１時間、さらにインキュベーションし、ＰＢＳで４回洗浄した後、ポリクローナルロバ抗ウサギ検出抗体（西洋わさびペルオキシダーゼ（１／７００希釈；Ｐｅｔｓｋａ
ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を結合体化した）を３７℃で１時間添加した。次いで、このプレートをＰＢＳで４回洗浄し、そして１００μｌのＫ−青色基質（ＥＬＩＳＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｅｏｇｅｎ
Ｃｏｒｐ．）を標準曲線を含むウェル内の色が十分発色するまで添加した。そして、そのときに１００μｌの赤色停止溶液（ＥＬＩＳＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。このプレートをＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００）を用いて６５０ｎｍで読み取り、そして試験サンプルの光学密度をコントロールＩＦＮ−γの希釈液から得られた標準曲線と比較することによって、ＩＦＮ−γ量を算出した。ＩＬ−２およびＩＬ−１２の両方の存在下で誘導されたＩＦＮ−γ量は、一般に、１２００〜２０００ｐｇ／ｍｌの範囲であるが、一方、ＩＬ−１２の非存在下で生成される量は、一般に５０ｐｇ／ｍｌより少ない。

実施例２に記載の培養上清の生物学的活性をＩＦＮ−γ生成を刺激する能力について比較した。図４に示すように、最も高い活性が、遊離のｐ４０サブユニットと同時発現するＦｃ−ｐ３５融合タンパク質で得られたが、両方のサブユニットとの他の組み合せ物もまた、活性であった。精製されたタンパク質を用いるより正確な測定法を以下に記載する。

（実施例４抗体ＩＬ−１２融合タンパク質の発現）
実施例２に記載の実験は、ＩＬ−１２ヘテロ二量体サイトカインを有する融合タンパク質を発現するのに都合の良い方法が、同じ細胞において遊離のｐ４０サブユニットと共に融合したｐ３５サブユニットタンパク質を同時発現することであることを実証する。これは、２つのアプローチによってなされ得る；第１は、融合タンパク質ベクターおよびｐ４０発現ベクターを一斉に同時トランスフェクションすること（すなわち、同時トランスフェクション（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｔｒａｎｆｅｃｔｉｏｎ））により達成する。；第２は、細胞をｐ４０のみと最初にトランスフェクトし、そしてこのタンパク質の高いレベル、分泌の安定性について選択し、次いで、融合タンパク質の発現構築物によるトランスフェクション（すなわち、連続的トランスフェクション）に対するレシピエントとしてこの細胞を使用する。後者の方法は、融合タンパク質が正確なアッセンブリおよび分泌に対して適切にアッセンブリされる必要がある重鎖および軽鎖の両方を有する抗体分子である場合、特に有効である。理論上、ｐ３５サブユニットの融合は、重鎖または軽鎖とであり得るが、好ましい実施態様は、重鎖のカルボキシル末端であり、ここでは細胞上のＩＬ−１２レセプターとの相互作用はより自由になり得る。ｐ３５サブユニットをそのカルボキシル末端を介して重鎖または軽鎖のアミノ末端と融合することもまた、可能である。この場合、リーダー配列は、それが融合タンパク質のアミノ末端にあるため、ｐ３５の発現を要求する。従って、細胞からのアッセンブリおよび分泌のために小胞体へのその方向づけを要求する。

核酸構築物はまた、キメラ免疫グロブリン鎖の発現を調節するために可変領域をコードする遺伝子に対する内因性プロモーターおよび内因性エンハンサーを含む。例えば、可変領域をコードする遺伝子は、リーダーペプチド、軽鎖のＶＪ遺伝子（接合（Ｊ）セグメントを有する機能的再配置可変（Ｖ）領域）または重鎖のＶＤＪ遺伝子、ならびにこれらの遺伝子に対する内因性プロモーターおよび内因性エンハンサーを含むＤＮＡフラグメントとして得られ得る。あるいは、可変領域についてコードする遺伝子は、内因性調節エレメントから分離して得られ得、そしてこれらのエレメントを提供する発現ベクターにおいて使用され得る。

可変領域遺伝子は、所望される抗体を産生する細胞由来の産物の標準ＤＮＡクローニングにより得られ得る。特異的機能的再配置可変領域についてのゲノムライブラリーのスクリーニングは、適切なＤＮＡプローブ（例えば、Ｊ領域ＤＮＡ配列を含むＤＮＡセグメント）および下流配列の使用により成し遂げられ得る。次いで正確なクローンの同定および確認は、クローン化遺伝子のＤＮＡ配列決定およびその配列と適切にスプライスされたｍＲＮＡである全長の対応する配列と比較することにより達成される。

（４．１同時トランスフェクション）
同時トランスフェクションを、２つの転写ユニットおよび選択マーカー遺伝子を有するベクターの構築により達成し得る。このようなベクターは、哺乳動物細胞における組換え型抗体の発現について記載される。Ｇｉｌｌｉｅｓ，ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１２５：１９１−２０２（１９８９）。代替的な方法は、それら自体の選択マーカー遺伝子を有する２つの独立したプラスミドベクター（１つは融合タンパク質のための転写ユニットを有し、そしてもう１つはｐ４０サブユニットのための転写ユニットを有する）を使用すること、および細胞が耐性になる薬物（例えば、ｄｈｆｒ遺伝子でトランスフェクトされた細胞ではメトトレキサート）の存在下で培養することにより、首尾よくトランスフェクトされ、発現する細胞について選択することである。さらに、別のアプローチは、選択マーカー遺伝子を含み、そして選択マーカーをもたない第２のベクターを同時トランスフェクションするｐ３５サブユニットに対する融合タンパク質についての発現ベクター、およびｐ４０サブユニットに対する転写ユニットを使用することである。後者の方法により得られた任意の薬剤耐性クローンは、ｐ４０サブユニットの非存在下において融合タンパク質を分泌し得なかった。従って、この任意の薬剤耐性クローンは培養上清物のＥＬＩＳＡアッセイにより検出されない。両ベクターを用いてトランスフェクトされた細胞のみが、完全な融合タンパク質ｐ４０ヘテロ二量体を分泌する。

プラスミドベクター（ｐｄＨＬ７−１４，１８−ｐ３５）を、Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１２５：１９１−２０２（１９８９）に記載のように構築した。このベクターは、ｄｈｆｒ選択可能マーカー遺伝子、ヒト化１４．１８抗ＧＤ２抗体軽鎖をコードする転写ユニット、およびヒトＩＬ−１２のｐ３５サブユニットと融合したヒト化重鎖をコードする転写ユニットを含む。この融合は、実施例２に記載のようにＸｍａＩを、適合化ｐ３５サブユニットｃＤＮＡのＸｈｏＩフラグメントと、ヒトＩｇＧ１Ｈ鎖遺伝子のＣＨ３エキソンの末端における独特のＸｍａＩ部位とに連結することにより達成した。Ｈ鎖の転写ユニットおよびＬ鎖の転写ユニットは共に、５‘末端でのサイトメガウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（本来の参考物におけるメタロチオネインプロモーターの置換）、および３’末端でのポリアデニル化部位を含む。同様のベクター（ｐＣ−ｐ４０）を遊離のｐ４０サブユニット（選択可能なマーカー遺伝子（ｄｈｆｒまたは他）を含まず、さらに転写のためにＣＭＶプロモーターを使用した）の発現のために構築した。この場合のコード領域は、小胞体への適切な輸送および融合タンパク質とのアッセンブリのためにｐ４０サブユニットの天然のリーダー配列を含んでいた。このベクターの別のバージョン（ｐＮＣ−ｐ４０）（ネオマイシン耐性遺伝子を含む）を連続的トランスフェクションにおいて使用するために構築した。

同時トランスフェクションについて、プラスミドＤＮＡ（約１０μｇの各プラスミド；ｐｄＨＬ−７−１４．１８−ｐ３５およびｐＣ−ｐ４０）をＳａｌＩ制限酵素で消化することによって線状にし、ＰＣＲＣｌｅａｎｕｐキット（Ｗｉｚａｒｄ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製し、そして０．２５ボルトおよび５００μＦの設定を使用して５×１０⁶ミエローマ細胞（０．５ｍｌ氷冷ＰＢＳ中）にエレクトロポーレイションした。氷上で１０分間回復させた後、細胞を新鮮な培地に移動し、そして約１０⁵細胞／ｍｌで９６ウェル皿にプレートした。４８時間後、細胞にメトトレキサート（０．１μｌ）を含む培地を与えた。新鮮培地を、クローンが出現するまで４日間毎に液体容量の半分を交換することによって添加した。所望される抗体−ＩＬ−１２融合タンパク質の発現を抗体Ｆｃ検出に基づいたＥＬＩＳＡを使用してアッセイした。捕捉抗体はヒトＨ鎖およびＬ鎖と反応し、そして検出にはヒトＦｃに対して特異的な抗体を利用した。陽性のクローンは、選択培地中で増殖し、そして産物を上記のプロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅと結合させ、そしてこれから溶出することにより精製した。溶出したタンパク質をＰＡＧＥにより分析し、そしてクマシーブルーによる染色によって検出した。

（４．２連続的トランスフェクション）
連続的トランスフェクションについて、プラスミドｐＮＣ−ｐ４０を細胞へ上記のようにエレクトロポーレイションし、そして細胞をプレートし、Ｇ４１８含有培地において選択した。薬剤耐性クローンからの培養上清をＥＬＩＳＡによりｐ４０サブユニットの生成について試験した。捕捉抗体は、マウス抗ヒトＩＬ−１２ｐ４０であり、そして検出抗体は、ヒトＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０に指向された。市販のＥＬＩＳＡキットは、この目的についていくつかの製造業者から入手可能である（Ｐｈａｒｍｉｎｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）。最も高く生成する細胞クローンを、ｐ４０の安定した発現について試験した。１つのこのようなクローンを、上記のようにｐｄＨＬ７−１４．１８−ｐ３５プラスミドＤＮＡでトランスフェクトし、そしてクローンをメトトレキサート含有培地において選択した。所望される抗体ＩＬ−１２融合タンパク質の発現を、抗体Ｆｃ検出に基づくＥＬＩＳＡを使用してアッセイした。捕捉抗体はヒトＨ鎖およびＬ鎖と反応し、そして検出にはヒトＦｃに対して特異的な抗体を利用した。陽性クローンを選択培地中で増殖させ、そしてその産物を上記のプロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅと結合させ、そしてそこから溶出することより精製した。溶出したタンパク質をＰＡＧＥにより分析し、そしてクマシーブルーによる染色により検出した。

（４．３抗体−ＩＬ−１２融合タンパク質の活性）
表１に概要されるように、融合タンパク質発現細胞クローンを同時トランスフェクションおよび連続的トランスフェクションのいずれかにより得たが、連続的トランスフェクションを使用して、より多い生成クローンを生成した。２つの別々のトランスフェクタントから分泌される産物を鎖組成について分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図５Ａに示す。明らかに、両方のクローンは各３鎖（軽鎖、Ｈ鎖−ｐ３５、および共有結合ｐ４０）について同じ相対量を分泌する。このことは、この６鎖分子の完全で適切なアッセンブリを示す。同じプロセスを、実際に全ての表皮癌細胞（結腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、卵巣癌、および膀胱癌）において発現するＥｐＣＡＭ抗原と反応する第２の抗体である、ＫＳ−１／４で繰り返した。これらそれぞれの抗原に対する抗体の正常な結合活性を含む、正確に同じ結果が得られた。

全抗体ＩＬ−１２融合タンパク質の生物学的活性を、図５に示す。マイトジェン活性化ヒトＰＢＭＣの増殖を刺激する能力についてアッセイされる場合、ヒトＩＬ−１２鎖の両方を有するＨｕ−ＫＳ−ＩＬ−１２融合タンパク質は、モル基準でヒトＩＬ−１２標準とほぼ同じ活性である（図５Ｂ）。Ｈｕ−ＫＳ−１／４に融合されるマウスｐ３５サブユニットを含む同一の構築物は、ヒトＰＢＭＣの刺激において有意により低い活性であった。ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ分泌を誘導する能力についてアッセイされる場合、ヒトＩＬ−１２鎖を有するＨｕ−ＫＳ−ＩＬ−１２タンパク質は、ＩＬ−１２標準よりも約６倍低い活性であったが、このハイブリッド形態は、さらに４倍低い活性であった（図５Ｃ）。マウスエフェクター細胞（コンカナバリンＡで前刺激される）を使用した場合、このハイブリッド形態は、マウスＩＬ−１２標準よりも約５０倍低い活性であった。全ヒト形態は、文献から予測されるように不活性であった（図５Ｄ）。Ｓｃｈｏｅｎｈａｕｔら、ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１４８：３４３３〜３３４０（１９９２）を参照のこと。

（実施例５単鎖ＩＬ−１２融合タンパク質の発現）
二量体の抗体およびＦｃベースの融合タンパク質の産生についてまさに記載された方法はまた、ＩＬ−１２を有する単鎖融合タンパク質（これらは二量体を形成しない）を発現させるために、その、より単純な方式において使用され得る。この場合において、配列をコードする単鎖ポリペプチドを、ｐ３５サブユニットに対する配列に結合し、そして同一の細胞において遊離のｐ４０サブユニットとして同時発現させる。２つの方法、すなわち同時トランスフェクションまたは連続的トランスフェクションのいずれかを使用して、単鎖ヘテロ二量体融合タンパク質を産生し得る。このような融合タンパク質の目的は、単鎖Ｆｖ（ｓｃ−Ｆｖ）抗体の融合によって、抗原を有する細胞に対してＩＬ−１２を標的化するため（ＨｕｓｔｏｎおよびＯｐｐｅｒｍａｎｎ、ＷＯ８８／０９３４４号）か、またはＩＬ−１２の非常に特異的な免疫刺激効果を、アジュバントとしてのタンパク質抗原とともに組み合わせるためのいずれかであり得る。刺激タンパク質および抗原の結合は、動物への注射に続くそれらの共存局在化を保証する。この抗原は、任意のポリペプチドであり得る。これらは、治療的価値を有する腫瘍、ウイルス性または他の抗原と反応する能力を有する動物において、抗体を誘導し得る。例えば、ｓｃ−Ｆｖは、イディオタイプ（特異的な抗原結合領域）ネットワークを刺激する目的のために、このイディオタイプを含む抗体Ｖ領域に対する免疫応答を誘導することがしばしば有利であるので使用され得る。

このような融合タンパク質のために使用される抗原の型はまた、通常アレルギー性応答を誘導する抗原（例えば、塵埃ダニ（ｄｕｓｔｍｉｔｅ）由来のＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｐＩＩ、またはいくつかの型の甲殻類由来のトロポミオシン）であり得、これはＩＬ−１２のｐ３５サブユニットに、ＤＮＡレベルで融合され、そしてｐ４０サブユニットと共に同一の細胞中で発現され得る。このような融合タンパク質を用いる免疫化は、アレルギーを伴うアトピー患者において疾患を引き起こすＴｈ２応答を除感作することにおいて有用である、強力なＴｈ１ヘルパー細胞応答を誘導する。

単鎖融合タンパク質の発現を示すために、ＫＳ−１／４抗体のｓｃＦｖバージョンを構築した。融合遺伝子のタンパク質コード部分の５’末端（ＸｂａＩからＡｆＩＩＩまでのフラグメント）は、ＫＳ−１／４Ｌ鎖Ｖ領域の成熟タンパク質配列に融合される、マウスｋ軽鎖由来のリーダー配列からなる。このＶ領域の末端を、インフレームで、他（ＨｕｓｔｏｎおよびＯｐｐｅｒｍａｎｎ、ＷＯ８８／０９３４４号）に記載される、単純なリンカー配列（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃をコードするＤＮＡに続いて、インフレームで、ＫＳ−１／４のＨ鎖Ｖ領域をコードする配列に融合する。このｓｃＦｖの３’末端はＸｍａＩ部位を含み、ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットのヒトおよびマウスバージョンの５’末端（ＸｍａＩからＸｈｏＩまでのフラグメント）に対する連結に適合性がある。最終のＸｂａＩからＸｈｏＩまでのフラグメントを、遊離のＩＬ−１２サブユニットを発現するために使用される同一の発現ベクター（ｐｄＣ）の対応部位に挿入し、ベクターｐｄＣ−ＳＣＡ−ｈｕ−ｐ３５およびベクターｐｄＣ−ＳＣＡ−ｍｕ−ｐ３５を得た。

これらのベクターを、ヒトｐ４０を発現する細胞株内に導入し、そしてメトトレキセート（０．１μＭ）を含む培地で増殖させた。融合タンパク質を発現する、薬物耐性のクローンを、構築物において利用されるｐ３５種に対して特異的なＥＬＩＳＡアッセイによって同定した（すなわち、ＩＬ−１２ヒトｐ４０抗体を、抗原捕獲のために使用し、そして特異的抗マウスまたはヒトｐ３５抗体を、検出のために使用した）。各々の型の単鎖融合タンパク質由来の培養培地を使用してこれらの量を決定し、その結果、相対的な比活性を算出し得た。各々のサンプルの連続希釈液を、上記の実施例２に詳細に記されるように、ＩＦＮ−γ分泌を誘導する能力について試験した。この結果を図６に示す。これは、両ヒトサブユニットで作製されるか、またはマウスｐ３５およびヒトｐ４０で作製されるかのいずれかである、単鎖ＩＬ−１２融合タンパク質の活性ならびにこの融合タンパク質の種特異性を比較する。このデータは、ヒトＩＬ−１２単鎖融合タンパク質が、ＩＦＮ−γを誘導するその能力において全抗体融合と同程度に活性であるが、ヒトＰＢＭＣを使用した場合、ヒトＩＬ−１２標準ほど強力ではないことを示す（図６Ａ）。このハイブリッドマウス／ヒト形態は、全抗体構築物で見られるように、マウスＩＬ−１２コントロールよりも約５０倍少なかった（図６Ｂ）。図６Ｃは、単鎖ＩＬ−１２タンパク質の抗原結合アッセイを示す。プレートを、ＫＳ−１／４抗体によって認識されるＫＳ抗原でコートし、そして任意の反応性抗体または抗体融合タンパク質を捕獲するために使用した。数回洗浄した後、この結合融合タンパク質を、抗ヒトＩＬ−１２ｐ４０抗体を使用して検出した。このデータは、単鎖融合タンパク質が、抗原をコートしたプレートに結合し、そしてＩＬ−１２に対する抗体で検出され得たことを示し、従って、融合された分子が、抗原結合活性を保持することを示す。この結合の強度は、全ＫＳ−１／４抗体で見られるよりもおおよそ３倍低かったが、このことは、単鎖構築物の一原子価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｃｙ）のために、予想されないことではない。

全抗体および単鎖ＩＬ−１２融合タンパク質の両方を用いる活性の結果は、融合が活性を減少すると思われるので、ｐ３５鎖のアミノ末端がレセプター結合に重要であり得ることを示唆する。それにも関わらず、この抗体−ＩＬ−１２分子は、１ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で、ＩＦＮ−γのさらに強力な誘導因子である。処置された動物におけるこのような分子の濃度は、血液循環および標的作用部位の両方において、これよりも数オーダー高い強度であることが予想される。

抗体−ＩＬ−１２融合タンパク質の比活性を増大するための可能な方法は、抗体とｐ３５配列との間に可撓性のペプチドリンカーを挿入することであり、従ってこのサブユニットのアミノ末端配列に対してより自由度を与える。上記の（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃リンカーのような配列は、この様式において使用され得る。このアプローチに伴う一つの可能性のある問題は、特にＩＬ−１２のような強力な免疫刺激因子に融合する場合に、このようなリンカーが免疫原性になり得ることである。

（実施例６ＩＬ−１２融合タンパク質の薬学動態学的特性）
抗体−ＩＬ−１２融合タンパク質を、Ｂａｌｂ／ｃマウスへの静脈注射に続いて、これらの薬学動態学的挙動について試験した。血液を、マウスから眼窩後方の出血によって採取し、そしてＥｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロ遠心分離チューブ中において４℃で保存した。ＥＬＩＳＡ方法を使用して、増加する時間点において血液中に残存するヒト抗体の量、ならびにインタクトＩＬ−１２融合タンパク質の量を測定した。ヒト抗体を測定する最初のＥＬＩＳＡは、捕獲のためのヒトＨおよびＬ鎖に対する抗体、ならびに検出のための抗ヒトＦｃ抗体を利用する。この融合タンパク質特異的アッセイは同一の最初の捕獲工程を使用するが、検出のために抗ｐ４０サブユニット抗体を使用する。図７に示されるように、抗体およびＩＬ−１２融合タンパク質の両方は、長い半減期を有したが、この融合タンパク質の半減期は幾分短かった。このことは、この環状融合タンパク質が、抗体が循環中に残存する間、経時的に切断されてＩＬ−１２を放出することを示唆する。他の抗体−サイトカイン融合タンパク質を用いた、より以前に報告された実験は、サイトカインがタンパク質分解切断によって放出され得ることを示す。Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：２３０〜２３５（１９９３）を参照のこと。それにも関わらず、この融合タンパク質の半減期は、ネイティブのＩＬ−１２について報告された３時間という値よりもよりはるかに長い。実際、７２時間での血清濃度は、ＩＦＮ−γ分泌を誘導するために要求されるレベルよりもなおずっと高い。Ｔｒｉｎｃｉｅｒｉ、Ｂｌｏｏｄ８４：４００８〜４０２７（１９９２）を参照のこと。

（実施例７抗体−ＩＬ−１２融合タンパク質を用いる、確立された結腸癌の処置）
マウス結腸癌、ＣＴ２６は、非毒性用量でのマウスＩＬ−１２を用いる全身投与での処置に特に非感受性である。Ｍａｒｔｉｎｏｔｔｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１３７〜１４６（１９９５）。いくらかの効力は、全身性のＩＬ−１２投与がＩＬ−２を分泌するように操作された、照射を受けたＣＴ２６細胞の繰り返しワクチン接種と組み合わされる場合に見出された。Ｖａｇｌｉａｎｉら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、５６：４６７〜４７０（１９９６）。首尾良い治療に対する代替のアプローチは、低いレベルのＩＬ−１２を分泌するように操作されたＣＴ２６を含んだ。これは、おそらくインビボで操作された腫瘍に対して曝露した後のこれらの細胞の免疫抑制効果のために、マウスがＣＤ４＋細胞を枯渇させるために初めて抗体で処理されない限り、効果がなかった（Ｍａｒｔｉｎｏｔｔｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１３７〜１４６（１９９５））。よりずっと高いＩＬ−１２分泌物を操作するためのさらに別のアプローチは、はるかにより首尾良く、従って局在するＩＬ−１２の量が皮下の腫瘍に対する免疫応答を確立することにおいて重大であることを示す（Ｃｏｌｏｍｂｏら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５６：２５３１〜２５３４（１９９６））。しかしこの場合において、臨床設定においてみられるものと同様の確立され、汎発された腫瘍の処置の実証はなかった。本実験の目的は、ネズミ結腸癌、ＣＴ２６の処置のための抗体−ＩＬ−１２融合タンパク質の有効性を評価することであった。

ＣＴ２６細胞を、ＫＳ−１／４抗体によって認識される抗原（ＫＳ抗原（ＫＳＡ）かまたは上皮細胞付着分子（ＥｐＣＡＭ）のいずれかで呼ばれる）をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトした。これらの表面上でこのタンパク質を発現するクローンを、ＫＳ−１／４を用いる免疫染色および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって同定した。ＫＳＡを安定に発現する一つのクローン（クローン２１．６）由来の細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウス（マウス一匹あたり１×１０⁵）の尾静脈中に注射した。未処置のマウスは、２８日までに広範な肺転移を形成し、そして接種の４０日以内に死亡した。この増殖速度は、ヒトＫＳＡの発現がＣＴ２６免疫原性または腫瘍を形成する能力に対して全く影響を有さないことを示す、親細胞と事実上同一であった。

ＣＴ２６転移の治療のための抗体−ＩＬ−１２融合タンパク質の有効性を、マウス細胞上で活性を有するハイブリッドヒト／マウス形態を使用する、このマウスモデルで試験した。腫瘍細胞注射の後、マウスは、ＰＢＳ（未処置コントロール）、ＫＳ−１／４−ＩＬ−２融合タンパク質（正のコントロール）、遊離のＩＬ−２を伴うＫＳ−１／４抗体（負のコントロール）、またはＫＳ−１／４−ＩＬ−１２融合タンパク質（試験サンプル）のいずれかの注射を受けた。処置は４日目（これは、確立された転移が動物の肺において組織学的染色によって容易に検出可能である時間である）に始め、そして５日間毎日続けた。腫瘍細胞接種後の２８日目に、動物を安楽死させ、そしてそれらの肺を腫瘍の存在について試験した。この肺の重量もまた測定し、腫瘍のないマウスと比較して、腫瘍塊の量を決定した。この結果を表２に要約する。未処置の動物は、個体の転移小結節の融合によって腫瘍を伴う器官近傍の完全な表面範囲によって特徴付けられる、広範な転移疾患を有した。この肺の重量は、平均して３倍増加し、腫瘍塊が、実際に器官の大部分に至ったことを示す。処置された動物は、いかなる転移の形跡も有さず、いくつかの動物は完全に腫瘍を有さなかった。いずれの動物も処置プロセスの間に毒性の明らかな徴候を示さなかった。従って、全身性のＩＬ−１２での処置とは異なり、抗体−ＩＬ−１２融合タンパク質治療は、確立された転移ＣＴ２６結腸癌を全滅させ得る。

実験的な肺転移を、１０⁵ＣＴ２６−ＫＳＡ細胞の静脈注射によって誘導した。処置は、１０μｇのヒト化したＫＳ−１／４抗体、または示された融合タンパク質の連続５日間の静脈注射を行った３日後に始めた。動物を屠殺し、そして転移スコアを表面範囲の程度によって決定した。０＝目に見える転移病巣なし；１＝覆われた表面の５％未満；２＝覆われた表面の５〜５０％；および３＝５０％より多い肺表面が転移病巣で覆われる。

（実施例８ワクチンとしてのＩＬ−１２融合タンパク質）
ＰＢＳ緩衝液中のヒト化ＫＳ−１／４抗体ＩＬ−１２融合タンパク質（マウスｐ３５サブユニット（ＨｕＫＳ−１／４−ｍＩＬ−１２を用いて作製された）を、Ｂａｌｂ／ｃマウスに静脈内注射した（５μｇ／日×５）。コントロールマウスは、同一の抗体を同一の量、しかしＩＬ−１２を付着せずに受けた。注射溶液もまた、任意の他の型のアジュバントを含まなかった。１０日目、血液サンプルを、眼窩後方の出血によってマイクロ遠心分離チューブ中に採集し、そして血漿を、クエン酸ナトリウムを含むプラスチックチューブ中に血液サンプルを採集し、続いて、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上マイクロ遠心分離装置で最高速度で遠心分離することによって調製した。ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル）を、ヒト定常領域を含むＨｕＫＳ−１／４タンパク質でコートし、そして免疫化に応答して作製された任意のマウス抗体を捕獲するために使用した。非結合物質を洗浄除去した後、結合したマウス抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗マウスＦｃ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。任意の結合した抗体をヒト定常領域または可変領域のいずれかに指向させ得た。これらは共に、ＨＵ−ＫＳ−１／４と融合タンパク質との間で共有される。

図８に示されるように、融合されたＩＬ−１２がなければＨｕ−ＫＳ−１／４に対する反応性は、ほとんどまたは全くなかった。一方、この融合タンパク質は、外因性のアジュバントの非存在下で強力な抗体応答を誘導し、そして投与の静脈経路が、このような応答を誘導するために非常に都合が悪いという事実にも関わらず、皮下投与かまたは腹腔内投与のいずれにも匹敵した。ＩｇＧ２ａアイソタイプの抗体（これは、ＩＬ−１２増強応答に代表的である）は、抗体−ＩＬ−１２を注射された群において見られたが、Ｈｕ−ＫＳ−１／４抗体を注射された群においては見られなかった。

種々の経路によって投与されたＩＬ−１２融合タンパク質の免疫原性は、ＰＢＳ中もしくは他の生体適合性緩衝液中、またはフロイント非完全アジュバントまたはフロイント完全アジュバントのような公知のアジュバント中で融合タンパク質の溶液（例えば、上記）を注射することによって試験される。例えば、単一のまたは複数の皮下の、皮内のもしくは腹腔内の注射は、２週間毎に与えられ得る。あるいは、この融合タンパク質は、まず皮下注射によって、次いで腹腔内注射によって投与され得る。フロイントアジュバントは、注射部位での刺激のため、ヒトの使用のために用いられ得ない。水酸化アルミニウム沈殿物（ミョウバン）のような代替のアジュバントは、ヒトの使用について認可され、そして本発明において使用され得る。スクアレンおよび脂質に基づく新規の有機化学アジュバントもまた、皮膚内への注射のために使用され得る。

（等価性）
本発明は、その精神または本質の特徴から逸脱することなく他の特定の形態で具体化され得る。従って、前述の実施態様は、本明細書中に記載される本発明に関して制限よりもむしろ実例となるすべての局面において考慮されるべきである。従って、本発明の範囲は、前述の記載よりもむしろ添付の請求項によって示され、そして本請求項の等価の意味および範囲内にある全ての変化は、本発明中に包含されることが意図される。

本発明の前述のおよび他の目的、ならびにそれらの種々の特徴は、添付の図面と共に読まれる場合、以下の記述からより十分に理解され得る：
図１は、ヘテロ二量体融合タンパク質の予想されるタンパク質構造の図示である。図２は、Ｆｃ−ｐ３５融合タンパク質（レーン１）、Ｆｃ−ｐ４０融合タンパク質（レーン２）、Ｆｃ−ｐ３５融合タンパク質およびＦｃ−ｐ４０融合タンパク質（レーン３）、Ｆｃ−ｐ３５融合タンパク質およびｐ４０サブユニット（レーン４）、ならびにｐ３５サブユニットおよびＦｃ−ｐ４０融合タンパク質（レーン５）を発現するベクターでトランスフェクトさせた細胞により分泌されたタンパク質の、還元条件下での分析を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図示である。図３は、発現される融合タンパク質の予想されるタンパク質構造の図示である。図４は、種々の融合タンパク質のＩＦＮ−γ産生を刺激する能力を示す棒グラフである。図５は、２つの独立したトランスフェクト体により産生される抗体−ＩＬ−１２融合タンパク質の全体の分析を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図示である（非還元条件下（レーン１および２）および還元条件下（レーン３および４））。図５Ｂは、マイトジェン活性化されたヒトＰＢＭＣの増殖における、ヒトＩＬ−１２（×）、ヒトＩＬ−１２の両方の鎖を有するＨｕ−ＫＳ−ＩＬ−１２融合タンパク質（黒四角）、およびＨｕ−ＫＳ−１／４−マウスｐ３５ヒトｐ４０融合タンパク質（白四角）の効果を示す線グラフである。図５Ｃは、ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣから分泌されるＩＦＮ−γの誘導における、ヒトＩＬ−１２（×）、ヒトＩＬ−１２の両方の鎖を有するＨｕ−ＫＳ−ＩＬ−１２融合タンパク質（黒四角）、およびＨｕ−ＫＳ−１／４−マウスｐ３５ヒトｐ４０融合タンパク質（白四角）の効果を示す線グラフである。図５Ｄは、コンカナバリンＡでの刺激前のマウスエフェクター細胞からの、ヒトＩＬ−１２（×）、ヒトＩＬ−１２の両方の鎖を有するＨｕ−ＫＳ−ＩＬ−１２融合タンパク質（黒四角）、およびＨｕ−ＫＳ−１／４−マウスｐ３５ヒトｐ４０融合タンパク質（白四角）の効果を示す線グラフである。図６Ａは、ＩＦＮ−γ分泌の誘導における、ＩＬ−１２（×）、ヒトｐ３５およびｐ４０サブユニットを有する単鎖融合タンパク質（黒四角）、マウスｐ３５およびヒトｐ４０サブユニットを有する単鎖融合タンパク質（白四角）の効果を示す線グラフである。図６Ｂは、ＩＦＮ−γ分泌の誘導における、ＩＬ−１２（×）、ヒトｐ３５およびｐ４０サブユニットを有する単鎖融合タンパク質（黒四角）、マウスｐ３５およびヒトｐ４０サブユニットを有する単鎖融合タンパク質（白四角）の効果を示す線グラフである。図６Ｃは、Ｈｕ−ＫＳ−１／４−ＩＬ−１２融合タンパク質全体（白四角）、ヒトＩＬ−１２を有する単鎖融合タンパク質（白ダイヤ型）、マウスｐ３５ヒトｐ４０を有する単鎖融合タンパク質（白丸）、およびヒトＩＬ−２（白三角）の抗原結合活性を示す線グラフである。図７は、抗ヒトＨ鎖およびＬ鎖での捕獲工程、ならびに抗ヒトＦｃ抗体（黒ダイヤ型）または抗ヒトＩＬ−１２ｐ４０抗体（白四角）のいずれかを用いる二次検出を使用するＥＬＩＳＡにより測定されるＨｕ−ＫＳ−ＩＬ−１２（マウスｐ３５ヒトｐ４０）の血清半減期を示すグラフである。図８（上および下のパネル）は、ＩＬ−１２融合タンパク質の免疫原性を示す線グラフである。Ｈｕ−ＫＳ−１／４抗体またはＨｕ−ＫＳ−１／４−ＩＬ−１２（マウスｐ３５３ヒトｐ４０）のいずれかを注射した動物からの血清希釈を、Ｈｕ−ＫＳ−１／４抗体に対する反応性について試験した。

Claims

第１および第２のキメラ鎖を含むヘテロ二量体融合タンパク質であって、該第１のキメラ鎖が、ペプチド結合によりヘテロ二量体サイトカインの第１のサブユニットに連結されたＩｇ重鎖の部分を含み、該第２のキメラ鎖が、ペプチド結合により該へテロ二量体サイトカインの第２のサブユニットに連結されるＩｇ重鎖の部分を含み、該第１および該第２の鎖がジスルフィド結合によって連結されている、ヘテロ二量体融合タンパク質。